Dako EnVision+ System-HRP (AEC) Για χρήση µε Πρωτογενή Αντισώµατα Ποντικού. Κωδικός K ml Κωδικός K ml

Transcript

1 Dako EnVision+ System-HRP (AEC) Για χρήση µε Πρωτογενή Αντισώµατα Ποντικού Κωδικός K ml Κωδικός K ml Χρήση για την οποία προορίζεται Για διαγνωστική χρήση Ιn vitro. Οι οδηγίες αυτές απευθύνονται στο EnVision+ Σύστηµα- HRP (AEC) της Dako (Dako EnVision+ Σύστηµα, HRP). Το κιτ προορίζεται για χρήση µε πρωτογενή αντισώµατα από ποντικό που παρέχεται από το χρήστη για την ποιοτική ταυτοποίηση αντιγόνων µέσω οπτικής µικροσκοπίας σε φυσιολογικούς ιστούς και παθολογικούς ιστούς έγκλειστους σε παραφίνη, ιστούς κρυοστάτη ή κυτταρικά παρασκευάσµατα. Είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθούν ιστοί επεξεργασµένοι σε µια ποικιλία παραγόντων καθήλωσης, στους οποίους περιλαµβάνεται η αιθανόλη, B-5, Bouin s, φορµαλίνη ψευδαργύρου και φορµαλίνη σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα. Ανατρέξτε στις "Γενικές οδηγίες για Ανοσοϊστοχηµική χρώση" ή τις Οδηγίες Συστήµατος ανίχνευσης των διαδικασιών IHC για: (1) Αρχή της διαδικασίας, (2) Υλικά που απαιτούνται, εν παρέχονται, (3) Φύλαξη, (4) Παρασκευή δειγµάτων, (5) ιαδικασία Χρώσης, (6) Ποιοτικό έλεγχο, (7) Επίλυση προβληµάτων (8) Ερµηνεία χρώσης,(9) Γενικούς περιορισµούς. Περίληψη και επεξήγηση Το EnVision+ Σύστηµα, HRP είναι µια τεχνική χρώσης IHC δύο βηµάτων. Το σύστηµα αυτό βασίζεται σε ένα επισηµασµένο πολυµερές HRP το οποίο έχει συζευχθεί µε δευτερογενή αντισώµατα. Το επισηµασµένο πολυµερές δεν περιέχει αβιδίνη ή βιοτίνη. Εποµένως, η µη ειδική χρώση, που προκύπτει από ενδογενή δραστηριότητα αβιδίνης-βιοτίνης στο συκώτι, νεφρά, λεµφοειδείς ιστούς και τοµές κρυοστάτη εξαλείφεται ή µειώνεται σηµαντικά. Όλα τα αντιδραστήρια στο EnVision+ Σύστηµα, HRP µε υπόστρωµα AEC+ είναι έτοιµα προς χρήση. Το σύστηµα αυτό είναι µια εξαιρετικά ευαίσθητη µέθοδος και, ως αποτέλεσµα, οι βέλτιστες αραιώσεις του πρωτογενούς αντισώµατος είναι έως 20 φορές υψηλότερες από εκείνες που χρησιµοποιήθηκαν για την κλασσική τεχνική ΡΑΡ και αρκετές φορές µεγαλύτερες από εκείνες που χρησιµοποιήθηκαν για τις κλασσικές µεθόδους ABC ή LSAB. Το πρωτόκολλο αυτό προσφέρει ένα σύστηµα παραγωγής ενισχυµένου σήµατος για την ανίχνευση αντιγόνων, που υπάρχουν σε χαµηλές συγκεντρώσεις ή για πρωτογενή αντισώµατα χαµηλού τίτλου. Τα πρωτογενή αντισώµατα παράγονται σε υποδοχή αντίδρασης ποντικού µε το επισηµασµένο πολυµερές. Η ερµηνεία κάθε θετικής χρώσης ή η απουσία της θα µπορούσε να συµπληρωθεί από µορφολογικές και ιστολογικές µελέτες µε κατάλληλους µάρτυρες. Αρχές της διαδικασίας Καταστείλετε οποιαδήποτε ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης επωάζοντας το δείγµα για πέντε λεπτά µε διάλυµα αποκλεισµού Υπεροξειδάσης της Dako. Το δείγµα κατόπιν επωάζεται µε κατάλληλα χαρακτηρισµένο και αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα ποντικού, και ακολουθεί επώαση µε επισηµασµένο πολυµερές χρησιµοποιώντας δύο διαδοχικές επωάσεις των 30 λεπτών. Πρέπει να σηµειωθεί ότι για αντισώµατα που απαιτούν ενζυµική πέψη ή ανάκτηση στόχου, είναι πιθανό να χρειάζεται να αυξηθούν οι χρόνοι επώασης του πρωτογενούς αντισώµατος και του επισηµασµένου πολυµερούς από 5 έως 10 λεπτά. Η χρώση είναι ολοκληρωµένη µε επώαση 5 30 λεπτών µε 3-αµινο-9-αιθυλκαρβαζόλη υποστρώµατος-χρωµογόνου (AEC)+, που έχει ως αποτέλεσµα ίζηµα χρώµατος ερυθρού στην περιοχή του αντιγόνου. (Το AEC είναι δυνητικό καρκινογόνο, Βλ. ενότητα Προφυλάξεις). Παρεχόµενα αντιδραστήρια Κωδικός K4005: Στο κιτ αυτό περιλαµβάνονται τα παρακάτω υλικά, επαρκή για 150 τοµές ιστών, βασισµένα σε 100 µl ανά τοµή: Αρ.