για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά από την τοποθέτηση του ρητινώδους επανορθωτικού υλικού. Μια σημαντική επίπτωση της κυτταροτοξικής δράσης των

Transcript

1 Περίληψη H αντίδραση του συμπλέγματος οδοντίνης-πολφού σε διάφορα ερεθίσματα παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον καθώς η παραγωγή και η εναπόθεση επανορθωτικής οδοντίνης που τη χαρακτηρίζει αποτελεί μοναδική έκφραση της ικανότητας των πολφικών κυττάρων για αναγέννηση του πολφικού ιστού. Ερεθίσματα που μπορεί να επάγουν τη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης είναι η τερηδόνα, το μηχανικό τραύμα από την παρασκευή κοιλότητας στην οδοντίνη και η εφαρμογή επανορθωτικών υλικών όπως είναι τα ρητινώδη υλικά σε κοντινή ή ακόμα και άμεση επαφή με τον πολφό. H διαδικασία αυτή αποτελεί ένα πολύπλοκο φαινόμενο που βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο πολλών παραγόντων. Ένας από τους παράγοντες αυτούς μπορεί να είναι το οξειδωτικό στρες, η διαταραχή δηλαδή της ισορροπίας της οξειδοαναγωγικής κατάστασης του κυττάρου, η οποία έχει αποδειχτεί ότι εμπλέκεται σε μια σειρά από σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Στο οξειδωτικό στρες, η ισορροπία μεταξύ των οξειδωτικών και των αντιοξειδωτικών παραγόντων ανατρέπεται σε βάρος των δεύτερων. Έτσι στην παρούσα διατριβή επιχειρείται καταρχάς η διερεύνηση του ρόλου ενός σημαντικού αντιοξειδωτικού συστήματος, αυτού που αποτελείται από την κυτταροπλασματική θειορεδοξίνη (Trx1) και την αναγωγάση της (TrxR1), στη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών αυτών σε τομές παραφίνης ανθρώπινων δοντιών που ανήκαν σε δύο κατηγορίες: δόντια με παρασκευή κοιλότητας και έμφραξη με ένα ρητινώδες επανορθωτικό υλικό (συγκολλητικός παράγοντας XR Bond) ή ακέραιοι έγκλειστοι τρίτοι γομφίοι (δόντια ελέγχου). Επίσης μελετήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών αυτών σε πρωτογενή καλλιέργεια ανθρώπινων πολφικών κυττάρων με την τεχνική της ανοσοκυτταροχημείας. Για την ανάπτυξη της πρωτογενούς καλλιέργειας έγινε λήψη πολφικού ιστού από έγκλειστους μη πλήρως διαπλασμένους τρίτους γομφίους, ο οποίος μετά από κατάλληλη επεξεργασία οδήγησε στην ανάπτυξη σε καλλιέργεια αμιγούς πληθυσμού πολφικών κυττάρων. Επιπλέον στόχος της μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης στην έκφραση της θειορεδοξίνης του μονομερούς ΗΕΜΑ το οποίο είναι γνωστό ότι απελευθερώνεται από τα ρητινώδη υλικά και έχει αποδειχτεί κυρίως in vitro ότι έχει σημαντική κυτταροτοξική δράση, η οποία κατά ένα μεγάλο μέρος οφείλεται στο οξειδωτικό στρες που προκαλεί με αύξηση στην παραγωγή ROS και καταστολή των κυτταρικών αντιοξειδωτικών συστημάτων. Έτσι μελετήθηκε η έκφραση της θειορεδοξίνης στα πολφικά κύτταρα μετά την έκθεσή τους σε χαμηλές συγκεντρώσεις ΗΕΜΑ (10, 50 και 100μΜ) για χρονικά διαστήματα 15 λεπτών, 1 ώρας και 4 ωρών. O λόγος της επιλογής των χαμηλών αυτών συγκεντρώσεων σχετίζεται με την κλινική σημασία τους καθώς η διαρροή μονομερών σε τέτοιες συγκεντρώσεις συνεχίζεται

