QUANTA Plex TM ANCA Profile Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Plex TM ANCA Profile Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Plex ANCA Profile είναι μια ανοσολογική ανάλυση φθορισμού για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των αυτοαντισωμάτων anti-mpo και anti-pr3 σε αυτοαντισωμάτων ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα κι άλλες εργαστηριακές εξετάσεις, συνδράμοντας στη διάγνωση της αυτοάνοσου αγγειίτιδων συμπεριλαμβανομένης της μικροσκοπικής πολυαρτηρίτιδας, της μηνοειδούς σπειραματονεφρίτιδας και της κοκκιωμάτωσης του Wegener. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου H ανίχνευση των αντισωμάτων έναντι κυτταροπλασματικών αντιγόνων των ουδετερόφιλων έχει προκαλέσει επανάσταση στη διάγνωση και στη θεραπεία διαφόρων αυτοάνοσων αγγειοπαθειών (autoimmune mediated vasculitides). 1-4 Τα αυτοαντισώματα panca και canca έχουν αποδειχθεί κλινικά χρήσιμα στην ανίχνευση νόσων όπως η κοκκιωμάτωση του Wegener (WG) και η μηνοειδής σπειραματονεφρίτιδα. Υπάρχουν τουλάχιστον έξι ταυτοποιημένα αντιγόνα ANCA και ορισμένα που δεν έχουν ταυτοποιηθεί ακόμη, όπως τα αντιγόνα που αποκαλούνται άτυπα ANCA ή ANCA φλεγμονώδους εντερικής νόσου (IBD). 1,5 Τα περισσότερα από αυτά φαίνεται ότι είναι ένζυμα που βρίσκονται στα κοκκία των ουδετερόφιλων. Τα ένζυμα αυτά συμπεριλαμβάνουν την μυελοπεροξειδάση (myeloperoxidase - MPO) την πρωτεάση σερίνης 3 (serine protease 3) την ελακτάση (elactase), την λακτοφερίνη (lactoferin), την καθεψίνη G (cathepsin G) και την κατιονική πρωτεΐνη 57 (cationic protein 57 - CAP 57). Οι πρώτες μελέτες είχαν δείξει ότι το 80 90% των δειγμάτων με θετικά canca αντιδρούσαν με την πρωτεινάση 3 (PR 3). 1,3 Το πραγματικό ποσοστό όμως εξαρτάται από τον πληθυσμό των ασθενών που ελέγχονται και από την ποιότητα της δοκιμασίας ELISA που χρησιμοποιείται. Έχει βρεθεί ότι πολλές ELISA παρουσιάζουν μολύνσεις στο κεκαθαρμένο αντιγόνο που χρησιμοποιείται για την επικάλυψη των πηγαδιών στη στερεά φάση και για αυτό το λόγω δίνονται ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Σε μια μελέτη που συμπεριέλαβε 277 ασθενείς με κοκκιωμάτωση του Wegener και 1657 φυσιολογικά δείγματα, η ειδικότητα των αντι PR 3 αντισωμάτων βρέθηκε στο 98%. Το PR 3 βρέθηκε στο 93% των ασθενών με ενεργή γενικευμένη νόσο στο 60% των ασθενών με ενεργή περιφερειακός νόσο και στο 40% των ασθενών σε ύφεση. Έχει αποδειχτεί ότι οι μεταβολές στους τίτλους των αυτοαντισωμάτων ακολουθούν τις μεταβολές της νόσου και βοηθούν στη διαφοροποίηση των εξάρσεων της κοκκιωμάτωσης του Wegener από άλλα νοσήματα που μπορεί να συνυπάρχουν όπως διάφορες λοιμώξεις οι οποίες είναι επικίνδυνες σε άτομα υπό ανοσοκατασταλτική αγωγή. 6 Τα αντισώματα anti-mpo είναι ιδιαιτέρως ειδικά για την ιδιοπαθή αγγειίτιδα, την αγγειίτιδα που συνδέεται με μηνοειδή σπειραματονεφρίτιδα καθώς και για την κλασική οζώδη πολυαρτηρίτιδα, το σύνδρομο Churg-Strauss και το σύνδρομο επικάλυψης πολυαγγειίτιδας χωρίς νεφρική εμπλοκή Ως προς την ευαισθησία, είτε τα MPO είτε τα PR 3 αντισώματα βρέθηκαν στο % των ασθενών με ιδιοπάθεια και αγγειοπάθεια που σχετίζεται με την μηνοειδή σπειραματονεφρίτιδα. Στη κοκκιωμάτωση Wegener τα αντι- MPO αντισώματα ανιχνεύτηκαν μόνο περιστασιακά και γενικά σε ασθενείς που ήταν αρνητικοί για PR 3 αυτοαντισώματα. 7 Τα επίπεδα των MPO αντισωμάτων είναι σημαντικώς υψηλότερα κατά τη διάρκεια της έξαρσης της νόσου σε σχέση με τις περιόδους ύφεσης. 7 Για αυτό το λόγω τόσο τα MPO όσο και τα PR 3 αυτοαντισώματα φαίνεται να είναι χαρακτηριστικοί δείκτες για τη δραστικότητα της νόσου. Οι ειδικές για αντι-mpo και αντι-pr3 μέθοδοι όπως το QUANTA Plex ANCA Profile δεν είναι ικανές να αντικαταστήσουν την τυπική έμμεση ανάλυση ανοσοφθορισμού (IFA) που χρησιμοποιεί μονιμοποιημένα ανθρώπινα ουδετερόφιλα για ανίχνευση ANCA, καθώς υπάρχουν πάρα πολλές άλλες ειδικότητες οι οποίες είναι σημαντικές. Αυτό ισχύει ειδικά στην περίπτωση των ANCA της άτυπης ή φλεγμονώδους νόσου των εντέρων (IBD) που απαντώνται σε ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα ή σκληρυντική χολαγγιίτιδα. 