ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ (HPLC)

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ Π. ΑΓΡΑΦΙΩΤΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ (HPLC) Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 26

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ Π. ΑΓΡΑΦΙΩΤΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ (HPLC) Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυσικής Χηµείας, του Τοµέα Φυσικής, Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χηµείας, του Τµήµατος χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπ. Καθηγήτρια Αδριανή Παππά-Λουίζη - Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Καθηγητής Παναγιώτης Νικήτας - (Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής) Επικ. Καθηγητής Σωτήρης Σωτηρόπουλος-(Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής Αναστάσιος Βουλγαρόπουλος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/κης) Καθηγητής Γεώργιος Κοκκινίδης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/κης) Καθηγητής Ιωάννης Παπαδογιάννης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/κης) Αναπ.Καθηγήτρια Περσεφόνη Αυγουστίδου -Σαββοπούλου (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/κης)

3 Η επταµελής εξεταστική επιτροπή που διορίστηκε για την κρίση της ιδακτορικής ιατριβής της Παναγιώτας Αγραφιώτου, χηµικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης την Τρίτη , όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής µε τίτλο «Βελτιστοποίηση της ηλεκτροχηµικής ανίχνευσης και του διαχωρισµού των αµινοξέων µε υγρή χρωµατογραφία (HPLC)». Η επιτροπή έκρινε οµόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συµβολή στην πρόοδο της Επιστήµης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Αναπ. Καθηγήτρια Α ΡΙΑΝΗ ΠΑΠΠΑ-ΛΟΥIΖΗ Καθηγητής ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΝΙΚΗΤΑΣ. Επικ. Καθηγητής ΣΩΤΗΡΗΣ ΣΩΤΗΡΟΠΟΥΛΟΣ. Καθηγητής ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΒΟΥΛΓΑΡΟΠΟΥΛΟΣ. Καθηγητής ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΟΚΚΙΝΙ ΗΣ. Καθηγητής ΙΩΑΝΝΗΣ ΠΑΠΑ ΟΓΙΑΝΝΗΣ... Αναπ.Καθηγήτρια ΠΕΡΣΕΦΟΝΗ ΑΥΓΟΥΣΤΙ ΟΥ ΣΑΒΒΟΠΟΥΛΟΥ

4 «Η έγκριση της παρούσης ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα Χηµείας τη Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα» (Ν.5343/1932, άρθρο 22, παρ.2)

5 Στους γονείς µου

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΣΚΟΠΟΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ 7 Α ΜΕΡΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ HPLC ΚΑΙ ΣΤΗΛΕΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ 13 Α.Ι ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ 15 Α.I.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 15 Α.Ι.2 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 21 Α.Ι.2.1 ΚΥΚΛΙΚΗ ΒΟΛΤΑΜΜΕΤΡΙΑ ΜΕ ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟ- ΗΛΕΚΤΡΟ ΙΑ ΣΕ ΣΤΑΤΙΚΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ 21 - Συνθήκες σταθερής και µη σταθερής κατάστασης 22 - Κυκλικά βολταµµογραφηµατα µακρο- και µικρο-ηλεκτροδίων 24 Α.Ι.2.2 ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ HPLC 29 - Τύποι ηλεκτροχηµικών ανιχνευτών 3 - Ρεύµα σταθερής κατάστασης σε κυψέλες ροής 31 - Το φορτίο που διέρχεται από τον αµπεροµετρικό ανιχνευτή σε πείραµα HPLC 38 - Σύγκριση συνθηκών µεταφοράς µάζας σε κυψέλη ροής λεπτής στιβάδας ΗPLC και µικρο-ηλεκτροδίων σε στατικά διαλύµατα 39 - Σύγκριση κυκλικής βολταµµετρίας µε υδροδυναµικά διαγράµµατα που παίρνονται σε ηλεκτροχηµικές κυψέλες HPLC 41 1

7 Α.Ι.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 43 Α.Ι.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 47 Α.Ι.4.1 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΗΛΕΚΡΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ Υ ΑΤΙΚΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ - ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΜΕ iproh ΩΣ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΗ 47 - Κυκλική βολταµµετρία µε µακρο-ηλεκτρόδιο 47 - Kυκλική βολταµµετρία µε µικροηλεκτρόδιο 56 - Ηλεκτροxηµική µελέτη αµινοξέων σε κυψέλες HPLC, υδροδυναµικά διαγράµµατα 61 Α.Ι.4.2 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ ΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΜΕ iprοη ΩΣ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΗ 69 - Υδροδυναµικά διαγράµµατα σε κυψέλη µε µακρο- ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (κυψέλη α) 72 - Υδροδυναµικά διαγράµµατα σε κυψέλη µε µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και 2 ίνες άνθρακα (κυψέλη β) 72 - Κυκλική βολταµµετρία µε µικρο-δίσκο άνθρακα 73 - Σύγκριση πυκνοτήτων ρεύµατος που καταγράφηκαν στα κυκλικά βολταµµογραφήµατα και στα υδροδυναµικά διαγράµµατα 75 - Σύγκριση υαλώδους άνθρακα της κυψέλης α και της κυψέλης β 79 - Σύγκριση µακρο-ηλεκτροδίου της κυψέλης β και του µικρο-δίσκου σε στατικό διάλυµα 8 - Σύγκριση µακρο-ηλεκτροδίου και µικρο-ινών της κυψέλης β 82 - Σύγκριση µικρο-δίσκoυ στην κυκλική βολταµµετρία µε τις δύο ίνες άνθρακα της κυψέλης β 84 Α.Ι.4.3. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΣΕ ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΜΕ MeCN ΩΣ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΗ 86 A.Ι.5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 11 A.Ι.6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 14 2

8 A.ΙI ΒΕΛΤΙΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΙΠΛΗ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ, ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΙΠΛΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΣΤΟ UV 17 Α.ΙΙ.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 17 Α.ΙΙ.2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 18 Α.ΙΙ.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ 112 Α.ΙΙ.3.1 ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ ΚΑΤΑΓΡΑΦΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΣΗΜΑΤΩΝ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΤΩΝ 112 Α.ΙΙ.3.2 ΒΕΛΤΙΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ 113 Α.ΙΙ.3.3 ΒΕΛΤΙΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΣΤΟ UV 116 Α.ΙΙ.3.4 ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ 122 Α.ΙΙ.3.5 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ 124 Α.IΙ.4 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 126 Α.IΙ.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 128 A.ΙII ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΠΟΛΥΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 129 Α.ΙΙI.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 129 Α.ΙΙI.2 ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΕΣ ΕΚΦΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΧΡΟΝΩΝ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΒΑθΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 131 Α.ΙΙI.3 ΑΝΑΛΥΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ Ε ΟΜΕΝΩΝ 137 3

9 Α.ΙΙI.3.1 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΓΙΑ ΤΗ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΠΟΛΥΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 138 Α.ΙΙI.3.2 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΙΜΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΤΗΣ Εξ.(21) ΠΟΥ ΠΕΡΙΓΡΑΦΕΙ ΤΗΝ ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ 142 Α.ΙΙI.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 145 Α.ΙIΙ.5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 146 Α.ΙIΙ.6 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 159 Α.ΙIΙ.7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 162 A.ΙV ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΤΗΣ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ 165 Α.ΙV.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 165 Α.ΙV.2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 167 Α.ΙV.3 ΑΝΑΛΥΣΗ Ε ΟΜΕΝΩΝ 169 Α.ΙV.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 17 Α.ΙV.4.1 ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ 17 Α.ΙV.4.2 ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 176 Α.ΙV.4.3 ΙΟΡΘΩΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 186 Α.ΙV.4.4 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΤΗΣ ΜΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 22 Α.ΙV.5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 219 Α.ΙV.6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 222 4

10 Β ΜΕΡΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ HPLC ΚΑΙ ΣΤΗΛΕΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ 225 Β.Ι ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΤΟ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ AQC 227 B.I.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 227 Β.Ι.2 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΟ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ AQC 229 Β.Ι.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 232 Β.Ι.3.1 ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΤΟ AQC 232 Β.Ι.3.2 ΣΥΣΤΗΜΑ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ- ΣΤΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ 233 Β.Ι.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 235 Β.Ι.4.1 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Ηλεκτροχηµική µελέτη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων-σύγκριση µε µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα Μελέτη της απορρόφησης των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων στο UV-Σύγκριση µε τα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα Μελέτη της φθορισµοµετρικής συµπεριφοράς των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων- Σύγκριση µε τα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα Βελτιστοποίηση της ανίχνευσης των παραγώγων των αµινοξέων µε τρεις ανιχνευτές σε σειρά :UV-FL-EC 259 Β.Ι.4.2 ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Ισοκρατική µελέτη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων Πρόβλεψη της συγκράτησης των παραγώγων των αµινοξέων κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης-βελτιστοποίηση διαχωρισµού 267 5

11 - Πρόβλεψη της ισοκρατικής συγκράτησης των παραγώγων των αµινοξέων από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης 284 Β.Ι.5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 287 Β.Ι.6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 29 EXTENDED SUMMARY 293 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 297 ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΣΥΝΕ ΡΙΑ ΠΟΥ ΠΡΟΕΚΥΨΑΝ 299 ΑΠΟ ΤΗ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ 6

12 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Στην παρούσα διατριβή έγινε βελτιστοποίηση της ανίχνευσης και του διαχωρισµού µιας σειράς αµινοξέων µε τη µέθοδο της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) και τη χρήση στηλών αντίστροφης φάσης. Προς το σκοπό αυτό, στο Α Μέρος της διατριβής, ασχοληθήκαµε αποκλειστικά και σε βάθος µε την ανίχνευση και το διαχωρισµό των ελεύθερων µη παραγωγοποιηµέων αµινοξέων, και στο Β Μέρος µε την ανίχνευση και το διαχωρισµό των ίδιων αµινοξέων µετά την παραγωγοποίηση τους µε τον καρβαµιδικό εστέρα της 6-Ν-αµινοκινολίνης και του Ν-υδροξυ-σουκινιµιδίου (AQC). Συγκεκριµένα, στο Α Μέρος της διατριβής, που αποτελείται από 4 κεφάλαια, περιλαµβάνονται τα παρακάτω θέµατα : Στο πρώτο κεφάλαιο, Α.Ι, µελετήθηκε η ηλεκτροχηµική ανίχνευση των ελεύθερων αµινοξέων χρησιµοποιώντας κυψέλη ροής µε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα συµβατικού µεγέθους (διαµέτρου 3mm), αλλά και κυψέλη µε δύο ηλεκτρόδια σε σειρά, ενός συµβατικού υαλώδους άνθρακα και δύο µικροινών άνθρακα (διαµέτρου 3µm και µήκους,5cm). Ο έλεγχος δύο σηµάτων ηλεκτροχηµικής ανίχνευσης ήταν δυνατός χάρη στον κατάλληλο πολλαπλό ποτενσιοστάτη που κατασκευάστηκε στο εργαστήριο του Φυσικού Τµήµατος του Α.Π.Θ. Επίσης, στο κεφάλαιο αυτό εξετάσαµε κατά πόσο οι συνθήκες που επικρατούν σε µια κυψέλη ροής µπορούν να προσοµοιωθούν µε τις συνθήκες που επικρατούν σε µια στατική κυψέλη βολταµµετρίας, όταν σαν ηλεκτρόδιο εργασίας χρησιµοποιείται µικροδίσκος άνθρακα (διαµέτρου 3µm), σε τρόπο ώστε τα εύκολα καταγραφόµενα κυκλικά βολταµµογραφήµατα να µπορούν να µας δίνουν τις ίδιες πληροφορίες µε τα υδροδυναµικά διαγράµµατα που παίρνονται µε τις κυψέλες ροής και απαιτούν πολύ χρόνο. Στο δεύτερο κεφάλαιο, Α.ΙΙ, βελτιστοποιήσαµε την ανίχνευση των ελεύθερων αµινοξέων µε τη χρήση τριών ανιχνευτών σε σειρά : UV, φθορισµοµετρικού και πολλαπλού 7

13 ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή. Συγκεκριµένα, σε κάθε χρωµατογράφηµα καταγράφαµε ταυτόχρονα την απορρόφηση των αµινοξέων σε δύο µήκη κύµατος, το φυσικό τους φθορισµό και το ηλεκτροχηµικό τους σήµα σε µακρο- και µικρο- ηλεκτρόδιο άνθρακα. Τη δυνατότητα καταγραφής της πολλαπλής ανίχνευσης µας την έδινε το κατάλληλο λογισµικό που αναπτύξαµε στο εργαστήριό µας στα πλαίσια αυτής της διδακτορικής διατριβής. Όσον αφορά τέλος τη βελτιστοποίηση του διαχωρισµού των ελεύθερων αµινοξέων, αυτό έγινε στο τρίτο και στο τέταρτο κεφάλαιο, Α.ΙΙΙ και Α.IV αντίστοιχα, του Α Μέρους της διατριβής. Συγκεκριµένα, στο κεφάλαιο Α.ΙΙΙ βελτιστοποιήσαµε το διαχωρισµό των ελεύθερων αµινοξέων που µελετήσαµε υπό συνθήκες πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης, χρησιµοποιώντας έναν κατάλληλο γενετικό αλγόριθµο που αναπτύξαµε στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Όµως, πριν βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού προηγήθηκε µια ακριβής πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης των αναλυόµενων ουσιών από τη χρωµατογραφική στήλη υπό διάφορες συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. Αυτό απαιτούσε την ανάπτυξη κατάλληλων εξισώσεων και λογισµικών και ήταν ιδιαίτερα δύσκολο στην περίπτωση της βαθµωτής έκλουσης που ξεκινάει από καθαρή υδατική κινητή φάση στην οποία προστίθεται η ισοπροπανόλη ως οργανικός διαλύτης στη βαθµωτή µεταβολή. Στην περίπτωση αυτή, λόγω µη ισορροπίας της στήλης κατά τη διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης, απαιτούνται ειδικές διορθώσεις στους χρόνους συγκράτησης των χρωµατογραφούµενων ουσιών µε µία µέθοδο που αναπτύξαµε στο κεφάλαιο Α.ΙV του Α Μέρους της διατριβής. Τέλος, στο Β Μέρος της διδακτορικής διατριβής, βελτιστοποιήθηκε η ανίχνευση και ο διαχωρισµός των ίδιων αµινοξέων που µελετήθηκαν στο Α Μέρος της διατριβής µετά την παραγωγοποίηση τους µε το αντιδραστήριο AQC, και έγινε µία σύγκριση της έµµεσης και της άµεσης ανάλυσης των αµινοξέων, δηλαδή της ανάλυσής τους µε και χωρίς παραγωγοποίηση. Στο σηµείο αυτό θα πρέπει να τονιστούν τα ακόλουθα για την επιλογή µας γενικά να ασχοληθούµε στη διατριβή αυτή µε τη 8

14 χρωµατογραφική ανάλυση των αµινοξέων : Η µεγάλη πολικότητα των αµινοξέων και η έλλειψη µια ισχυρής χρωµοφόρας ή ηλεκτροενεργής οµάδας έχει ως αποτέλεσµα τόσο ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός όσο και η ανίχνευση των αµινοξέων να είναι µια δύσκολη υπόθεση. Γι αυτό και µετά από πολλά χρόνια έρευνας πάνω στην ανάλυση των αµινοξέων µε HPLC, δεν έχει αναπτυχθεί µέχρι σήµερα κάποια µέθοδος που να πλεονεκτεί εµφανώς έναντι των άλλων µεθόδων και να στερείται κατά το δυνατό µειονεκτηµάτων. Κάθε καινούργια λοιπόν ιδέα αναλυτικής τεχνικής εφαρµόζεται σχεδόν πρώτα στην ανάλυση των αµινοξέων µε σκοπό την βελτιστοποίηση του προσδιορισµού τους, δεδοµένου του ενδιαφέροντος που υπάρχει για τον προσδιορισµό των αµινοξέων σε βιολογικά δείγµατα, καθώς οι προσδιοριζόµενες µεταβολές στις συγκεντρώσεις των αµινοξέων σε βιολογικά δείγµατα σχετίζονται µε σοβαρές νευρολογικές διαταραχές, όπως είναι η ασθένεια Alzheimer καθώς και µε έναν αριθµό µεταβολικών νοσηµάτων. Τέλος, η επιλογή των συγκεκριµένων αµινοξέων στην παρούσα διατριβή, τα οποία µπορούν να προσδιοριστούν τόσο άµεσα όσο και έµµεσα µετά από παραγωγοποίηση, δίνει τη δυνατότητα σύγκρισης των δύο µεθόδων και την πρόταση µιας εναλλακτικής λύσης για τον άµεσο προσδιορισµό µιας σειράς αµινοξέων, χωρίς τη διαδικασία παραγωγοποίησης που πάντα εισάγει µια µη επιθυµητή πολυπλοκότητα στη µέθοδο της ανάλυσης και επιπλέον ενέχει προβλήµατα επαναληψιµότητας και απόδοσης. Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής έγινε στο εργαστήριο Φυσικής Χηµείας του Τµήµατας Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Α.Π.Θ. υπό την επίβλεψη της Αναπλ. Καθηγήτριας κ. Α. Παππά Λουίζη, και συνχρηµατοδοτήθηκε από το Υπουργείο Παιδείας και από την Ευρωπαϊκή Ένωση/Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταµείο (ΕΠΕΑΕΚ/ΑΚΤ) στα πλαίσια των υποτροφιών βασικής έρευνας «Ηράκλειτος» µε επιστηµονικό υπεύθυνο την Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Α. Παππά Λουίζη. Σε αυτό το σηµείο, αισθάνοµαι την ανάγκη να ευχαριστήσω θερµότατα την Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Α. Παππά Λουίζη, επιβλέπουσα 9

15 καθηγήτρια της συγκεκριµένης διαδακτορικής διατριβής, για τη συνεχή παρακολούθηση της εξέλιξης της διατριβής, την ενεργό της συµµετοχή, την επιστηµονική καθοδήγηση σε όλους τους τοµείς µε τους οποίους ασχολήθηκα και ειδικότερα σε θέµατα της υγρής χρωµατογραφίας, τη στήριξη, την άψογη συνεργασία και το απόλυτα φιλικό περιβάλλον που µου προσέφερε καθόλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής µου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τον Καθηγητή κ. Π. Νικήτα, µέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, για την ενεργό συµµετοχή και στήριξη σε όλη τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής, για την επιστηµονική βοήθεια και συµβουλές που µου προσέφερε, καθώς και για την ανάπτυξη των προγραµµάτων πρόβλεψης των χρόνων έκλουσης των ουσιών και βελτιστοποίησης του διαχωρισµού τους, τα οποία ήταν καθοριστικά στην εξέλιξη της διατριβής µου. Βαθύτατα ευχαριστώ τον Επίκ. Καθηγητή κ. Σ. Σωτηρόπουλο, µέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, για όλες τις γνώσεις που µου προσέφερε σε ότι αφορά το κοµµάτι της Ηλεκτροχηµείας που εφάρµοσα στη συγκεκριµένη διατριβή, για τα µικροηλετρόδια και τις ειδικές κυψέλες ροής HPLC που κατασκεύασε και µε τον τρόπο αυτό βοήθησε στη βελτιστοποίηση της ηλεκτροχηµικής ανίχνευσης των αµινοξέων, για την άριστη συνεργασία, το ενδιαφέρον του, τη πολύτιµη βοήθεια και στήριξη. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπλ. Καθηγήτρια του Ιατρικού Τµήµατος του Α.Π.Θ. κ. Π. Αυγουστίδου- Σαββοπούλου, η οποία, ως ειδική στην ανάλυση των αµινοξέων στο Ερευνητικό Βιοχηµικό Εργαστήριο της Α Πανεπιστηµιακής Παιδιατρικής Κλινικής του Ι.Γ.Π.Ν.Θ., συµµετέχει στη συνεργαζόµενη ερευνητική οµάδα του προγράµµατος «Ηράκλειτος» και αποτελεί µέλος της Επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής, για την εµπειρία και τις γνώσεις που απέκτησα στο εργαστήριο της κατά την τρίµηνη παραµονή µου εκεί και την ενασχόλησή µου µε την ανάλυση φυσικών δειγµάτων αµινοξέων. Τις ειλικρινείς µου ευχαριστίες µου θα ήθελα να εκφράσω στον Καθηγητή κ. Α. Βουλγαρόπουλο, στον Καθηγητή κ. Γ. Κοκκινίδη και στον 1

16 Καθηγητή κ. Ι. Παπαδογιάννη, µέλη της επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής, οι οποίοι ήταν πρόθυµοι να αξιολογήσουν τη συγκεκριµένη διατριβή και να βοηθήσουν στη βελτίωση της µε τις καθοριστικές τους υποδείξεις. Κλείνοντας, οφείλω ένα µεγάλο ευχαριστώ στους γονείς µου, Παύλο και Μαρία Αγραφιώτη καθώς και στα δύο µου αδέρφια ηµήτρη και Στέφανο, για την ανεξάντλητη ηθική, ψυχολογική και υλική υποστήριξή τους σε όλη την πορεία µου και την προσπάθειά µου. Παναγιώτα Π. Αγραφιώτου Θεσσαλονίκη, εκέµβριος 26 11

17 12

18 Α ΜΕΡΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ HPLC ΚΑΙ ΣΤΗΛΕΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ 13

19 14

20 Α.Ι ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Α.I.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όπως αναφέρθηκε και στο σκοπό της διδακτορικής διατριβής, οι µελέτες οι οποίες πραγµατοποιήθηκαν στο Α µέρος της διατριβής αναφέρονται µόνο σε ελεύθερα αµινοξέα. Τα αµινοξέα που επιλέχθηκαν να µελετηθούν είναι αµινοξέα τα οποία µπορούν από µόνα τους χωρίς να παραγωγοποιηθούν - να ανιχνεύονται σε κάποιον ανιχνευτή, ηλεκτροχηµικό [1-28], φθορισµοµετρικό ή ανιχνευτή UV. Πριν την έναρξη κάθε έρευνας είναι απαραίτητη η µελέτη της συµπεριφοράς που εµφανίζει η κάθε ουσία στον αισθητήρα ο οποίος θα χρησιµοποιηθεί για την ανίχνευσή της. Πιο συγκεκριµένα, σε αυτό το κεφάλαιο θα µελετηθεί η συµπεριφορά των αµινοξέων στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή (EC) και για το σκοπό αυτό θα γίνει µια εκτενής µελέτη της ηλεκτροχηµικής συµπεριφοράς των αµινοξέων τόσο σε µακρο- όσο και σε µικρο- ηλεκτρόδια. Στη συγκεκριµένη διατριβή µελετήθηκαν 19 αµινοξέα, ένα διπεπτίδιο (καρνοσίνη) και η κρεατινίνη, η οποία ανήκει στις βιολογικές βάσεις και συνυπάρχει µε τα αµινοξέα στα βασικά βιολογικά υγρά. Οι συντακτικοί τύποι όλων των χηµικών ενώσεων που χρησιµοποιήθηκαν φαίνονται στο Σχήµα A.I.1 : 15

21 H 2 N CH C OH CH 2 O CH 3 H 2 N C C OH CH 2 O HO HO OH OH β-(3,4-δι-ύδροξυ-φαίνυλο) -αλανίνη (dopa) α-µέθυλο-dopa (me-dopa) O O O H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 S N CH 3 µεθειονίνη (met) ιστιδίνη (his) φαινυλαλανίνη (phe) NH O H 2 N CH C OH CH 2 O O S H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 CH CH 3 CH 2 H 2 N CH C OH CH CH 3 CH 2 O CH 3 CH 3 Κυσταθειονίνη (cysta) Λευκίνη (leu) Ισολευκίνη (Ile) 16

22 O O O H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 CH 2 O 2 N OH HO OH Τυροσίνη (tyr) µετα-τυροσίνη (m-tyr) 3-n-τυροσίνη (n-tyr) CH 3 O O H 2 N C C OH OH CH 2 CH 2 O O H 3 C N H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH C NH CH 2 CH 2 OH NH 2 S S µεθυλο-τυροσίνη κρεατίνη (crn) Κυστίνη (cys-cys) (me-tyr) O O O H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 S SH SH CH 3 Κυστεΐνη (cys) Οµοκυστεΐνη (hcy) s-µεθυλο-κυστεΐνη (me-cys) 17

23 O O H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 HN HN OH τρυπτοφάνη (trp) 5-υδροξυ-τρυπτοφάνη (5htp) O C CH OH N H O C H 2 CH 2 O N H CH 2 NH 2 NH N N NH CH 3 Καρνοσίνη (car) κρεατινίνη (cre) Σχήµα A.I.1 : Ουσίες που µελετήθηκαν στη συγκεκριµένη διατριβή Οι παραπάνω ενώσεις, ανάλογα µε το χηµικό τους τύπο, κατατάσσονται σε ορισµένες κατηγορίες οι οποίες είναι οι: Α. Αρωµατικές υδροξυ-ενώσεις : - Κατεχόλες : έχουν στο µόριό τους τον κατεχολικό δακτύλιο ο οποίος απεικονίζεται στο Σχήµα A.I.2.α. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν η dopa και η me-dopa. - Φαινόλες : έχουν στο µόριό τους το φαινολικό δακτύλιο ο οποίος απεικονίζεται στο Σχήµα A.I.2.β. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν η tyr, m-tyr, me-tyr και n-tyr. 18

24 B. Ινδόλες : - 3-ινδολο-ενώσεις : έχουν στο µόριό τους το δακτύλιο που απεικονίζεται στο Σχήµα A.I.2.γ. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκει η trp. - 5-υδροξυ-ινδόλες : έχουν στο µόριό τους το δακτύλιο που απεικονίζεται στο Σχήµα A.I.2.δ. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκει η 5htp. α. β. HO HO R HO R γ. δ. HO R NH R NH Σχήµα A.I.2 : α. κατεχόλες, β. φαινόλες, γ. 3-ινδολο-ενώσεις και δ. 5-υδροξυινδόλες. Για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση των παραπάνω αµινοξέων, γενικά γνωρίζουµε [29] ότι οι οµάδες που µπορούν να οξειδωθούν, και άρα να δώσουν σήµα στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή είναι : 1. ΟΗ σε αρωµατικό δακτύλιο 2. ΝΗ 2 σε αρωµατικό δακτύλιο 3. θειολικές οµάδες καθώς και το Ν και το S που βρίσκονται σε ετεροκυκλικές ενώσεις. Από τις κατηγορίες των αµινοξέων που αναφέρθηκαν πιο πάνω, είναι γνωστό [29] ότι οι ενώσεις που περιέχουν τον κατεχολικό δακτύλιο καθώς 19

25 και οι 5-υδροξυ-ινδόλες οξειδώνονται γύρω στα,8v vs Ag/AgCl, οι φαινόλες γύρω στα 1,2V και οι ινδόλες γύρω στο 1V. Η οξείδωση του κατεχολικού δακτυλίου είναι µία αντίδραση δύο ηλεκτρονίων, που οδηγεί στην αντίστοιχη κινόνη που απεικονίζεται στο Σχήµα Α.Ι.3.α. Η οξείδωση του φαινολικού υδροξυλίου οδηγεί µε αποβολή ενός ηλεκτρονίου στην αντίστοιχη φαινολική ρίζα Α.Ι.3.β.i και µε αποβολή ενός δεύτερου ηλεκτρονίου στο φαινολικό κατιόν Α.Ι.3.β.ii. Αµφότερα είναι ασταθή και στο διάλυµα δίνουν διάφορα παράγωγα (προϊόντα). Η οξείδωση του ινδολικού δακτυλίου οδηγεί στο προϊόν του Σχήµατος Α.Ι.3.γ και πρόκειται για µια αντίδραση δύο ηλεκτρονίων [7]. Η οξείδωση του υδροξυ-ινδολικού δακτυλίου µε µια αντίδραση τεσσάρων ηλεκτρονίων, οδηγεί στο προϊόν του Σχήµατος Α.Ι.3.δ. α. β. i. ii. O O R. Ο R Ο + R γ. δ. O O O R N R N Σχήµα Α.Ι.3 : Οξείδωση του α. κατεχολικού, β. του φαινολικού, γ. του ινδολικού δακτυλίου και δ. του υδροξυ-ινδολικού δακτυλίου. 2

26 Α.Ι.2. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α.Ι.2.1 ΚΥΚΛΙΚΗ ΒΟΛΤΑΜΜΕΤΡΙΑ ΜΕ ΜΑΚΡΟ- ΚΑΙ ΜΙΚΡΟ-ΗΛΕΚΤΡΟ ΙΑ ΣΕ ΣΤΑΤΙΚΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ Σε ένα ηλεκτροχηµικό σύστηµα οι παράµετροι που µπορούν να µεταβάλλονται είναι τέσσερις : 1. Το δυναµικό του ηλεκτροδίου, Ε 2. Το ρεύµα ή η πυκνότητα ρεύµατος, I ή i 3. Ο χρόνος λήψης της µέτρησης, t 4. Η συγκέντρωση της ηλεκτρενεργής ουσίας στο διάλυµα του ηλεκτρολύτη, C b. Η κυκλική βολταµµετρία ανήκει στις ηλεκτροχηµικές µεθόδους και αποτελεί µια από τις καλύτερες τεχνικές για τη µελέτη ηλεκτροδιακών δράσεων [3,31]. Γενικά χρησιµοποιείται για την προκαταρκτική µελέτη νέων συστηµάτων, λόγω του ότι µπορεί να δώσει βασικές πληροφορίες για την συµπεριφορά µιας ουσίας σε πολύ µικρό χρονικό διάστηµα. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί άµεσα για ποσοτικές µελέτες, για τη µελέτη του µηχανισµού και της κινητική µιας ηλεκτροδιακής δράσης. Επίσης, η κυκλική βολταµµετρία είναι µία µέθοδος που βασίζεται στην µεταβολή του δυναµικού µε σταθερή ταχύτητα κατά την οποία και καταγράφεται η µεταβολή του ρεύµατος (Ι) κατά την ηλεκτροδιακή δράση σε συνάρτηση µε το εφαρµοζόµενο δυναµικό (E). Ουσιαστικά, τα βολταµµογραφήµατα που προκύπτουν δεν είναι τίποτα άλλο παρά καµπύλες i E. Συνήθως, οι κυψέλες που χρησιµοποιούνται είναι τριών ηλεκτροδίων όπου δηλαδή υπάρχουν το ηλεκτρόδιο αναφοράς, το ηλεκτρόδιο εργασίας και το βοηθητικό ηλεκτρόδιο, ώστε να αποφεύγονται φαινόµενα πόλωσης του ηλεκτροδίου αναφοράς. Για µεγαλύτερη ακρίβεια του δυναµικού που εφαρµόζεται στο ηλεκτρόδιο εργασίας, συνιστάται να τοποθετείται το 21

27 ηλεκτρόδιο εργασίας πολύ κοντά στο ηλεκτρόδιο αναφοράς (ελαττώνεται η πτώση δυναµικού λόγω ωµικής απώλειας ir πτώση). Το βοηθητικό ηλεκτρόδιο θα πρέπει να τοποθετείται σχετικά κοντά στο ηλεκτρόδιο εργασίας ώστε να περιορίζεται το συνολικά εφαρµοζόµενο δυναµικό στην κυψέλη (και να µην υπερβαίνει το όριο συµβατότητας compliance voltage - του ποτενσιοστάτη). Τέλος, το ηλεκτρόδιο εργασίας θα πρέπει να έχει µικρή επιφάνεια συγκριτικά µε το βοηθητικό ηλεκτρόδιο ώστε να αποφεύγονται φαινόµενα πόλωσης στο δεύτερο ηλεκτρόδιο [31]. Συνθήκες σταθερής και µη σταθερής κατάστασης Αν το προφίλ της συγκέντρωσης, C, και η ποσότητα x C της ( ) x= ηλεκτροενεργής ουσίας, όπου x η απόσταση από την ηλεκτροδιακή επιφάνεια, άρα και η πυκνότητα ρεύµατος που δίνεται από τη σχέση i=nfd x C =nf(d/δ) ( C ) ( ) x= C, καθώς και η στιβάδα διάχυσης δ, c x παραµένουν σταθερά µε το χρόνο, τότε επικρατούν συνθήκες σταθερής κατάστασης (steady state). Στην παραπάνω ισότητα, n είναι ο αριθµός ηλεκτρονίων που µεταφέρονται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, C είναι η συγκέντρωση της ηλεκτροενεργής ουσίας, F η σταθερά Faraday και D ο συντελεστής διάχυσης της ουσίας. Αν όµως το προφίλ της συγκέντρωσης, C, και η ποσότητα C x ( ) x= της ηλεκτρoενεργής ουσίας, άρα και η πυκνότητα ρεύµατος, i=nfd C, καθώς και η στιβάδα διάχυσης δ, µεταβάλλονται µε το x ( ) x = χρόνο, τότε επικρατούν συνθήκες µη σταθερής κατάστασης (non-steady state). 22

28 Γενικά, στην κυκλική βολταµµετρία όπου χρησιµοποιούνται στατικά µακρο-ηλεκτρόδια, επειδή επικρατούν συνθήκες γραµµικής διάχυσης, οπότε και τα x C, δ και i µεταβάλλονται µε το χρόνο, δεν υπάρχουν ( ) x= συνθήκες σταθερής κατάστασης. Είναι βέβαια δυνατό, σε κάποιες ηλεκτροχηµικές µετρήσεις να επικρατούν συνθήκες σταθερής κατάστασης. Αν η ταχύτητα σάρωσης του δυναµικού είναι πολύ µικρή, σχεδόν µηδενική, το ηλεκτρόδιο εργασίας θα βρίσκεται πρακτικά υπό σταθερό δυναµικό και έπειτα από πολύ χρόνο, χωρίς να υπάρχει ανάδευση στην κυψέλη, θα δηµιουργηθούν συνθήκες σταθερής κατάστασης λόγω φυσικής ανάδευσης που τελικά σταθεροποιούν τη στιβάδα διάχυσης. δ. Επίσης, αν χρησιµοποιηθεί ειδική µεµβράνη διάχυσης στο ηλεκτρόδιο εργασίας θα µπορούσαν και πάλι να επιτευχθούν συνθήκες σταθερής κατάστασης µετά την έλευση ικανού χρόνου, ώστε η στιβάδα διάχυσης να φτάσει στα όρια της µεµβράνης και να σταθεροποιηθεί στο πάχος της. Γενικά, για να δηµιουργηθούν συνθήκες σταθερής κατάστασης θα πρέπει να έχει αποκτήσει το πάχος της στιβάδας διάχυσης σταθερή τιµή. Ακόµη όµως και µε τις παραπάνω µεθόδους δε γίνεται να επιτευχθούν πλήρως επαναλήψιµες συνθήκες σταθερής κατάστασης στη κυκλική βολταµµετρία µε στατικό µακρο- ηλεκτρόδιο. Κάτι τέτοιο όµως δεν συµβαίνει στην κυκλική βολταµµετρία όταν χρησιµοποιούνται µικρο ηλεκτρόδια. Ο χρόνος που απαιτείται για να δηµιουργηθούν συνθήκες σταθερής κατάστασης, δηλαδή πλήρης ανάπτυξη της στιβάδας διάχυσης, δ (δ=πr/4), χοντρικά προβλέπεται από τη σχέση 6 A/D, όπου Α είναι η επιφάνεια του µικροηλεκτροδίου και D ο συντελεστής διάχυσης της ουσίας [32]. Παρατηρούµε ότι όσο πιο µικρό είναι το ηλεκτρόδιο, τόσο πιο γρήγορα θα επιτευχθούν οι συνθήκες σταθερής κατάστασης. 23

29 Κυκλικά βολταµογραφηµατα µακρο- και µικρο-ηλεκτροδίων Η µορφή που θα έχουν τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα εξαρτάται από το αν επικρατούν συνθήκες σταθερής κατάστασης ή µη σταθερής κατάστασης. Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, σταθερή κατάσταση έχουµε όταν χρησιµοποιούµε, σε στατικά διαλύµατα, µικρο-ηλεκτρόδια, ενώ µη σταθερή κατάσταση όταν χρησιµοποιούµε µακρο-ηλεκτρόδια. Βολταµµογραφήµατα σταθερής κατάστασης. Το χαρακτηριστικό στα βολταµµογραφήµατα σταθερής κατάστασης είναι η σιγµοειδής µορφή που έχουν. ηλαδή, η πυκνότητα ρεύµατος αρχικά αυξάνεται µε αύξηση του δυναµικού και στο τέλος αποκτά µία οριακή τιµή η οποία και παραµένει σταθερή καθώς αυξάνεται το δυναµικό. Το φαινόµενο αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι κατά την αύξηση του δυναµικού πάνω από µία ορισµένη τιµή (µετά το δυναµικό ισορροπίας) η επιφανειακή συγκέντρωση του ηλεκτροδραστικού συστατικού µηδενίζεται, η στιβάδα διάχυσης παραµένει σταθερή και από ένα σηµείο και έπειτα το προφίλ συγκέντρωσης και η κλίση του x C παραµένουν σταθερά, µε ( ) x= αποτέλεσµα η πυκνότητα ρεύµατος, i, να αποκτά µία οριακή τιµή. Στο Σχήµα A.I.4(Α) απεικονίζεται ένα βολταµµογράφηµα σταθερής κατάστασης και στο Σχήµα A.I.4(Β) απεικονίζεται ένα βολταµµογράφηµα σχεδόν σταθερής κατάστασης στο οποίο η υστέρηση που εµφανίζεται ανάµεσα στο ρεύµα οξείδωσης και αναγωγής οφείλεται στην υψηλή ταχύτητα σάρωσης [33]. 24

30 (Α) (Β) Σχήµα Α.Ι.4 : (Α) Κυκλικό βολταµµογράφηµα σταθερής κατάστασης και (Β) κυκλικό βολταµµογράφηµα σχεδόν σταθερής κατάστασης. Η σχέση µέσω της οποίας µπορούµε να υπολογίζουµε την τιµή του ορικού ρεύµατος (στο πλατώ) εξαρτάται φυσικά από τα γεωµετρικά χαρακτηριστικά του µικρο-ηλεκτροδίου. Ενδεικτικά παραθέτουµε την εξίσωση ορικού ρεύµατος για µικροδίσκους : I=2nFCDd (1) όπου d είναι η διάµετρος του µικρο-ηλεκτροδίου, n είναι ο αριθµός ηλεκτρονίων που µεταφέρονται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, C είναι η συγκέντρωση της ουσίας και D ο συντελεστής διάχυσης. 25

31 Βολταµµογραφήµατα µη σταθερής κατάστασης. Το χαρακτηριστικό σε αυτού του είδους τα βολταµµογραφήµατα είναι η κορυφώδης µορφή (peak-shaped) που έχουν. Εµφανίζουν δηλαδή µία κορυφή, peak, τουλάχιστον κατά την µία φορά σάρωσης του δυναµικού, και αν η δράση είναι αντιστρεπτή ή σχεδόν αντιστρεπτή, εµφανίζεται κορυφή και κατά την ανάστροφη φορά, δηλαδή κατά την οξείδωση και κατά την αναγωγή. Κατά την αύξηση του δυναµικού, η ταχύτητα της ηλεκτροδιακής δράσης αυξάνει µε αποτέλεσµα αρχικά η πυκνότητα ρεύµατος να αυξάνει. Από ένα σηµείο και έπειτα όµως η συνεχής επέκταση της στιβάδας διάχυσης οδηγεί σε συνεχή µεταβολή του προφίλ συγκέντρωσης και σε µείωση της κλίσης του οδηγεί σε πτώση της πυκνότητας ρεύµατος, i. x C, κάτι που ( ) x= Στο Σχήµα A.I.5 [33], απεικονίζονται διάφορα i-e βολταµµογραφήµατα, κατά τη µία φορά σάρωσης του δυναµικού, Ε, τα οποία πάρθηκαν µε διάφορες ταχύτητες σάρωσης τους δυναµικού. Στο συγκεκριµένο σχήµα παρατηρούµε ότι στην πιο αργή ταχύτητα σάρωσης του δυναµικού επικρατούν συνθήκες σταθερής κατάστασης (χαρακτηριστική σιγµοειδής µορφή), ενώ όσο αυξάνει η ταχύτητα σάρωσης, από την εµφάνιση µεγίστου που παρατηρείται στα βολταµµογραφήµατα, καταλαβαίνουµε ότι µεταπίπτουν σε περιπτώσεις µη σταθερής κατάστασης, κάτι που οφείλεται στο ότι τα συγκεκριµένα βολταµµογραφήµατα παίρνονται σε µικρό χρόνο µε αποτέλεσµα η στιβάδα διάχυσης να µην προλαβαίνει να σταθεροποιηθεί. Επίσης, από το Σχήµα A.I.5 παρατηρούµε ότι η ταχύτητα σάρωσης του δυναµικού, u, επηρεάζει την πυκνότητα ρεύµατος (i) και πιο συγκεκριµένα, αύξηση της ταχύτητας σάρωσης (u) προκαλεί αύξηση της πυκνότητας ρεύµατος, και µάλιστα ισχύει ότι το i είναι ανάλογο του u ½. Το φαινόµενο αυτό ερµηνεύεται από το γεγονός ότι το δυναµικό µεταβάλλεται τόσο γρήγορα µε αποτέλεσµα η στιβάδα διάχυσης, δ, να µην προλαβαίνει να αναπτυχθεί αρκετά, είναι δηλαδή µικρότερη όσο αυξάνει η ταχύτητα 26

32 σάρωσης του δυναµικού, και κατά συνέπεια το ρεύµα είναι πιο υψηλό αφού είναι αντιστρόφως ανάλογο της στιβάδας διάχυσης (i=nfdc/δ). Η εµφάνιση ρεύµατος αναγωγής κατά την ανάστροφη σάρωση του δυναµικού οφείλεται στην αναγωγή του παραγόµενου προϊόντος οξείδωσης, το οποίο δεν προλαβαίνει να διαχυθεί εκτός της στιβάδας διάχυσης. Από τη µορφή που θα έχουν τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα µπορούµε να βγάλουµε συµπεράσµατα : Α. για το µηχανισµό της αντίδρασης, τα στάδια οξείδωσης ή αναγωγής της ουσίας, ανάλογα µε τα πόσα κύµατα εµφανίζονται, Β. για την αντιστρεπτότητα της δράσης ανάλογα µε τη σχετική θέση ανάµεσα στην κορυφή οξείδωσης και αναγωγής, Γ. και τέλος, µπορούµε να κάνουµε ποσοτικές µελέτες, όπως το πόσο ευοξείδωτη είναι η ουσία (ανάλογα µε την τιµή του δυναµικού µισού κύµατος), κτλ. Κατά την ποσοτική µελέτη µας ενδιαφέρει περισσότερο να υπολογίζουµε το ρεύµα και το δυναµικό της κορυφής, καθώς και το δυναµικό µισού κύµατος. Αύξηση ταχύτητας σάρωσης του δυναµικού Συνθήκες σταθερής κατάστασης Σχήµα Α.Ι.5 : Βολταµµογραφήµατα σταθερής και µη σταθερής κατάστασης. 27

33 Στα πειράµατα της κυκλικής βολταµµετρίας, όταν οι ηλεκτροδιακές δράσεις είναι αντιστρεπτές, οι πυκνότητες ρεύµατος οξείδωσης και αναγωγής A i, C i παρέχονται από τις σχέσεις : A(ήC ) i = 2,69*1 5 n 3/2 CD 1/2 u 1/2 A και i = C i (2) όπου u η ταχύτητα σάρωσης του δυναµικού, D ο συντελεστής διάχυσης της ουσίας, n ο αριθµός των ηλεκτρονίων που µεταφέρονται κατά την διάρκεια της αντίδρασης και C η συγκέντρωση της ηλεκτροενεργής ουσίας. Ενώ για µη αντιστρεπτές δράσεις ισχύει ότι : i A(ήC ) = σταθ.* u 1/2 Τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα των ηµιαντιστρεπτών δράσεων χαρακτηρίζονται από δύο κορυφές, ανοδική και καθοδική, σχετικά διευρυµένες (συγκριτικά µε τις αντιστρεπτές δράσεις) και άνισου ύψους, των οποίων η θέση επηρεάζεται σηµαντικά από την ταχύτητα σάρωσης του δυναµικού, u, σε αντίθεση µε τα αντίστοιχα των αντιστρεπτών δράσεων. Στο Σχήµα Α.Ι.6 [33] απεικονίζονται κυκλικά βολταµµογραφήµατα αντιστρεπτής και µη αντιστρεπτής δράσης (βολταµµογραφήµατα µεταφοράς 1e - ). Μη αντιστρεπτή δράση Αντιστρεπτή δράση Σχηµα A.I.6 : Σύγκριση κυκλικών βολταµµογραφηµάτων αντιστρεπτών ( ) και µη αντιστρεπτών ( ) δράσεων. 28

34 Α.Ι.2.2 ΗΛΕΤΡΟΧΗΜΙΚΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ HPLC Η χρήση των ηλεκτροχηµικών ανιχνευτών σε συστήµατα υγρής χρωµατογραφίας ολοένα και αυξάνεται λόγω κάποιων σηµαντικών πλεονεκτηµάτων που εµφανίζουν. Τα σηµαντικότερα πλεονεκτήµατα ενός ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή είναι τα εξής: 1. Υψηλή ευαισθησία και χαµηλά όρια ανίχνευσης. 2. Ευρεία και γραµµική δυναµική περιοχή. 3. Μεγάλη εκλεκτικότητα ανίχνευσης. 4. Είναι οικονοµικότερος σε σχέση µε άλλους ανιχνευτές. 5. Απαιτεί αµελητέο όγκο από την ανιχνεύσιµη ουσία µε αποτέλεσµα να καταγράφονται οξείες κορυφές. 6. Επιδεκτικός σε σµικρύνσεις του όγκου των κυψελών. Βέβαια, όπως κάθε ανιχνευτής, έτσι και ο ηλεκτροχηµικός, εµφανίζει κάποια σηµαντικά µειονεκτήµατα, όπως χαρακτηριστικά θα µπορούσαµε να αναφέρουµε το γεγονός ότι απαιτεί ηλεκτροχηµικά εκπαιδευµένους χρήστες και ότι παθητικοποιείται εύκολα το ηλεκτρόδιο εργασίας µε αποτέλεσµα να αλλοιώνεται το σήµα ανίχνευσης. Φυσικά, για να χρησιµοποιηθεί ο ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής θα πρέπει οι ουσίες που ανιχνεύονται να είναι ηλεκτροχηµικά ενεργές καθώς και ο διαλύτης να είναι αγώγιµος. Αν µια ουσία δεν είναι απευθείας ηλεκτρoενεργή θα πρέπει, προκειµένου να χρησιµοποιηθεί ο ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής, να µπορεί να γίνει ηλεκτροχηµικά ενεργή αντιδρώντας µε ένα αντιδραστήριο. Σε αυτήν την ιδιότητα βασίζονται οι µέθοδοι ανάλυσης στην υγρή χρωµατογραφία µε προ- ή µετα- στήλης παραγωγοποίηση (pre- ή post- column derivatization), κατά τις οποίες η προς ανίχνευση ουσία αντιδρά µε ένα αντιδραστήριο πριν την εισαγωγή της στη στήλη ή αφού βγει από τη στήλη, αντίστοιχα. Ιδιαίτερη σηµασία θα πρέπει να δοθεί στις συνθήκες που χρησιµοποιούνται, για παράδειγµα 29

35 θα πρέπει να λάβουµε υπόψη την αγωγιµότητα, το ph καθώς και την σύσταση της κινητής φάσης. Γενικά απαιτείται υψηλή αγωγιµότητα για να ελαττώνεται η ir πτώση στην κυψέλη, και έτσι να ελαττώνονται τα ρεύµατα των θορύβων. Το ph παίζει ουσιαστικό ρόλο τόσο στο σήµα ανίχνευσης όσο και στο διαχωρισµό των ουσιών, γι αυτό συνήθως χρησιµοποιούνται ρυθµιστικά διαλύµατα ορισµένου ph. Τύποι ηλεκτροχηµικών ανιχνευτών Παρά την ευρεία χρήση των κουλοµετρικών και των ποτενσιοµετρικών ανιχνευτών, στην HPLC ειδικά έχει καθιερωθεί ο ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής, συνήθως, να είναι αµπεροµετρικός. Επίσης, κατά το πλείστον προτιµάται η χρήση στερεών ηλεκτροδίων και λιγότερο η χρήση του υγρού και τοξικού υδραργύρου. Υπάρχουν διάφοροι τύποι κυψελών που χρησιµοποιούνται ως ηλεκτροχηµικοί ανιχνευτές. Από αυτούς, οι πιο κοινοί είναι οι ανιχνευτές διαύλου ροής (channel) και οι ανιχνευτές διαβροχής τοιχώµατος (wall-jet). Στο διδακτορικό αυτό χρησιµοποιήθηκαν κυψέλες ροής λεπτής στιβάδας, οι οποίες ανήκουν στην πρώτη κατηγορία που αναφέρθηκε πιο πάνω. Στις κυψέλες αυτές υπήρχαν τόσο µικροηλεκτρόδια όσο και µεγάλα ηλεκτρόδια άνθρακα, είτε µεµονωµένα είτε σε συνδυασµό ανά δύο (βλ. Κεφ. Α.Ι.3). Στην πράξη, τα δυναµικά που χρησιµοποιούνται στις ηλεκτροχηµικές κυψέλες είναι τέτοια ώστε στο ηλεκτρόδιο εργασίας η αντίδρασή να ελέγχεται από συνθήκες µεταφοράς µάζας. 3

36 Ρεύµα σταθερής κατάστασης σε κυψέλες ροής Τα ηλεκτροχηµικά πειράµατα που λαµβάνουν χώρα µε κυψέλες ηλεκτροχηµικής ανίχνευσης HPLC κατά τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό ουσιών, είναι από αυστηρή άποψη πειράµατα µη σταθερής κατάστασης λόγω του ότι η συγκέντρωση της εκλουόµενης ουσίας (άρα και το ρεύµα) πάνω στον ανιχνευτή-ηλεκτρόδιο µεταβάλλεται. Όµως, οι συνθήκες µεταφοράς µάζας (k m =D/δ) που επικρατούν στις συγκεκριµένες κυψέλες ροής είναι σταθερές. Και αυτός είναι ο λόγος που τα υδροδυναµικά διαγράµµατα (ρεύµατος κορυφής συγκεκριµένου χρόνου ή φορτίου) που παίρνουµε χρησιµοποιώντας αυτές τις κυψέλες είναι σιγµοειδούς µορφής (ύπαρξη ορικού ρεύµατος), όπως συµβαίνει και στα πειράµατα της βολταµµετρίας µε µικροηλεκτρόδια. Για να έχουµε πείραµα απόλυτα σταθερής κατάστασης χρησιµοποιώντας κυψέλη ροής ΗPLC θα πρέπει η ακλουόµενη ουσία να βρίσκεται στην κινητή φάση ώστε να είναι σταθερή η συγκέντρωσή της που διέρχεται από τον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή. Η γενική εξίσωση ορικού ρεύµατος σταθερής κατάστασης, Ι ss, για δράση ελεγχόµενη από µεταφορά µάζας είναι : Ι ss =nfk m CA (3) όπου n είναι ο αριθµός ηλεκτρονίων που µεταφέρονται κατά την διάρκεια της αντίδρασης, C είναι η συγκέντρωση της ουσίας, Α είναι η επιφάνεια του ηλεκτροδίου, F η σταθερά Faraday και k m ο συντελεστής µεταφοράς µάζας. Η συσχέτιση των αδιάστατων αριθµών που περιγράφουν τη ροή σε κυψέλη παράλληλων τοιχωµάτων µε ορθογώνια ηλεκτρόδια και για πλήρη γραµµική ροή δίνεται από την σχέση : 1/3 1/3 d e Sh = 1.85Φ Re Sc (4) L el 31

37 όπου Sh=k m d e /D είναι ο αριθµός Sherwood, Re=ν d / ν = ( U / S) d / ν είναι ο αριθµός Reynolds, Sc=ν/D είναι ο αριθµός Schmidt όπου D είναι ο συντελεστής διάχυσης, ν είναι το κινηµατικό ιξώδες του διαλύµατος, ν είναι η µέση γραµµική ταχύτητα του διαλύµατος, U είναι η ταχύτητα ογκοµετρικής ροής του διαλύµατος, S είναι η διατοµή της διαύλου ροής, L el είναι το µήκος του ηλεκτροδίου και d e είναι η υδραυλική διάµετρος της κυψέλης. To d e δίνεται από την σχέση d e = 4S/P = 2(w ch d ch )/(w ch +d ch ), όπου S είναι η επιφάνεια του ηλεκτροδίου, P είναι η περίµετρος του και w ch, d ch είναι το πλάτος και το πάχος της διαύλου ροής, αντίστοιχα. To Φ είναι µία παράµετρος που καθορίζεται από την γεωµετρία της κυψέλης και παίρνει τιµές από.788 µέχρι 1 (Ref. [34], p.24). Θεωρώντας ότι το ισοδύναµο µήκος του ηλεκτροδίου δίσκου (δηλ. το µήκος ενός τετράγωνου ηλεκτροδίου που έχει την ίδια επιφάνεια µε το ηλεκτρόδιο δίσκου διαµέτρου d el =.3 cm, (Lel) 2 eq = πd 2 el /4), πλάτους w ch =.5 cm και πάχους d ch =.1 cm της κυψέλης µας, είναι (L el ) eq =.2658 cm, το Φ πλησιάζει το 1 [34]. Από τις διαστάσεις τις κυψέλης µας, που αναφέρθηκαν πιο πάνω, προκύπτει ότι d e =.196 cm και (L el ) eq / d e = Επιπλέον, για U =.1-3mL min -1 (περιοχή τιµών που χρησιµοποιήθηκε), τις διαστάσεις της κυψέλης, και για µια τυπική τιµή του ν ίση µε,11 cm 2 s -1, ο αριθµός Reynolds είναι πολύ µικρός µε αποτέλεσµα, στην περίπτωσή µας, να επικρατεί γραµµική ροή (laminar flow). Τέλος, η απόσταση ανάµεσα στην είσοδο του διαλύµατος και στο ηλεκτρόδιο για την κυψέλη µας είναι,5 cm, τιµή πολύ υψηλότερη από την αντίστοιχη τιµή l e =.1d e Re = 35µm (όπως υπολογίστηκε σύµφωνα µε την µέγιστη τιµή του Re) που απαιτείται, σύµφωνα µε την αναφορά [34] p. 18, για απόλυτα ανεπτυγµένη γραµµική ροή. Συνοψίζοντας, η Εξ. (4) είναι ικανή να περιγράψει τις συνθήκες σταθερής κατάστασης των πειραµάτων µας. Αντικαθιστώντας τις εκφράσεις των αδιάστατων αριθµών στην Εξ. (4), λύνοντας ως προς k m και αντικαθιστώντας το στην Εξ. (3), προκύπτει e e 32