Φιάλης Ποσότητα Περιγραφή 1 1x15 ml Αποκλεισµός Υπεροξειδάσης 0,03% υδροξείδιο του υδρογόνου, που περιέχει αζίδιο του νατρίου. 2 1x15 ml Επισηµασµένο πολυµερές Επισηµασµένο πολυµερές υπεροξειδάσης συζευγµένο µε ανοσοσφαιρίνες αίγας έναντι ποντικού σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl, που περιέχει σταθεροποιητικές πρωτεΐνες και αντιµικροβιακό παράγοντα. 3 1x15 ml AEC+ Υπόστρωµα-Χρωµογόνου 3-αµινο-9-αιθυλκαρβαζόλη, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου, σταθεροποιητικούς παράγοντες, ενισχυτές και ένα αντιµικροβιακό παράγοντα. Φυλάσσεται στους 2 8 C. ( ) P04044GR_01/K4004_K4005/ σελ. 1/7

2 Κωδικός K4004: Στο κιτ αυτό περιλαµβάνονται τα παρακάτω υλικά, επαρκή για 1100 τοµές ιστών, βασισµένα σε 100 µl ανά τοµή: Αρ.Φιάλης Ποσότητα Περιγραφή 1 1x110 ml Αποκλεισµός Υπεροξειδάσης 0,03% υδροξείδιο του υδρογόνου, που περιέχει αζίδιο του νατρίου. 2 1x110 ml Επισηµασµένο πολυµερές Επισηµασµένο πολυµερές υπεροξειδάσης συζευγµένο µε ανοσοσφαιρίνες αίγας έναντι ποντικού σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl, που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. 3 1x110 ml Υπόστρωµα-Χρωµογόνο AEC+ 3-αµινο-9-αιθυλκαρβαζόλη που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου, σταθεροποιητικούς παράγοντες, ενισχυτές και ένα αντιµικροβιακό παράγοντα. Φυλάσσεται στους 2 8 C. Yλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Απορροφητικά σφουγγαράκιαιστός µάρτυρας, θετικός και αρνητικός Αντίχρωση; υδατικής βάσης, όπως Αιµατοξυλίνη του Mayer ή τροποποιηµένη του Lillie αιµατοξυλίνη του Mayer(κωδικός S3309)ΚαλυπτρίδεςΑπεσταγµένο νερόαιθανόλη, απόλυτη και 95%Οπτικό µικροσκόπιο (20x 800x) Υλικό στερέωσης, όπως Υλικό Στερέωσης Glycergel (κωδικός C0563) ή Faramount, Υδατικό υλικό στερέωσης, Έτοιµο προς χρήση (κωδικός S3025) ή µη υδατικό µόνιµο υλικό στερέωσης, Ultramont (κωδικός S1964)Πρωτογενή αντισώµατα και αντιδραστήριο αρνητικού υλικού ελέγχου Αντικειµενοφόροι πλάκες, καλυµµένες µε Πολυ-L-λυσίνη ή Επεξεργασµένες µε σιλάνιο αντικειµενοφόροι πλάκες (κωδικός S3003) οχεία ή λουτρά χρώσηςχρονόµετρο (ικανό για διαστήµατα 3 40 λεπτών)φιάλες πλύσηςρυθµιστικό διάλυµα πλύσηςξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα Ξυλενίου Προαιρετικά Υλικά που Απαιτούνται αλλά δεν ΠαρέχονταιΥδροξείδιο του αµµωνίου, 15 mol/l αραιωµένο προς 0,037 mol/lpap Pen (κωδικός S2002) Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις του προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνη, η συσσώρευση αζιδίου του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε µόλυβδο και χαλκό των υδραυλικών σωληνώσεων και να σχηµατίσει ιδιαίτερα εκρηκτικά οξείδια µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων στις υδραυλικές σωληνώσεις. 1,2 3. Το Υπόστρωµα-Χρωµογόνου AEC+ είναι ευαίσθητο στη µόλυνση από ποικιλία παραγόντων οξείδωσης όπως τα µέταλλα, βακτήρια, η σκόνη και τα γυάλινα σκεύη, που χρησιµοποιούνται συνήθως στο εργαστήριο. Για να αποφύγετε την µόλυνση και πρόωρη λήξη, αποφύγετε την έκθεση του διαλύµατος AEC+ σε οποιαδήποτε πηγή µόλυνσης και ποτέ µην αναρροφάτε µε πιπέτα από τη φιάλη. Μεταβιβάστε την απαιτούµενη ποσότητα σε καθαρό δοχείο και αναρροφήστε µε πιπέτα από αυτό. Μην επιστρέφετε την περίσσεια διαλύµατος AEC+ στο αρχικό δοχείο φύλαξης. 4. Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια πέραν της ηµεροµηνίας λήξης για την καθορισµένη µέθοδο φύλαξης. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες, εκτός από εκείνες που καθορίζονται στο ένθετο προϊόντος, πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη. 5. Μην υποκαθιστάτε αντιδραστήρια από άλλους αριθµούς παρτίδας ή από κιτ άλλων κατασκευαστών. 6. Τα ένζυµα και τα υποστρώµατα-χρωµογόνου είναι δυνατόν να επηρεαστούν δυσµενώς αν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μην φυλάτε τα συστατικά του κιτ ή πραγµατοποιείτε χρώση σε έντονο φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. 7. Οι χρόνοι επώασης ή θερµοκρασίες διαφορετικές από εκείνες που καθορίστηκαν είναι δυνατόν να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. Οποιαδήποτε τέτοια αλλαγή πρέπει να εγκριθεί από το χρήστη. 8. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που προέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. 9. Φοράτε τον κατάλληλο Εξοπλισµό Προσωπικής Προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 10. Τυχόν µη χρησιµοποιηµένο διάλυµα θα πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς και εθνικούς κανονισµούς. 11. ιατίθενται κατόπιν αιτήµατος ελτία εδοµένων ασφαλείας για επαγγελµατίες χρήστες. Κίνδυνος AEC+ Substrate-Chromogen: 5-10% Polyethylene glycol, 1-5% N-Methyl-2-pyrrolidone, 0.1-1% Acetic acid, 0.1-1% 3-amino-9- ethyl carbazole H320 Προκαλεί οφθαλµικό ερεθισµό. H350 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. P201 Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P202 Μην το χρησιµοποιήσετε πριν διαβάσετε και κατανοήσετε τις οδηγίες προφύλαξης. P281 Χρησιµοποιείτε µέσα ατοµικής προστασίας όταν απαιτείται. P280 Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. P264 Πλύνετε τα χέρια σας σχολαστικά µετά το χειρισµό. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανότητας έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. P305 + P351 + ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν ( ) P04044GR_01/K4004_K4005/ σελ. 2/7

3 P338 P337 + P313 P405 P501 φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Εάν δεν υποχωρεί ο οφθαλµικός ερεθισµός: Επισκεφθείτε γιατρό. Φυλάσσεται κλειδωµένο. ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. Παρασκευή αντιδραστηρίων Είναι βολικό να παρασκευάζετε τα παρακάτω αντιδραστήρια πριν τη χρώση. Ρυθµιστικό ιάλυµα Πλύσης Το TBST, 0,05 mol/l Αλατούχο ρυθµιστικό διάλυµα Tris µε Tween (κωδικός S3006) είναι το προτεινόµενο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης για αυτοµατοποιηµένη και χειροκίνητη ανίχνευση IHC. Τα TBS, 0,05 mol/l Αλατούχο ρυθµιστικό διάλυµα Tris (κωδικός S1968) και PBS, 0,02 mol/l Αλατούχο ρυθµιστικό διάλυµα Φωσφορικών (κωδικός S3024), είναι επίσης κατάλληλα ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης για χειροκίνητη χρώση. Τα Ρυθµιστικά ιαλύµατα Πλύσης που περιέχουν αζίδιο του νατρίου δεν συνιστώνται. Το αζίδιο του νατρίου αδρανοποιεί την υπεροξειδάση (HRP) έχοντας ως αποτέλεσµα αρνητική χρώση. Φυλάξτε το µη χρησιµοποιηµένο ρυθµιστικό διάλυµα στους 2 8 C. Απορρίψτε το διάλυµα αν είναι νεφελώδες. Είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθεί απεσταγµένο νερό για έκπλυση του αποκλεισµού υπεροξειδάσης, του υποστρώµατος και της αντίχρωσης. Πρωτογενές ΑντίσωµαΤα έτοιµα προς χρήση αντισώµατα NP-Series Plus είναι βελτιστοποιηµένα και συνιστώνται για χρήση µε τα συστήµατα υψηλής ευαισθησίας Plus της Dako. Επίσης, η Dako διαθέτει τα συµπυκνωµένα αντισώµατα. Η βελτιστοποίηση των συµπυκνωµένων αντισωµάτων απαιτείται από τον τελικό χρήστη. Οι Αραιώσεις πρέπει να παρασκευάζονται χρησιµοποιώντας Αραιωτικό Αντισώµατος (κωδικός S0809), ή ένα αραιωτικό που περιέχει 0,05 mol/l ρυθµιστικού διαλύµατος Tris-HC1 µε 1% βόειας αλβουµίνης ορού (BSA). Τα έτοιµα προς χρήση αντισώµατα N-Series της Dako δεν είναι βελτιστοποιηµένα για χρήση µε τα συστήµατα ανίχνευσης plus της Dako. Για τα περισσότερα πρωτογενή αντισώµατα, που χρησιµοποιούνται στο κιτ αυτό, αρκεί χρόνος επώασης των 30 λεπτών. Αντιδραστήριο Αρνητικού ΜάρτυραΚατά τη χρήση των έτοιµων προς χρήση αντισωµάτων NP-Series Plus της Dako, ως αρνητικός µάρτυρας συνιστάται ο Universal Negative Control(s)+. Αυτοί οι µάρτυρες είναι βελτιστοποιηµένοι για χρήση τόσο µε τα έτοιµα προς χρήση αντισώµατα ποντικού (κωδικός NP015) όσο και µε τα αντισώµατα κουνελιού (κωδικός NP001) NP-Series Plus. Ιδανικά, ένα αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα περιέχει ένα αντίσωµα, το οποίο δεν παρουσιάζει καµία αντιδραστικότητα µε τους ανθρώπινους ιστούς ή µε τον φυσιολογικό/µη άνοσο ορό στο ίδιο στρώµα/διάλυµα, όπως µε το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα. Το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα πρέπει να είναι της ίδιας υπόταξης και ζωικού είδους όπως το πρωτογενές αντίσωµα, αραιωµένο µε την ίδια ανοσοσφαιρίνη ή συγκέντρωση πρωτεΐνης, όπως το πρωτογενές αντίσωµα χρησιµοποιώντας το ίδιο αραιωτικό. Η περίοδος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα πρέπει να ανταποκρίνεται στο πρωτογενές αντίσωµα. Αναφερθείτε στις "Γενικές Οδηγίες για Ανοσοϊστοχηµική Χρώση" για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τους θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. ΑντίχρωσηΤο χρωµατισµένο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης είναι διαλυτή µορφή αλκοόλης και πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο µε αντιχρώσεις υδατικής βάσης, όπως η αιµατοξυλίνη του Mayer ή η τροποποιηµένη κατά Lillie αιµατοξυλίνη του Mayer (κωδικός S3309). Συνεχίστε την αντίχρωση αιµατοξυλίνης µε πλήρη έκπλυση σε απεσταγµένο νερό, κατόπιν εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους ιστών σε λουτρό µε 0,037 mol/l αµµωνίας ή παρόµοιου κυανού προσθετικού. Τριάντα επτά χιλιοστά µολ νερού αµµωνίας παρασκευάζονται αναµειγνύοντας 2,5 ml από 15 mol/l (συµπυκνωµένου) υδροξειδίου του αµµωνίου µε 1 λίτρο νερού. Τα 0,037 mol/l αµµωνίας που δεν χρησιµοποιήθηκε µπορούν να φυλαχτούν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) σε καλά σφραγισµένη φιάλη έως 12 µήνες. Συµβουλευτείτε τις οδηγίες κατασκευαστή για εναλλακτικές διαδικασίες αντίχρωσης. Υλικό ΣτερέωσηςΓια υδατική στερέωση συνιστάται Υλικό Στερέωσης Glycergel (κωδικός C0563) ή Faramount, Υδατικό Υλικό Στερέωσης, Έτοιµο προς χρήση (κωδικός S3025). Το Glycergel πρέπει να θερµαίνεται τουλάχιστον στους 50 C πριν τη χρήση. Είναι επίσης δυνατόν να χρησιµοποιηθεί µη υδατικό µόνιµο υλικό στερέωσης (Ultramount, κωδικός S1964). Φύλαξη Τα