Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και ένα συντηρητικό.

Transcript

1 Dako EnVision+ System-HRP (DAB) Για χρήση µε πρωτογενή αντισώµατα ποντικού Code K ml Code K ml Χρήση για την οποία προορίζεται Για διαγνωστική χρήση in vitro. Οι οδηγίες αυτές ισχύουν για το Dako EnVision + System, Peroxidase (EnVision+ System, HRP της Dako). Το παρόν κιτ προορίζεται για χρήση µε πρωτογενή αντισώµατα από ποντικό τα οποία παρέχονται από το χρήστη για την ποιοτική ταυτοποίηση των αντιγόνων σε φυσιολογικούς και παθολογικούς ιστούς ενσωµατωµένους σε παραφίνη, ιστούς κρυοστάτη ή κυτταρικά παρασκευάσµατα µε χρήση µικροσκοπίου φωτός. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν ιστοί που έχουν υποστεί επεξεργασία σε µια ποικιλία καθηλωτικών, όπως αιθανόλη, υγρό του Bouin, φορµαλίνη ψευδαργύρου και ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης. Περίληψη και επεξήγηση Το EnVision+ System, HRP της Dako είναι µια τεχνική IHC χρώσης δύο βηµάτων. Το σύστηµα αυτό βασίζεται σε ένα επισηµασµένο µε HRP πολυµερές το οποίο είναι συζευγµένο µε δευτερογενή αντισώµατα. Το επισηµασµένο πολυµερές δεν περιέχει αβιδίνη ή βιοτίνη. Κατά συνέπεια, εξαλείφεται ή µειώνεται σηµαντικά η µη ειδική χρώση που προκύπτει από δραστικότητα ενδογενούς αβιδίνης-βιοτίνης στο ήπαρ, το νεφρό, τους λεµφοειδείς ιστούς και τις τοµές κρυοστάτη. Όλα τα αντιδραστήρια στο EnVision+ System, HRP, της Dako εκτός από το υγρό χρωµογόνο υποστρώµατος DAB+, είναι έτοιµα προς χρήση. Το σύστηµα αυτό αποτελεί µια εξαιρετικά ευαίσθητη µέθοδο και, ως εκ τούτου, οι βέλτιστες αραιώσεις του πρωτογενούς αντισώµατος είναι έως 20 φορές υψηλότερες από αυτές των παραδοσιακών τεχνικών PAP, και αρκετές φορές υψηλότερες από αυτές που χρησιµοποιούνται για τις παραδοσιακές µεθόδους ABC ή LSAB. Το πρωτόκολλο αυτό προσφέρει ένα σύστηµα παραγωγής ενισχυµένου σήµατος για την ανίχνευση αντιγόνων που υπάρχουν σε χαµηλές συγκεντρώσεις ή χαµηλό τίτλο πρωτογενούς αντισώµατος. Τα πρωτογενή αντισώµατα που παράγονται σε ποντικό αντιδρούν καλά µε το επισηµασµένο πολυµερές. Η ερµηνεία τυχόν θετικής χρώσης, ή η απουσία της, θα πρέπει να συµπληρώνεται µε µορφολογικές και ιστολογικές µελέτες µε κατάλληλα υλικά ελέγχου. Αρχές διαδικασίας Τυχόν δραστικότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης καταστέλλεται µε επώαση του δείγµατος για πέντε λεπτά µε υπεροξειδάση αποκλεισµού. Το δείγµα κατόπιν επωάζεται µε ένα κατάλληλα χαρακτηρισµένο και αραιωµένο πρωτογενές ή αντίσωµα ποντικού, ακολουθούµενο µε επώαση µε το επισηµασµένο πολυµερές µε χρήση δύο διαδοχικών επωάσεων 30 λεπτών. Πρέπει να σηµειωθεί ότι για αντισώµατα που απαιτούν ενζυµική πέψη ή ανάκτηση στόχου, ενδεχοµένως να είναι απαραίτητο να αυξηθούν οι χρόνοι επώασης του πρωτογενούς αντισώµατος και του επισηµασµένου πολυµερούς κατά 5 έως 10 λεπτά. Η χρώση ολοκληρώνεται µε επώαση 5 έως 10 λεπτών µε χρωµογόνο υποστρώµατος 3,3 -διαµινοβενζιδίνη (DAB+) η οποία έχει ως αποτέλεσµα καφέ καθίζηση στη θέση του αντιγόνου. (Το DAB είναι δυνητικό καρκινογόνο. Βλ. ενότητα Προφυλάξεις). Αντιδραστήρια που παρέχονται Κωδικός 4006 Στο κιτ αυτό περιλαµβάνονται τα ακόλουθα υλικά, τα οποία επαρκούν για 150 τοµές ιστών, υπολογίζοντας 100 µl για κάθε τοµή: Ποσότητα 1x15 ml Περιγραφή Peroxidase Block Υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,03% που περιέχει αζίδιο του νατρίου. 1x15 ml Labelled Polymer Επισηµασµένο µε υπεροξειδάση πολυµερές συζευγµένο σε αντιανοσοσφαιρίνες ποντικού από αίγα σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl που περιέχει πρωτεΐνη σταθεροποίησης και αντιµικροβιακό παράγοντα. 1x18 ml Substrate Buffer Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και ένα συντηρητικό. ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 1/8