38 ότι η εξάρτηση του ρεύµατος σταθερής κατάστασης, Ι ss χαρακτηριστικά της κυψέλης δίνεται από την Εξ. (5): I = ss 1.85 nfcad 2 / 3 1 ( L el ) 1 / 3 1 ( de ) 1 / 3 ( d U w ch ch ) 1 / 3, από τα (5) Για d ch <<w ch (όπως στην περίπτωσή µας ), η διάµετρος d e µπορεί να θεωρηθεί ότι είναι περίπου ίση µε 2d ch. Οπότε η Εξ. (5) γίνεται: I = ss 1.47 nfca 1 ( L el ) 1 / 3 ( D d ch ) 2 / 3 ( U w ch ) 1 / 3 (6) Για ορθογώνια ηλεκτρόδια, όπου Α= w el L el, η Εξ. (6) γίνεται: I = ss 1.47 nfcw el D 2 / 3 L 2 el / 3 1 ( d ch ) 2 / 3 ( U w ch ) 1 / 3 (7) Η Εξ. (7), είναι η εξίσωση που προτείνουν και οι Weber και Purdy [2,3] καθώς και οι Roosendaal και Poppe [34], και γενικά είναι η εξίσωση που χρησιµοποιείται για ορθογώνια ηλεκτρόδια σε κυψέλες ροής λεπτής στιβάδας. Επίσης, η Εξ. (7) µπορεί να τροποποιηθεί ώστε να παρέχει το ρεύµα Ι ss, όταν πρόκειται για µακροδίσκο ο οποίος τοποθετείται παράλληλα στην ροή του διαλύµατος σε µια κυψέλη. Η παράµετρος L el µπορεί να αντικατασταθεί από ένα ισοδύναµο µήκος ηλεκτροδίου (L el ) eq το οποίο αντιστοιχεί στο µήκος ενός τετράγωνου ηλεκτροδίου το οποίο έχει την ίδια επιφάνεια µε το µακροδίσκο διαµέτρου d el. Γνωρίζοντας ότι (L el ) 2 eq = πd 2 el /4 και ότι Α = πd 2 el /4, η Εξ. (7) µετατρέπεται στην : 1.53 ( 1 ) D ( ) U ( 1/ 3 2 / 3 1/ 3 I = nfca = ss d d w el ch ch ) 1.2nFCd 5 / 3 el ( D d ch ) 2 / 3 ( U w ch ) 1/ 3 (8) Το Σχήµα Α.Ι.7 [35] φανερώνει την επίδραση της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης στο ρεύµα σταθερής κατάστασης για την οξείδωση 2 ηλεκτρονίων του ασκορβικού οξέος, η οποία καταγράφηκε στα,8v, ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl, σε µακροδίσκο που ήταν 33

39 τοποθετηµένος σε κυψέλη ροής λεπτής στιβάδας. Για την µελέτη χρησιµοποιήθηκαν διαλύµατα ασκορβικού οξέος συγκέντρωσης 5x1-6 M σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ph=5 και ιονικής ισχύος,5μ. Επίσης, µεταβάλλαµε την παράµετρο d ch η οποία έπαιρνε τιµές 1, 2 και 3µm, ανάλογα µε το αν χρησιµοποιούσαµε 1, 2 ή 3 διαχωριστικά (spacers) στην κυψέλη. Τα παραπάνω πειράµατα έγιναν για να ελεγχθεί η αξιοπιστία της Εξ. (8) που αφορά τον µακροδίσκο σε κυψέλη λεπτής στιβάδας. Το ένθετο στην εικόνα απεικονίζει το log Ι ss ως προς το log U, όπου φαίνεται η πολύ καλή γραµµικότητα των καµπυλών. Επίσης, οι κλίσεις των ευθειών αυτών είναι πολύ κοντά στις θεωρητικές τιµές (,33) που προκύπτουν από την Εξ. (8). Σχήµα Α.Ι.7 : Επίδραση της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης, U, στο ρεύµα σταθερής κατάστασης, Ι ss, το οποίο καταγράφηκε στα.8v ως προς Ag/AgCl χρησιµοποιώντας διάλυµα ασκορβικού οξέος 5x1-6 M και κυψέλη ροής λεπτής στιβάδας µε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα όπου το d ch ήταν 1, 2 ή 3 µm (1,2,3 separators) µε 1,2,3. το µικρό σχήµα στο εσωτερικό απεικονίζει τις αντίστοιχες γραφικές παραστάσεις του log Ι ss ως προς το log U. 34

40 Επιπλέον, αν αντικαταστήσουµε στην Εξ. (8) τα αντίστοιχα στοιχεία για το ασκορβικό οξύ, δηλαδή n=2, D=6.9x 1-6 cm 2 s -1 [37], C= 5x1-6 M =5x1-9 mol cm -3, καθώς και τα στοιχεία της κυψέλης d ch =1µm =,1 cm για ένα διαχωριστικό (spacer), w ch =.5 cm και τέλος U =1 ml min -1 = 1/6 cm 3 s -1, η θεωρητική τιµή του ρεύµατος σταθερής κατάστασης (Ι ss ) th που προκύπτει είναι 391,2 na, η οποία είναι πολύ κοντά στην πειραµατική τιµή (Ι ss ) exp των 4 na. Τα ίδια πειράµατα επαναλήφθηκαν και για άλλη ουσία, την υδροκινόνη της οποίας η οξείδωση είναι 2 ηλεκτρονίων. Αντίστοιχα, τα χαρακτηριστικά της υδροκινόνης είναι n=2, D=8.5x 1-6 cm 2 s -1, C= 5x1-6 M σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ιονικής ισχύος,2μ και ph= 4,68. Και σε αυτή την περίπτωση, οι θεωρητικές τιµές του ρεύµατος συµπίπτουν µε τις πειραµατικές τιµές, αφού προέκυψε ότι (Ι ss ) exp /( Ι ss ) th =,97. Αναλυτικά τα αποτελέσµατα για το ασκορβικό οξύ και την υδροκινόνη φαίνονται στον Πίνακα Α.Ι.1 [36]. Πίνακας Α.Ι.1 : Κλίσεις και συντελεστές συσχέτισης των συναρτήσεων του λογαρίθµου του ρεύµατος σταθερής κατάστασης ως προς το λογάριθµο της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης (logi ss - logu ), για τρεις τιµές πάχους στιβάδας, d ch, για την οξείδωση του ασκορβικού οξέος και της υδροκινόνης σε κυψέλη ροής λεπτής στιβάδας. Κλίση του logi ss ως προς το logu Ασκορβικό οξύ Yδροκινόνη 1 spacer 2 spacers 3 spacers 1 spacer 2 spacers 3 spacers (R 2 = (R 2 = (R 2 = (R 2 =.9995).9995).9981).9999) (R 2 = (R 2 =.9998).9994) Η Εξ. (7) µπορεί να τροποποιηθεί κατάλληλα ώστε να εφαρµόζεται και στην περίπτωση που το ηλεκτρόδιο είναι µικροκύλινδρος διαµέτρου (d el ) m, µήκους b, ο οποίος είναι τοποθετηµένος σε κυψέλη ροής λεπτής 35

41 στιβάδας. Και σε αυτή την περίπτωση τα (L el ) eq αντικατασταθούν από ένα ισοδύναµο µήκος ηλεκτροδίου και d ch πρέπει να (L el ) eq και από ένα ισοδύναµο πάχος κυψέλης (d ch ) eq. Σύµφωνα µε την αναφορά [34] για κυµατοειδούς ή πριονωτής µορφής ηλεκτρόδια, σαν µήκος ηλεκτροδίου πρέπει να λαµβάνεται η απόσταση µεταξύ της αρχής και του τέλους του ηλεκτροδίου κατά την διαδροµή πάνω στην επιφάνειά του και όχι το µήκος της προβολής του πάνω στην κατεύθυνση της ροής (flow streamline). Σε αυτή την περίπτωση το (L el ) eq είναι ίσο µε το µισό της περιµέτρου του µικροκυλίνδρου, δηλ (L el ) eq =π(d el ) m /2. To (d ch ) eq είναι ίσο µε το πάχος του καναλιού d ch αν αφαιρεθεί το µέσο πάχος του ηλεκτροδίου, d el, κατά την διεύθυνση που είναι κάθετο στην ροή, δηλαδή (d ch ) eq = d ch - π /4(d el ) m. Αντικαθιστώντας τα (L el ) eq και (d ch ) eq στην Εξ. (5) και θεωρώντας ως επιφάνεια του µικροκυλίνδρου την επιφάνεια που δίνεται από την σχέση Α m =π(d el ) m b, προκύπτει ότι: 1 Iss = 1.265nFCAm ( d ) el = 3.975nFCb[( d el ) m ] 2/3 m ( d 1/3 ch ( d ) m ch ) m 1 π / 4( d 1 π / 4( d el ) m el 2/ 3 ) m D 2/ 3 2/ 3 D 2/ 3 U wch 1/ 3 U w ch 1/ 3 = (9) Τα ρεύµατα που υπολογίζονται από την Εξ. (9) (πολλαπλασιασµένα µε τον αριθµό 2 διότι χρησιµοποιήσαµε στα συγκεκριµένα πειράµατα 2 µικροκυλίνδρους) έχουν µία απόκλιση γύρω στο 5% από τις πειραµατικές τιµές ρεύµατος που προέκυψαν από µετρήσεις µε το ασκορβικό οξύ όπως φαίνεται στο Σχήµα Α.Ι.8 [36] [n=2, D=6.9x 1-6 cm 2 s -1 [8], C= 5x1-6 M =5x1-9 mol cm -3, (d ch ) m =3µm=,3cm, (d ch ) m =2µm =,2 cm (δύο διαχωριστικά), w ch =.5 cm,u =1 ml min -1 = 1/6 cm 3 s -1 ]. Μία διασπορά των τιµών της τάξης των 5% είναι δικαιολογηµένη λόγω του ότι οι µικρο-κύλινδροι ( ή µικρο-ίνες) µέσα στην κυψέλη µπορεί να µην είναι απόλυτα 36

42 ευθυγραµµισµένοι, µπορεί να κάµπτονται και εκτός αυτού η αναγέννησή τους µε χρωµικό οξύ µπορεί να µην είναι τόσο αποτελεσµατική όσο στην περίπτωση του µακροδίσκου όπου η αναγέννηση της επιφάνειας γίνεται µε µηχανική τριβή. Συνεπώς µε την βοήθεια της Εξ. (9) µπορούµε να έχουµε µία πρόχειρη εκτίµηση της τάξης µεγέθους του ρεύµατος που θα πάρουµε, αλλά πολύ περισσότερο µπορούµε να γνωρίζουµε την επίδραση της ροής και της διαµέτρου του µικροδίσκου, (d el ) m, στο ρεύµα σταθερής κατάστασης. Σχήµα Α.Ι.8 : Επίδραση της κυβικής ρίζας της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης, U 1/3, στο ρεύµα σταθερής κατάστασης, (Ι ss ) m, το οποίο καταγράφηκε στα.8v ως προς Ag/AgCl χρησιµοποιώντας διαλύµα ασκορβικού οξέος 5x1-6 M και κυψέλη ροής λεπτής στιβάδας µε 2 µικρο-κυλίνδρους άνθρακα (διαµέτρου 3µm και µήκους.5cm). Tο µικρό σχήµα στο εσωτερικό απεικονίζει το ρεύµα σταθερής κατάστασης, (Ι ss ) Μ, ως προς την U 1/3, το οποίο καταγράφηκε χρησιµοποιώντας ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα διαµέτρου 3mm και υπό τις συνθήκες που εφαρµόστηκαν µε τους µικρο-κυλίνδρους. 37

43 Το φορτίο που διέρχεται από τον αµπεροµετρικό ανιχνευτή σε πείραµατα HPLC Θεωρούµε ότι C s και V s είναι η συγκέντρωση και ο όγκος του δείγµατος που εισάγεται κατά το πείραµα της HPLC. Αν C είναι η συγκέντρωση της ουσίας στοιχειώδους όγκου dv στη ζώνη διασποράς, τότε προκύπτει από το ισοζύγιο µάζας για την εισαγόµενη και διασπειρόµενη ουσία, ότι : C s V s = Vtotal CdV όπου V total είναι ο συνολικός όγκος όπου διασπείρεται η ουσία. (1) H ταχύτητα ογκοµετρικής ροής του διαλύµατος, δηλαδή η ταταχύτητα ροής της κινητής φάσης, U, στο σύστηµα δίνεται από την σχέση U=dV/dt, συνεπώς η Εξ. (1) γράφεται C s V s = U t r C dt (11) όπου t r είναι ο συνολικός χρόνος που κάνει όλη η ποσότητα της ουσίας να περάσει πάνω και να διασπαρεί πέρα από τον ανιχνευτή από την στιγµή που εισάγεται στο σύστηµα. Το σήµα του αµπεροµετρικού ανιχνευτή, το ρεύµα Ι, σε ένα στοιχειώδη χρόνο dt, µπορεί να θεωρηθεί ανάλογο της µέσης συγκέντρωσης της ουσίας που βρίσκεται πάνω από τον ανιχνευτή το δεδοµένο χρόνο, δηλαδή I=K C όπου Κ είναι µία σταθερά που προκύπτει από την εξίσωση (8) και (9), ανάλογα αν έχουµε µακρο-δίσκο ή µικροκύλινδρο, αντίστοιχα, ως ηλεκτρόδιο. Το ρεύµα σε ένα πείραµα σταθερής κατάστασης όπου η ουσία βρίσκεται στην κινητή φάση και έχει συγκέντρωση C s µπορεί να γραφτεί σύµφωνα πάλι µε τις Εξ. (8) και (9) ως Ι ss =Κ C s. Αντικαθιστώντας τις παραπάνω εκφράσεις του Ι και Ι ss στην Εξ. (11) προκύπτει : 38

44 I ss V s = U t r Idt (12) Το ολοκλήρωµα στο δεξί µέλος της Εξ. (12) είναι ίσο µε το συνολικό φορτίο Q το οποίο περνά από τον αµπεροµετρικό ανιχνευτή καθώς εκλούεται η ουσία. Έτσι ισχύει ότι Q I ssv U = (13) Η Εξ. (13) επιτρέπει την σύνδεση των χρωµατογραφικών δεδοµένων (φορτίο οξείδωσης, Q) που λαµβάνουµε κατά την χρήση µιας κυψέλης ροής σε πείραµα HPLC µε το ρεύµα σταθερής κατάστασης που θα προέκυπτε αν το ίδιο πείραµα γινόταν υπό συνθήκες σταθερής κατάστασης (αν δηλαδή η ουσία ήταν στην κινητή φάση και δεν εισάγονταν µε ένεση). Κάτι τέτοιο είναι πολύ χρήσιµο ειδικά για την HPLC όπου το ρεύµα που καταγράφεται κατά την διάρκεια της µέτρησης υπό σταθερό δυναµικό δεν είναι ρεύµα σταθερής κατάστασης (αφού παρόλο που οι συνθήκες µεταφοράς µάζας-στιβάδα διάχυσης- είναι σταθερές, η συγκέντρωση της εκλουόµενης ουσίας που διέρχεται από τον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή δεν είναι σταθερή). Σύγκριση συνθηκών µεταφοράς µάζας σε κυψέλη ροής λεπτής στιβάδας ΗPLC και µικροηλεκτροδίων σε στατικά διαλύµατα Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω η γενική εξίσωση ορικού ρεύµατος για δράση ελεγχόµενη από µεταφορά µάζας δίνεται από την Εξ. (3). Γνωρίζοντας ότι k m = D/δ, η Εξ. (3) γίνεται : Ι ss =nf (D/δ) CA (14) 39

45 όπου D είναι ο συντελεστής διάχυσης της ουσίας και δ είναι το πάχος της στιβάδας διάχυσης. Στην περίπτωση όπου στην κυψέλη της HPLC υπάρχει µακροδίσκος, το ορικό ρεύµα θα παρέχεται από την Εξ. (8). Με την βοήθεια των Εξ. (8) και (14) προκύπτει ότι το πάχος της στιβάδας διάχυσης θα παρέχεται σε αυτή την περίπτωση από την σχέση: δ=,65d 1/3 el d 2/3 (Dw ch /u) 1/3. Έτσι για τυπικές τιµές µιας ηλεκτροχηµικής κυψέλης : w ch =,5 cm, d el =,3 cm, d=1 µm, n=1 και για συντελεστή διάχυσης 7x1-6 cm 2 /s, η επίδραση της ταχύτητας ροής στο πάχος της στιβάδας διάχυσης φαίνεται στον Πίνακα Α.Ι.2. Πίνακας A.I.2 : Επίδραση της ταχύτητας ροής στο πάχος της στιβάδας διάχυσης µακροδίσκων σε κυψέλες HPLC. u ( ml/ min ) δ ( µm),1 55,9,3 38,7,5 32,7,1 26, Στην HPLC, οι ταχύτητες ροής που χρησιµοποιούνται συνήθως είναι από,5 µέχρι 1 ml/ min, συνεπώς η στιβάδα διάχυσης είναι της τάξης των 12 έως 15 µm. Για µικροδίσκους ακτίνας r d, το ορικό ρεύµα δίνεται από την σχέση: I= 4nFDCr d =4nFDCr d A / π r 2 d =4nFDCA / πr d (15) οπότε και το πάχος στιβάδας διάχυσης δίνεται από την σχέση : δ=πr d /4. 4

46 Οι ενδεικτικοί υπολογισµοί για µικροδίσκους διαφόρων (εµπορικά διαθέσιµων) διαµέτρων καταγράφονται στον Πίνακα Α.Ι.3. Με βάση τους Πίνακες Α.Ι.2 και Α.Ι.3 είναι δυνατόν να προβλέψουµε µε ποια διαθέσιµα µικροηλεκτρόδια χρησιµοποιώντας την µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας είναι δυνατόν να προσοµοιώσουµε τις συνθήκες µεταφοράς µάζας που επικρατούν σε έναν ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή της HPLC. ηλαδή, αν στην HPLC χρησιµοποιούµε ροή 1 ml/min όπου η στιβάδα διάχυσης είναι γύρω στα 12 µm ο κατάλληλος µικροδίσκος που µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε στατικά διαλύµατα ώστε να επικρατούν ίδιες συνθήκες µε αυτές στην κυψέλη της HPLC, θα πρέπει να έχει διάµετρο γύρω στα 3 µm. Πίνακας A.I.3 : Τιµές στιβάδων διάχυσης για µικροδίσκους διαφόρων διαµέτρων. διάµετρος µm δ µm 8 3,1 2 7, ,8 3 11,8 6 23,6 Σύγκριση κυκλικής βολταµµετρίας µε υδροδυναµικά διαγράµµατα που παίρνονται σε ηλεκτροχηµικές κυψέλες HPLC Ως γνωστόν η κυκλική βολταµµετρία αποτελεί µία µέθοδο που συνήθως χρησιµοποιείται για να µας δώσει πληροφορίες γρήγορα και άµεσα για την ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των ουσιών. 41

47 Όταν ο στόχος µιας έρευνας είναι η ανίχνευση και ο διαχωρισµός ενός µίγµατος ουσιών µε τη βοήθεια της HPLC και ενός ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή, θα πρέπει φυσικά να προηγηθεί ηλεκτροχηµική µελέτη των ουσιών αυτών, ώστε να επιλεχθεί το βέλτιστο δυναµικό το οποίο να ανιχνεύει όλες τις ουσίες. Για να γίνει αυτό απαιτείται να παρθούν τα υδροδυναµικά διαγράµµατα των ουσιών, δηλαδή να καταγραφούν τα χρωµατογραφήµατα µε τον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή σε διαφορετικά δυναµικά. Κάτι τέτοιο απαιτεί πολύ χρόνο, ειδικά αν ο χρόνος έκλουσης των ουσιών είναι µεγάλος. Έτσι, σύµφωνα µε τα παραπάνω ένας συνδυασµός των δύο µεθόδων, δηλαδή της κυκλικής βολταµµετρία και των υδροδυναµικών διαγραµµάτων, θα ήταν το ιδανικό. ηλαδή θα ήταν καλύτερο να µελετηθεί η ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των ουσιών µε την βοήθεια της βολταµµετρίας, να βρεθεί το βέλτιστο δυναµικό για όλες τις ουσίες και η πληροφορία αυτή να επιβεβαιωθεί µε τα υδροδυναµικά διαγράµµατα όταν κριθεί απαραίτητο. Η κυκλική βολταµµετρία σε µεγάλο ηλεκτρόδιο σαφώς και παρέχει µία πρώτη λεπτοµερή εικόνα για την οξείδωση και τα στάδια της οξείδωσης των ουσιών, έτσι ώστε να µπορεί να βγει ένα συµπέρασµα για το ποιο θα ήταν το βέλτιστο δυναµικό που θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί στην ηλεκτροχηµική κυψέλη που συνδέεται µε την HPLC. Όµως η κυκλική βολταµµετρία µε µικροηλεκτρόδια, θα µπορούσε να υποστηριχθεί ότι θα ήταν καλύτερη για την παραπάνω µελέτη λόγω του ότι οι συνθήκες που επικρατούν σε αυτήν την περίπτωση προσοµοιώνονται καλύτερα µε τις συνθήκες που επικρατούν στο εσωτερικό της ηλεκτροχηµικής κυψέλης της HPLC, που είναι και ο τελικός στόχος. Πιο συγκεκριµένα οι συνθήκες µεταφοράς µάζας που επικρατούν στην ηλεκτροχηµική κυψέλη της HPLC προσοµοιώνονται καλύτερα µε τις συνθήκες που επικρατούν στην κυκλική βολταµµετρία όπου χρησιµοποιούνται µικροηλεκτρόδια παρά όταν χρησιµοποιούνται µακρο- ηλεκτρόδια. Η στιβάδα διάχυσης των µικροηλεκτροδίων αναµένεται να είναι της ίδιας τάξης µεγέθους µε την αντίστοιχη στην ηλεκτροχηµική κυψέλη του ανιχνευτή στο σύστηµα της 42

48 HPLC, µε αποτέλεσµα αφενός τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα µε τα µικροηλεκτρόδια και τα υδροδυναµικά διαγράµµατα στην ηλεκτροχηµική κυψέλη να έχουν την ίδια µορφή, και αφετέρου, επειδή η οξείδωση και στις δύο περιπτώσεις ελέγχεται υπό συνθήκες µεταφοράς µάζας και ο µηχανισµός οξείδωσης στα µικροηλεκτρόδια και στην ηλεκτροχηµική κυψέλη είναι ο ίδιος, αναµένεται να έχουµε και περίπου ίδιες πυκνότητες ρεύµατος. Επιπλέον, και οι δύο µέθοδοι είναι µέθοδοι σταθερής κατάστασης όπου οι συνθήκες µεταφοράς µάζας ευνοούνται. Τέλος, µε τα µικροηλεκτρόδια µπορούν να χρησιµοποιηθούν οι ίδιες ηλεκτρολυτικές συνθήκες µε αυτές που χρησιµοποιούνται και στην HPLC. Όλα τα παραπάνω υποδεικνύουν πως η κυκλική βολταµµετρία µε µικρο-ηλεκτρόδια µπορεί να είναι πιο αντιπροσωπευτική της συµπεριφοράς του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή της HPLC από ότι η κυκλική βολταµµετρία µε µακρο-ηλεκτρόδιο. ηλαδή, τα υδροδυναµικά διαγράµµατα που προκύπτουν µε χρήση της υγρής χρωµατογραφίας µπορούν να προσοµοιωθούν µε τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα που παίρνονται µε µικροηλεκτρόδια. Α.Ι.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Οι ουσίες που µελετήθηκαν σε ελεύθερη µορφή ήταν οι εξής 21 : dopa, me-dopa, met, his, phe, cysta, leu, Ile, tyr, m-tyr, n-tyr, me-tyr, crn, cre, cys, hcy, me-cys, trp, 5htp, cys-cys και car. Στο συγκεκριµένο κεφάλαιο πραγµατοποιήθηκε η ηλεκτροχηµική µελέτη των ουσιών χρησιµοποιώντας δυο µεθόδους : τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας και τη µέθοδο της υγρής χρωµατογραφίας µε κυψέλες ροής HPLC. 43

49 Πιο συγκεκριµένα, όσον αφορά τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας, οι µετρήσεις που έλαβαν χώρα ήταν οι εξής: Αρχικά, ως ηλεκτρόδιο εργασίας χρησιµοποιήθηκε ένα µακρο-ηλεκτρόδιο (µακροδίσκος) υαλώδους άνθρακα διαµέτρου 3mm, καθώς και ένας µικρο- δίσκος γραφιτικού άνθρακα διαµέτρου 3µm. Ως ηλεκτρόδιο αναφοράς χρησιµοποιήθηκε ηλεκτρόδιο Ag/AgCl. Οι ταχύτητες σάρωσης του δυναµικού που χρησιµοποιήθηκαν ήταν 1 και 4 mv/s. Για τη λήψη των κυκλικών βολταµογραφηµάτων τα αµινοξέα διαλύονταν σε υδατικά διαλύµατα καθώς και σε υδατικά διαλύµατα που περιείχαν 2% ισοπροπανόλη (iproh) µε ph= 2.5 και µε ιονική ισχύ του φέροντα ηλεκτρολύτη.2μ (ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών H 3 PO 4 -K 2 HPO 4 ). Τα διαλύµατα των αµινοξέων που χρησιµοποιήθηκαν ήταν από 25*1-4 µέχρι και 5*1-2 Μ, ανάλογα µε το είδος της µελέτης που λάβαινε χώρα. Για τη µέθοδο της υγρής χρωµατοτογραφίας µε ηλεκτροχηµικές κυψέλες HPLC έχουµε τα παρακάτω πειραµατικά δεδοµένα : Αρχικά, τα διαλύµατα των αµινοξέων (τα οποία εισάγονταν στη στήλη µε ένεση) ήταν καθαρά υδατικά διαλύµατα συγκέντρωσης 1 1 µg/ml. Οι κινητές φάσεις που χρησιµοποιήθηκαν ήταν υδατικά διαλύµατα ή υδατικά διαλύµατα iproh 2% ή υδατικά διαλύµατα ακετονιτριλίου (MeCN) µέχρι και 15%, µε ph= 2.5 και µε ιονική ισχύ του φέροντα ηλεκτρολύτη.2μ (ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών H 3 PO 4 -K 2 HPO 4 ). Οι µελέτες που έλαβαν χώρα µε τις καθαρά υδατικές και µε τις υδατικές κινητές φάσεις παρουσία iproh 2% πραγµατοποιήθηκαν ισοκρατικά ενώ για µελέτες που έγιναν µε το MeCN χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της βαθµωτής έκλουσης κατά την οποία η συγκέντρωση του MeCN µεταβάλλοταν από µέχρι 15 % (το πρόγραµµα της βαθµωτής έκλουσης που χρησιµοποιείται αναφέρεται στο επόµενο κεφάλαιο όπου γίνεται πιο εκτεταµένη µελέτη). Η ταχύτητα ροή της κινητής φάσης ήταν σταθερή και ίση µε 1mL/min. Όσον αφορά το σύστηµα της υγρής χρωµαταγραφίας υψηλής πίεσης, αυτό αποτελούνταν από µία αντλία Shimadzu LC-2AD, από βαλβίδα µοντέλου 7125 για την εισαγωγή του δείγµατος σε loop 2 µl, 44

50 από έναν πολλαπλό ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή κατασκευασµένο στο εργαστήριό µας και από ειδικό φούρνο για στήλες Shimadzu CTO-1ASVP µε τον οποίο διατηρούταν η θερµοκρασία των χρωµατογραφικών στηλών σταθερή στους 25 C. Οι στήλες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν δύο : i. MZ- Analytical column (5µm Inertsil ODS-3) 25 4 mm, η οποία χρησιµοποιήθηκε για τις υδατικές κινητές φάσεις και τις υδατικές κινητές φάσεις παρουσία της iproh, και ii. MZ- Analytical column (MZ-Aqua Perfect C18 5µm) mm, η οποία χρησιµοποιήθηκε στις µελέτες όπου ως κινητή φάση είχαµε υδατικά διαλύµατα MeCN. Για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση χρησιµοποιήθηκαν διάφορες ηλεκτροχηµικές κυψέλες ροής λεπτής στιβάδας, οι οποίες κατασκευάστηκαν στο εργαστήριό µας και οι οποίες περιείχαν ως ηλεκτρόδιο αναφοράς ηλεκτρόδιο Ag/AgCl και ως ηλεκτρόδια εργασίας µακρο-ηλεκτρόδιο, µικροηλεκτρόδια ή και συνδυασµούς των δύο. Πιο συγκεκριµένα, οι ηλεκτροχηµικές κυψέλες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν οι ακόλουθες : Α. κυψέλη µε µακρο-ηλεκτρόδιο (δίσκο, M) υαλώδους άνθρακα διαµέτρου 3mm και επιφάνειας Α=πr 2 =3.14*(3/2) 2 =.765 cm 2. To πάχος της κυψέλης ήταν 1 µm (το οποίο καθοριζόταν µε χρήση ενός διαχωριστικού). Β. κυψέλη µε µακρο-ηλεκτρόδιο (δίσκο, M) υαλώδους άνθρακα διαµέτρου 3mm και επιφάνειας Α=πr 2 =.765 cm 2, και 2 µικρο-ίνες (2mf) γραφιτικού άνθρακα διαµέτρου 3µm και µήκους,5cm και συνολικής επιφάνειας Α=.942 cm 2 (οι 2 ίνες παρείχαν ένα σήµα οξείδωσης). Το ρέον διάλυµα περνούσε πρώτα από το µακρο-ηλεκτρόδιο και στη συνέχεια από τις µικρο-ίνες, οι οποίες είναι τοποθετηµένες κάθετα στη ροή του διαλύµατος. To πάχος της κυψέλης ήταν 2 µm (2 διαχωριστικά). Γ. κυψέλη µε µακρο-ηλεκτρόδιο (δίσκο, M) υαλώδους άνθρακα διαµέτρου 3mm, και µικρο-δίσκο (m) γραφιτικού άνθρακα διαµέτρου 3µm, πάχους 1 µm. 45

51 . κυψέλες πάχους 1 µm, µε 1 ή 2 ή 3 µικρο-δίσκους (m) γραφιτικού άνθρακα διαµέτρου 3µm. Ο κάθε µικρο-δίσκος παρείχε ξεχωριστό σήµα. Ε. κυψέλη πάχους 1 µm, µε 1 µικρο-δίσκο (m) γραφιτικού άνθρακα διαµέτρου 3µm και 2 µικρο-ίνες (2mf) άνθρακα διαµέτρου 3µm και µήκους,5cm. Οι δύο µικρο-ίνες παρείχαν ένα σήµα. Στ. κυψέλη µε 4 µικρο-ίνες (4mf) άνθρακα διαµέτρου 3µm και µήκους,5cm οι οποίες παρείχαν ένα σήµα. Το πάχος της κυψέλης ήταν 1 µm. Από τις παραπάνω κυψέλες, αυτές που έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσµατα είναι οι δύο πρώτες δηλ. η κυψέλη µε το µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και η κυψέλη µε το το µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και τις δύο ίνες γραφιτικού άνθρακα, τις οποίες στο εξής θα χαρακτηρίζουµε ως κυψέλη α και κυψέλη β, αντίστοιχα. Στο Σχήµα A.I.9 απεικονίζεται η κυψέλη µε τις 4 ίνες άνθρακα (4mf), η οποία χρησιµοποιήθηκε στη συγκεκριµένη διατριβή. Οι υπόλοιπες κυψέλες ήταν της ίδιας µορφής µε διέφεραν τα ηλεκτρόδια. αυτή του Σχήµατος A.I.9 απλά carbon microfibres aluminium foil contact solution outlet reference electrode port teflon block screw holes teflon spacer solution inlet Σχήµα A.I.9 : Ηλεκτροχηµική κυψέλη µε 4 ίνες άνθρακα (4mf). 46

52 Α.Ι.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α.Ι.4.1 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΗΛΕΚΡΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ ΙΑΛΥΜΑΤΑ -ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΜΕ iproh ΩΣ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΗ Κυκλική βολταµµετρία µε µακρο-ηλεκτρόδιο Αρχικά, µελετήθηκε η ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των ελεύθερων αµινοξέων µε τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας χρησιµοποιώντας το µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα, ούτως ώστε να γνωρίζουµε ποια από τα αµινοξέα δίνουν ηλεκτροχηµικό σήµα. Στα Σχήµατα Α.Ι.1 και Α.Ι.11 δίνονται, ενδεικτικά, τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα ορισµένων από τις ουσίες που µελετήθηκαν, χρησιµοποιώντας υδατικές φάσεις και υδατικές φάσεις iproh 2%, αντίστοιχα, ενώ η ταχύτητα σάρωσης του δυναµικού είναι 1mV/s. Η συγκέντρωση των me-dopa, cys-cys, tyr, leu, cys είναι 5*1-4 Μ, των trp, 5htp, dopa είναι 5*1-2 Μ, της hcy 2.5*1-4 M και της met 1*1-3 M. Στα συγκεκριµένα σχήµατα παρατίθενται ο πρώτος και ο (περίπου σταθερότερος) τρίτος κύκλος σάρωσης του δυναµικού, καθώς και το κυκλικό βολταµµογράφηµα του φέροντα ηλεκτρολύτη (φ.η.) σε υδατικό διάλυµα και σε υδατικό διάλυµα µε 2% iproh, αντίστοιχα. Από τα αµινοξέα που µελετήθηκαν, ηλεκτροχηµική απόκριση δίνουν τα : dopa, me-dopa, cys, hcy, trp, met, 5htp, tyr, m-tyr, me-tyr, n-tyr. Στα πειράµατα της κυκλικής βολταµµετρίας το δυναµικό που εφαρµόζεται στο ηλεκτρόδιο εργασίας µεταβάλλεται γραµµικά µεταξύ των δυναµικών V και 1.8 V. Πριν το πείραµα, το ηλεκτρόδιο εργασίας καθαριζόταν µηχανικά µε τριβή σε διάφορα αιωρήµατα σωµατιδίων εις τρόπον ώστε να έχουµε κάθε φορά µια καθαρή και καινούργια επιφάνεια. Επίσης, πριν τη σάρωση του δυναµικού, το ηλεκτρόδιο παρέµενε σε 47

53 I / µα φ.η. met his cys-cys 5htp a cycle Ε / V I / µa φ.η. met his cys-cys 5htp c cycle Ε / V I / µα φ.η. cys tyr trp dopa a cycle I / µα φ.η. cys tyr trp dopa c cycle I / µα E / V φ.η. leu me-dopa hcy a cycle Ε / V I / µa Ε / V φ.η. leu me-dopa hcy c cycle Ε / V Σχήµα A.I.1 : O πρώτος (a cycle) και ο τρίτος (c cycle) κύκλος των βολταµογραφηµάτων (Ι/µΑ-Ε/V vs Ag/AgCl) των αµινοξέων οι οποίοι πάρθηκαν σε υδατική φάση και µε ταχύτητα σάρωσης δυναµικού 1mV/s. 48

54 φ.η. cys dopa met tyr a cycle φ.η. cys dopa met tyr c cycle I / µα 2 I/ µα E / V Ε / V I / µα φ.η. 5htp me-dopa tryp hcy a cycle Ε / V I / µα φ.η. 5htp me-dopa tryp hcy c cycle Ε / V Σχήµα A.I.11 : Ότι και στο Σχήµα Α.Ι.9 αλλά χρησιµοποιώντας υδατική φάση ιproh 2%. 49

55 δυναµικό 1.8V για 2 λεπτά (ακραίο δυναµικό στην περιοχή έκλυσης οξυγόνου), ούτως ώστε το ηλεκτρόδιο να καθαρίζεται και µε ηλεκτροχηµικό τρόπο. Στη συνέχεια, το ηλεκτρόδιο ηρεµούσε στο δυναµικό V για 2 λεπτά από το οποίο ξεκινούσε και η σάρωση. Τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα πάρθηκαν σε δύο ταχύτητες σάρωσης, µία γρήγορη, στα 4 mv/s, ώστε να υπάρχει µία πρώτη ενδεικτική εικόνα της οξείδωσης της ουσίας, και στη συνέχεια σε µια πιο αργή ταχύτητα σάρωσης, στα 1 mv/s, ούτως ώστε να µελετηθεί λεπτοµερώς η οξείδωση της ουσίας (όσο πιο µικρή ταχύτητα σάρωσης δυναµικού χρησιµοποιείται τόσο καλύτερα φαίνεται η πορεία της οξείδωσης της ουσίας και τα ενδιάµεσα στάδια της αντίδρασης). Όπως αναφέρθηκε στο θεωρητικό τµήµα, τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα, ως πειράµατα µη σταθερής κατάστασης, εµφανίζουν τα χαρακτηριστικά µέγιστα τα οποία δηλώνουν το δυναµικό που αρχίζει να οξειδώνεται η κάθε ουσία. Τα χαρακτηριστικά αυτά µέγιστα αυξάνονται µε αύξηση της ταχύτητας σάρωσης του δυναµικού (λόγω του ανταγωνισµού ανάµεσα στην τάση αύξησης του ρεύµατος, εξαιτίας της αύξησης του δυναµικού, και στην τάση πτώσης του λόγω συνεχούς αύξησης του πάχους της στιβάδας διάχυσης, δ) Το ύψος και η θέση των κορυφών των κυκλικών βολταµογραφηµάτων εξαρτάται από το βαθµό αντιστρεπτότητας-κινητική της δράσης και την ταχύτητα σάρωσης. Είναι φανερό ότι οι κορυφές, και γενικά τα ρεύµατα οξείδωσης είναι πιο υψηλά στον πρώτο κύκλο, κάτι που είναι αναµενόµενο διότι στην αρχή της σάρωσης το ηλεκτρόδιο εργασίας είναι περισσότερο ενεργοποιηµένο. Στο δεύτερο και τρίτο κύκλο σάρωσης τα ρεύµατα είναι πιο χαµηλά λόγω πιθανής παθητικοποίησης του ηλεκτροδίου, συσσώρευσης αντιδρώντος και κατανάλωσης προϊόντος κοντά στην ηλεκτροδιακή επιφάνεια. Επίσης, από το ύψος της κορυφής καθώς και από τη µορφή του κυκλικού βολταµογραφήµατος µπορεί να γίνει αντιληπτό ποιες από τις ουσίες είναι περισσότερο ευοξείδωτες. Οι ουσίες dopa, me-dopa, 5htp, οξειδώνονται σε χαµηλά δυναµικά (~,5V). Στη συνέχεια, ακολουθούν οι υπόλοιπες, οι οποίες οξειδώνονται σε ψηλότερες τιµές δυναµικών (.9V-1.1V). 5

56 Επίσης, είναι φανερό πως στην περίπτωση της met, δεν φαίνεται ξεκάθαρα κάποια κορυφή στο κυκλικό βολταµµογράφηµα, αυτό σηµαίνει πως µέχρι το 1,8 V δεν έχει πιάσει την ορική περιοχή, περιοχή µεταφοράς µάζας. Στο Σχήµα Α.Ι.12 παραθέτονται τα βολταµµογραφήµατα της medopa και του φέροντα ηλεκτρολύτη, σε υδατικές φάσεις, τα οποία αναφέρονται σε ταχύτητες σάρωσης 1 mv/s και 4 mv/s, όπου είναι φανερή η επίδραση της ταχύτητας στη µορφή του βολταµογραφήµατος (όπως αναφέρθηκε στην προηγούµενη παράγραφο). I / µα 8 7 φ.η.1mv/s 6 me-dopa 1mV/s 5 φ.η. 4mV/s 4 me-dopa 4mV/s E / V Σχήµα A.I.12 : Βολταµµογραφήµατα (I / µα Ε / V vs Ag/AgCl) της me-dopa και του φέροντα ηλεκτρολύτη (φ.η.) σε υδατικές φάσεις και µε ταχύτητες σάρωσης του δυναµικού 1mV/s και 4mV/s. 51

57 Στους Πίνακες Α.Ι.4(Α) και Α.Ι.4(Β) καταγράφονται, ενδεικτικά, τα ρεύµατα των κορυφών ορισµένων αµινοξέων στις δύο ταχύτητες σάρωσης, 1 mv/s και 4 mv/s, τα οποία προέρχονται από τον α κύκλο σάρωσης του δυναµικού, τόσο σε υδατικά όσο και σε διαλύµατα iρroh. Στους πίνακες αυτούς είναι φανερή η επίδραση της ταχύτητας σάρωσης στο ύψος του ρεύµατος. Επίσης, µε εξαίρεση την trp και τη dopa, τετραπλασιασµός της ταχύτητας σάρωσης οδηγεί σε αύξηση του ρεύµατος κορυφής όχι πολύ µακριά από διπλασιασµό (όπως θεωρητικά προβλέπεται για έλεγχο µεταφοράς µάζας). Η ποιοτική µελέτη των βολταµογραφηµάτων συνεπάγεται εύρεση του ρεύµατος κορυφής, Ι p (αναγράφεται στον Πίνακα Α.Ι.4 για ορισµένα από τα αµινοξέα), του δυναµικού όπου βρίσκεται η κορυφή, E p, και τέλος το δυναµικό E p/2. Από τα παραπάνω βολταµµογραφήµατα του α κύκλου των αµινοξέων, οι πληροφορίες που παίρνουµε για το E p και το E p/2 καταγράφονται στον Πίνακα Α.Ι.5 (Α) και Α.Ι.5 (Β) για υδατική φάση και υδατική φάση iproh 2%, αντίστοιχα. Από τους συγκεκριµένους πίνακες παρατηρούµε πως η παρουσία του οργανικού διαλύτη, δηλαδή της iproh, δεν επηρεάζει σηµαντικά (µε εξαίρεση την cys) την θέση και το ύψος της κορυφής συγκριτικά µε τα αντίστοιχα βολταµµογραφήµατα σε υδατικά διαλύµατα. εν έχουµε δηλαδή σηµαντικές µετατοπίσεις στα κύµατα µε την παρουσία του συγκεκριµένου οργανικού διαλύτη. Ενδεικτικά παρατίθενται στο Σχήµα Α.Ι.13 τα βολταµµογράφηµα του φέροντα ηλεκτρολύτη (φ.η., Η 2 Ο ph=2.5 και 2% iproh ph=2.5) και των ουσιών σε υδατικά διαλύµατα και σε υδατικά διάλυµατα παρουσία iproh 2%. 52

58 Πίνακας A.I.4 : Ρεύµατα κορυφών, I p,των αµινοξέων σε ταχύτητες σάρωσης του δυναµικού 1 mv/s και 4 mv/s (Α) σε υδατικά διαλύµατα και (Β) σε υδατικά διαλύµατα iproh 2%. (A) 1 mv / s 4 mv / s ΟΥΣΙΑ I p (µa) I p (µa) I p (µa) I p (µa) α κύµα οξείδωσης β κύµα οξείδωσης α κύµα οξείδωσης β κύµα οξείδωσης 5htp met tyr dοpa me-dopa trp cys hcy (B) 1 mv / s 4 mv / s ΟΥΣΙΑ I p (µa) I p (µa) I p (µa) I p (µa) α κύµα οξείδωσης β κύµα οξείδωσης α κύµα οξείδωσης β κύµα οξείδωσης 5htp met tyr dopa me-dopa trp cys hcy

59 Πίνακας A.I.5 : Τιµές E p και Ε p/2 όπως προκύπτουν από τον α κύκλο των κυκλικών βολταµογραφηµάτων των σχηµάτων Α.Ι.9 και Α.Ι.1 για (Α) υδατικά διαλύµατα και (Β) υδατικά διαλύµατα iproh 2%. (Α) E p α κύµα οξείδωσης E p β κύµα οξείδωσης 5htp, , ΟΥΣΙΑ Ε p/2 α κύµα οξείδωσης met 1, tyr Ε p/2 β κύµα οξείδωσης cys,978 1, dopa hcy, me-dopa trp (Β) Ε p/2 α κύµα οξείδωσης Ε p/2 β κύµα οξείδωσης ΟΥΣΙΑ E p E p α κύµα β κύµα οξείδωσης οξείδωσης 5htp, ,54 1,17 met 1,48,978 tyr.881,843 cys, ,546,826 dopa.473,433 hcy ,826 me-dopa.487,447 trp.89,83 54

60 6 4 hcy ihcy φ.η.h2o φ.η.2%iproh a cycle 4 3 c cycle hcy ihcy φ.η.h2o φ.η.2%iproh Ι / µα I / µα E/ V E / V Ι / µα me-dopa φ.η.h2o ime-dopa φ.η.iproh a cycle I / µα me-dopa φ.η.h2o ime-dopa φ.η.iproh c cycle 1 5 5,5 1 1,5 Ε/ V,5 1 1,5 Ε / V trp φ.η.h2o itrp φ.η.iproh a cycle 15 1 trp φ.η.h2o itrp φ.η.iproh c cycle Ι / µα 15 I / µα E / V E / V Σχήµα A.I.13 : Σύγκριση βολταµογραφηµάτων (πρώτος και τρίτος κύκλος), Ι/Α- E/ V vs Ag/AgCl, των αµινοξέων hcy, me-dopa και trp, σε υδατικά διαλύµατα και σε υδατικά διαλύµατα iproh 2%. (το i µπροστά από το όνοµα των αµινοξέων συµβολίζει ότι το διάλυµα ήταν υδατικό διάλυµα iproh). 55

61 Kυκλική βολταµµετρία µε µικροηλεκτρόδιο Το µικροηλεκτρόδιο που χρησιµοποιήθηκε ήταν δίσκος άνθρακα, όπως αναφέρεται στο πειραµατικό µέρος. Οι συγκεντρώσεις των ουσιών είναι 2*1-3 Μ, εκτός από αυτήν της dopa που είναι 5*1-3 Μ, την tyr που είναι 1-3 Μ (διότι το διάλυµα των 2*1-3 Μ είναι υπέρκορο) και της met που είναι 5*1-3 Μ (δεν είναι ευοξείδωτη και έτσι χρειάστηκε µεγαλύτερη συγκέντρωση για να ληφθεί µετρήσιµο σήµα). Ο τρόπος εργασίας, η περιοχή δυναµικού που έγινε η µελέτη και ο ηλεκτροχηµικός τρόπος καθαρισµού ήταν ο ίδιος µε αυτό που αναφέρθηκε και στο µακροηλεκτρόδιο. Ο µηχανικός καθαρισµός µόνο διέφερε, όπου το µικροηλεκτρόδιο λειάνθηκε µε κόκκους αλουµίνας διαφορετικών διαστάσεων (,3 και,5µm). Στα Σχήµατα Α.Ι.14 και Α.Ι.15 απεικονίζονται τα βολταµµογραφήµατα ορισµένων αµινοξέων σε υδατικά διαλύµατα και σε υδατικά διαλύµατα µε 2% iproh, αντίστοιχα, στα οποία χρησιµοποιήθηκε το µικροηλεκτρόδιο που αναφέρεται στην παραπάνω παράγραφο. Με τη βοήθεια των συγκεκριµένων σχηµάτων µπορούµε να παρατηρήσουµε την εµφανή διαφορά που έχουν τα βολταµµογραφήµατα που παίρνονται µε µικροηλεκτρόδια, όσον αφορά τη µορφή, από τα αντίστοιχα βολταµµογραφήµατα της κλασικής βολταµµετρίας, όπου στην δεύτερη περίπτωση είναι κορυφώδη ενώ στην πρώτη σιγµοειδή. Η σιγµοειδής µορφή είναι χαρακτηριστική στα πειράµατα όπου επικρατούν συνθήκες σταθερής κατάστασης, όπου δηλαδή το προφίλ συγκέντρωσης της ουσίας στο χώρο και οι συνθήκες µεταφοράς µάζας παραµένουν αµετάβλητες µε το χρόνο. Σε αυτού του είδους τα βολταµµογραφήµατα διακρίνονται δύο περιοχές : την περιοχή όπου επικρατεί ο κινητικός έλεγχος ρεύµατος, δηλαδή η ταχύτητα-ρεύµα ελέγχεται από τη µεταφορά φορτίου, και αντιστοιχεί στο «ποδαράκι» του κύµατος, και την περιοχή όπου επικρατεί ο έλεγχος µεταφοράς µάζας, δηλαδή η ταχύτητα ρεύµα καθορίζεται από τη µεταφορά µάζας, και αντιστοιχεί στο πλατώ του κύµατος. 56

62 Ι / nα 15 φ.η. 5htp hcy cys his a cycle I / na φ.η. 5htp hcy cys his c cycle Ε / V E / V a cycle φ.η tyr met dopa c cycle I / na I / na φ.η. met dopa tyr E / V E / V 2 17 φ.η. trp me-dopa cys-cys a cycle 14 φ.η. trp me-dopa cys-cys c cycle I / na 11 I / na E / V E / V Σχήµα A.I.14 : Βολταµµογραφήµατα (πρώτος και τρίτος κύκλος) I/nA E/V vs Ag/AgCl, των αµινοξέων και του φέροντα ηλεκτρολύτη (φ.η.), χρησιµοποιώντας δίσκο άνθρακα διαµέτρου 3µm και υδατικά διαλύµατα. 57

63 3 3 I / na φ.η. 5htp hcy cys his a cycle I / na φ.η. 5htp hcy cys his c cycle Ε / V E / V φ.η.. met dopa tyr a cycle φ.η. met dopa tyr c cycle I / na 15 I / na Ε / V E / V 3 25 φ.η. trp me-dopa cys-cys a cycle φ.η. trp me-dopa cys-cys c cycle 2 11 I / na 15 I / na E / V Ε / V Σχήµα A.I.15 : Ότι και στο Σχήµα Α.Ι.14 αλλά για υδατικά διαλύµατα iproh 2% 58

64 Πιο συγκεκριµένα, το δυναµικό, Ε p, πέραν του οποίου οι ουσίες, στα κυκλικά βολταµµογραφήµατα, αποκτούν ορικό ρεύµα (πλατώ του κύµατος) το οποίο µας ενδιαφέρει διότι το ρεύµα σε εκείνη την περιοχή είναι ανεξάρτητο του δυναµικού, καταγράφεται στους Πίνακες Α.Ι.6 (Α) και Α.Ι.6 (Β) για υδατικά διαλύµατα και υδατικά διαλύµατα iproh 2%, αντίστοιχα. Συγκρίνοντας τους Πίνακες Α.Ι.6 (Α) και Α.Ι.6 (Β) παρατηρούµε ότι και πάλι δεν υπάρχουν σηµαντικές µετατοπίσεις στα κύµατα των βολταµογραφηµάτων ανάµεσα σε αυτά που πάρθηκαν σε υδατικά διαλύµατα και σε υδατικά διαλύµατα µε την παρουσία iproh, όπως ακριβώς παρατηρήθηκε και στην κυκλική βολταµµετρία µε µακροηλεκτρόδιο. 59

65 Πίνακας A.I.6 : Τιµές Ε p και Ε p/2, των αµινοξέων όπως προκύπτουν από τη βολταµµετρία χρησιµοποιώντας µικροηλεκτρόδιο (δίσκο άνθρακα διαµέτρου 3µm) για (A) υδατικά διαλύµατα και (Β)για υδατικά διαλύµατα µε 2% iproh. (Α) ΟΥΣΙΑ Ε p α κύµα οξείδωσης Ε p β κύµα οξείδωσης Ε p/2 α κύµα οξείδωσης Ε p/2 β κύµα οξείδωσης 5htp,52 1.2,449,956 met 1,28 1,12 tyr,89,89 cys,878,531 dopa.425,394 hcy, ,865 1,218 me-dopa.434,417 trp.518,484 (Β) Ε p β κύµα οξείδωσης Ε p/2 α κύµα οξείδωσης Ε p/2 β κύµα οξείδωσης Ε p ΟΥΣΙΑ α κύµα οξείδωσης 5htp met tyr cys dopa hcy me-dopa trp