4 Οι ειδικές για MPO και PR-3 μέθοδοι μπορούν να παρέχουν ένα σημαντικό επιβεβαιωτικό αποτέλεσμα για δύο από τα σπουδαιότερα από τα αναγνωρισμένα αντιγόνα. Αυτές οι ειδικές αναλύσεις είναι επίσης χρήσιμες για την ερμηνεία δειγμάτων τα οποία είναι "δύσκολο" να προσδιοριστούν με την IFA, όπως εκείνα τα οποία παρουσιάζουν ταυτόχρονα διάφορα σχήματα ή εκείνα με υψηλό φθορισμό παρασκηνίου. Το QUANTA Plex TM ANCA Profile προσφέρει αντικειμενικό, ταυτόχρονο προσδιορισμό των αυτοαντισωμάτων σε σύγκριση με τις μεθόδους MPO και PR-3, που είναι οι δύο πιο σχετικές μέθοδοι ANCA κλινικά. Αρχη Μεθοδου Αμιγή αντιγόνα MPO και PR-3 δεσμεύονται το καθένα σε διαφορετικούς, χρωματισμένους με φθορισμό κόμβους. Οι δύο διαφορετικοί επικαλυμμένοι με αντιγόνο κόμβοι, καθώς και ένας επικαλυμμένος με αντι-igg κόμβος ελέγχου, αναμιγνύονται μεταξύ τους και τοποθετούνται στα 1

2 πηγαδάκια μιας μικροπλάκας υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν τα αντιγόνα στην αντιδραστική τους κατάσταση. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενούς προστίθενται σε ξεχωριστές κοιλότητες, επιτρέποντας στα οποιαδήποτε παρόντα αυτοαντισώματα MPO και PR-3 να δεσμευθούν στα ακινητοποιημένα αντιγόνα στους κόμβους, καθώς και στην ελεύθερη IgG να δεσμευθεί στον κόμβο αντι-igg. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο φθορίζον σύζευγμα αντιανθρώπινης IgG να συνδεθεί σε οποιαδήποτε αυτοαντισώματα του ασθενούς έχουν προσαρτηθεί στο αντιγόνο των κόμβων. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο φθορίζον σύζευγμα αντι-ανθρώπινης IgG να δεσμευθεί σε οποιαδήποτε αυτοαντισώματα ασθενούς τα οποία έχουν προσαρτηθεί στα αντιγόνα στους κόμβους ή συλληφθεί από τον κόμβο αντι-igg. Τα δείγματα στη συνέχεια μετρώνται στο κυτταρόμετρο ροής Luminex. Αυτό το αναλυτής ροής μπορεί να διακρίνει το χρώμα του κάθε κόμβου από τα άλλα, καθώς και να μετρά την ένταση φθορισμού του συζεύγματος σε κάθε κόμβο. 11 Η ένταση φθορισμού στον κόμβο είναι ανάλογη προς την ποσότητα του δεσμευμένου συζεύγματος, η οποία με τη σειρά της είναι ανάλογη προς την ποσότητα των αντισωμάτων του ασθενούς που έχουν δεσμευθεί στους επικαλυμμένους με αντιγόνο κόμβους ή στον κόμβο αντι-iga. Κάθε αντιγόνο μπορεί να μετρηθεί ημι-ποσοτικά συγκρίνοντας την ένταση φθορισμού του δείγματος ασθενούς με το φθορισμό του αντίστοιχου χαμηλού θετικού. Ο κόμβος ελέγχου αντι-igg χρησιμοποιείται για να διασφαλιστεί η ανίχνευση των ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων λόγω λειτουργικού σφάλματος, όπως περιγράφεται στον Έλεγχο Ποιότητας. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου, 12 ταινίες (1 x 8) (σφραγισμένο χρυσός στο χρώμα) μικροκοιλοτήτων με θήκη, που περιέχουν κόμβους 3 διαφορετικών χρωμάτων. Καθένας από τους χρωματισμένους κόμβους είναι επικαλυμμένος με ένα διαφορετικό καθαρό αντιγόνο (MPO, PR-3 ή anti-iga), σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά μέσα. 2. QUANTA Plex Negative Control, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό με μη IgG ανθρώπινα αντισώματα MPO ή PR-3 αντιγόνα, προαραιωμένος, 1.2mL 3. ANCA Profile χαμηλό θετικό, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού στα αντιγόνα MPO και PR-3, προαραιωμένο, 1.2mL 4. ANCA Profile υψηλός θετικός, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού στα αντιγόνα MPO και PR-3, προαραιωμένο, 1.2mL 5. HRP αραιωτικό δείγματος, 1 φιαλίδιο - χρώματος ροζ, που περιέχει αλατούχο διάλυμα με ρυθμιστικό Tris, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικά, 50mL 6. Σύζευγμα IgG σεσημασμένο με φθορισμό (κατσίκας), αντιανθρώπινη IgG (fc ειδική), 1 φιαλίδιο χρώματος κεχριμπαρί - λυοφιλοποιημένη σκόνη, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικά. Ανατρέξτε στο τμήμα Μεθόδων για οδηγίες ανασύστασης. 7. QUANTA Plex Conjugate Diluent, 1 φιαλίδιο - χρώματος ροζ, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, στεθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικά, 7mL Προσοχή 1. Το προϊόν αυτό περιέχει μια χημική ουσία (0.02% chloramphenicol) που θεωρείται καρκινογενή. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Όταν απορρίπτονται τα αντιδραστήρια να ρίχνεται μεγάλη ποσότητα νερού έτσι ώστε να αποφεύγεται η συσσώρευση κατάλοιπων στις υδραυλικές εγκαταστάσεις. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. 4. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 5. Να ακολουθούνται όλοι οι κανονισμοί και νόμιμες διαδικασίες για την απόρριψη των αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η προσθήκη αζιδίου ή άλλων συντηρητικών στα δείγματα ορού μπορεί να επηρεάσουν τα αποτελέσματα. 3. Η προσαρμογή αυτής της ανάλυσης για χρήση με ορισμένους αυτόματους επεξεργαστές υγρού δείγματος κατέδειξε ότι δίνει ισοδύναμα αποτελέσματα με εκείνα που λαμβάνονται με χρήση της χειροκίνητης διαδικασίας. Αποτελεί ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να αξιολογεί ότι η αυτόματη διαδικασία δίνει αποτελέσματα δοκιμασίας εντός των αποδεκτών ορίων. 2

