QUANTA Lite TPO ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TPO ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η ανοσοενζυμική μέθοδος QUANTA Lite Thyroid M ELISA χρησιμοποιείται για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων Θυρεοειδικής υπεροξειδάσης στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα και ορολογικές εξετάσεις μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση αυτοάνοσης θυρεοειδίτιδας όπως θυρεοειδίτιδας Hashimoto και νόσο Grave. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα Αντιθυρεοειδικά αντισώματα έχουν παρουσία στά αυτοάνοσα νοσήματα του θυρεοειδούς, και τά δύο αντισώματα θυρεοσφαιρίνης και μικροσωμιακά ερευνώνται σάν ρουτίνα. 1.2 Αντισώματα στόν ορό κατά μικροσωμιακού αντιγόνου εμφανίζονται ευρέως σε ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα του θυρεοειδούς και η παρουσία τους συνδέεται με την θυρεοειδίτιδα Hashimoto. 3 Αντισώματα του μικροσωμιακού αντιγόνου είναι θετικά 70-90% σε ασθενείς με χρόνια θυρεοειδίτιδα.τα αντισώματα αυτά εμφανίζονται σε ποσοστό 64% σε ασθενείς με πρώιμο θυρεοειδισμό, 50% σε θυρεοτοξίκωση, 10% σε βρογχοκήλη καί 17% σε νεόπλασμα θυρεοειδούς. 4 Αντισώματα θυρεοσφαιρίνης ανιχνεύονται σε υψηλούς τίτλους κυρίως σε αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα και στή νόσο Graves. Αντισώματα θυρεοσφαιρίνης στόν ορό εμφανίζονται 40-70% σε ασθενείς με χρόνια θυρεοειδίτιδα, και σε μικρότερο ποσοστό σε ασθενείς με θυρεοτοξίκωση και μή τοξική βρογχοκήλη. 5, 6 Έχει διαπιστωθεί ότι το αντιγόνο που εμφανίζεται συνήθως σε μικροσωμιακά είναι το ένζυμο θυρεοειδικής υπεροξειδάσης ΤΡΟ. 7 Mέθοδοι βασιζόμενες στο κεκαθαρμένο ΤΡΟ έχουν αρκετά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με μεθόδους που βασίζονται σε μικροσωμιακά καθώς μπορεί να περιέχουν θυρεοσφαιρίνη η επίσης και άλλα απροσδιόριστα αντιγόνα. 8 Πρόσφατη μελέτη απέδειξε ότι τα αντισώματα αντιδρούν με παρόμοιο τρόπο σε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θυρεοειδική υπεροξειδάση και αμιγές TPO κεκαθαρμένο από ιστό. 9 Αντιθυρεοειδικά αντισώματα ανιχνεύονται με αντιδράσεις καθίζησης, 10 Latex, 11 αιμοσυγκόλληση 12 και ανοσοφθορισμό. 13,14 Πρόσφατα ανοσοενζυματικές τεχνικές (ELISA) έχουν αναπτυχθεί και είναι πιό ευαίσθητες και αντικειμενικές από την αιμοσυγκόλληση 18 και τόν ανοσοφθορισμό. Η τεχνική ELISA είναι ευαίσθητη, ειδική, αντικειμενική και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μεγάλο και μικρό αριθμό δειγμάτων. Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο ανασυνδυασμένη ανθρώπινο αντιγόνο TPO είναι συνδεδεμένο στα πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι αντιδραστική ιδιότητες. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδιάκια επιτρέποντας τα αντι- Θυρεοειδικά αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο κεκαθαρμένο ανασυνδυασμένο TPO (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα Θυρεοειδικής υπεροξειδάσης) 3. TPO Control, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml TPO θετικό πρότυπο ελέγχου (control) που περιέχει ανθρώπινο 4. TPO Calibrator A, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml TPO πρότυπο διάλυμα Α που περιέχει ανθρώπινο 5. TPO Calibrator B, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml TPO πρότυπο διάλυμα Β που περιέχει ανθρώπινο 6. TPO Calibrator C, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml TPO πρότυπο διάλυμα C που περιέχει ανθρώπινο 7. TPO Calibrator D, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml TPO πρότυπο διάλυμα D που περιέχει ανθρώπινο 8. TPO Calibrator E, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml TPO πρότυπο διάλυμα E που περιέχει ανθρώπινο 9. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 10. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 11. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 12. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 13. HRP Stop Soulution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml 1

2 Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση,θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (στο παρελθόν NCCLS) H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 TPO ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος TPO πρότυπο διάλυμα ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος TPO Calibrator A Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος TPO Calibrator B Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος TPO Calibrator C Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος TPO Calibrator D Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 2

3 1 1.2mL αραιωμένος TPO Calibrator E Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά.. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. 5. Εάν επιθυμείτε τα αποτελέσματα μπορούν να υπολογισθούν ημιποσοτικά σε μονάδες WHO με καμπυλης χρησιμοποιείστε τούς έτοιμους πρότυπους ορούς για τον σχεδιασμό κάμπύλης 5 σημείων. Σημείο Μονάδες WHO Α πρότυπος ορός ΤPO A Β πρότυπος ορός ΤPO Β C πρότυπος ορός ΤPO C D πρότυπος ορός ΤPO D E πρότυπος ορός ΤPO E 62.5 Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl διάλυμα ελέγχου (Control) και πρότυπων ορών ελέγχου Α-Ε, και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις όπως παρουσιάζονται στο παρακάτω διάγραμμα. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των αντιδραστηρίων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 3

4 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού πρότυπου ορού ελέγχου Α θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του πρότυπου διάλυματος ελέγχου (Control) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου Α θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του πρότυπου διαλυματος ελέγχου (Control) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Η συγκέντρωση του θετικού πρότυπου ορού θα πρέπει να βρίσκεται εντός του αποδεκτού εύρους που αναγράφεται στην ετικέτα. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο CLSI (στο παρελθόν NCCLS) C24-A3 για επιπλέον οδηγίες στις κατάλληλες πρακτικές QC. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων 1. Καθορίστε τη μέση τιμή για όλες τις διπλές μετρήσεις. 2. Κάντε γραφική αναπαράσταση της μέσης απορρόφησης (O.A.) της καμπύλης του βαθμονομητή σε σύγκριση με το λογάριθμο των συγκεντρώσεών τους. Χρησιμοποιήστε μια γραμμή που ταιριάζει καλύτερα ή μια γραφική αναπαράσταση σημείο-σε-σημείο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά γραφική αναπαράσταση καμπύλης/καμπύλης. 