66 Ηλεκτροxηµική µελέτη αµινοξέων σε κυψέλες HPLC-υδροδυναµικά διαγράµµατα Μετά τη µελέτη της ηλεκτροχηµικής συµπεριφοράς των αµινοξέων χρησιµοποιώντας τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας µε µακρο- και µικρο- ηλετρόδια, θα γίνει µελέτη της αντίστοιχης συµπεριφοράς τους σε ηλεκτροχηµικές κυψέλες οι οποίες συνδέθηκαν µε το σύστηµα της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC), προκειµένου να γίνει σύγκριση των υδροδυναµικών διαγραµµάτων και των κυκλικών βολταµογραφηµάτων. Από τις κυψέλες που χρησιµοποιήθηκαν και αναφέρονται στο πειραµατικό µέρος, τα πλέον ικανοποιητικά αποτελέσµατα ελήφθησαν µε την κυψέλη α και µε την κυψέλη β. Πριν την εισαγωγή των µικρο-ινών στην ηλεκτροχηµική κυψέλη ροής HPLC, προηγήθηκε ο χαρακτηρισµός τους µε τη βοήθεια της κυκλικής βολταµµετρίας σε διάλυµα σιδηροκυανυούχων 5*1-3 Μ /,1Μ ΚΟΗ. Στις κυψέλες HPLC τοποθετήθηκαν µικρο-ηλεκτρόδια τα οποία ήταν του ίδιου υλικού µε τα µικρο-ηλεκτρόδια που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα της κυκλικής βολταµµετρίας, διότι πιστεύεται ότι άλλες ιδιότητες θα εµφανίζει ο υαλώδης άνθρακας και άλλες ο απλός άνθρακας. Στα Σχήµατα Α.Ι.16 Α.Ι.19 απεικονίζονται τα υδροδυναµικά διαγράµµατα φορτίου (Q /nc) ως προς το δυναµικό (E/V) και ρεύµατος (Ι/nA) ως προς το δυναµικό (E/V) των ελεύθερων αµινοξέων, τα οποία πάρθηκαν χρησιµοποιώντας κυψέλη α και την κυψέλη β, αντίστοιχα. Αρχικά, αυτό που παρατηρείται από τα συγκεκριµένα σχήµατα είναι ότι όλα τα υδροδυναµικά διαγράµµατα έχουν σιγµοειδή µορφή όπως αυτή των βολταµογραφηµάτων µε µικρο-ηλεκτρόδια, κάτι που ήταν αναµενόµενο λόγω των όσων αναφέρθηκαν για τις συνθήκες που επικρατούν στο εσωτερικό της κυψέλης (συνθήκες σταθερής κατάστασης ως προς την µεταφορά µάζας). 61

67 (Α) I / na trp me-dopa dopa 5htp met tyr hcy cys 4 2,3,5,7,9 1,1 1,3 1,5 E / V (Β) I / na trp me-dopa dopa 5htp met tyr hcy cys 4 2,3,5,7,9 1,1 1,3 1,5 E / V Σχήµα A.I.16 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα ρεύµατος δυναµικού (Ι / na E / V vs Ag/AgCl) αµινοξέων χρησιµοποιώντας κυψέλη α µε µακρο - ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και (Α) υδατική κινητή φάση και (Β) υδατική κινητή φάση µε 2% iproh. 62

68 (Α) 16 Q / nc trp me-dopa dopa 5htp met tyr hcy cys 4 2,3,5,7,9 1,1 1,3 1,5 E / V (Β) Q / nc trp me-dopa dopa 5htp met tyr hcy cys 6 4 2,2,4,6,8 1 1,2 1,4 E / V Σχήµα A.I.17 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα αµινοξέων φορτίου δυναµικού (Q / nc E / V vs Ag/AgCl) χρησιµοποιώντας κυψέλη α µε µακρο - ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και (Α) υδατική κινητή φάση και (Β) υδατική κινητή φάση µε 2% iproh. 63

69 (A) I / na htp cys dopa hcy me-dopa trp tyr 4 2,4,6,8 1 1,2 1,4 E / V (B) I / na 1,2E+3 1,E+3 8,E+2 6,E+2 5htp cys dopa hcy me-dopa trp tyr 4,E+2 2,E+2,E+,4,6,8 1 1,2 1,4 E / V Σχήµα A.I.18 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα ρεύµατος ως προς δυναµικό (I/nA E /V vs AgAgCl) των αµινοξέων χρησιµοποιώντας την κυψέλη β µε τα δύο ηλεκτρόδια: (Α) υαλώδης άνθρακας και (Β) δύο ίνες άνθρακα. Η κινητή φάση που χρησιµοποιήθηκε ήταν υδατικό διάλυµα µε 2% iproh. 64

70 (A) Q / nc 1,4E+5 1,2E+5 1,E+5 8,E+4 6,E+4 5htp cys dopa hcy me-dopa trp tyr 4,E+4 2,E+4,E+,4,6,8 1 1,2 1,4 E / V (B) 1,E+4 9,E+3 Q / nc 8,E+3 7,E+3 6,E+3 5,E+3 4,E+3 5htp cys dopa hcy me-dopa trp tyr 3,E+3 2,E+3 1,E+3,E+,4,6,8 1 1,2 1,4 E / V Σχήµα A.I.19 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα φορτίου ως προς δυναµικό (Q/nC E /V vs AgAgCl) των αµινοξέων χρησιµοποιώντας την κυψέλη β µε τα δύο ηλεκτρόδια : (Α) υαλώδης άνθρακας και (Β) δύο ίνες άνθρακα. Η κινητή φάση που χρησιµοποιήθηκε ήταν υδατικό διάλυµα µε 2% iproh. 65

71 Πιο συγκεκριµένα, µε τη βοήθεια των υδροδυναµικών διαγραµµάτων των Σχηµάτων Α.Ι.16 - Α.Ι.19, µπορούµε να πάρουµε πληροφορίες για τις τιµές των δυναµικών Ε p και Ε p/2, οι οποίες καταγράφονται στους Πίνακες Α.Ι.7 για την κυψέλη α (χρησιµοποιώντας (A) υδατική κινητή φάση και (B) υδατική κινητή φάση παρουσία της iproh ως οργανικό τροποποιητή), και Α.Ι.8 για την κυψέλη β (για την περίπτωση που ως κινητή φάση χρησιµοποιείται υδατικό διάλυµα 2% iproh). Παρατηρώντας όλα τα βολταµµογραφήµατα και τα υδροδυναµικά διαγράµµατα θα µπορούσε κανείς να ισχυριστεί τα εξής : α. η κατάλληλη περιοχή δυναµικού προκειµένου να είναι δυνατή η ανίχνευση όλων των ουσιών είναι 1 V 1,2 V vs Ag/AgCl. Έτσι, µια καλή επιλογή δυναµικού που θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί είναι το 1,1V ούτως ώστε να αποφεύγεται το υψηλότερο δυναµικό 1,2V (για να µην είµαστε κοντά στην περιοχή έκλυσης οξυγόνου) αλλά και για να είναι λίγο πιο ενισχυµένα τα σήµατα για ορισµένες ουσίες, όπως πχ η met, οι οποίες έχουν πολύ µικρό ηλεκτροχηµικό σήµα. β. Οι τιµές Ε p/2 που προκύπτουν από τα υδροδυναµικά διαγράµµατα χρησιµοποιώντας κυψέλες HPLC και ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα είναι γενικά µεγαλύτερες από τις αντίστοιχες τιµές που προκύπτουν µε τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας που εφαρµόστηκε µακρο ηλεκτρόδιο, κάτι που ήταν αναµενόµενο λόγω της αύξησης της µη αντιστρεπτότητας των δράσεων που προκαλούνται στις κυψέλες HPLC, εξαιτίας των αυξηµένων συνθηκών µεταφοράς µάζας. Με τα παραπάνω πειράµατα τελειώνει η αρχική ποιοτική µελέτη των ουσιών που έγινε µε σκοπό να µελετηθεί ποιες από τις ουσίες οξειδώνονται, ποια είναι η ηλεκτροχηµική τους συµπεριφορά, τη µορφή και την ποιοτική σύγκριση των κυκλικών βολταµµογραφηµάτων και των υδροδυναµικών διαγραµµάτων και τέλος να βρεθεί το βέλτιστο δυναµικό που να ανιχνεύει όλες τις ουσίες το οποίο θα χρησιµοποιηθεί αργότερα για την βελτιστοποίηση της ανίχνευσης των αµινοξέων που µελετώνται. 66

72 Πίνακας A.I.7 : Τιµές Ε p και Ε p/2 για την κυψέλη α (Α) χρησιµοποιώντας υδατική κινητή φάση και (Β) υδατική κινητή φάση µε 2% iproh. (A) ΟΥΣΙΑ Ε p (V) α κύµα οξείδωσης Ε p (V) β κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) α κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) β κύµα οξείδωσης 5htp met (δεν λαµβάνει ορικό ρεύµα) tyr 1.9 cys dopa.6.45 hcy me-dopa.6.45 trp (B) ΟΥΣΙΑ Ε p (V) α κύµα οξείδωσης Ε p (V) β κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) α κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) β κύµα οξείδωσης 5htp met (δεν λαµβάνει ορικό ρεύµα) tyr 1.92 cys dopa.6.4 hcy me-dopa.5.47 trp

73 Πίνακας A.I.8 Τιµές Ε p και Ε p/2 για την κυψέλη β,όπου στο (Α) αναγράφονται οι τιµές για το µεγάλο ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και στο (Β) οι τιµές για τις 2 ίνες άνθρακα χρησιµοποιώντας υδατική κινητή φάση µε 2 % iproh. (Α) ΟΥΣΙΑ Ε p (V) α κύµα οξείδωσης Ε p (V) β κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) α κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) β κύµα οξείδωσης 5htp met (δεν λαµβάνει ορικό ρεύµα) tyr cys dopa.7.55 hcy me-dopa.7.5 trp 1.9 (Β) ΟΥΣΙΑ Ε p (V) α κύµα οξείδωσης Ε p (V) β κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) α κύµα οξείδωσης Ε p/2 (V) β κύµα οξείδωσης 5htp met (δεν λαµβάνει ορικό ρεύµα) tyr cys dopa.7.6 hcy me-dopa.6.5 trp

74 Στη συνέχεια, επαναλήφθηκαν ορισµένα από τα πειράµατα χρησιµοποιώντας µεγαλύτερες συγκεντρώσεις αµινοξέων, για να υπάρχει µεγαλύτερη και πιο ξεκάθαρη ευκρίνεια στα σήµατα κυρίως των µικροηλεκτροδίων, ώστε να µπορεί να γίνει µε µεγαλύτερη ακρίβεια η απαραίτητη ποσοτική µελέτη. Πιο συγκεκριµένα, στόχος είναι να γίνει σύγκριση των ορικών ρευµάτων, της πυκνότητας ρεύµατος, των ορίων ευαισθησίας σε σύγκριση µε το θόρυβο, κ.λ.π., έτσι ώστε να ελεγχθούν τα πιθανά πλεονεκτήµατα των µικροηλεκτροδίων ως προς τα µακροηλεκτρόδια στην ηλεκτροχηµική ανίχνευση της HPLC ή στην προκαταρκτική ηλεκτροχηµική µελέτη µε τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας. Α.Ι.4.2 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ ΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΜΕ iprοη ΩΣ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΗ Κατά την ποσοτική µελέτη ουσιαστικά µας ενδιαφέρει να συγκρίνουµε τις δύο µεθόδους, της κυκλικής βολταµµετρίας µε µικροηλεκτρόδιο και των υδροδυναµικών διαγραµµάτων σε κυψέλες HPLC οι οποίες, όπως αναφέρεται και στο θεωρητικό τµήµα, αναµένεται να εµφανίζουν τα ίδια χαρακτηριστικά όσο αφορά µηχανισµό οξείδωσης, πυκνότητες ρεύµατος κ.α. Για αυτό το σκοπό χρειάστηκε να επαναληφθούν κάποιες µετρήσεις έτσι ώστε να χρησιµοποιηθούν τα ίδια διαλύµατα, οι ίδιες συνθήκες και στις δύο αυτές µεθόδους που εφαρµόστηκαν. Στην ποσοτική µελέτη επίσης έχει σηµασία να ληφθούν οι µετρήσεις και την ίδια χρονική περίοδο. Εφόσον πιο πάνω παρατηρήθηκε ότι δεν υπάρχει ουσιαστική διαφορά ανάµεσα στα υδατικά και στα υδατικά διαλύµατα iproh 2%, για την ποσοτική µελέτη χρησιµοποιήθηκαν µόνο υδατικά διαλύµατα iproh. 69

75 Έτσι, παρασκευάστηκαν διαλύµατα των ουσιών συγκέντρωσης 2µg/mL και ελήφθησαν ξανά τα υδροδυναµικά τους διαγράµµατα στην κυψέλη α και στην κυψέλη β, καθώς και τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα µε µικροδίσκο άνθρακα. Ο λόγος που χρησιµοποιείται τόσο µεγάλη συγκέντρωση ουσιών είναι για να ενισχυθεί το σήµα στα κυκλικά βολταµµογραφήµατα µε µικροηλεκτρόδια. Στο Σχήµα Α.Ι.2 παραθέτονται µόνο τα βολταµµογραφήµατα που πάρθηκαν µε το µικροδίσκο, κατά τον πρώτο και τρίτο κύκλο σάρωσης του δυναµικού, και όχι τα υδροδυναµικά διαγράµµατα, λόγω συντοµίας και λόγω του ότι τα τελευταία δεν έχουν ουσιαστική διαφορά στη µορφή µε τα αντίστοιχα που απεικονίζονται στα Σχήµατα Α.Ι.16-Α.Ι.19 στο κεφάλαιο της ποιοτικής µελέτης. Η ποσοτική µελέτη ξεκινά υπολογίζοντας το ορικό ρεύµα σταθερής κατάστασης και την πυκνότητα ρεύµατος της κάθε ουσίας για κάθε ηλεκτροχηµική µέθοδο που εφαρµόστηκε. Στην περίπτωση της κυκλικής βολταµµετρίας µε µικρο-ηλεκτρόδιο, που όπως αναφέρθηκε είναι πείραµα σταθερής κατάστασης, το ρεύµα που λαβαίνεται είναι και το ρεύµα σταθερής κατάστασης που χρειάζεται. Στην περίπτωση όµως των πειραµάτων µε τις κυψέλες ΗPLC, λόγω του ότι δεν επικρατούν συνθήκες σταθερής κατάστασης, το ρεύµα αυτό που καταγράφει ο ποτενσιοστάτης πρέπει να µετατραπεί σε ρεύµα σταθερής κατάστασης [11,13]. Ο τρόπος για να γίνει αυτό όπως αναφέρθηκε και στο θεωρητικό µέρος είναι µέσω της εξίσωσης Q=I ss V s / U, δηλαδή της Εξ. (13), όπου Q (nc) είναι το φορτίο που διαρρέει το ηλεκτρόδιο κατά την οξείδωση της ουσίας, I ss (na) είναι το ρεύµα σταθερής κατάστασης και U (ml/s) είναι η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης. Συνεπώς, για τον παραπάνω υπολογισµό και για το δυναµικό όπου για κάθε ουσία λαµβάνεται ορικό ρεύµα, βρίσκουµε το φορτίο της ουσίας που οξειδώνεται και υπολογίζουµε το I ss. Η πυκνότητα ρεύµατος, είναι το ρεύµα σταθερής κατάστασης ανά µονάδα επιφάνειας. Για να υπολογιστεί απλά διαιρούµε το I ss µε την επιφάνεια του ηλεκτροδίου, Α (cm 2 ). 7

76 (Α) 5.E+ 4.E+ cys φ.η. dopa hcy tyr I / na 3.E+ 2.E+ 1.E+ -2.E E / V (Β) 4.E+ 3.5E+ 3.E+ 5htp φ.η. me-dopa trp I / na 2.5E+ 2.E+ 1.5E+ 1.E+ 5.E-1.E E / V Σχήµα A.I.2 : Βολταµµογραφήµατα αµινοξέων (2µg/mL) και του φέροντα ηλεκτρολύτη (φ.η.), χρησιµοποιώντας µικρο-δίσκο άνθρακα και υδατικά διαλύµατα αµινοξέων µε 2% iproh. (A) πρώτος κύκλος και (B) τρίτος κύκλος σάρωσης του δυναµικού. 71

77 Υδροδυναµικά διαγράµµατα σε κυψέλη µε µακρο- ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (κυψέλη α) Η επιφάνεια του µακρο-ηλεκτροδίου της κυψέλης α είναι: Α=.765cm 2. Τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν για το συγκεκριµένο ηλεκτρόδιο, δίνονται στον Πίνακα Α.Ι.9. Πίνακας Α.Ι.9 : Τιµές Ε p (V), I ss (nα) και I ss / A (na / cm 2 ) των αµινοξέων, για την κυψέλη α. Ουσία Ε p (V)* I ss (nα) I ss / A (na / cm 2 ) cys** hcy** dopa me-dopa htp** tyr trp * το Ε p αναφέρεται στο δυναµικό όπου µετράται το ορικό ρεύµα κάθε ουσίας. ** στις συγκεκριµένες ουσίες το Ε p αναφέρεται στο πρώτο κύµα οξείδωσης. Υδροδυναµικά διαγράµµατα σε κυψέλη µε µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και 2 ίνες άνθρακα (κυψέλη β) Η επιφάνεια του µακρο-ηλεκτροδίου υαλώδους άνθρακα της κυψέλης β είναι ίδια µε την αντίστοιχη του µακρο-ηλεκτροδίου της κυψέλης α που αναγράφεται στην παραπάνω παράγραφο, δηλαδή Α=.765 cm 2. Η επιφάνεια κάθε ίνας άνθρακα, ως επιφάνεια µικροκυλίνδρου είναι ίση µε.471 cm 2. Επειδή οι ίνες είναι δύο, η ολική επιφάνεια του µικρο-ηλεκτροδίου είναι Α=.942cm 2. Τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν µε την συγκεκριµένη κυψέλη δίνονται στον Πίνακα Α.Ι.1. Οι µικρές διαφορές που υπάρχουν ανάµεσα στα δύο µακροηλεκτρόδια των κυψελών α και β, πιθανόν να οφείλονται στο διαφορετικό όγκο των κυψελών, στη διαφορετική ενεργοποίηση και παθητικοποίηση 72

78 των ηλεκτροδίων και σε πειραµατικά σφάλµατα, που οδηγούν σε έλλειψη επαναληψιµότητας. Πίνακας Α.Ι.1 : Τιµές Ε p (V), I ss (nα) και I ss / A (na / cm 2 ) των αµινοξέων, για την κυψέλη β, όπου στο (Α) αναγράφονται οι τιµές για το ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα και στο (Β) οι τιµές για τις δύο ίνες άνθρακα. (Α) (Β) ουσία Ε (V) I ss (nα) I ss / A (na / cm 2 ) a b a b a b cys hcy dopa me-dopa htp tyr trp ουσία Ε (V) I ss (nα) I ss / A (na / cm 2 ) a b a b a b cys hcy dopa me-dopa htp tyr trp *Τα a και b αναφέρονται στο πρώτο και στο δεύτερο κύµα οξείδωσης, αντίστοιχα. Κυκλική βολταµµετρία µε µικρο-δίσκο άνθρακα Η επιφάνεια του µικρο-δίσκου είναι Α = πr 2 =7.7*1-6 cm 2. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν εφαρµόζοντας τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας µε το συγκεκριµένο µικρο-ηλεκτρόδιο (βλ. σχήµα Α.Ι.2) αναγράφονται στον Πίνακα Α.Ι.11 για τον (Α) πρώτο κύκλο και (Β) για τον 73

79 τρίτο κύκλο σάρωσης του δυναµικού. Στο συγκεκριµένο πίνακα αναγράφονται οι τιµές ρεύµατος που οφείλονται στον φέροντα ηλεκτρολύτη (φ.η.) καθώς και τα ρεύµατα που οφείλονται στο διάλυµα του αµινοξέος στο οποίο υπάρχει και ο φέροντας ηλεκτρολύτης. Είναι φανερό ότι το ρεύµα που οφείλεται αποκλειστικά στο αµινοξύ, υπολογίζεται µε την αφαίρεση αυτών των δύο τιµών, δηλαδή της τιµής ρεύµατος του φ.η. από το ρεύµα που λαµβάνεται από το διάλυµα, Ι = I (δ/τος) - I (φ.η.), το οποίο ουσιαστικά αποτελεί το ρεύµα σταθερής κατάστασης, I ss. Πίνακας Α.Ι.11 : Τιµές Ε p (V), I ss (nα) και I ss / A (na / cm 2 ) των αµινοξέων χρησιµοποιώντας µικρο-δίσκο και τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας σε υδατικά διαλύµατα iproh 2%. (A) πρώτος και (Β) τρίτος κύκλος σάρωσης του δυναµικού. (Α) Ουσία Ε p (V) I (φ.η.) /na I(δ/τος) /na I ss /na I ss / A (na / cm 2 ) (Β) cys hcy dopa me-dopa htp tyr trp Ουσία Ε p (V) I (φ.η.) /na I(δ/τος) /na I ss /na I ss / A (na / cm 2 ) cys hcy dopa me-dopa htp tyr trp

80 Σύγκριση πυκνοτήτων ρεύµατος που καταγράφηκαν στα κυκλικά βολταµµογραφήµατα και στα υδροδυναµικά διαγράµµατα Το ρεύµα κάθε ουσίας που οξειδώνεται είναι ανάλογο µε την επιφάνεια του ηλεκτροδίου που χρησιµοποιείται. Συνεπώς το ρεύµα I ss δεν είναι αντιπροσωπευτικό για τη σύγκριση µεταξύ των παραπάνω ηλεκτροδίων σε αντίθεση µε την πυκνότητα ρεύµατος η οποία δηλώνει το ρεύµα ανά µονάδα επιφάνειας. Γι αυτό το λόγο, για τη σύγκριση των ηλεκτροδίων χρησιµοποιείται η πυκνότητα ρεύµατος ( I ss /Α, όπου Α η επιφάνεια του ηλεκτροδίου η οποία έρχεται σε επαφή µε το διάλυµα της ουσίας). Στην κυψέλη β τοποθετήθηκαν 2 διαχωριστικά (spacers), ούτως ώστε να είναι σίγουρο ότι οι ίνες δεν ακουµπούν στο απέναντι ηλεκτρόδιο (σε περίπτωση που κάποια ίνα κατά την τοποθέτησή της έχει καµπυλωθεί). Συνεπώς, η απόσταση ανάµεσα στο ηλεκτρόδιο εργασίας και στο απέναντι ηλεκτρόδιο, σε αυτήν την περίπτωση είναι 2 µm σε αντίθεση µε την κυψέλη α όπου η αντίστοιχη απόσταση είναι 1 µm, αφού εκεί υπάρχει µόνο ένα διαχωριστικό. Η εξάρτηση του ρεύµατος σταθερής κατάστασης από τα χαρακτηριστικά της κυψέλης φαίνεται από την Εξ. (6) του Κεφ. Α.Ι.2.2, δηλ. την : I = ss 1.47 nfca 1 ( L el ) 1 / 3 ( D d ch όπου n είναι ο αριθµός ηλεκτρονίων που µεταφέρονται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, C είναι η συγκέντρωση της ουσίας, D είναι ο συντελεστής ) 2 / 3 ( U w διάχυσης, Α είναι η επιφάνεια του ηλεκτροδίου, L el ch ) 1 / 3 είναι το µήκος του ηλεκτροδίου που είναι παράλληλο στη ροή, d ch είναι το πάχος του καναλιού, w ch είναι το πλάτος του καναλιού (κάθετα στη ροή) και U είναι η ταχύτητα ροής. Με τη βοήθεια της παραπάνω εξίσωσης µπορεί να αντιληφθεί κανείς γιατί τα ρεύµατα οξείδωσης που παίρνονταιε µε την κυψέλη β µε τα δύο διαχωριστικά είναι χαµηλότερα συγκριτικά µε τα αντίστοιχα που παίρνονται µε την κυψέλη α που έχει ένα διαχωριστικό. Συνεπώς, για να 75

81 γίνουν συγκρίσιµα τα ρεύµατα των δύο κυψελών, θα πρέπει τα ρεύµατα της κυψέλης β, να πολλαπλασιαστούν µε τον παράγοντα 2 2/3. Για την περίπτωση της κυκλικής βολταµµετρίας, αναγράφονται οι τιµές που ελήφθησαν από τον πρώτο και τον τρίτο, κατά προσέγγιση σταθεροποιηµένο, κύκλο σάρωσης του δυναµικού. Στον πίνακα Α.Ι.12 καταγράφονται οι τιµές πυκνότητας ρεύµατος των αµινοξέων για την κυψέλη α, την κυψέλη β και την κυκλική βολταµµετρία µε τον µικροδίσκο. Στο συγκεκριµένο πίνακα οι τιµές της πυκνότητας ρεύµατος για την κυψέλη β έχουν ήδη πολλαπλασιαστεί µε τον παράγοντα που αναφέραµε πιο πάνω (2 2/3 ). Πίνακας Α.Ι.12 : Τιµές πυκνότητας ρεύµατος για τα αµινοξέα χρησιµοποιώντας την κυψέλη α την κυψέλη β και την κυκλική βολταµµετρία µε µικροδίσκο (τα ρεύµατα της κυψέλης β είναι πολλαπλασιασµένα µε τον παράγοντα2 2/3 ). Ουσία * δεν ελήφθη τιµή Κυψέλη α Υαλώδης άνθρακας Κυψέλη β 2 ίνες άνθρακα Κυκλική βολταµµετρία µικροδίσκου α κύκλος γ κύκλος cys 2.14E E E E+4 6.4E+4 hcy 9.91E E E+5 -* 1.23E+5 dopa 1.31E E E+6 1.9E E+5 tyr 8.2E E E+5 -* 5.56E+4 me-dopa 9.23E E E+5 2.4E E+5 5htp 1.92E E E E E+4 trp 2.16E E E E E+4 Από τον Πίνακα Α.Ι.12 παρατηρούµε ότι οι πυκνότητες ρεύµατος µεταξύ των δύο µεγάλων ηλεκτροδίων υαλώδους άνθρακα είναι παρόµοιες, όπως ήταν αναµενόµενο. Οι συντελεστές µεταφοράς µάζας k m, 76

82 του µεγάλου ηλεκτροδίου στην κυψέλη και των µικροδίσκων στην κυκλική βολταµµετρία είναι περίπου ίδιοι (βλ. Κεφάλαιο Α.Ι.2.2). Κάτι τέτοιο θα σήµαινε και ότι οι πυκνότητες ρεύµατος θα έπρεπε να είναι ίδιες. Παρατηρώντας τον ίδιο πίνακα είναι φανερό ότι οι πυκνότητες ρεύµατος των µεγάλων ηλεκτροδίων και του µικρο-δίσκου είναι της ίδιας τάξης µεγέθους για τις ουσίες που λαµβάνουν πολύ νωρίς ορικό ρεύµα, όπως είναι η dopa, η me-dopa, η trp και η 5htp κατά το πρώτο κύµα οξείδωσης. Για τις άλλες ουσίες, όπου η ορική περιοχή πλησιάζει την περιοχή έκλυσης οξυγόνου, υπάρχουν πολύ µεγάλες αποκλίσεις. Πιθανόν η έκλυση οξυγόνου επηρεάζει τις τιµές του ορικού ρεύµατος. Επίσης, ένας επιπλέον λόγος αυτής της απόκλισης είναι το διαφορετικό υλικό από το οποίο είναι κατασκευασµένα τα συγκεκριµένα ηλεκτρόδια, αφού τα µακρο-ηλεκτρόδια είναι από υαλώδη άνθρακα ενώ ο µικρο-δίσκος (όπως και οι ίνες) από γραφιτικό άνθρακα. Γι αυτό ακριβώς και στην κυψέλη της HPLC τοποθετήθηκαν οι ίνες, για να µπορεί να γίνει σύγκριση µε την κυκλική βολταµµετρία χωρίς να υπεισέρχεται ο παράγοντας του υλικού από το οποίο είναι κατασκευασµένα. Ο συντελεστής k m των ινών στην κυψέλη β προκύπτει ότι είναι µεγαλύτερος από τον αντίστοιχο των µικρο-δίσκων στη κυκλική βολταµµετρία ( βλ. παρακάτω σελ. 78) και άρα και του υαλώδη άνθρακα στις κυψέλες HPLC. Αυτό σηµαίνει ότι και οι πυκνότητες ρεύµατος θα έπρεπε να είναι µεγαλύτερες στις ίνες. Από τον Πίνακα Α.Ι.12 παρατηρούµε ότι οι τιµές των πυκνοτήτων ρεύµατος είναι µεγαλύτερες στις ίνες από ότι στους µικροδίσκους αλλά µόνο για τα αµινοξέα dopa και me-dopa (επειδή αυτές οξειδώνονται σε µικρά δυναµικά). Το ίδιο ισχύει συγκρίνοντας τις πυκνότητες ρεύµατος των ινών µε το µεγάλο ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα. Πιο συγκεκριµένα, όσον αφορά τους συντελεστές µεταφοράς µάζας, k m, από την γενική σχέση Ι ss =nfk m CA και τις σχέσεις Ι ss των Εξ. (8) και (9) του Κεφ. Α.Ι.2.2, προκύπτει ότι ο συντελεστής µεταφοράς µάζας για το µακρο- ηλεκτρόδιο στην κυψέλη είναι : 77

83 1 / 3 2 / 3 1 D U ( k ) = m M ( ) ( ) d el M d ch M w ch ενώ για τις ίνες στην κυψέλη ισχύει: 1 / 3 (16) 3 2 / 3 1 / 3 1 / 1 3 U ( k ) ( ) 2 / m m = ) D (d el m d ch π / 4 ( d el ) m m w ch 1 (17) [1/(d el ) M ] 1/3 Από τις παραπάνω σχέσεις φαίνεται ότι το (k m ) Μ είναι ανάλογο του µε αποτέλεσµα µείωση της διαµέτρου του ηλεκτροδίου να οδηγεί σε αύξηση της πυκνότητας ρεύµατος. Για τις µικρο-ίνες, ο τελεστής (k m ) m είναι ανάλογος του [1/(d el ) m ] 1/3 [1/((d ch ) m - π / 4(d el ) m ] 2/3 µε αποτέλεσµα και σε αυτή τη περίπτωση η πυκνότητα ρεύµατος να αυξάνεται όσο µειώνεται η διάµετρος τους, όπως προκύπτει µε αντικατάσταση των αριθµητικών δεδοµένων και για τιµές (d el ) m στο διάστηµα 1-1µm [37]. Ο λόγος των παραπάνω δύο συντελεστών µάζας θα είναι: ( k ( k m m ) ) m M =.827 ( d ( d el el ) ) M m 1 / 3 ( d ch ) m ( d ) M π / 4 ( d ch el ) m 2 / 3 (18) Από τις διαστάσεις των ηλεκτροδίων και της κυψέλης β που χρησιµοποιήθηκαν, ο παραπάνω λόγος είναι ίσος µε 2,65. Κάτι τέτοιο υποδεικνύει ότι η υψηλότερη αναµενόµενη πυκνότητα ρεύµατος στις µικρο-ίνες οφείλεται στις υψηλότερες συνθήκες µεταφοράς µάζας προς αυτές, οι οποίες, µε τη σειρά τους, οφείλονται στην µικρή τους διάσταση παράλληλα στη ροή του διαλύµατος. Πιο αναλυτικά, παραθέτουµε παρακάτω τη σύγκριση διαφορετικών ηλεκτροδίων και κυψελών κατά ζεύγη. 78

84 Σύγκριση υαλώδους άνθρακα της κυψέλης α και της κυψέλης β Στον Πίνακα Α.Ι.13 καταγράφονται τα αποτελέσµατα που προέκυψαν για τα δύο µακρο- ηλεκτρόδια υαλώδους άνθρακα των κυψελών α και β, όσο αφορά το δυναµικό εµφάνισης του ορικού ρεύµατος, E p, και τα φορτία τους (Q 1, Q 2 τα φορτία των κυψελών α και β, αντίστοιχα) και το λόγο των φορτίων Q 1 /Q 2. Πίνακας Α.Ι.13 : Τιµές E p / V vs Ag/AgCl, και φορτίων οξείδωσης των αµινοξέων Q 1, Q 2 /nc στις κυψέλες α και β, αντίστοιχα, όπως προκύπτουν από πειραµατικές µετρήσεις, καθώς και ο λόγος των φορτίων τους Q 1 /Q 2. Ουσία Ε p / V Κυψέλη α Q 1 / nc Ε p / V Κυψέλη β Q 2 / nc Q 1 / Q 2 cys hcy dopa me-dopa htp tyr trp Στον παραπάνω πίνακα έχει υπολογιστεί ο λόγος Q 1 / Q 2 από πειραµατικές τιµές. Στη συνέχεια θα γίνει µία σύγκριση αυτού µε τον λόγο όπως προκύπτει θεωρητικά. Από τη σχέση : Q = I V ss U s, προκύπτει ότι : ( Q 1 / Q 2 ) th = ( Ι ss1 / I ss2 ) th (19) Όµως, όπως αναφέρθηκε στο θεωρητικό µέρος, το ρεύµα σταθερής κατάστασης για µακρο-δίσκο παρέχεται από την Εξ. (6) του Κεφ Α.Ι.2.2. δηλ. την εξίσωση : 79

85 I = ss 1.47 nfca ( 1 L el ) 1 / 3 ( D d ch ) 2 / 3 ( U w ch ) 1 / 3, συνεπώς αντικαθιστώντας την συγκεκριµένη εξίσωση στην Εξ.(19) προκύπτει ότι : ( Ι ss1 / I ss2 ) th = ( d ch2 / d ch1 ) 2/3 (2) Στην περίπτωση µας όµως η κυψέλη β έχει δύο διαχωριστικά (spacers) συνεπώς θα ισχύει ότι d ch2 = 2 d ch1, οπότε η Εξ. (19) σε συνδυασµό µε την Εξ.(2) γίνεται: ( Q 1 / Q 2 ) th = ( Ιss 1 / Iss 2 ) th = 2 2/3 =1.587 Παρατηρώντας τον Πίνακα Α.Ι.13 συµπεραίνουµε ότι για ορισµένες ουσίες υπάρχει σύγκλιση ανάµεσα στο (Q 1 / Q 2 ) exp και στο (Q 1 / Q 2 ) th. Ουσιαστικά απόκλιση ανάµεσα στο θεωρητικό και πειραµατικά προσδιοριζόµενο λόγο των φορτίων υπάρχει για τα αµινοξέα dopa, hcy και tyr. Σύγκριση µακρο-ηλεκτροδίου της κυψέλης β και του µικρο-δίσκου σε στατικό διάλυµα Από τη γενική σχέση ρεύµατος µεταφορά µάζας Ι ss =nfk m CA, αν εφαρµοστεί για το µακροηλεκτρόδιο (Μ) της κυψέλης και για το µικροηλεκτρόδιο (m) σε στατικό διάλυµα και διαιρεθούν οι αντίστοιχες εξισώσεις κατά µέλη, προκύπτει ότι Κ=(Iss) m* A M /Iss 1* A m = (k m ) m /(k m ) M. Από τις πειραµατικές τιµές υπολογίζεται το Κ πειρ το οποίο καταγράφεται στον πίνακα Α.Ι.14. Στον ίδιο πίνακα επίσης καταγράφονται οι τιµές E p για τα δύο ηλεκτρόδια, του φορτίου και της πυκνότητας ρεύµατος για το µακροηλεκτρόδιο πολλαπλασιασµένα µε τον συντελεστή 2 2/3 λόγω των δύο 8

86 διαχωριστικών που υπάρχουν στην κυψέλη. και τέλος η πυκνότητα ρεύµατος για το µικροδίσκο. Πίνακας Α.Ι.14 : Τιµές E p /V vs Ag/AgCl, πυκνοτήτων ρεύµατος (na/cm 2 ), λόγων πυκνότητας ρεύµατος για τα αµινοξέα, όπως προκύπτουν από πειραµατικές µετρήσεις µε µακροηλεκτρόδιο στη κυψέλη β και µικροδίσκο σε στατικό διάλυµα, καθώς και το φορτίο οξείδωσης (Q 2 /nc ) των αµινοξέων για το µακροηλεκτρόδιο. Ουσία cys hcy E p / V β κυψέλη Q 2*2 2/ Iss 1* 2 2/3 / A M (na/cm 2 ) E p / V µικροδίσκος (Iss) m / A m (na/cm 2 ) Κ πειρ = (Iss) m* A M / Iss 1* A m 1 6.4* * dopa * me-dopa * htp * * tyr *14.41 trp * Στη συνέχεια, θα υπολογιστεί η θεωρητική τιµή του Κ, Κ θεωρ, προκειµένου να συγκριθεί µε το Κ πειρ. Όπως αναφέρθηκε στο θεωρητικό µέρος, το k m υπολογίζεται από τον τύπο k m = D/δ. Συνεπώς Κ θεωρ = (k m ) m /(k m ) M = δ Μ / δ m. Για το µικρο-ηλεκτρόδιο, το πάχος της στιβάδας διάχυσης, όπως αναφέρεται στο θεωρητικό τµήµα, είναι δ m =πr /4, συνεπώς για r = 1,25 µm προκύπτει ότι δ m =11,8 µm. Για το µακροηλεκτρόδιο και για συντελεστή διάχυσης 7x1-6 cm 2 /s, η στιβάδα διάχυσης, όπως αποδεικνύεται και στο θεωρητικό τµήµα είναι δ Μ = 12 µm. Τελικά προκύπτει ότι Κ θεωρ = 12/11,8 = 1,2. Παρατηρείται ότι αν και υπάρχει ποιοτική συµφωνία στη θέση του Ε 1/2 και κυρίως στην µορφή των καµπυλών ρεύµατος - δυναµικού (στις περιπτώσεις λήψης ορικού ρεύµατος σε όχι ακραία θετικά δυναµικά, 81

87 µικρότερα από +1,V, για το µικροηλεκτρόδιο, δηλ. για dopa, me-dopa, trp, tyr, hcy στο πρώτο κύµα οξείδωσης, 5htp στο πρώτο κύµα), η Κ πειρ διαφέρει περίπου µία τάξη µεγέθους από την Κ θεωρ. Αυτό µπορεί να οφείλεται : Α) στο διαφορετικό υλικό του µακρο-ηλεκτροδίου (υαλώδης άνθρακας) και του µικροηλεκτροδίου (γραφίτης) που µπορεί να επηρεάζει στάδια προσρόφησης ή ενδιάµεσης χηµείας (πχ µηχανισµού ECΕ) κατά τη διεξαγωγή των πολυηλεκτρονιακών πολυσταδιακών ηλεκτροχηµικών δράσεων των αµινοξέων. Επίσης, είναι γνωστό ότι ο υαλώδης άνθρακας έχει µικρό πορώδες ενώ ο γραφίτης µπορεί και έχει έως και 2% πορώδες άρα και µικρότερη ειδική επιφάνεια. Β) Τα κύµατα I vs E στα µικροηλεκτρόδια είναι περισσότερο παραµορφωµένα λόγω της ύπαρξης υψηλότερου ρεύµατος υποβάθρου του γραφίτη (βλ. βολταµµογραφήµατα µακρο-ηλεκτροδίου και µικροηλεκτροδίων σε προηγούµενη ενότητα). Η αφαίρεση του ρεύµατος αυτού για να προκύψει το (Iss) m, γίνεται αναγκαστικά από διαφορετικά πειράµατα και άρα είναι περιορισµένης αξιοπιστίας (ενώ στην HPLC το ρεύµα κορυφής προσδιορίζεται επί του σχεδόν ταυτόχρονα µετρούµενου υποβάθρου). Γ) Το µικρό µέγεθος του µικρο-ηλεκτροδίου, 3µm, κάνει τα φαινόµενα επιµόλυνσης πιο καθοριστικά, ιδιαίτερα µάλιστα µιας και το δυναµικό κατά τα βολταµµογραφήµατα σαρώνεται από χαµηλά δυναµικά όπου οι όποιες προσµίξεις δεν οξειδώνονται. Αντίθετα, στα πειράµατα HPLC τα ορικά ρεύµατα καταγράφονται µετά από παρατεταµένη παραµονή στο δυναµικό µέτρησης. Σύγκριση µακρο-ηλεκτροδίου και µικρο-ινών της κυψέλης β Στις Εξ. (16), (17) και (18), αν αντί για (d ch ) M (1 spacer) βάλουµε 2(d ch ) M (αφού στην κυψέλη αυτή έχουµε 2 spacers) προκύπτει πως: 82

88 k 2mf (2spacer) / k M (2spacer) = k 2mf (2spacer) / k M (1spacer) *2 2/3 =2.65*2 2/3 =4,2. Άρα το Κ θεωρ =(k m ) 2mf /(k m ) M = 4,2 Στη συνέχεια, από τις πειραµατικές µετρήσεις θα υπολογιστεί το Κ πειρ, το οποίο δίνεται από την σχέση Κ πειρ = (Iss) 2mf* A M / Iss M* A 2mf. Στον Πίνακα Α.Ι.15 καταγράφονται οι τιµές Κ πειρ, οι πυκνότητες ρεύµατος του µακροηλεκτροδίου (Μ) και των δύο ινών άνθρακα (2mf) καθώς και το φορτίο οξείδωσης των αµινοξέων στο µακροηλεκτρόδιο. Πίνακας Α.Ι.15 : Τιµές E p /V vs Ag/AgCl, πυκνοτήτων ρεύµατος (na/cm 2 ), λόγων πυκνότητας ρεύµατος για τα αµινοξέα, όπως προκύπτουν από πειραµατικές µετρήσεις µε µακροηλεκτρόδιο και µε τις 2 ίνες άνθρακα της κυψέλης β, καθώς και το φορτίο οξείδωσης (Q Μ /nc ) των αµινοξέων για το µακροηλεκτρόδιο. Ουσία (E p ) M / V QΜ / nc Iss Μ /A M (na / cm 2 ) (E p ) 2mf /V (Iss) 2mf /A 2mf na / cm 2 Κ πειρ = (Iss) 2mf * A M / Iss M* A 2mf cys hcy > dopa me-dopa htp tyr trp >

89 Αν και υπάρχει µεγάλη οµοιότητα στη θέση και στη µορφή των καµπυλών του I ως προς το E µεταξύ του µακροηλεκτροδίου και των δύο ινών άνθρακα, οι τιµές των Κ πειρ διαφέρουν από µισή (me-dopa, dopa) έως περίπου µία τάξη µεγέθους από τα αντίστοιχα Κ θεωρ. Οι αιτίες είναι : Α) και πάλι το διαφορετικό ηλεκτροδιακό υλικό που έχει σαν αποτέλεσµα αφενός µεν τη διαφορετική καταλυτική ικανότητα, αφετέρου δε τη διαφορετική διαθέσιµη γεωµετρική επιφάνεια (βλ. τη σχετική συζήτηση της περίπτωσης Α για τον Πίνακα A.I.14 ). Β) Παρά το ότι και τα δύο ηλεκτρόδια χρησιµοποιούνται στην HPLC κυψέλη, οπότε το υπόβαθρο αφαιρείται από το ίδιο πείραµα κατά τον υπολογισµό του I peak ή Q κάθε κορυφής, το ρεύµα της βασικής γραµµής σε υψηλά δυναµικά οφείλεται στην παρασιτική έκλυση O 2 η οποία µειώνει τις διαθέσιµες θέσεις για οξείδωση του αµινοξέος. Μιας και το ρεύµα αυτό είναι υψηλότερο στον γραφίτη των 2mf ( βλ. βολταµµετρία 2mf και του µακρο-ηλεκτροδίου υαλώδους άνθρακα) τα ορικά ρεύµατα στα 2mf µειώνονται σε σχέση µε τα αντίστοιχα του µακρο-ηλεκτροδίου). Γ) Στο σηµαντικά µεγαλύτερο k 2mf (k 2mf =4k Μ ) που έχει σαν αποτέλεσµα την απώλεια µεταφορά στο bulk ενδιάµεσων προϊόντων των πολυσταδιακών δράσεων ( 5htp, cys, hcy, trp) πριν ολοκληρωθεί η οξείδωσή τους στο τελικό προϊόν. Σύγκριση µικρο-δίσκoυ στην κυκλική βολταµµετρία µε τις δύο ίνες άνθρακα της κυψέλης β Από τη σύγκριση των δύο µικρο-ινών (2mf) και του µακροηλεκτροδίου (Μ) υαλώδους άνθρακα, βρέθηκε ότι k 2mf (2spacer) / k M (1spacer) = 2.65, ενώ από τη σύγκριση των µικρο-δίσκων στην κυκλική βολταµµετρία και του µακρο-ηλεκτροδίου υαλώδους άνθρακα προκύπτει ότι (k m ) m /(k m ) M = 1,2. ιαιρώντας αυτούς τους δύο λόγους κατά µέλη προκύπτει ότι Κ θεωρ = (k m ) M / k 2mf =.385. Η πειραµατική τιµή του Κ, Κ πειρ, όπως προκύπτει 84

90 από τις πειραµατικές µετρήσεις, δίνεται στον Πίνακα Α.Ι.16, όπου καταγράφονται και τα E p για τους µικροδίσκους και τις δύο µικρο-ίνες άνθρακα ( (E p ) m και (E p ) 2mf, αντίστοιχα) καθώς και οι αντίστοιχες πυκνότητες ρεύµατος : Πίνακας Α.Ι.16 : Τιµές E p /V vs Ag/AgCl, πυκνοτήτων ρεύµατος (na/cm 2 ), λόγων πυκνότητας ρεύµατος για τα αµινοξέα, όπως προκύπτουν από πειραµατικές µετρήσεις µε τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας µε µικρο-δίσκο (m) και µε τις 2 ίνες άνθρακα της κυψέλης β. Ουσία (E p ) 2mf / V (I ss ) 2mf /A 2mf (E p ) m /V (I ss ) m / A m 5htp Κ πειρ = (I ss ) m * A 2mf / (I ss ) 2mf * A m 1.84* * dopa * me-dopa * tyr * cys hcy > * *1 5.1 trp > * Παρατηρούµε ότι σε όλες τις περιπτώσεις (µε εξαίρεση το πρώτο κύµα οξείδωσης της hcy) το Κ πειρ και το Κ θεωρ είναι της ίδιας τάξης µεγέθους και µάλιστα για δράσεις σε χαµηλά δυναµικά (dopa, me-dopa, tyr) βρίσκονται πολύ κοντά. Το γεγονός αυτό, και σε συνδυασµό µε τους παραπάνω πίνακες καταδεικνύει το σηµαντικότατο ρόλο της ακριβούς φύσης του άνθρακα ως ηλεκτρόδιο (υαλώδης άνθρακας ή γραφίτης). Οι διαφορές που παρατηρούνται για τις υπόλοιπες ενώσεις µπορεί να οφείλονται : 85

91 Α) Στην περιορισµένης αξιοπιστίας αφαίρεση του υποβάθρου ανεξάρτητου πειράµατος για τα µικροηλεκτρόδια. Β) Μιας και k 2mf = 2,5k m, για τους ίδιους λόγους µε το Γ) της συζήτησης του Πίνακα Α.Ι.15 της παραπάνω παραγράφου. Συµπερασµατικά, από όλες τι παραπάνω συγκρίσεις προκύπτει ότι η χρήση µικρο-δίσκων σε πειράµατα προκαταρκτικής βολταµµετρίας σε στατικό διάλυµα των προς ανάλυση αµινοξέων, παρέχει καµπύλες I vs E που είναι παρόµοιες ποιοτικά (παρόµοια Ε 1/2 και Ε p ) µε τα υδροδυναµικά διαγράµµατα που λαµβάνονται κατά την ανίχνευση τους σε κυψέλη ροής HPLC (µε µακρο- και µικρο- ηλεκτρόδιο), αλλά πρόβλεψη για το µέγεθος των ρευµάτων µπορεί να γίνει µόνο µε ταυτόσηµο ηλεκτροδιακό υλικό και για ουσίες που οξειδώνονται όχι σε ακραία δυναµικά οξείδωσης. Α.Ι.4.3. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΣΕ ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΜΕ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΗ MeCN ΩΣ ΟΡΓΑΝΙΚΟ Σε αυτό το τµήµα της µελέτης µας, στόχος είναι να επαναληφθεί η σύγκριση ανάµεσα στους ανιχνευτές µακρο-ηλεκτροδίου και µικρο-ινών σε πειράµατα HPLC ως προς την επαναληψιµότητα της απόκρισης, την ευαισθησία και το όριο ανίχνευσης, χρησιµοποιώντας αυτή τη φορά σαν κινητή φάση υδατικά διαλύµατα ακετονιτριλίου (MeCN). Πιο συγκεκριµένα, θα µελετηθεί και πάλι η ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των αµινοξέων που χρησιµοποιήθηκαν στις προηγούµενες ενότητες, αλλά αντί για iproh, ως οργανικό τροποποιητή, θα χρησιµοποιηθεί το MeCN, διατηρώντας το ίδιο 86

92 ph (2,5), και την ίδια ιονική ισχύ του φέροντα ηλεκτρολύτη (,2 Μ) σε φωσφορικά (K 2 HPO 4 H 3 PO 4 ). Η µελέτη ξεκίνησε καταγράφοντας τα υδροδυναµικά διαγράµµατα των αµινοξέων µε τη βοήθεια της κυψέλης β, που αναφέρθηκε πιο πάνω και η οποία είχε διπλό ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, ένα µεγάλο ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (Μ) διαµέτρου 3mm και δύο ίνες άνθρακα οι οποίες είναι τοποθετηµένες κάθετα στη ροή του διαλύµατος και έχουν διάµετρο 3µm. Η συγκέντρωση των αµινοξέων ήταν 1µg/mL. Η κινητή φάση ήταν µεταβλητής συγκέντρωσης ως προς το MeCN (-15%), αφού για τη µελέτη εφαρµόστηκε η µέθοδος της βαθµωτής έκλουσης. Στα Σχήµατα Α.Ι.21 Α.Ι.24, δίνονται τα υδροδυναµικά διαγράµµατα όλων των ουσιών (ρεύµατος ανά µονάδα επιφάνειας ως προς το δυναµικό, Ι/Α V, και φορτίου ανά µονάδα επιφάνειας ως προς το δυναµικό, Q/Α- V). Τα υδροδυναµικά διαγράµµατα ελήφθησαν ταυτόχρονα για ένα µίγµα των ουσιών µε τη µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης. Αρχικά πρέπει να αναφερθεί, όπως και στην περίπτωση της iproh, ότι η µορφή των υδροδυναµικών διαγραµµάτων είναι σιγµοειδής, όπως αναµενόταν λόγω του ότι πρόκειται για πειράµατα σταθερής κατάστασης, όσον αφορά τις συνθήκες µεταφοράς µάζας. Κάνοντας σύγκριση µε το προηγούµενο κεφάλαιο της iproh, θα µπορούσε να υποστηριχθεί ότι η συµπεριφορά των αµινοξέων όταν χρησιµοποιείται ως κινητή φάση υδατικό διάλυµα MeCN, είναι ανάλογη µε αυτή όταν χρησιµοποιείται υδατικό διάλυµα iproh. Τα στάδια οξείδωσης δηλαδή της κάθε ουσίας είναι ίδια και στις δύο κινητές φάσεις καθώς και το δυναµικό στο οποίο εµφανίζεται το ορικό ρεύµα. Τέλος, παρατηρώντας τα υδροδυναµικά διαγράµµατα των Σχηµάτων Α.Ι.21-Α.Ι.24, µπορεί να υποστηριχθεί πως το δυναµικό 1,1V είναι µία τιµή δυναµικού κατάλληλη, και σε αυτή την περίπτωση, για όλες τις ουσίες, και µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την περαιτέρω ηλεκτροχηµική ανίχνευσή τους. 87

93 Q/A(nC/cm 2 ) me-cys M 2mf 1,1 1,3 1,5 E/V Q/A(nC/cm 2 ) met M 2mf 1,1 1,3 1,5 E/V 7 me-tyr 12 n-tyr 6 M 2mf 1 M 2mf Q/A(nC/cm 2 ) Q/A(nC/cm 2 ) ,7,9 1,1 1,3 1,5 E/V 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 E/V 8 dopa 8 tyr 7 6 M 2mf 7 6 M 2mf Q/A(nC/cm 2 ) Q/A(nC/cm 2 ) ,4,9 1,4 E/V 1,5 1 1,5 E/V Σχήµα Α.Ι.21 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα φορτίου ανά µονάδα επιφάνειας (Q/Α nc/cm 2 ) ως προς το δυναµικό (Ε/V) για τις ουσίες : me-cys, met, me-tyr, n-tyr, dopa και tyr. 88

94 3 m-tyr 16 5htp Q/A(nC/cm 2 ) M 2mf Q/A(nC/cm 2 ) M 2mf,6,9 1,2 1,5 E/V,4,7 1 1,3 E/V 18 trp 25 hcy Q/A(nC/cm 2 ) M 2mf Q/A(nC/cm 2 ) M 2mf 4 5 2,5,8 1,1 1,4 E/V,4,7 1 1,3 E/V Q/A(nC/cm 2 ) cys M 2mf,4,7 1 1,3 E/V Q/A(nC/cm 2 ) me-dopa,5,8 1,1 1,4 E/V M 2mf Σχήµα Α.Ι.22 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα φορτίου ανά µονάδα επιφάνειας (Q/Α nc/cm 2 ) ως προς το δυναµικό (Ε/V) για τις ουσίες : m-tyr, 5htp, trp, hcy, cys και me-dopa. 89