2 1x1 ml DAB+ Chromogen ιάλυµα χρωµογόνου 3,3 -διαµινοβενζιδίνη Κωδικός 4007 Στο κιτ αυτό περιλαµβάνονται τα ακόλουθα υλικά, τα οποία επαρκούν για 1100 τοµές ιστών, υπολογίζοντας 100 µl για κάθε τοµή: Ποσότητα 1x110 ml Περιγραφή Peroxidase Block Υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,03% που περιέχει αζίδιο του νατρίου. 1x110 ml Labelled Polymer Επισηµασµένο µε υπεροξειδάση πολυµερές συζευγµένο σε αντιανοσοσφαιρίνες ποντικού από αίγα σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl που περιέχει πρωτεΐνη σταθεροποίησης και αντιµικροβιακό παράγοντα. 1x120 ml Buffered Substrate Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και ένα συντηρητικό. 1x5 ml DAB+ Chromogen ιάλυµα χρωµογόνου 3,3 -διαµινοβενζιδίνη Αξεσουάρ 1 Βαθµονοµηµένο δοκιµαστικό σωληνάριο 1 Πλαστική πιπέτα pasteur Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Απορροφητικά χαρτοµάντιλα Ιστός ελέγχου, θετικός και αρνητικός Επίχρωση, µε υδατική βάση, όπως Mayer s Hematoxylin ή Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309) Καλυπτρίδες Απεσταγµένο νερό Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Μικροσκόπιο φωτός (20x 800x) Μέσο στερέωσης, όπως Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (κωδικός S3025) ή µη υδατικό µέσο µόνιµης στερέωσης, Ultramount (κωδικός S1964) Πρωτογενή αντισώµατα και αντιδραστήριο αρνητικού υλικού ελέγχου Αντικειµενοφόροι πλάκες, επικαλυµµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή σιλανοποιηµένές αντικειµενοφόροι πλάκες (κωδικός S3003) Βάζα ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε δυνατότητα µέτρησης χρονικών διαστηµάτων 3 έως 40 λεπτών) Φιάλες πλύσης ιάλυµα ρυθµισµένου διαλύµατος πλύσης Ξυλόλιο, τολουόλιο ή υποκατάστατα ξυλολίου Προαιρετικά υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Υδροξείδιο του αµµωνίου, 15 mol/l αραιωµένο σε 0,037 mol/l PAP Pen (κωδικός S2002) Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, οι συσσωρεύσεις του NaN 3 ενδέχεται να αντιδράσουν µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό για το σχηµατισµό ιδιαίτερα εκρηκτικών συσσωρεύσεων αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις. 1,2 3. Μη χρησιµοποιείτε τα αντιδραστήρια σε περίπτωση που έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης για τη συνιστώµενη µέθοδο φύλαξης. Σε περίπτωση που τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται στο ένθετο του προϊόντος, θα πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη. 4. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια µε τα αντίστοιχα άλλων αριθµών παρτίδας ή κιτ άλλων κατασκευαστών. ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 2/8

