REKOMBINACIJA MOLEKULA DNK

Transcript

1 REKOMBINACIJA MOLEKULA DNK

2 Fenomeni odgovorni za održavanje i ekspresiju genoma

3 Svaki molekul DNK je rekombinovani molekul DNK Pojam rekombinacije Tridesete godine prošlog veka Mejoza (poslednja istraživanja i u mitozi) I kod prokatiota i kod eukariota Tehnologija rekombinovane DNK

4 Vrste rekombinacije DNK Homologna rekombinacija molekula DNK Rekombinacija DNK specifična za mesto Rekombinacija DNK transpozicijom Ilegitimna (nepravilna) rekombinacija

5 Rekombinacija DNK kod prokariota Horizontalni transfer Bakteriofagna infekcija Reparacija molekula DNK

6 Rekombinacije DNK kod eukariota Održanje integriteta genoma (tokom mejoze, npr.) Razmena genetičkih informacija genetički diverzitet Zaštita gen. informacija omogućava reparaciju DSB u DNK Učestvuje i u procesima regulacije ekspresije nekih gena Obezbeđuje nesmetano odvijanje replikacije pomaže da zarobljena replikaciona viljuška ponovo krene

7 HOMOLOGNA REKOMBINACIJA Fizička razmena istih ili homolognih sekvenci DNK između dva različita molekula DNK Generalna, opšta Homologna RecA zavisna (kod prokariota)

8 Homologna rekombinacija Fizička bliskost dva molekula DNK Homologija najmanje u 100 bp dugom regionu DNK Prekidi u jednom ili oba lanca molekula DNK Formiranje i kretanje Holidejeve strukture Razrešenje (rezolucija) Holidejeve strukture de novo sinteza molekula DNK

9 Pola veka istraživanja homologne rekombinacije godine otkriva je Robin Holliday ( )

10 Holidejev model homologne rekombinacije DNK Pojava jednolančanih prekida u lancima iste polarnosti u dva blisko postavljena molekula DNK predstavlja početak homologne rekombinacije

11 Holidejev model homologne rekombinacije DNK Slobodni krajevi mogu razmeniti svoje homologne partnere procesom koji se definiše kao INVAZIJA LANACA Invazija lanaca za posledicu ima formiranje mosta ili sinapse Ova strukuta se stabilizuje zatvaranjem jednolančanih prekida delovanjem enzima DNK ligaze

12 Holidejev model homologne rekombinacije DNK Dobijena hibridna struktura naziva se Holidejev rekombinovani intermedijer (Holidejeva struktura) Hibridna struktura je stabilna ali ne i statična MIGRACIJA GRANA Holidejeva veza

13 Holidejev model homologne rekombinacije DNK Migracija grana stvara kraće ili duže regione koji su u hemijskom smislu heterodupleksi a u genetičkom smislu heterozigoti

14 Holidejev model homologne rekombinacije DNK Razrešenje Holidejeve strukture Uvođenjem dva jednolančana prekida

15 Produkti homologne rekombinacije molekula DNK Dva različita Startna genotipa Patch Produkti sa umetkom Splice Splajsovani produkti

16 Delovanje endonukleaze

17 MODEL REPARACIJE DVOLANČANIH PREKIDA HOMOLOGNOM REKOMBINACIJOM DNK

18 Dvolančani prekidi DNK i njihova reparacija homolognom rekombinacijom Dvolančani prekidu u DNK molekulu česti događaji I jedan dvolančani prekid može biti letalan za E.coli Dejstvom jonizujućeg zračenja i citotoksičnih agenasa

19 Na mestu dvolančanog prekida dolazi do enzimske degradacije molekula DNK i formiranja regiona jednolančanih repova DNK ili invazivni lanci koji se završavaju slobodnom 3 OH grupom.

