QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Cell Antibody) ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Cell Antibody) ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM GPA αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) χρησιμοποιείται για την ημιποσοτική ανίχνευση των GPA (γαστρικών βρεγματικών κυτταρικών (Η+\Κ+) ATPase αντισωμάτων IgG στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλα ορολογικά τεστ και κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές εξετάσεις για να βοηθήσουν στην διάγνωση των περιπτώσεων με ανεβασμένα επίπεδα των αντι-γαστρικών βρεγματικών κυτταρικών (Η+\Κ+) ATPase αντισωμάτων συμπεριλαμβανομένης της κακοήθους αναιμίας. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η κακοήθης αναιμία είναι μια χρόνια ασθένεια, όπως επίσης και το τελικό στάδιο της χρόνιας ατροφικής γαστρίτιδας τύπου Α (αυτοάνοσης). Η χρόνια ατροφική γαστρίτιδα τύπου Α επηρεάζει τον βυθό και το σώμα του στομάχου, ενώ η τύπου Β (μη-άνοση) επηρεάζει την κοιλότητα μαζί με τον πυθμένα και το σώμα. Η τύπου Α σχετίζεται με την κακοήθη αναιμία και η τύπου Β με την μόλυνση Helic. Pylori. 1-3 Κατά την διάρκεια της πορείας της χρόνιας ατροφικής γαστρίτιδας τύπου Α σε γαστρική ατροφία, καταστρέφονται τα γαστρικά βρεγματικά κύτταρα, τα οποία παράγουν ενδογενείς παράγοντες και HCl, και εξαφανίζεται η παραγωγή του ενδογενή παράγοντα και του HCl. Ο ενδογενής παράγοντας είναι απαραίτητος για την απορρόφηση της βιταμίνης Β 12 από το έντερο και η απουσία του οδηγεί σε ανεπάρκεια της βιταμίνης Β 12 και σε μεγαλοπλαστική αναιμία. Η έναρξη της κακοήθους αναιμίας είναι τυπικά αργή με την πρόοδο από χρόνια ατροφική γαστρίτιδα σε γαστρική ατροφία και κλινική αναιμία που διαρκεί χρόνια. Η μεσαία ηλικία στη διάγνωση είναι τα 60 χρόνια. Παρόλο που η ασθένεια συχνά δεν αναγνωρίζεται μέχρις ότου η αναιμία ή άλλα συμπτώματα γίνουν εμφανή, οι υποβόσκουσες γαστρικές αλλοιώσεις μπορούν να αναγνωριστούν χρόνια προτού αναπτυχθεί η αναιμία. 3,4 Παρατηρείται μια αυξημένη συχνότητα των αυτοάνοσων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του αυτοάνοσου θυρεοειδούς (θυρεοειδής του Hashimoto), του διαβήτη τύπου 1, της ασθένειας του Addison, της ασθένειας του Grave (εξόφθαλμος βρογχοκήλη) και της σοβαρής μυασθένειας, σε ασθενείς με κακοήθη αναιμία. Έχει αναφερθεί ότι οι ασθενείς με κακοήθη αναιμία έχουν ένα αυξημένο ποσοστό 3x για γαστρικό καρκίνωμα και ένα αυξημένο ποσοστό 13x γαστρικού καρκινοειδούς του εντέρου. 5 Γαστρικά βρεγματικά κυτταρικά αντισώματα βρίσκονται στο 90% περίπου των ασθενών με κακοήθη αναιμία και στο 30% περίπου των συγγενών πρώτου βαθμού των ασθενών με κακοήθη αναιμία. 1-3 Τα αντισώματα (GPA) ανιχνεύονται συνήθως με έμμεσο ανοσοφθορισμό (IFA) χρησιμοποιώντας περιοχές ιστών από γαστρικό βλεννογόνο υμένα τρωκτικού. 2 Τα GPA αντισώματα κατευθύνονται προς το συνδεδεμένο με μεμβράνη αντιγόνο στον εκκριτικό πόρο (secretory canaliculi) και στο κυστίδιο (tubulovesicles) των γαστρικών βρεγματικών κυττάρων. 6 Ο στόχος αντιγόνου του GPA έχει αναγνωριστεί ως το γαστρικό Η+\Κ+ ATPase (γαστρική πρωτονιακή αντλία), το οποίο είναι υπεύθυνο για την οξεοποίηση του στομαχικού αυλού Το GPA συνδέεται και με την α και με τη β υπομονάδα του Η+\Κ+ ATPase. 