αντιδραστήρια του EnVision+ Σύστηµα, HRP πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. Μην καταψύχετε. Μην τα χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης, που αναγράφεται στα φιαλίδια αντιδραστηρίων και στην ετικέτα του κιτ. Η µεταβολή στην εµφάνιση οποιουδήποτε αντιδραστηρίου, όπως η καθίζηση, είναι δυνατόν να προκαλέσει αστάθεια ή αλλοίωση. Στις περιπτώσεις αυτές, το αντιδραστήριο(α) δεν πρέπει να χρησιµοποιείται(ούνται). Το διάλυµα Υποστρώµατος-Χρωµογόνου AEC+ είναι ασταθές σε θερµοκρασίες µεγαλύτερες των 8 C. Χρησιµοποιείτε και φυλάτε το διάλυµα Υποστρώµατος-Χρωµογόνου AEC+ στο προτεινόµενo εύρος θερµοκρασίας των 2 8 C. Το διάλυµα αυτό µπορεί να χρησιµοποιηθεί αµέσως µετά την αποµάκρυνση από το ψυγείο. Μετά τη χρήση επιστρέψτε στους 2 8 C φύλαξης όσο το δυνατόν συντοµότερα. εν υπάρχουν εµφανείς ενδείξεις που υποδεικνύουν την αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, θα πρέπει να εξετάζονται θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες ταυτόχρονα µε τα δείγµατα των ασθενών. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το κιτ, επικοινωνήστε µε το τµήµα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της Dako. ( ) P04044GR_01/K4004_K4005/ σελ. 3/7

4 Προετοιµασία δείγµατος Ιστός έγκλειστος σε παραφίνη Πριν τη χρώση IHC, οι ιστοί πρέπει να καθηλώνονται και να επεξεργάζονται. Η καθήλωση αποτρέπει την αυτόλυση και σήψη των ιστών που έχουν αποκοπεί, διατηρεί την αντιγονικότητα, ενισχύει το διαθλαστικό δείκτη των συστατικών ιστού και αυξάνει την αντίσταση των κυτταρικών στοιχείων στην επεξεργασία ιστών. Η επεξεργασία ιστών περιλαµβάνει αφυδάτωση, καθαρισµό των παραγόντων αφυδάτωσης, διήθηση των µέσων εγκλεισµού, εγκλεισµό και τµηµατοποίηση ιστών. Οι πιο κοινοί παράγοντες καθήλωσης για τα παρασκευάσµατα ιστού IHC περιγράφονται στις Γενικές Οδηγίες για Ανοσοϊστοχηµική Χρώση. Αυτές είναι κατευθυντήριες οδηγίες µόνο. Οι βέλτιστες διαδικασίες πρέπει να καθορίζονται και να επαληθεύονται από το χρήστη. (Για συγκεκριµένες πληροφορίες που αφορούν την καθήλωση ιστών και την επεξεργασία τους, βλ. τις αναφορές 3 και 4.) ιαδικασία χρώσης Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε τα περιεχόµενα του κιτ πριν τη χρήση του. Για ευκολία, παρέχονται συµπυκνωµένες οδηγίες σε ένα πλαστικό στρωµατοποιηµένο ένθετο. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες, που παρέχονται στο κιτ αυτό, έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων του κιτ ή η µεταβολή των χρόνων επώασης ή της θερµοκρασίας είναι δυνατόν να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. Η Φιάλη 1 και η Φιάλη 2 πρέπει να ισορροπήσουν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) πριν την ανοσοχρώση. Παροµοίως, όλες οι επωάσεις πρέπει να πραγµατοποιηθούν σε θερµοκρασία δωµατίου. Για ευκολία, το υπόστρωµα AEC+ είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθεί αµέσως µετά την αποµάκρυνση από το ψυγείο και δεν χρειάζεται να βρεθεί σε θερµοκρασία δωµατίου πριν τη χρήση. Μετά τη χρήση επιστρέψτε στους 2 8 C φύλαξης. Η φύλαξη πάνω από τους 8 C επηρεάζει δυνητικά τη σταθερότητα του υποστρώµατος-χρωµογόνου AEC+. Μην αφήνετε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια της χρωστικής διαδικασίας. Οι στεγνές τοµές ιστών είναι δυνατόν να εµφανίσουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Καλύψτε τις