3 4. Η απόδοση της ανάλυσης επηρεάζεται από μια ποικιλία παραγόντων. Αυτοί συμπεριλαμβάνουν τη θερμοκρασία εκκίνησης των αντιδραστηρίων, τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος, την ακρίβεια και επαναληψιμότητα της τεχνικής χορήγησης με πιπέττα, την επαναληψιμότητα της τεχνικής ανάμιξης, το κυτταρόμετρο ροής Luminex συσκευή ανάλυσης που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση των αποτελεσμάτων και τη διάρκεια των χρόνων επώασης κατά την ανάλυση. Η προσοχή στη συνάφεια είναι σημαντική για την ακρίβεια και επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. 5. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 6. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας(κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 7. Είναι δυνατό να παρατηρηθεί μη αποδεκτά χαμηλός φθορισμός μετά από πολλαπλές χρήσεις από ένα μεμονωμένο φιαλίδιο φθορίζοντος συζεύγματος κατά τη διάρκεια ενός χρονικού διαστήματος. Για να αποφευχθεί αυτό, είναι σημαντικό να τηρούνται όλες οι συνιστώμενες διαδικασίες χειρισμού φθορίζοντος συζεύγματος. 8. Η χημική μόλυνση του φθορίζοντος συζεύγματος μπορεί να προέρχεται από τον ακατάλληλο καθαρισμό ή ξέπλυμα του εξοπλισμού ή των οργάνων. Κατάλοιπα από συνήθη εργαστηριακά χημικά, όπως φορμαλίνη, λευκαντικό, αιθανόλη ή απορρυπαντικό προκαλούν υποβάθμιση του φθορίζοντος συζεύγματος με την πάροδο του χρόνου. Ξεπλένετε τελείως όλον τον εξοπλισμό ή τα όργανα με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό μετά τη χρήση χημικών καθαριστικών/απολυμαντικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 ANCA Profile μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) (σφραγισμένο χρυσός στο χρώμα)με βάση 1 1.2mL αραιωμένος QUANTA Plex Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ANCA Profile Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ANCA Profile High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50mL ELISA Sample Diluent Διάλυμα αραίωσης 1 Φιαλίδιο λυοφιλοποιημένου φθορίζοντος συζεύγματος (κατσίκας), αντιανθρώπινη IgG 1 QUANTA Plex Conjugate Diluent 7mL Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Υγρό Ελύτρου για συσκευή κυτταρομετρίας ροής Luminex Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5 και 500 μl 8κάναλη πιπέτα ρυθμιζόμενου όγκου Δοκιμαστικοί σωλήνες για αραιώσεις δειγμάτων ασθενών, όγκος 1 έως 4mL Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό Συσκευή ανάλυσης ροής Luminex Ηλεκτρονική πιπέττα 8 καναλιών για την παροχή 5, 30, 45, 50 και 60µL ή αυτόματη συσκευή πιπεττών/αραιωτής Χρήση του κυτταρόμετρου ροής Luminex 1. Βλ. το εγχειρίδιο χρήσης που παρέχεται με το Luminex για λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία του συσκευή ανάλυσης ροής Luminex και την έκδοση Luminex Integrated System (IS) ή την έκδοση λογισμικού 2.0 ή ανώτερος. Τα δεδομένα για το ANCA Profile συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας IS Έκδοση 2.2. Για πρόσθετες πληροφορίες και για 3

4 πληροφορίες αντιμετώπισης προβλημάτων με την ανάλυση, επικοινωνήστε με την υπηρεσία τεχνικής υποστήριξης της INOVA Diagnostics, Inc. στη διεύθυνση ή στον αριθμό τηλεφώνου που παρέχεται στην τελευταία σελίδα του ένθετου οδηγιών. Συνοπτικές οδηγίες λειτουργίας για το συσκευή ανάλυσης ροής Luminex παρέχονται παρακάτω. 2. Βαθμονομείτε το Luminex χρησιμοποιώντας τους κόμβους πρότυπου ορού που διατίθενται από τη Luminex Corporation τουλάχιστον μία φορά το μήνα και επαληθεύετε ότι η βαθμονόμηση ήταν επιτυχής. Επίσης, βαθμονομείτε το Luminex εάν η διαφορά θερμοκρασίας βαθμονόμησης είναι μεγαλύτερη από 3 βαθμούς, εάν οι οροί ελέγχου ανάλυσης βρίσκονται εκτός εύρους ή όπως απαιτείται. 