9 Η συχνότητα της νόσου του GPA αυξάνει με την ηλικία και έχει αναφερθεί στο 2.5% ενός φυσιολογικού πληθυσμού ηλικίας χρόνων και στο 9.6% ενός πληθυσμού στην 8 η δεκαετία τους 3. Μια πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι η συχνότητα της νόσου του GPA και της σχετιζόμενης αυτοάνοσης γαστρικής ασθένειας υπάρχει στους διαβητικούς του τύπου 1 και υποδεικνύει σαφώς ότι οι διαβητικοί ασθενείς με αναιμία και\ή γαστρεντερικά συμπτώματα θα πρέπει να εξετάζονται για GPA. 12 Υψηλά επίπεδα του GPA έχουν βρεθεί σε ασθενείς με νόσο θυρεοειδούς, αναιμία στερητική σιδήρου, γυροειδή αλωπεκία, λεύκη (δερματοπάθεια). 13,14 Η ανίχνευση του GPA με τη μέθοδο IFA είναι ευαίσθητη στο εργαστήριο, απαιτεί υποκειμενική ερμηνεία των αποτελεσμάτων από εκπαιδευμένο προσωπικό, και υπόκειται στην ικανότητα της προσαρμογής στην ποιότητα και αναπαραγωγικότητα των τμημάτων των ιστών που χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευαστούν τα πλακάκια της μεθόδου IFA. Με την αναγνώριση των γαστρικών Η+\Κ+ ATPase α και β υπομονάδων ως κύριους μοριακούς στόχους των γαστρικών βρεγματικών κυτταρικών αυτοαντισωμάτων, έχουν δημιουργηθεί ευαίσθητες και συγκεκριμένες δοκιμασίες ELISA για την ανίχνευση των αντισωμάτων GPA. 15 Η χρήση της ELISA επιτρέπει τα τυποποιημένα, επαναληψιμα και αντικειμενικά αποτελέσματα της ανάλυσης για το GPA. Αρχη Μεθοδου Τα συγγενικά κεκκαθαρμένα Η+\Κ+ ATPase αντιγόνα είναι συνδεδεμένα σε πηγαδάκια μικροπλάκας πολυστερίνης κάτω από συνθήκες που θα συγκρατήσουν το αντιγόνο στην φυσική του κατάσταση. Έτοιμοι πρότυποι οροι (control ) και αραιωμένος ορός ασθενούς προσθέτονται σε ξεχωριστά πηγαδάκια επιτρέποντας έτσι το όποιο Η+\Κ+ ATPase, αντίσωμα που υπάρχει να προσκολλήσει στο ακινητοποιημένο αντιγόνο κατά την πρώτη επώαση. Το υπόλοιπο του δείγματος ξεπλένεται και ένα ένζυμο από σεσημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (conjugate) αντίσωμα που προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο να συνδεθεί με όποιο αντίσωμα του ασθενούς έχει προσκολληθεί στο υπόστρωμα του πηγαδιού. Με το δεύτερο ξέπλυμα των μη συνδεδεμένων συζυγών ενζύμων (conjugate), η υπόλοιπη ενζυματική δραστηριότητα μετριέται με την πρόσθεση ενός χρωστικού διαλύματος (chromogen) μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσεται. Η επεξεργασία μπορεί να κριθεί με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια μαρτύρων (control). Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο Η+\Κ+ ATPase (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα Η+\Κ+ ATPase) 1

2 3. GPA ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Η+\Κ+ ATPase, προαραιωμένο, 1.2ml 4. GPA ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Η+\Κ+ ATPase, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. 2

3 Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 GPA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2mL αραιωμένος GPA ELISA High Υψηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος GPA ELISA Low Χαμηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής 3

4 πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Το GPA ELISA (Low Positive), το GPA ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το GPA ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το GPA ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου GPA ELISA High Positive πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου GPA ELISA Low Positive, του οποίου η απορροφητικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από αυτή του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control. Β. Το προ-αραιωμένο GPA ELISA High Positive πρέπει να έχει O.A. μεγαλύτερο από 1.0, ενώ η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από το 0.2. γ. Η απορροφητικότητα του GPA ELISA Low Positive πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA Negative Control ή πάνω από δ. Το ELISA Negative Control και το GPA ELISA High Positive έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. To GPA ELISA High Positive δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο NCCLS Document C24-A για επιπλέον οδηγίες. 