αντικειµενοφόρους πλάκες, που εκτίθενται σε ρεύµατα. Αν χρησιµοποιηθούν παρατεταµένες επωάσεις, τοποθετήστε τους ιστούς σε υγρό περιβάλλον. Η ευαισθησία του EnVision+ Σύστηµα, HRP µπορεί να αυξηθεί παρατείνοντας τους χρόνους επώασης των βηµάτων 2 και 3 για 5 10 λεπτά. Πρωτόκολλο χρώσης ΒΗΜΑ 1 ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙ ΑΣΗΣ Κτυπήστε ελαφρά την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος. Χρησιµοποιώντας ένα πανί χωρίς χνούδι (όπως το Kimwipe ή επίθεµα γάζας), σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα, για να αφαιρέσετε όσο υγρό έχει αποµείνει και να διατηρήσετε το αντιδραστήριο εντός της καθορισµένης περιοχής. Χορηγήστε αρκετό αποκλεισµό Υπεροξειδάσης από τη Φιάλη 1 για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε 5 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε απαλά µε απεσταγµένο νερό ή ρυθµιστικό διάλυµα από φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή κατευθείαν στον ιστό) και τοποθετήστε σε ένα ανανεωµένο λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος. ΒΗΜΑ 2 ΠΡΩΤΟΓΕΝΕΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Η ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΜΑΡΤΥΡΑ Κτυπήστε ελαφρά την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Χορηγήστε αρκετό αραιωµένο βέλτιστα πρωτογενές αντίσωµα ή αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε 30 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε απαλά µε ρυθµιστικό διάλυµα από φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή κατευθείαν στον ιστό) και τοποθετήστε σε ένα ανανεωµένο λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος. Αν πρέπει να διακοπεί η διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες πρέπει να διατηρηθούν σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος µετά την επώαση του πρωτογενούς αντισώµατος (Βήµα 2) έως µία ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C), χωρίς να επηρεαστεί η απόδοση της χρώσης. ΒΗΜΑ 3 ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΠΟΛΥΜΕΡΕΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙ ΑΣΗΣ Κτυπήστε ελαφρά την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Χορηγήστε αρκετό Επισηµασµένο Πολυµερές από τη Φιάλη 2 για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε 30 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως στο Βήµα 2. ΒΗΜΑ 4 ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ-ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Χορηγήστε αρκετό από το έτοιµο προς χρήση διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου AEC+ από τη Φιάλη 3 για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε για 5 30 λεπτά. Ξεπλύνετε απαλά µε απεσταγµένο νερό από φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή κατευθείαν στον ιστό). Συλλέξτε τα απόβλητα υποστρώµατος-χρωµογόνου σε δοχείο επικίνδυνων υλικών για σωστή απόρριψη. ΒΗΜΑ 5 ΑΝΤΙΧΡΩΣΗ ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ (προαιρετικά) Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό υδατικής αιµατοξυλίνης (κωδικός S3309). Ο χρόνος επώασης εξαρτάται από την ισχύ της αιµατοξυλίνης που χρησιµοποιείται. Ξεπλύνετε απαλά σε λουτρό απεσταγµένου νερού. Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες 10 φορές σε λουτρό 0,037 mol/l αµµωνίας ή παρόµοιου κυανού προσθετικού. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού για 2 5 λεπτά. ( ) P04044GR_01/K4004_K4005/ σελ. 4/7