95 12 me-cys 12 met 1 M 2mf 1 M 2mf I/A(nA/cm 2 ) I/A(nA/cm 2 ) ,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 E/V 1,1 1,3 1,5 E/V I/A(nA/cm 2 ) me-tyr,7,9 1,1 1,3 1,5 E/V M 2mf I/A(nA/cm 2 ) n-tyr I/A M 2mf 1 1,2 1,4 E/V I/A(nA/cm 2 ) dopa,4,7 1 1,3 E/V M 2mf I/A(nA/cm 2 ) M 2mf tyr,5,8 1,1 1,4 E/V Σχήµα Α.Ι.23 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα ρεύµατος ανά µονάδα επιφάνειας (Ι/Α nα/cm 2 ) ως προς το δυναµικό (Ε/V) για τις ουσίες : me-cys, met, me-tyr, n-tyr, dopa και tyr 9

96 I/A(nA/cm 2 ) M 2mf m-tyr,7 1 1,3 E/V I/A(nA/cm 2 ) M 2mf 5htp,4,7 1 1,3 E/V 25 trp 4 hcy I/A(nA/cm 2 ) M 2mf I/A(nA/cm 2 ) M 2mf,5,8 1,1 1,4 1,7 E/V,4,7 1 1,3 E/V 6 5 cys me-dopa M 2mf I/A(nA/cm 2 ) M 2mf I/A(nA/cm 2 ) ,4,7 1 1,3 E/V,5,8 1,1 1,4 E/V Σχήµα Α.Ι.24 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα ρεύµατος ανά µονάδα επιφάνειας (Ι/Α nα/cm 2 ) ως προς το δυναµικό (Ε/V) για τις ουσίες : m-tyr, 5htp, trp, hcy, cys και me-dopa. 91

97 Όπως αναφέρθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο παρουσία της iproh στην κινητή φάση, ο συντελεστής µεταφοράς µάζας, (k m ) 2mf, των µικροινών (2mf), είναι µεγαλύτερος από τον αντίστοιχο στο µακρο-ηλεκτρόδιο, (k m ) M, κάτι που σηµαίνει ότι και η πυκνότητα ρεύµατος στο µικροηλεκτρόδιο θα έπρεπε να είναι µεγαλύτερη από την αντίστοιχη στο µακροηλεκτρόδιο. Το πηλίκο Q/A, δηλαδή του φορτίου προς την επιφάνεια του ηλεκτροδίου, παρέχει ουσιαστικά τον ρυθµό οξείδωσης της ουσίας ανά µονάδα επιφάνειας του ηλεκτροδίου. Με βάση αυτήν την ποσότητα µπορεί να γίνεται η σύγκριση του µακρο-ηλεκτροδίου και των µικρο-ινών. Παρατηρώντας τα αντίστοιχα υδροδυναµικά διαγράµµατα στα Σχήµατα Α.Ι.21 και Α.Ι.22 βλέπουµε πως ο ρυθµός οξείδωσης είναι µεγαλύτερος στο µεγάλο ηλεκτρόδιο παρά στο µικρο-ηλεκτρόδιο. ηλαδή το σήµα είναι πιο ενισχυµένο στο µακρο- ηλεκτρόδιο παρά στο µικρο-ηλεκτρόδιο. Το γεγονός αυτό έρχεται σε αντίθεση µε τις αυξηµένες συνθήκες µεταφοράς µάζας προς τις µικρο-ίνες, και οφείλεται στους λόγους που αναφέρθηκαν στο προηγούµενο κεφάλαιο (και κυρίως στο διαφορετικό υλικό των δύο ηλεκτροδίων). Στη συνέχεια, για να γίνει σύγκριση των δύο αυτών ηλεκτρόδιων θα πρέπει να ελεγχθεί η ευαισθησία τους, s, το όριο ανίχνευσής τους και το πηλίκο S/N, δηλαδή του σήµατος προς το θόρυβο. Η ευαισθησία, s, σε ένα ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή ορίζεται ως το πηλίκο του φορτίου Q ανά µονάδα συγκέντρωσης, C, και ανά µονάδα επιφάνειας, Α, δηλαδή s=q/ac ή του ρεύµατος Ι peak ανά µονάδα συγκέντρωσης, C, και ανά µονάδα επιφάνειας, Α, δηλαδή s= Ι peak /AC. Όσο µεγαλύτερη είναι η ευαισθησία τόσο καλύτερος θεωρείται ο ανιχνευτής. Για να µελετήθούν τα παραπάνω παρασκευάστηκαν διαλύµατα των αµινοξέων µικρότερης συγκέντρωσης, µέχρι και 1 µg/ml (πέραν της τυπικής συγκέντρωσης των 1µg/mL που χρησιµοποιήθηκε σε όλες τις µελέτες της διδακτορικής διατριβής ), και καταγράφηκαν τα σήµατά τους, ύψος κορυφής ρεύµατος (Ι/nA) και φορτίο οξείδωσης (Q/nC), σε δυναµικό 1.1V, που όπως αναφέρθηκε είναι το βέλτιστο δυναµικό για την 92

98 ηλεκτροχηµική µελέτη όλων των αµινοξέων. Στον Πίνακα Α.Ι.17 καταγράφονται τα αποτελέσµατα για συγκεντρώσεις των αµινοξέων 1 µg/ml, 5µg/mL και 1µg/mL. Κατασκευάζοντας τις γραφικές παραστάσεις του ρεύµατος και του φορτίου ανά µονάδα επιφάνειας του ηλεκτροδίου ως προς τη συγκέντρωση της ουσίας, και για το µακρο-ηλεκτρόδιο και για τις δύο µικρο-ίνες παρατηρήθηκε ότι η εξάρτησή τους ήταν γραµµική. Από την κλίση της ευθείας των ελαχίστων τετραγώνων που διέρχεται από τα σηµεία (Ι,C) ή (Q,C) υπολογίστηκε απευθείας η πειραµατική τιµή της ευαισθησίας ως προς το ρεύµα και ως προς το φορτίο, αντίστοιχα, του ανιχνευτή και τα συγκεκριµένα αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα Α.Ι.18. Από τους Πίνακες Α.Ι.18 (Α) και (Β) προκύπτει το συµπέρασµα ότι η ευαισθησία στο µακρο-ηλεκτρόδιο (Μ), για τις δεδοµένες συνθήκες προφανώς, είναι καλύτερη αυτής στις µικρο-ίνες (2mf). 93

99 94 Πίνακας Α.Ι.17 : τιµές φορτίων και ρευµάτων ανά µονάδα επιφάνειας για το µακρο-ηλεκτρόδιο (g.c.) και για τις µικρο-ίνες (2mf) για υδατικά διαλύµατα αµινοξέων σε συγκεντρώσεις των 1, 5 και 1µg/mL. Q/A Μ C (µg/ml) met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr 5htp n-tyr trp Q/A 2mf C (µg/ml) met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr 5htp n-tyr trp I/A Μ C (µg/ml) met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr 5htp n-tyr trp I/A 2mf C (µg/ml) met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr 5htp n-tyr trp

100 Πίνακας Α.Ι.18 : Τιµές ευαισθησίας (s) ως προς το ρεύµα (Α) και ως προς το φορτίο (Β) καθώς οι αντίστοιχοι συντελεστές συσχέτισης (R 2 ) των µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων για το µακρο-ηλεκτρόδιο (M) και για τις 2 µικροίνες (2mf) (A) s Ουσία (na cm -2 µg -1 ml) R 2 g.c. 2mf g.c. 2mf met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr htp n-tyr trp (B) s Ουσία (nc cm -2 µg -1 ml) R 2 g.c. 2mf g.c. 2mf met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr htp n-tyr trp Ένας εµπειρικός τρόπος καθορισµού του ορίου ανίχνευσης χρησιµοποιεί την ποσότητα του συστατικού η οποία δίνει σήµα τριπλάσιο από το µέγιστο θόρυβο του σήµατος. 95

101 Τα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.Ι.25 πάρθηκαν ταυτόχρονα για τα δύο ηλεκτρόδια, αφού βρίσκονται στην ίδια κυψέλη, µε αποτέλεσµα ορισµένες από τις αιτίες που προκαλούν τον θόρυβο (ηλεκτρονικός θόρυβος, υδροδυναµικές µεταβολές, κ.α.) να είναι ίδιες και για τα δύο ηλεκτρόδια, γι αυτό και τα σηµεία καταγραφής του µέγιστου θορύβου βρίσκονται στην ίδια θέση και στα δύο χρωµατογραφήµατα. Από αυτά τα χρωµατογραφήµατα επιλέχθηκε για το κάθε ένα ο µέγιστος θόρυβος από όπου υπολογίστηκε το ρεύµα οξείδωσης και το αντίστοιχο φορτίο. Τα διαλύµατα των ουσιών είναι υδατικά συγκέντρωσης 1 µg/ml. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν καταγράφονται παρακάτω µακρο-ηλεκτρόδιο µικρο-ίνες 25 2 Ι/nΑ I/nA t, min Σχήµα Α.Ι.25 : Χρωµατογράφηµα των 9 ελεύθερων αµινοξέων µε σειρά έκλουσης :met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp, χρησιµοποιώντας ως ηλεκτροχηµικούς ανιχνευτές µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (µπλε γραµµή) και τις 2 µικρο-ίνες άνθρακα (ροζ γραµµή). H συγκέντρωση των αµινοξέων ήταν 1µg/mL. 96

102 Για το µακρο-ηλεκτρόδιο έχουµε : Επιφάνεια ηλεκτροδίου Α =,765 cm 2. Ρεύµα οξείδωσης για το θόρυβο : Inoise=122 na Έτσι προκύπτει : Inoise*3= na και Inoise*3/A= na / cm 2 Αντίστοιχα, για τις 2 µικρο- ίνες άνθρακα έχουµε : Επιφάνεια ηλεκτροδίου Α =.942 cm 2 Ρεύµα οξείδωσης για το θόρυβο : Inoise=2.93 na Έτσι προκύπτει ότι : Inoise*3=8.79 na και Inoise*3/A= nA / cm 2 Από τα παραπάνω δεδοµένα και µε τη βοήθεια των εξισώσεων που προέκυψαν από τις γραφικές παραστάσεις των ουσιών I/A C, µπορούµε να υπολογίσουµε τις συγκεντρώσεις των ουσιών που µπορούν να δώσουν σήµα τριπλάσιο από αυτό του θορύβου. Τα αποτελέσµατα που προκύπτουν για το µακρο- ηλεκτρόδιο (Μ) και τις µικρο- ίνες (2mf) καταγράφονται στον Πίνακα Α.Ι.19. Πίνακας Α.Ι.19 : Τιµές συγκεντρώσεων των αµινοξέων που παρέχουν ηλεκτροχηµικό σήµα τριπλάσιο από το σήµα του θορύβου, όπως προέκυψε από το χρωµατογράφηµα του Σχήµατος Α.Ι.25. ουσία M (µg/ml) 2mf (µg/ml) met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr htp n-tyr trp

103 Παρατηρώντας τον Πίνακα Α.Ι.19, µπορεί να υποστηριχθεί ότι, σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις, οι µικρο-ίνες έχουν µικρότερο όριο ανίχνευσης από το µακρο-ηλεκτρόδιο, κάτι που σηµαίνει ότι οι µικρο-ίνες υπερτερούν σε ότι αφορά το όριο ανίχνευσης από τα µακρο-ηλεκτρόδια. Στη συνέχεια, θα γίνει µία προσπάθεια να γίνει σύγκριση του σήµατος προς τον θόρυβο, S/N, για το µακρο-ηλεκτρόδιο και τις µικροίνες. Η βασική γραµµή που εµφανίζεται στα πειράµατα της HPLC οφείλεται κυρίως στην οξείδωση της κινητής φάσης η οποία γίνεται φυσικά υπό συνθήκες σταθερής κατάστασης. Η οξείδωση αυτή ελέγχεται από τη µεταφορά φορτίου, δηλαδή επικρατεί κινητικός έλεγχος του ρεύµατος. Μεταβολές αυτού του ρεύµατος, που µπορούν να οφείλονται σε διάφορους παράγοντες (µεταπτώσεις του δυναµικού, µεταβολή της επιφάνειας του ηλεκτροδίου, επιµολύνσεις της κινητής φάσης, κτλ), οδηγούν είτε σε συνεχή µεταβολή (drift) της βασικής γραµµής είτε σε δηµιουργία κορυφών, φαινόµενα που χαρακτηρίζονται ως θόρυβος, N. Ο θόρυβος αυτός εξαρτάται από την επιφάνεια του ηλεκτροδίου και όχι από τις συνθήκες µεταφοράς µάζας. Σε αντίθεση, το σήµα S του αµπεροµετρικού ανιχνευτή δεν είναι ανάλογο µόνο της επιφάνειας του ηλεκτροδίου αλλά εξαρτάται επίσης από τις συνθήκες µεταφοράς µάζας της ουσίας που ανιχνεύεται, και συγκεκριµένα αυξάνει όσο αυξάνουν οι συνθήκες µεταφοράς µάζας. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα να αυξάνει και ο λόγος S/N όσο αυξάνει ο ρυθµός µεταφοράς µάζας, µε αποτέλεσµα να αναµένεται στις µικρο-ίνες ο λόγος αυτός να είναι µεγαλύτερος από ότι στο µακροηλεκτρόδιο. Στον Πίνακα Α.Ι.2 καταγράφονται οι τιµές S/N για τις µικροίνες και τα µακρο-ηλεκτρόδιο. Από τον Πίνακα Α.Ι.2 είναι φανερό ότι οι λόγοι S/N, όταν τα σήµατα αυτά αναφέρονται στο ύψος των κορυφών είναι πολύ µεγαλύτεροι όταν πρόκειται για το µικροηλεκτρόδιο. ηλαδή σε αυτήν την περίπτωση τα µικρο-ηλεκτρόδια πλεονεκτούν έναντι του µακρο-ηλεκτροδίου, όπως ακριβώς προβλέπει η θεωρία. Η υπεροχή του µικρο-ηλεκτροδιου έναντι του µακρο-ηλεκτροδίου όσον αφορά το θόρυβο φαίνεται χαρακτηριστικά στο χρωµατογράφηµα 98

104 του Σχήµατος Α.Ι.26, το οποίο πάρθηκε σε µία µέρα µε έντονο ηλεκτρονικό θόρυβο (εφαρµόζοντας τη µέθοδο της βαθµωτής µεταβολής). Παρατηρώντας το χρωµατογράφηµα µπορεί κανείς να βγάλει το συµπέρασµα ότι τον ίδιο θόρυβο το µικροηλεκτρόδιο (ίνες άνθρακα) τον «αντιλαµβάνεται» λιγότερο (ροζ γραµµή) από ότι το µακροηλεκτρόδιο (µπλε γραµµή). Συνοψίζοντας, τα αποτελέσµατα που προκύπτουν από αυτή τη µελέτη είναι ότι τα µακρο-ηλεκτρόδια υπερτερούν όσο αναφορά την ευαισθησία έναντι των µικρο-ινών, ενώ οι µικρο-ίνες έχουν µικρότερο όριο ανίχνευσης και υπερτερούν και στο λόγο S/N. Πίνακας Α.Ι.2 : Τιµές σήµατος οξείδωσης (I/nA) των αµινοξέων, συγκέντρωσης 1µg/mL, ως προς το θόρυβο του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή, για το µακρο-ηλεκτρόδιο (Μ) και τις δύο µικρο-ίνες (2mf). ουσία Μ 2mf I (nα) I/N I (nα) I/N met dopa tyr m-tyr me-dopa me-tyr htp n-tyr trp

105 i, na t, min Σχήµα Α.Ι.26 : Χρωµατογράφηµα των 11 ελεύθερων αµινοξέων µε σειρά έκλουσης : cys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp, χρησιµοποιώντας ως ηλεκτροχηµικού ανιχνευτές µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (µπλε γραµµή) και τις 2 µικρο-ίνες άνθρακα (ροζ γραµµή). Η συγκέντρωση των αµινοξέων ήταν 1µg/mL. 1

106 Α.I.5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στο κεφάλαιο αυτό µελετήθηκε εκτενώς η ηλεκτροχηµική συµπεριφορά µιας σειράς ελεύθερων αµινοξέων χρησιµοποιώντας τη µέθοδο της κυκλικής βολταµµετρίας µε µακρο- και µικρο-ηλεκτρόδια, καθώς και τη µέθοδο καταγραφής των υδροδυναµικών διαγραµµάτων των αµινοξέων σε διαφορετικές ηλεκτροχηµικές κυψέλες ροής της HPLC. Συγκεκριµένα, τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα πάρθηκαν σε καθαρά υδατικά ρυθµιστικά διαλύµατα φωσφορικών µε ph=2.5 και ιονική ισχύ.2μ ή στα ίδια ρυθµιστικα µε 2% iproh και µε ηλεκτρόδιο εργασίας µακρο-δίσκο υαλώδους άνθρακα, συµβατικού µεγέθους (διαµέτρου 3mm) ή µικρο-δίσκο γραφιτικού άνθρακα διαµέτρου 3µm. Όσον αφορά τα υδροδυναµικά διαγράµµατα, αυτά πάρθηκαν σε κινητές φάσεις σταθερής σύστασης ίδιας µε τα διαλύµατα που χρησιµοποιήθηκαν για τα κυκλικά βολταµµογραφήµατα, και µε δύο διαφορετικές ηλεκτροχηµικές κυψέλες ροής οι οποίες επιλέχθηκαν από µία µεγάλη ποικιλία κυψελών που δοκιµάστηκαν. Οι ηλεκτροχηµικές κυψέλες ροής που χρησιµοποιήθηκαν αποτελούνταν, η πρώτη από ένα ηλεκτρόδιο που ήταν µακρο-δίσκος υαλώδους άνθρακα (κυψέλη α) και η δεύτερη από δύο ηλεκτρόδια σε σειρά, ενός συµβατικού µακρο-δίσκου υαλώδους άνθρακα και ενός συστήµατος δύο µικρο-ινών άνθρακα (διαµέτρου 3µm και µήκους.5cm) (κυψέλη β). Τέλος, οι παραπάνω ηλεκτροχηµικές κυψέλες χρησιµοποιήθηκαν και σε κινητές φάσεις µεταβλητής σύστασης του MeCN στα παραπάνω ρυθµιστικά διαλύµατα. Από την παραπάνω ηλεκτροχηµική µελέτη, προέκυψαν τα ακόλουθα συµπεράσµατα : 1. Από τις 21 ενώσεις που µελετήθηκαν, εκ των οποίων τα 19 ήταν ελεύθερα αµινοξέα : his, cys, me-cys, hcy, cys-cys, crn, met, dopa, medopa, 5htp, trp, leu, Ile, tyr, n-tyr, me-tyr, m-tyr, phe, cysta, και οι άλλες δύο ήταν η cre και ένα διπεπτίδιο, η car, ηλεκτροχηµικά ενεργές ήταν οι ακόλουθες 11 : dopa, me-dopa, cys, hcy, trp, met, 5htp, tyr, m-tyr, metyr, n-tyr. 11

107 2. Η ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των ουσιών, όσον αφορά το µηχανισµό οξείδωσης, το ορικό ρεύµα ή ρεύµα κορυφής, το δυναµικό µισού κύµατος, δεν επηρεαζόταν, ουσιαστικά, από την παρουσία των οργανικών διαλυτών iproh (2%) ή MeCN (µέχρι και 15%), στα υδατικά ρυθµιστικά διαλύµατα που χρησιµοποιήθηκαν. 3. Tο βέλτιστο δυναµικό, δηλαδή το δυναµικό το οποίο θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί για την ανίχνευση ενός µίγµατος των παραπάνω ουσιών παρέχοντας ικανοποιητικό σήµα για όλες τις ουσίες σε ηλεκτροχηµικές κυψέλες ροής HPLC, βρέθηκε ότι είναι 1,1V ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl. 4. H µέθοδος της κυκλικής βολταµµετρίας µπορεί να δώσει τις ίδιες πληροφορίες για την ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των αµινοξέων µε αυτές που παρέχουν τα υδροδυναµικά διαγράµµατα που παίρνονται σε κυψέλες ροής της HPLC. Οι συνθήκες όµως που επικρατούν σε κυψέλες ροής της HPLC προσοµοιώνονται καλύτερα µε τις συνθήκες που επικρατούν µε τη χρήση µικρο-ηλεκτροδίων στη βολταµµετρία, όσον αφορά τις συνθήκες µεταφοράς µάζας. Έτσι, µπορούµε να υποκαταστήσουµε τη λήψη των υδροδυναµικών διαγραµµάτων σε κυψέλες HPLC µε κυκλικά βολταµµογραφήµατα που παίρνονται µε µικρο-ηλεκτρόδια. Συγκρίνοντας τις παραπάνω µεθόδους µεταξύ τους συµπεράναµε ότι η χρήση βολταµµετρίας µε µικρο-δίσκους παρέχει καµπύλες I ως προς E που είναι παρόµοιες ποιοτικά (παρόµοια Ε p/2 και Ε p ) µε τα υδροδυναµικά διαγράµµατα που λαµβάνονται κατά την ανίχνευση τους σε κυψέλη ροής HPLC, αλλά πρόβλεψη για το µέγεθος των ρευµάτων µπορεί να γίνει µόνο µε ταυτόσηµα ηλεκτροδιακό υλικό και για ουσίες µε όχι ακραία δυναµικά οξείδωσης. ηλαδή, η χρήση κυκλικής βολταµµετρίας µε µακροηλεκτρόδιο ενδείκνυται για µια ποιοτική µελέτη ηλεκτροχηµική αλλά όχι για ποσοτική µελέτη. 5. Τέλος, συγκρίνοντας τη χρήση µικρο-ηλεκτροδίων και µακροηλεκτροδίων σε κυψέλες ροής HPLC για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση των ελεύθερων αµινοξέων, προέκυψαν τα ακόλουθα συµπεράσµατα: α. η 12

108 ευαισθησία στο µακρο-ηλεκτρόδιο (M), για τις ίδιες πειραµατικές συνθήκες, είναι καλύτερη αυτής στις µικρο-ίνες (2mf), β. Τα µικρο-ηλεκτρόδια έχουν µικρότερο όριο ανίχνευσης από ότι το µακρο-ηλεκτρόδιο, και γ. Τα µικρο-ηλεκτρόδια υπερτερούν και στο λόγο σήµατος / θόρυβο (S/N). 13

109 Α.I.6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] S. G. Weber, W. Purdy, Anal. Chim. Acta 1 (1978) 531 [2] S. G. Weber, J. Electroanal. Chem. 145 (1983) 1 [3] J. Lankelma, H. Poppe, J. Chromatogr. 125 (1976) 375 [4] P. Meschi, D. C. Johnson, Anal.Chim. Acta 124 (1981) 35 [5] D.Mimica, F. Bedioui, J. H. Jagal, Electrochim. Acta 48 (22) [6] M. Zhang, C. M. Pfeiffer, Clin. Chim. Acta 34 (24)195-2 [7] G-P. Jin, X.Q. Lin, Electroche. Communications 6 (24) [8] K. Gong, Y. Dong, S. Xiong, Y. Chen, L. Mao, Biosensors anid Bioelelectronics 2 (24) [9] H. Liu, T. Huang, C. B. Kissinger, P. T. Kissinger, J. Chromatogr. B, 713 (1998) [1] Y. V. Tcherkas, L. A. Kartsova, I.N. Krasnova. J. Chromatogr. A, 913 (21) [11] D. Johnson, W. LaCourse, Anal. Chem, 62 (199) 589 [12] R. Accinni, S. Bartesaghi, G. De Leo, C. Cursano, G. Achilli, A. Loaldi, C. Cellerino, O. Parodi, J. Chromatogr. A 896 (2) 183 [13] M. D. Oates, B.R. Cooper, J. W. Weingarz, M. Podolak, Anal. Chem, 62 (199) 1573 [14] L. Dou, J. Mazzeo, I.S. Krull, Biochromatogr. 5 (199) 74 [15] P. Luo, F. Zhang, R. P. Baldwin, Anal. Chim. Acta 244 (1991) 169 [16] P. Luo, R. P. Baldwin, Electroanalysis 4 (1992) 393 [17] N. C. Reynolds, B.M. Kissela, L.H. Fleming, Electroanalysis 7 (1995) 1177 [18] C. D. Paras, R. T. Kennedy, Electroanalysis 9 (1997) 23 [19] P. Luo, F. Zhang, R. P. Baldwin, Anal. Chim. Acta 63 (1991) 172 [2] L.A. Colon, R. daddo, R.N. Zare, Anal.Chem. 65 (1993) 476 [21] J. Ye, R. P. Baldwin, Anal.Chem. 66 (1994) 2669 [22] T. Kappes, P. C. Hauser, Anal. Chim. Acta 354 (1997) 129 [23] D. A. Martens, W. T. Frankenberger, j. Liq. Chrom. 15 (1992)

110 [24] A. P. Clarke, P. Jandik, R.D. Rcoklin, Y. Liu, N. Avdalovic, Anal. Chem. 71 (1999) 2774 [25] P. Akhtar, C. O. Too, G. G. Wallace, Anal. Chim. Acta, 339 (1997) 21 [26] P. Akhtar, C. O. Too, G. G. Wallace, Anal. Chim. Acta, 339 (1997) 211 [27] I. G. Casella, M. Gatta, T.R.I. Cataldi, J. Chromatogr. A 875 (2) 57 [28] S.A. Brazill, P. Singhal, W. G. Kurh, Anal. Chem, 72 (2) 5542 [29] K. Stulic, V. Pacakova, Electroanalytical measurements in flowing liquids, Ellis Horwood limited. 1987, p [3] «Αρχές και µέθοδοι µελέτης ηλεκτροδιακών δράσεων» Γ. Κοκκινίδης. [31] «Ηλεκτροχηµεία», Ι.Α. Μουµτζής,.Π. Σαζού. [32] Steady state voltammetry, Keith Oldham, page 41 [33] Εlectroanalytical Τechniques, Chapter 6. page 16 [34] I. Rousar, K. Micka, A. Kimla, Electrochemical Engineering II (Parts D-F), Chemical Engineering Monographs (chapter 22), Elsevier, Amsterdam, 1986, pp [35] E.M.M Roosendaal, H. Poppe, Anal. Chim. Acta 158 (1984) 323 [36] P. Agafiotou, C. Maliakas, A. Pappa-Louisi, S. Sotiropoulos, Electrochim. Acta 47 (23) [37] P. Agafiotou, S. Sotiropoulos, Anal.Chim. Acta 497 (23)

111 16

112 A.ΙΙ ΒΕΛΤΙΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΔΙΠΛΗ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ, ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΔΙΠΛΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΣΤΟ UV Α.IΙ.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στόχος αυτού του κεφαλαίου είναι η βελτιστοποίηση της ανίχνευσης των αµινοξέων, µετά το διαχωρισµό τους µε τη µέθοδο της υγρής χρωµατογραφίας αντίστροφης φάσης, χρησιµοποιώντας σε σειρά τρεις ανιχνευτές : ηλεκτροχηµικό (EC), φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (FL) και ανιχνευτή UV. Για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση χρησιµοποιήθηκε η κυψέλη β (βλ. κεφ. Α.Ι), η οποία περιείχε σε σειρά ένα µακρο-δίσκο υαλώδους άνθρακα (Μ) και ένα συνδυασµό µικρο-ηλεκτροδίων (2 ίνες άνθρακα τοποθετηµένες κάθετα στη ροή της κινητής φάσης, 2mf), µε αποτέλεσµα κατά την ηλεκτροχηµική ανίχνευση να καταγράφονται ταυτόχρονα δύο σήµατα. Ο ανιχνευτής UV τέλος είχε τη δυνατότητα να δίνει την απορρόφηση των αµινοξέων σε δύο µήκη κύµατος ταυτόχρονα. Συνεπώς, κατά τη διάρκεια ενός µόνο χρωµατογραφήµατος των αµινοξέων καταγραφόταν ταυτόχρονα 5 σήµατα χρησιµοποιώντας τρεις ανιχνευτές σε σειρά, UV, FL και EC. Γενικά, η χρήση πολλών ανιχνευτών βοηθάει την ανάλυση όσον αφορά την εκλεκτικότητα, την ταυτοποίηση των ουσιών αλλά και τον έλεγχο της σωστής λειτουργίας των οργάνων ανίχνευσης, και ιδιαίτερα του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή που έχει πρόβληµα σταθερότητας λόγω της παθητικοποίησης του ηλκετροδίου εργασίας. Ειδικά στην περίπτωση των 17

113 αµινοξέων, η χρήση πολλαπλής ανίχνευσης κατά κάποιο τρόπο είναι απαραίτητη µιας και σε ελεύθερη µορφή τα αµινοξέα δεν περιέχουν όλα κάποια ιδιαίτερα χρωµοφόρα [1-6], φθορίζουσα [7-9] ή ηλεκτροενεργή οµάδα [1-12]. Χρησιµοποιώντας συνεπώς τρεις ανιχνευτές είναι εφικτό να ανιχνεύονται ταυτόχρονα αµινοξέα σε µίγµα, εκ των οποίων κάποια µπορούν και δίνουν σήµα σε έναν µόνο από τους τρεις ανιχνευτές και επιπλέον να γίνεται ταυτοποίηση των αµινοξέων που δίνουν περισσότερα από ένα σήµατα. Α.IΙ.2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Το σύστηµα της υγρής χρωµαταγραφίας υψηλής πίεσης αποτελούνταν από µία αντλία Shimadzu LC-2AD, από βαλβίδα µοντέλου 7125 για την εισαγωγή του δείγµατος σε loop 2 µl, a mm MZ- Analytical column (MZ-Aqua Perfect C18 5µm), από ειδικό φούρνο για στήλες, Shimadzu CTO-1ASVP, ο οποίος διατηρούσε τη θερµοκρασία της στήλης σταθερή στους 25 ο C, από έναν ανιχνευτή UV Shimadzu (SPD-1A) ο οποίος έχει τη δυνατότητα να δίνει την απορρόφηση ταυτόχρονα σε δύο µήκη κύµατος, από έναν φθορισµοµετρικό ανιχνευτή Shimadzu (RF- 1AXL) και από έναν πολλαπλό ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή ο οποίος κατασκευάστηκε στο εργαστήριό µας και στον οποίο συνδέθηκε κυψέλη (κυψέλη β) µε δυο ηλεκτρόδια, η οποία επίσης κατασκευάστηκε στο εργαστήριό µας. Τα ηλεκτρόδια της κυψέλης ήταν ένα ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (δίσκος, Μ) διαµέτρου 3mm και ένα σύστηµα µικροηλεκτροδίων αποτελούµενο από 2 ίνες γραφιτικού άνθρακα (2mf) διαµέτρου 3µm και µήκους,5cm, οι οποίες ήταν τοποθετηµένες κάθετα 18

114 στη ροή της κινητής φάσης. Η σειρά µε την οποία ήταν συνδεδεµένοι οι ανιχνευτές ήταν η ακόλουθη : UV, FL και ΕC (η κινητή φάση περνούσε πρώτα από το µακρο-ηλεκτρόδιο και ύστερα από το σύστηµα των µικροηλεκτροδίων). Το δυναµικό που εφαρµόστηκε και στα δύο ηλεκτρόδια ήταν 1,1V, ως προς Ag/AgCl, το UV λειτουργούσε σε µήκη κύµατος 19, 2 και 21nm (σε συνδυασµούς ανά δύο), και το µήκος κύµατος διέγερσης και εκποµπής στο φθορισµοµετρικό ανιχνευτή ήταν 22nm και 32nm, αντίστοιχα. Στα σχήµατα Α.ΙΙ.1 (Α) και Α.ΙΙ.1 (Β) απεικονίζεται η χρησιµοποιούµενη διάταξη της υγρής χρωµατογραφίας και των διαφόρων ανιχνευτών. Τα αµινοξέα που µελετήθηκαν σε ελεύθερη µορφή ήταν τα εξής 18: L-ιστιδίνη (his), L-κυστεΐνη (cys), κυστίνη (cys-cys), κρεατίνη (crn), S- µέθυλο-l-κυστεΐνη (me-cys), DL-οµοκυστεΐνη (hcy), L-µεθειονίνη (met), β-(3,4-δι-υδροξυ-φαίνυλο)-l-αλανίνη (dopa), L-τυροσίνη (tyr), DL-mτυροσίνη (m-tyr), L-a-µεθυλο-dopa (me-dopa), L-φαινυλαλανίνη (phe), DL-α-µεθυλο-τυροσίνη (me-tyr), 5-υδροξυ-τρυπτοφάνη (5htp), 3-νιτρο- L-τυροσίνη (n-tyr), L-τρυπτοφάνη (trp), λευκίνη (Leu), ισολευκίνη (Ile) και η L-κυσταθειονίνη (cysta), καθώς και ένα διπεπτίδιο: L-καρνοσίνη (car), και η κρεατινίνη (cre). Η συγκέντρωση των αναλυόµενων ουσιών ήταν 1µg/mL. Οι κινητές φάσεις που χρησιµοποιήθηκαν ήταν υδατικά ρυθµιστικά διαλύµατα φωσφορικών µε ph 2.5 και ιονική ισχύ.2μ τα οποία ήταν είτε καθαρά είτε περιείχαν ισοπροπανόλη (iproh), µέχρι και 8%, είτε ακετονιτρίλιο (MeCN), µέχρι και 15%. Η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης ήταν 1mL/min. Τα χρωµατογραφήµατα που δίνονται σε αυτό το κεφάλαιο πάρθηκαν χρησιµοποιώντας ένα συγκεκριµένο τύπο βαθµωτής µεταβολής της συγκέντρωσης του MeCN που προσδιορίστηκε από κατάλληλο γενετικό αλγόριθµο που περιγράφεται στο επόµενο κεφάλαιο της διδακτορική διατριβής. Ο προγραµµατισµός της βαθµωτής µεταβολής είναι ο ακόλουθος: 19

115 (Α) FL Πολλαπλός Ποτενσιοστάτης Φούρνος στήλης Κλωβός Κυψέλης EC Η/Υ Καταγραφή σηµάτων UV Κινητές φάσεις Εισαγωγή δείγµατος αντλία απόβλητα (Β) Κυψέλη µε διπλό ηλεκτρόδιο (Μ και 2mf) Σχήµα Α.ΙΙ.1 : Το σύστηµα της υγρής χρωµατογραφίας και οι ανιχνευτές που χρησιµοποιήθηκαν στη συγκεκριµένη διατριβή. 11

116 t (min) φ (V MeCN /V m ) Όπου ο χρόνος t εκφράζεται σε min, και φ είναι το κλάσµα όγκου του MeCN (V MeCN ) στην κινητή φάση (V m ). Η βαθµωτή αυτή µεταβολή δίνεται επίσης γραφικά στο Σχήµα Α.ΙΙ Acetonitrile, % t, min Σχήµα Α.ΙΙ.2: Η % µεταβολή της συγκέντρωσης του ΜeCN όταν φτάνει στον ανιχνευτή UV. Τέλος, για να είναι εφικτό να καταγράφονται ταυτόχρονα 5 σήµατα από τους 3 διαφορετικούς ανιχνευτές, αναπτύχθηκε στο εργαστήριό µας ειδικό λογισµικό το οποίο περιγράφεται περιληπτικά στο επόµενο κεφάλαιο ( κεφ. Α.ΙΙ.3.1). 111

117 Α.IΙ.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α.ΙΙ.3.1 ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ ΚΑΤΑΓΡΑΦΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΣΗΜΑΤΩΝ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΤΩΝ Ως γνωστόν, τα σήµατα που παρέχουν οι ανιχνευτές πρέπει να καταγράφονται στον υπολογιστή χρησιµοποιώντας ειδικό λογισµικό. Στο εργαστήριό µας είχε αναπτυχθεί ειδικό λογισµικό [13] στη γλώσσα προγραµµατισµού Visual Basic, µε το οποίο µπορούσαµε να καταγράφουµε µέχρι και δύο σήµατα ταυτόχρονα από τους ανιχνευτές και µε δυνατότητα ανάλυσης των καταγραφόµενων κορυφών κάθε χρωµατογραφήµατος. ηλαδή, σε κάθε χρωµατογράφηµα υπολογίζεται, εκτός από τον χρόνο συγκράτησης και το ύψος κάθε κορυφής, και τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά των κορυφών που είναι το ολοκλήρωµα, το εύρος και η ασυµµετρία της κορυφής. Στην παρούσα εργασία, θελήσαµε να βελτιστοποιήσουµε την ανίχνευση των αµινοξέων και να εκµεταλλευτούµε τα πλεονεκτήµατα της πολλαπλής ανίχνευσης, γι αυτό ήταν απαραίτητο να αναβαθµιστεί το ήδη υπάρχον λογισµικό για να µπορεί να καταγράφει ταυτόχρονα 5 σήµατα. Στην ουσία, η αλλαγή που χρειάστηκε να γίνει πραγµατοποιήθηκε στο παράθυρο «Detectors connections» όπου µε µια σειρά κατάλληλων εντολών έγινε εφικτό να διαβάζονται µέχρι και 5 σήµατα από ανιχνευτές : σήµα από φθορισµοµετρικό ανιχνευτή, δύο σήµατα από ανιχνευτή UV και δύο σήµατα από ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή. Στο Σχήµα Α.ΙΙ.3 απεικονίζεται το παράθυρο «Detectors connections» από όπου µπορούµε να επιλέγουµε τους ανιχνευτές που θέλουµε να χρησιµοποιήσουµε σε κάθε χρωµατογράφηµα. 112

118 Σχήµα Α.ΙΙ.3 : Το παράθυρο «Detectors connections» όπου έγινε η αναβάθµιση του προγράµµατος [13] της Visual Basic για την καταγραφή των 5 σηµάτων των ανιχνευτών. Α.ΙΙ.3.2 ΒΕΛΤΙΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Εκτεταµένη αναφορά για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση και την ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των ουσιών γίνεται στο κεφ. Α.Ι. της συγκεκριµένης διδακτορικής διατριβής. Στη συγκεκριµένη παράγραφο ουσιαστικά χρησιµοποιούµε τα αποτελέσµατα που βρήκαµε απευθείας, κάνοντας µια µικρή αναφορά σε αυτά, για την ανίχνευση του µίγµατος των 21 εκλουόµενων ουσιών µε την βοήθεια του προγράµµατος της βαθµωτής έκλουσης που αναφέρεται στο πειραµατικό µέρος. 113

119 Στο κεφ. Α.Ι εφαρµόστηκε η µέθοδος της κυκλικής βολταµµετρίας χρησιµοποιώντας τόσο µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (δίσκος διαµέτρου 3µµ) όσο και µικρο-ηλεκτρόδιο άνθρακα (δίσκος διαµέτρου 3µm), προκειµένου να µελετηθεί λεπτοµερώς η ηλεκτροχηµική συµπεριφορά των αµινοξέων. Επίσης, µε τη βοήθεια του χρωµατογραφικού συστήµατος και της ηλεκτροχηµικής κυψέλης ροής HPLC η οποία περιείχε διπλό ηλεκτρόδιο (κυψέλη β, βλ. Κεφ. Α.Ι.3), δηλ. ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (Μ) διαµέτρου 3mm και 2 µικρο-ίνες γραφιτικού άνθρακα (2mf) µήκους.5cm και διαµέτρου 3µm, πάρθηκαν τα υδροδυναµικά διαγράµµατα των ελεύθερων αµινοξέων. Από όλες τις 21 ουσίες που µελετήθηκαν, ηλεκτροχηµικό σήµα δίνουν µόνο οι 11 : cys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp. Επίσης, και µε τις δύο παραπάνω µεθόδους προέκυψε το συµπέρασµα ότι το βέλτιστο δυναµικό για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση όλων των ελεύθερων αµινοξέων, που δίνουν σήµα στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, είναι το 1.1V ως προς Ag/AgCl. Επίσης, χρησιµοποιώντας τη διπλή κυψέλη (κυψέλη β), µε το µακρο- και µικρο- ηλεκτρόδιο, εκµεταλλευτήκαµε τα διαφορετικά πλεονεκτήµατα που εµφανίζουν τα δύο αυτά ηλεκτρόδια όπως προέκυψε στο κεφ. Α.Ι. Πιο συγκεκριµένα, την καλύτερη ευαισθησία του µακροηλεκτρόδιου, το µικρότερο όριο ανίχνευσης του µικρο-ηλεκτροδίου καθώς και την υπεροχή του µικρο-ηλεκτροδίου στο λόγο σήµατος προς θόρυβο, S/N (βλ. Κεφ. Α.Ι.4.3) Στο Σχήµα Α.ΙΙ.4 δίνεται µέρος του χρωµατογραφήµατος των αµινοξέων που καταγράφηκε µε τους τρεις ανιχνευτές σε σειρά, το µέρος δηλαδή που αφορά την ηλεκτροχηµική ανίχνευσή τους. Τα συγκεκριµένα χρωµατογράφηµατα του Σχήµατος Α.ΙΙ.4 πάρθηκαν µε το µακροηλεκτρόδιο (M) και µε το µικρο-ηλεκτρόδιο (2 ίνες άνθρακα, 2mf), χρησιµοποιώντας τον τύπο της βαθµωτής µεταβολής της συγκέντρωσης του MeCN που αναφέρεται στο πειραµατικό µέρος και το βέλτιστο δυναµικό 1.1V ως προς Ag/AgCl. 114

120 12 8 M 2mf 6 8 I, na t,min Σχήµα Α.ΙΙ.4 : Χρωµατογράφηµα του µίγµατος των 18 ουσιών µε σειρά έκλουσης : cys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp, που πάρθηκε µε τον τύπο της βαθµωτής έκλουσης που περιγράφεται στο Σχήµα Α.ΙΙ.2 και χρησιµοποιώντας την κυψέλη β που περιέχει µακρο-ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (Μ) και ένα σύστηµα µικρο-ηλεκτροδίων γραφιτικού άνθρακα (2mf) και δυναµικό οξείδωσης το 1.1V ως προς Ag/AgCl. Αυτό που πρέπει να σηµειωθεί παρατηρώντας τα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙΙ.4 είναι η επίδραση της µεταβολής της συγκέντρωσης της κινητής φάσης, δηλ. του ΜeCN, στη βασική γραµµή. Πιο συγκεκριµένα, µετά τα 25 min, όπου πλέον έχουµε τη µέγιστη συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή, ο θόρυβος που εµφανίζεται στη βασική γραµµή και των δύο ηλεκτροδίων είναι τόσο µεγάλος που ουσιαστικά παρεµποδίζει τον ποσοτικό προσδιορισµό των τελευταίων εκλουόµενων ουσιών (n-tyr και trp). Γενικά παρατηρήθηκε, ότι µόνο χρησιµοποιώντας µικρές µεταβολές στη συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή, κατά τη µέθοδο της βαθµωτής µεταβολής, η βασική γραµµή του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή δεν επηρεάζεται. Επίσης, σε αυτό το σηµείο καλό είναι να αναφερθεί ότι το αµινοξύ sm-cys στο συγκεκριµένο δυναµικό και στη συγκεκριµένη συγκέντρωση παρέχει ένα πολύ µικρό σήµα, ουσιαστικά µη µετρήσιµο, στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή. 115

121 Α.ΙΙ.3.3 ΒΕΛΤΙΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΣΤΟ UV Είναι γνωστό ότι τα αµινοξέα δεν περιέχουν κάποια ισχυρή χρωµοφόρα οµάδα, κάτι που καθιστά τη χρωµατογραφική ανίχνευση και το διαχωρισµό τους, σε ελεύθερη µορφή, µια δύσκολη υπόθεση. Γενικά αναµένεται τα περισσότερα αµινοξέα να απορροφούν σε µικρά µήκη κύµατος, σε µήκη κύµατος, δηλαδή, όπου απορροφά η καρβοξυλική οµάδα. Στόχος σε αυτό το τµήµα της διδακτορικής διατριβής είναι να µελετηθεί η απορρόφηση των αµινοξέων στο υπεριώδες και να βρεθεί το βέλτιστο µήκος κύµατος το οποίο θα χρησιµοποιηθεί στις περαιτέρω µελέτες. Η µελέτη της απορρόφησης των αµινοξέων στο UV πραγµατοποιήθηκε σε µία περιοχή µηκών κύµατος από 19nm µέχρι 254nm, και χρησιµοποιώντας ως κινητές φάσεις καθαρά υδατικά διαλύµατα, υδατικά διαλύµατα iproh 2% και υδατικά διαλύµατα MeCN διαφόρων συγκεντρώσεων. Γενικά και σε αυτή την περίπτωση, όπως και κατά την µελέτη στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, δεν παρατηρήθηκε ουσιαστική διαφορά στην απορρόφηση των ουσιών µε την παρουσία ή µη του οργανικού τροποποιητή, εκτός από την περίπτωση της car η οποία µόνο σε καθαρές υδατικές κινητές φάσεις και όχι µε την παρουσία της iproh ή του MeCN, παρείχε διπλή κορυφή στο UV. Στον Πίνακα Α.Ι.1 δίνονται οι απορροφήσεις (AU), που πάρθηκαν χρησιµοποιώντας υδατικές κινητές φάσεις µε την παρουσία iproh 2%, 13 αµινοξέων και της car, οι οποίες απεικονίζονται στο Σχήµα Α.Ι.5. Από τον Πίνακα Α.ΙI.1 και το Σχήµα Α.ΙΙ.5 παρατηρούµε αρχικά ότι οι ουσίες cys-cys, Ile, leu απορροφούν ελάχιστα έως καθόλου στο UV. Το πιο σηµαντικό συµπέρασµα που προκύπτει όµως, µελετώντας το συγκεκριµένο πίνακα και σχήµα, είναι ότι τα βέλτιστα µήκη κύµατος, τα µήκη κύµατος δηλαδή όπου απορροφούν περισσότερο οι συγκεκριµένες ουσίες, είναι τα 19nm και 2nm. Ικανοποιητικά όµως αποτελέσµατα 116

122 Πίνακας Α.Ι.1 : Τιµές απορρόφησης (AU) των αµινοξέων (1µg/ml) και της car, στα διάφορα µήκη κύµατος στην περιοχή του υπεριώδους. µ.κ.(nm) Ουσία his car cys-cys cys hcy met dopa Ile tyr , leu me-dopa phe htp trp ,45 ΑU,4,35,3,25, ,15,1,5, Ουσίες Σχήµα Α.ΙΙ.5 : Γραφική παράσταση της απορρόφησης (AU) των αµινοξέων και της car στα διάφορα µήκη κύµατος στην περιοχή του υπεριώδους. Οι αριθµοί στον άξονα των x αντιστοιχούν σε αµινοξέα: 1. his, 2. car, 3. cys-cys, 4. cys, 5. hcy, 6. met, 7. dopa, 8. Ile, 9. tyr, 1. leu, 11. me-dopa, 12. phe, 13. 5htp, 14. trp. 117

123 παρέχονται χρησιµοποιώντας και το µήκος κύµατος των 21 nm, όπου έχουµε και καλύτερη βασική γραµµή η οποία δεν επηρεάζεται από τη µεταβολή της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή. Στη συνέχεια πάρθηκε, όπως αναφέρθηκε και στην παράγραφο Α.ΙΙ.3.1, το χρωµατογράφηµα των ουσιών χρησιµοποιώντας τους τρεις ανιχνευτές και τον τύπο της βαθµωτής µεταβολής της συγκέντρωσης του ΜeCN που περιγράφεται στο πειραµατικό µέρος. Στο UV υπήρχε η δυνατότητα ταυτόχρονης καταγραφής µόνο δυο µήκων κύµατος. Έτσι, προκειµένου να γίνει πιο λεπτοµερής µελέτη στα τρία µήκη κύµατος, το ίδιο χρωµατογράφηµα πάρθηκε τόσες φορές ώστε να έχουµε όλους τους συνδυασµούς ανά δύο των τριών µήκων κύµατος (19, 2 και 21nm). Στα Σχήµατα Α.ΙΙ.6 και Α.ΙΙ.7 δίνονται τα χρωµατογραφήµατα των ουσιών που πάρθηκαν σε µήκη κύµατος 19, 2 και 21nm. Στο Σχήµα Α.ΙΙ.6 (Β) δίνονται τα 5 πρώτα λεπτά του χρωµατογραφήµατος του Σχήµατος Σχήµα Α.ΙΙ.6 (Α) προκειµένου να φανούν καλύτερα οι κορυφές των εκλουόµενων ουσιών. Αυτό που παρατηρείται στα συγκεκριµένα σχήµατα είναι τα εξής : α. οι ουσίες me-cys και hcy συνεκλούονται κάτι που δεν επιτρέπει την ανίχνευσή τους µε το συγκεκριµένο ανιχνευτή. Όµως δεδοµένου ότι από τις δύο αυτές ουσίες µόνο η hcy παρέχει σήµα στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, η ταυτόχρονη χρήση των δύο αυτών ανιχνευτών σε σειρά, UV και EC, παρέχει τελικά την δυνατότητα της ανίχνευσης και των δύο αυτών αµινοξέων. β. στα χρωµατογραφήµατα που πάρθηκαν στα 19nm παρατηρούµε ότι γύρω στα 25min υπάρχει ένα ανέβασµα της βασικής γραµµής κάτι που οφείλεται στην απορρόφηση του MeCN. Το ίδιο φαινόµενο σε µικρότερο βαθµό εµφανίζεται στα 2nm και καθόλου στο χρωµατογράφηµα που πάρθηκε στα 21nm. γ. παρατηρώντας τα Σχήµατα Α.ΙΙ.6(Β) και Α.ΙΙ.7(Β) προκύπτει το συµπέρασµα οι ουσίες που συγκρατούνται ελάχιστα από τη στήλη παρουσιάζουν στα φάσµατα απορρόφησής τους µικρότερη αλληλοεπικάλυψη (µεγαλύτερη διακριτική ικανότητα) στα 19 nm. Στα 2nm η cysta δεν είναι δυνατό να ανιχνευθεί διότι η κορυφή της εκλούεται στην ουρά της προηγούµενης 118

124 (Α),3 Absorbance,2,1 19 nm 21 nm (Β) t,min,3 19 nm 21 nm Absorbance,2,1 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 t,min Σχήµα Α.ΙΙ.6 : (Α) Χρωµατογράφηµα του µίγµατος των 18 ουσιών µε σειρά έκλουσης : his, cysta, car,cys, cre, crn, me-cys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, medopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp όπως καταγράφηκε στο UV σε µήκος κύµατος 19nm και 21nm, µε την µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης που περιγράφεται στο Σχήµα Α.ΙΙ.2, (Β) το ίδιο µε το (Α) αλλά για τα 5 πρώτα λεπτά της µέτρηση. H me-cys και η hcy συνεκλούονται. 119

125 (Α) Absorbance,25,2,15,1,5 2 nm t, min (Β) Absorbance,25,2,15,1,5 2 nm t, min Σχήµα Α.ΙΙ.7 : (Α) Χρωµατογράφηµα του µίγµατος των 18 ουσιών µε σειρά έκλουσης : his, cysta, car,cys, cre, crn, me-cys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, medopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp όπως καταγράφηκε στο UV σε µήκος κύµατος 2nm, µε την µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης που περιγράφεται στο Σχήµα Α.ΙΙ.2. H me-cys και η hcy συνεκλούονται. (B) τα πρώτα 5 min του χρωµατογραφήµατος (Α). 12

126 ουσίας, his, ενώ στα 21nm τόσο η cysta όσο και η cys δεν ανιχνεύονται διότι και πάλι εκλούονται στην ουρά των προηγούµενων ουσιών his και car, αντίστοιχα. δ. η ανίχνευση των ουσιών στα 2nm και στα 21nm δεν παρουσιάζει ουσιαστικά κάποια διαφορά εκτός του ότι το σήµα ορισµένων ουσιών είναι πιο ενισχυµένο στο ένα µήκος κύµατος και κάποιων άλλων στο δεύτερο µήκος κύµατος. Συνεπώς χρησιµοποιώντας το µήκος κύµατος των 2nm ή 21nm αποφεύγουµε την ανύψωση της βασικής γραµµής, κάτι που πιθανόν να οδηγούσε στη µη δυνατότητα ανίχνευσης κάποιας ουσίας που θα εκλούοταν στο σηµείο ανύψωσης, θυσιάζοντας όµως την ευαισθησία της ανίχνευσης ορισµένων ουσιών που εκλούονται στην αρχή του χρωµατογραφήµατος, κάτι που κερδίζουµε χρησιµοποιώντας τα 19nm. Γενικά, αυτό που παρατηρείται είναι, τουλάχιστον µε τις συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν στη συγκεκριµένη διατριβή, ότι ο ανιχνευτής UV, λόγω του µήκους κύµατος που χρησιµοποιείται, επηρεάζεται περισσότερο από ότι ο ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής από τη µεταβολή της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή χρησιµοποιώντας τη µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης, ακόµη και όταν η µέγιστη συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή είναι σχετικά µικρή. Στο Σχήµα Α.ΙΙ.8 δίνεται ένα χρωµατογράφηµα το οποίο καταγράφηκε µε ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή συµβατικού υαλώδους άνθρακα (1.1V) και µε ανιχνευτή UV (2nm), χρησιµοποιώντας τη µέθοδο της βαθµωτής µεταβολής κατά την οποία η µέγιστη συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή ήταν 8% iproh. Παρατηρήθηκε ότι ο ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής δεν επηρεάζεται από τη µικρή µεταβολή της συγκέντρωσης της iproh κάτι που δεν ισχύει µε τον ανιχνευτή UV. 121