2 για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά από την τοποθέτηση του ρητινώδους επανορθωτικού υλικού. Μια σημαντική επίπτωση της κυτταροτοξικής δράσης των μονομερών που απελευθερώνονται από τα ρητινώδη υλικά είναι η αναστολή της ενασβεστίωσης που προκαλούν τόσο in vitro όσο και in vivo. Φαίνεται δηλαδή ότι τα μονομερή παρεμβαίνουν στη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης. Δεδομένου ότι βασικό ρόλο στη διαδικασία αυτή παίζουν πρωτεΐνες όπως η οδοντινική σιαλοπρωτεΐνη (DSP) που εκκρίνονται από τα κύτταρα που μοιάζουν με οδοντινοβλάστες που προκύπτουν από τα προγονικά/βλαστικά κύτταρα του πολφού κατά την επανορθωτική οδοντινογένεση, διερευνήθηκε στη συνέχεια η πιθανότητα συμμετοχής στους σχετικούς μηχανισμούς των διαδικασιών που λαμβάνουν χώρα στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Το ενδοπλασματικό δίκτυο είναι το κυτταρικό διαμέρισμα στο οποίο επιτελείται κατά κύριο λόγο η τροποποίηση της δομής των πρωτεϊνών ή αλλιώς η αναδίπλωσή τους πριν από την έκκρισή τους. Οποιαδήποτε εμπλοκή στη λειτουργία του μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση του στρες του ενδοπλασματικού δικτύου (ER στρες), το οποίο οδηγεί με τη σειρά του σε μια σειρά κυτταρικών αντιδράσεων που συνολικά ονομάζονται αντίδραση της μη-αναδιπλωμένης πρωτεΐνης (unfolded protein response - UPR). Σε αυτή βασικό ρόλο παίζουν πρωτεΐνεςμοριακές συνοδοί (chaperones), μεταξύ των οποίων ιδιαίτερα σημαντική είναι η ERdj5, πρωτεΐνη που μπορεί να θεωρηθεί δείκτης καταρχάς του ER και κατα δεύτερο λόγο του ER στρες καθώς επάγεται από αυτό. Διερευνήθηκε έτσι στη συνέχεια της διατριβής η έκφραση της πρωτεΐνης αυτής σε συνθήκες στις οποίες αναμένονται διαδικασίες επανορθωτικής οδοντινογένεσης όπως σε τομές παραφίνης δοντιών με τερηδόνα και δοντιών με παρασκευή κοιλότητας και έμφραξη με ένα ρητινώδες επανορθωτικό υλικό (XR Bond). Επιπλέον μελετήθηκε η έκφρασή της σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων πολφικών κυττάρων που αναπτύσσονταν με τον οστεο-επαγωγικό παράγοντα β-γλυκεροφωσφατάση πριν και μετά την έκθεσή τους στο μονομερές HEMA σε χαμηλές συγκεντρώσεις (10, 50, 100μM) για χρονικά διαστήματα 15 λεπτών, 1 ώρας και 4 ωρών. Προκειμένου τέλος να διερευνηθεί η επίπτωση του μονομερούς στην έκφραση της DSP σε συνδυασμό με την ERdj5, μελετήθηκε η έκφραση και των δύο αυτών πρωτεϊνών μετά την έκθεση στο HEMA στις συγκεντρώσεις και στα χρονικά διαστήματα που προαναφέρθηκαν, ποσοτικά με την τεχνική της ανοσοστύπωσης κατά Western (Western Blot) και ποιοτικά με ανοσοφθορισμό. Στα αποτελέσματα, η ανοσοϊστοχημεία έδειξε αυξημένη έκφραση των θειορεδοξινών στο στρώμα των οδοντινοβλαστών κάτω ακριβώς από την κοιλότητα, στην περιοχή της επανορθωτικής οδοντίνης, στις τομές των δοντιών με έμφραξη με ένα ρητινώδες υλικό, σε σχέση με μια διάχυτη αμυδρή χρώση στα ακέραια δόντια. Έντονη ήταν επίσης και η έκφραση της ERdj5 στις οδοντινοβλαστικές αποφυάδες κυρίως αλλά και στους οδοντινοβλάστες στην ίδια ακριβώς περιοχή. Στις τομές επίσης των δοντιών με τερηδόνα, έντονη ήταν η έκφραση