5 ΒΗΜΑ 6 ΣΤΕΡΕΩΣΗ Τα δείγµατα µπορούν να στερεωθούν και να καλυφτούν µε καλυπτρίδες µε υλικό στερέωσης µε υδατική βάση, όπως το Υλικό Στερέωσης Glycergel (κωδικός C0563) ή το Faramount (κωδικός S3025) ή σε µόνιµο υλικό στερέωσης µη υδατικής βάσης, Ultramount (κωδικός S1964). Σηµείωση: Το προϊόν αντίδρασης AEC είναι διαλυτό σε οργανικούς διαλύτες και εποµένως δεν είναι συµβατό µε τα µόνιµα υλικά στερέωσης βάσης τολουένιου ή ξυλένιου. Σηµείωση: Οι αντικειµενοφόροι πλάκες πρέπει να διαβάζονται όταν είναι κατάλληλο. Ωστόσο, είναι δυνατόν να συµβεί αποχρωµατισµός αν εκτεθούν σε δυνατό φως για περισσότερο από µία εβδοµάδα. Για να ελαχιστοποιήσετε τον αποχρωµατισµό, φυλάξτε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) στο σκοτάδι. Ποιοτικός έλεγχος Οι διαφορές στην επεξεργασία ιστών και στις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη είναι δυνατόν να προκαλέσουν σηµαντική µεταβλητότητα αποτελεσµάτων, απαιτώντας τακτική διεξαγωγή εσωτερικών ελέγχων επιπλέον των παρακάτω διαδικασιών. Βλ. τις οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists (CAP) Certification Program για Ανοσοϊστοχηµεία και τις αναφορές 5 έως 7 για επιπλέον πληροφορίες. Αναφερθείτε στο δελτίο προδιαγραφών για το κάθε πρωτογενές αντίσωµα που χρησιµοποιείται, για λεπτοµέρειες σχετικά µε την ευαισθησία και ανοσοαντιδραστικότητα. Αναφερθείτε στις "Γενικές Οδηγίες για Ανοσοϊστοχηµική Χρώση" για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τους θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. Ερµηνεία χρώσης Αναφερθείτε στις Γενικές Οδηγίες για Ανοσοϊστοχηµική Χρώση για οδηγίες ερµηνείας. Περιορισµοί Η χρώση των ιστών εξαρτάται από τον σωστό χειρισµό και την επεξεργασία των ιστών πριν από τη χρώση. Η ακατάλληλη στερέωση, η κατάψυξη, η απόψυξη, η πλύση, η ξήρανση, η θέρµανση ή η κατάτµηση ή µόλυνση µε άλλους ιστούς ή υγρά µπορεί να δηµιουργήσουν ψευδή στοιχεία, παγίδευση των αντισωµάτων ή ψευδή αρνητικά αποτελέσµατα. Η χρήση παλιών ή µη ρυθµισµένων σε διάλυµα καθηλωτικών µέσων ή η έκθεση ιστών σε υπερβολική θερµότητα (µεγαλύτερη των 60 C) κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας είναι δυνατόν να επιφέρει µειωµένη ευαισθησία χρώσης. Η ενδογενής δραστηριότητα υπεροξειδάσης ή ψευδοϋπεροξειδάσης µπορεί να βρεθεί σε αιµοπρωτεΐνες, όπως η αιµοσφαιρίνη, µυοσφαιρίνη, κυτόχρωµα και καταλάση, καθώς και τα ηωσινόφιλα. 8,9 Η δραστηριότητα αυτή µπορεί να αποτραπεί επωάζοντας τα δείγµατα µε αποκλεισµό Υπεροξειδάσης Φιάλη #1 του EnVision+ Σύστηµα, HRP για πέντε λεπτά πριν την χορήγηση του πρωτογενούς αντισώµατος. Τα επιχρίσµατα αίµατος και µυελού των οστών και οι κατεψυγµένοι ιστοί µπορούν επίσης να αντιµετωπιστούν µε το αντιδραστήριο αυτό. Ωστόσο, η διαδικασία αυτή δεν καταργεί τη χρωστική ερυθρού-καφέ χρώµατος των αιµοπρωτεϊνών. Εναλλακτικά, µπορεί να χρησιµοποιηθεί υπεροξείδιο υδρογόνου-µεθανόλης. Μερικά αντιγόνα είναι δυνατόν να µετουσιωθούν µε τη διαδικασία αυτή. Οι ιστοί από άτοµα, που έχουν µολυνθεί µε ιό ηπατίτιδας Β και περιέχουν αντιγόνο επιφανείας ηπατίτιδας Β (HBsAg) είναι δυνατόν να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε υπεροξειδάση χρένου. 