3. Το Luminex χρειάζεται 30 λεπτά για να προθερμανθεί μετά την ενεργοποίησή του. Όταν η περίοδος προθέρμανσης ολοκληρωθεί, εκτελέστε τις συνιστώμενες από τον κατασκευαστή λειτουργίες προετοιμασίας, έκπλυσης με αλκοόλη και πλύσης. 4. Λογισμικό χρήσης της δημοσίευσης IS, φορτώστε το πρότυπο "QP ANCA Profile" και διασφαλίστε ότι όλες οι πληροφορίες παρτίδας είναι σωστές. Εάν είναι απαραίτητο, ενημερώστε τις πληροφορίες παρτίδας. Οι παράμετροι του υποδείγματος έχουν ως εξής: Τα χρώματα κόμβων είναι MPO = 24, PR-3 = 25, anti-igg ελέγχου = 20. Ρυθμίστε τα συμβάντα ανά κόμβο σε 50, το μέγεθος δείγματος σε 50μL, το ρυθμό ροής σε 60μL/λεπτό (γρήγορο) και την πύλη σε περίπου 7500 έως Οι διάμεσες τιμές χρησιμοποιούνται για τη Διάμεση ένταση φθορισμού (Median Fluorescent Intensity MFI). 5. Εισάγετε τα ονόματα δείγματος είτε χειροκίνητα και είτε κάνοντας κλικ στο "Load Pa List". 6. Φορτώστε την πλάκα στην πλατφόρμα XY του Luminex. 7. Εκκινήστε το Luminex κάνοντας κλικ στο κουμπί "Start Plate". 8. Όταν ολοκληρώσετε τις εργασίες σας για την ημέρα, εκτελέστε τις λειτουργίες υγιεινής και μουσκέματος πριν απενεργοποιήσετε το όργανο. Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Για πληροφορίες προγραμματισμού για αυτόματο εξοπλισμό, επικοινωνήστε με τις υπηρεσίες τεχνικής υποστήριξης της INOVA Diagnostics. 2. Ενεργοποιήστε το συσκευή ανάλυσης ροής Luminex, διασφαλίστε ότι έχει προθερμανθεί και εκτελέστε όλες τις λειτουργίες ημερήσιας συντήρησης όπως περιγράφηκαν παραπάνω. Εάν είναι απαραίτητο, βαθμονομήστε το όργανο και επαληθεύστε ότι η βαθμονόμηση ήταν επιτυχής. 3. Φέρτε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα ασθενών σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 o C) και αναμίξτε τα καλά. 4. Εάν το φθορίζον σύζευγμα αντι-ανθρώπινης IgG δεν έχει ανασυσταθεί, προσθέστε 6mL αραιωτικού συζεύγματος στο φιαλίδιο χρώματος κεχριμπαρί που περιέχει τη λυοφιλοποιημένη σκόνη και στοβιλίστε το δοχείο για περίπου 30 δευτερόλεπτα για να διαλύσετε το περιεχόμενο. Το ανασυσταθέν φθορίζον σύζευγμα είναι σταθερό για 3 μήνες σε θερμοκρασία 2-8 C. Μην καταψύχετε. 5. Βεβαιωθείτε ότι ο περιέκτης υγρού ελύτρου στη συσκευή Luminex 100 είναι γεμάτος με Υγρό Ελύτρου που διατίθεται από την Luminex Corporation. 6. Προετοιμάστε μια αραίωση 1:101 κάθε δείγματος ασθενούς προσθέτοντας 5µL από κάθε ορό σε 500µL αραιωτικού δείγματος HRP, και στη συνέχεια περιδινίστε για να αναμίξετε τελείως το διάλυμα. Τα αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 8 ωρών από την ανασύσταση. ΜΗΝ ΑΡΑΙΩΝΕΤΕ τον QUANTA Plex Negative Control και το ANCA Profile χαμηλό και υψηλό θετικό. 7. Ο προσδιορισμός της παρουσίας ή της απουσίας των αντισωμάτων MPO και PR-3 χρησιμοποιώντας αυθαίρετες μονάδες απαιτεί δύο κοιλότητες για το ANCA Profile Low Positive (Διάλυμα χαμηλού θετικού προφίλ) και μία κοιλότητα για καθένα από τα QUANTA Plex Negative Control (Αρνητικός ορός ελέγχου) και ANCA Profile High Positive (Διάλυμα υψηλού θετικού προφίλ). Συνιστάται τα δείγματα να αναλύονται ένα-ένα χωριστά. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να έλθουν σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 C) πριν την έναρξη της ανάλυσης. Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό μικροκοιλοτήτων/ταινιών στη θήκη. Επιστρέψτε αμέσως τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στο σάκο που περιέχει τα αφυγραντικά μέσα και σφραγίστε καλά για να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση σε υδρατμούς και φως. 2. Προσθέστε 45μL αραιωτικού δείγματος HRP σε κάθε μικροκοιλότητα που προορίζεται για ορό ασθενούς. Μην προσθέσετε Αραιωτικό Δείγματος HRP στα πρώτα τέσσερα μικροπηγαδάκια, διότι θα περιέχουν το QUANTA Plex Negative Control, το ANCA Profile χαμηλό θετικό (εις διπλούν) και υψηλός θετικός. Μην προσθέτετε τα αραιωμένα δείγματα ασθενών στις μικροκοιλότητες αυτή τη στιγμή. 3. Τηρήστε μία από τις παρακάτω χρονικές ακολουθίες κατά την πρόσθεση ορών ελέγχου, δειγμάτων και συζεύγματος στις μικροκοιλότητες. Επειδή τα δείγματα διαβάζονται διαδοχικά 4