20 Jedan jednolančani DNK rep svojim 3 krajem napada homologni molekul dvolančane DNK Izmeštanje jednog lanca homolognog molekula DNK Kontakt oba jednolančana repa prekinutog molekula DNK sa homolognim delovima neprekinutog molekula DNK. Formiranje karakteristične strukture neprekinutog molekula DNK koja se naziva D petlja

21 Reparaciona sinteza DNK Elongacija 3 -krajeva jednočanačnih DNK repova. Matrica za DNK sintezu su homologni segmenti lanaca neprekinutog molekula DNK. DNK ligaze

22 Rekombinovani DNK intermedijer sa dve Holidejeve strukture Migracija grana je posledica raskidanja vodoničnih veza u originalnim molekulima DNK i istovremeno formiranje novih vodoničnih veza u rekombinovanom intermedijeru između lanaca dva homologna molekula DNK. Migracija grana za posledicu ima povećanje dužine segmenata DNK koji bivaju razmenjeni između homologih molekula DNK

23 Razrešenje rekombinovanog intermedijera sa dve Holidejeve strukture Odvija se uvođenjem dva jednolančana prekida Za posledicu ima stvaranje dva rekombinovana molekula DNK (dve veze sa dva mesta)

24 Razrešenje rekombinovanog intermedijera sa dve Holidejeve strukture Ako se na isti način seku obe Holidejeve veze rezultat homologne rekombinacije su produkti sa umetkom

25 Razrešenje rekombinovanog intermedijera sa dve Holidejeve strukture Ako se korišćenjem različitih mesta seku dve Holidejeve veze rezultat homologne rekombinacije su produkti sa krosingoverom splajsovani produkti

26 Kombinacija dve pojedinačne Holidejeve strukture Patch + patch = patch Splice + splice = patch Splice + patch = splice

27 Proteinska mašinerija reparacije dvolančanih prekida molekula DNK kod E.coli Specijalizovani proteini: Proteinski kompleks RecBCD promoter rekombinacije (obrada dvolančanog prekida i formiranje invazivnog lanca) Protein RecA centralni protein homologne rekombinacije (proces invazije i razmene lanaca) Proteinski kompleks RuvAB odgovoran za prepoznavanje Holidejeve veze i za proces migracije grana Protein RuvC učestvuje u razrešenju Holidejevih veza

28 Proteinska mašinerija reparacije dvolančanih prekida molekula DNK kod E.coli Pored specijalizovanih proteina u procesu homologne rekombinacije učestvuju i: DNK polimeraza DNK ligaza Topoizomeraza Proteini koji se vezuju za jednolančane molekule DNK (eng. single-strand binding protein, SSB) SSB proteini

29 Proteinski kompleks RecBCD promoter homologne rekombinacije Tri subjedinice proteinski produkti tri gena Prepoznaje dvolančani prekid u molekulu DNK odnosno njegove ravne krajeve Poseduje helikazno/nuleaznu aktivnost zavisnu od ATP Rezultat ove aktivnosti je formiranje invazivnog lanca

30 Protein RecB Dva funkcionalna domena Domen na N-kraju ima helikaznu aktivnost u smeru 3-5 Multifunkcionalan domen na C-kraju poseduje nukleaznu aktivnosti Domen na C-kraju uspostavlja interakcije sa proteinom RecA

31 Protein RecD Poseduje helikaznu aktivnost u smeru 5-3

32 Protein Rec C U svojoj strukturi poseduje izraženu petlju u vidu čiode Širi dva lanca molekula DNK i usmerava lance ka helikaznim motorima druge dve subjedinice kompleksa Prepoznaje chi mesta

33 Proteinski kompleks RecBCD promoter homologne rekombinacije Lanci DNK različitim kanalima stižu do nukleaznog centra kompleksa. Kanal kojim u nukleazni centar dospeva lanac sa 3-5 polarnošću je tako pozicioniran da je nukleazna aktivnost efikasnija na ovom lancu.

34 Proteinski kompleks RecBCD promoter homologne rekombinacije Aktivnost kompleksa RecBCD regulisanaje specifičnim sekvencama u molekulu DNK ('5-GCTGGTGG-3') koje se nazivaju chi (eng. crossover hotspot instigator, chi) ili χ mesta.

35 Prelaskom preko chi mesta dolazi do konformacione promene subjedinice RecC. Fleksibilna petlja RecC proteina zatvara kanal kojim se kreće lanac sa polarnošću 3-5. Usled toga, nukleazni centar počinje efikasnije da degradira lanac sa polarnošću 5-3. Na taj način dolazi do formiranja jednolančanog DNK repa invazivnog lanca.