127 1,3 8 I, na 6 4,2,1 AU t, min, Σχήµα Α.ΙΙ.8 : ιαχωρισµός µε τη µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης 1 αµινοξέων µε σειρά έκλουσης : his, cys, hcy, met, dopa, tyr, m-dopa, phe, 5htp, trp, χρησιµοποιώντας σε σειρά ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή ( ) υαλώδους άνθρακα και ανιχνευτή UV ( ). Η γραµµή µε τις τελείες παριστάνει την επί τοις εκατό µεταβολή της συγκέντρωσης της iproh όταν φτάνει στον ανιχνευτή UV, η οποία αναπαριστάνεται στον άξονα του ρεύµατος αν διαιρεθεί µε το 1 Α.ΙΙ.3.4 ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Γενικά, η φθορισµοµετρική ανίχνευση των ελεύθερων αµινοξέων είναι δύσκολη λόγω του ότι µόνο τα αµινοξέα που περιέχουν τον κατεχολικό ή ινδολικό δακτύλιο φθορίζουν. Όπως αναφέρεται και στην βιβλιογραφία [7-9], η φθορισµοµετρική ανίχνευση αυτών πραγµατοποιείται χρησιµοποιώντας ως µήκος διέγερσης και εκποµπής τα 22 και 32nm, αντίστοιχα. 122

128 Στη συνέχεια, χρησιµοποιώντας τα προαναφερόµενα µήκη κύµατος διέγερσης και εκποµπής καταγράφηκε ο φθορισµός του µίγµατος των 18 ουσιών (οι οποίες δίνουν σήµα στο UV), που µελετήθηκε σε αυτό το κεφάλαιο, µε τον τύπο της βαθµωτής έκλουσης που αναφέρεται στο πειραµατικό µέρος. Το αντίστοιχο χρωµατογράφηµα απεικονίζεται στο Σχήµα Α.ΙΙ.9. Από το χρωµατογράφηµα του Σχήµατος Α.ΙΙ.9 είναι φανερό ότι οι ουσίες που σε ελεύθερη µορφή µπορούν να ανιχνευτούν µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή στη σειρά είναι οι ακόλουθες 7 : dopa, tyr, m- tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp και trp. Εδώ, όπως φαίνεται, το µόνο αµινοξύ που, ενώ περιέχει τον κατεχολικό δακτύλιο, δεν µπορεί να ανιχνευθεί φθορισµοµετρικά, είναι η n-tyr λόγω της νιτρο-οµάδας που περιέχει η οποία παρεµποδίζει τον φθορισµό. Επίσης, σηµαντικό είναι να τονιστεί η µεταβολή της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή δεν επηρεάζει την βασική γραµµή, σε αντίθεση µε τα καταγραφόµενα χρωµατογραφήµατα µε τους ανιχνευτές UV και EC. 11 Fluorescence t,min Σχήµα Α.ΙΙ.9 : Χρωµατογράφηµα του µίγµατος των 18 ουσιών µε σειρά έκλουσης : dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp και trp χρησιµοποιώντας την µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης που περιγράφεται στο Σχήµα Α.ΙΙ.2 και τον φθορισµοµετρικό ανιχνευτή. 123

129 Α.ΙΙ.3.5 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Τα πλεονεκτήµατα της χρήσης της πολλαπλής ανίχνευσης κατά τη διάρκεια ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού ενός µίγµατος ουσιών είναι πολύ σηµαντικά. Αρχικά είναι εφικτό να επιβεβαιωθεί η σωστή λειτουργία των ανιχνευτών και να αποφευχθούν τυχόν πειραµατικά σφάλµατα. Αυτό είναι ιδιαίτερα σηµαντικό στην περίπτωση που ένας ανιχνευτής δεν είναι ιδιαίτερα σταθερός, όπως χαρακτηριστικά ισχύει στην περίπτωση του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή όπου το ηλεκτρόδιο εργασίας παθητικοποιείται σχετικά εύκολα. Αν κατά τη διάρκεια του χρωµατογραφικού διαχωρισµού έχουµε τουλάχιστον δύο ανιχνευτές εκ των οποίων ο ένας είναι ο ηλεκτροχηµικός και παρατηρηθεί ότι τα σήµατά του είναι χαµηλότερα από ότι συνήθως, µπορούµε µε τη βοήθεια του δεύτερου ανιχνευτή, και πιο συγκεκριµένα από το αν τα σήµατα και του δεύτερου είναι ή όχι πεσµένα, να ελέγξουµε αν αυτό οφείλεται σε παθητικοποίηση του ηλεκτροδίου ή σε καταστροφή του αναλυόµενου µίγµατος. Επίσης, υπάρχουν ουσίες που δίνουν σήµα µόνο σε έναν από τους τρεις ανιχνευτές. Με τη χρήση και των τριών ανιχνευτών είναι εφικτό να ανιχνεύσουµε ένα µίγµα όλων αυτών των ουσιών χωρίς να χάνουµε καµία ουσία. Επίσης καταγράφοντας έστω και δύο σήµατα στον ίδιο ανιχνευτή είναι δυνατόν να βελτιστοποιηθεί µία ανίχνευση, όπως συνέβη χαρακτηριστικά στην περίπτωση µας µε το UV, καθώς όταν λειτουργούσε σε δύο διαφορετικά µήκη κύµατος είχαµε στο ένα µήκος κύµατος καλύτερη ανίχνευση ορισµένων ουσιών ενώ στο δεύτερο µήκος κύµατος σταθερή βασική γραµµή, ανεπηρέαστη από την αύξηση της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή. Ουσιαστικά, τα µειονεκτήµατα του ενός ανιχνευτή διορθώνονται µε την χρήση ενός άλλου ανιχνευτή. Χαρακτηριστικά θα αναφερθούµε στο Σχήµα Α.ΙΙ.4, όπου η υψηλή συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη δεν επιτρέπει την σωστή απόκριση του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή για τα 124

130 τελευταία δύο αµινοξέα, κάτι που διορθώνεται µε την χρήση του UV σε σειρά, όπως φαίνεται στο Σχήµα Α.ΙΙ.6(Α) και Α.ΙΙ.7(Α). Επίσης, το µειονέκτηµα της αύξησης του σήµατος της βασικής γραµµής, που παρατηρείται στο UV στο Σχήµα Α.ΙΙ.8, διορθώνεται µε τη χρήση του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή σε σειρά όπου δεν εµφανίζεται αντίστοιχο πρόβληµα. Με τη βοήθεια της πολλαπλής ανίχνευσης µπορεί να γίνει ταυτοποίηση των ουσιών στην περίπτωση βέβαια που οι συγκεκριµένες ουσίες δίνουν σήµα σε τουλάχιστον δύο ανιχνευτές ή στον ίδιο ανιχνευτή, όπως στο UV αλλά σε δύο διαφορετικά µήκη κύµατος. Πιο συγκεκριµένα, ο λόγος των κορυφών µιας ουσίας σε δύο ανιχνευτές είναι πάντα σταθερός. Έτσι, ακόµη και αν µεταβληθούν οι χρωµατογραφικές συνθήκες πχ η συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή, µε αποτέλεσµα η ουσία να εκλούεται σε άλλο χρόνο, είναι δυνατό να επιβεβαιωθεί η ταυτότητά της µόνο από το λόγο των κορυφών των σηµάτων στους δύο ανιχνευτές. Τέλος, η πολλαπλή ανίχνευση µπορεί να βοηθήσει στον προσδιορισµό των ουσιών οι οποίες δεν είναι δυνατό να διαχωρισθούν χρωµατογραφικά. Έτσι, για παράδειγµα, στην περίπτωσή των αµινοξέων me-cys και hcy, αν και συνεκλούονται µε τη βαθµωτή έκλουση που χρησιµοποιήθηκε για το διαχωρισµό τους, µπορούν να προσδιορισθούν λόγω του ότι ενώ δίνουν και τα δύο αυτά αµινοξέα απορρόφηση στο UV, µόνο η hcy ανιχνεύεται ηλεκτροχηµικά. 125

131 Α.IΙ.4 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Σε αυτό το κεφάλαιο µελετήθηκε η ανίχνευση ενός µίγµατος 21 ελεύθερων αµινοξέων και σχετικών ενώσεων, καταγράφοντας ταυτόχρονα 5 σήµατα χρησιµοποιώντας σε σειρά τρεις ανιχνευτές : UV, FL και ΕC. Στο UV καταγραφόταν δύο σήµατα απορρόφησης των ουσιών σε δύο διαφορετικά µήκη κύµατος, ενώ στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή καταγραφόταν επίσης δύο σήµατα χρησιµοποιώντας ένα µακρο-ηλεκτρόδιο και ένα σύστηµα µικρο-ηλεκτροδίων που βρίσκονταν σε σειρά στην ίδια κυψέλη ροής HPLC. Τα συµπεράσµατα που προέκυψαν από αυτό το κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής και τη χρήση πολλών ανιχνευτών κατά τη διάρκεια µιας χρωµατογραφικής ανάλυσης, είναι τα ακόλουθα : 1. Από τις 21 ουσίες που µελετήθηκαν : his, cysta, car,cys, cre, crn, me-cys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, trp, leu, Ile και cys-cys, µόνο οι 18, δηλαδή όλες εκτός από τις leu, Ile και cys-cys, δίνουν σήµα στο UV σε µήκη κύµατος από 19-21nm, ενώ στο δυναµικό 1.1V ως προς Ag/AgCl, δίνουν ηλεκτροχηµικό σήµα µόνο οι 11 ουσίες : cys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp, και φθορίζουν στα 32nm κατόπιν διέγερσης στα 22 nm τα 7 αµινοξέα : dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, me-tyr, 5htp και trp. 2. Με τη χρήση της διπλής απορρόφησης σε δύο διαφορετικά µήκη κύµατος έχουµε το εξής πλεονέκτηµα : στο µήκος κύµατος 19 nm έχουµε πολύ καλή ανίχνευση και διαχωρισµό των φασµάτων των ουσιών, ειδικά αυτών που εκλούονται στα πρώτα 5 λεπτά του χρωµατογραφήµατος, όµως η απορρόφηση που εµφανίζει το MeCN προκαλεί µεγάλο θόρυβο - ανύψωση στην βασική γραµµή γύρω στα 25min. To φαινόµενο αυτό δεν εµφανίζεται κατά τη χρήση των µηκών κύµατος των 2nm και 21nm, αλλά σε αυτά τα µήκη κύµατος δεν έχουµε καλό διαχωρισµό των ουσιών που εκλούονται νωρίς, δηλ. της cysta και της cys οι οποίες συνεκλούονται η κάθε µια µε µία άλλη ουσία (his και car,αντίστοιχα). Άρα ο συνδυασµός της ταυτόχρονης χρήσης δύο µηκών κύµατος απορρόφησης, εκ των 126

132 οποίων το ένα θα είναι τα 19 nm και το δεύτερο 2 ή 21nm, κατά τη διάρκεια ενός χρωµατογραφήµατος, θα ήταν ιδανικός για την ανίχνευση των συγκεκριµένων ουσιών στο UV. 3. Η δυνατότητα της χρήσης ηλεκτροχηµικής κυψέλης που αποτελείται από δύο ηλεκτρόδια εργασίας σε σειρά, εκ των οποίων το ένα είναι µακρο-δίσκος και το άλλο ένα κατάλληλο σύστηµα µικροηλεκτροδίων, δίνει τη δυνατότητα της εκµετάλλευσης των πλεονεκτηµάτων που παρουσιάζει κάθε τύπος ηλεκτροδίου στην ηλεκτροχηµική ανίχνευση. 4. Τέλος, η πολλαπλή ανίχνευση των 18 (από τα 21 η leu, Ile και cys-cys δεν έδιναν σε κανέναν ανιχνευτή σήµα) µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων και των συγγενών ενώσεων, δίνει την δυνατότητα της ταυτοποίησης των ουσιών αυτών σε ένα άγνωστο πολύπλοκο φυσικό δείγµα, δεδοµένου ότι τα ύψη των κορυφών που καταγράφονται από τους τρεις ανιχνευτές στη σειρά δε µεταβάλλονται κατά τον ίδιο τρόπο για τις διαφορετικές χρωµατογραφούµενες ουσίες και συνεπώς οι λόγοι αυτών των κορυφών µπορούν να χρησιµοποιηθούν για το χαρακτηρισµό των αναλυόµενων ουσιών. Συµπερασµατικά, ο συνδυασµός της ταυτόχρονης διπλής απορρόφησης στο UV, της φθορισµοµετρικής ανίχνευσης και της διπλής ηλεκτροχηµικής ανίχνευσης µε µακρο- και µικρο- ηλεκτρόδιο που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο αυτό της διδακτορικής διατριβής για την ανίχνευση ενός µίγµατος 18 ελεύθερων αµινοξέων και συγγενών ενώσεων προτείνεται ανεπιφύλακτα ως µια συµπληρωµατική µέθοδος ανάλυσης των αµινοξέων, απαλλαγµένη από τα µειονεκτήµατα µιας παραγωγοποίησης των αµινοξέων πριν ή µετά το διαχωρισµό τους από τη χρωµατογραφική στήλη. 127

133 Α.IΙ.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Petritis K., Elfakir C., Dreux M., J. Chrom. A, 961 (22) 9-21 [2] Klampfl CW, Vo TDT, J. Liq. Chrom. R T 26 (23) [3] Klampfl CW, Buchberger W., Turner M., et al., J. Chrom. A, 84 (1998) [4] Salimi-Moosavi H., Cassidy RM, J. Chrom. A, 79 (1997) [5] Y. Yokohama, S. Horikoshi, T. Takahashi, H. Sato, J. Chrom. A, 886 (2) [6] H. Wang, V. Pacakova, K. Stulik, J. Chrom. A, 59 (199) [7] S. Sasaki, A.Hashizume, D. Citterio, E. Fujii, K. Suzuki, Tetrahedron Letters 43 (22) [8] M. Yang, s. A. Τomellini, Anal. Chim, acta, 49 (2) [9] A. T. Wood, M. R. Hall, J. Chrom. B, 744 (22) [1] I. G. Casella, M. Gatta, T.R.I. Cataldi, J. Chrom. A 875 (2) 57 [11] P. Akhtar, C. O. Too, G. G. Wallace, Anal. Chim. Acta, 339 (1997) 211 [12] I. G. Casella and Michela Contrurs, Anal. Chim Acta 478 (23) [13] «Ανάπτυξη λογισµικού για on-line µετρήσεις και ανάλυσης δεδοµένων στην HPLC», διπλωµατική εργασία, Χ. Μαλλιάκας. 128

134 A.ΙΙI ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΤΟΥ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΠΟΛΥΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Α.IΙI.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η µέθοδος της βαθµωτής έκλουσης αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο, το οποίο βελτιώνει αισθητά τις δυνατότητες που έχει η χρωµατογραφία όσον αφορά το διαχωρισµό και την ανίχνευση των ουσιών. Η βαθµωτή έκλουση αποτελεί µία τεχνική η οποία βασίζεται σε βαθµωτές µεταβολές κάποιου χρωµατογραφικού µεγέθους κατά τη διάρκεια του διαχωρισµού. Στην υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) τα µεγέθη που προγραµµατίζονται να µεταβάλλονται έχουν να κάνουν µε τη σύσταση της κινητής φάσης, την ταχύτητα ροής και τη θερµοκρασία της στήλης. Από τις προαναφερόµενες µεθόδους βαθµωτής έκλουσης η πιο σηµαντική είναι η βαθµωτή έκλουση που γίνεται υπό συνθήκες µεταβαλλόµενης σύστασης της κινητής φάσης. Μέχρι σήµερα η πιο διαδεδοµένη µορφή βαθµωτής έκλουσης είναι η γραµµική µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης λόγω του ότι µπορεί να περιγραφεί από απλές θεωρητικές µαθηµατικές εκφράσεις. Σε µία πρόσφατη εργασία [1] που πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριό µας, είχε παρουσιαστεί µια νέα µαθηµατική διαδικασία που αφορά τη µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης (gradient elution) [2-4] στην 129

135 RP-HPLC, για την περίπτωση όπου το κλάσµα όγκου φ του οργανικού τροποποιητή της υδατικής κινητής φάσης µεταβάλλεται γραµµικά µε το χρόνο. Σύµφωνα µε αυτήν τη µαθηµατική προσέγγιση, η καµπύλη των πειραµατικών τιµών του lnk ως προς το φ, όπου k είναι ο συντελεστής συγκράτησης της ουσίας ο οποίος υπολογίζεται υπό ισοκρατικές συνθήκες χρησιµοποιώντας δυαδική κινητή φάση, υποδιαιρείται σε ένα πεπερασµένο αριθµό γραµµικών τµηµάτων. Με βάση αυτήν τη διαίρεση, ο χρόνος συγκράτησης της ουσίας υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης υπολογίζεται µε τη βοήθεια µιας αναλυτικής έκφρασης η οποία προκύπτει από τη βασική εξίσωση της βαθµωτής έκλουσης [2-8]. Αυτή η αναλυτική έκφραση για το χρόνο συγκράτησης στη συνέχεια χρησιµοποιήθηκε σε έναν αλγόριθµο κατάλληλο για βελτιστοποίηση, ο οποίος προσδιορίζει την καλύτερη γραµµική µεταβολή του φ η οποία οδηγεί στο βέλτιστο διαχωρισµό ενός µίγµατος ουσιών. Πρέπει να τονιστεί ότι όταν η µέθοδος της βαθµωτής έκλουσης χρησιµοποιείται στην υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), γραµµικές µεταβολές της συγκέντρωσης του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση δεν οδηγούν υποχρεωτικά σε µία απλή µαθηµατική έκφραση που να µπορεί να περιγράψει τους χρόνους συγκράτησης των ουσιών κάτω από τις συνθήκες αυτές των βαθµωτών µεταβολών. Αυτό είναι δυνατό µόνο όταν το lnk µεταβάλλεται γραµµικά µε το φ, κάτι που δύσκολα παρατηρείται στην πλειοψηφία των πειραµατικών συστηµάτων, εκτός και αν η µελέτη γίνεται σε µία στενή περιοχή τιµών του φ. Ο συνδυασµός της γραµµικής βαθµωτής έκλουσης µε τη γραµµική εξάρτηση του lnk ως προς το φ, ονοµάζεται «linear solvent strength gradient» [9-16]. Αυτή η περίπτωση αποτελεί τη βάση του προγράµµατος DryLab, που είναι το περισσότερο ευρέως µέχρι σήµερα χρησιµοποιούµενο πρόγραµµα προσοµοίωσης δεδοµένων της HPLC [17,18]. Είναι φανερό ότι η µέθοδος που περιγράφεται στην [1] αίρει τον περιορισµό ότι το lnk θα πρέπει να µεταβάλλεται γραµµικά µε το φ. Ωστόσο µία αδυναµία αυτής της µεθόδου είναι ότι το προφίλ της βαθµωτής µεταβολής του οργανικού τροποποιητή της κινητής φάσης θα πρέπει να έχει µόνο ένα γραµµικό τµήµα, γεγονός που µπορεί να µην είναι 13

136 ικανοποιητικό για τον απόλυτο διαχωρισµό όλων των ουσιών. Γι αυτό το λόγο σε αυτό το κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής θα γίνει µία προσπάθια να επεκταθεί η µέθοδος που αναπτύχθηκε στην εργασία [1] σε πολυγραµµικές βαθµωτές εκλούσεις, δηλ. σε βαθµωτές µεταβολές που αποτελούνται από πολλά γραµµικά τµήµατα µεταβολής της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή. Οι αναλυτικές εκφράσεις των χρόνων συγκράτησης των ουσιών σε αυτού του είδους τις βαθµωτές εκλούσεις, όπως θα προκύψουν από τη συγκεκριµένη προσέγγιση, θα χρησιµοποιηθούν σε έναν γενετικό αλγόριθµο (GA) κατάλληλο για βελτιστοποίηση στη RP-HPLC. Η αξιοπιστία των αναλυτικών µαθηµατικών εκφράσεων που θα προκύψουν για την περιγραφή της συγκράτησης ουσιών υπό συνθήκες πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης, καθώς και η αποτελεσµατικότητα της τεχνικής βελτιστοποίησης, θα ελεγχθεί σε ένα µίγµα 15 µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων µε κινητές φάσεις τροποποιηµένες µε ακετρονιτρίλιο (MeCN). Α.IΙI.2 ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΕΣ ΕΚΦΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΧΡΟΝΩΝ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΒΑθΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Ο χρόνος συγκράτησης µιας ουσίας, t R, υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης µπορεί να υπολογιστεί από την βασική εξίσωση [1] tr t tin td dt t k = 1 t t D + t k ϕ ϕin in (1) 131

137 όπου k ϕ = (t ϕ - t )/t είναι ο παράγοντας συγκράτησης της ουσίας ο οποίος αντιστοιχεί σε µία σταθερή σύσταση κινητής φάσης ίσης µε φ, t ϕ t R(ϕ) είναι ο αντίστοιχος ισοκρατικός χρόνος συγκράτησης, t είναι ο νεκρός χρόνος της στήλης, δηλαδή ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση να διανύσει τη στήλη, t D είναι ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση για να διανύσει τη διαδροµή από το µίκτη µέχρι την αρχή της στήλης, ο οποίος στη βιβλιογραφία αναφέρεται ως dwell time, t in είναι µία επιπρόσθετη χρονική διάρκεια που µπορεί να προγραµµατιστεί ώστε να επεκταθεί ή να µειωθεί το αρχικό ισοκρατικό τµήµα που οφείλεται στο dwell time, και φ in είναι η σύσταση της κινητής φάσης αυτού του αρχικού ισοκρατικού τµήµατος. Για να γίνει δυνατή η εύρεση µιας αναλυτικής µαθηµατικής έκφρασης η οποία να υπολογίζει το χρόνο συγκράτησης µιας ουσίας κατά τη διάρκεια µια βαθµωτής έκλουσης βασισµένη στην εξ. (1), θα πρέπει να επεκταθεί η µέθοδος που παρουσιάστηκε στην [1] ως εξής: Θεωρούµε ότι η ισοκρατική συµπεριφορά της συγκράτησης µιας ουσίας σε στήλη αντίστροφης φάσης έχει µελετηθεί στην περιοχή φ, από φ σε φ m, καθώς και ότι έχει προσδιοριστεί η εξάρτηση του ln k ως προς το φ, δηλαδή η εξίσωση ln k = f(φ). Η καµπύλη του ln k ως προς φ γενικά δεν είναι γραµµική αλλά πάντα µπορεί να υποδιαιρεθεί σε m γραµµικά κοµµάτια. Αυτό σηµαίνει ότι η περιοχή [φ, φ m ] διαιρείται σε m τµήµατα, [φ i, φ i+1 ], i =, 1, 2..., m-1, που σε κάθε ένα ισχύει ότι : όπου ln k i = ln k i b i ϕ (2) b i = -[f(ϕ i+1 ) - f(ϕ i )]/(ϕ i+1 - ϕ i ) και ln k i = f(ϕ i ) + b i ϕ i (3) Ας θεωρήσουµε τώρα µία πολυγραµµική βαθµωτή έκλουση, δηλαδή µία βαθµωτή έκλουση που να αποτελείται από ένα συγκεκριµένο αριθµό γραµµικών µεταβολών του φ. Μία βαθµωτή έκλουση µπορεί να οριστεί απόλυτα εάν γνωρίζουµε τις συντεταγµένες (Φ i, T i ) της αρχής και του τέλους κάθε γραµµικού τµήµατος, όπου τα κεφαλαία γράµµατα 132

138 χρησιµοποιούνται απλά για να τονιστούν οι συντεταγµένες των γραµµικών τµηµάτων της βαθµωτής έκλουσης. Έτσι, µια βαθµωτή µεταβολή µε p+1 γραµµικά τµήµατα ορίζεται από την ακόλουθη οµάδα τιµών Φ i, T i : (Φ, Φ 1,, Φ p, T =, T 1,, T p ). Πρέπει να τονιστεί ότι το τελευταίο γραµµικό τµήµα είναι πάντα παράλληλο στον άξονα των χρόνων, δηλαδή Φ p = σταθερό, ανεξάρτητα από το αν Φ p = φ m ή Φ p < φ m. Στη µέθοδο που παρουσιάζεται σε αυτό το κεφάλαιο θεωρούµε ότι οι συντεταγµένες Φ i υπόκεινται στον ακόλουθο περιορισµό: Υποχρεωτικά ανήκουν στο διάνυσµα (φ, φ 1,, φ m ). Επίσης θεωρούµε ότι Φ = φ αλλά αυτός ο περιορισµός εύκολα αίρεται, όπως θα φανεί και στο τέλος αυτής της µαθηµατικής επεξεργασίας. Για ένα συγκεκριµένο προφίλ πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης, δηλαδή για ένα συγκεκριµένο διάνυσµα (Φ, Φ 1,, Φ p, T, T 1,, T p ), µπορούµε πάντα να αποκαταστήσουµε µία (µοναδική) αντιστοιχία ανάµεσα στο διάνυσµα (φ, φ 1,, φ m ) ή σε ένα τµήµα αυτού και σε µία οµάδα χρόνων (t =, t 1,, t q ), όπου γενικά το q m (βλ. Σχήµα Α.ΙIΙ.1). Είναι φανερό ότι σε αυτή τη γενική περίπτωση, το χρονικό διάστηµα (t i, t i+1 ) αντιστοιχεί σε ένα µόνο διάστηµα τιµών φ, πχ (φ j, φ j+k ), όπου το k µπορεί να είναι ίσο µε το 1 ή το -1 ή το. Είναι επίσης φανερό ότι το διάνυσµα των χρόνων (, t 1, t 2,, t q ) αντιστοιχεί σε µία οµάδα τιµών φ, η οποία µπορεί γενικά να οριστεί ως (φ, φ 1, φ 2,, φ q ). Για παράδειγµα, στο Σχήµα Α.ΙIΙ.1 η βαθµωτή µεταβολή (Φ, Φ 1, Φ 2, Φ 3, Φ 4, T, T 1, T 2, T 3, T 4 ), όπου Φ = φ, Φ 1 = φ 1, Φ 2 = φ 3, Φ 3 = φ 2, Φ 4 = φ 4, T = t, T 1 = t 1, T 2 = t 3, T 3 = t 4, και T 4 = t 6, καθιερώνει µία αντιστοιχία ανάµεσα στο διάνυσµα (φ, φ 1,, φ 4 ) και στο διάνυσµα των χρόνων (t =, t 1,, t 6 ), η οποία φαίνεται στο συγκεκριµένο σχήµα. Επιπρόσθετα, το διάνυσµα (t =, t 1,, t 6 ) αντιστοιχεί στο (φ, φ 1, φ 2,, φ 6 ), όπου φ = φ, φ 1 = φ 1, φ 2 = φ 2, φ 3 = φ 3, φ 4 = φ 2, φ 5 = φ 3, και φ 6 = φ 4, όπως φαίνεται το Σχήµα Α.ΙIΙ.1. Πρέπει να σηµειωθεί ότι οι τιµές φ i είναι χρήσιµες για να εκφράζουν τη σύσταση της κινητής φάσης φ σε όρους χρόνου t στο χρονικό διάστηµα (t i, t i+1 ), βλ. εξ. (6) πιο κάτω. 133

139 ϕ m=5 φ 6 =Φ 4 =ϕ 4 φ 3 =φ 5 =Φ 2 =ϕ 3 φ 2 =φ 4 =Φ 3 =ϕ 2 φ 1 =Φ 1 =ϕ 1 φ =Φ =ϕ t =T t 1 =T 1 t 2 t 3 =T 2 t 4 =T 3 t 5 t 6 =T 4 t Σχήµα Α.ΙΙI.1. Ένα σχηµατικό παράδειγµα πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης. Αν θεωρήσουµε ότι Φ = ϕ και ότι η προς ανάλυση ουσία εκλούεται αµέσως µετά το χρόνο t n, τότε από την εξ. (1) παίρνουµε : t1 dt t k ϕ t 2 t R t t in t D dt t k t1 ϕ dt t k t n ϕ + I S = 1 (4) όπου I S = t D t + k t in ϕ (5) Ωστόσο, στο χρονικό διάστηµα (t i, t i+1 ) η σύσταση της κινητής φάσης φ µεταβάλλεται γραµµικά από φ i σε φ i+1. Αυτό περιγράφεται από την παρακάτω εξίσωση : 134

140 ϕ = φ i + t φ i+ 1 t i ( t ti ) = φi + Bi( t ti ) (6) όπου φ = φ i+1 - φ i και B i µπορεί να πάρει θετική αρνητική ή µηδενική τιµή. Έτσι, t i + 1 t i i t i + dt 1 1 = e t k t k ϕ t i b i ϕ dt = a i (7) όπου και a a i i biφi bibit e i b ( ibiti 1 bibit = e + e i tkibibi ) όταν B i (8) biφi t t t t i + 1 ( i i + 1 i = όταν B k i t k i = (9) φi e = ) t Βασιζόµενοι στις παραµέτρους a i και στην εξ. (4), εύκολα βρίσκουµε ότι η προς ανάλυση ουσία πρόκειται να εκλουστεί αµέσως µετά από το χρόνο t n, όπου το n προσδιορίζεται από τις ανισότητες : a + a1 + + a n 1 + IS < 1 (1) και a + a + + a + I 1 (11) 1 n S > Στη συνέχεια, πρέπει να ερευνηθούν δύο περιπτώσεις : α) το γραµµικό τµήµα (t n, t n+1 ) έχει κλίση διάφορη του µηδενός (B n ) και β) ίση µε το µηδέν (B n = ). Αν B n, τότε η Εξ. (4) παίρνει την µορφή 135

141 136 1 I e e A a S t B b t t t t B b n 1 n i i n n n in D R n n = + + = ) ( ) ( (12) όπου το A n ορίζεται από τη σχέση n n n t B b b n B b k t e A n n n n n φ = (13) Από την Εξ. (12) εύκολα προκύπτει ότι n n in D R b B C t t t t / = (14) όπου ] / ) ln[( n t b B n S 1 n A e A I s 1 C n n n + = (15) και 1 n 1 1 n a a a s = (16) Οµοίως, για B n =, έχουµε ) ( 1 n S n in D R s I 1 k t t t t t t n φ = (17) Αν η προς ανάλυση ουσία εκλούεται κατά την διάρκεια του τελευταίου βήµατος όπου φ q = σταθερό, έχουµε και πάλι B q = οπότε ) ( 1 q S q in D R s I 1 k t t t t t t q φ = (18) όπου το s q-1 υπολογίζεται από την Εξ. (16) βάζοντας το q στη θέση του n. Πρέπει να τονιστεί ότι στην παραπάνω µαθηµατική επεξεργασία θεωρούµε ότι Φ = φ. Αυτός ο περιορισµός µπορεί εύκολα να εξαλειφθεί µε µία κατάλληλη επαναρίθµηση των τιµών φ i. Για παράδειγµα, εάν Φ = φ 2, τότε κάνουµε την µετατροπή φ 2 φ, φ 3 φ 1, κλπ και όλες οι παραπάνω εξισώσεις ισχύουν κανονικά. Τέλος, η προς ανάλυση ουσία µπορεί να εκλούεται κατά τη διάρκεια του αρχικού ισοκρατικού τµήµατος. Σε αυτήν την περίπτωση η συνθήκη είναι :

142 I S 1 (19) Και ο χρόνος έκλουσης µπορεί να υπολογιστεί από την tr = t ( 1+ k ) (2) ϕin Παρατηρούµε ότι ο χρόνος συγκράτησης t R µπορεί εύκολα να υπολογιστεί από τις Εξ. (14), (17), (18) ή (2) αν η συνάρτηση του παράγοντα συγκράτηση της αναλυόµενης ουσίας, k φ, ως προς το φ είναι γνωστή. Σε αυτό το κεφάλαιο έχουµε χρησιµοποιήσει την ακόλουθη έκφραση για το k ϕ [19] c ϕ k ϕ = exp{ c 2 1 } (21) 1 + c ϕ 3 όπου οι παράµετροι c i µπορούν να υπολογιστούν είτε από ισοκρατικά είτε από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης όπως περιγράφεται πιο κάτω. Α.IIΙ.3 ΑΝΑΛΥΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ Ε ΟΜΕΝΩΝ Οι µαθηµατικές εκφράσεις του χρόνου συγκράτησης που αναπτύχθηκαν πιο πάνω, Εξ. (14), (17), (18) ή (2), µπορούν να χρησιµοποιηθούν και για πρόβλεψη αλλά και για τη βελτιστοποίηση ενός διαχωρισµού ουσιών υπό συνθήκες πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης. 137

143 Σε αυτό το κεφάλαιο η βελτιστοποίηση πραγµατοποιήθηκε µε την βοήθεια των γενετικών αλγορίθµων (GAs) µε την προϋπόθεση ότι οι προσαρµόσιµες παράµετροι c 1, c 2, c 3 της Εξ. (21) έχουν υπολογιστεί είτε από ισοκρατικά δεδοµένα είτε/και από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης χρησιµοποιώντας µία κατάλληλη µέθοδο προσαρµογής. Α.ΙIΙ.3.1 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΓΙΑ ΤΗ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΠΟΛΥΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Οι γενετικοί αλγόριθµοι ουσιαστικά αποτελούν µια προσοµοίωση των φυσικών διαδικασιών εξέλιξης των ειδών, και πιο συγκεκριµένα βασίζονται στις αρχές που αποκάλυψε ο αρβίνος και αναφέρονται στην επικράτηση του πιο προσαρµοστικού είδους. Ο πρώτος που εµπνεύστηκε τους γενετικούς αλγορίθµους ήταν ο John Holland τη δεκαετία του 6 και από τότε έχουν µελετηθεί εκτενώς και έχουν εφαρµοστεί σε πολλά ερευνητικά πεδία. Θα µπορούσε να υποστηριχθεί ότι οι γενετικοί αλγόριθµοι είναι ένα χρήσιµο εργαλείο σε προβλήµατα ελαχιστοποίησης ή µεγιστοποίησης µιας συνάρτησης και αυτό γιατί έχουν την ικανότητα να µην παγιδεύονται σε οποιοδήποτε τοπικό µέγιστο ή ελάχιστο το οποίο δεν αποτελεί το ολικό-πραγµατικό µέγιστο ή ελάχιστο [2-28]. Για αυτό το λόγο η χρήση τους στην επίλυση προβληµάτων βελτιστοποίησης στην ΗPLC ενδείκνυται και έχει ήδη αρχίσει να βρίσκει ευρεία εφαρµογή [23,26-28]. Σε αυτό το κεφάλαιο ο αλγόριθµος που χρησιµοποιείται βασίζεται στον κλασικό αλγόριθµο που προτάθηκε από τον Michalewicz [21] και αποτελείται από τα ακόλουθα βήµατα: 138

144 Βήµα (1) επιλογή των αρχικών παραµέτρων : Αυτές είναι ο µέγιστος αριθµός γενεών, το µέγεθος του πληθυσµού, η πιθανότητα της ανταλλαγής γονιδίων µεταξύ των χρωµοσωµάτων (αναπαραγωγή) και η πιθανότητα της µετάλλαξης. Βήµα (2) δηµιουργία πληθυσµού µε n χρωµοσώµατα : Ένας αρχικός πληθυσµός δηµιουργείται µε τη βοήθεια της µεθόδου των τυχαίων αριθµών. Ο πληθυσµός αποτελείται από N χρωµοσώµατα, τα οποία µπορεί να είναι του τύπου (Φ, Φ 1,, Φ p, t in, T 1, T 2,, T p ) για το fmode = ή (Φ, t in, T 1, T 2,, T m ) για το fmode = 1, όπου T i = T i - T i-1 και Φ = ϕ in είναι η σύσταση της κινητής φάσης κατά την διάρκεια του αρχικού ισοκρατικού τµήµατος το οποίο διαρκεί t D + t in. Όταν fmode =, η επιλογή των γονιδίων Φ i γίνεται από την οµάδα (ϕ, ϕ 2,, ϕ m ) είτε υπόκεινται στον περιορισµό Φ i < Φ i+1 (i =, 1,, p-1) είτε όχι. Αν fmode = 1, τότε Φ j = ϕ j = ϕ in + j(ϕ m - ϕ )/m, j = 1, 2,, m, µε την προϋπόθεση ότι Φ j ϕ m, ειδάλλως Φ j = ϕ m. Είναι φανερό ότι όταν fmode = υπό τον περιορισµό Φ i < Φ i+1 ή όταν fmode = 1, η βαθµωτή έκλουση είναι µία αυστηρά συνεχης, αυξανόµενη συνάρτηση του χρόνου, ϕ(t), ενώ η µορφή της βαθµωτής µεταβολής µπορεί να έχει τµήµατα που αυξάνονται ή ελαττώνονται ή παραµένουν σταθερά αν fmode = χωρίς τον περιορισµό Φ i < Φ i+1. Πρέπει να τονιστεί ότι αυτός ο αλγόριθµος χρησιµοποιεί χρωµοσώµατα που εκφράζονται από πραγµατικούς και όχι από δυαδικούς αριθµούς, [2-22]. Βήµα (3) υπολογισµός της τιµής της συνάρτησης κόστους για το κάθε χρωµόσωµα : Το κόστος ή η αντικειµενική συνάρτηση εφαρµόζεται σε κάθε ένα από τα χρωµοσώµατα του πληθυσµού. Ο αλγόριθµος µπορεί να λειτουργεί µε δύο επιλογές : single ή multi-objective. Όταν ο αλγόριθµος λειτουργεί στην επιλογή «single-objective» η συνάρτηση κόστους µπορεί να γραφεί γενικά ως εξής : CF = w 1 δt 1 + w 2 δt 2 + w 3 δt 3 + w 4 (1- t g,max t R,max /C) + w 5 N /p (22) 139

145 όπου w 1, w 2, είναι παράγοντες βαρύτητας που υπόκεινται στον εξής περιορισµό : w 1 +w 2 +w 3 +w 4 +w 5 = 1, δt 1, δt 2, δt 3 είναι οι πρώτες τρεις ελάχιστες τιµές της διαφοράς t R,m t R,n ανάµεσα σε ζευγάρια γειτονικών εκλουόµενων ουσιών σε ένα χρωµατογράφηµα, t g,max είναι ο µέγιστος χρόνος της βαθµωτής µεταβολής, t R,max είναι ο χρόνος έκλουσης της πιο µακρινής χρωµατογραφούµενης ουσίας, C είναι µία σταθερά που κάνει την ποσότητα µέσα στις παρενθέσεις θετική και N είναι ο αριθµός των γραµµικών τµηµάτων της βαθµωτής µεταβολής ο οποίος πληρεί τη συνθήκη Φ i Φ i+1 (i =, 1,, p-1). Αν η σταθερά C δεν µπορεί να κάνει τον τέταρτο όρο της Εξ. (22) θετικό, τότε η συνάρτηση κόστους CF ορίζεται ίση µε µηδέν. Στο δικό µας αλγόριθµο, αρχικά το C είναι ίσο µε 1 και αυξάνεται σε 2 αν παραπάνω από το µισό πληθυσµό έχει CF =. Τέλος, ο τελευταίος όρος είναι ενεργός µόνο αν fmode = χωρίς τον περιορισµό Φ i < Φ i+1. Τότε ο τελευταίος όρος ευνοεί αυστηρά αυξανόµενες βαθµωτές µεταβολές. Στην επιλογή «multi-objective» υπολογίζουµε παραπάνω από µία τιµή κόστους σε κάθε χρωµόσωµα. Έτσι σε κάθε χρωµόσωµα µπορούµε να υπολογίσουµε την τιµή του CF από την Εξ. (22) όπως επίσης και τις τιµές από διάφορες αντικειµενικές συναρτήσεις, όπως είναι οι ακόλουθες: CF i = δt i / t g,max (23) ή/και CF i = δt i υπό την προϋπόθεση ότι t R,max t g,max (24) ή/και CF i = δt i υπό την προϋπόθεση ότι t R,max t g,max και Φ j Φ j+1 (25) όπου j =, 1,, p-1 και i = 1, 2, 3. Βήµα (4) επιλογή του καλύτερου χρωµοσώµατος : Στην επιλογή «single-objective» το καλύτερο χρωµόσωµα, δηλ. το χρωµόσωµα το οποίο παρέχει τη µεγαλύτερη τιµή στη συνάρτηση κόστους CF, βρίσκεται και κρατείται στη µνήµη. Ενώ στο «multi-objective» βρίσκουµε και 14

146 αποθηκεύουµε τα χρωµοσώµατα τα οποία παρέχουν τις µεγαλύτερες τιµές στη συνάρτηση CF κόστους και σε όλες τις συναρτήσεις CF i. Βήµα (5) επιλογή συντρόφου για ταίρι (ζεύγους) : Η επιλογή συντρόφου για ταίρι γίνεται µε τη βοήθεια του τροχού ρουλέτας [2-22] που βασίζεται στην συνάρτηση CF. Για καλύτερα αποτελέσµατα, χρησιµοποιείται η µέθοδος γραµµικής κλιµάκωσης [2]. Βήµα (6) αναπαραγωγή : Η τεχνική της συνδυασµένης διασταύρωσης, δηλ. ανταλλαγής γονιδίων µεταξύ των χρωµατοσωµάτων, χρησιµοποιήθηκε για την αναπαραγωγή [2-22] λαµβάνοντας υπόψη ότι στο δικό µας αλγόριθµο τα γονίδια Φ, Φ 1,, Φ p είναι, στην πράξη, ακέραιοι αριθµοί που ανήκουν στην περιοχή από µέχρι m. Έτσι ο ακέραιος n χρησιµοποιείται για τον υπολογισµό του Φ n µε τη βοήθεια της σχέσης Φ n = ϕ in + n(ϕ m - ϕ )/m αν Φ n ϕ m ειδάλλως Φ n = ϕ m. Βήµα (7) µετάλλαξη : Εξαιτίας της παραπάνω φύσης των χρωµοσωµάτων, µόνο οµοιόµορφες µεταλλάξεις δηµιουργούνται [21]. Βήµα (8) κριτήριο διακοπής διαδικασίας : Τα βήµατα (3)-(7) επαναλαµβάνονται µέχρι ο αριθµός των γενεών να πάρει τη µέγιστη τιµή που ορίζεται από το βήµα (1). Στην επιλογή «single-objective» το αποτέλεσµα είναι µόνο ένας τύπος βαθµωτής έκλουσης, ενώ στην επιλογή «multi-objective» παίρνουµε τόσους τύπους βαθµωτής έκλουσης όσος είναι ο αριθµός των αντικειµενικών συναρτήσεων. 141

147 Α.ΙIΙ.3.2 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΙΜΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΤΗΣ Εξ.(21) ΠΟΥ ΠΕΡΙΓΡΑΦΕΙ ΤΗΝ ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Γενικά οι προσαρµόσιµες παράµετροι της Εξ.(21) υπολογίζονται πολύ εύκολα αν προσαρµόσουµε αυτήν την εξίσωση στα ισοκρατικά δεδοµένα των χρωµατογραφούµενων ουσιών χρησιµοποιώντας το πρόγραµµα Solver του Excel. Όµως, ο Solver δεν λειτουργεί αν προσπαθήσουµε να προσαρµόσουµε την Εξ. (21) σε δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης µέσω των Εξ. (14), (17), (18) ή (2). Για αυτό το λόγο, όπως επίσης και για τους λόγους που εξηγούνται παρακάτω, εφαρµόστηκαν διάφοροι µέθοδοι προκειµένου να επιλυθεί αυτό το πρόβληµα προσαρµογής της Εξ. (21) σε δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης. Πιο συγκεκριµένα, δεδοµένου ότι ο Solver στηρίζεται στον αλγόριθµο Levenberg-Marquardt, χρησιµοποιήσαµε απευθείας τον αλγόριθµο Levenberg-Marquardt (LM) όπως περιγράφεται στην [29] για να προσαρµόσουµε την Εξ. (21) σε δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης. Παρόλα αυτά, σε πολλές περιπτώσεις εµφανίστηκαν σοβαρά προβλήµατα σύγκλισης. Αυτή η συµπεριφορά µπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η διαδικασία προσαρµογής πραγµατοποιείται µέσω των προσεγγιστικών Εξ. (14), (17) ή (18), οι οποίες είναι πιθανό να επηρεάζουν την ακρίβεια του προσδιορισµού των διάφορων παραγώγων που απαιτούνται για την εφαρµογή του αλγόριθµου LM. Προκειµένου να µειωθούν ή και να εξαλειφθούν αυτά τα προβλήµατα σύγκλησης έγινε µία προσπάθεια πρώτα να αυξθεί η απόδοση του αλγόριθµου LM µε πολύ απλές αλλαγές και στη συνέχεια δοκιµάστηκαν άλλες τεχνικές προσαρµογής, όπως για παράδειγµα η µέθοδο simplex και ένας γενετικός αλγόριθµος. Σύµφωνα µε την πρώτη µετατροπή του αλγόριθµου LM (MLM), όταν ο αλγόριθµος αποτυγχάνει να συγκλίνει σε µία συγκεκριµένη λύση έπειτα από έναν προκαθορισµένο αριθµό επαναλήψεων, συνήθως ίσο µε 1, ο αλγόριθµος ξεκινά από την αρχή µε νέες αρχικές τιµές 142

148 επιλεγµένες τυχαία από την περιοχή που ψάχνει. Το ίδιο γίνεται όταν εµφανίζεται µια άτοπη µαθηµατική διαδικασία, όπως για παράδειγµα διαίρεση µε το µηδέν. Μία εναλλακτική µεταβολή στον αλγόριθµο LM προκύπτει αν συνδυάσουµε αυτόν µε µία αρχική τυχαία αναζήτηση, µέσα σε µία περιοχή που ορίζουµε εκ των προτέρων για τις προσαρµόσιµες παραµέτρους της Εξ. (21) [3]. Έτσι ένας αριθµός n rnd οµάδων µε τιµές (c 1, c 2, c 3 ) επιλέγονται τυχαία από την περιοχή αναζήτησης και η οµάδα η οποία δίνει την µικρότερη τιµή για το n 2 ( Rj, exp Rj, calc (26) j= 1 CF = t t ) επιλέγεται, και οι συντεταγµένες c 1, c 2, c 3 χρησιµοποιούνται ως µία αρχική εκτίµηση στον αλγόριθµο LM. Εδώ, t R j, exp είναι οι πειραµατικές τιµές των χρόνων συγκράτησης µιας συγκεκριµένης αναλυόµενης ουσίας κατά την διάρκεια της j βαθµωτής µεταβολής και t R j, calc είναι οι αντίστοιχες θεωρητικές τιµές όπως υπολογίστηκαν µε την βοήθεια των Εξ. (14), (17), (18) ή (2). Αυτός ο συνδυασµός της τυχαίας αναζήτησης και του αλγόριθµου LM (RND+LM) έχει το πλεονέκτηµα ότι µπορεί να παρέχει αρχικές εκτιµήσεις γύρω από το συνολικό πραγµατικό ελάχιστο και επιπλέον αναµένεται ότι θα ελαττώνει τα προβλήµατα σύγκλισης όπως επίσης και τα προβλήµατα που συνδέονται µε την «παγίδευση» σε ένα τοπικό ελάχιστο. Η µέθοδος simplex έχει το πλεονέκτηµα ότι δεν χρησιµοποιεί παραγώγους συναρτήσεων, αλλά έχει την τάση να παγιδεύεται σε ένα τοπικό ελάχιστο, αν υπάρχουν αρκετά. Σε αυτήν την περίπτωση υιοθετήθηκε η µέθοδος simplex που περιγράφεται στην [31]. Το πρώτο simplex αυτής της µεθόδου επιλέχθηκε τυχαία από την περιοχή αναζήτησης. Τέλος, η χρήση του γενετικού αλγορίθµου (GA) για να λύσει το πρόβληµα προσαρµογής της Εξ. (21), διασφαλίζει την σύγκλιση στο πραγµατικό ελάχιστο, απαιτεί όµως περισσότερο χρόνο υπολογισµού συγκριτικά µε τις κλασικές µεθόδους προσαρµογής. Οι βασικές διαφορές 143

149 ανάµεσα στο GA που χρησιµοποιήθηκε για προσαρµογή και σε αυτόν που υιοθετήθηκε για βελτιστοποίηση αφορούν : α) τις παραµέτρους εισαγωγής, β) τα χρωµοσώµατα, γ) τον τύπο των µεταλλάξεων και δ) τη συνάρτηση κόστους. Πιο συγκεκριµένα, οι κύριες παράµετροι εισαγωγής είναι τρεις ή περισσότερες πολυγραµµικές βαθµωτές µεταβολές και οι αντίστοιχοι χρόνοι συγκράτησης της κάθε εκλουόµενης ουσίας υπό αυτές τις βαθµωτές µεταβολές. Όλες οι βαθµωτές εκλούσεις πρέπει να αποτελούνται από τον ίδιο αριθµό γραµµικών τµηµάτων, p. Αν µια συγκεκριµένη βαθµωτή µεταβολή αποτελείται από λιγότερα γραµµικά τµήµατα, τότε προσθέτουµε στο τέλος της συγκεκριµένης βαθµωτής µεταβολής τον απαραίτητο αριθµό γραµµικών τµηµάτων ως εξής : η βαθµωτή έκλουση (Φ, Φ 1,, Φ p, T 1, T 2,, T p ) επεκτείνεται στο (Φ, Φ 1,, Φ p, Φ p, Φ p,, T 1, T 2,, T p, T p+1, T p+2, ). Κάθε χρωµόσωµα έχει γενικό τύπο (c 1i, c 2i, c 3i ), i = 1, 2,, N, όπου c 1, c 2, c 3 είναι οι παράµετροι της Εξ. (21). Η µετάλλαξη είναι τύπου «Gaussian» (Γκαουζιανές µεταλλάξεις) [21] και η συνάρτηση κόστους παρέχεται από την Εξ. (26). Όλοι οι αλγόριθµοι που χρησιµοποιήθηκαν έγιναν στο εργαστήριό µας χρησιµοποιώντας τη γλώσσα προγραµµατισµού C++ η οποία έτρεχε σε υπολογιστή Pentium cpu 3 GHz υπό τα windows XP. Όλοι οι υπόλοιποι υπολογισµοί διεξήχθησαν σε φύλλα Excel χρησιµοποιώντας µακροεντολές για την εφαρµογή των διαφόρων εξισώσεων που αναπτύχθηκαν πιο πάνω. 144

150 Α.IIΙ.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η συσκευή υγρής χρωµατογραφίας υψηλής πίεσης αποτελείται από µία αντλία Shimadzu LC-2AD, από βαλβίδα µοντέλου 7125 για την εισαγωγή του δείγµατος σε loop των 2µL (Rheodyne, Cotati, CA), από µία 25x4.6 mm MZ-Analytical στήλη (ΜΖ- Aqua Perfect C18 5µm), και από έναν ανιχνευτή ορατού υπεριώδους (Shimadzu SPD-1A) ο οποίος ήταν ρυθµισµένος στα 2nm. Οι κινητές φάσεις ήταν υδατικά φωσφορικά διαλύµατα συγκέντρωσης,2μ και ph=2.5 και ως οργανικός τροποποιητής χρησιµοποιήθηκε το MeCN. Οι ουσίες των οποίων ο διαχωρισµός βελτιστοποιήθηκε µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο αυτό της διδακτορικής διατριβής είναι τα εξής 13 µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα: L-ιστιδίνη (his), κρεατίνη (crn), DLοµοκυστείνη (hcy), L-µεθειονίνη (met), βήτα-(3,4-διύδροξυφαίνυλο)-lαλανίνη (dopa), L-τυροσίνη (tyr), DL-m-τυροσίνη (m-tyr), L-a-µέθυλο - dopa (me-dopa), L-φαινυλαλανίνη (phe), DL-alpha-µέθυλο-τυροσίνη (me-tyr), 5-ύδροξυ-τρυπτοφάνη (5htp), 3-νίτρο-L-τυροσίνη (n-tyr), και L-τρυπτοφάνη (trp), καθώς και ένα διπεπτίδιο, η L-καρνοσίνη (car) και τέλος η κρεατινίνη (cre). Όλες οι χηµικές ουσίες που χρησιµοποιήθηκαν αγοράστηκαν από εµπορικές πηγές. Η συγκέντρωση των ουσιών στις µελέτες µας ήταν 1 µg/ml. Η ταχύτητα ροής που χρησιµοποιήθηκε ήταν 1 ml/min. Ο χρόνος t D υπολογίστηκε καταγράφοντας την καµπύλη απορρόφησης στο UV σε µήκος κύµατος 23 nm κατά την διάρκεια ενός απλού βήµατος κατά το οποίο η συγκέντρωση της µεθανόλης από φ=,2 γίνεται απευθείας φ=. Βρέθηκε ότι t D = 1,1 min. Τέλος, ο νεκρός χρόνος είναι t = 2,56 min. 145

151 Α.IIΙ.5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Προκαταρκτικά πειράµατα που έγιναν στο προηγούµενο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής έδειξαν ότι ο χρόνος συγκράτησης πέντε από τις αναλυόµενες ουσίες που µελετήθηκαν, δηλ. των his, car, cre, crn, και hcy, είναι πολύ κοντά στον νεκρό χρόνο, t. Γι αυτό το λόγο µελετήθηκαν µόνο ισοκρατικά σε δύο συγκεντρώσεις κινητής φάσης, σε φ = και σε φ =.1. Οι χρόνοι συγκράτησης που βρέθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.1. Οι υπόλοιπες ουσίες µελετήθηκαν τόσο ισοκρατικά όσο και υπό διάφορες συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. Και πιο συγκεκριµένα, η ισοκρατική τους µελέτη έγινε σε φ =,.1, και.6, ενώ οι τύποι των βαθµωτών εκλούσεων που εφαρµόστηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.2. Οι χρόνοι συγκράτησης που προέκυψαν κάτω από τις ισοκρατικές και τις συνθήκες βαθµωτής έκλουσης καταγράφονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.3. Για τις ουσίες his, car, cre, crn, και hcy οι οποίες εκλούονται κοντά στο t υποθέτουµε ότι η εξάρτηση του ln k ϕ ως προς το φ είναι γραµµική. Και για αυτό σε αυτήν την περίπτωση εφαρµόζουµε την Εξ. (21) θεωρώντας ότι c 3 =. Ο προσδιορισµός των παραµέτρων c 1 και c 2 αυτής της εξίσωσης µπορεί εύκολα να γίνει χρησιµοποιώντας το Excel. Οι τιµές αυτών των παραµέτρων που υπολογίστηκαν χρησιµοποιώντας γραµµική προσαρµογή δίνονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ

152 Πίνακας Α.ΙΙI.1. Πειραµατικοί χρόνοι συγκράτησης (σε min) των ουσιών που εκλούονται ισοκρατικά πριν τα 5min σε φ = και φ =.1. Ουσία t ϕ (ϕ = ) t ϕ (ϕ =.1) his car cre crn hcy Πίνακας Α.ΙIΙ.2. Τύποι βαθµωτών εκλούσεων που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό των παραµέτρων c i της Εξ. (21). Τύπος βαθµωτής έκλουσης*: φ in φ 1 φ 2 φ 3 t in t 1 t 2 t 3 *ο χρόνος σε min Πίνακας Α.ΙIΙ.3. Πειραµατικοί χρόνοι συγκράτησης (σε min) των ουσιών met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, και trp υπό ισοκρατικές συνθήκες για φ =,.1,.6, υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης που αναφέρονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.2 καθώς και υπό συνθήκες της βέλτιστης βαθµωτής έκλουσης (best) που αναφέρεται στο κείµενο. Ουσία t ϕ t ϕ t ϕ t R t R t R t R (ϕ=) (ϕ=.1) (ϕ=.6) (1) (2) (3) (best) met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr trp

153 Πίνακας Α.ΙIΙ.4. Τιµές των παραµέτρων c 1, c 2, c 3 της Εξ. (21) όπως υπολογίστηκαν από τα ισοκρατικά δεδοµένα για τις 5 πρώτες ουσίες και από τα δεδοµένα των τριών τύπων βαθµωτής έκλουσης του Πίνακα Α.ΙIΙ.2 για τις 1 τελευταίες ουσίες. ουσία c 1 c 2 c 3 his car cre crn hcy met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr trp Για τον προσδιορισµό των παραµέτρων c 1, c 2, c 3 των υπόλοιπων εκλουόµενων ουσιών, πρώτα ελέγχεται η αποτελεσµατικότητα καθενός από τους αλγόριθµους προσαρµογής που αναφέρθηκαν στην παράγραφο Α.IΙΙ.3.2. Έτσι, ο κάθε αλγόριθµος έτρεξε 3 φορές για την κάθε αναλυόµενη ουσία, χρησιµοποιώντας για την κάθε µια τέσσερις χρόνους έκλουσης, οι οποίοι προέρχονται από τις βαθµωτές εκλούσεις (1), (2), (3) που περιγράφονται στον Πίνακα Α.ΙΙΙ.2, και από την ισοκρατική έκλουση για φ=,6. Για την εφαρµογή του αλγόριθµου LM χρησιµοποιήθηκε ένας σταθερός αριθµός επαναλήψεων ίσος µε 1, n iter = 1. Ο αριθµός n rnd των οµάδων (c 1, c 2, c 3 ) οι οποίοι επιλέχθηκαν τυχαία από την περιοχή αναζήτησης για την µέθοδο RND+LM ήταν 5. Η περιοχή αναζήτησης ήταν συνήθως [, 2] για την παράµετρο c 1 και [, 2] για τις παραµέτρους c 2 και c 3, και ήταν ίδιες για όλους τους αλγόριθµους. Βρέθηκε ότι µεγαλύτεροι αριθµοί για το n rnd δεν βελτιώνουν την εφαρµογή 148

154 του LM αισθητά. Η µέθοδος simplex απαιτεί περισσότερες επαναλήψεις για να υπάρξει κάποια σύγκλιση. Σε αυτή την µελέτη χρησιµοποιήσαµε δύο τιµές για το n iter, 1 και 5. Τέλος για τον αλγόριθµο GA, πρώτα µελετήθηκαν οι συνθήκες που πρέπει να υπάρχουν ώστε να έχει τη βέλτιστη εφαρµογή. Μετά από πολλές προκαταρκτικές µελέτες προέκυψε το συµπέρασµα ότι ο αλγόριθµος πρέπει να εφαρµόζεται υπό τις ακόλουθες συνθήκες : ο µέγιστος αριθµός γενεών πρέπει να βρίσκεται στην περιοχή από 1 µέχρι 3, το µέγεθος του πληθυσµού πρέπει να είναι 1, η πιθανότητα ανταλλαγής χρωµοσωµάτων µε διασταύρωση πρέπει να είναι.8, και η πιθανότητα µετάλλαξης να είναι.2. Πρέπει να σηµειωθεί ότι αυτές οι ρυθµίσεις είναι ίδιες και για τις δύο εφαρµογές του γενετικού αλγόριθµου, δηλ. όταν ο αλγόριθµος χρησιµοποιείται για βελτιστοποίηση ή για προσαρµογή χρωµατογραφικών δεδοµένων, και είναι ίδιες µε αυτές που βρέθηκαν σε προηγούµενες µελέτες [24,25]. Παρατηρήθηκε ότι χρησιµοποιώντας τις παραπάνω παραµέτρους, επιτυγχάνεται η µέγιστη απόδοση του κλασικού GA για ένα µεγάλο πλήθος εφαρµογών, οπότε δεν υπάρχει ανάγκη να βρίσκουµε τις βέλτιστες τιµές αυτών των παραµέτρων κάθε φορά που χρησιµοποιείται σε κάποια εφαρµογή. Πρέπει επίσης να σηµειωθεί ότι στους διάφορους υπολογισµούς χρησιµοποιήθηκαν οι τιµές : ϕ m =.3, ϕ =, και m = 2. Στην εργασία [1] βρέθηκε ότι µία τιµή του m µεγαλύτερη ή ίση του 1, m 1, παρέχει αποτελέσµατα τα οποία πρακτικά συγκλίνουν σε εκείνα που παίρνονται από την αριθµητική λύση της βασικής εξίσωσης που ισχύει στη µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης, Εξ. (1). Ο πίνακας Α.ΙΙI.5 παρέχει τα αποτελέσµατα που παρθηκαν από τις διάφορες µεθόδους προσαρµογής µόνο για την trp. Παρόµοια αποτελέσµατα πάρθηκαν και για τις άλλες αναλυόµενες ουσίες. Η επιτυχία ενός αλγόριθµου προσαρµογής κρίνεται από τους επί τοις εκατό επιτυχείς προσδιορισµούς του πραγµατικού ελάχιστου (% αποτελεσµατικότητα), τον ολικό αριθµό υπολογισµού της συνάρτησης (21), n e, που χρειάζονται για κάθε επιτυχή προσδιορισµό του πραγµατικού ελαχίστου, και από τον χρόνο που ξοδεύεται για την προσαρµογή. Παρατηρούµε ότι οι δύο 149

155 Πίνακας Α.ΙIΙ.5. Σύγκριση των διάφορων µεθόδων υπολογισµού των παραµέτρων c 1, c 2, c 3 για την trp. Μέθοδος Αποτελεσµατικότητα (%) n iter a n e b Χρόνος (s) c 1 c 2 c 3 GA ± ± ±.12 LM ± ± ±.2 MLM ± ± ±.2 RND+LM ± ± ±.2 Simplex ± ± ±1.2 Simplex ± ±.7 4.±.2 a Αριθµός επαναλήψεων b αριθµός υπολογισµού της συνάρτησης 15

156 παραλλαγές του αλγόριθµου LM, MLM και RND+LM, παρουσιάζουν την καλύτερη απόδοση. Προσδιορίζουν το γενικό ελάχιστο σχεδόν σε όλες τις προσπάθειες παρέχοντας τη µικρότερη n e τιµή καθώς τον µικρότερο χρόνο υπολογισµών. Ο γενετικός αλγόριθµος, GA, µπορεί επίσης να χρησιµοποιηθεί εφόσον ο χρόνος υπολογισµού είναι 75s για την κάθε αναλυόµενη ουσία κάτι που δεν είναι απαγορευτικό για τους σύγχρονους υπολογιστές. Πρέπει να τονιστεί ότι οι λύσεις που προσδιορίζονται µε τον γενετικό αλγόριθµο έχουν µεγαλύτερη αβεβαιότητα συγκριτικά µε τον αλγόριθµο LM. Αυτό είναι κάτι τυπικό στους γενετικούς αλγόριθµους αλλά δεν έχει κάποια πρακτική επίδραση στην ακρίβεια υπολογισµού των χρόνων συγκράτησης µέσω των Εξ. (14), (17), (18) or (2). Τέλος, παρατηρούµε ότι η µέθοδος simplex έχει την µικρότερη απόδοση. Απαιτεί µεγάλο χρόνο υπολογισµού ώστε να δώσει µία αποδεκτή ακρίβεια για τις παραµέτρους c 1, c 2, c 3 και, επιπλέον, η επί τοις εκατό επιτυχία των προσδιορισµών του πραγµατικού ελάχιστου είναι η µικρότερη, γύρω στο 4%. Γενικά, όταν ο αλγόριθµος αποτυγχάνει να υπολογίσει το πραγµατικό ελάχιστο, αυτό σηµαίνει ότι έχει παγιδευτεί σε ένα τοπικό ελάχιστο. Λαµβάνοντας υπόψη τα παραπάνω αποτελέσµατα, πολύ εύκολα προκύπτει το συµπέρασµα ότι ο απλός αλγόριθµος MLM είναι πολύ αποτελεσµατικός για την επίλυση του προβλήµατος προσαρµογής των δεδοµένων βαθµωτής έκλουσης στην Εξ. (21). Στην παρούσα εργασία, για µεγαλύτερη ασφάλεια, χρησιµοποιήθηκε και αυτός ο αλγόριθµος αλλά και ο γενετικός αλγόριθµος για τον προσδιορισµό των προσαρµόσιµων παραµέτρων της Εξ. (21). Προκειµένου να βρεθεί η καλύτερη βαθµωτή µεταβολή του φ ως προς το χρόνο t η οποία θα παρέχει το βέλτιστο διαχωρισµό του µίγµατος των αναλυόµενων ουσιών που µελετούνται σε αυτό το κεφάλαιο, πρώτα χρησιµοποιήθηκαν οι χρόνοι συγκράτησης που αναφέρονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.3 και που πάρθηκαν υπό συνθήκες τριών τύπων βαθµωτής έκλουσης που περιγράφονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.2, και έπειτα υπολογίστηκαν οι τιµές των παραµέτρων c 1, c 2, c 3 που δίνονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.4. Αυτές οι τιµές 151

157 χρησιµοποιούνται στη συνέχεια στο γενετικό αλγόριθµο που είναι κατάλληλος για βελτιστοποίηση, για να υπολογίσει τις βέλτιστες βαθµωτές µεταβολές του φ έναντι του t, οι οποίες αποτελούνται από ένα συγκεκριµένο αριθµό διαφορετικών γραµµικών τµηµάτων διατηρώντας όµως σταθερό τον ολικό χρόνο έκλουσης. Με αυτό το σκεπτικό, ξεκινήσαµε µε έναν αρχικό ολικό χρόνο έκλουσης ίσο µε 15 λεπτά και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες βαθµωτές εκλούσεις οι οποίες αποτελούνται από τρία, τέσσερα, πέντε και έξι γραµµικά τµήµατα. Αυτό επαναλαµβάνεται τρεις φορές χρησιµοποιώντας την επιλογή «multi-objective» που περιγράφεται στο κεφάλαιο Α.ΙIΙ.3.1 και ένα µέγιστο αριθµό γενεών ίσο µε 3 ώστε να είναι βέβαιο ότι έχει επιτευχθεί η βέλτιστη λύση. Κάθε φορά το πρόγραµµα έτρεχε για περίπου έξι λεπτά. Η βέλτιστη από όλες τις βαθµωτές µεταβολές αποθηκευόταν σε ένα φύλλο του Excel. Έπειτα, ο ολικός χρόνος έκλουσης αυξανόταν κατά 5 λεπτά και η όλη διαδικασία επαναλαµβανόταν. Με αυτήν την διαδικασία βρέθηκε ότι ο τύπος της βέλτιστης βαθµωτής µεταβολής, δηλαδή της βαθµωτής µεταβολής του MeCN που επιτρέπει τον βέλτιστο διαχωρισµό των 15 µελετούµενων αµινοξέων, είναι : ϕ in =, ϕ 1 =.15, ϕ 2 =.3, ϕ 3 =.9, ϕ 4 =.15, t in = 1, t 1 = 7, t 2 = 2, t 3 = 21, t 4 = 24 min Τα χρωµατογραφήµατα των Σχηµάτων Α.IΙΙ.2 και Α.ΙIΙ.3 έχουν καταγραφεί χρησιµοποιώντας την παραπάνω βαθµωτή έκλουση και οι χρόνοι συγκράτησης των αναλυόµενων ουσιών, που εκλούονται µετά τα 5 λεπτά, οι οποίοι καταγράφηκαν στο χρωµατογράφηµα του Σχήµατος Α.ΙIΙ.2, δίνονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.3. Τα ίδια σχήµατα, δηλαδή τα Σχήµατα Α.ΙIΙ.2 και Α.ΙIΙ.3, δείχνουν επίσης τους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης, σύµφωνα µε τις Εξ. (14), (17), (18) ή (2). Φαίνεται ότι υπάρχει µία πολύ καλή πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης αφού το µέσο επί τοις εκατό σφάλµα των προβλεπόµενων τιµών είναι πολύ χαµηλό, ίσο µε.78% όπως φαίνεται στον Πίνακα Α.ΙIΙ

158 Absorbance ϕ t, m in. Σχήµα Α.ΙIΙ.2. Χρωµατογράφηµα που καταγράφηκε υπό τις βέλτιστες συνθήκες διαχωρισµού που περιγράφονται στο κείµενο για τις ουσίες : (1) met, (2) dopa, (3) tyr, (4) m-tyr, (5)me-dopa, (6) phe, (7) me-tyr, (8) 5htp, (9) n-tyr, (1) trp χρησιµοποιώντας UV ως ανιχνευτή. Οι κάθετες γραµµές δείχνουν τους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης ενώ η γραµµή (- - -) δείχνει την µεταβολή του φ έναντι του t όταν αυτή φτάνει στον ανιχνευτή UV..3 Absorbance t, m in Σχήµα Α.ΙIΙ.3. Τα πρώτα 6 λεπτά του χρωµατογραφήµατος του Σχήµατος Α.ΙΙΙ.2. Οι κορυφές αντιστοιχούν κατά σειρά στις ουσίες his, car, cre, crn, και hcy (ξεκινώντας από αριστερά προς τα δεξιά) και οι κάθετες γραµµές δείχνουν τους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης. 153

159 Πίνακας Α.ΙIΙ.6. Προβλεπόµενοι χρόνοι συγκράτησης (σε λεπτά) των αναλυόµενων ουσιών του Πίνακα Α.ΙΙΙ.3 για το βέλτιστο τύπο βαθµωτής έκλουσης και το αντίστοιχο επί τοις εκατό σφάλµα ανάµεσα στους πειραµατικούς και στους θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης. Η πρόβλεψη βασίζεται στα δεδοµένα συγκράτησης των τριών βαθµωτών εκλούσεων του Πίνακα Α.ΙΙΙ.2 (t R (a)), στα δεδοµένα συγκράτησης των βαθµωτών εκλούσεων 2, 3 και στα ισοκρατικά δεδοµένα για ϕ =.6 (t R (b)), στα δεδοµένα συγκράτησης των τριών βαθµωτών εκλούσεων 1, 2 και στα ισοκρατικά δεδοµένα για ϕ = (t R (c)), και στα ισοκρατικά δεδοµένα του Πίνακα Α.ΙΙΙ.3 (t R (d)). Ουσία t R (a) % t R (b) % t R (c) % t R (d) % met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr trp Μέσος όρος = Προκειµένου να µελετήθεί επιπλέον η συµφωνία ανάµεσα στους πειραµατικούς και στους θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης που αντιστοιχεί στο βέλτιστο διαχωρισµό συγκράτησης, εφαρµόστηκαν τα ακόλουθα : Αντικαθιστάθηκε µία οµάδα από τα δεδοµένα που δίνονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.3 για τους τρεις τύπους βαθµωτής έκλουσης του Πίνακα Α.ΙIΙ.2 από ισοκρατικά δεδοµένα, και επαναλήφθηκε η παραπάνω διαδικασία. ηλαδή, πρώτα υπολογίστηκαν οι παράµετροι c 1, c 2, c 3 της Εξ. (21) και έπειτα προσδιορίστηκαν οι χρόνοι συγκράτησης των αναλυόµενων ουσιών χρησιµοποιώντας τις Εξ. (14), (17), (18) ή (2) για το βέλτιστο τύπο βαθµωτής έκλουσης που βρέθηκε πιο πάνω. Και πιο συγκεκριµένα, πρώτα αντικαταστήθηκαν τα δεδοµένα της βαθµωτής έκλουσης τύπου 1 από τα ισοκρατικά δεδοµένα για φ =.6, και έπειτα αντικαταστήθηκαν τα δεδοµένα της βαθµωτής έκλουσης τύπου 3 από τα ισοκρατικά δεδοµένα 154

160 για φ =. Οι προβλεπόµενοι χρόνοι συγκράτησης και τα αντίστοιχα επί τοις εκατό σφάλµατα ανάµεσα στους πειραµατικούς και στους θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης φαίνονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.6. Στον ίδιο πίνακα επίσης αναγράφονται οι προβλεπόµενοι χρόνοι συγκράτησης όταν οι παράµετροι c 1, c 2, c 3 της Εξ. (21) προσδιορίζονται άµεσα από τα ισοκρατικά δεδοµένα του Πίνακα Α.ΙIΙ.3. Είναι φανερό ότι η χρήση των χρωµατογραφικών δεδοµένων που πάρθηκαν υπό συνθήκες βαθµωτών µεταβολών ή υπό συνθήκες βαθµωτών και ισοκρατικών µεταβολών παρέχουν πολύ καλύτερες προβλέψεις, όσο αφορά τους χρόνους συγκράτησης, ενώ οι προβλέψεις που προέρχονται µόνο από ισοκρατικά δεδοµένα είναι χειρότερες. Και ο λόγος µπορεί να είναι ο ακόλουθος: Υπάρχουν τρεις κύριες αιτίες σφαλµάτων που µπορούν να οδηγήσουν σε µεγάλες αποκλίσεις ανάµεσα στους προβλεπόµενους και στους πειραµατικούς χρόνους συγκράτησης. Αυτές οι αιτίες έχουν να κάνουν µε πειραµατικά σφάλµατα που οφείλονται στα όργανα λήψης των χρωµατογραφηµάτων, µε επιδράσεις µη ισορροπίας της στήλης ή µπορεί να οφείλονται σε απόκλιση της ισοκρατικής συµπεριφοράς από το µοντέλο της Εξ. (21) [18]. Στην περίπτωσή µας, µπορούµε να αποκλείσουµε τα πειραµατικά σφάλµατα λόγω οργάνων οπότε πρέπει να ερευνήσουµε τις άλλες δύο αιτίες. Η µη ισορροπία της στήλης είναι αποτέλεσµα της µεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης µε το χρόνο κατά την διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης. Όµως, η επίδραση της µη ισορροπίας θα πρέπει να είναι πιο έντονη όταν χρησιµοποιούνται ισοκρατικά δεδοµένα προκειµένου να υπολογίστούν οι χρόνοι συγκράτησης στις διάφορες βαθµωτές εκλούσεις, και αυτό γιατί τα ισοκρατικά δεδοµένα παρέχονται υπό συνθήκες ισορροπίας της στήλης, ενώ φαινόµενα µη ισορροπίας µπορούν να εµφανιστούν κατά τη διάρκεια των βαθµωτών εκλούσεων. Αντίθετα, περιµένουµε µείωση των συγκεκριµένων σφαλµάτων όταν χρησιµοποιούνται δεδοµένα από βαθµωτές εκλούσεις για την πρόβλεψη ενός άλλου τύπου βαθµωτής µεταβολής όπως είναι ο βέλτιστος τύπος βαθµωτής µεταβολής λόγω του ότι οι συνθήκες που επικρατούν τότε είναι 155

161 παρόµοιες. Όσον αφορά το µοντέλο της Εξ. (21), αν χρησιµοποιηθεί ένας περιορισµένος αριθµός πειραµατικών δεδοµένων για τον υπολογισµό των c 1, c 2, c 3 (τρία σηµεία στην δική µας περίπτωση), υπάρχει µία µεγάλη πιθανότητα να γίνει λάθος κατά τον υπολογισµό των τιµών του k ϕ για δύο λόγους. Πρώτα, η Εξ. (21) µπορεί να µη αποτελεί το κατάλληλο µοντέλο για τον υπολογισµό του k ϕ και, δεύτερον, όταν τα δεδοµένα που χρησιµοποιούνται για τον υπολογισµό των c 1, c 2, c 3 είναι πολύ περιορισµένα (τρία), κάθε πειραµατικό σφάλµα σε αυτά τα δεδοµένα επηρεάζει σηµαντικά την ακρίβεια του υπολογισµού της τιµής του k ϕ. Είναι φανερό ότι κάθε σφάλµα στην τιµή του k ϕ προκαλεί σφάλµα και στην πρόβλεψη της τιµή του t R µέσω των Εξ. (14), (17), (18) ή (2). Τα σφάλµατα που συνδέονται µε την Εξ. (21) µειώνονται αν η διασπορά των χρόνων συγκράτησης που χρησιµοποιούνται για τον υπολογισµό των c 1, c 2, c 3 είναι σχετικά µικρή, µία προϋπόθεση που πρέπει να εκπληρώνεται όταν χρησιµοποιούνται δεδοµένα από βαθµωτές εκλούσεις για τους συγκεκριµένους υπολογισµούς. Πρέπει να διευκρινιστεί ότι η πρόβλεψη σύµφωνα µε τις εξισώσεις που αναπτύσσονται σε αυτό το κεφάλαιο είναι πολύ καλή µε την προϋπόθεση ότι η προβλεπόµενη τιµή του χρόνου συγκράτησης της αναλυόµενης ουσίας είναι κοντά µε τις αντίστοιχες τιµές των βαθµωτών εκλούσεων που χρησιµοποιούνται για τον υπολογισµό των παραµέτρων της Εξ. (21). Σε αυτή τη περίπτωση το σφάλµα των προβλεπόµενων τιµών είναι συνήθως µικρότερο από 1% και µπορεί να αυξηθεί σηµαντικά αν η προαναφερόµενη προϋπόθεση δεν εκπληρώνεται. Αυτό φαίνεται και στον Πίνακα Α.ΙIΙ.7, στον οποίο καταγράφονται οι προβλεπόµενοι χρόνοι συγκράτησης των αναλυόµενων ουσιών που εκλούονται µετά τα 5 λεπτά υπό τους τύπους βαθµωτής έκλουσης που αναφέρονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.2. Ο υπολογισµός των παραµέτρων της Εξ. (21) για ένα συγκεκριµένο τύπο βαθµωτής έκλουσης βασίζεται στα δεδοµένα των άλλων δύο βαθµωτών εκλούσεων του Πίνακα Α.ΙIΙ.2 και στα αντίστοιχα δεδοµένα του βέλτιστου τύπου βαθµωτής έκλουσης. Εύκολα µπορεί κανείς να παρατηρήσει ότι οι µεγαλύτερες αποκλίσεις ανάµεσα στους 156

162 πειραµατικούς και στους θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης εµφανίζονται όταν οι προβλεπόµενες τιµές βρίσκονται σε περιοχή διαφορετική από εκείνη των αντίστοιχων τιµών των βαθµωτών εκλούσεων που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό των παραµέτρων c 1, c 2, c 3 της Εξ.(21). Για τον ίδιο λόγο, είναι σχετικά αδύνατο να προβλέψουµε αξιόπιστα ισοκρατικά δεδοµένα από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης, όπως φαίνεται ξεκάθαρα στον Πίνακα Α.ΙIΙ.8. Τέλος, πρέπει να αναφερθεί ότι η σηµασία της κατάλληλης επιλογής της εξίσωσης που θα περιγράψει την ισοκρατική συµπεριφορά των χρωµατογραφούµενων ουσιών, όπως επίσης και η δυνατότητα χρήσης µιας πιο απλή εξίσωσης, όπως η γραµµική εξάρτησης του ln k ως προς φ, έχει συζητηθεί λεπτοµερώς στην [1]. Έχει αποδειχθεί ότι, ανάλογα µε το σύστηµα, η γραµµική εξάρτηση του ln k ως προς φ συνήθως καταλήγει σε µη αποδεκτές προβλέψεις εκτός και αν η συνολική διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης είναι πολύ µικρή. Όµως, αν η πρόβλεψη βασίζεται σε δεδοµένα από βαθµωτές εκλούσεις, όπως προτείνεται στο παρόν κεφάλαιο, και η περιοχή αυτών των χρωµατογραφικών δεδοµένων είναι µικρή, τότε η γραµµική εξάρτηση µπορεί να δώσει αρκετά ικανοποιητικές προβλέψεις. Έτσι, αν εφαρµόσουµε την Εξ. (21) µε c 3 = στα δεδοµένα των τριών βαθµωτών εκλούσεων του Πίνακα Α.ΙIΙ.3, παρατηρούµε ότι το µέσο επί τοις εκατό σφάλµα ανάµεσα στους πειραµατικούς και στους θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης για το βέλτιστο τύπο βαθµωτής έκλουσης αυξάνεται από.78% (βλ. Πίνακα Α.ΙIΙ.6) σε 2.1%, κάτι που ακόµη όµως παραµένει να είναι µία καλή πρόβλεψη. Ωστόσο, γενικά δεν γνωρίζουµε εκ των προτέρων αν τα δεδοµένα βαθµωτών εκλούσεων που θα χρησιµοποιήσουµε για τον υπολογισµό των c 1, c 2, c 3 θα είναι στην ίδια περιοχή ή όχι ή αν θα πρέπει να χρησιµοποιήσουµε ισοκρατικά δεδοµένα ή δεδοµένα από βαθµωτές µεταβολές για να προβλέψουµε τον βέλτιστο διαχωρισµό. Για αυτό το λόγο η χρήση της τριπαραµετρικής Εξ. (21) θα µας εξασφαλίσει πολύ καλές προβλέψεις σε κάθε περίπτωση. 157

163 Πίνακας Α.ΙIΙ.7. Θεωρητικοί χρόνοι συγκράτησης (σε λεπτά) των αναλυόµενων ουσιών του Πίνακα Α.ΙIΙ.3 για τους τύπους βαθµωτής έκλουσης που αναγράφονται στον Πίνακα Α.ΙIΙ.2, και τα αντίστοιχα επί τοις εκατό σφάλµατα (%) ανάµεσα στους θεωρητικούς και στους πειραµατικούς χρόνους συγκράτησης. ουσία t R (1) % t R (2) % t R (3) % met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr trp Μέσος όρος = Πίνακας Α.ΙIΙ.8. Θεωρητικοί χρόνοι συγκράτησης (σε λεπτά) υπό ισοκρατικές συνθήκες χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους c i του Πίνακα Α.ΙIΙ.4. Ουσία t ϕ (ϕ=) % t ϕ (ϕ=.1) % t ϕ (ϕ=.6) % met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr trp Μέσος όρος =

164 Α.IIΙ.6 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συνοψίζοντας, τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τη µελέτη της βελτιστοποίησης µε τη χρήση γενετικών αλγορίθµων του διαχωρισµού µίγµατος ελεύθερων αµινοξέων υπό συνθήκες πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης, καταλήγουµε στα παρακάτω συµπεράσµατα : 1. Στο κεφάλαιο αυτό της διδακτορικής διατριβής, για πρώτη φορά αναπτύχθηκε ένας γενετικός αλγόριθµος κατάλληλος για τη βελτιστοποίηση ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού υπό συνθήκες πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης. Μέχρι σήµερα, το πρόγραµµα προσοµοίωσης δεδοµένων HPLC µε στόχο τη βελτιστοποίηση ενός διαχωρισµού, που κυκλοφορεί στο εµπόριο και χρησιµοποιείται κατά κόρον, το DryLab, βασίζεται στο συνδυασµό γραµµικής βαθµωτής έκλουσης µε µία γραµµική µεταβολή του ισοκρατικού lnk ως προς το φ. Σε µια πρόσφατη εργασία που έγινε στο εργαστήριό µας, αναφορά [1], είχαµε άρει τον περιορισµό της γραµµικής εξάρτησης του lnk ως προς φ διαιρώντας την καµπύλη του lnk φ σε ένα πεπερασµένο αριθµό γραµµικών τµηµάτων, όµως η βελτιστοποίηση του διαχωρισµού περιοριζόταν σε µία απλή γραµµική βαθµωτή µεταβολή του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση. Η επέκταση της παραπάνω µεθόδου (αναφορά [1]) σε πολυγραµµική βαθµωτή έκλουση, έγινε µε επιτυχία στο κεφάλαιο αυτό της διδακτορικής διατριβής. 2. Ο γενετικός αλγόριθµος που αναπτύχθηκε για τη βελτιστοποίηση ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού υπό συνθήκες πολυγραµµικής βαθµωτής έκλουσης εφαρµόστηκε σε ένα µίγµα 15 ελεύθερων αµινοξέων και συγγενών ενώσεων και µε κινητές φάσεις τροποποιηµένες µε MeCN. Συγκεκριµένα χρησιµοποιήθηκαν 13 αµινοξέα : his, crn, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp,n-tyr και trp, ένα διπεπτίδιο, η car, και η cre. 3. Τα 15 αµινοξέα συγγενείς ενώσεις που χρησιµοποιήθηκαν στο µέρος αυτό της διδακτορικής διατριβής είναι τα ίδια µε αυτά που 159

165 χρησιµοποιήθηκαν στο προηγούµενο κεφάλαιο, Α.IΙ, όπου µελετήθηκε αναλυτικά η ανίχνευση τους µε τη χρήση σε σειρά των ανιχνευτών UV, ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή µε µακρο και µικρο ηλεκτρόδιο και φθορισµοµετρικού ανιχνευτή. Στο κεφάλαιο αυτό, η ανάλυση των χρωµατογραφικών δεδοµένων των παραπάνω ουσιών έγινε αποκλειστικά από τους χρόνους συγκράτησης που καταγράφηκαν στα 2nm του UV. 4. Από τα 15 αµινοξέα συγγενείς ενώσεις που µελετήθηκαν στο κεφάλαιο αυτό, οι 5 ενώσεις his, car, cre, crn και hcy συγκρατούνται πολύ λίγο από την χρωµατογραφική στήλη αντίστροφης φάσης, δηλαδή εκλούονται πολύ µπροστά στα καταγραφόµενα χρωµατογραφήµατα, και συνεπώς για αυτά δεχθήκαµε µία γραµµική εξάρτηση του lnk ως προς το φ που υπολογίστηκε εύκολα µε το πρόγραµµα Solver του Excel. Για τα υπόλοιπα 1 αµινοξέα προσαρµόσαµε τους χρόνους συγκράτησης τους, που πάρθηκαν υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης ή/και υπό ισοκρατικές συνθήκες, στην εξίσωση k φ = exp((c 1 -c 2 φ/(1+c 2 φ)), (Εξ. (21) του κειµένου), και οι παράµετροι c 1, c 2, c 3 υπολογίστηκαν µε έναν κατάλληλο γενετικό αλγόριθµο ή/και έναν τροποποιηµένο Levenberg-Marquardt αλγόριθµο. 5. Ο προσδιορισµός των παραµέτρων c 1, c 2, c 3 της Εξ. (21) απευθείας από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης, τα οποία χρησιµοποιούνται περαιτέρω για την πρόβλεψη του βέλτιστου τύπου βαθµωτής έκλουσης, παρουσιάζει τα ακόλουθα πλεονεκτήµατα : α. Μικρότερος χρόνος πειραµάτων διότι χρησιµοποιούνται δεδοµένα από βαθµωτές εκλούσεις και όχι ισοκρατικά. β. Μείωση των σφαλµάτων που προέρχονται από φαινόµενα µη ισορροπίας της στήλης λόγω του ότι χρησιµοποιούνται οι ίδιες πειραµατικές συνθήκες βαθµωτής έκλουσης για την εύρεση των δεδοµένων που θα χρησιµοποιηθούν στην πρόβλεψη του βέλτιστου τύπου βαθµωτής έκλουσης. γ. Μείωση των σφαλµάτων που συνδέονται µε το µοντέλο της Εξ. (21) που περιγράφει την ισοκρατική συµπεριφορά των ουσιών. Η διασπορά των χρόνων συγκράτησης µιας αναλυόµενης ουσίας, υπό 16

166 συνθήκες βαθµωτών εκλούσεων, που χρησιµοποιούνται για τον προσδιορισµό των παραµέτρων της Εξ. (21) είναι πολύ µικρότερη από ότι αν χρησιµοποιούσαµε ισοκρατικά δεδοµένα, και αυτή η ιδιότητα ελαττώνει τα σφάλµατα που εισάγονται από την Εξ. (21). Βέβαια µια βασική προϋπόθεση που πρέπει να λαµβάνεται υπόψη για προβλέψεις υψηλής ακρίβειας είναι η ακόλουθη. Η προβλεπόµενη τιµή του χρόνου συγκράτησης της προς µελέτη ουσίας, θα πρέπει να βρίσκεται στην περιοχή των αντίστοιχων τιµών των χρόνων συγκράτησης που παίρνονται υπό βαθµωτές συνθήκες που χρησιµοποιούνται για τον υπολογισµό των παραµέτρων της Εξ. (21). Αν κάτι τέτοιο δεν ισχύει, µπορούν να αντικατασταθούν τα δεδοµένα από έναν τύπο βαθµωτής έκλουσης, από κατάλληλα δεδοµένα µιας ισοκρατικής έκλουσης ή µπορούν να προστεθούν τα συγκεκριµένα δεδοµένα ισοκρατικής έκλουσης στα δεδοµένα των βαθµωτών εκλούσεων ώστε να εκπληρώνεται η προαναφερόµενη προϋπόθεση. 6. Η µελέτη της βελτιστοποίησης ενός χρωµατογραφήµατος διαχωρισµού βασισµένη πάνω σε χρόνους συγκράτησης που πάρθηκαν υπό άλλες συνθήκες βαθµωτής έκλουσης, συνεχίστηκε και ολοκληρώθηκε στο κεφάλαιο Β.Ι. της παρούσας διατριβής. 161

167 Α.IΙI.7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, J. Chromatogr. A, 168 (25) 279. [2] P. Jandera and J. Churacek, Gradient Elution in Liquid Chromatography. Theory and Practice, Elsevier, Amsterdam, [3] C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, [4] L.R. Snyder in High Performance Liquid Chromatography, Cs. Horvath (Ed.), Academic Press, New York, 198 [4] L.R. Snyder, J. Chromatogr. 13 (1964) 415. [5] L.R. Snyder, Chromatogr. Rev., 7 (1965) 1. [6] L.R. Snyder and D.L. Saunders, J. Chromatogr. Sci., 7 (1969) 145. [7] P.J. Schoenmakers, H.A.H. Billiet, R. Tijssen, J. Chromatogr., 149 (1978) 519. [8] M.A. Quarry, R.L. Grob, L.R. Snyder, Anal. Chem. 58 (1986) 97. [9] L.R. Snyder, J.W. Dolan and J.R. Gant, J. Chromatogr. 165 (1979) 1. [1] L.R. Snyder, J.W. Dolan and J.R. Gant, J. Chromatogr. 165 (1979) 31. [11] L.R. Snyder, M.A. Stadalious and M.A. Quarry, Anal. Chem., 55 (1983) 1412A. [12] J.W. Dolan, L.R. Snyder and M.A. Quarry, Chromatographia, 24 (1987) 261. [13] B.F.D. Ghrist, B.S. Coopermann and L.R.Snyder, J. Chromatogr. 459 (1988) 1. [14] B.F.D. Ghrist, B.S. Coopermann and L.R.Snyder, J. Chromatogr. 459 (1988) 25. [15] B.F.D. Ghrist, B.S. Coopermann and L.R.Snyder, J. Chromatogr. 459 (1988) 43. [16] L.R. Snyder, J.W. Dolan and D.C. Lammen and, J. Chromatogr. 485 (1989) 65. [17] J.W. Dolan, D.C. Lammen and L.R. Snyder, J. Chromatogr. 485 (1989)

168 [18] L.R. Snyder and J.W. Dolan, Adv. Chromatogr. 38 (1998) 115. [19] A. Pappa-Louisi, P. Nikitas, P. Balkatzopoulou, C. Malliakas, J. Chromatogr. A, 133 (24) 29. [2] D.E Goldberg, Genetic algorithms in search, optimization and machine learning, Addison-Wesley, Reading, [21] Z. Michalewicz, Genetic algorithms + data structures = Evolution Programs, Springer, Berlin, [22] R.L. Haupt, S.H. Haupt, Practical genetic algorithms, John Wiley & Sons, New York, [23] B. Andeginste, D. Massart, L. Buydens, S. De Jong, P. Lewi, J. Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part B, Elsevier, Amsterdam, [24] P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, A. Papageorgiou, A. Zitrou, J. Chromatogr. A, 942 (22) 93. [25] P. Nikitas, A. Papageorgiou, A. Comput. Phys. Commun., 141 (21) 225. [26] C.A. Coello Coello, D.A. Van Veldhuizen, G.B. Lamont, Evolutionary Algorithms for Solving Multi-Objective Problems, Kluwer Academic Publishing, New York, 22. [27] R.Cela, J.A. Martìnez, C. González-Barreiro, M.Lores, Chemom. Intell. Lab. Syst., 63 (23) 137 [28] N.H. Beltran, M.A. Duarte-Mermoud, S.A. Salah, M.A. Bustos, A.I. Pena-Neira, E.A. Loyola, J.W. Jalocha, J. Food Eng., 67 (25) 483. [29] W.H. Press, S.A. Teukolsky, W.T. Vetterling, B. P. Flannery, Numerical Recipes in C, Second Edition, Cambridge University Press, Cambridge, [3] P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, Chromatographia, 52 (2) 477. [31] V. Kvasnicka, J. Pospichal, Chemom. Intel. Lab. Syst., 39 (1997)

169 164

170 Α.ΙV ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΤΗΣ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Α.ΙV.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σε προηγούµενη εργασία είχαν ελέγθεί στο εργαστήριό µας οι βασικές εξισώσεις που ισχύουν στη βηµατική βαθµωτή έκλουση στην υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης για το διαχωρισµό ενός µίγµατος κατεχολαµινών χρησιµοποιώντας υδατικές κινητές φάσεις µε την παρουσία µεθανόλης ή ακετονιτριλίου ως οργανικών τροποποιητών [1]. Σε όλες τις περιπτώσεις η πρόβλεψη των χρόνων έκλουσης των ουσιών ήταν ικανοποιητικά ακριβής. Στη συνέχεια, έγινε αντίστοιχη µελέτη και για τη µέθοδο της γραµµικής βαθµωτής έκλουσης [2] καθώς επίσης και για την πολυγραµµική βαθµωτή έκλουση που αναφέρεται στο προηγούµενο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής, από όπου και προέκυψε η δηµοσίευση [3]. Η ακρίβεια της πρόβλεψης της συγκράτησης των ουσιών κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως είναι [4-8] α. ο ακριβής προσδιορισµός του dwell-time, t D, δηλαδή του χρόνου που χρειάζεται ώστε η κινητή φάση να φτάσει από τον µίκτη στην αρχή της στήλης, β. ο ακριβής προσδιορισµός της ισοκρατικής συµπεριφοράς των εκλουόµενων ουσιών, γ. η πιθανή παραµόρφωση της προγραµµατισµένης µορφής βαθµωτής έκλουσης, δ. η ισορροπία της στήλης κατά τη διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες θα πρέπει να ληφθούν σοβαρά υπόψη προκειµένου να προβλεφτούν µε ακρίβεια οι χρόνοι έκλουσης των ουσιών και συνεπώς να µπορούµε να προχωρήσουµε στη συνέχεια στη βελτιστοποίηση ενός διαχωρισµού. Στο εργαστήριό µας έχουν γίνει µέχρι σήµερα προκαταρκτικές µελέτες πάνω στην πρόβλεψη της συγκράτησης ουσιών σε 165

171 συνθήκες βαθµωτής έκλουσης, και αυτό που παρατηρήθηκε είναι ότι υπάρχει απόλυτη συµφωνία ανάµεσα στους θεωρητικούς και στους πειραµατικούς χρόνους έκλουσης των ουσιών όταν σαν κινητές φάσεις χρησιµοποιούνται υδατικά διαλύµατα µεθανόλης (MeOH) και ακετονιτριλίου (MeCN) ενώ υπήρχαν µεγάλες αποκλίσεις όταν χρησιµοποιούνταν υδατικά διαλύµατα ισοπροπανόλης (iproh). Από τις παραµέτρους οι οποίες µπορούν να επηρεάζουν την πρόβλεψη του χρόνου έκλουσης και που αναφέρθηκαν παραπάνω, οι τρεις πρώτοι είναι είτε ανεξάρτητοι από τον οργανικό διαλύτη που χρησιµοποιούµε στην κινητή φάση είτε µπορούν να ελεγχθούν πολύ εύκολα. Κατά συνέπεια παραµένει ο τέταρτος παράγοντας, δηλαδή η ισορροπία της στήλης κατά τη διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης, ο οποίος θα µπορούσε να είναι υπεύθυνος για τις αποκλίσεις που αναφέρθηκαν πιο πάνω και ο οποίος θα πρέπει να µελετηθεί συστηµατικά. Το γεγονός ότι η στήλη πιθανόν δεν προλαβαίνει να ισορροπήσει κατά τη διάρκεια µιας βαθµωτής έκλουσης, µπορεί να αποδοθεί σε διάφορες αιτίες από τις οποίες οι πιο σηµαντικές είναι [5] : α) Η στήλη δεν έχει προλάβει να ισορροπήσει µε την αρχική κινητή φάση. Το φαινόµενο αυτό είναι πιο έντονο όταν σαν αρχική κινητή φάση χρησιµοποιείται το καθαρό νερό [5-7]. β) Στη στατική φάση της στήλης προσροφώνται κατά προτίµηση τα µόρια του οργανικού διαλύτη και όχι του νερού µε αποτέλεσµα η κινητή φάση για ένα χρονικό διάστηµα να φαίνεται ότι είναι µικρότερης συγκέντρωσης σε οργανικό τροποποιητή από ότι προγραµµατίζεται να είναι κατά τη διάρκεια µιας βαθµωτής έκλουσης. Το φαινόµενο αυτό στη βιβλιογραφία αναφέρεται σαν «Solvent demixing» [7-15]. γ) Αργές αλλαγές στη διαµόρφωση των αλκυλικών αλυσίδων της στατικής φάσης οι οποίες οφείλονται στη µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης [16,17]. δ) Μεταβολή στη δοµή των µορίων των εκλουόµενων ουσιών λόγω της µεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης [18-2]. Στόχος αυτού του κεφαλαίου είναι να µελετήσουµε τη συµπεριφορά της στήλης στην υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης κατά 166

172 την εφαρµογή της τεχνικής της βαθµωτής έκλουσης (gradient elution), και πιο συγκεκριµένα να µελετήσουµε αν η στήλη προλαβαίνει να ισορροπήσει κατά τη διαρκή µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης καθώς και τις επιπτώσεις που θα προκαλούσε η πιθανή µη ισορροπία της. Για το σκοπό αυτό εφαρµόστηκαν οι βασικές εξισώσεις που περιγράφουν τη βαθµωτή γραµµική (linear) και βηµατική (step) έκλουση σε ένα µίγµα µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων χρησιµοποιώντας ως κινητές φάσεις υδατικά διαλύµατα iproh, MeCN και MeOH. Επίσης, ο σκοπός της συγκεκριµένης µελέτης δεν εστιάζεται τόσο στη µελέτη του µηχανισµού που προκαλεί αυτά τα φαινόµενα αλλά στην εύρεση ενός τρόπου µε τον οποίο να είναι εφικτό να προβλεφθούν καλύτερα οι χρόνοι συγκράτησης των ουσιών σε συνθήκες βαθµωτής έκλουσης µε προβλήµατα ισορροπίας και κατά συνέπεια να είναι εφικτό να βελτιστοποιηθεί ο διαχωρισµός των µελετούµενων µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων κάτω από συνθήκες µη ισορροπίας. Α.ΙV.2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η συσκευή υγρής χρωµατογραφίας υψηλής πίεσης αποτελείται από µία αντλία Shimadzu LC-2AD, από βαλβίδα µοντέλου 7125 για την εισαγωγή του δείγµατος σε loop των 2µL (Rheodyne, Cotati, CA), από έναν ανιχνευτή UV (Shimadzu SPD-1A) καθώς και από έναν ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή συνδεδεµένο σε σειρά µε το UV. Όσον αφορά τις στήλες, χρησιµοποιήθηκαν δύο διαφορετικές MZ-Analytical στήλες 5µm, µια Aqua Perfect στήλη C18 25x4.6 mm µε νεκρό χρόνο (hold-up time) t o = 2.67 min και µία Inertsil ODS-3 στήλη 25x4 mm µε t o = 1.8 min. Οι κινητές φάσεις που χρησιµοποιήθηκαν ήταν υδατικά φωσφορικά 167

173 διαλύµατα (ph=2.5) µε την παρουσία διαφόρων οργανικών τροποποιητών, iproh, MeCN και MeOH, διαφόρων % συγκεντρώσεων ή πηλίκου όγκου, φ. Ως διαλυµένες ουσίες χρησιµοποιήθηκαν 1 µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα, τα οποία ήταν τα εξής : L-µεθειονίνη (met), β-(3,4-δι-ύδροξυφαίνυλο)-l-αλανίνη (dopa), L-τυροσίνη (tyr), DL-m-τυροσίνη (m-tyr), L- a-µέθυλο-dopa (me-dopa), L-φαινυλαλανίνη (phe), DL-α-µέθυλοτυροσίνη (me-tyr), 5-υδροξυ-τρυπτοφάνη (5htp), 3-νιτρο-L- τυροσίνη (ntyr), and L-τρυπτοφάνη (trp). Η συγκέντρωση των ουσιών στις µελέτες µας ήταν 1 µg/ml. Η ανίχνευσή τους έγινε καταγράφοντας πάντα δύο σήµατα, ή την απορρόφηση σε δύο µήκη κύµατος του UV, στα 2 και 21 nm ταυτόχρονα, ή την απορρόφηση στο UV στα 2 nm και το σήµα στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή στο 1.1V ως προς Ag/AgCl. Η ταχύτητα ροής που χρησιµοποιήθηκε ήταν 1 ml/min. Ο χρόνος t D υπολογίστηκε καταγράφοντας την καµπύλη απορρόφησης στο UV σε µήκος κύµατος 23 nm κατά τη διάρκεια ενός απλού βήµατος κατά το οποίο η συγκέντρωση της µεθανόλης από φ=.2 γίνεται απευθείας φ=. Για να ελέγξουµε την επίδραση του t D στην ισορροπία της χρωµατογραφικής στήλης χρησιµοποιήσαµε δύο διαφορετικές διαµορφώσεις του µίκτη των διαλυτών, όπου ο ένας έδινε t D = 1.1 min και ο δεύτερος t D = 4.6 min. Σε αυτό το σηµείο πρέπει να σηµειωθεί ότι πριν την έναρξη µιας βαθµωτής έκλουσης η στήλη αφήνοταν πολύ ώρα για να ισορροπήσει στην αρχική κινητή φάση, περίπου 3 min και ακόµη περισσότερο όταν η αρχική κινητή φάση ήταν καθαρά υδατική. Ο έλεγχος ότι η στήλη έχει ισορροπήσει γινόταν µε 3 τρόπους : α) από την καταγραφόµενη πίεση, β) από τη βασική γραµµή του UV αν έχει σταθεροποιηθεί και γ) από τους χρόνους έκλουσης των ουσιών που βγαίνουν νωρίς, και οι οποίοι χρόνοι θα πρέπει να είναι ίδιοι κάθε φορά που χρησιµοποιούταν η ίδια αρχική κινητή φάση και να µην επηρεάζονται από τις συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. 168

174 Α.ΙV.3 ΑΝΑΛΥΣΗ Ε ΟΜΕΝΩΝ Ο χρόνος συγκράτησης της αναλυόµενης ουσίας, t R, µπορεί να υπολογιστεί µε τη βοήθεια της βασικής εξίσωσης (1) που ισχύει στη βαθµωτή έκλουση, αφού λάβουµε υπόψη την προσέγγιση που περιγράφεται στην [21] t R t t D dt td + = 1 (1) t k t k ϕ ϕ in όπου t είναι ο νεκρός χρόνος της στήλης, δηλαδή ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση να διανύσει τη στήλη, t D είναι ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση για να διανύσει τη διαδροµή από τον µίκτη µέχρι την αρχή της στήλης, ο οποίος στη βιβλιογραφία αναφέρεται ως dwell time, t R είναι ο χρόνος συγκράτησης της αναλυόµενης ουσίας υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης, k ϕ είναι ο παράγοντας συγκράτησης της ουσίας όταν η σύσταση της κινητής φάσης είναι φ, and k φin είναι ο παράγοντας συγκράτησης της ουσίας στην αρχική κινητή φάση. Η εξίσωση (1) µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον υπολογισµό του t R ανεξάρτητα από τον τύπο της βαθµωτής έκλουσης. Παρόλα αυτά, στη περίπτωση όπου έχουµε βηµατική βαθµωτή έκλουση µε p βήµατα, το t R µπορεί να υπολογιστεί πιο εύκολα από την Εξ. (2) [1] k k ϕ1 ϕn t R = ( t D + t1 ) + t 2 kϕ 1 k ϕ2 k k ϕ2 ϕn + + t( n 1 ) k ϕ ( n 1 ) k ϕ k ( n 1 ) ϕ n + t ( 1+ k ϕ ) (2) n όπου το n προσδιορίζεται από τις ανισότητες ( t 1 t + t k D ) t + t k 2 t n + + t k ϕ1 ϕ2 1 ϕn 1 < 1 ( t1 + t D ) t 2 t n και t k t k t k ϕ1 ϕ2 ϕn (3) όπου το t i εκφράζει τη διάρκεια του βήµατος i κατά το οποίο η συγκέντρωση της κινητής φάσης είναι ϕ i, και k φi είναι ο παράγοντας 169

175 συγκράτησης της ουσίας για τη συγκεκριµένη σύσταση της κινητής φάσης. Το σύστηµα των ανισοτήτων (3) χρησιµοποιείται για n>1. Αν n = 1, εξετάζεται µόνο η δεύτερη ανισότητα από τις ανισότητες (3), η οποία αν ικανοποιείται, το t R υπολογίζεται µε την βοήθεια της εξίσωσης (2). Αν όµως καµία από τις συνθήκες των ανισοτήτων (3) δεν ικανοποιείται, η προς ανάλυση ουσία εκλούεται κατά τη διάρκεια του τελευταίου βήµατος, p, και το t R µπορεί να υπολογιστεί πάλι από την εξίσωση (2), όπου το n αντικαθίσταται από το p. To k φi που περιγράφει την ισοκρατική συµπεριφορά των εκλουόµενων ουσιών περιγράφεται από την παρακάτω εξίσωση [22]: k i cϕ = exp{ a i 1 + b ϕ } ϕ (4) i όπου οι παράµετροι a, b, και c αποτελούν προσαρµόσιµες παραµέτρους οι οποίες µπορούν να υπολογιστούν από ισοκρατικά δεδοµένα. Ο προσδιορισµός αυτών των παραµέτρων από ισοκρατικά δεδοµένα πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια του αλγόριθµου Levenberg-Marquart ο οποίος τροποποιήθηκε κατάλληλα. Α.ΙV.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α.ΙV.4.1 ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Αρχικά µελετήθηκε η ισοκρατική συµπεριφορά των αµινοξέων χρησιµοποιώντας ως κινητές φάσεις υδατικά διαλύµατα iproh, MeCN και MeOH, σε δύο διαφορετικά χρωµατογραφικά συστήµατα µε διαφορετικό t D και διαφορετικές στήλες. Τα ισοκρατικά δεδοµένα παρέχουν τις απαραίτητες πληροφορίες προκειµένου να προβλεφθούν οι χρόνοι 17