17 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του GPA ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του GPA ELISA Low. Η τιμή του GPA ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X GPA oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. GPA ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η δοκιμασία ELISA είναι πολύ ευαίσθητη τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει τα δικά του όρια βασισμένα πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να ταξινομηθεί ως αρνητικό (για αντίσωμα IgG σε GPA), αμφίβολο ή θετικό (ανιχνεύθηκε αντίσωμα IgG σε GPA) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: 4

5 Μονάδες Αρνητικό Αμφίβολο Θετικό >25 Τα αμφίβολα δείγματα πρέπει να αναλύονται ξανά πριν την αναφορά των αποτελεσμάτων. 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα φανερώνει την παρουσία των αντισωμάτων τηςgpa και προτείνει την πιθανότητα κακοήθους αναιμίας η σχετικής νόσου. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα φανερώνει την έλλειψη των αντισωμάτων της GPA ή των επιπέδων υπό την αρνητική αποκοπή της ανάλυσης. 3. Δείγμα με αμφίβολο αποτέλεσμα δέν εκτιμώνται.εάν παραμένει αμφίβολο μετα απο επανάληψη τότε θα χαρακτηρισθει αμφίβολο η θα επαναληφθεί με νέο δείγμα. 4. Συνιστάται τα αποτελέσματα που βγαίνουν από το εργαστήριο να περιλαμβάνουν την εξής δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα αποκτήθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite TM GPA ELISA. Οι τιμές GPA που αποκτήθηκαν με διαφορετικές μεθόδους ανάλυσης του κατασκευαστή μπορεί να μην χρησιμοποιηθούν αμοιβαία. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgG δεν μπορούν να συσχετιστούν με την τελευταία τιτλοποίηση.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων συσσωρευμάτων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο από μη-συγκεκριμένο δέσιμο και να παράγει ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα για Γαστρικό Βρεγματικό Κυτταρικό Αντίσωμα δεν αποκλείει την ύπαρξη της κακοήθους αναιμίας. 3. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα GPA δεν αποκλείει την παρουσία του GPA, επειδή η συμπύκνωση του αντισώματος μπορεί να είναι κάτω από το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης. 4. Ένα θετικό αποτέλεσμα της ανάλυσης δείχνει μόνο την παρουσία του αντισώματος στο Η+\Κ+ ATPase και δεν δείχνει, απαραίτητα, την παρουσία της αυτοάνοσης ή άλλης ασθένειας. 5. Η διαδικασία της ανάλυσης δεν ισχύει για παιδιατρικούς ασθενείς. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 7. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης δεν ισχύουν για άλλα καλούπια εκτός από ορό. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα της μεθόδου QUANTA Lite TM GPA ELISA να ανιχνεύει τα αντισώματα H+\K+ ATPase εκτιμήθηκε μετά από σύγκριση με ένα τεστ Η+\Κ+ ATPase ELISA kit που κυκλοφορεί στο εμπόριο. Ολοκληρώθηκε, επίσης, μια σύγκριση των αποτελεσμάτων που επιτεύχθηκαν με τη μέθοδο της QUANTA Lite TM GPA ELISA και με μια ανάλυση έμμεσου ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας μέρη από νεφρό \ιστό στομάχου ποντικού. Η συχνότητα της νόσου του GPA σε υγιείς κανονικούς πληθυσμούς αυξάνει με την ηλικία από 2.5% περίπου στην τρίτη δεκαετία έως 9.6% στην ογδόη δεκαετία. Η συχνότητα της GPA είναι γενικά υψηλότερη στις γυναίκες από ότι στους άνδρες. Για τους άνδρες ηλικίας κάτω των 55 χρόνων, το 5.5% ήταν θετικό για GPA σε σύγκριση με το 14.7% των γυναικών. Για άτομα άνω των 55 χρόνων, το 9.2% των ανδρών και το 22.3% των γυναικών είχαν GPA. 4 Φυσιολογικές Tιμές Ένας συνδυασμένος κατάλογος 210 δειγμάτων από υγιή άτομα χωρίς συμπτώματα εξετάστηκε με τη μέθοδο QUANTA Lite TM GPA ELISA kit. Οι ηλικίες κλιμακώνονταν από 17 έως 77 (μέση ηλικία 32). Από τα 210 δείγματα, τα 154 (73.3%) ήταν από αρσενικά άτομα και τα 56 (26.7%) από θηλυκά άτομα. Η μέση τιμή ήταν 7.3 μονάδες με μια κλίμακα από 1.3 έως 84.1 μονάδες. Δύο από τα 7 θετικά δείγματα της GPA ήταν θετικά GPA IFA. Εξαιρώντας 4 ισότιμα αποτελέσματα, η μέθοδος αποδείχτηκε με ακρίβεια 96.6% (199/206). Ευαισθησία και Ειδικότητα Τα αποτελέσματα από την εξέταση 20 δειγμάτων ασθενών με κακοήθη αναιμία με τη μέθοδο QUANTA Lite TM GPA ELISA και ενός βεβαιωμένου GPA ELISA kit φαίνονται στον Πίνακα 1. Σύγκριση των αποτελεσμάτων που επιτεύχθηκαν με τη μέθοδο IFA χρησιμοποιώντας νεφρό ποντικού\slides στομάχου σε αυτό τον κατάλογο φαίνονται στον Πίνακα 2. Ο Πίνακας 3 απεικονίζει συγκρινόμενα αποτελέσματα της QUANTA Lite TM GPA ELISA και του βεβαιωμένου GPA ELISA kit σε ένα κατάλογο από 41 δείγματα. Πίνακας 1: Αποτελέσματα με QUANTA Lite TM GPA (Γαστρικό Βρεγματικό Αντίσωμα) και Βεβαιωμένο GPA ELISA σε κατάλογο για ασθενή με κακοήθη αναιμία ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ QUANTA Lite TM GPA ELISA βεβαιωμένου GPA N=20 ELISA Θετικά (15) Αμφίβολα (0) Αρνητικά (5) Θετικά Θετικά (14) Αμφίβολα Ισότιμα (5) Αρνητικά Αρνητικά (1) Συμφωνία (εκτός από τα αμφίβολα αποτελέσματα): 100% (15/15) 5

6 Πίνακας 2: Αποτελέσματα με QUANTA Lite TM GPA ELISA και ΑΝΑ (νεφρό \στομάχι ποντικού) IFA σε κατάλογο για ασθενή με κακοήθη αναιμία ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ QUANTA Lite TM GPA ELISA GPA IFA N=20 Θετικά (15) Αμφίβολα (0) Αρνητικά (5) Θετικά Θετικά (15) Αμφίβολα Ισότιμα (0) Αρνητικά Αρνητικά (5) Συμφωνία: 100% (20/20) Πίνακας 3: Αποτελέσματα με QUANTA Lite TM GPA (Γαστρικό Βρεγματικό Αντίσωμα) και Βεβαιωμένο GPA ELISA σε δείγματα που υποβλήθηκαν σε εξέταση GPA ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ QUANTA Lite TM GPA ELISA βεβαιωμένου GPA N=41 ELISA Θετικά (19) Αμφίβολα (2) Αρνητικά (20) Θετικά Θετικά (22) Αμφίβολα Ισότιμα (0) Αρνητικά Αρνητικά(19) Συμφωνία (εκτός από τα αμφίβολα αποτελέσματα): 89.7% (35/39) Μελέτη Aληλεπίδρασης Εξετάστηκε ορός από ασθενείς με αντισώματα αυτοάνοσης ή μολυσματικής ασθένειας ή διάφορων κλινικών συνθηκών, συμπεριλαμβανομένων των: H. pylori (7), thyroid peroxidase (5), thyroid-m (5), thyroid-t (4), beta-2 glycoprotein (5), LKM-1 (5), autoimmune hepatitis type 1 (14), mitochondria M2 (4) για διασταυρωμένη αντιδραστικότητα με τη μέθοδο QUANTA Lite TM GPA ELISA. Ένα δείγμα H. pylori και 2 TPO ήταν θετικά με τη μέθοδο QUANTA Lite TM GPA ELISA. Αυτά τα 3 δείγματα ήταν επίσης θετικά για GPA με τη μέθοδο IFA. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Τα χαρακτηριστικά μεταξύ αναλύσεων για τη μέθοδο QUANTA Lite TM GPA ELISA αξιολογήθηκαν με την εξέταση 6 δειγμάτων, 9 φορές το καθένα στο σύνολο. Τα αποτελέσματα, που συνοψίζονται στον Πίνακα 4, δείχνουν την ακρίβεια της μεταξύ αναλύσεων. Πίνακας 4: Διαδικασία μεταξύ αναλύσεων για τη QUANTA Lite TM GPA ELISA Δείγμα Α Δείγμα Β Δείγμα C Δείγμα D Δείγμα E Δείγμα F Μέσες τιμές SD CV% Η διαδικασία της ενδοανάλυσης εκτιμήθηκε με την εξέταση, εις διπλούν, ενός καταλόγου από 5 δείγματα δύο φορές την ημέρα για 3 μέρες. Πίνακας 5: Διαδικασία της ενδοανάλυσης για την QUANTA Lite TM GPA ELISA Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Μέσες τιμές SD CV% Βιβλιογραφία 1. Gleeson PA and B-H Toh. Molecular Targets in Pernicious Anemia. Immunology Today 12(7): , Gleeson PA, Van Driel IR and B-H Toh. Parietal Cell Antibodies. In: Autoantibodies. Peter JB and Y Shoenfeld, eds., Elsevier Science B.V. pp , Toh B-H, Van Driel IR and PA Gleeson. Pernicious Anemia. N. Eng. J. Med. 37(20): , Lee GR. Pernicious Anemia and other causes of vitamin B12 (cobalamin) deficiency. In: Wintrobe s Clinical Hematology, 10 th ed, Williams & Wilkins, pp , Hsing AW, Hansson L-E, McLaughlin JK, et al. Pernicious anemia and subsequent cancer: a population-based cohort study. Cancer 71: , Hoedemaeker PJ and S Ito. Ultrastructural localization of gastric parietal cell antigen with peroxidasecoupled antibody. Lab. Invest. 22: , Burman P, Mardh S, Norberg L and FA Karlsson. Parietal cell antibodies in pernicious anemia inhibit H+/K+ -adenosine triphosphatase, the proton pump of the stomach. Gastroenterol. 96: , Toh B-H, Gleeson PA, Simpson RJ, et al. The 60- to 90 kda parietal cell autoantigen associated with autoimmune gastritis is a β subunit of the gastric H+/K+ ATPase (proton pump). PNAS 87: , Callagham JM, Khan MA, Alderuccio F, Van Driel IR, Gleeson PA and B-H Toh. α and β subunits of the gastric H+/K+ ATPase are concordantly targeted by parietal cell autoantibodies associated with autoimmune gastritis. Autoimmun. 16: , Ma JY, Borch K and S Mardh. Human gastric H,K-adenosine triphosphatase β-subunit is a major autoantigen in atrophic corpus gastritis. Expression of the recombinant human glycoprotein in insect cells. Scand. J. Gastroenterol. 29: ,

7 11. Claeys D, Galler G, Appelmelk BJ, Negrini R and T Kirchner. The gastric H+/K+-ATPase is a major autoantigen in chronic Helicobacter pylori gastritis with body mucosa atrophy. Gastroenterol. 115: , DeBlock CRM, DeLeeuw IH, Van Gaal LF and the Belgian Diabetes Registry. High prevalence of manifestations of gastric autoimmunity in parietal cell antibody-positive type 1 (insulin-dependent) diabetic patients. J. Clin. Endocrin. Metab. 84(1): , Mandry, RC, Ortiz LJ, Lugo-Somolinos A and JL Sanchez. Organ-specific autoantibodies in Vitiligo patients and their relatives. Int. J. Dermatol. 35(1): , Kumar B, Sharma VK and S Sehgal. Anti-smooth muscle and anti-parietal cell antibodies in Indians with alopecia areata. Int. J. Dermatol. 34(8): , Chuang JS, Callagham JM, Gleeson PA and B-H Toh. Diagnostic ELISA for parietal cell autoantibody using tomato lectin-purified gastric H+/K+-ATPase (proton pump). Autoimmun. 12:1-7, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). 17. National Committee for Clinical Laboratory Standards,1991. Internal Quality Control: Principles and Definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service June 2005 Revision GRC3 7