3 της ERdj5 στα πολφικά κύτταρα στην περιοχή της βλάβης που αντιστοιχούσε στην τερηδόνα αλλά και στα οδοντινοσωληνάρια και στους οδοντινοβλάστες ακριβώς κάτω από την περιοχή της βλάβης. Στις πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων πολφικών κυττάρων, η επώαση με χαμηλές συγκεντρώσεις ΗEΜΑ δεν φάνηκε να έχει κάποια επίπτωση στην έκφραση της θειορεδοξίνης, αλλά είχε σημαντική επίπτωση στην έκφραση της ERdj5. Έτσι, ενώ στην καλλιέργεια κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, η έκφραση της ERdj5 φαινόταν διάχυτη στο κυτταρόπλασμα, σε μια περιοχή που μπορούσε να οριστεί σαν το ενδοπλασματικό δίκτυο, μία ώρα μετά την επώαση με ΗEΜΑ, παρατηρήθηκε αύξηση στην έκφρασή της και συγκέντρωσή της με τη μορφή συσσωματωμάτων στο ER. Τέσσερις ώρες μετά την έκθεση στο ΗEΜΑ παρατηρήθηκε έκφραση και στον πυρήνα εκτός από το ER. Οι ποσοτικές μετρήσεις με το Western Blot και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων επιβεβαίωσαν την αύξηση στην έκφραση της ERdj5 κατά την πρώτη ώρα έκθεσης στο ΗEΜΑ, ενώ συγχρόνως έδειξαν ότι η έκφραση της DSP παρέμεινε στάσιμη στο ίδιο χρονικό διάστημα. H έκφραση όμως και των δύο πρωτεϊνών άρχισε να πέφτει 4 ώρες μετά την έκθεση στο ΗEΜΑ, γεγονός που υποδηλώνει πιθανά την πρόκληση από το μονομερές μιας παροδικής αντίδρασης ER στρες η οποία ακολουθείται από αποκατάσταση της ομοιόστασης του ER και συνέχιση της διαδικασίας της εναπόθεσης ενασβεστιωμένου ιστού. Ο ανοσοφθορισμός έδειξε επίσης μια σαφή μετατόπιση της έκφρασης της DSP από το κυτταρόπλασμα στο ER μετά την επώαση με ΗEΜΑ, που επιβεβαιώθηκε με τη συν-εντόπιση της πρωτεΐνης με την ERdj5 στο ER. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι μηχανισμοί που σχετίζονται τόσο με το οξειδωτικό στρες όσο και με το στρες του ενδοπλασματκού δικτύου εμπλέκονται πιθανά στη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης. H ενεργοποίηση του σημαντικού αντιοξειδωτικού συστήματος των θειορεδοξινών σε περιοχή στην οποία έχει προηγηθεί μηχανικό τραύμα από παρασκευή κοιλότητας και έμφραξη με ένα ρητινώδες υλικό υποδηλώνει συμμετοχή του συστήματος αυτού στις διεργασίες επούλωσης του πολφού. Περαιτέρω όμως έρευνα απαιτείται για την διαλεύκανση του ακριβούς ρόλου που μπορεί να παίζει καθώς το φάσμα της δράσης του περιλαμβάνει πολλές κυτταρικές λειτουργίες. Αντίστοιχα, η έκφραση της ERdj5 κάτω από τις ίδιες συνθήκες καθώς και σε δόντια με τερηδόνα υποδηλώνει ενεργοποίηση και του πολύπλοκου φαινομένου του ER στρες σε καταστάσεις πολφικού τραύματος. H διερεύνηση επίσης της επίπτωσης χαμηλών συγκεντρώσεων του μονομερούς ΗEΜΑ σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων πολφικών κυττάρων για μικρά χρονικά διαστήματα οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ένα μέρος της κυτταροτοξικότητας του μονομερούς αυτού μπορεί να οφείλεται στην πρόκληση ER στρες στα πολφικά κύτταρα. Ειδικά η αναστολή της ενασβεστίωσης που παρατηρείται μετά από την επίδραση μονομερών φαίνεται να σχετίζεται με πιθανή αναστολή της έκκρισης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης όπως η DSP, λόγω