3 5. Τα ένζυµα και τα χρωµογόνα υποστρώµατος ενδεχοµένως να επηρεάζονται αρνητικά σε περίπτωση που εκτεθούν σε υπερβολικό φως. Μη φυλάσσετε τα συστατικά του κιτ ή εκτελείτε τη χρώση σε ισχυρό φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. 6. Οι χρόνοι ή οι θερµοκρασίες επώασης που διαφέρουν από αυτές που καθορίζονται ενδεχοµένως να παράγουν λανθασµένα αποτελέσµατα. Τέτοιες αλλαγές θα πρέπει να πιστοποιούνται από το χρήστη. 7. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που προέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. 8. Για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα, φορέστε κατάλληλο ατοµικό προστατευτικό εξοπλισµό. 9. Τυχόν µη χρησιµοποιηµένο διάλυµα θα πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς και εθνικούς κανονισµούς. 10. ιατίθενται κατόπιν αιτήµατος ελτία εδοµένων ασφαλείας για επαγγελµατίες χρήστες. Κίνδυνος DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. H341 Ύποπτο για πρόκληση γενετικών ελαττωµάτων. P201 Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P202 Μην το χρησιµοποιήσετε πριν διαβάσετε και κατανοήσετε τις οδηγίες προφύλαξης. P281 Χρησιµοποιείτε µέσα ατοµικής προστασίας όταν απαιτείται. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανότητας έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. Φύλαξη Τα αντιδραστήρια του Dako EnVision+ System, HRP πρέπει να φυλάσσονται στους 2 έως 8 C. Να µην καταψυχθούν. Να µη χρησιµοποιούνται µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στα φιαλίδια των αντιδραστηρίων και την ετικέτα του κιτ. Η µεταβολή της εµφάνισης οποιουδήποτε αντιδραστηρίου, όπως µιας καθίζησης, ενδεχοµένως να υποδεικνύει αστάθεια ή φθορά. Σε τέτοιες περιπτώσεις, δεν θα πρέπει να χρησιµοποιούνται τα αντιδραστήρια. εν υπάρχουν εµφανείς ενδείξεις που υποδεικνύουν την αστάθεια των προϊόντων αυτών. Εποµένως, θα πρέπει να αναλύονται θετικά και αρνητικά υλικά ελέγχου ταυτόχρονα µε τα δείγµατα των ασθενών. Εάν παρατηρείτε µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το κιτ, επικοινωνήστε µε το τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako. Παρασκευή αντιδραστηρίων Είναι κατάλληλο να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση. Ρυθµισµένο διάλυµα πλύσης Το συνιστώµενο ρυθµισµένο διάλυµα πλύσης για αυτοµατοποιηµένη και µη αυτόµατη IHC ανίχνευση είναι το TBST, 0.05 mol/ltris Buffered Saline with Tween (κωδικός S3006). Το TBS, 0.05 mol/l Tris Buffered Saline (κωδικός S1968) και το PBS, 0.02 mol/l Phosphate Buffered Saline (κωδικός S3024) είναι επίσης κατάλληλα ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης για µη αυτόµατη χρώση. εν συνιστώνται ρυθµισµένα διαλύµατα πλύσης που περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου θα απενεργοποιήσει την υπεροξειδάση χρένου (HRP) έχοντας ως αποτέλεσµα αρνητική χρώση. Φυλάσσετε τα αχρησιµοποίητο ρυθµιστικό διάλυµα στους 2 8 C. Απορρίψτε το ρυθµιστικό διάλυµα σε περίπτωση που είναι θολό. Ενδεχοµένως να χρησιµοποιηθεί απεσταγµένο νερό για την έκπλυση του υπεροξειδάση, αποκλεισµού του υποστρώµατος και της επίχρωσης. Πρωτογενές αντίσωµα ιατίθενται συµπυκνωµένα αντισώµατα από την Dako. Ωστόσο, οι βέλτιστες αραιώσεις θα πρέπει να καθορίζονται πειραµατικά από το χρήστη. Λόγω της υψηλής ευαισθησίας του συστήµατος EnVision+, HRP της Dako, οι αραιώσεις πρωτογενούς αντισώµατος ενδεχοµένως να κυµαίνονται από πέντε έως είκοσι φορές παραπάνω από αυτές που χρησιµοποιούνται σε παραδοσιακές IHC µεθόδους. Οι αραιώσεις πρέπει να παρασκευάζονται µε χρήση ρυθµιστικού διαλύµατος Tris-HCl 0,05 mol/l, ph 