10 Οι φυσιολογικοί/µη άνοσοι οροί από την ίδια ζωική πηγή, όπως οι δευτερογενείς αντιοροί που χρησιµοποιούνται στα βήµατα αποκλεισµού, είναι δυνατόν να προκαλέσουν ψευδή-αρνητικά ή ψευδή-θετικά αποτελέσµατα, εξαιτίας αυτο-αντισωµάτων ή φυσικών αντισωµάτων. Τα αντιδραστήρια, που παρέχονται στο κιτ αυτό, έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Η περαιτέρω αραίωση είναι δυνατόν να προκαλέσει απώλεια ανίχνευσης αντιγόνου. Αντιµετώπιση προβληµάτων Πρόβληµα Πιθανή Αιτία Προτεινόµενη αντιµετώπιση 1. Καµία χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών. 1α. Επανεξετάστε τη χορήγηση αντιδραστηρίων. 2. Ασθενής χρώση όλων των αντικειµενοφόρων πλακών. 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου σε όλες τις αντικειµενοφόρους πλάκες. 1α. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιούνται µε τη σωστή σειρά. 1β. Αζίδιο του νατρίου. 2α. Οι τοµές έχουν κρατήσει πάρα πολύ διάλυµα µετά το λουτρό πλύσης. 2β. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν έχουν επωαστεί αρκετά µε τα αντισώµατα ή το υπόστρωµα. 3α. Τα δείγµατα περιέχουν υψηλή ενδογενή δραστηριότητα εροξειδάσης. 1β. Χρησιµοποιήστε ανανεωµένο ρυθµιστικό διάλυµα χωρίς αζίδιο. 2α. Κτυπήστε ελαφρά την περίσσεια διαλύµατος πριν σκουπίσετε τριγύρω την τοµή. 2β. Επανεξετάστε τους προτεινόµενους χρόνους επώασης. 3α. Χρησιµοποιήστε περισσότερο χρόνο επώασης του αποκλεισµού υπεροξειδάσης, Φιάλη 1. ( ) P04044GR_01/K4004_K4005/ σελ. 5/7

6 3β. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς. 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν έχουν ξεπλυθεί κατάλληλα. 3β. Χρησιµοποιήστε ανανεωµένα λουτρά ξυλένιου ή τολουένιου. Αν αρκετές αντικειµενοφόροι πλάκες χρωσθούν αυτόχρονα, το δεύτερο λουτρό ξυλένιου πρέπει να περιέχει νανεωµένο ξυλένιο. 3γ. Χρησιµοποιήστε ανανεωµένα διαλύµατα σε λουτρά ρυθµιστικού διαλύµατος και φιάλες πλύσης. 3δ. Γρηγορότερη από το κανονικό αντίδραση υποστρώµατος εξαιτίας π.χ.υπερβολικής θερµοκρασίας δωµατίου. 3ε. Οι τοµές στέγνωσαν κατά τη διάρκειατης διαδικασίας χρώσης. 3στ. Μη ειδική δέσµευση των αντιδραστηρίων στην τοµή ιστών. 3η. Το αντίσωµα είναι πολύ συµπυκνωµένο. 3δ. Χρησιµοποιήστε συντοµότερους χρόνους επώασης µε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου. 3ε. Χρησιµοποιήστε θάλαµο υγρασίας. Σκουπίστε µόνο τρεις έως τέσσερις αντικειµενοφόρους τη φορά πριν τη χορήγηση αντιδραστηρίου. 3στ. Χορηγήστε ένα διάλυµα αποκλεισµού, που περιέχει άσχετη πρωτεΐνη. 3η. Χρησιµοποιήστε υψηλότερη αραίωση του αντισώµατος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν το πρόβληµα δεν µπορεί να αποδοθεί σε καµία από τις παραπάνω αιτίες, ή αν η προτεινόµενη αντιµετώπιση αποτύχει να επιλύσει το πρόβληµα, παρακαλώ επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υποστήριξη της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Μπορείτε να βρείτε επιπλέον πληροφορίες σχετικά µε τις διαδικασίες χρώσης και την παρασκευή δειγµάτων στο Εγχειρίδιο - Immunochemical Staining Methods 4 (που διατίθεται από την Dako), Atlas of Immunohistology 11 και Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 12 Βιβλιογραφία 1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ No , Current 13. August 16, Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 7. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Επιπλέον βιβλιογραφικές αναφορές Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct ( ) P04044GR_01/K4004_K4005/ σελ. 6/7

7 Edition 07/15 ( ) P04044GR_01/K4004_K4005/ σελ. 7/7