4 κατακράτησής τους μέσα στο ενδοπλασματικό δίκτυο, σαν αποτέλεσμα της ακολουθίας των αντιδράσεων που προκαλείται από την ενεργοποίηση του ER στρες. Έχει ιδιαίτερη σημασία η σε βάθος κατανόηση του μηχανισμού με τον οποίο τα μονομερή που απελευθερώνονται από τα ρητινώδη υλικά παρεμβαίνουν στην αναγέννηση του συμπλέγματος οδοντίνης-πολφού, καθώς η γνώση αυτή μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη νέων μεθόδων σύγχρονης οδοντιατρικής θεραπείας οι οποίες θα ενσωματώνουν τρόπους αποφυγής των ανεπιθύμητων παρενεργειών των ρητινωδών υλικών.

5 Summary Study of the expression of oxidative and endoplasmic-reticulum stress proteins in the pulp and the dentin after exposure to caries, mechanical trauma and resinous monomers. Diamanti Evangelia The reaction of the dentin-pulp complex to stimuli is of great interest since the production and deposition of reparative dentin that characterizes this reaction is a unique expression of the regenerative capability of pulp cells. Stimuli that may induce reparative dentinogenesis include deep caries, the mechanical trauma caused by a cavity preparation in the dentin or the application of restorative materials like resinous ones in close proximity or even directly on the pulp tissue. Reparative dentinogenesis is a complicated process affected by several factors. One of them could be oxidative stress, which is defined as the disturbance of the cell redox state equilibrium, a situation that has been implicated in several important cell functions. During oxidative stress, the balance between oxidants and antioxidants shifts in favor of the first. A purpose of the present study was therefore to investigate the role of an important antioxidant system, which consists of the cytoplasmic thioredoxin (Trx1) and its reductase (TrxR1), during reparative dentinogenesis. To achieve this goal, the expression of these two proteins was studied in paraffin sections of human teeth of two types: teeth with a cavity preparation and a filling with a resinous material (adhesive resin XR Bond) or fully developed impacted third molars (control teeth). Moreover, the expression of the proteins was studied in a primary human pulp cell culture by immunocytochemistry. For the development of the culture, pulp tissue was obtained from normal immature impacted third molars, which, after proper processing, gave rise to a culture of a pure population of pulp cells. Another goal of this study was to investigate how the monomer HEMA, which is known to be released from resinous materials and has been proven, mainly in vitro, to be considerably cytotoxic, influences the expression of thioredoxin. A main reason for HEMA cytotoxicity is attributed to the oxidative stress that it causes because of the increase in the production of reactive oxygen species (ROS) and the depletion of the cellular antioxidant systems. The expression of thioredoxin was studied in pulp cells after incubation with low HEMA concentrations (10, 50, 100κΜ) for 15 minutes, 1 hour and 4 hours. These low concentrations were chosen because of their clinical relevance since the leakage of such monomer concentrations is continuing for long periods of time after the application of a resinous restorative material.

