QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM Εξέταση Κοιλιακής DGP αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό των αντισωμάτων IgA και IgG σε συνθετικά, απαμιδωμένα πεπτίδια που προέρχονται από τη γλιαδίνη στον ορό ανθρώπων. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων από απαμιδωμένα πεπτίδια μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες για τη διάγνωση κοιλιακής νόσο τόσο με επάρκεια όσο και με έλλειψη IgA καθώς και της ερπητοειδούς δερματίτιδας. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η κοαιλιοκάκη ή η εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη είναι μια χρόνια κατάσταση, στην οποία ως κύριο χαρακτηριστικό περιλαμβάνεται το φούσκωμα και η χαρακτηριστική ιστολογική «λείανση» του εντερικού βλεννογόνου υμένα, έχοντας ως αποτέλεσμα ένα σύνδρομο δυσαπορρόφησης. Η ακριβής αιτιολογία της ασθένειας παραμένει άγνωστη, αλλά η γλιαδίνη ή το αλκοολούχο διαλυτό κλάσμα της γλουτένης του σίτου είναι σαφέστατα ο τοξικός παράγοντας. 1 Αρχικά, χρησιμοποιούνταν μια σειρά από πολλαπλές βιοψίες εντέρου για τη διάγνωση της κοιλιακής νόσου και των σχετικών διαταραχών. Πιο πρόσφατα, ορολογικές εξετάσεις έχουν προταθεί για έναν εξεταζόμενο πληθυσμό ασθενών με εντοπισμένη εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη, καθώς και για την διατήρηση υπό έλεγχο μιας διαιτητικής συμβιβαστικότητας. 2-5 Η Ευρωπαϊκή Επιτροπή για την Παιδιατρική Γαστρεντερολογία και Διατροφή (ESPGAN) έχει συστήσει τη χρήση ορολογικών δεικτών όπως η γλιαδίνη, καθώς και η ρετικουλίνη και τα ενδομυϊκά αντισώματα, για να μειώσουν τον αριθμό των εντερικών βιοψιών που χρειάζονται για να βγει μια διάγνωση. 6 Πρόσφατες έρευνες αποκάλυψαν ότι αντισώματα αντιδραστικά για γλιαδίνη από ασθενείς με κοιλιακή νόσο δεσμεύουν έναν πολύ περιορισμένο αριθμό ειδικών επιτόπων στο μόριο γλιδίνης. 7,8 Οι ίδιες αυτές μελέτες περαιτέρω αποκαλύπτουν ότι η επιλεκτική απαμίδωση της γλιαδίνης από το κοιλιακό σχετιζόμενο ένζυμο, την τρανσγλουταμινάση ιστού, προκαλεί ενισχυμένη δέσμευση από τα αντισώματα αντι-γλιαδίνης. Με βάση τις ανωτέρω παρατηρήσεις, οι αναλύσεις που χρησιμοποιούν απαμιδωμένα και προσδιορισμένα πεπτίδια έχει καταδειχθεί ότι παρέχουν υψηλότερη διαγνωστική ακρίβεια για την κοιλιακή νόσο, σε σύγκριση με τις τυπικές δοκιμασίες αντι-γλιαδίνης και ttg. 9,10,11 Η γλιαδίνη και των δύο αντισωμάτων IgA και IgG έχουν ανιχνευθεί στον ορό ασθενών με εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη. 2,3 Μια ευαίσθητη στρατηγική για πληθυσμούς με κίνδυνο περιλαμβάνει εξετάσεις για αντισώματα IgG και IgA γλιαδίνης, εφόσον μια σημαντική μερίδα των κοιλιακών ασθενών είναι ελλιπής σε IgA. 12 Τα αντισώματα IgA της γλιαδίνης έχουν ενδιαφέρον για την επόμενη δραστηριότητα της ασθένειας με τον καιρό και για την διατήρηση υπό συνεχή έλεγχο της σταθερής προσκόλλησης σε μια δίαιτα χωρίς γλουτένη. 5 Η Ερπητοειδής Δερματίτιδα (DH) είναι μία νόσος του δέρματος η οποία, όπως και η κοιλιακή νόσος, προκαλείται από την κατανάλωση πρωτεΐνης σιταριού. Η πλειοψηφία των ασθενών με DH έχουν ατροφία λαχνών στη νήστιδα ίδια με εκείνη που απαντάται στην κοιλιακή νόσο και η αυστηρή διατροφή ελεύθερη γλουτένης βελτιώνει τις βλάβες του εντέρου και του δέρματος. 