176 συγκράτησης των ουσιών κάτω από διαφορετικές συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. Οι ισοκρατικοί χρόνοι συγκράτησης των ουσιών που πάρθηκαν στα διαφορετικά χρωµατογραφικά συστήµατα και στις διαφορετικές συνθήκες δίνονται στους Πίνακες Α.ΙV.1 και Α.ΙV.2. Στα Σχήµατα Α.ΙV.1-Α.ΙV.4 δίνονται ενδεικτικά µερικά χρωµατογραφήµατα τα οποία πάρθηκαν κάτω από ισοκρατικές συνθήκες. Συγκεκριµένα, στο Σχήµα Α.ΙV.1 η κινητή φάση είναι καθαρά υδατική, στο Σχήµα Α.ΙV.2 η κινητή φάση περιέχει 1% iproh, στο Σχήµα Α.ΙV.3 η κινητή φάση περιέχει 3% MeCN και τέλος στο Σχήµα Α.ΙV.4 η κινητή φάση περιέχει 7.5% MeOH. Όλα τα χρωµατογραφήµατα πάρθηκαν καταγράφοντας την απορρόφηση του UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2 και στα 21 nm, για καλύτερη ταυτοποίηση των ουσιών. Στη συνέχεια από τα ισοκρατικά δεδοµένα και µε τη βοήθεια του αλγόριθµου Levenberg-Marquart υπολογίστηκαν οι προσαρµόσιµες παράµετροι a, b, c της Εξ. (4) για τους τρεις οργανικούς τροποποιητές. Η συνάρτηση κόστους η οποία ελαχιστοποιήθηκε µέσω του συγκεκριµένου αλγόριθµου ήταν η εξής : f N = Σ i = 1 ( ln k ln k ) 2 (exp) ( calc ) (5) όπου Ν είναι ο αριθµός των πειραµατικών σηµείων, lnk (exp) είναι ο πειραµατικός συντελεστής συγκράτησης µιας συγκεκριµένης ουσίας και lnk (calc) είναι ο θεωρητικός συντελεστής συγκράτησης της ουσίας που υπολογίστηκε από την Εξ.(4). Στους Πίνακες Α.ΙV.3 και Α.ΙV.4 δίνονται οι τιµές των παραµέτρων a, b, c που προέκυψαν από την προσαρµογή των ισοκρατικών δεδοµένων που πάρθηκαν στη στήλη Aqua Perfect και Inertsil, αντίστοιχα, καθώς και η ελάχιστη τιµή της f, f(min). Παρατηρούµε ότι η περιγραφή των ισοκρατικών δεδοµένων από την Εξ. (4) είναι ικανοποιητική, όπως προκύπτει από την µικρή τιµή της συνάρτησης f. 171

177 Πίνακας Α.ΙV.1 : Ισοκρατικοί χρόνοι συγκράτησης (min) των αµινοξέων στη στήλη Aqua Perfect (t D = 1.1 min) χρησιµοποιώντας κινητές φάσεις µε οργανικούς τροποποιητές iproh, MeCN ή MeOH. iproh MeCN MeOH ουσία ϕ = met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Πίνακας Α.ΙV.2 : Ισοκρατικοί χρόνοι συγκράτησης (min) των αµινοξέων στη στήλη Inertsil (t D = 4.6 min) χρησιµοποιώντας κινητή φάση µε οργανικό τροποποιητή iproh. ουσία ϕ = met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr trp

178 ,1,8,6 AU (2nm) AU(21nm) AU,4,2 -, t, min Σχήµα Α.ΙV.1 : Χρωµατογράφηµα των 9 αµινοξέων κατά σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr 5htp, n-tyr, που καταγράφηκαν σε δύο µήκη κύµατος και µε τη στήλη Aqua Perfect σε καθαρά υδατική κινητή φάση.,16,12 AU (2nm) AU(21nm) AU,8, t, min Σχήµα Α.ΙV.2 : Χρωµατογράφηµα των 9 αµινοξέων κατά σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr 5htp, n-tyr, που καταγράφηκαν σε δύο µήκη κύµατος και µε τη στήλη Aqua Perfect σε υδατική κινητή φάση που περιέχει 1% iproh. 173

179 ,3,25,2 AU (2nm) AU(21nm),15 AU,1,5 -, t, min Σχήµα Α.ΙV.3 : Χρωµατογράφηµα των 9 αµινοξέων κατά σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr 5htp, n-tyr, που καταγράφηκαν σε δύο µήκη κύµατος και µε τη στήλη Aqua Perfect σε υδατική κινητή φάση που περιέχει 3% MeCN. Η phe και η me-tyr συνεκλούονται.,3,25,2 AU(2nm) AU (21nm) AU,15,1, t, min Σχήµα Α.ΙV.4 : Χρωµατογράφηµα των 9 αµινοξέων κατά σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, που καταγράφηκαν σε δύο µήκη κύµατος και µε τη στήλη Aqua Perfect σε υδατική κινητή φάση που περιέχει 7.5% MeOH. H me-tyr και η 5htp συνεκλούονται. 174

180 Πίνακας A.IV.3 : Τιµές των προσαρµόσιµων παραµέτρων a, b, c της Εξ.(4) που προέκυψαν από ισοκρατικά δεδοµένα των αµινοξέων παρουσία (Α) iproh, (Β) MeCN και (Γ) MeOH στην κινητή φάση για τη στήλη Aqua Perfect. (A) Ουσία a b c f(min) met.3 ± ± ± E-3 dοpα.99 ± ± ± E-3 tyr 1.61 ± ± ± E-4 m-tyr 1.88 ± ± ± E-4 me-dopa 2.13 ± ± ± E-3 phe 2.31 ± ± ± E-3 me-tyr 2.74 ± ± ± E-3 5htp 2.75 ± ± ± E-3 n-tyr 3.13 ± ± ± E-4 (B) Ουσία a b c f(min) met.31 ± ± ± E-3 dοpα 1.1 ± ± ± E-2 tyr 1.62 ±.3 7.7± ± E-3 m-tyr 1.88±. 5.57±.5 4.3± E-6 me-dopa 2.14± ±.5 5.1± E-4 phe 2.32±. 5.22± ±.4 4.2E-5 me-tyr 2.75±. 5.9± ± E-7 5htp 2.76± ± ± E-3 n-tyr 3.13 ± ± ±.5 5.6E-5 (Γ) Ουσία a b c f(min) met.3 ± ± ± E-4 dοpα.99 ± ± ± E-4 tyr 1.62 ± ± ±.1 5.6E-6 m-tyr 1.88 ± ± ± E-4 me-dopa 2.14 ± ± ±.8 4.2E-4 phe 2.32 ± ± ± E-4 me-tyr 2.74 ± ± ± E-4 5htp 2.75 ± ± ± E-4 n-tyr 3.13 ± ± ± E-4 175

181 Πίνακας A.IV.4 : Τιµές των προσαρµόσιµων παραµέτρων a, b, c της Εξ.(4) που προέκυψαν από ισοκρατικά δεδοµένα των αµινοξέων παρουσία iproh στην κινητή φάση για την στήλη Inertsil. Ουσία a b c f(min) met E-11 dopa E-6 tyr E-7 m-tyr E-6 me-dopa E-6 phe E-2 me-tyr E-6 5htp E-6 n-tyr E-6 trp E-1 Α.ΙV.4.2 ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Στη συνέχεια µελετήθηκαν δύο τύποι βαθµωτής έκλουσης : γραµµική και βηµατική. Όσον αφορά τους τύπους γραµµικής έκλουσης, η συγκέντρωση του τροποποιητή αυξανόταν γραµµικά από φ= σε χρόνο t= σε φ=φ max σε χρόνους t=2, 5 και 1 min αντίστοιχα. Οι παραπάνω τύποι βαθµωτής έκλουσης συµβολίζονται ως L 1, L 2 και L 3 ανεξάρτητα από τον χρησιµοποιούµενο οργανικό τροποποιητή. Οι τιµές φ max ήταν.15 για τη MeOH,.6 για το MeCN και.2 για την iproh. Οι βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις που χρησιµοποιήθηκαν αποτελούνταν από ένα ή δύο ή και τρία βήµατα, και εφαρµόστηκαν επίσης και για τους τρεις προαναφερθέντες οργανικούς τροποποιητές. Στις βαθµωτές εκλούσεις µε ένα βήµα, το φ µεταβαλλόταν από φ= σε φ=φ max σε χρόνους t=, 2, 5, 1 και 2 min, όπου το φ max έπαιρνε τις ίδιες τιµές µε αυτές που αναφέρθηκαν στις γραµµικές βαθµωτές εκλούσεις. Οι παραπάνω εκλούσεις µονού βήµατος συµβολίζονται ως 1S 1, 1S 2, 1S 3, 1S 4 και 1S 5, αντίστοιχα. Βαθµωτές εκλούσεις διπλού και τριπλού βήµατος, οι οποίες ονοµάζονται 176

182 2S i και 3S i, πραγµατοποιήθηκαν µόνο µε την παρουσία της iproh στην κινητή φάση. Ο προγραµµατισµός όλων των βηµατικών εκλούσεων, µε την παρουσία της iproh, παρουσιάζεται στον Πίνακα Α.ΙV.5. Επιπλέον, µε την παρουσία της iproh πραγµατοποιήσαµε τις εξής βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος : σε χρόνο t=5 min το φ γινόταν από α) σε.1 (1S 6 ), β) σε.4 (1S 7 ) και γ).1 σε.4 (1S 8 ). Συνοψίζοντας, χρησιµοποιούµε τα σύµβολα 1S, 2S και 3S για τις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µονού-, διπλού- και τριπλού-βήµατος αντίστοιχα, και το σύµβολο L για γραµµικές βαθµωτές εκλούσεις ανεξάρτητα από το χρησιµοποιούµενο οργανικό τροποποιητή. Πίνακας A.IV.5 : Βαθµωτές εκλούσεις µε δύο και τρία βήµατα που χρησιµοποιήθηκαν µε την παρουσία iproh στην κινητή φάση (ο χρόνος είναι σε min). Τύπος βαθµωτής έκλουσης 2S 1 2S 2 2S 3 3S 1 3S 2 3S 3 3S 4 ϕ 1 ϕ 2 ϕ 3 ϕ 4 t 1 t 2 t Στους Πίνακες Α.ΙV.6 µέχρι Α.ΙV.13 καταγράφονται οι πειραµατικοί χρόνοι συγκράτησης των αµινοξέων που προέκυψαν από τις γραµµικές και βηµατικές εκλούσεις µονού, διπλού και τριπλού βήµατος. Αυτοί οι πίνακες περιέχουν επίσης τους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης των ουσιών, το επί τοις εκατό σφάλµα της πρόβλεψης καθώς και το µέσο όρο των σφαλµάτων. Οι θεωρητικοί χρόνοι συγκράτησης, t R(calc), υπολογίστηκαν µε την βοήθεια των Εξ. (1) ή (2) όπου ο k φi υπολογίστηκε από τα a, b και c των Πινάκων Α.ΙV.3 και Α.ΙV.4. Από τους Πίνακες Α.ΙV.6 - Α.ΙV.13 είναι φανερό ότι υπάρχει µία συστηµατική απόκλιση ανάµεσα στους πειραµατικούς και στους 177

183 προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης για τις ουσίες οι οποίες εκλούονται από την στιγµή που η αλλαγή της κινητής φάσης φτάνει στον ανιχνευτή και για τα επόµενα περίπου 5 λεπτά, η οποία αποτελεί και την προβληµατική περιοχή. Για παράδειγµα στον Πίνακα Α.ΙV.6 και για την βαθµωτή έκλουση τύπου 1S 2 για την περίπτωση της στήλης Aqua Perfect, ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση να φτάσει στον ανιχνευτή είναι ίσος µε το άθροισµα του dwell- time, t D, του νεκρού χρόνου, t, και του χρόνου που προηγείται πριν την έναρξη της βαθµωτής έκλουσης, t 1. Σε αυτήν την περίπτωση δηλαδή, ο χρόνος για να φτάσει στον ανιχνευτή η αλλαγή της κινητής φάσης είναι ίσος µε =5.77 min. Όπως λοιπόν µπορούµε να δούµε στον συγκεκριµένο πίνακα τα µεγαλύτερα σφάλµατα της πρόβλεψης εµφανίζονται στην χρονική διάρκεια µεταξύ των 5.8 min και των επόµενων περίπου 5 min. Το ίδιο παρατηρείται και στην ίδια βαθµωτή έκλουση χρησιµοποιώντας την στήλη Inertsil, η οποία έχει µεγαλύτερο t D. Πιο συγκεκριµένα, η κινητή φάση φτάνει στον ανιχνευτή σε χρόνο ίσο µε =8.4 min όπου αρχίζουν και εµφανίζονται οι πρώτες µεγάλες αποκλίσεις, οι οποίες επικρατούν µέχρι τα 13.5 min περίπου, δηλαδή διαρκούν για τα επόµενα 5 min. Από τα 5 αυτά λεπτά και έπειτα οι αποκλίσεις ελαττώνονται αισθητά και επανέρχονται σε τιµές που επιτρέπουν µία ικανοποιητική πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης. Επιπρόσθετα, παρατηρούµε ότι αυτές οι αποκλίσεις είναι µεγαλύτερες παρουσία της iproh, µικρότερες µε την παρουσία του MeCN και ακόµη µικρότερες µε την παρουσία της MeOH στην κινητή φάση. Αυτό φαίνεται και στους Πίνακες A.IV.6 - Α.ΙV.11 όπου ο µέσος όρος των σφαλµάτων, για τον ίδιο τύπο βαθµωτής έκλουσης και για τους 3 οργανικούς τροποποιητές, είναι µεγαλύτερος µε την παρουσία της iproh και µικρότερος, σχεδόν αµελητέος, µε την παρουσία της MeOH. Για παράδειγµα στη βαθµωτή έκλουση τύπου 1S 2 και για το ίδιο χρωµατογραφικό σύστηµα, ο µέσος όρος των σφαλµάτων για την iproh είναι 1.1, για το MeCN είναι 3.4 και για την MeOH είναι 1.7 (βλ. Πίνακες Α.ΙV.6, Α.ΙV.1 και Α.ΙV.11, αντίστοιχα). Παρακάτω θα γίνει µία 178

184 προσπάθεια να διορθωθούν αυτές οι αποκλίσεις που εµφανίζονται ανάµεσα στη θεωρία και στο πείραµα. Το γεγονός ότι η θεωρία αποτυγχάνει να προβλέψει τους χρόνους έκλουσης των ουσιών, ειδικά για τις ουσίες που εκλούονται στην προβληµατική περιοχή, δηλαδή µετά την πρώτη αλλαγή στη σύσταση της κινητής φάσης, έχει ως µια άµεση συνέπεια τη µη δυνατότητα πρόβλεψης ενός χρωµατογραφήµατος κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. Από τους Πίνακες A.IV.6-13 παρατηρείται, όπως αναφέρθηκε προηγούµενα, ότι αυτές οι αποκλίσεις ανάµεσα στις πειραµατικές και στις θεωρητικές τιµές δεν είναι ίδιες για όλες τις ουσίες. Συνεπώς, αναµένεται ότι θα υπάρχει πρόβληµα όχι µόνο στην πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης αλλά και στην πρόβλεψη του διαχωρισµού των ουσιών. Αυτό φαίνεται πολύ καθαρά στο Σχήµα Α.ΙV.5 όπου οι διαφορές των πειραµατικών χρόνων ανάµεσα σε γειτονικές κορυφές συγκρίνονται µε τις αντίστοιχες θεωρητικές για την περίπτωση των βαθµωτών εκλούσεων 1S 2 και L 1 µε την παρουσία της iproh και χρησιµοποιώντας τη στήλη Aqua Perfect. Η διαφορά των χρόνων ανάµεσα σε δύο γειτονικές κορυφές αποτελεί µέτρο του διαχωρισµού των ουσιών. Παρατηρούµε ότι η θεωρία της βηµατικής βαθµωτής έκλουσης αποτυγχάνει να περιγράψει τον διαχωρισµό των ουσιών που εκλούονται στην προβληµατική περιοχή, για παράδειγµα στην περίπτωση του βήµατος όπου η συγκέντρωση της iproh από φ= γίνεται φ=.2 σε χρόνο 2 λεπτών στη στήλη Aqua Perfect, οι ουσίες dopa, tyr, και m-tyr εκλούονται ταυτόχρονα, ενώ η θεωρία προβλέπει πλήρη διαχωρισµό των συγκεκριµένων ουσιών. Το ίδιο παρατηρείται και στη γραµµική βαθµωτή έκλουση L 1. Έτσι, µε τις παραπάνω παρατηρήσεις είναι αντιληπτό ότι δεν είναι δυνατό να χρησιµοποιείται η συγκεκριµένη θεωρία προκειµένου να προβλεφθεί ένα χρωµατογράφηµα, ειδικά όταν ως κινητή φάση χρησιµοποιούνται υδατικά διαλύµατα iproh, και συνεπώς δεν µπορούν να προβλεφθούν µε επιτυχία οι βέλτιστες συνθήκες διαχωρισµού. 179

185 Πίνακας Α.ΙV.6 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος για υδατικές κινητές φάσεις µε την παρουσία iproh. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ. (2) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.3 (A) και του Α.ΙV.4 για τις στήλες Aqua Perfect και Inertsil, αντίστοιχα. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) 1S 1 1S 2 1S 3 1S 4 1S 5 % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) Στήλη Aqua Perfect, t D = 1.1min met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Μ.Ο Στήλη Inertsil, t D = 4.6 min met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr trp Μ.Ο t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα 151

186 Πίνακας Α.ΙV.7 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος για υδατικές κινητές φάσεις µε την παρουσία iproh. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ.(2) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.3 (A) για τη στήλη Aqua Perfect. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) 1S6 1S7 1S8 % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Μ.Ο Πίνακας Α.ΙV.8 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για βαθµωτές εκλούσεις διπλού βήµατος για υδατικές κινητές φάσεις παρουσία iproh. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ. (2) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.3 (A) για τη στήλη Aqua Perfect. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) 2S 1 2S 2 2S 3 % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Μ.Ο

187 Πίνακας Α.ΙV.9 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για βαθµωτές εκλούσεις τριπλού βήµατος και κινητές φάσεις µε iproh. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ.(2) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.4 για τη στήλη Inertsil. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) 3S 1 3S 2 3S 3 3S 4 % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα met dopa tyr , m-tyr me-dopa phe 13, me-tyr htp n-tyr trp Μ.Ο

188 Πίνακας Α.ΙV.1 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος και κινητές φάσεις µε MeCN. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ. (2) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.3 (B) για τη στήλη Aqua Perfect. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) 1S 2 1S 3 1S 4 % σφάλµα t R(exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Μ.Ο Πίνακας Α.ΙV.11 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος και κινητές φάσεις µε MeOH. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ. (2) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.3 (Γ) για τη στήλη Aqua Perfect. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) 1S 2 1S 3 1S 4 % σφάλµα t R(exp) t R (calc) % σφάλµα t R(exp) t R (calc) % σφάλµα met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Μ.Ο

189 Πίνακας Α.ΙV.12 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για γραµµικές βαθµωτές εκλούσεις και κινητές φάσεις µε iproh. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ. (1) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.3 (A) για τη στήλη Aqua Perfect. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) L 1 L 2 L 3 % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Μ.Ο Πίνακας Α.ΙV.13 : Σύγκριση ανάµεσα σε πειραµατικούς και θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών όπως υπολογίστηκαν για γραµµικές βαθµωτές εκλούσεις και κινητές φάσεις µε MeCN. Οι θεωρητικές τιµές υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια της Εξ. (1) µε τις τιµές a, b, c του πίνακα Α.ΙV.3 (B) για τη στήλη Aqua Perfect. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) L 1 L 2 L 3 % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα t R (exp) t R (calc) % σφάλµα met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Μ.Ο

190 4 3 (A) 2 1 δt, min 3 (B) Pair of peaks Σχήµα Α.ΙV.5 : Σύγκριση ανάµεσα στις πειραµατικές ( ) και στις θεωρητικές (o) διαφορές των χρόνων συγκράτησης ανάµεσα σε γειτονικές κορυφές παρουσία κινητών φάσεων µε iproh, χρησιµοποιώντας τη στήλη Aqua Perfect και για βαθµωτούς προγραµµατισµούς τύπου 1S 2 (A) και τύπου L 1 (B). Η διόρθωση βασίζεται στην Εξ. (8) και παριστάνεται µε το σύµβολο (+). 185

191 Α.ΙV.4.3 ΙΟΡΘΩΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Οι παραπάνω αποκλίσεις που αναφέρθηκαν ανάµεσα στους πειραµατικούς και στους θεωρητικούς χρόνους συγκράτησης (οι οποίες δηλώνονται ως δt R = t R (exp) - t R(calc) ), γίνονται πιο εµφανείς εάν κάνουµε τις γραφικές παραστάσεις αυτών (των αποκλίσεων) ως προς το σχετικό χρόνο, t rel, ο οποίος ορίζεται από την εξίσωση : t rel = t t t (6) R(calc) D t 1 όπου το t R(calc) είναι ο χρόνος συγκράτησης που υπολογίζεται από την εξίσωση (1) ή (2) και t 1 είναι ο χρόνος που προηγείται της έναρξης της βαθµωτής έκλουσης. Οι τιµές των δt R και t rel δίνονται στους Πίνακες Α.ΙV.14 - Α.ΙV.21 για τους διάφορους τύπους βαθµωτής έκλουσης που µελετήθηκαν. Από τους Πίνακες αυτούς προκύπτουν τα Σχήµατα Α.ΙV.6 µέχρι και Α.ΙV.9. Το Σχήµα Α.ΙV.6 απεικονίζει τις γραφικές παραστάσεις του δt R έναντι του t rel οι οποίες αφορούν τις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος, για τους τρεις οργανικούς τροποποιητές, τα οποία και πάρθηκαν µε τη στήλη Aqua Perfect (µε t D =1.1 min). Το Σχήµα Α.ΙV.7 δείχνει την επίδραση στο δt R του µονού και του διπλού βήµατος, µε την παρουσία της iproh, και µάλιστα στην περίπτωση του µονού βήµατος έχουµε διαφορετικές τιµές φ init και φ max στην κινητή φάση. Στο Σχήµα Α.ΙV.8 απεικονίζεται η επίδραση ενός διαφορετικού χρωµατογραφικού συστήµατος που αποτελείται από στήλη Inertsil µε t D =4.6 min πάνω στο δt R, παρουσία της iproh. Τέλος, το Σχήµα Α.ΙV.9 απεικονίζει το δt R έναντι του t rel που υπολογίστηκαν για τις γραµµικές βαθµωτές εκλούσεις. 186

192 Πίνακας Α.ΙV.14 : Τιµές t rel και δt R για τη στήλη (Α) Aqua Perfect και (Β) Inertsil παρουσία της iproh ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους βηµατικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Πίνακα Α.ΙV.6. (A) Τύπος βαθµωτής έκλουσης 1S 1 1S 2 1S 3 1S 4 1S 5 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr (B) Τύπος βαθµωτής έκλουσης 1S 1 1S 2 1S 3 1S 4 1S 5 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 4.6 -, htp n-tyr trp

193 Πίνακας Α.ΙV.15 : Τιµές t rel και δt R για τη στήλη Aqua Perfect (t D = 1.1 min) παρουσία της iproh ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους βηµατικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Α.ΙV.7. Τύπος βαθµωτής έκλουσης 1S 6 1S 7 1S 8 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Πίνακας Α.ΙV.16 : Τιµές t rel και δt R για τη στήλη Aqua Perfect (t D = 1.1 min) παρουσία της iproh ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους βηµατικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Πίνακα Α.ΙV.8. Τύπος βαθµωτής έκλουσης 2S 1 2S 2 2S 3 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr

194 Πίνακας Α.ΙV.17: Τιµές t rel και δt R για τη στήλη Inertsil (t D = 4.6 min) µε την παρουσία της iproh ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους βηµατικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Πίνακα Α.ΙV.9 Τύπος βαθµωτής έκλουσης 3S 1 3S 2 3S 3 3S 4 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr 2.7 1, me-dopa phe , me-tyr htp n-tyr , trp Πίνακας Α.ΙV.18 Τιµές t rel και δt R για τη στήλη Aqua Perfect (t D = 1.1 min) µε την παρουσία της MeCN ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους βηµατικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Πίνακα Α.ΙV.1. Τύπος βαθµωτής έκλουσης 1S 2 1S 3 1S 4 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe m-tyr htp n-tyr

195 Πίνακας Α.ΙV.19 Τιµές t rel και δt R για τη στήλη Aqua Perfect (t D = 1.1 min) µε την παρουσία της MeΟΗ ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους βηµατικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Πίνακα Α.ΙV.11. Τύπος βαθµωτής έκλουσης 1S 2 1S 3 1S 4 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr Πίνακας Α.ΙV.2 : Τιµές t rel και δt R για τη στήλη Aqua Perfect (t D = 1.1 min) µε την παρουσία της iproh ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους γραµµικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Πίνακα Α.ΙV.12. Τύπος βαθµωτής έκλουσης L 1 L 2 L 3 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr

196 Πίνακας Α.ΙV.21 : Τιµές t rel και δt R για τη στήλη Aqua Perfect (t D = 1.1 min)µε την παρουσία του MeCN ως οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση για τους τύπους γραµµικής βαθµωτής έκλουσης που αναλύθηκαν στον Πίνακα Α.ΙV.13. Τύπος βαθµωτής έκλουσης L 1 L 2 L 3 Ουσία t rel δt R t rel δt R t rel δt R met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr htp n-tyr

197 3 2 (A) 1 2 (B) δt R 1 2 (C) t rel Σχήµα Α.ΙV.6. Εξάρτηση του δt R = t R (exp) t R (calc) ως προς τον σχετικό χρόνο t rel = t R (calc) t 1 t D t για τις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µε ένα βήµα στη συγκέντρωση της iproh (A), MeCN (B), and MeOH (C). Το χρωµατογραφικό σύστηµα αποτελείται από τη στήλη Aqua Perfect και έχει t D = 1.1 min. Τα σηµεία αντιστοιχούν στις εξής βαθµωτές εκλούσεις : ( ) 1S 1, (+)1S 2, ( )1S 3, (o)1s 4, και ( )1S 5 και δίνονται στους Πίνακες Α.ΙV.14(Α), Α.ΙV.18 και Α.ΙV.19. Οι γραµµές έχουν υπολογιστεί µε την βοήθεια της εξ. (8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους του 1S του Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίες υπολογίστηκαν για το συγκεκριµένο χρωµατογραφικό σύστηµα. 192

198 3 (A) 2 1 δt R (B) t rel Σχήµα Α.ΙV. 7 : Εξάρτηση του δt R ως προς τον σχετικό χρόνο t rel για τις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µε δύο βήµατα (Α) και µε ένα βήµα (Β) στη συγκέντρωση της iproh χρησιµοποιώντας το σύστηµα µε τη στήλη Aqua Perfect και t D = 1.1 min. Τα σηµεία αντιστοιχούν στις εξής βαθµωτές εκλούσεις : (A) ( ) 2S 1, ( ) 2S 2, (o) 2S 3 ; (B) ( ) 1S 6, ( ) 1S 7, (+) 1S 8, ( ) 1S 3 και δίνονται στους Πίνακες Α.ΙV.16, Α.ΙV.15 και Α.ΙV.14(Α). Οι γραµµές προέκυψαν χρησιµοποιώντας την εξ.(8) και τις παραµέτρους του 2S (A) και του 1S (B) του Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίες υπολογίστηκαν για το συγκεκριµένο χρωµατογραφικό σύστηµα. 193

199 3 (A) 2 1 δt R 3 (B) t rel Σχήµα Α.ΙV.8 : Εξάρτηση του δt R ως προς τον σχετικό χρόνο t rel για τις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µε ένα βήµα (Α) και µε πολλά βήµατα (Β) στη συγκέτρωση της iproh χρησιµοποιώντας το σύστηµα µε τη στήλη Inertsil και t D = 4.6 min. Τα σηµεία αντιστοιχούν στις εξής βαθµωτές εκλούσεις : (A) ( ) 1S 1, (+) 1S 2, ( ) 1S 3, (o) 1S 4, ( ) 1S 5 ; (B) ( ) 3S 1, (+) 3S 2, ( ) 3S 3, (o) 3S 4. και δίνονται στους Πίνακες Α.ΙV.14(Β) και Α.ΙV.17. Οι γραµµές προέκυψαν χρησιµοποιώντας την εξ.(8) και τις παραµέτρους του (A) 1S, και (B) 3S ( ) και 1S ( ) του Πίνακα A.IV.22, οι οποίες υπολογίστηκαν για το συγκεκριµένο χρωµατογραφικό σύστηµα. 194

200 3 (A) 2 1 δt R (B) t rel Σχήµα A.IV.9 : Γραφική παράσταση του δt R ως προς το σχετικό χρόνο t rel για τις γραµµικές µεταβολές στη συγκέντρωση της (A) iproh και του (B) MeCN χρησιµοποιώντας τη στήλη Aqua Perfect µε t D = 1.1 min. Τα σηµεία αντιστοιχούν στις εξής βαθµωτές εκλούσεις : (+) L 1, (o) L 2, and ( ) L 3 και δίνονται στους Πίνακες Α.ΙV.2 και Α.ΙV.21.Οι γραµµές έχουν σχεδιαστεί βάση της εξ. (8) χρησιµοποιώντας τις αντίστοιχες παραµέτρους του L από τον Πίνακα Α.ΙV

201 Από τα παραπάνω σχήµατα παρατηρούµε ότι το δt R µεταπηδά σχετικά απότοµα από την τιµή για t rel = σε µία µέγιστη τιµή δt R(max), η οποία καθορίζεται από α) τον οργανικό τροποποιητή β) τις τιµές του φ init και φ max και γ) τον τύπο της βαθµωτής έκλουσης. Επίσης, βλέπουµε ότι αρχικά το δt R αυξάνεται απότοµα και σχεδόν γραµµικά για περίπου 2 λεπτά και έπειτα µειώνεται εκθετικά µε τον χρόνο. Έτσι θα µπορούσαµε να ισχυριστούµε ότι δt R µπορεί να περιγραφεί από την παρακάτω απλή εξίσωση : δt R = k2 t h e rel k (t t ) rel < t rel < rel 1 rel m t > t t < t c c (7) όπου τα h, k 1, k 2, t m, και t c είναι σταθερές. Το t c αντιπροσωπεύει την χρονική διάρκεια της αρχικής αύξησης του δt R και η τιµή k 2 προσδιορίζεται από τη συνθήκη συνέχειας σε t rel = t c. Στον Πίνακα Α.ΙV.22 δίνονται οι τιµές των παραµέτρων h, k 1, t m, και t c οι οποίες περιγράφουν τη µεταβολή του δt R ως προς το t rel των διαφόρων τύπων βαθµωτής έκλουσης οι οποίες µελετήθηκαν στο συγκεκριµένο κεφάλαιο. Οι θεωρητικές γραφικές παραστάσεις του δt R ως προς το t rel, σύµφωνα µε τις συγκεκριµένες τιµές των παραµέτρων, απεικονίζονται στα Σχήµατα Α.ΙV.6 µέχρι Α.ΙV.9. Πρέπει να σηµειωθεί ότι οι τιµές των παραµέτρων για τις βαθµωτές γραµµικές εκλούσεις αντιστοιχούν στον τύπο βαθµωτής έκλουσης L 2. Μελετώντας τις γραφικές παραστάσεις στα Σχήµατα Α.ΙV.6 µέχρι Α.ΙV.9 µπορούµε να οδηγηθούµε σε πολύ σηµαντικά συµπεράσµατα όσον αφορά τη συµπεριφορά των οργανικών διαλυτών. Αρχικά, πρέπει να αναφερθεί ότι η µορφή του δt R έναντι του t rel είναι ίδια για όλες τις βαθµωτές εκλούσεις µονού-βήµατος µε τον ίδιο τροποποιητή, υπό την προϋπόθεση ότι τα φ init και φ max διατηρούνται σταθερά, και δεν 196

202 επηρεάζεται από το χρωµατογραφικό σύστηµα που χρησιµοποιείται. Αυτό επιβεβαιώνεται µελετώντας τις γραφικές παραστάσεις των Σχηµάτων Α.ΙV.6(Α) και Α.ΙV.8(Α), οι οποίες απεικονίζουν τους ίδιους ακριβώς τύπους βαθµωτής έκλουσης µε τον ίδιο οργανικό τροποποιητή σε δύο διαφορετικές στήλες µε διαφορετικό t D. Όσον αφορά τις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις πολλαπλών βηµάτων οι αντίστοιχες γραφικές παραστάσεις έχουν επίσης την ίδια µορφή µε την προϋπόθεση ότι το πρώτο βήµα είναι σχεδόν το ίδιο στις διάφορες βαθµωτές εκλούσεις, βλ. Σχήµατα Α.ΙV.7(Α) και Α.ΙV.8(Β). Οι πιο σηµαντικές όµως παρατηρήσεις προκύπτουν από το Σχήµα Α.ΙV.7(Β). Στο σχήµα αυτό αρχικά παρατηρούµε ότι οι τιµές του δt R εξαρτώνται αποκλειστικά από το φ max, όταν το φ init είναι το ίδιο, ιδιαίτερα στις κινητές φάσεις µε iproh. Και πιο συγκεκριµένα, όσο πιο χαµηλό είναι το φ max τόσο µεγαλύτερες είναι οι αποκλίσεις του δt R, δηλαδή τόσο µεγαλύτερες είναι οι αποκλίσεις. Το ίδιο µοτίβο αλλά σε µικρότερη έκταση παρατηρείται στις βαθµωτές εκλούσεις µε MeCN στην κινητή φάση. Επίσης, παρατηρούµε ότι οι αποκλίσεις ανάµεσα στις θεωρητικές και πειραµατικές τιµές του χρόνου συγκράτησης µπορούν να µειωθούν σηµαντικά εφόσον η αρχική κινητή φάση δεν είναι καθαρό υδατικό διάλυµα. Έτσι για το βήµα από φ= σε φ=.4 παρουσία iproh, η τιµή του δt R(max) διπλασιάζεται συγκριτικά µε το βήµα από φ=.1 σε φ=.4 για τον ίδιο τροποποιητή (βλ. Σχήµα Α.ΙV.7(Β)). Τέλος, η περίπτωση των γραµµικών βαθµωτών εκλούσεων είναι επίσης ενδιαφέρουσα. Τα συµπεράσµατα που προκύπτουν είναι τα εξής: α) το µέγεθος της απόκλισης του δt R εξαρτάται σηµαντικά από το πόσο απότοµη είναι η γραµµική µεταβολη της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή, β) η µείωση των τιµών δt R ως προς το t rel είναι εκθετική συνάρτηση και γ) η αρχική αύξηση των τιµών δt R ως προς το t rel µπορεί δύσκολα να θεωρηθεί γραµµική, τουλάχιστον στην δύσκολη περίπτωση όπου χρησιµοποιείται η iproh ως οργανικός τροποποιητής. Βασιζόµενοι στις παραπάνω παρατηρήσεις προσπαθήσαµε να διορθώσουµε τους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης, t R, που παρέχουν οι εξισώσεις (1) ή (2) µε την βοήθεια της παρακάτω εξίσωσης : 197

203 t R ( cor ) = δt R + t R ( calc ) (8) όπου το δt R παρέχεται από την Εξ.(7). Τα αποτελέσµατα από την παραπάνω διόρθωση παρουσιάζονται στους πίνακες Α.ΙV.23 - Α.ΙV.26 όπου καταγράφεται το µέγιστο (Max) και το µέσο (Mean) επί τοις εκατό σφάλµα στην πρόβλεψη του χρόνου συγκράτησης, για τους διάφορους τύπους βαθµωτής έκλουσης, πριν και µετά την διόρθωση. Παρατηρούµε ότι η βελτίωση στην πρόβλεψη είναι σηµαντική σε όλες τις περιπτώσεις. Επίσης, η βελτίωση και στο διαχωρισµό είναι εµφανής, όπως παρατηρούµε στο Σχήµα Α.ΙV.5. Η πιο δύσκολη περίπτωση είναι η βελτίωση της πρόβλεψης των γραµµικών βαθµωτών εκλούσεων όπου ως οργανικός τροποποιητής χρησιµοποιείται η iproh. Ήδη έχουµε αναφέρει ότι οι αποκλίσεις των τιµών δt R εξαρτώνται από το πόσο απότοµη είναι η γραµµική µεταβολή στη συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή και ότι η αρχική αύξηση του δt R ως προς το t rel δύσκολα µπορεί να περιγραφεί από κάποια µαθηµατική εξίσωση. Έτσι, η διόρθωση έγινε για t rel > 2.5 min χρησιµοποιώντας τα h, k 1 και t m που αντιστοιχούν στην γραµµική βαθµωτή έκλουση τύπου L 2. Η διόρθωση είναι ικανοποιητική αλλά δεν µπορούµε να αποκλείσουµε µερικές περιπτώσεις όπου η διόρθωση δεν θα ήταν δυνατή. Γενικά όµως η διόρθωση που έγινε στις προβλέψεις των χρόνων συγκράτησης στις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις είναι πιο αποτελεσµατική από τις αντίστοιχες στις γραµµικές βαθµωτές εκλούσεις. Στην περίπτωση της βηµατικής βαθµωτής έκλουσης, όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω, η µορφή των γραφικών παραστάσεων του δt R έναντι του t rel είναι σχεδόν ανεπηρέαστη από το χρησιµοποιούµενο χρωµατογραφικό σύστηµα, δηλαδή την στήλη και το t D (πίνακας Α.ΙV.22). Συνεπώς, η διόρθωση που έγινε για τις βαθµωτές εκλούσεις της οµάδας 1S και για την στήλη Aqua Perfect µε t D =1.1 min µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία σε οποιοδήποτε χρωµατογραφικό σύστηµα όπως στην περίπτωση της στήλης Inertsil µε t D = 4.6 min, όπου η διόρθωση είναι εξίσου αποτελεσµατική (βλ. Πίνακα Α.ΙV.24 ). Πρέπει 198

204 επίσης να σηµειωθεί ότι οι βαθµωτές εκλούσεις πολλαπλών βηµάτων µπορούν να διορθωθούν χρησιµοποιώντας τα δεδοµένα των αντίστοιχων µονού-βήµατος, µε την προϋπόθεση ότι το πρώτο βήµα είναι περίπου το ίδιο για τις διάφορες βαθµωτές εκλούσεις ( Πίνακες Α.ΙV.25, Α.ΙV.26). Ωστόσο, παρόλο που µε την παραπάνω διόρθωση που περιγράψαµε αναλυτικά, δηλαδή µε την χρήση της Εξ.(8), είναι δυνατόν να προβλεφθούν ικανοποιητικά οι χρόνοι συγκράτησης των αµινοξέων κάτω από συνθήκες µη ισορροπίας κατά την διάρκεια µιας βαθµωτής έκλουσης, θα πρέπει να αποφεύγονται βαθµωτές εκλούσεις που ξεκινούν µε καθαρή υδατική φάση, ιδιαίτερα στην περίπτωση όπου στην βαθµωτή έκλουση χρησιµοποιείται η iproh ως οργανικός τροποποιητής ή πιθανόν και άλλοι ισχυροί διαλύτες. Εάν ο διαχωρισµός των ουσιών που εκλούονται στην αρχή του χρωµατογραφήµατος απαιτούν µια βαθµωτή έκλουση που να αρχίζει από καθαρό υδατικό διαλύτη, αυτό µπορεί να γίνει µε συνδυασµό βαθµωτής έκλουσης που να αρχίζει µε κάποια µικρή ποσότητα οργανικού διαλύτη και µε ταυτόχρονη µεταβολή της ταχύτητας ροής. Πίνακας Α.ΙV.22 : Τιµές των παραµέτρων της εξίσωσης (7). Στήλη : Aqua Perfect Inertsil Οργανικός τροποποητής: iproh MeCN MeOH iproh Τύπος βαθµωτής L 1S 2S L 1S L 1S 1S 3S έκλουσης h k 1 t m t c

205 Πίνακας Α.ΙV.23 : Μέγιστο ( Max) και µέσο (Mean) επί τοις εκατό σφάλµα στους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης για τις βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος ή τις γραµµικές µεταβολές στους οργανικούς τροποποιητές iproh, MeCN, MeOH και στο χρωµατογραφικό σύστηµα µε τη στήλη Aqua Perfect και µε t D = 1.1 min. Οργανικός Τροποποιητής Τύπος βαθµωτής έκλουσης 1S 1 1S 2 1S 3 1S 4 1S 5 L 1 L 2 L 3 iproh MeCN MeOH Max a Mean a Max b Mean b Max a Mean a Max b Mean b Max a Mean a Max b Mean b a µη διορθωµένες t R(calc) τιµές όπως υπολογίστηκαν από τις εξ (1) ή (2) και (4). b διορθωµένες τιµές t R(calc) σύµφωνα µε την Εξ. (8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους 1S και L του Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίοι υπολογίστηκαν για το συγκεκριµένο χρωµατογραφικό σύστηµα Πίνακας Α.ΙV.24 : Μέγιστο (max) και µέσο (mean) επί τοις εκατό σφάλµα στους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης για βαθµωτές µεταβολές µονού βήµατος στην iproh και χρησιµοποιώντας το χρωµατογραφικό σύστηµα µε τη στήλη Inertsil και µε t D = 4.6 min. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Max a Mean a Max b Mean b Max c Mean c 1S S S S S a µη διορθωµένες t R(calc) τιµές όπως υπολογίστηκαν από τις εξ. (2) και (4). b διορθωµένες t R(calc) τιµές σύµφωνα µε την εξ. (8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους του 1S από τον Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίοι υπολογίστηκαν για το σύστηµα µε τη στήλη Inertsil και για t D = 4.6 min. c διορθωµένες t R(calc) τιµές σύµφωνα µε την εξ.(8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους 1S του Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίοι υπολογίστηκαν για το σύστηµα µε τη στήλη Aqua Perfect και για t D = 1.1 min. 2

206 Πίνακας Α.ΙV.25 : Μέγιστο(Μax) και µέσο (Μean) επί τοις εκατό σφάλµα στους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης για τις βαθµωτές µεταβολές µε δύο βήµατα στην iproh και χρησιµοποιώντας το χρωµατογραφικό σύστηµα µε τη στήλη Aqua Perfect και µε t D = 1.1 min. Τύπος βαθµωτής έκλουσης 2S 1 2S 2 2S 3 Max a Mean a Max b Mean b Max c Mean c a µη διορθωµένες t R(calc) τιµές όπως υπολογίστηκαν από τις εξ. (2) και (4). b διορθωµένες t R(calc) τιµές σύµφωνα µε την εξ. (8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους του 2S από τον Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίοι υπολογίστηκαν για το σύστηµα µε τη στήλη Aqua Perfect και µε t D = 1.1 min c διορθωµένες t R(calc) τιµές σύµφωνα µε την εξ.(8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους 1S του Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίοι υπολογίστηκαν για το σύστηµα µε τη στήλη Aqua Perfect και για t D = 1.1 min. Πίνακας Α.ΙV.26 : Μέγιστο(Μax) και µέσο (Μean) επί τοις εκατό σφάλµα στους προβλεπόµενους χρόνους συγκράτησης για τις βαθµωτές εκλούσεις µε τρία βήµατα στην iproh και χρησιµοποιώντας το χρωµατογραφικό σύστηµα µε τη στήλη Inertsil και για t D = 4.6 min. Τύπος βαθµωτής έκλουσης 3S 1 3S 2 3S 3 3S 4 Max a Mean a Max b Mean b Max c Mean c a µη διορθωµένες t R(calc) τιµές όπως υπολογίστηκαν από τις εξ. (2) και (4). b διορθωµένες t R(calc) τιµές σύµφωνα µε την εξ. (8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους του 3S από τον Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίοι υπολογίστηκαν για το σύστηµα µε τη στήλη Inertsil και για t D = 4.6 min. c διορθωµένες t R(calc) τιµές σύµφωνα µε την εξ.(8) χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους 2S του Πίνακα Α.ΙV.22, οι οποίοι υπολογίστηκαν για το σύστηµα µε τη στήλη Aqua Perfect και για t D = 1.1 min. 21

207 Α.ΙV.4.4 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΤΗΣ ΜΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Όπως αναφέρθηκε στην Εισαγωγή, Α.ΙV.1, ο Snyder και ο Dolan [5] αποδίδουν το φαινόµενο της µη ισορροπίας κατά την µέθοδο της βαθµωτής έκλουσης σε τέσσερις κυρίως παράγοντες: α) στο γεγονός ότι στήλη δεν έχει ισορροπήσει από την αρχή µε την αρχική κινητή φάση, β) στην ύπαρξη του φαινοµένου «solvent demixing», γ) στην αργή µεταβολή της διαµόρφωσης των αλκυλικών αλυσίδων της στατικής φάσης λόγω της µεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης, και τέλος δ) στις µεταβολές της δοµής των µορίων των εκλουόµενων ουσιών. Από αυτές τις παραµέτρους η πρώτη και η τελευταία αποκλείονται στην περίπτωσή µας διότι 1) η στήλη αφήνεται πολύ ώρα για να ισορροπήσει στην αρχική κινητή φάση, και 2) η χρήση κινητής φάσης µε σταθερό ph και ιονική ισχύ δεν µπορεί να προκαλέσει µεταβολή στη δοµή των µορίων των αναλυόµενων ουσιών που µελετάµε, δηλαδή των αµινοξέων, τα οποία είναι µικρά µόρια. Τέτοιο φαινόµενο έχει παρατηρηθεί προς το παρόν σε µεγάλα µόρια, όπως είναι τα πεπτίδια και οι πρωτεΐνες [18-2]. Το φαινόµενο «solvent demixing» αναφέρεται στην επιλεκτική συγκράτηση από στήλες αντίστροφης φάσης ορισµένων συστατικών της κινητής φάσης, τα οποία προφανώς έχουν µεγαλύτερη συγγένεια µε τις ανθρακικές αλυσίδες της στατικής φάσης, όπως είναι οι οργανικοί διαλύτες που περιέχουν οι κινητές φάσεις. Το ποσό της ουσίας που µπορεί να προσροφηθεί από την κινητή φάση, καθώς και η επίδρασή που θα έχει στον διαχωρισµό εξαρτάται από το πόσο ισχυρές είναι οι αλληλεπιδράσεις των οργανικών διαλυτών µε την στατική φάση. Το παραπάνω φαινόµενο έχει σαν αποτέλεσµα η κινητή φάση στην πραγµατικότητα να περιέχει µικρότερη ποσότητα οργανικού διαλύτη στην αρχή της εφαρµογής της βαθµωτής έκλουσης από αυτήν που προγραµµατίζεται, και για αυτό το λόγο οι χρόνοι συγκράτησης των αναλυόµενων ουσιών είναι µεγαλύτεροι από αυτούς που προβλέπονται θεωρητικά. Στη συνέχεια της βαθµωτής 22

208 µεταβολής και αφού κορεστεί η στατική φάση από τον οργανικό διαλύτη έχουµε µία απότοµη έκλουσή του οργανικού διαλύτη, την οποία µπορούµε να την αντιληφθούµε εφόσον ο οργανικός διαλύτης δίνει µία κορυφή σε σχήµα βελόνας στο UV. Κάτι τέτοιο παρατηρήθηκε στα χρωµατογραφήµατα που πάρθηκαν κάτω από διάφορες συνθήκες βαθµωτής µεταβολης. Τα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.1 αναφέρονται σε βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µε 3 βήµατα και συγκεκριµένα τύπου 3S 3 (Πίνακας Α.ΙV.9) που πάρθηκαν χρησιµοποιώντας την στήλη Inertsil έχοντας σε σειρά ταυτόχρονα ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή στα 1.1V (Σχήµα Α.ΙV.1Α) και ανιχνευτή UV στα 2nm (Σχήµα Α.ΙV.1Β). Η βαθµωτή έκλουση ξεκινάει από υδατική κινητή φάση και στη συνέχεια, στα 8.3 min, προγραµµατίζεται να περνά υδατικό διάλυµα µε 1% iproh. Γνωρίζουµε ότι για την συγκεκριµένη στήλη ο νεκρός χρόνο, t, είναι ίσος µε 1.8 min και ότι το t D είναι ίσο µε 4.6min. Συνεπώς η iproh θα πρέπει να φτάνει στο ανιχνευτή σε χρόνο ίσο µε =14.7 min. Παρατηρούµε, τόσο στον ηλεκτροχηµικό ανιχευτή όσο και στο UV, ότι η βασική γραµµή όντως αρχίζει να ανεβαίνει στα 14.7 min -λόγω της iproh - αλλά στα 19.7 min εµφανίζεται µία κορυφή-βελόνα, η οποία οριοθετεί τον κορεσµό της στήλης µε iproh. Το φαινόµενο αυτό µπορεί να ερµηνευθεί αν θεωρήσουµε ότι όταν ξεκινάει η βαθµωτή µεταβολή ένα σηµαντικό µέρος της iproh της κινητής φάσης προσροφάται στην στατική φάση ενώ το υπόλοιπο, το οποίο παραµένει στην κινητή φάση, φτάνοντας στους ανιχνευτές µετά από 14.7min όπως ήταν αναµενόµενο- προκαλεί µία αύξηση στη βασική τους γραµµή, ενώ στα 19.7min απότοµα η συγκέντρωση της iproh στην κινητή φάση γίνεται ίδια µε αυτή που έχουµε προγραµµατίσει δίνοντας την συγκεκριµένη κορυφή. Η πιο σηµαντική παρατήρηση είναι ότι ουσιαστικά η συγκέντρωση της iproh παίρνει την προγραµµατισµένη τιµή, δηλαδή 1%, 5min αργότερα από το χρόνο που έχουµε προγραµµατίσει και για αυτό το λόγο σε αυτήν την περιοχή των 23

209 (Α) I / na t, min (Β),18 AU,16,14,12,1,8,6,4, t, min Σχήµα Α.ΙV.1 : Χρωµατογραφήµατα βηµατικής µεταβολής της iproh τύπου 3S 3 στη στήλη Inertsil. Τα 1 αµινοξέα µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, medopa, phe (µόνο στο UV), me-tyr, 5htp, n-tyr και trp, καταγράφηκαν στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή (Α) και στο UV στα 2nm (B). 24

210 5min οι ουσίες εκλούονται αργότερα από ότι προβλέπεται θεωρητικά, αφού η κινητή φάση περιέχει µικρότερη ποσότητα iproh από την προγραµµατισµένη. Το ίδιο φαινόµενο ουσιαστικά παρατηρήθηκε και µε το άλλο χρωµατογραφικό σύστηµα, µε την στήλη Aqua Perfect, όπου t =2.7min και t D =1.1min, όπως φαίνεται στα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.11. Τα συγκεκριµένα χρωµατόγραφήµατα αναφέρονται σε βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µε ένα βήµα, το οποίο καταγράφηκε χρησιµοποιώντας το UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2 (Σχήµα Α.ΙV.11(Α)) και στα 21 nm (Σχήµα Α.ΙV.11(Β)). Στις µικρές εικόνες µέσα στα χρωµατογραφήµατα απεικονίζονται σε µεγέθυνση οι βελόνες-κορυφές της ισοπροπανόλης. To βήµα που εφαρµόστηκε ήταν η iproh από φ= να γίνει φ=.2 σε χρόνο t=2min, δηλαδή τύπου 1S 5 (βλ. Πίνακα Α.ΙV.6(Α)). Παρατηρούµε ότι η βελόνακορυφή εµφανίζεται στα 28 min ενώ κανονικά θα έπρεπε να εµφανιστεί σε χρόνο =23.8 min, δηλαδή υπάρχει µία χρονική καθυστέρηση κατά 4.2 min. Και σε αυτήν την χρονική περίοδο εµφανίζονται οι µεγαλύτερες αποκλίσεις µεταξύ των πειραµατικών και θεωρητικών τιµών έκλουσης των ουσιών. Επίσης, στα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.12 που πάρθηκαν µε το παραπάνω χρωµατογραφικό σύστηµα, η βαθµωτή έκλουση πραγµατοποιήθηκε µε ένα βήµα, από φ= σε φ=,1 σε iproh και σε χρόνο t=5min, δηλαδή είναι τύπου 1S 6 (βλ. Πίνακα Α.ΙV.7). Παρατηρούµε λοιπόν στα χρωµτατογρφήµατα αυτά ότι η βελόνα-κορυφή κάνει την εµφάνισή της στα 14.3 min ενώ θα έπρεπε να είναι στα 5+3.8=8.8 min, δηλαδή υπάρχει µία καθυστέρηση γύρω στα 5.5 min. Η καθυστέρηση αυτή είναι µεγαλύτερη από ότι στην παραπάνω περίπτωση που ήταν 4.2 min, κάτι που ίσως οφείλεται στο γεγονός ότι στην παραπάνω περίπτωση το βήµα ήταν από φ= σε φ=.2 ενώ τώρα από φ= σε φ=.1. ηλαδή όσο µεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της κινητής φάσης τόσο πιο γρήγορα φαίνεται να κορένεται η στατική φάση και να αποκαθίσταται η ισορροπία στην στήλη. 25

211 (Α) AU,25,2,15,1,35,3,25,2,15,1,5 -,5 27,5 27,8 28,1 28,4,5 -, t, min (B),25,2,15,2,15,1,5 -,5 27, ,5 AU,1,5 -, t, min Σχήµα Α.ΙV.11 : Χρωµατογραφήµατα βηµατικής µεταβολής της iproh τύπου 1S 5 στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέα µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2nm (Α) και στα 21nm (B). Τα µικρά σχήµατα εσωτερικά µεγενθύνουν τη βελόνα -κορυφή της iproh. 26

212 (A),25,2,15 AU,1,5 -, t, min (B),25,2,15 AU,1,5 -, t, min Σχήµα Α.ΙV.12 : Χρωµατογραφήµατα βηµατικής µεταβολής της iproh τύπου 1S 6 στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέα µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2nm (Α) και στα 21 nm (B). 27