7,2 έως 7,6, που περιέχει βόεια αλβουµίνη ορού 1% (Antibody Diluent, κωδικός S0809). Για τα περισσότερα πρωτογενή αντισώµατα που χρησιµοποιούνται µε το παρόν κιτ, επαρκεί χρόνος επώασης 30 λεπτών. Τα έτοιµα προς χρήση αντισώµατα της σειράς NP Plus έχουν βελτιστοποιηθεί και συνιστώνται για χρήση µε τα συστήµατα ανίχνευσης υψηλής ευαισθησίας Plus της Dako. ιατίθενται επίσης συµπυκνωµένα αντισώµατα από την Dako. Απαιτείται η βελτιστοποίηση των συµπυκνωµένων αντισωµάτων από τον τελικό χρήση. Οι αραιώσεις θα πρέπει να προετοιµάζονται µε χρήση του Antibody Diluent (κωδικός S0809) ή ένα αραιωτικό που περιέχει ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl 0,05 mol/l µε βόεια αλβουµίνη ορού (BSA) 1%. Τα έτοιµα προς χρήση αντισώµατα της σειράς N της Dako δεν έχουν βελτιστοποιηθεί για χρήση µε τα συστήµατα ανίχνευσης Plus της Dako. ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 3/8

4 Αντιδραστήριο αρνητικού υλικού ελέγχου Ιδανικά, ένα αντιδραστήριο αρνητικού υλικού ελέγχου περιέχει ένα αντίσωµα που δεν παρουσιάζει ειδική αντιδραστικότητα µε ανθρώπινους ιστούς ή φυσιολογικό / µη άνοσο ορό στην ίδια θεµέλια ουσία/διάλυµα όπως το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα. Το αντιδραστήριο αρνητικού υλικού ελέγχου θα πρέπει να είναι της ίδια υποτάξης και του ίδιου ζωικού είδους όπως το πρωτογενές αντίσωµα, αραιωµένο στην ίδια συγκέντρωση ανοσοσφαιρίνης ή πρωτεΐνης µε το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα χρησιµοποιώντας το ίδιο αραιωτικό. Η περίοδος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου θα πρέπει να αντιστοιχεί στο πρωτογενές αντίσωµα. Όταν χρησιµοποιείτε έτοιµα προς χρήση αντισώµατα της σειράς NP Plus της Dako, συνιστάται Universal Negative Control(s)+ ως αντιδραστήριο αρνητικού υλικού ελέγχου. Τα υλικά ελέγχου αυτά έχουν βελτιστοποιηθεί για χρήση µε έτοιµα προς χρήση αντισώµατα της σειράς NP Plus από ποντικό (κωδικός NP015) ή κόνικλο (κωδικός NP001). Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε την παρασκευή αντιδραστηρίου αρνητικού υλικού ελέγχου, ανατρέξτε στην ενότητα Ποιοτικός έλεγχος. ιάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος Το ακόλουθο πρωτόκολλο για την παρασκευή 1 ml διαλύµατος χρωµογόνου υποστρώµατος είναι αρκετό για έως δέκα τοµές ιστών ή έως πέντε κυτταρικά επιχρίσµατα. ΒΗΜΑ 1 Ανάλογα µε τον αριθµό αντικειµενοφόρων πλακών που θα χρωµατιστούν, µεταφέρετε αρκετά κλάσµατα ρυθµιστικού διαλύµατος των 1 ml από τη φιάλη 3a (ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος) στο βαθµονοµηµένο δοκιµαστικό σωληνάριο που παρέχεται. ΒΗΜΑ 2 Για κάθε 1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος, προσθέστε µία σταγόνα (20 µl) από τη φιάλη 3b (υγρό χρωµογόνο DAB+). Αναµίξτε αµέσως και τοποθετήστε στις τοµές ιστών µε την πιπέτα pasteur που παρέχεται. Το παρασκευασµένο διάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος είναι σταθερό για περίπου πέντε ηµέρες όταν φυλάσσεται στους 2 έως 8 C. Το διάλυµα αυτό θα πρέπει να αναµιγνύεται καλά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζηµα που σχηµατίζεται στο διάλυµα δεν επηρεάζει την ποιότητα της χρώσης. Εκπλύντε εξονυχιστικά το δοκιµαστικό σωληνάριο και την πιπέτα µετά από κάθε χρήση. Σε περίπτωση που χρησιµοποιηθεί ολόκληρο, τα 18 ml του ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος που παρέχονται µε το K4006 θα παράγουν αρκετό όγκο για 150 εξετάσεις. Μπορεί να παραµείνει παραπάνω όγκος. Σε περίπτωση που χρησιµοποιηθεί ολόκληρο, τα 120 ml του ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος που παρέχονται µε το K4007 θα παράγουν αρκετό όγκο για 1100 εξετάσεις. Μπορεί να παραµείνει παραπάνω όγκος. Επίχρωση Το κεχρωσµένο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης είναι αδιάλυτο στην αλκοόλη και ενδεχοµένως να χρησιµοποιηθεί µε επιχρώσεις µε αλκοολική ή υδατική βάση, όπως Mayer s hematoxylin ή Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309). Μετά την επίχρωση της αιµατοξυλίνης ακολουθήστε µε εξονυχιστική έκπλυση µε απεσταγµένο νερό. Κατόπιν εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες ιστού σε λουτρό αµµωνίας 0,037 mol/l ή παρόµοιο παράγοντα κυάνωσης. Παρασκευάζονται 37 µmol αµµωνιούχο νερό µε ανάµιξη 2,5 ml υπεροξειδίου του αµµωνίου 15 mol/l (συµπυκνωµένο) µε 1 λίτρο νερό. Η αχρησιµοποίητη αµµωνία 0,037 mol/l µπορεί να φυλαχτεί σε θερµοκρασία δωµατίου (20 έως 25 C) σε ερµητικά κλειστό φιαλίδιο για έως 12 µήνες. Για εναλλακτικές διαδικασίες επίχρωσης, συµβουλευτείτε τις κατευθυντήριες οδηγίες του κατασκευαστή. Μέσο στερέωσης Για υδατική στερέωση, συνιστώνται το Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή το Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (κωδικός S3025). Το Glycergel θα πρέπει να θερµανθεί τουλάχιστον στους 50 C ακριβώς πριν από τη χρήση. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί επίσης και µη υδατικό µέσο µόνιµης στερέωσης (Ultramount, κωδικός S1964). Παρασκευή δείγµατος Ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση» ή/και στο δελτίο προδιαγραφών του αντισώµατος. Πριν από τη IHC χρώση, οι ιστοί πρέπει να καθηλωθούν και να υποστούν επεξεργασία. Η καθήλωση εµποδίζει την αυτόλυση και τη σήψη των τοµών ιστών, διατηρεί την αντιγονικότητα, ενισχύει το δείκτη διάθλασης των συστατικών του ιστού και αυξάνει την αντίσταση των κυτταρικών στοιχείων κατά της επεξεργασίας ιστού. Η επεξεργασία ιστού περιλαµβάνει αφυδάτωση, αποµάκρυνση αφυδατικών παραγόντων, διήθηση των µέσων ενσωµάτωσης, ενσωµάτωση και τοµή των ιστών. Τα συνηθέστερα καθηλωτικά για παρασκευάσµατα ιστών IHC περιγράφονται στις γενικές οδηγίες. Το παρόν αποτελεί µόνο κατευθυντήριες οδηγίες. Οι βέλτιστες διαδικασίες θα πρέπει να καθορίζονται και να επαληθεύονται από το χρήστη. ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 4/8

5 ιαδικασία χρώσης Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης θα πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε το περιεχόµενο του κιτ πριν από τη χρήση. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται µε το κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων του κιτ ή µεταβολή των χρόνων ή θερµοκρασιών επώασης ενδεχοµένως να παράγει λανθασµένα αποτελέσµατα. Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να ισορροπήσουν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 έως 25 C) πριν από την ανοσοχρώση. Παροµοίως, όλες οι επωάσεις θα πρέπει να εκτελούνται σε θερµοκρασία δωµατίου. Μην αφήσετε τις τοµές ιστού να ξηραθούν κατά τη διαδικασία χρώσης. Οι στεγνές τοµές ιστού ενδεχοµένως να εµφανίσουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Καλύψτε τις αντικειµενοφόρους πλάκες που εκτίθενται σε αέρια ρεύµατα. Σε περίπτωση που χρησιµοποιηθούν παρατεταµένες επωάσεις, τοποθετήστε τους ιστούς σε υγρό περιβάλλον. Η ευαισθησία του EnVision+ System, HRP της Dako µπορεί να αυξηθεί περαιτέρω µε την παράταση των χρόνων επώασης στα βήµατα 2 και 3 για 5 έως 10 λεπτά. Πρωτόκολλο χρώσης ΒΗΜΑ 1 ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΥΠΕΡΟΞΕΙ ΑΣΗΣ Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος. Με χρήση χαρτοµάντιλου χωρίς χνούδι (όπως kimwipe ή γάζα), σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για να αφαιρέσετε τυχόν υγρό που παραµένει και για να διατηρήσετε το αντιδραστήριο στην περιοχή που συνιστάται. Τοποθετήστε αρκετή υπεροξειδάση αποκλεισµού από το φιαλίδιο 1 για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε για 5 (±1) λεπτά. Εκπλύντε απαλά µε απεσταγµένο νερό ή ρυθµιστικό διάλυµα από µια φιάλη πλύσης (µην εστιάζετε τη ροή απευθείας στον ιστό) και τοποθετήστε σε λουτρό µε πρόσφατο ρυθµιστικό διάλυµα. ΒΗΜΑ 2 ΠΡΩΤΟΓΕΝΕΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Ή ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Τοποθετήστε αρκετό πρωτογενές αντίσωµα, βέλτιστα αραιωµένο, ή αντιδραστήριο αρνητικού υλικού ελέγχου για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε για 30 (±1) λεπτά. Εκπλύντε απαλά µε ρυθµιστικό διάλυµα από µια φιάλη πλύσης (µην εστιάζετε τη ροή απευθείας στον ιστό) και τοποθετήστε σε λουτρό µε πρόσφατο ρυθµιστικό διάλυµα. Σε περίπτωση που πρέπει να διακοπεί η διαδικασία χρώσης, µπορείτε να διατηρήσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκας σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος µετά την επώαση ενός πρωτογενούς αντισώµατος (Βήµα 2) για έως µία ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 έως 25 C) χωρίς να επηρεάσετε την απόδοση της χρώσης. ΒΗΜΑ 3 ΒΗΜΑ 4 ΒΗΜΑ 5 ΠΟΛΥΜΕΡΕΣ ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΜΕ ΥΠΕΡΟΞΕΙ ΑΣΗ Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Τοποθετήστε αρκετό επισηµασµένο πολυµερές από το φιαλίδιο 2 για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε για 30 (±1) λεπτά. Εκπλύντε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως στο Βήµα 2. ΧΡΩΜΟΓΟΝΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Τοποθετήστε αρκετό από το παρασκευασµένο διάλυµα υγρού DAB+χρωµογόνο υποστρώµατοςγια να καλύψετε το δείγµα (βλ. ενότητα Παρασκευή αντιδραστηρίων). Επωάστε για περίπου 5 έως 10 λεπτά. Εκπλύντε απαλά µε απεσταγµένο νερό από µια φιάλη πλύσης (µην εστιάζετε τη ροή απευθείας στον ιστό). Για σωστή διάθεση, συλλέξτε το απόβλητο χρωµογόνο υποστρώµατος σε ένα δοχείο για επικίνδυνα υλικά. ΕΠΙΧΡΩΣΗ ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ (προαιρετική) Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό αιµατοξυλίνης (κωδικός S3309). Η διάρκεια της επώασης εξαρτάται από την ισχύ της αιµατοξυλίνης που χρησιµοποιείται. Εκπλύντε απαλά σε λουτρό απεσταγµένου νερού Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες 10 φορές σε λουτρό αµµωνίας 0,037 mol/l ή παρόµοιο παράγοντα κυάνωσης. Εκπλύντε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό για 2 έως 5 λεπτά. ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 5/8