13, 14 Οι τρέχουσες οροδιαγνωστικές μέθοδοι όπως οι αναλύσεις EMA και ttg παρουσιάζουν απογοητευτικά αποτελέσματα στις δοκιμές για DH, με εύρος ευαισθησιών από μόνο 60-75% 15,16, συγκριτικά με ευαισθησίες 95% και υψηλότερες που έχουν αναφερθεί για κοιλιακή νόσο. Η QUANTA Lite TM Εξέταση Κοιλιακής DGP είναι μία δοκιμή με βελτιωμένη απόδοση για τον ταυτόχρονο εντοπισμό των αντισωμάτων IgA και IgG σε επιλεγμένα απαμιδωμένα, συνθετικά πεπτίδια που προέρχονται από την πρωτεΐνη γλιαδίνη του σιταριού και έτσι επιτρέπει τον εντοπισμό της κοιλιακής νόσου ακόμα και με συνυπάρχουσα έλλειψη IgA. Αρχη Μεθοδου Κεκαθαρμένα συνθετικόςπεπτίδια γλιαδίνης δεσμεύονται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου, υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν το αντιγόνο στην αμιγή του κατάσταση. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντιγλιαδινικά αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgA και IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgA και/ή IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Μικροπλάκα πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με κεκαθαρμένα πεπτίδια γλιαδίνης (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα IgA ή IgG αντισώματα gliadin πεπτίδια) 3. Celiac DGP Screen ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρωπίνου ορού IgA και IgG σε πεπτίδια γλιαδίνης, προαραιωμένο, 1.2ml 4. Celiac DGP Screen ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρωπίνου ορού IgA και IgG σε πεπτίδια γλιαδίνης, προαραιωμένο, 1.2ml 1

2 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate Ig G/A (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG και IgA, 1 φιαλίδιο άχρωμο, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10 ml 9. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα 2

3 Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα.clsi (NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 18 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 Celiac DGP Screen ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος Celiac DGP Screen Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος Celiac DGP Screen High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Ig G/A Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG και IgA (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP Ig G/A συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 3

4 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A2 toυ CLSI (NCCLS) για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 19 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του Celiac DGP Screen ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του Celiac DGP Screen ELISA Low. Η τιμή του Celiac DGP Screen ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X Celiac DGP Screen oρού ελέγχου O.A. Celiac DGP Screen ορού ελέγχου (μονάδες) Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων, πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί να χαρακτηρισθεί σάν αρνητικό, ασθενές θετικό, ισχυρώς θετικό. Mονάδες Αρνητικό <20 Ασθενώς Θετικό Συγκρατήστε θετικά στο Εντόνως θετικά >30 1. Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία gliadin IgA και/ή IgG αντισωμάτων καί την πιθανότητα εντεροπαθειών ευαίσθητων στην γλουτένη όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων gliadin IgA ή IgG αντισώματα ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA. Οι τιμές gliadin IgA και/ή IgG που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων αντίσωμα δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα σε έναν ασθενή χωρίς θεραπεία, δεν αποκλείει εντελώς την εντεροπάθεια 4

5 με ευαισθησία στη γλουτένη. Τα αρνητικά δείγματα μπορούν να δοκιμαστούν ξανά για άλλα κοιλιακά σχετιζόμενα αντισώματα, όπως αντισώματα ενδομυΐου (EMA) ή τρανσγλουταμινάση ιστού (ttg). 2. Σε ασθενείς με υψηλές τιμές αντισωμάτων gliadin IgΑ ο δείκτης αυτών είναι σημαντικότερος απο τών IgG Είναι δυνατή η ύπαρξη ψευδών θετικών (υψηλά επίπεδα αντισωμάτων χωρίς χαρακτηριστικά ιστολογικά ευρήματα). Σπανίως, άλλες γαστρεντερικές διαταραχές και κανονικά δείγματα μπορούν να έχουν αντίδραση αντισωμάτων με το αντιγόνο DGP. 4. Η σχέση μεταξύ ερπητοειδής δερματίτιδας και ευαισθησίας στην γλουταίνη εντεροπάθειας είναι τόσο δυνατή ώστε έχει συσταθεί ότι και οι δύο αρρώστιες έχουν την ίδια αιτιολογία. Σε αυτούς τους ασθενείς ο ορισμός του αντισώματος της γλουταίνης είναι χρήσιμος για να προσδιοριστούν κοιλιακές αρρώστιες χωρίς συμπτώματα και να εκτιμηθεί η σοβαρότητα της γαστρεντερικής επιπλοκής. 13,14 5. Αυτή η δοκιμή εντοπίζει ταυτόχρονα τα αντισώματα IgA και IgG. Αν είναι προτιμότερος ο ξεχωριστός καθορισμός συγκεκριμένων αντισωμάτων IgA ή IgG, η INOVA προσφέρει ξεχωριστά κιτ IgA και IgG ELISA (QUANTA Lite TM Gliadin IgA II και QUANTA Lite TM Gliadin IgG II) για αυτόν τον σκοπό. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα της ανάλυσης QUANTA Lite TM Εξέταση Κοιλιακής DGP να ανιχνεύει αντισώματα γλιαδίνης IgG και IgA αξιολογήθηκε με τη σύγκριση με τα QUANTA Lite TM Gliadin IgA II και QUANTA Lite TM Gliadin IgG II ELISA. Φυσιολογικές Τιμές Τετρακόσια ενενήντα επτά τυχαία ασυμπτωματικά, υγιή άτομα που διέμεναν στις ΗΠΑ δοκιμάστηκαν για αντισώματα σε DGP. Από αυτά, τριακόσιοι από τους δότες ήταν γνωστό πως ανήκαν στο εύρος ηλικίας από 14 έως 78 ετών και συμπεριλάμβαναν ίσο αριθμό ανδρών και γυναικών. Τέσσερα δείγματα (0.8%) ήταν πάνω από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. Δύο ήταν ασθενή θετικά με τιμές 20.1 και 20.2 μονάδων και ένα ήταν μεσαία θετικό με τιμή 46.6 μονάδων. Το τέταρτο θετικό, στις 25.4 μονάδες, πιστεύεται πως ήταν πραγματικά κοιλιακό εξαιτίας του γεγονότος πως το δείγματα ήταν επίσης ισχυρά θετικό για αντισώματα IgA σε τρανσγλουταμινάση ιστού (57 μονάδες). Η μέση τιμή των 497 δειγμάτων ήταν 3.17 μονάδες. Η τυπική απόκλιση των δειγμάτων ήταν 3.0 μονάδες. Η μέση τιμή είναι έξι τυπικές αποκλίσεις κάτω από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Μελέτη Aληλεπίδρασης Εκατόν ένα δείγματα από τρία εργαστήρια αναφοράς κοιλιακής νόσου εξετάστηκαν εσωτερικά τόσο με την QUANTA Lite TM Εξέταση Κοιλιακής DGP, το QUANTA Lite