5 με ρυθμό περίπου 1 δείγματος ανά 19 δευτερόλεπτα (ή μία ταινία 8 κοιλοτήτων ανά περίπου 2½ λεπτά) από το Luminex, τα δείγματα ασθενών και επίσης το σύζευγμα πρέπει να προστίθενται στις μικροκοιλότητες με αυτόν το ρυθμό, ώστε να ελαχιστοποιείται η διακύμανση της ανάλυσης από εμπρός προς τα πίσω. Εάν οι οροί ελέγχου, τα δείγματα ή το σύζευγμα προστίθενται το καθένα ξεχωριστά, καθυστερήστε κάθε πρόσθεση των παραπάνω στην επόμενη μικροκοιλότητα κατά 19 δευτερόλεπτα. Εάν οι οροί ελέγχου, τα δείγματα ή το σύζευγμα προστίθενται 8 κάθε φορά σε μια ταινία, καθυστερήστε κάθε πρόσθεση οποιουδήποτε από αυτά στην επόμενη ταινία κατά 2 ½ λεπτά. Καθένα από αυτά τα χρονικά σχήματα χρειάζεται περίπου 30 λεπτά για την πρόσθεση των δειγμάτων και στις 12 ταινίες μιας ολόκληρης πλάκας και ελαχιστοποιεί τη διακύμανση της ανάλυσης από εμπρός προς τα πίσω. 4. Περιδινίστε και στη συνέχεια προσθέστε 50μL από καθέναν από τους εξής προαραιωμένους ορούς ελέγχου: Το QUANTA Plex Negative Control στο πρώτο μικροπηγαδάκι, το ANCA Profile χαμηλό θετικό στο δεύτερο και τρίτο μικροπηγαδάκι και το ANCA Profile υψηλός θετικός στο τέταρτο μικροπηγαδάκι. Κατά τη χειροκίνητη πρόσθεση δειγμάτων και ανάμιξη κόμβων, πρέπει να χρησιμοποιείται ηλεκτρονική πιπέττα. Χρησιμοποιήστε μία από τις χρονικές ακολουθίες για την πρόσθεση των ορών ελέγχου που περιγράφεται στο βήμα 3. Ανακινήστε έντονα με πιπέττα τουλάχιστον 30μL του QUANTA Plex Negative Control και του ANCA Profile χαμηλού θετικού και υψηλού θετικού πάνω-κάτω τέσσερις φορές για να αναμίξετε τους κόμβους και τους ορούς ελέγχου σε κάθε μικροκοιλότητα. Η περίοδος επώασης των 30 λεπτών αρχίζει μετά την πρόσθεση του QUANTA Plex Negative Control στην πρώτη μικροκοιλότητα. 5. Αμέσως συνεχίστε την ανάλυση προσθέτοντας 5μL αραιωμένου ορού ασθενούς στις κατάλληλες μικροκοιλότητες (σημειώστε: αυτό δίνει 1:1010 τελική αραίωση του ορού ασθενούς). Διατηρήστε την ίδια χρονική ακολουθία που χρησιμοποιήθηκε στο βήμα 4. Αναμίξτε το αραιωμένο δείγμα ασθενούς και το HRP αραιωτικό δείγματος στην μικροκοιλότητα ανακινώντας έντονα με πιπέττα τουλάχιστον 30μL του περιεχομένου της μικροκοιλότητας πάνω-κάτω τέσσερις φορές. Προσθέστε 50 μl του προαραιωμένου ANCA Profile χαμηλού θετικού στην κατάλληλη μικροκοιλότητα μετά την πρόσθεση του τελευταίου δείγματος ασθενούς και αναμίξτε όπως παραπάνω. Συνεχίστε να χρονομετράτε την επώαση για 30 λεπτά από το χρόνο της πρόσθεσης του QUANTA Plex Negative Control. Τοποθετήστε τις ταινίες μικροκοιλοτήτων σε θερμοκρασία δωματίου, σε επίπεδη επιφάνεια και μακριά από άμεσο ηλιακό φως για το υπόλοιπο της περιόδου επώασης. 6. Στο τέλος της πρώτης περιόδου επώασης, προσθέστε 50μL του φθορίζοντος συζεύγματος σε κάθε μικροκοιλότητα και ανακινήστε με πιπέττα τουλάχιστον 60μL του περιεχομένου της μικροκοιλότητας πάνω-κάτω τέσσερις φορές. Διατηρήστε την ίδια χρονική ακολουθία για την πρόσθεση του συζεύγματος που χρησιμοποιήθηκε στα βήματα 4 και 5. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρείται από τη φιάλη υπό τυπικές ασηπτικές συνθήκες και ακολουθώντας καλές εργαστηριακές τεχνικές. Αφαιρείτε από τη φιάλη μόνο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΓΙΑ ΝΑ ΑΠΟΦΥΓΕΤΕ ΤΗΝ ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΠΟΤΕ ΜΗΝ ΕΠΙΣΤΡΕΦΕΤΕ ΜΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΜΕΝΟ ΣΥΖΕΥΓΜΑ ΣΤΗ ΦΙΑΛΗ. Επωάστε τις ταινίες μικροκοιλοτήτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, σε επίπεδη επιφάνεια και μακριά από άμεσο ηλιακό φως. Ο χρόνος επώασης αρχίζει μετά από την πρώτη πρόσθεση συζεύγματος. 7. Εντός μίας ώρας από την ολοκλήρωση της επώασης φθορίζοντος συζεύγματος διάρκειας 30 λεπτών, διαβάστε την πλάκα ANCA Profile στο Luminex, όπως περιγράφεται στο παραπάνω τμήμα Χρήση του Συσκευή ανάλυσης ροής Luminex. Ποιοτικός έλεγχος 1. Το ANCA Profile χαμηλό θετικό (εις διπλούν), το ANCA Profile υψηλός θετικός και QUANTA Plex Negative Control πρέπει να χρησιμοποιούνται με κάθε παρτίδα δειγμάτων, ώστε να διασφαλίζεται ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες έχουν διενεργηθεί σωστά. 2. Σημειώστε ότι επειδή το ANCA Profile χαμηλό και υψηλό θετικό και ο QUANTA Plex Negative Control ελέγχου είναι προαραιωμένα, δεν επηρεάζουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με τις αραιώσεις των δειγμάτων. 