6 ΒΗΜΑ 6 ΣΤΕΡΕΩΣΗ Τα δείγµατα ενδεχοµένως να στερεωθούν και να καλυφθούν µε καλυπτρίδα µε ένα µέσο στερέωσης υδατικής βάσης, όπως το Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή Faramount (κωδικός S3025) ή το µη υδατικό µέσο µόνιµης στερέωσης, Ultramount (κωδικός S1964). Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µπορούν επίσης να αφυδατωθούν και να στερεωθούν µόνιµα. Ποιοτικός έλεγχος Οι διαφορές στην επεξεργασία ιστού και τις τεχνικές διαδικασίες µεταξύ των εργαστηρίων των χρηστών ενδεχοµένως να παράγουν σηµαντική µεταβλητότητα αποτελεσµάτων, καθιστώντας απαραίτητη την τακτική ανάλυση υλικών ελέγχου του κάθε εργαστηρίου µαζί µε τις ακόλουθες διαδικασίες. Για πληροφορίες σχετικά µε την ανοσοϊστοχηµεία, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες για ποιοτικό έλεγχο του προγράµµατος πιστοποίησης του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (CAP) και, για πρόσθετες πληροφορίες, συµβουλευτείτε τις αναφορές 3 έως 5. Για λεπτοµέρειες σχετικά µε την ευαισθησία και την ανοσοαντιδραστικότητα, ανατρέξτε στο δελτίο προδιαγραφών για κάθε πρωτογενές αντίσωµα που χρησιµοποιείται. Για περαιτέρω οδηγίες σχετικά µε τα θετικά και αρνητικά υλικά ελέγχου, ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση». Ερµηνεία χρώσης Περιορισµοί Για κατευθυντήριες οδηγίες σχετικά µε την ερµηνεία, ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση». Η χρώση ιστού εξαρτάται από το σωστό χειρισµό και την επεξεργασία των ιστών πριν από τη χρώση. Η λανθασµένη στερέωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, στέγνωµα, θέρµανση, τοµή ή µόλυνση µε άλλους ιστούς ή υγρά ενδεχοµένως να παράγει τεχνήµατα, παγίδευση αντισώµατος ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα. Η χρήση παλαιών ή µη ρυθµισµένων στερεωτικών, ή η έκθεση των ιστών σε υπερβολική θερµότητα (υψηλότερη από 60 C) κατά την επεξεργασία ενδεχοµένως να έχει ως αποτέλεσµα τη µειωµένη ευαισθησία χρώσης. Η δραστικότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης ή ψευδοϋπεροξειδάσης µπορεί να βρεθεί σε αιµοπρωτεΐνες όπως αιµοσφαιρίνη, µυοσφαιρίνη, κυτόχρωµα και καταλάση, καθώς και σε ηωσινόφιλα. 6,7 Η δραστικότητα αυτή µπορεί να ανασταλεί µε την επώαση των δειγµάτων µε υπεροξειδάση αποκλεισµού, φιαλίδιο 1, του EnVision+ System, HRP της Dako για πέντε λεπτά πριν από την εφαρµογή του πρωτογενούς αντισώµατος. Η επεξεργασία των επιχρισµάτων αίµατος και µυελού των οστών και των καταψυγµένων ιστών µπορεί επίσης να γίνει µε το αντιδραστήριο αυτό. Ωστόσο, η διαδικασία αυτή δεν εξαλείφει την ερυθροκαφέ χρωστική των αιµοπρωτεϊνών. Εναλλακτικά, µπορεί να χρησιµοποιηθεί ένα διάλυµα µεθανόλης-υπεροξειδίου του υδρογόνου. Με τη διαδικασία αυτή, µερικά αντιγόνα ενδεχοµένως να µετουσιωθούν. Οι ιστοί από άτοµα µολυσµένα µε τον ιό της ηπατίτιδας B και που περιέχουν το επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg) ενδεχοµένως να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε υπεροξείδιο του χρένου. 8 Φυσιολογικός/µη άνοσος ορός από την ίδια ζωική πηγή όπως του δευτερεύοντος αντιορού που χρησιµοποιείται σε βήµατα αναστολής ενδεχοµένως να παράγει ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά αποτελέσµατα λόγω των αυτοαντισωµάτων ή των φυσικών αντισωµάτων. Τα αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν αραιωθεί βέλτιστα. Περαιτέρω αραίωση ενδεχοµένως να έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια της ανίχνευσης του αντιγόνου. Για τους γενικούς περιορισµούς, ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση». Αντιµετώπιση προβληµάτων Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. Καµία χρώση στην αντικειµενοφόρο πλάκα. 