36 c mesto Genoma E. coli poseduje 1009 c mesta Zaštita bakterijske od dejstva fagne DNK ili segmenata bakterijskih DNK koje ne poseduju chi mesta a koje dospevaju u bakterijsku ćeliju raznim vidovima horizontalnog transfera gena. 10x povećava frekvencu rekombinacije.

37 Proteinski kompleks RecBCD promoter homologne rekombinacije Zahvaljujući subjedinici RecB, kompleks RecBCD pomaže vezivanje proteina RecA za invazivni lanac.

38 Protein RecA Protein RecA je centralni protein homologne rekombinacije kod E. coli. Pripada proteinskoj familiji proteina za razmenu lanaca (eng. strandexchange proteins). Mutacija u proteinu RecA smanjuje učestalost rekombinacije za puta. Poseduje ATP aznu i proteaznu aktivnost. Proteni RecA vezuju se za invazivni lanac (jednolančani DNK rep) i omogućava proces invazije.

39 Filament RecA Za invazivni lanac, proteini RecA vezuju se kooperativno i na taj način formiraju filament RecA. Filament RecA sastoji se od oko 100 molekula proteina RecA koji se vezuju za 300 nukleotida dugu sekvencu DNK invazivnog lanca.

40 Filament RecA Štiti jednolančanu DNK od dejstva nukleaza i omogućava proces invazije lanaca. Vrši napad na dvolančani homologni molekul DNK. Struktura koja se sastoji od filamenta RecA i segmenta dvolančanog molekula DNK naziva se spojeni (eng. joint) molekul.

41 Filament RecA Filament RecA poseduje dva vezujuća mesta za molekule DNK. U okviru jednog nalazi se invazivni lanac i ono se naziva primarno mesto. Drugo mesto za vezivanje molekula DNK naziva se sekundarno mesto i za njega se vezuje homologni dvolančani molekul DNK.

42 Filament RecA Zahvaljujući postojanju ovih mesta u okviru filamenta RecA, tokom invazije lanaca jednolančani DNK repovi (invazivni lanci) pretražuju i pronalaze homologne regione u dvolančanom molekulu DNK.

43 Filament RecA Vezivanje dvolančanog molekula DNK za sekundarno mesto filamenta RecA je brzo, slabo, prolazno i nezavisno od sekvence. Mehanizam kojim filament RecA pretražuje dvolančani molekul DNK kako bi pronašao homologne sekvence sa sekvencom invazivnog lanca nije sasvim poznat.

44 Pretpostavka je da se baze invazivnog lanca i baze dvolančane DNK spajaju vodoničnim vezama. Energiju potrebnu za raskidanje vodoničnih veza u dvolančanom molekulu DNK obezbeđuju molekuli RecA svojom ATP-aznom aktivnošću. Raskidanjem vodoničnih veza segment dvolančanog molekula DNK privremeno se otvara i omogućava svojim bazama da formiraju vodonične veze sa bazama u jednolančanom molekulu DNK (invazivnom lancu).

45 Ispravno sparivanje 15 baza signal da je pronađena homologna sekvenca

46 Reparaciona sinteza DNK Nakon invazije lanaca i pronalaženja homologije između molekula DNK, proteini RecA disosuju, a spojeni molekul postaje mesto aktivnosti DNK polimeraza i DNK ligaza. Aktivnošću DNK polimeraze i DNK ligaze formiraju se Holidejeve veze.

47 Migracija Holidejevih veza omogućena je proteinskim kompleksom RuvAB Protein RuvA vezuje se za Holidejevu strukturu u formi tetramera i regrutuje dva molekula RuvB heksamerni protein sa ATP-aznom aktivnošću koji omogućava migraciju grana

48 U razrešenju Holidejeve strukture učestvuje protein RuvC Holidejevu strukturu prepoznaje zahvaljujući protein-protein interakciji sa kompleksomruvab. Dva molekula proteina RuvC vezuju se za kompleks RuvAB.