3. Μπορεί να απαιτείται η ανάλυση πρόσθετων ορών ελέγχου, σύμφωνα με τις οδηγίες ή τις απαιτήσεις των τοπικών ή/και εθνικών διατάξεων ή των οργανισμών διαπίστευσης. Πρόσθετοι κατάλληλοι οροί ελέγχου μπορούν να ανασυσταθούν διαιρώντας σε υποπολλαπλάσια δείγμα ανθρώπινου ορού πολλαπλών δοτών και αποθηκεύοντάς το σε θερμοκρασία < -20 C. 4. Για να θεωρούνται έγκυρα τα αποτελέσματα της δοκιμασίας, πρέπει να τηρούνται όλα τα κριτήρια που παρατίθενται παρακάτω. Σε περίπτωση μη τήρησης κάποιου από αυτά, η δοκιμασία πρέπει να θεωρηθεί άκυρη και η ανάλυση να επαναληφθεί. Η τιμή σε Luminex Units (LU) του χαμηλού θετικού για κάθε αντιγόνο αναγράφεται στην ετικέτα του κουτιού για το συγκεκριμένο κιτ. Ανατρέξτε στον τύπο στο τμήμα Υπολογισμός των αποτελεσμάτων, για 5

6 να καθορίσετε τις LU του QUANTA Plex Negative Control και ANCA Profile υψηλός θετικός. α. Η τιμή του QUANTA Plex Negative Control πρέπει να είναι < 20 LU για MPO και PR3. Πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 10 και 40 LU τόσο για τον κόμβο ελέγχου IgA όσο και για τον αντι-igg. β. Η τιμή του ANCA Profile High Positive (Διάλυμα υψηλού θετικού προφίλ) πρέπει να βρίσκεται μεταξύ 100 και 300 LU για MPO και PR-3. Πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 10 και 50 LU για τον αντι-iga. γ. Ο κόμβος ελέγχου αντι-igg σκοπό έχει να διασφαλίσει την ανίχνευση τυχόν ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων ασθενούς λόγω λειτουργικών σφαλμάτων. Εάν ο κόμβος ελέγχου αντι-igg έχει υπολογισμένο αποτέλεσμα μικρότερο από 3.0 LU για έναν συγκεκριμένο ασθενή, εμφανίζεται το αποτέλεσμα Retest (Επανάληψη δοκιμασίας) στην έκδοση λογισμικού IS 2.0 και ανώτερη. Υπάρχει πιθανότητα να μην προστέθηκε στην κοιλότητα ορός ασθενούς ή/και σύζευγμα. Σε αυτήν την περίπτωση, πρέπει να επαναληφθεί η δοκιμασία του ασθενούς, για να επιβεβαιωθεί το αρνητικό αποτέλεσμα. 5. Ο QUANTA Plex Negative Control και το ANCA Profile χαμηλό και υψηλό θετικό προορίζονται για την ανίχνευση της περίπτωσης σημαντικής αστοχίας του αντιδραστηρίου. Ο χρήστης πρέπει να ανατρέξει στο CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document C24-A3 για πρόσθετες οδηγίες σχετικά με τις κατάλληλες πρακτικές ελέγχου ποιότητας. 6. Εάν το επιθυμείτε, μπορεί να αναλυθεί ένα πηγαδάκι με αραιωτικό δείγματος αλλά όχι ορό, για να επιβεβαιωθεί ότι ο κόμβος ελέγχου αντι-igg θα ανιχνεύσει ένα πηγαδάκι χωρίς ορό. Αυτό το ελεύθερο ορού διάλυμα ελέγχου πρέπει να είναι < 3.0 LU στον αντι-igg κόμβος ελέγχου και αρνητικό σε όλους τους άλλους κόμβους. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Πρώτα προσδιορίζονται οι τιμές MFI για όλους τους ορούς ελέγχου και τα δείγματα ασθενούς για κάθε αντιγόνο. Η αντιδραστικότητα σε LU ενός δεδομένου δείγματος για κάθε τύπο αντιγόνου μπορεί στη συνέχεια να υπολογιστεί μέσω του ακόλουθου τύπου. Διαιρέστε το MFI του δείγματος δια το MFI του ANCA Profile χαμηλού θετικού για το συγκεκριμένο αντιγόνο και πολλαπλασιάστε το αποτέλεσμα επί τον αριθμό LU που έχει εκχωρηθεί στο ANCA Profile χαμηλό θετικό γι αυτό το αντιγόνο. Η τιμή LU του χαμηλού θετικού για κάθε αντιγόνο αναγράφεται στην ετικέτα του κουτιού για τη συγκεκριμένη παρτίδα κιτ. Το ακόλουθο παράδειγμα προορίζεται για τον προσδιορισμό της αντιδραστικότητας αντι-mpo. Χρησιμοποιήστε την ισοδύναμη σύνθεση για το αντιγόνο PR-3 και κόμβος ελέγχου αντι-igg. MFI δείγματος για MPO Τιμή δείγματος (σε LU) = x τιμή MPO χαμηλού θετικού (σε LU) MFI MPO χαμηλού θετικού Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να ταξινομηθεί σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. LU Αρνητικό <20 Ασθενές θετικό Μέτριο θετικό Ισχυρό θετικό >100 Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα αυτοαντισώματος που είναι παρούσα στον κόμβο με μη γραμμικό τρόπο. Ενώ αυξήσεις και μειώσεις στις συγκεντρώσεις αντισώματος ασθενούς αντικατοπτρίζονται σε αντίστοιχη αύξηση ή μείωση στη δραστηριότητα φθορισμού, η μεταβολή δεν είναι ανάλογη (δηλ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης αντισώματος δε διπλασιάζει την αντιδραστικότητα). Επιπρόσθετα, η ποσότητα ολικής IgG στον ορό του ασθενούς επηρεάζει το μετρούμενο MFI. Εάν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση του αυτοαντισώματος του ασθενούς, το δείγμα πρέπει να αναλύεται με ποσοτική δοκιμασία. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Το FIA είναι πολύ ευαίσθητο στην τεχνική και είναι ικανό να ανιχνεύει μικρές διαφορές σε πληθυσμούς ασθενών. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθιερώσει το δικό του εύρος φυσιολογικών τιμών με βάση τις δικές του τεχνικές, ορούς ελέγχου, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις εσωτερικές καθιερωμένες διαδικασίες του εργαστηρίου. Συνιστάται τα αποτελέσματα που δίνονται από το εργαστήριο να περιλαμβάνουν τη δήλωση: Τα ακόλουθα αποτελέσματα ελήφθησαν με χρήση του INOVA QUANTA Plex TM ANCA Profile. Τιμές που λαμβάνονται με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών ενδέχεται να μην μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων αυτοαντισώματος IgG δεν μπορεί πάντοτε να συσχετίζεται με έναν τίτλο τελικού σημείου. 6

7 Όρια της Διαδικασίας 1. Η παρουσία άνοσων συμπλόκων ή άλλων συσσωρευμάτων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενούς μπορεί να προκαλέσει αυξημένο επίπεδο μη ειδικής δέσμευσης και να παράγει ψευδή θετικά στη συγκεκριμένη ανάλυση. 2. Δεν εμφανίζουν όλοι οι ασθενείς αγγειίτιδας θετικό αποτέλεσμα για αυτοαντισώματα MPO ή PR Η ανάλυση αυτή δεν ανιχνεύει τα επονομαζόμενα άτυπα ANCA, που είναι γνωστά και ως IBD ή ANCA φλεγμονώδους εντέρου. Το αντιγόνο αυτό δεν είναι χαρακτηρισμένο σήμερα. Αυτό το αυτοαντίσωμα μπορεί να ανιχνευτεί χρησιμοποιώντας τυπικές αντικειμενοφόρους πλάκες με υπόστρωμα ανθρώπινων ουδετερόφιλων κυττάρων, σταθεροποιημένες με αιθανόλη και φορμόλη σε ένα σύστημα εξέτασης ανοσοφθορισμού. 4. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες οροδιαγνωστικές δοκιμασίες. 5. H ατελής ανάμειξη των ορών ελέγχου ή/και των αραιωμένων δειγμάτων ορού με τους διατηρημένους κόμβους στην πλάκα μπορεί να δώσει υψηλότερες τιμές %C.V. από εκείνες που απαντώνται τυπικά σε αναλύσεις ELISA. 6. Μετά από την περίοδο επώασης μισής ώρας με το φθορίζον σύζευγμα, υπάρχει μια περίπου 10% περαιτέρω αύξηση στο φθορισμό για κάθε πρόσθετη μισή ώρα χρόνου επώασης. 7. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης αυτής της ανάλυσης δεν έχουν τεκμηριωθεί για μήτρες διαφορετικές από ορό. 8. Η μη τήρηση ακρίβειας των χρόνων πρόσθεσης του αντιδραστηρίου μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη διακύμανση της ανάλυσης από εμπρός προς τα πίσω. Αναμενόμενες τιμές Η ικανότητα της δοκιμασίας QUANTA Plex TM ANCA Profile να ανιχνεύει αντισώματα MPO και PR-3 αξιολογήθηκε σε σύγκριση με εμπορικά διαθέσιμες δοκιμασίες ELISA από την INOVA Diagnostics, Inc. Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών ELISA και καθεμίας από τις δοκιμασίες QUANTA Plex ANCA Profile καθορίστηκαν ως θετικά εάν το δείγμα του ασθενούς ήταν 20 μονάδες ή υψηλότερο και αρνητικά εάν ήταν χαμηλότερο από 20 μονάδες. Εύρος φυσιολογικών τιμών Εκτελέστηκαν 256 δείγμα από υγιείς αιμοδότες με την εξέταση QUANTA Plex ANCA Profile. Και τα 256 υγιή δείγματα, πλην ενός, (99.6%) ήταν αρνητικά στο σκέλος MPO της εξέτασης QUANTA Plex. Το υψηλότερο δείγμα έδωσε τιμή 56 LU. Εξαιρουμένου του ενός θετικού δείγματος, η μέση τιμή ήταν 2.6 LU με τυπική απόκλιση (SD) 1.8. Η τιμή αποκλεισμού είναι 9.6 SD υψηλότερη του μέσου όρου. Ωστόσο, και τα 256 υγιή δείγματα, πλην τριών, (98.8%) ήταν αρνητικά στο σκέλος PR- 3 της εξέτασης QUANTA Plex ANCA Profile. Το υψηλότερο δείγμα έδωσε τιμή 100 LU. Ένα από τα άλλα δείγματα ήταν επίσης θετικό στην ανάλυση ELISA PR-3. Εξαιρουμένων των τριών θετικών δειγμάτων, η μέση τιμή ήταν 2.1 LU με τυπική απόκλιση (SD) 2.5. Η τιμή αποκλεισμού είναι 7.2 SD υψηλότερη του μέσου όρου. Σύγκριση μεταξύ αναλύσεων QUANTA Plex και ELISA Για τον προσδιορισμό της σχετικής ευαισθησίας και ειδικότητας των αναλύσεων, εξετάστηκαν με την τεχνική QUANTA Plex ANCA Profile και 2 αντίστοιχες τεχνικές ELISA 327 δείγματα που περιείχαν αντισώματα μεγάλης ποικιλίας αντιγόνων. Τα δείγματα αυτά περιελάμβαναν 237 δείγματα που απεστάλησαν για αξιολόγηση ANCA στην INOVA Technical Services, 7 ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, 16 ασθενείς με μολυσματικές νόσους και 67 με άτυπα ANCA. n=327 INOVA ANCA Profile (MPO) MPO ELISA Αρνητικό θετικό 97.2% ίδια κατά Αρνητικό 247 6** θετικό 3* 71 *Ένα ήταν χαμηλό θετικό με την