6 An important effect of the cytotoxic action of monomers leaking from resinous materials is the inhibition of mineralization that they cause, which has been observed in vitro and in vivo. It seems therefore that these monomers interfere in the process of reparative dentinogenesis. Proteins like dentin sialoprotein (DSP), which are secreted from odontoblastlike cells occurring from the differentiation of pulp cells during reparative dentinogenesis are indispensable for the mineralization of the newly formed tissue. The importance of the secretion and function of DSP led us to the investigation of processes that take place in the endoplasmic reticulum. The endoplasmic reticulum (ER) is the cellular compartment where the modification of the protein structure or their folding is taking place before their secretion. Any disturbance in its function may lead to the induction of ER stress, which then leads to a cascade of cellular responses named the unfolded protein response (UPR). A fundamental role in ER stress mechanisms and the UPR response is played by ER resident chaperones, among which ERdj5 with its unique characteristics regulates ER stress and the degradation of misfolded proteins. The expression of ERdj5 was investigated in this study in environments where reparative dentinogenesis is expected to take place such as paraffin sections of human teeth with deep caries or a cavity preparation and a filling with a resinous material (XR Bond). The expression of ERdj5 was also investigated in primary human pulp cell cultures supplemented with an osteo-inductive factor (β-glycerophosphate) before and after incubation with low HEMA concentrations (10, 50, 100κΜ) for 15 minutes, 1 hour and 4 hours. In order finally to investigate the effect of the monomer in the expression of DSP in combination with ERdj5, the expression of both proteins was studied after the exposure of cells to HEMA under similar experimental conditions, by Western Blot and immunofluorescence. Immunohistochemistry in sections of teeth filled with a resinous material showed an increased expression of thioredoxins in the odontoblast layer exactly beneath the cavity, in the reparative dentin area, compared to a relatively diffuse and weak staining in intact teeth. The expression of ERdj5 was also intense in the odontoblastic processes and, to a lesser extent, in the bodies of the odontoblasts in exactly the same area. In sections of teeth with deep caries, ERdj5 staining was intense in the pulp cells at the pulp lesion area and also in the dentinal tubules and the odontoblasts beneath the dentin area affected by caries. In primary pulp cell cultures, while the incubation with low HEMA concentrations did not seem to affect thioredoxin expression, it had a considerable effect in ERdj5 expression. Under normal pulp cell culture conditions, ERdj5 expression was covering a large area of the cytoplasm that could be identified as the endoplasmic reticulum. After incubation with HEMA for one hour, the expression of ERdj5 increased and the protein was accumulated in the ER. Under similar conditions, DSP expression remained stable. Measurements by Western Blot and statistical analysis of the results confirmed the increase in the expression of ERdj5 during the first hour of incubation with HEMA, as well as the stable expression of DSP. The expression of both

7 proteins, however, started to decrease 4 hours after incubation with HEMA. This could imply a possible restoration of ER homeostasis and the continuation of the process of tissue mineralization after a transient ER stress phenomenon. Immunofluorescence analyses also revealed an obvious relocalization of DSP from the cytoplasm and its accumulation in the ER after incubation with HEMA. In summary, the results of this study suggest that mechanisms related to oxidative stress and ER stress are involved in the process of reparative dentinogenesis. The activation of the antioxidant system of thioredoxins in an area of a previous mechanical trauma (cavity preparation) and a filling with a resinous material suggests a possible participation of this system in the pulp repair process. However, the exact role of the system remains to be elucidated. Our investigation also suggests that a part of the cytotoxicity of low concentrations of the monomer HEMA in primary human pulp cell cultures may be related to the induction of ER stress. Specifically, the inhibition of mineralization observed under the impact of monomers seems to be related to a possible inhibition of the secretion of DSP, a key protein in reparative dentinogenesis, because of its retainment into the ER. Understanding in depth the mechanism by which monomers leaching from resinous materials interfere in the pulp-dentin complex regeneration is of great importance, since it may help in the development of contemporary methods of dental treatment that can then be designed to avoid possible adverse effects of the resinous materials.