49 Protein RuvC Protein RuvC je endonukleaza koja uvodi jednolančane prekide u lancima DNK iste polarnosti. Jednolančane prekide uvodi posle drugog timina u sekvenci 5'-A/T-T-T-C/G -3'. Ova sekvenca se u molekulu DNK E. coli nalazi na svakih 64 nukleotida.

50 DNK ligaza još jednom DNK krajevi nastali dejstvom proteina RuvC imaju slobodnu 5 fosfatnu grupu i 3 OH grupu koje se direktno spajaju dejstvom DNK ligaze. Rekombinovani molekuli DNK međusobno se razdvajaju i time je homologna rekombinacija završena.

51 Homologna rekombinacija i mejoza Mejoza (dve sukcesivne deobe, redukciona i ekvaciona deoba). Homologna rekombinacija odvija se u pahitenu profaze I. Mejotička rekombinacija: - omogućava pravilno razdvajanje hormozoma (održavanje genoma) - putem krosingovera predstavlja izvor genetičke varijabilnosti (ekspresija genoma).

52 Nondisjunction Odsustvo mejotičke rekombinacije za posledicu ima nepravilno razdvajanje hromozoma. Rezultat: Povećan broj gameta bez kompletnog broja hromozma što je uzrok smanjenog fertiliteta.

53 Protein Spo11 Protein Spo11 programirano uvodi dvolančani prekid u molekul DNK tokom inicijacije mejotičke rekombinacije. Topoizomerazama sličan protein koga poseduju svi eukarioti od kvasca do čoveka. Značaj proteina Spo11 za odvijanje homologne rekombinacije i mejoze pokazan je u eksperimentima na C.elegans.

54 Protein Spo11 U formi dimera, protein Spo11 napada molekul DNK (svaki monomer napada po jedan lanac). OH grupa tirozina raskida fosfodiestarsku vezu. Generiše se kovalentna veza fosfatne grupe molekula DNK i proteina Spo11. Energija kovalentne veze može se osloboditi raskidanjem iste i iskoristiti za repariranje dvolančanog prekida u uslovima kada ćelija dobije signal za zaustavljanje procesa mejoze.

55 Protein Spo11 Seče molekul DNK na mnogim mestima sa malom selektivnošću za sekvencu. Mesta delovanja proteina SPO11 nisu nasumično raspoređena po molekulu DNK češća u regionima koji nisu čvrsto pakovani sa histonima vruća mesta (eng. hot spots) za rekombinaciju. Vremenski strogo kontrolisana aktivnost.

56 Proteinski kompleks MRX Funkcija slična funkciji kompleksa RecBCD kod E.coli. Sastoji se od tri subjedinice: Mre11, Rad 50 i Nbs1/Xrs 2. Kompleks ispoljava nukleaznu aktivnost Rezultat aktivnosti ovog kompleksa je stvaranje invazivnog lanca od najmanje 1kb.

57 Dmc1 i Rad51 Eukariotski analozi proteina RecA Dmc1 se u ćeliji eksprimira isključivo tokom mejoze Rad51 i tokom mitoze i tokom mejoze

58 Protein Dcm1 Mejotička rekombinacija dešava se između 4 kompletna dvolančana lanca DNK (svaki u po jednoj hromatidi homologih hromozoma) Dcm1 zavisna rekombinacija češće se odigrava između nesestrinskih hromatida homolognih hromozoma Mehanizam kojom protein Dcm1 promoviše rekombinaciju između nesestrinskih hromatida je nepoznat. JASNA BIOLOŠKA ULOGA

59 Brojni drugi proteini uključeni su u proces mejotičke rekombinacije. Rad52 stimuliše vezivanja jednolančane DNK repove. proteina Rad51 za Rad54 eukariotski analog RuvB (?) Veliki protein-dnk kompleksi rekombinacione fabrike. nazivaju se

60 Rekombinacione fabrike Protein Mus81 je visoko konzerviran protein eukariota. Kompleks Mus81-Eme1 ima ulogu endonukleaze (resolvaze) u razrešenju Holidejevih struktura.