ανάλυση ELISA και έδωσε σχήμα canca με την ανάλυση IFA το οποίο είναι περισσότερο τυπικό για αντι-pr3 από ό,τι για αντι-mpo. Δύο δείγματα ήταν χαμηλά θετικά με την ανάλυση ELISA, υψηλά αρνητικά με την ανάλυση Luminex (17 LU) και έδωσαν σχήμα panca το οποίο είναι τυπικό για αντι-mpo. **Τέσσερα δείγματα ήταν χαμηλά θετικά με την ανάλυση Luminex, υψηλά αρνητικά με την ανάλυση ELISA και έδωσαν σχήμα panca το οποίο είναι τυπικό για αντι-mpo. Ένα ήταν χαμηλό θετικό με την ανάλυση Luminex, υψηλό αρνητικό με την ανάλυση ELISA και δίνει άτυπο σχήμα ANCA με την ανάλυση IFA. Ένα ήταν αρνητικό για ANCA με την ανάλυση IFA. n=327 INOVA ANCA Profile (PR-3) PR-3 ELISA Αρνητικό θετικό 97.2% ίδια κατά Αρνητικό 212 8** θετικό 1* 106 7

8 *Αυτό το δείγμα είναι μετρίως θετικό με την ανάλυση ELISA, υψηλό αρνητικό με την ανάλυση Luminex και αρνητικό με την ανάλυση ANCA IFA. **Δύο δείγματα ήταν μετρίως θετικά με την ανάλυση Luminex, υψηλά αρνητικά με την ανάλυση ELISA και αρνητικά με την ανάλυση ANCA IFA. Δύο δείγματα ήταν χαμηλά ή μετρίως θετικά με την ανάλυση Luminex, υψηλά αρνητικά με την ανάλυση ELISA και θετικά για panca με την ανάλυση IFA, περισσότερο συναφή με αντι-mpo από ό,τι με αντι-pr-3. Δύο δείγματα ήταν θετικά με την ανάλυση Luminex και canca με την IFA, συναφή με αντι-pr3. Δύο δείγματα ήταν άτυπα ANCA με την ανάλυση IFA. Ευαισθησία και Ειδικότητα Όλα τα παραπάνω δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της σχετικής ευαισθησίας κάθε εξέτασης QUANTA Plex σε σύγκριση με την αντίστοιχη ανάλυση ELISA. Όλα τα Και τα Και τα ELISA αρν. ELISA θετ. Σχετική ευαισθησία Σχετική ειδικότητα Ποσοστό δείγματα N=583 δύο αρν. δύο θετ. Q.Plex θετ. Q.Plex αρν. (95% Διάστημα Εμπιστοσύνης) (95% Διάστημα Εμπιστοσύνης) συμφωνίας MPO % ( %) 98.6% ( %) 98.3% PR % ( %) 98.1% ( %) 98.1% Ακρίβεια και επαναληψιμότητα Διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων και εντός της ανάλυσης. Για τον προσδιορισμό της διααναλυτικής διακύμανσης αναλύθηκαν αρκετά δείγματα σε 5 εξετάσεις που εκτελέστηκαν σε 4 διαφορετικές ημέρες. Η διακύμανση σε τρία διαφορετικά δείγματα για κάθε ειδικότητα εξέτασης αναφέρεται στον παρακάτω πίνακα. Για τον προσδιορισμό της ενδο-αναλυτικής διακύμανσης, αναλύθηκαν αρκετά δείγματα 10 φορές το κάθε ένα σε μια ανάλυση. Η διακύμανση σε τρία διαφορετικά δείγματα για κάθε ειδικότητα εξέτασης αναφέρεται στον παρακάτω πίνακα. Διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων Διακύμανση εντός της ανάλυσης AΑντιγόνο Μέση τιμή LU Αντιγόνο Μέση τιμή LU Αντιγόνο Μέση τιμή LU MPO 24 14% MPO 26 10% MPO 63 15% MPO 62 5% MPO 183 7% MPO 161 5% PR % PR % PR % PR % PR % PR % 8

9 Βιβλιογραφία 1. Goeken JA, Antineutrophil cytoplasmic antibody - a useful serological marker for vasculitis. J Clin Immunol 11: , Specks U, et al., Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow-up of Wegener s granulomatosis. May Clin Proc 64:28-36, van der Woude FJ, et al., Autoantibodies against neutrophils and monocytes: tools for diagnosis and marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet , Cohen-Tervaert JW, et al., Association between active Wegener s granulomatosis and anticytoplasmic antibodies. Arch Intern Med 149: , Cambridge, et al., Antineutrophil antibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 33: , Nolle, B, et al., Anticytoplasmic autoantibodies: their immunodiagnostic value in Wegener s granulomatosis. Ann Int Med 111:28-40, Cohen-Tervaert JW, et al., Association of autoantibodies to myeloperoxidase with different forms of vasculitis. Arth & Rheum 33(8): , Cohen-Tervaert JW, et al., Autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 37: , Falk RJ, Jenette JC, Anti neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis. N Engl J Med 318: , Cohen-Tervaert JW, et al., Detection of autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes: a useful adjunct to classification of patients with biopsy proven necrotizing arteritis. Am J Med 91:59-66, Martins TB, Burlingame R, von Muhlen CA, Jaskowski TD, Litwin CM and Hill HR. Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens. Clin Diagn Lab Immunol 11: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service February 2008 Revision GRC1 9