TM Gliadin IgA II και το QUANTA Lite TM Gliadin IgG II ELISA. Παρακάτω παρατίθενται αυτά τα αποτελέσματα, συν τα 497 φυσιολογικά. N= 598 Gliadin IgG II and/or Gliadin IgA II Θετικός Αρνητικός Celiac DGP Screen Θετικός 39 3* Αρνητικός 11** 545 Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 39/50 (78.0%) Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 545/548 (99.4%) Γενική συμφωνία: 548/598 (91.6%) *Από τα 3 δείγματα που βρέθηκαν θετικά σε Εξέταση Κοιλιακής DGP, αλλά αρνητικά και στα δύο κιτ Gliadin II, τα 2 ήταν ασθενείς με διαγνωσμένη κοιλιακή νόσο σε διατροφή ελεύθερη γλουτένης με 28.7 και 20.9 μονάδες. Ο τρίτος ασθενής ήταν συγγενής 1 ου βαθμού ενός ασθενή με κοιλιακή νόσο με 20.2 μονάδες. **Από τα έντεκα δείγματα που βρέθηκαν αρνητικά από την Εξέταση Κοιλιακής DGP αλλά θετικά από ένα από τα κιτ gliadin II, οι 9 ήταν από την κανονική μελέτη. Από τα υπόλοιπα δύο, και οι δύο ήταν ασθενείς με διαγνωσμένη κοιλιακή νόσο σε διατροφή ελεύθερη γλουτένης. Ο ένας είχε 20.1 μονάδες σε Gliadin IgG II και ο άλλος είχε 25.3 μονάδες Gliadin IgA II. Κλινικές μελέτες Δείγματα ασθενών που προσδιορίστηκαν κλινικά είτε ως ασθενείς με κοιλιακή νόσο, ασθενείς με έλλειψη IgA, ασθενείς θετικοί για κοιλιακή νόσο με διατροφή ελεύθερη γλουτένης, συγγενής πρώτου βαθμού ενός ασθενούς με κοιλιακή νόσο, ασθενείς με ερπητοειδή δερματίτιδα, ασθενείς ελέγχου με έλλειψη IgA ή ασθενείς αρνητικοί για κοιλιακή νόσο, εξετάστηκαν τόσο σε εσωτερικές όσο και εξωτερικές κλινικές μελέτες χρησιμοποιώντας την QUANTA Lite TM Εξέταση Κοιλιακής DGP. Παρακάτω παρατίθεται μια σύνοψη των κλινικά προσδιορισμένων δειγμάτων συν 517 από τα δείγματα φυσιολογικού εύρους που αναφέρονται παραπάνω. Ομάδα ασθενών # Θετικά Celiac DGP % κοιλιακή % Ελλιπή για IgA κοιλιακής νόσου % κοιλιακή, διατροφή ελεύθερη γλουτένης % συγγενείς 1 ου βαθμού 18 2* 11% Ερπητοειδής Δερματίτιδα Ασθενείς 65 59** 91% Ελλιπή για IgA νόσου έλεγχοι κοιλιακή % Μη κοιλιακή νόσο Ασθενείς ασθενειών % φυσιολογικά 517 4*** 0.8% 5

6 *Ένας από τους συγγενείς ήταν 41.3 μονάδες και ήταν θετικός τόσο σε h-ttg όσο και EMA. Ο δεύτερος ήταν 20,2 μονάδες και ήταν αρνητικός τόσο σε h-ttg όσο και EMA. **Σε αυτήν την ίδια ομάδα ασθενών μόνο 54 ή το 83% ήταν θετικοί σε h-ttg και 6 από αυτά τα 65 άτομα δεν είχε εντερική εμπλοκή (βιοψία Marsh 0). ***Από αυτά τα 4 δείγματα, το 1 ήταν 20.1 μονάδες και το άλλο 20.2 μονάδες. Το όριο ήταν 20 μονάδες. Ένα άλλο από τα 4 ήταν 25.4 μονάδες και ήταν επίσης ισχυρά θετικό για h-ttg και ίσως να είναι στην πραγματικότητα θετικό σε κοιλιακή νόσο. Εξέταση Κοιλιακής DGP ELISA Performance με Κοιλιακή Διάγνωση: QUANTA LITE DGP Screen Diagnosis Θετικός Αρνητικός (Έλεγχοι ασθενειών και υγιείς έλεγχοι) Σύνολο Θετικός Αρνητικός Σύνολο Ευαισθησία: 97% (131/135) Ειδίκευση: 99.2% (629/634) Ευαισθησία - Η συνολική ευαισθησία για την κοιλιακή νόσο υπολογίζεται ομαδοποιώντας τα αποτελέσματα και για τους 85 ασθενείς με κοιλιακή νόσο συν τους 50 ασθενείς με κοιλιακή νόσο και έλλειψη IgA. Ο συνολικός αριθμός ασθενών με κοιλιακή νόσο είναι 135 από τους οποίους οι 131 ή το 97% ήταν θετικοί. Ειδίκευση - Η ειδικότητα μπορεί να