61 Rekombinacione fabrike Protein BRCA2 interaguje sa proteinom Rad51 i reguliše proces mejotičke rekombinacije. Poslednja istraživanja pokazuju da BRCA2 protein interaguje i sa proteinom Dmc1. Ovo otkriće, BRCA2 protein promoviše u univerzalnog regulatora rekombinacionog događaja.

62 Genska konverzija Genska konverzija je vrsta homologne rekombinacije bez krosingovera i formiranja Holidejeve veze. Zbog odsustva krosingovera naziva se i nerecipročna rekombinacija. Mehanizam kojim se odvija nerecipročna rekombinacija naziva se i sparivanje lanaca zavisno od sinteze (eng. synthesis-dependent strand annealing, SDSA).

63 Pivski kvasac

64 Lokus MAT otključana kaseta (mating type locus) Mating type geni kodiraju regulatorne proteine koji regulišu ekspresiju gena čiji proteinski produkti definišu tip ćelije. Kopije ovih gena prisutne su u svim tipovima ćelija ali se sve ne eksprimiraju. Nalaze se u okviru lokusa koji se naziva lokus MAT ili otključana kaseta.

65 Lokus MAT otključana kaseta (mating type locus) U a ćelijama u lokusu MAT prisutan gen a1. U a ćelijama u lokusu MAT prisutni geni a 1 i a 2. U diploidnim ćelijama sva tri mating-type control gena prisutna su u dva lokusa MAT.

66 Lokusi HMR i HML Utišane kasete skladište genetičkih informacija Svaka ćelija sadrži dodatne kopije kako gena a1, tako i gena a1 i a2. Ove kopije se ne eksprimiraju i nalaze se u lokusima označenim kao HML i HMR ( zaključane kasete ). Lokusi HMR i HML čuvaju genetičku informaciju neophodnu da ćelija promeni svoj tip.

67 Nerecipročna rekombinacija Lokus HML kodira utišane kompije gena a Lokus HMR kodira utišanu kopiju gena a Rekombinacija između lokusa MAT i lokusa HML, a ćelija prelazi u a ćeliju. Rekombinacija između lokusa MAT i lokusa HMR, a ćelija prelazi u a ćeliju.

68 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Nerecipročna rekombinacija otpočinje uvođenjem dvolančanog prekida u okviru lokusa MAT. HO sekvencno-specifična endonukleaza. HO endonukleaza jedino prepoznaje i seče lokus MAT (nikada lokus HMR ili HML jer hromatinska struktura to ne dozvoljava).

69 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Razgradnja molekula DNK u smeru 5 3 na mestu delovanja HO endonukleaze odvija se istim mehanizmom kao kod mejotičke rekombinacije dejstvom proteinskog kompleksa MRX.

70 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Formirani jednolančani DNK rep iz lokusa MAT povezuje se sa proteinima Rad51 i Rad52 i napada zaključanu kasetu (dvolančanu DNK).

71 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Ako je u lokusu MAT sekvenca gena a1 invazijom se napada lokus HML koji kodira utišane kopije a gena Ako je u lokusu MAT sekvenca a1 i a2 gena invazijom se napada lokus HMR koji kodira utišanu kopiju a gena

72 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Nakon invazije, slobodni 3 -kraj jednolančanog DNK repa služi kao prajmer za iniciranje sinteze DNK. Matrica za ovu sintezu DNK je sekvenca zaključane kasete.

73 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Suprotno mehanizmu replikacije molekula DNK, novosintetisani lanci komplementarni zaključanoj kaseti napuštaju matricu i povezuju se sa sekvenacma koje okružuju lokus MAT. Pre ove ligacije, preostali lanac DNK iz lokusa MAT biva isečen.

74 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Nakon rekombinacije genetička informacija koja je u lokusu HMR nalazi se i u lokusu MAT. Informacija u lokusu MAT je zamenjena, dok je informacija u lokusu HMR ostala ista.

75 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze - SDSA Mating-type swiching je unidirekcioni - informacija iz lokusa HML ili HMR može biti premeštena u lokus MAT, ali ne i obruto Lokus MAT je uvek recipijentni partner rekombinacije.

76 Sparivanje lanaca zavisno od sinteze SDSA

77 Sledi... Rekombinacija DNK specifična za mesto