2. Ασθενής χρώση όλων των αντικειµενοφόρων πλακών. 3. Υπερβολική χρώση υπόβαθρου σε όλες τις αντικειµενοφόρους πλάκες. 1α. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιούνται µε τη σωστή σειρά. 1β. Υπάρχει αζίδιο του νατρίου στο λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος. 2α. Οι τοµές συγκρατούν υπερβολικό διάλυµα µετά το λουτρό πλύσης. 2β. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν επωάστηκαν αρκετό χρόνο µε τα αντισώµατα ή το υπόστρωµα. 3α. Τα δείγµατα περιέχουν υψηλή δραστικότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης 1α. Εξετάστε την εφαρµογή των αντιδραστηρίων. 1β. Χρησιµοποιήστε πρόσφατο ρυθµιστικό διάλυµα χωρίς αζίδιο. 2α. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια διαλύµατος πριν σκουπίσετε γύρω από την τοµή. 2β. Εξετάστε τους συνιστώµενους χρόνους επώασης. 3α. Χρησιµοποιήστε µεγαλύτερο χρόνο επώασης της υπεροξειδάσης αποκλεισµού, φιαλίδιο 1. ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 6/8

7 3β. Η παραφίνη δεν έχει αποµακρυνθεί εντελώς. 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν έχουν εκπλυθεί σωστά. 3δ. Ταχύτερη από τη φυσιολογική αντίδραση υποστρώµατος λόγω π.χ. υψηλής θερµοκρασίας δωµατίου. 3ε. Οι τοµές ξηράθηκαν κατά τη διαδικασία χρώσης. 3στ.Μη ειδική δέσµευση των αντιδραστηρίων στην τοµή ιστού. 3ζ. Το αντίσωµα είναι πολύ συµπυκνωµένο. 3β. Χρησιµοποιήστε λουτρό µε πρόσφατο ξυλόλιο ή τολουόλιο. Αν χρωµατίζονται αρκετές αντικειµενοφόροι πλάκες ταυτόχρονα, το δεύτερο λουτρό ξυλολίου θα πρέπει να περιέχει πρόσφατο ξυλόλιο. 3γ. Χρησιµοποιήστε πρόσφατα διαλύµατα στα λουτρά ρυθµιστικών διαλυµάτων και τις φιάλες πλύσης. Χρησιµοποιήστε TBST ως ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (κωδικός S3306). 3δ. Χρησιµοποιήστε συντοµότερο χρόνο επώασης µε το διάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος. 3ε. Χρησιµοποιήστε θάλαµο υγρασίας. Σκουπίστε µόνο τρεις ή τέσσερις αντικειµενοφόρους πλάκες τη φορά πριν τοποθετήσετε το αντιδραστήριο. 3στ.Τοποθετήστε διάλυµα αποκλεισµού που περιέχει πρωτεΐνη. 3ζ. Χρησιµοποιήστε µεγαλύτερη αραίωση για το πρωτογενές αντίσωµα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Σε περίπτωση που το πρόβληµα δεν µπορεί να αποδοθεί σε καµία από τις παραπάνω αιτίες, ή σε περίπτωση που η προτεινόµενη διορθωτική ενέργεια δεν επιλύσει το πρόβληµα, παρακαλείστε να καλέσετε το τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Μπορείτε να βρείτε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά µε τις τεχνικές χρώσης και την προετοιµασία δειγµάτων στο Handbook -Immunochemical Staining Methods 13 (διατίθεται από την Dako), το Atlas of Immunohistology 10 και το Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 11 Αναφορές 1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Center for Disease Control Manual Guide - Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, Georgia. April 30, Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Πρόσθετες αναφορές Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. DAKO Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 7/8

8 Edition 07/15 ( ) P04045GR_01_K4006_K4007/ σελ. 8/8