υπολογιστεί ομαδοποιώντας τους 517 φυσιολογικούς (περιλαμβανομένου του δείγματος που ήταν θετικό σε h-ttg) τους 81 ελέγχου που ήταν αρνητικοί σε κοιλιακή νόσο και τους 36 ελέγχου με έλλειψη IgA. Αυτή η ομάδα έχει σύνολο 634 δείγματα. Από αυτά, μόνο 5 δείγματα ήταν θετικά για ειδικότητα 99.2%. Μελέτη Aληλεπίδρασης Για την αξιολόγηση πιθανών προβλημάτων διασταυρωμένης αντιδραστικότητας με άλλα αυτοαντισώματα, αναλύθηκαν με το κιτ QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen διάφορα δείγματα υψηλού τίτλου θετικά για αυτοαντισώματα. Συνολικά, αναλύθηκαν 86 δείγματα. Πολλά από τα δείγματα ήταν τα υψηλά θετικά ελέγχου από άλλα κιτ δοκιμών αντισωμάτων INOVA QUANTA Lite TM. Οι ειδικότητες περιλάμβαναν Κεντρόμερο (4), Ακτίνη (4), Sm (9), SS-A (12), RNP (9), Jo-1 (9), SS-B (8), Scl-70 (8), GBM (4), MPO (6), RF (5), Ribo P (4) και M2 (4). Η μέση τιμή αυτών των 86 δειγμάτων ήταν 2.40 μονάδες. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά στην QUANTA Lite TM Εξέταση Κοιλιακής DGP.Η μέση τιμή είναι οκτώ τυπικές αποκλίσεις κάτω από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης για το QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen αξιολογήθηκε εξετάζοντας 9 δείγματα 5 φορές συνολικά. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1 παρακάτω. Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης % Η απόδοση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε εξετάζοντας, εις διπλούν, 8 δείγματα καθώς και τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Μία περίληψη των αποτελεσμάτων της μελέτης εμφανίζεται παρακάτω. Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA HPC A B C D E F G H Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης %

7 Βιβλιογραφία 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: , Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: , Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidaion gliadin peptides. Clinical Chemistry 47: , Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clinical Chemistry 50: , Prince HE: Evaluations of the INOVA Diagnostics Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulins G (IgG) and IgA to Deamidated Glidin Peptides. Clinical and Vaccine Immunology 13: , Sugai E, et al.: Accuracy of Testing Antibodies to Synthetic Gliadin-Related Peptides in Celiac Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology 4: , Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand Journal Gastroenterology 27: , Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract. J. Allergy Clin. Immunol. July , Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterlogy and Hepatology 3: , Beutner EH, et al.: Sensitivity and Specificity of IgA-class antiendomysial antibodies for dermatitus herpetiformis and findings relevant to their pathogenic significance. Journal of the American Academy of Dermatology 15: , Porter WM, et al.: Tissue Transglutaminase Antibodies in Dermatitis Herpetiformis Correspondence. Gastroenterology 117: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5), Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC October 2008 Revision 2 7