3. Καθορίστε την άγνωστη συγκέντρωση TPO σε μονάδες (WHO) από τον άξονα "X", μετρώντας την αντίστοιχη απορρόφηση στον άξονα "Y". Οι ρυθμιστές και ο ορός ελέγχου για το κιτ αναφέρονται στα πρότυπα αναφοράς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO), Παρασκεύασμα αναφοράς MRC 66/ Οι αρνητικές τιμές κυμαίνονται ανάμεσα σε μονάδες. Τα θετικά αποτελέσματα είναι μεγαλύτερα από τις 100 μονάδες. 5. Τα δείγματα πάνω από το εύρος τιμών, όπου οι τιμές της Ο.Α. είναι μεγαλύτερες του προτύπου S1 μπορούν να εκφραστούν ως > 1000 μονάδες. Εναλλακτικά, το δείγμα μπορεί να αραιωθεί περαιτέρω (π.χ., αναλογία 1:2 και 1:4 στο αραιωτικό δείγματος HRP Sample Diluent). Η εξέταση επαναλαμβάνεται ώστε να φέρει την τιμή της Ο.Α. εντός του εύρους τιμών που περιλαμβάνει η πρότυπη καμπύλη. Παρακάτω παρουσιάζεται ένα παράδειγμα πρότυπης καμπύλης. Σημείο Μέση Ο.Α. Συγκέντρωση (μονάδες WHO) A B C D E Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. 1. Το θετικό αποτέλεσμα αντισωμάτων μικροσωμιακών δειχνει την πιθανότητα ύπαρξης θυρεοειδίτιδας Hashimoto και νόσο Grave.. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δηλώνει ότι δεν υπάρχει αντίσωμα για θυρεοειδική υπεροξειδάση ή συγκεντρώσεις κάτω από την οριακή τιμή για αρνητικό δείγμα της ανάλυσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TPO ELISA. Οι τιμές θυρεοειδικής υπεροξειδάσης που προσδιορίζονται με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Οι τιμές IgG δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων ή άλλων συσσωμάτων ανοσοσφαιρινών στο δείγμα, μπορεί να αύξηση το επίπεδο της μη ειδικής σύνδεσης και να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα. 2. Οι ασθενείς με θυρεοειδίτιδα Hashimoto δεν ολοί είναι θετικοί κατά TPO. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα αποτελέσματα δεν μπορούν να θεωρηθούν διαγνωστικής αξίας σε δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Ελέχθησαν 198 τυχαία δείγματα.104 άνδρες ετών,καί 94 γυναίκες ετών.11 δείγματα η 5.5% ευρέθησαν θετικά.6 εξ αυτών των 11θετικών ήταν από γυναίκες και τα υπόλοιπα 5 από άνδρες. 7 απο τα 11 θετικά ευρέθησάν θετικά κατά μικροσωμιακών και θετικά με άλλο εμπορικό κίτ ΤΡΟ ELISA. Η μέση τιμή του φυσιολογικού ανδρικού πλυθησμού ήταν 17 μονάδες και του γυναικείου 36 μονάδες. Ευαισθησία και Ειδικότητα Η ικανότητα του QUANTA Lite TPO ELISA ελέγχθηκε με άλλο εμπορικό κιτ TPO ELISA. Ελέχθησαν 88 δείγματα. 69 υποβλήθησαν σε εργαστήριο αναφοράς για θυρεοειδικά αντισώματα, και ελέγχθησαν επίσης 19 φυσιολογικά δείγματα με τα εξής αποτελέσματα. INOVA ΤΡΟ * Σχετική ευαισθησία 90.8% Αναφοράς Σχετική ειδικότητα 100% Σχετική απόδοση 92.6% 1 εξ αυτών ήταν από φυσιολογικό πλυθησμό και 4 ευρέθησαν αρνητικά καί με ανοσοφθορισμό και ELISA κατά μικροσωμιακών. 4

5 Σε άλλη μελέτη το QUANTA Lite TPO ELISA συγκρίθηκε με άλλη μεθοδο ELISA ανίχνευσης αντισωμάτων ολικού μικροσωμικών με τα εξής αποτελέσματα. INOVA ΤΡΟ * Σχετική ευαισθησία 80.5% μικροσωμικών Σχετική ειδικότητα 92.7% - 17** 200 Σχετική απόδοση 89.7% *13 απο τα 15 ήταν με υψηλές τιμές θερεοσφαιρίνης. ** 16 απο τα 17 ήταν θετικά με κίτ αναφοράς TPO ELISA. Μία τρίτη μελέτη συγκρίθηκε το QUANTA Lite TPO ELISAμε Έμμεσο ανοσοφθορισμό με υπόστρωμα θυρεοειδούς ανώτερου θηλαστικού με τα εξής αποτελέσματα. INOVA ΤΡΟ Σχετική ευαισθησία 100% μικροσωμικών Σχετική ειδικότητα 81.5% - 5** 17 Σχετική απόδοση 89.0% *ΤΑ 5 δείγματα ήταν επίσης θετικά με το κίτ αναφοράς TPO ELISA. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα μετρήθηκαν με δοκιμή 6 δειγμάτων αρνητικών, ασθενώς θετικών, και εντόνως θετικών σε 6 διαφορετικές δοκιμασίες. Η μέση τιμή των ισχυρώς θετικών ήταν 815, τών ασθενώς θετικών 294, και των αρνητικών 53 μονάδες.τα αποτελέσματα ήταν τα εξής. Αρνητικό Ισχυρώς Θετικό Ασθενώς Θετικό SD CV SD CV SD CV Συνολικα % % % Eντος της δοκιμασίας % % % Μεταξύ των δοκιμασιών % % % QUANTA Lite είναι ένα θεωρημένο σήμα κατατεθέν της INOVA Diagnostics, Inc. 5

6 Βιβλιογραφία 1. Davies TF and DeBernardo E. Thyroid autoantibodies and disease. In "Autoimmune Endocrine Disease", TF Davies, ed., Wiley, New York, NY, 1983, p Wall JR and Kuroki T. Immunologic factors in thyroid disease. Medical Clinics of North America, 69: 913, Hall R and Evered DC. Autoimmune thyroid disease: thyroiditis. In "Endocrinology", DeGroot LJ, et al., eds., Grune and Stratton, New York, NY, 1979, p Delespesse G, et al. Thyroid autoimmunity. In Thyroiditis and Thyroid Function, Bastenie PA and Evans AM, eds., Pergamon Press, Oxford, 1972, p Balfour BM, et al. Fluorescent antibody studies in human thyroiditis: autoantibodies to an antigen of the thyroid colloid distinct from thyroglobulin. Br J Exp Pathol, 43:307, Tung KSK, et al. Antithyroid antibodies in juvenile lymphocytic thyroiditis. Am J Clin Pathol, 61: 549, Kotani T, et al. Detection of autoantibodies to thyroid peroxidase in autoimmune thyroid diseases by micro-elisa and immunoblotting. J Clin Endrocrinol Metab, 62: 928, Feldt-Rasmussen U. Analytical and clinical performance goals for testing autoantibodies to thyroperoxidase, thyroglobulin, and thyrotropin receptor. Clinical Chemistry, 42: 160, Gut P, et al. Recombinant human thyroid peroxidase produced in insect cells has similar properties to native human thyroid peroxidase. Thyroid. 10:543-50, Doniach D and Roitt IM. Autoimmunity in Hashimoto's disease and its implications. J Clin Endocrinol Metab, 17: 1293, Philip JR, et al. A latex particle precipitation test in the diagnosis of thyroid disease. J Clin Pathol, 15: 148, Fulthorpe AJ, et al. A stable sheep cell preparation for detecting thyroglobulin auto-antibodies and its clinical applications. J Clin Pathol, 14: 654, Holborrow J, et al. Cytoplasmic localization of complement-fixing auto-antigen in human thyroid epithelium. Br J Exp Pathol, 40: 583, Doniach D. Thyroid autoimmune disease: symposium on thyroid gland. J Clin Pathol, 20: 385, Ohwovoriole AE, et al. Improved ELISA for thyroid microsomal auto-antibodies, comparison with hemagglutination and immunofluorescent techniques. Int Arch Allergy Appl Immun, 86: 183, Hoshijima Y, et al. A sensitive enzyme immunoassay for anti-thyroglobulin antibody using Fabhorseradish peroxidase conjugate. J Immunl Methods, 96: 121, Roman SH, et al. Enzyme-linked immunosorbent microassay and hemagglutination compared for detection of thyroglobulin and thyroid microsomal autoantibodies. Clin Chem, 30: 246, Wilkin TJ, et al. A passive hemagglutination (TRC) inhibitor in thyrotoxic serum. J Clin Endocrinol, 10: 507, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: GRC November 2010 Revision 9 6