213 Ανάλογο φαινόµενο παρατηρείται και στα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.13 που πάρθηκαν µε την στήλη Aqua Perfect, όπου πραγµατοποιήθηκε διπλό βήµα, τύπου 2S 3 (βλ. Πίνακα Α.ΙV.8), κατά το οποίο η κινητή φάση σε χρόνο t=7min γίνεται φ=.1 από φ= και στην χρονική στιγµή t=15 min γίνεται φ=.2 (σε iproh). Παρατηρούµε ότι η βελόνα-κορυφή εµφανίζεται στα 16.4 min ενώ θα έπρεπε να βγαίνει σε χρόνο t=3.8+7=1.8 min, δηλαδή υπάρχει µία καθυστέρηση γύρω στα 5.5 min, όσο δηλαδή είναι και στα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.12, προφανώς επειδή το αρχικό βήµα είναι ίδιο και στις δύο περιπτώσεις. Όσον αφορά τις γραµµικές βαθµωτές εκλούσεις τα πράγµατα είναι πιο πολύπλοκα όπως φαίνεται και στα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.14. Πιο συγκεγκριµένα, η συγκέντρωση της ισοπροπανόλης αυξάνεται γραµµικά από φ= σε φ=,2 µέσα σε χρόνο 1min (γραµµική έκλουση τύπου L 3 του Πίνακα Α.ΙV.12). Κανονικά θα έπρεπε η βασική γραµµή να αυξάνεται σιγά-σιγά από την αρχή, ενώ παρατηρούµε ότι αρχίζει να αυξάνεται από τα 11.7 min µέχρι τα 15 min όπου και σταθεροποιείται. Τα φαινόµενο που περιγράφηκε πιο πάνω παρουσία της iproη στην κινητή φάση, δηλαδή το ανέβασµα της βασικής γραµµής και η εµφάνιση κορυφής-βελόνας, δεν παρατηρείται όταν στην κινητή φάση χρησιµοποιείται το MeCN ως οργανικός τροποποιητής για τον λόγο ότι το MeCN δεν απορροφά στο UV, όπως φαίνεται στα παρακάτω χρωµατογραφήµατα των Σχηµάτων Α.ΙV.15 και Α.ΙV.16. Τα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.15 αναφέρονται σε βηµατική µεταβολή στη συγκέντρωση του MeCN η οποία γίνεται από φ= σε φ=.3 σε t=5min, ενώ τα αντίστοιχα του Σχήµατος Α.ΙV.16 αναφέρονται σε γραµµική βαθµωτή έκλουση κατά την οποία η συγκέντρωση του MeCN γίνεται από φ= σε φ=.6 σε t=1min, δηλαδή είναι τύπου L 3 του Πίνακα Α.ΙV.13. Και οι δύο βαθµωτές εκλούσεις πάρθηκαν χρησιµοποιώντας 2 µήκη κύµατος, 2nm (Σχήµατα Α) και 21nm (Σχήµατα Β). 28

214 (Α),25,2,15 AU,1,5 -, t, min (Β),25,2,15 AU,1,5 -, t, min Σχήµα Α.ΙV.13 : Χρωµατογραφήµατα βηµατικής µεταβολής της iproh τύπου 2S 3 στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέα µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2nm (Α) και στα 21 nm (B). 29

215 (Α),25,2,15 AU,1,5 -, t, min (Β),25,2,15 AU,1,5 -, t, min Σχήµα Α.ΙV.14 : Χρωµατογραφήµατα γραµµικής µεταβολής της iproh τύπου L 3 στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέων µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m- tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2nm (Α) και στα 21 nm (B). 21

216 (Α),2,15,1 AU,5 -, t, min (Β),2,15,1 AU,5 -, t, min Σχήµα Α.ΙV.15 : Χρωµατογραφήµατα βηµατικής µεταβολης του MeCN από φ= σε φ=.3 σε 5min στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέα µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2nm (Α) και στα 21 nm (B). 211

217 (Α),3,25,2 AU,15,1, t, min (Β),3,25,2 AU,15,1, t, min Σχήµα Α.ΙV.16 : Χρωµατογράφηµα γραµµικής µεταβολής του MeCN τύπου L 3 στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέων µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m- tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2nm (Α) και στα 21 nm (B). 212

218 Τέλος, η συµπεριφορά της MeOH στην κινητή φάση σε παρόµοιου τύπου βαθµωτή µεταβολή φαίνεται στα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος Α.ΙV.17. Στο συγκεκριµένο χρωµατογράφηµα πραγµατοποιήθηκε βήµα από φ= σε φ=.15 σε χρόνο t=1 min, δηλαδή έχουµε βηµατική µεταβολή τύπου 1S 4 (βλ. Πίνακα Α.ΙV.11). Παρατηρούµε ότι η βασική γραµµή αρχίζει να ανεβαίνει στα 13.8 min, όπου και αναµέναµε διότι σύµφωνα µε την εφαρµοζόµενη βαθµωτή έκλουση θα έπρεπε να ανεβαίνει σε χρόνο t= =13.8 min, και σταθεροποιείται στα 14.7 min, δηλαδή µετά χρόνο.9min. Αυτή η µικρή διαφορά στον χρόνο συγκριτικά µε την iproh µπορεί να οφείλεται στο ότι στην περίπτωση της βαθµωτής µεταβολής της ΜeOH η τελική συγκέντρωση του βήµατος είναι πολύ µεγάλη, δηλαδή.15, συγκριτικά µε την περίπτωση της iproh όπου η τελική συγκέντρωση ήταν.2, αφού όπως αναφέρθηκε πιο πάνω όσο µεγαλύτερη είναι η τελική συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή τόσο γρηγορότερα εκλούεται από την στατική φάση και αποκαθίσταται η ισορροπία στην στήλη. 213

219 (Α),5,4,3 AU,2, t, min (Β),5,4,3 AU,2, t, min Σχήµα Α.ΙV.17 : Χρωµατογραφήµατα βηµατικής µεταβολής της MeOH τύπου 1S 4 στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέων µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV σε δύο µήκη κύµατος, στα 2nm (Α) και στα 21 nm (B). Oι phe, me-tyr και 5htp συνεκλούονται. 214

220 Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το φαινόµενο «solvent demixing» καταγράψαµε χρωµατογραφήµατα µε και χωρίς ρυθµιστικό διάλυµα καθώς και µε και χωρίς ένεση του δείγµατος. ύο ενδεικτικά χρωµατογραφήµατα φαίνονται στο γράφηµα του Σχήµατος Α.ΙV.18. Σε αυτό το χρωµατογράφηµα η στήλη Aqua Perfect έχει ισορροπήσει σε κινητή υδατική φάση µε ph = 2.5 (Σχήµα Α.ΙV.18(Α)) και σε καθαρό νερό (Σχήµα Α.ΙV.18(Β)). Στη συνέχεια εφαρµόζουµε ένα βήµα σε χρόνο 2min για το γράφηµα του Σχήµατος Α.ΙV.18(Α) και σε χρόνο min για το γράφηµα του Σχήµατος Α.ΙV.18(Β) όπου η συγκέντρωση της iproh από φ= γίνεται φ=.2. Παρατηρούµε ότι η στατική φάση κορένεται µε την iproh σε περίπου 4.2min από την έναρξη της βαθµωτής µεταβολής ανεξάρτητα από το αν η κινητή φάση περιέχει ή όχι ρυθµιστικό διάλυµα. Αν παρατηρήσουµε λεπτοµερώς το Σχήµα Α.ΙV.18(Β) θα αντιληφθούµε ότι µετά από χρόνο ίσο µε t υπάρχει µία αύξηση στην βασική γραµµή για χρόνο ίσο µε t D =1.1 min και στη συνέχεια η βασική γραµµή γίνεται σχεδόν παράλληλη στον άξονα των x για χρόνο 4.2 min. Κατά τη διάρκεια της χρονικής περιόδου των 4.2 min, η iproh συγκρατείται στο µεγαλύτερο ποσοστό της στη στατική φάση, µε αποτέλεσµα η κινητή φάση να µην περιέχει οργανικό τροποποιητή. Αφού όµως κορεστεί η στατική φάση από την iproh, η συγκέντρωση της iproh στην κινητή φάση αυξάνεται απότοµα δηµιουργώντας οξεία κορυφή στο χρόνο των 28 ή των 8 min στα χρωµατογραφήµατα που απεικονίζονται στα Σχήµατα Α.ΙV.18(Α) και Α.ΙV.18(Β), αντίστοιχα. Σε αυτό το σηµείο πρέπει να σηµειωθεί ότι το χρωµατογράφηµα του Σχήµατος Α.ΙV.18(Α) αντιστοιχεί στην βαθµωτή έκλουση 1S 5, ενώ το χρωµατογράφηµα του Σχήµατος Α.ΙV.18(Β) πραγµατοποιήθηκε χωρίς ένεση του δείγµατος. Επίσης πρέπει να τονιστεί ότι η χρονική περίοδος των 4.2min είναι χαρακτηριστική για την iproh όταν εφαρµόζεται βήµα όπου η συγκέντρωσή της από φ= γίνεται φ=.2. Αυτή η περίοδος αυξάνεται κατά τις αντίστοιχες γραµµικές µεταβολές της συγκέντρωσης της iproh και ελαττώνεται αν η τελική συγκέντρωση της iproh στις βηµατικές µεταβολές αυξάνεται. 215

221 .25.2 (A) Absorbance (B) t, min Σχήµα Α.ΙV.18 : (Α) Χρωµατογράφηµα βηµατικής µεταβολής της iproh τύπου 1S 5 στη στήλη Aqua Perfect. Τα 9 αµινοξέα µε σειρά έκλουσης : met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, καταγράφηκαν στο UV στα 2nm και (B) χρωµατογράφηµα βηµατικής µεταβολής τύπου 1S 1 χωρίς ρυθµιστικό διάλυµα που καταγράφηκε στο UV στα 2nm, κάνοντας ένεση καθαρού νερού. Η καµπύλη (1) στο (Β) αναφέρεται στον αριστερό άξονα του y ενώ η καµπύλη (2) στο δεξιό άξονα του y. 216

222 Από το Σχήµα Α.ΙV.18 προκύπτει ότι αν το φαινόµενο solvent demixing ήταν το κύριο αίτιο για τις εµφανιζόµενες αποκλίσεις µεταξύ πειραµατικών και θεωρητικών τιµών έκλουσης στις βαθµωτές µεταβολές του οργανικού διαλύτη, τότε µία απλή µετατόπιση της έναρξης της βηµατικής µεταβολής κατά 4.2 min για τις βηµατικές βαθµωτές εκλούσεις µονού βήµατος όπου η συγκέντρωση της iproh γίνεται από φ= σε φ=.2, θα ήταν αρκετό για να διορθωθεί το πρόβληµα. Όµως όπως παρατηρούµε στον Πίνακα Α.ΙV.27, κάτι τέτοιο δεν ισχύει. Αυτή η διόρθωση βελτιώνει την πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης για τις πρώτες δύο ή τρεις αναλυόµενες ουσίες, στις οποίες όπως φαίνεται στον Πίνακα Α.ΙV.6(Α) υπήρχε το µεγαλύτερο πρόβληµα πρόβλεψης, αλλά χειροτερεύει την πρόβλεψη για τις υπόλοιπες ουσίες. Με αυτόν τον τρόπο µπορούµε να συµπεράνουµε ότι µόνο οι ουσίες που εκλούονται µέχρι και 5 min µετά την έναρξη της βαθµωτής µεταβολής επηρεάζονται από το φαινόµενο «solvent demixing». Σε αντίθεση, ουσίες που συγκρατούνται ισχυρότερα στην στατική φάση δείχνουν να µην επηρεάζονται από το συγκεκριµένο φαινόµενο. Με άλλα λόγια θα µπορούσε να υποστηριχθεί ότι οι ουσίες που εκλούονται µετά από το προαναφερόµενο χρονικό διάστηµα είναι σαν να µην «θυµούνται» την διάρκεια και την σύσταση της κινητής φάσης σε κάθε βήµα πριν την έκλουσή τους. Το παράδοξο αυτό µπορεί να ερµηνευτεί αν δεχτούµε ότι υπάρχει κάποιο άλλο φαινόµενο το οποίο να δρα ανταγωνιστικά στο «solvent demixing». Υποθέτουµε ότι αυτό το φαινόµενο θα µπορούσε να είναι οι αργές µεταβολές στη διαµόρφωση των ανθρακικών αλυσίδων της στατικής φάσης, κατά τη διάρκεια τη µεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης [16,17]. Αν όντως υπάρχει µία αργή µεταβολή στη µορφή της στατικής φάσης, είναι πιθανόν οι ανθρακικές αλυσίδες να διατηρούν το σχηµατισµό που έχουν παρουσία καθαρής υδατικής κινητής φάσης (δηλαδή µια διαµόρφωση επίπεδη και παράλληλη στη στατική φάση) για µία χρονική περίοδο µεγαλύτερη από την αρχική ισοκρατική κατάσταση. Έτσι η συγκράτηση της προς ανάλυση ουσίας κατά την διάρκεια της βηµατικής µεταβολής από φ= σε φ max µειώνεται σε σχέση µε την ισοκρατική συµπεριφορά της σε συγκέντρωση κινητής φάση 217

223 ίσης µε φ max. Σε κάθε περίπτωση η µελέτη της ύπαρξης µη ισορροπίας κατά τη διάρκεια µιας βαθµωτής έκλουσης που ξεκινάει µε καθαρή υδατική φάση και οι συνέπειές της στην πρόβλεψη των χρόνων έκλουσης αποτελεί ένα δύσκολο και επιδέχεται περαιτέρω ενασχόληση σε βάθος. Πίνακας Α.ΙV.27 : Σύγκριση πειραµατικών και θεωρητικών χρόνων συγκράτησης όπως υπολογίστηκαν για τις βαθµωτές µεταβολές µονού βήµατος στη συγκέντρωση της iproh χρησιµοποιώντας τη στήλη Aqua Perfect. Για τον υπολογισµό των θεωρητικών χρόνων εφαρµόστηκε η εξ.(2) χρησιµοποιώντας t D = = 5.3 min. Τύπος βαθµωτής έκλουσης Ουσία t R (exp) t R (calc) met dopa tyr m-tyr me-dopa phe me-tyr 5htp n-tyr S 1 1S 2 1S % error t R (exp) t R (calc) % error t R (exp) t R (calc) % error Μ.Ο

224 Α.ΙV.5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συνοψίζοντας, τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τη µελέτη της επίδρασης της ισορροπίας της στήλης κατά τη διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης 9 ή 1 ελεύθερων αµινοξέων παρουσία iproh, MeCN ή MeOH στην κινητή φάση, καταλήγουµε στα παρακάτω συµπεράσµατα: 1. Όταν στην κινητή φάση υπάρχει iproh σαν οργανικός διαλύτης, εµφανίζονται έντονες αποκλίσεις µεταξύ των πειραµατικών χρόνων συγκράτησης των ουσιών κι αυτών που προβλέπονται από τη θεωρία της βαθµωτής έκλουσης. Το φαινόµενο αυτό είναι πιο έντονο όταν η βαθµωτή έκλουση ξεκινάει από καθαρή υδατική κινητή φάση και καταλήγει σε κινητή φάση µε µικρή συγκέντρωση iproh. Οι αποκλίσεις αυτές µεταξύ πειραµατικών και θεωρητικών χρόνων συγκράτησης, δt R = t R (exp) - t R(calc), εµφανίζονται στα χρωµατογραφήµατα αµέσως µετά τη χρονική στιγµή που η πρώτη αλλαγή στη σύσταση της κινητής φάσης φτάνει στον ανιχνευτή και διαρκούν περίπου 5min. Μέσα σε αυτήν τη χρονική διάρκεια και για περίπου 2min οι αποκλίσεις αυτές αυξάνουν απότοµα και γραµµικά µε το χρόνο, ενώ στη συνέχεια ελαττώνονται εκθετικά µε το χρόνο. Λόγω των παραπάνω παρατηρήσεων, η ταυτοποίηση των αµινοξέων ήταν δύσκολη στο αρχικό τµήµα των χρωµατογραφηµάτων, δηλαδή για τα πιο πολικά αµινοξέα που εκλούονται νωρίς, και για τον λόγο αυτό στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήσαµε λιγότερα αµινοξέα από αυτά που χρησιµοποιήθηκαν στο προηγούµενο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής. Συγκεκριµένα χρησιµοποιήθηκαν 1 αµινοξέα : met, dopa, tyr, m-tyr, medopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr και trp, ή µόνο 9, δηλαδή τα παραπάνω αµινοξέα χωρίς την trp που ούτως ή άλλως λόγω της έκλουσής της στη τελευταία θέση του χρωµατογραφήµατος δεν επηρεάζεται από το παραπάνω περιγραφόµενο φαινόµενο. Επιπλέον για την καλύτερη ταυτοποίηση των εκλουόµενων αµινοξέων χρησιµοποιήσαµε σε όλη τη µελέτη αυτή διπλή ανίχνευση που ήταν είτε απορρόφηση στο UV σε δύο 219

225 µήκη κύµατος, 2 και 21 nm αντίστοιχα, είτε ταυτόχρονη ηλεκτροχηµική ανίχνευση στα 1.1V ως προς Ag/AgCl και απορρόφηση στο UV στα 2 nm. 2. Οι αποκλίσεις αυτές µεταξύ πειραµατικών και θεωρητικών χρόνων συγκράτησης των εκλουόµενων ουσιών κατά τη διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης εξασθενούν σηµαντικά όταν στην κινητή φάση χρησιµοποιηθεί το MeCN αντί για την iproh και πρακτικά εξαφανίζονται παρουσία της ΜeOH στην κινητή φάση. 3. Η ύπαρξη των παραπάνω περιγραφόµενων αποκλίσεων µεταξύ πραγµατικών και θεωρητικών χρόνων συγκράτηση οφείλονται στη µη ισορροπία της στήλης κατά τη διάρκεια του αρχικού τµήµατος της βαθµωτής µεταβολής του οργανικού τροποποιητή και κυρίως της iproh. Η µη ισορροπία της στήλης αποδίδεται σε δύο ανταγωνιστικά φαινόµενα: α) στο φαινόµενο «solvent demixing» το οποίο ενεργεί µόλις ξεκινήσει η βαθµωτή µεταβολή και προκαλεί µία αύξηση στο χρόνο συγκράτησης των ουσιών, και β) στην αργή µεταβολή της διαµόρφωσης των ανθρακικών αλυσίδων της στατικής φάσης που οφείλεται στην µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης κατά την διάρκεια του αρχικού τµήµατος της βαθµωτής µεταβολής και προκαλεί µείωση στον χρόνο συγκράτησης των ουσιών. 4. Βασιζόµενοι στις παραπάνω παρατηρήσεις για τη µεταβολή του δt R ως προς το χρόνο ή καλύτερα ως προς το σχετικό χρόνο που ορίζεται από την εξίσωση t rel = t R(calc) -t D -t -t 1, υπολογίσαµε τις παραµέτρους της Εξ. (7) που περιγράφουν τις µεταβολές αυτές για τους διάφορους τύπους βαθµωτής έκλουσης που µελετήσαµε. Παρατηρήσαµε ότι η µορφή των µεταβολών αυτών δt R ως προς t rel, εξαρτάται από τον οργανικό τροποιητή, από την αρχική και την τελική συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή στην βαθµωτή έκλουση και από τον τύπο της βαθµωτής έκλουσης, δηλαδή εάν είναι βηµατική ή γραµµική. Τέλος, διορθώσαµε τη θεωρητική πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης ουσιών κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης χρησιµοποιώντας την εξίσωση t R(cor) = δt R + t R(calc) 22

226 όπου το δt R παρέχεται από την Εξ. (7) για κάθε διαφορετικό τύπο βαθµωτής µεταβολής. 5. Οι παραπάνω διορθώσεις, που έγιναν µε τη µέθοδο που περιγράψαµε, στους χρόνους συγκράτησης των ουσιών κάτω από συνθήκες µη ισορροπίας στη βαθµωτή έκλουση είναι ικανοποιητικές. Συνεπώς η µέθοδος που αναπτύξαµε στο κεφάλαιο αυτό της διαδακτορικής διατριβής επιτρέπει µια αρκετά ακριβή περιγραφή της συγκράτησης των αµινοξέων, ακόµη και υπό συνθήκες µη ισορροπίας της στήλης κατά τη διάρκεια της βαθµωτής έκλουσης, γεγονός που έχει ως άµεση συνέπεια τη δυνατότητα βελτιστοποίησης ενός τέτοιου διαχωρισµού. Όµως παρόλα αυτά, προτείνουµε ότι καλό θα ήταν να αποφεύγεται η χρήσης της βαθµωτής έκλουσης που ξεκινάει από καθαρή υδατική κινητή φάση, ιδιαίτερα όταν πρόκειται να χρησιµοποιηθεί η iproh σαν οργανικός διαλύτης στη βαθµωτή µεταβολή. Στην περίπτωση δε που η πολικότητα των διαχωριζόµενων ουσιών δεν επιτρέπει κάτι τέτοιο, προτείνουµε τη χρήση µιας αρχικής κινητής φάσης µε κάποια πολύ µικρή περιεκτικότητα οργανικού διαλύτη αντί για µια καθαρή υδατική φάση, και το συνδυασµό βαθµωτής µεταβολής στη συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη µε ταυτόχρονη µεταβολή της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης. 221

227 Α.ΙV.6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, K. Papachristos, J. Chromatogr. A, 133 (24) 283. [2] P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, J. Chromatogr. A, 168 (25) 279. [3] P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, P. Agrafiotou, J. Chromatogr. A, in press. [4] P. Jandera and J. Churacek, Gradient Elution in Liquid Chromatography. Theory and Practice, Elsevier, Amsterdam, [5] L.R. Snyder and J.W. Dolan, Adv. Chromatogr. 38 (1998) 115. [6] M.A. Quarry, R.L. Grob and L.R. Snyder, J. Chromatogr. 285 (1984) 1. [7] M.A. Quarry, R.L. Grob and L.R. Snyder, J. Chromatogr. 285 (1984) 19. [8] P. Jandera, Adv. Chromatogr. 43 (25) 1. [9] A. Velayudhan, M.R. Ladisch, Anal. Chem., 63 (1991) 228. [1] A. Velayudhan, M.R. Ladisch, Ind. Eng. Chem. Res., 34 (1995) 285. [11] P. Jandera, M. Kuserova, J. Chromatogr. A, 759 (1997) 13. [12] D.D. Lisi, J.D. Stuart, L.R. Snyder, J. Chromatogr., 555 (1991) 1. [13] A. Velayudhan, M.R. Ladisch, Chem. Eng. Sci., 47 (1992) 233. [14] N. Le Ha, J. Ungvaral, E. Kovats, Anal. Chem., 34 (1982) 241. [15] P. Jandera, L. Petranek, M. Kucerova, J. Chromatogr. A, 791 (1997) 1. [16] R.K. Gilpin, J. Chromatogr. A, 656 (1993) 217. [17] A. Vailaya, Cs. Horvath, J. Chromatogr. A, 829 (1988) 1. [18] K. Nugent, W. Burton, L.R. Snyder, J. Chromatogr., 443 (1988)

228 [19] M. Hanson, K.K. Unger, J. Schmid, K. Albert, E. Bayeer, Anal. Chem. 65 (1993) [2] Y. Liu, D.J. Anderson, J.R. Shainoff, J. Chromatogr. A, 753 (1996) 63. [21] P.Nikitas, A.Pappa-Louisi, Anal. Chem., 77 (25) 567. [22] A. Pappa-Louisi, P. Nikitas, P. Balkatzopoulou, C. Malliakas, J. Chromatogr. A, 133 (24)

229 224

230 Β ΜΕΡΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ HPLC ΚΑΙ ΣΤΗΛΕΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ

231 226

232 Β.Ι ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ AQC B.I.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα τελευταία χρόνια για την ανάλυση των αµινοξέων χρησιµοποιείται κατά κύριο λόγο η υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). Μέχρι σήµερα έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνικές µελέτης τους µε την βοήθεια της HPLC, από τις οποίες άλλες αφορούν την µελέτη των αµινοξέων σε ελεύθερη µορφή, ως έχουν δηλαδή (όπως είδαµε στο Α Μέρος της παρούσας διατριβής), και άλλες τη µελέτη τους κατόπιν παραγωγοποίησης (B Μέρος διατριβής). Η δεύτερη περίπτωση είναι πιο διαδεδοµένη διότι η δυνατότητα ανίχνευσης των ελεύθερων αµινοξέων είναι περιορισµένη µιας και τα περισσότερα από αυτά δεν περιέχουν κάποια οµάδα ιδιαίτερα χρωµοφόρα, φθορίζουσα ή ηλεκτροενεργή, οπότε ήταν φυσικό επακόλουθο να αναπτυχθούν διάφοροι µέθοδοι σχηµατισµού παραγώγων αµινοξέων που θα παρουσιάζουν µεγαλύτερο φθορισµό, µεγαλύτερη ηλεκτροχηµική δράση ή απορρόφηση στο UV-ορατό. Όσο αφορά την παραγωγοποίηση υπάρχουν δύο τεχνικές [1-4]: α. παραγωγοποίηση των αµινοξέων µετά τoν διαχωρισµό τους από την στήλη της υγρής χρωµατογραφίας (post-column derivatization), και β. παραγωγοποίηση τους πριν τον διαχωρισµό τους στην στήλη (pre-column derivatization). Η πρώτη τεχνική είναι ουσιαστικά η τεχνική που έχει καθιερωθεί στα περισσότερα εργαστήρια και αποτελεί κατά κάποιο τρόπο την παραδοσιακή µέθοδο µελέτης, ενώ η δεύτερη αναπτύσσεται τα τελευταία χρόνια και φαίνεται ότι είναι µια καλή εναλλακτική λύση της παραδοσιακής µεθόδου, έχοντας ίσως περισσότερα πλεονεκτήµατα όσον αφορά την ευαισθησία, την ταχύτητα ανάλυσης και την απαίτηση σε όργανα. Για την 227

233 παραγωγοποίηση των αµινοξέων έχουν µελετηθεί διάφορα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης εκ των οποίων τα πιο σηµαντικά είναι τα εξής : phenylisothiocyanate (αντιδραστήριο του Edman, PITC) [4,5], orthophthaldialdehyde (OPA) [6-8], ninydrin [9], dimethylaminonaphthalensulphonyl chloride (Dansyl-Cl) [1,11], fluorescamine [12,13], 4- dimethylaminoazobenzesulfonyl chloride (Dabsyl-Cl) [2,14], 9-fluorenylmethyl-chloroformate (9-FMOC) [3,15], 7- fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) [16,17], naphthalene-2,3- dicarboxaldehyde (NDA) [4,18,19] και το 6-aminoquinolyl-nhydorxysuccinimidyl carbamate (AQC) [2-22]. Όλα τα παραπάνω αντιδραστήρια παραγωγοποίησης δίνουν παράγωγα που είναι ανιχνεύσιµα φθορισµοµετρικά (εκτός από τα παράγωγα της νινυδρίνης (ninydrin)), ενώ ορισµένα από αυτά όπως το OPA και το NDA, περιέχουν οµάδες ηλεκτροχηµικά ενεργές (ισο-ινδολικές οµάδες), µε αποτέλεσµα να µπορούν να ανιχνευθούν και µε ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή. Παρά τη σχετικά ευρεία χρήση των παραπάνω αντιδραστηρίων, θα πρέπει να έχουµε υπόψη κάποια σηµαντικά µειονεκτήµατα που παρουσιάζουν : το PITC απαιτεί αρκετό χρόνο για να ολοκληρωθεί η αντίδραση παραγωγοποίησης (περίπου 2 min) και είναι απαραίτητο να αποµακρυνθεί η περίσσεια του µε εξάτµιση µέχρι ξηρού. To ΟPA δεν αντιδρά µε δευτεροταγή αµινοξέα και συχνά τα παράγωγα που δηµιουργεί είναι ασταθή. Το FMOC σε πολλές περιπτώσεις δηµιουργεί πολλαπλά παράγωγα και πρέπει να αποµακρύνεται η περίσσεια του πριν την ανάλυση. Το Dansyl-Cl απαιτεί και αυτό πολύ χρόνο µέχρι να ολοκληρωθεί η αντίδραση παραγωγοποίησης, περίπου 3 min, και τα παράγωγά του είναι συνήθως ασταθή. Τέλος, η παραγωγοποίηση µε το FMOC και το PITC έχει µικρό ποσοστό απόδοσης παρουσία κοινών ρυθµιστικών διαλυµάτων. Όµως τα περισσότερα από τα παραπάνω µειονεκτήµατα φαίνεται να µην εµφανίζονται στο AQC το οποίο αντιδρά τόσο µε πρωτοταγή όσο και µε δευτεροταγή αµινοξέα, η περίσσειά του δεν χρειάζεται να αποµακρυνθεί και ο χρόνος αντίδρασης της παραγωγοποίησης είναι ικανοποιητικός. Επίσης, τα παράγωγα των αµινοξέων µε AQC έχουν το πλεονέκτηµα να 228

234 είναι ηλεκτροχηµικά ενεργά [2]. Έτσι, εξαιτίας των όσων αναφέρθηκαν πιο πάνω, επιλέξαµε το AQC για την παραγωγοποίηση των αµινοξέων. Σκοπός του κεφαλαίου αυτού είναι να βελτιστοποιήσουµε την ανίχνευση και τον διαχωρισµό των παραγώγων των αµινοξέων µε AQC και να συγκρίνουµε την ανάλυση µε HPLC των παραγωγοποιηµένων και µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων. Προφανώς στην µελέτη αυτή επιλέξαµε για παραγωγοποίηση τα αµινοξέα που µελετήσαµε στο Α Μέρος της διατριβής και τα οποία µπορούν να αναλυθούν και να ανιχνευθούν άµεσα χωρίς παραγωγοποίηση. Συνεπώς, τα αµινοξέα τα οποία µελετήθηκαν και στο κεφάλαιο αυτό είναι τα ακόλουθα 17 : 5-υδροξυ-τρυπτοφάνη (5htp), κυστείνη (cys), οµοκυστείνη (hcy), ιστιδίνη (his), beta-(3,4- διύδροξυφαίνυλο)-αλανίνη (dopa), α-µέθυλο-dopa (me-dopa), τρυπτοφάνη (trp), µεθιονίνη (met), φαινυλαλανίνη (phe), τυροσίνη (tyr), µεθυλο-τυροσίνη (me-tyr), µετα-τυροσίνη (m-tyr), νίτρο-τυροσίνη (ntyr), s-µεθυλο-κυστείνη (me-cys), καρνοσίνη (car), κρεατίνη (crn) και κρεατινίνη (cre). Β.Ι.2 ΤΟ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ AQC Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, το ΑQC είναι ένα αντιδραστήριο παραγωγοποίησης το οποίο χρησιµοποιείται στην ανάλυση των αµινοξέων και φαίνεται να υπερτερεί έναντι των άλλων αντιδραστηρίων έχοντας ένα µεγάλο αριθµό πλεονεκτηµάτων. Όπως παρατηρείται στο Σχήµα Β.Ι.1, όπου απεικονίζεται το µόριο του ΑQC, στο µόριο της ουσίας αυτής υπάρχει µία αρωµατική αµινοµάδα δηλ. η αµινοκινολίνη. Γενικά οι αρωµατικές αµίνες (π.χ. η 2-229

235 αµινοκινολίνη, η ανιλίνη) είναι ηλεκτροχηµικά ενεργές και γι αυτό το λόγο θα πρέπει και τα παράγωγα του AQC να µπορούν να ανιχνευτούν µε ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή [2]. Έτσι είναι δυνατόν αµινοξέα τα οποία δεν είναι από µόνα τους ηλεκτροχηµικά ενεργά, όπως η phe, να γίνονται αντιδρώντας µε το AQC. O H N O N O N O Σχήµα Β.Ι.1 : To µόριο του AQC Στο Σχήµα Β.Ι.2 απεικονίζεται η αντίδραση παραγωγοποίησης του AQC µε αµίνες ή αµινοξέα, η οποία είναι ταχύτατη (t 1/2 << 1 s) καθώς και ποσοτική, επαναλήψιµη και γραµµική για µία ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων [2,24]. Η περίσσεια του αντιδραστηρίου υδρολύεται πολύ γρήγορα (t 1/2 << 15 s) παράγοντας την 6-αµινοκινολίνη (AMQ), διοξείδιο του άνθρακα και το N-hydroxysuccinimide (NHS), µε αποτέλεσµα ουσιαστικά µετά από 1min να µην µπορεί να λάβει χώρα περαιτέρω παραγωγοποίηση. Η ΑΜQ έχει το ίδιο µήκος κύµατος διέγερσης µε τα παράγωγα, 248nm, αλλά διαφορετικό µήκος κύµατος εκποµπής, 52nm, µε αποτέλεσµα να µην εµποδίζει την φθορισµοµετρική ανίχνευση των αµινοξέων. Όσο αφορά όµως το UV, η AMQ εµφανίζει µία τεράστια κορυφή στα πρώτα λεπτά της ανάλυσης, κάτι που µπορεί να εµποδίζει την ανίχνευση ορισµένων παραγώγων των αµινοξέων τα οποία εκλούονται νωρίς. Ανάλογο φαινόµενο παρατηρείται και στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, όπου η AMQ παρέχει µία διπλή κορυφή στην αρχή του 23

236 χρωµατογραφήµατος (βλ. χρωµατογραφήµατα πιο κάτω). Συνεπώς, το γεγονός ότι η περίσσεια του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης AQC υδρολύεται προς AMQ έχει το πλεονέκτηµα ότι δεν απαιτείται η αποµάκρυνση της περίσσειας του συγκεκριµένου αντιδραστηρίου, όπως συµβαίνει στην περίπτωση του PITC και του FMOC, αφού δεν δηµιουργούνται ουσιαστικά προβλήµατα στην ανίχνευση των παραγώγων. Συνοπτικά, τα πλεονεκτήµατα που εµφανίζει το AQC σαν αντιδραστήριο παραγωγοποίησης των αµινοξέων είναι τα ακόλουθα : 1. Αντιδρά µε πρωτοταγή και δευτεροταγή αµινοξέα. 2. Η αντίδραση παραγωγοποίησης ανάµεσα στις αµινοµάδες και στο AQC ολοκληρώνεται µέσα σε δευτερόλεπτα και είναι ταχύτερη συγκριτικά µε τα υπόλοιπα αντιδραστήρια λόγω της τιµής του t 1/2 (t 1/2 << 1 s). 3. Έχει υψηλή ευαισθησία µε όριο ανίχνευσης της τάξης του fmol, 4. Η περίσσεια του αντιδραστηρίου καταστρέφεται χωρίς να επηρεάσει την ανάλυση και χωρίς να χρειάζονται περαιτέρω διεργασίες αποµάκρυνσής του. 5. Τα παράγωγα που σχηµατίζονται είναι σταθερά και µπορούν να διατηρηθούν για περίπου µια βδοµάδα εντός του ψυγείου. 6. Τα διάφορα άλατα που µπορεί να υπάρχουν στο προς ανάλυση δείγµα δεν επηρεάζουν την αντίδραση παραγωγοποίησης. 7. Τα παράγωγα που προκύπτουν µπορούν να ανιχνευτούν µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή, µε ανιχνευτή ορατού-υπεριώδους καθώς και µε ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή. 231

237 H N O N O N O O 1 o or 2 o Amine or Amino Acid HN R 1 R 2 Fast, t 1/2 <<1s +H 2 O Slow,t 1/2 ~15s N H N O R 1 N R 2 O O HO NH 2 HO N + + N + CO 2 O N O Derivatized Amine NHS AMQ NHS Σχήµα Β.Ι.2 : Αντίδραση παραγωγοποίησης αµινών και αµινοξέων µε το αντιδραστήριο AQC. Β.Ι.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Β.Ι.3.1 ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΤΟ AQC Η παραγωγοποίηση των αµινοξέων µε το αντιδραστήριο AQC πραγµατοποιήθηκε µε την τεχνική που περιγράφεται στην βιβλιογραφία [18-35]. Αρχικά, σε θερµοκρασία περιβάλλοντος, διαλύουµε το στερεό 232

238 AQC σε ακετονιτρίλιο (MeCN) ώστε να σχηµατίσουµε διάλυµα συγκέντρωσης 3 mg/ml. Στη συνέχεια σε ένα δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετούµε 1µL από το αµινοξύ ή το διάλυµα των αµινοξέων που θέλουµε να παραγοντοποιήσουµε, καθώς και 7 µl ρυθµιστικού διαλύµατος βορικών (borate buffer,,2μ, ph=8.8) και τα αναδεύουµε ισχυρά. Έπειτα, τοποθετούµε στον ίδιο δοκιµαστικό σωλήνα 2µL από το διάλυµα του AQC που παρασκευάσαµε, αναδεύουµε ισχυρά και τέλος το θερµαίνουµε στους 5 o C για 1 min. Ο µοναδικός σκοπός της θέρµανσης είναι να µετατρέψει τα διάφορα παράγωγα που παρέχει η tyr κατά την αντίδραση παραγωγοποίησης σε ένα και µοναδικό παράγωγο- διαδικασία που επιταχύνεται µε την θέρµανση. Η σκόνη AQC, το MeCN που χρησιµοποιείται για την διάλυση του AQC και το ρυθµιστικό διάλυµα των βορικών παρέχονται ως kit από την Waters Corporation. Η αντίδραση παραγωγοποίησης µε τα αµινοξέα απεικονίζεται πιο πάνω, στο Σχήµα Β.Ι.2. Η αρχική συγκέντρωση όλων των αµινοξέων ήταν 1 µg/ml, η οποία όµως τελικά στο ενέσιµο διάλυµα υποδεκαπλασιάζεται λόγω της παραπάνω διαδικασίας παραγωγοποίησης (γίνεται τελικά 1 µg/ml). Β.Ι.3.2 ΣΥΣΤΗΜΑ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ -ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ - ΣΤΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ - ΚΙΝΗΤΕΣ ΦΑΣΕΙΣ Το σύστηµα της υγρής χρωµατογραφίας, καθώς και οι ανιχνευτές, είναι ίδια µε τα αντίστοιχα που αναφέρονται στο Α Μέρος της διδακτορικής διατριβής. Η στήλη που χρησιµοποιήθηκε ήταν MZ-Analytical Column Perfectsil 25x4.6mm 12 ODS 5µm και η θερµοκρασία της διατηρούταν σταθερή στους 25 o C. Στις µελέτες που επακολούθησαν χρησιµοποιήθηκαν τρεις ανιχνευτές σε σειρά, οι οποίοι ήταν συνδεδεµένοι µε την ακόλουθη 233

239 σειρά : ανιχνευτής ορατού- υπεριώδους (UV-Vis), φθορισµοµετρικός (FL) και ηλεκτροχηµικός (EC) ανιχνευτής. Οι κινητές φάσεις που χρησιµοποιήθηκαν ήταν διάφορα υδατικά διαλύµατα ΜeCN ph=2.5, ιονικής ισχύος,2μ (ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών H 3 PO 4 -K 2 HPO 4 ). Χρησιµοποιώντας τις παραπάνω κινητές φάσεις, µελετήθηκε τόσο η ισοκρατική συµπεριφορά των παραγώγων των αµινοξέων όσο και η συµπεριφορά τους κάτω από συνθήκες βαθµωτής γραµµικής έκλουσης (gradient). Οι συνθήκες της βαθµωτής έκλουσης που µελετήθηκαν δίνονται στον Πίνακα Β.Ι.9. Η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης ήταν 1 ml/min. Η ανίχνευσή τους πραγµατοποιήθηκε στα 254 nm µε το UV, στο 1,1V ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl στον ηλεκτροχηµικό, χρησιµοποιώντας ως ηλεκτρόδιο εργασίας υαλώδες άνθρακα διαµέτρου 3mm, ενώ το µήκος κύµατος διέγερσης και εκποµπής στο φθορισµόµετρο ήταν 248 nm και 395 nm, αντίστοιχα. Ο dwell χρόνος, t D, της διάταξης είναι 1,1min και ο νεκρός χρόνος t o της στήλης είναι 2,43 min. Ο χρόνος t o υπολογίστηκε χρησιµοποιώντας το πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης (7) που περιγράφεται στον Πίνακα Β.Ι.9, κάνοντας όµως ένεση απεσταγµένου νερού. Το αντίστοιχο χρωµατογράφηµα χρησιµοποιώντας και τους τρεις ανιχνευτές φαίνεται στο Σχήµα Β.Ι.3, όπου οι τιµές του ρεύµατος στον ΕC ανιχνευτή είναι διαιρεµένες µε το 1 απλά για να είναι τα σήµατα όλων των ανιχνευτών στην ίδια κλίµακα. Η ένταση φθορισµού, σε αυθαίρετες µονάδες, θα αναπαριστάνεται στα χρωµατογραφήµατα από εδώ και πέρα χάριν συντοµίας ως FL. Σε αυτό το σηµείο θα πρέπει να τονιστεί ότι όλα τα χρωµατογραφήµατα καταγράφηκαν µε την ίδια ευαισθησία από τον φθορισµοµετρικό ανιχνευτή. Ο χρόνος t o, όπως και όλοι οι χρόνοι συγκράτησης των ουσιών που αναφέρονται πιο κάτω, βασίζονται στις τιµές του ανιχνευτή UV. Οι χρόνοι που παρέχουν οι άλλοι ανιχνευτές έχουν µία υστέρηση, κάτι απόλυτα φυσιολογικό διότι είναι συνδεδεµένοι µετά το UV. 234

240 I / na, FL I/1 t FL UV / AU 1 AU t / min Σχήµα Β.Ι.3 : Χρωµατογράφηµα που πάρθηκε µε ένεση απεσταγµένου H 2 O, κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης (7) που περιγράφεται στον Πίνακα Β.Ι.9, για εύρεση του νεκρού χρόνου t o. Β.Ι.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Β.Ι.4.1 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Γενικά, τα παραπάνω αµινοξέα που επιλέχθηκαν να µελετηθούν είναι αµινοξέα τα οποία µπορούν να ανιχνευθούν ως έχουν είτε µε την βοήθεια του UV, είτε µέσω του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή, είτε µε την βοήθεια του φθορισµοµετρικού ανιχνευτή, είτε και µε τους τρεις αυτούς ανιχνευτές ή µε τους δύο ταυτόχρονα. Σκοπός πλέον είναι να µελετηθεί πώς η παραγωγοποίηση επιδρά στην συµπεριφορά των αµινοξέων, στην ανίχνευσή τους και γενικά αν είναι προτιµότερο τα συγκεκριµένα αµινοξέα 235

241 να µελετούνται παραγωγοποιηµένα ή µη. Για αυτό το σκοπό, παραγοντοποιώντας τα αµινοξέα µε τον τρόπο που αναφέρθηκε πιο πάνω και διατηρώντας σε σειρά τους τρεις αυτούς ανιχνευτές, θα µελετήσουµε χωριστά την ηλεκτροχηµική, φθορισµοµετρική συµπεριφορά των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων, καθώς και την απορρόφησή τους στην περιοχή ορατού-υπεριώδους. Στο σηµείο αυτό θα πρέπει να διευκρινιστούν τα ακόλουθα : α) από τα 17 αµινοξέα που παραγοντοποιήθηκαν µε το AQC, τα 2 αµινοξέα, cre και crn, εκλούονται στην περιοχή της αρχικής διαταραχής που εµφανίζεται ιδιαίτερα στο UV και στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, ακόµη και όταν σαν κινητή φάση χρησιµοποιείται διάλυµα που περιέχει 1% MeCN, δηλαδή την µικρότερη συγκέντρωση οργανικού διαλύτη που χρησιµοποιήθηκε σε αυτήν την εργασία. β) Η παραγωγοποίηση των 2 αµινοξέων, dopa και me-dopa, δίνει περισσότερα από ένα παράγωγα ελάχιστα ανιχνεύσιµα και στους τρεις ανιχνευτές που χρησιµοποιήσαµε σε σειρά. Συνεπώς η µελέτη περιορίστηκε µόνο στα παράγωγα των παρακάτω δεκατριών αµινοξέων: 5htp, cys, hcy, his, trp, met, phe, tyr, me-tyr, m-tyr, n-tyr, me-cys και car. γ) Το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης πρέπει να φυλάσσεται στο ψυγείο και να µην εκτίθεται στο φως. Όσον αφορά τα παράγωγα των αµινοξέων, παρατηρήθηκε ότι εκτός ψυγείου υπάρχει σηµαντική πτώση των σηµάτων τους. Ποιο συγκεκριµένα, µέσα σε δύο ώρες από την παρασκευή τους παρατηρήθηκε πτώση των σηµάτων τους περίπου στο µισό. Ενώ στο ψυγείο, για κάποιες µέρες, διατηρούταν σταθερά. Συνεπώς, και τα παράγωγα πρέπει να τοποθετούνται αµέσως µετά την ένεση στο ψυγείο προκειµένου να µην υπάρχει αλλοίωση. Η µελέτη των παραγώγων των αµινοξέων, όπως αναφέρθηκε στις παραπάνω παραγράφους, πραγµατοποιείται χρησιµοποιώντας υδατικά διαλύµατα τροποποιηµένα µε MeCN, ενώ η µελέτη των µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων, όπως είδαµε στο Α Μέρος της διατριβής, πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας υδατικά διαλύµατα τροποποιηµένα είτε µε iproh είτε µε MeCN. Αν και στο Α Μέρος είδαµε ότι η ανίχνευση των αµινοξέων δεν έχει ουσιαστική διαφορά όποιος από τους δύο 236

242 τροποποιητές και αν χρησιµοποιηθεί, εν τούτοις για να είναι πιο αξιόπιστη η σύγκριση της ανίχνευσης µεταξύ των αµινοξέων χωρίς και µε παραγωγοποίηση θα χρησιµοποιήσουµε µόνο τα αποτελέσµατα που πήραµε για τα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα παρουσία του MeCN στην κινητή φάση και τα οποία αναγράφονται αναλυτικά στο κεφάλαιο Α.Ι.4.3. Ηλεκτροχηµική µελέτη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων Σύγκριση µε µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα Όπως αναφέρθηκε και στο Α Μέρος της διδακτορικής διατριβής εκτεταµένως, για την ηλεκτροχηµική µελέτη οποιασδήποτε ουσίας πρέπει αρχικά να ληφθεί το υδροδυναµικό διάγραµµα ρεύµατος δυναµικού ή φορτίου δυναµικού (I vs. E ή Q vs. E) της συγκεκριµένης ουσίας και να προσδιοριστούν το ορικό ρεύµα και το δυναµικό µισού κύµατος ( Ε 1/2 ). Έτσι, αρχικά µελετήσαµε την οξείδωση των παραγωγοποιηµένων και µη αµινοξέων σε µία περιοχή δυναµικών από,45v µέχρι 1,35V χρησιµοποιώντας ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα διαµέτρου 3mm. Μετά την παραγωγοποίηση των 13 αµινοξέων µε το αντιδραστήριο AQC αυτά που βρέθηκαν να είναι ηλεκτροχηµικά ενεργά και µελετήθηκαν συστηµατικά είναι τα εξής : cys, me-cys, hcy, 5htp, tyr, m-tyr, met, metyr, n-tyr, phe και trp. Πιο συγκεκριµένα, όσον αφορά τις ουσίες his και car δεν µπορούµε να πάρουµε τα υδροδυναµικά τους διαγράµµατα γιατί εκλούονται πολύ νωρίς - δεν συγκρατούνται στην στήλη οπότε δεν γίνεται να µεταβληθεί ο χρόνος συγκράτησής τους όποια κινητή φάση και αν χρησιµοποιηθεί - ακριβώς την χρονική στιγµή όπου εµφανίζονται οι δύο τεράστιες κορυφές που οφείλονται στην οξείδωση του προϊόντος υδρόλυσης του AQC, δηλαδή στην AMQ. Στον Πίνακα Β.Ι.1 καταγράφονται οι τιµές των ρευµάτων για τις διάφορες τιµές δυναµικών ( (Α) µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα και (Β) 237

243 παραγωγοποιηµένα αµινοξέα), ενώ στον Πίνακα Β.Ι.2 οι τιµές των φορτίων στις διάφορες τιµές δυναµικών ((Α) µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα και (Β) παραγωγοποιηµένα αµινοξέα). Στα Σχήµατα Β.Ι.4 και Β.Ι.5 απεικονίζονται τα υδροδυναµικά διαγράµµατα του ρεύµατος οξείδωσης (Ι/nA) και του φορτίου οξείδωσης (Q/nC) ως προς το εφαρµοζόµενο δυναµικό (Ε,V), αντίστοιχα, των παραγώγων των αµινοξέων. Η µελέτη έγινε χρησιµοποιώντας υδατική κινητή φάση τροποποιηµένη µε MeCN 25%, ph=2.5 ενώ η ιονική ισχύς του φέροντα ηλεκτρολύτη (K 2 HPO 4 H 3 PO 4 ) ήταν,2 Μ. Στο σηµείο αυτό πρέπει να τονίσουµε ότι οι τιµές των ρευµάτων ή φορτίων που αναφέρονται στα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα έχουν διαιρεθεί µε το 1 σε σχέση µε αυτές που υπάρχουν στους αντίστοιχους πίνακες του Α µέρους της διατριβής και αυτό γιατί η συγκέντρωση των µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων στο ενέσιµο διάλυµα είναι δεκαπλάσια από την αντίστοιχη συγκέντρωση των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων. Γνωρίζουµε ότι γενικά ο ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής είναι από τους πιο ευαίσθητους ανιχνευτές αλλά υπάρχει µεγάλη πιθανότητα παθητικοποίησης του µετά από µια σειρά πειραµάτων, µε αποτέλεσµα τα σήµατα που παρέχει να µην είναι αξιόπιστα. Επίσης, γνωρίζουµε ότι µε την διαδικασία της παραγωγοποίησης, ουσιαστικά στις µετρήσεις υπεισέρχεται µια επιπλέον πηγή σφαλµάτων. Τα σφάλµατα αφορούν την ακρίβεια των ποσοτήτων των αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης, την αποτελεσµατικότητα της αντίδρασης παραγωγοποίησης δηλ. αν έχει παραγοντοποιηθεί όλη η ποσότητα του αµινοξέος, αν έχουν σχηµατιστεί παραπροϊόντα, την σταθερότητα των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων κατά την χρονική περίοδο διεξαγωγής των πειραµάτων, κ.α. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες φυσικά επηρεάζουν τις ιδιότητες και την ποσότητα του αµινοξέος που θα φτάσει στον ανιχνευτή και συνεπώς το σήµα του. Κατά την παραγωγή των υδροδυναµικών διαγραµµάτων, χρησιµοποιώντας τον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, διατηρούσαµε συνδεδεµένα σε σειρά το UV-Vis και τον φθορισµοµετρικό ανιχνευτή. Είναι φανερό ότι επειδή το µήκος κύµατος του UV και του φθορισµοµετρικού ανιχνευτή παρέµενε σταθερό, 238

244 θα πρέπει και το αντίστοιχο σήµα της κάθε ουσίας σε σταθερό δυναµικό, να διατηρείται σταθερό. Τυχόν αυξοµειώσεις στα σήµατά τους σηµαίνει ότι υπεισέρχεται οποιοδήποτε πειραµατικό σφάλµα σχετικό µε το δείγµα και την λειτουργία της χρωµατογραφικής συσκευής, το οποίο προφανώς και επηρεάζει και το σήµα του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή. Αν όµως ελαττώνεται µόνο το σήµα του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή, που καταγράφεται σε σταθερό δυναµικό, ενώ τα σήµατα των άλλων παραµένουν σταθερά, τότε προφανώς υπάρχει πρόβληµα στο ηλεκτρόδιο, δηλαδή παθητικοποίηση, και πρέπει να προβούµε σε ηλεκτροχηµικό ή µηχανικό καθαρισµό του ηλεκτροδίου. Συνεπώς, κατά την λήψη των υδροδυναµικών διαγραµµάτων, για να είµαστε σίγουροι ότι οι µεταβολές του σήµατος του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή οφείλονται αποκλειστικά και µόνο στην µεταβολή του δυναµικού, καλό θα ήταν να κανονικοποιήσουµε τα σήµατά του ως προς τις αντίστοιχες τιµές του UV ή του φθορισµοµετρικού ανιχνευτή, δηλαδή να διαιρέσουµε τις ενδείξεις του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή µε τις αντίστοιχες ενδείξεις ενός από τους άλλους δύο ανιχνευτές. Και αυτό γίνεται ουσιαστικά για την ποιοτική µελέτη των υδροδυναµικών διαγραµµάτων, δηλαδή για να φανούν καλύτερα τα κύµατα οξείδωσης, η περιοχή όπου λαµβάνεται το ορικό ρεύµα των ουσιών, καθώς και τα δυναµικά µισού κύµατος. εν έχει σηµασία αν θα κανονικοποιηθούν οι τιµές του ρεύµατος ή του φορτίου. Σε αυτήν την περίπτωση, όπως φαίνεται και στον Πίνακα Β.Ι.3, κανονικοποιούµε και τις τιµές φορτίου αλλά και τις τιµές ρευµάτων οξείδωσης. Στα Σχήµατα Β.Ι.6 και Β.Ι.7 απεικονίζονται τα υδροδυναµικά διαγράµµατα των αµινοξέων µε τις κανονικοποιηµένες τιµές (Β.Ι.6 τιµές ρευµάτων οξείδωσης, I/nA, και Β.Ι.7 τιµές φορτίου, Q/nC), από όπου και θα προκύψουν οι τιµές των δυναµικών εµφάνισης ορικού ρεύµατος οξείδωσης, E ορ, και µισού κύµατος, E 1/2, οι οποίες καταγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.4. Στην περίπτωση των µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων η κανονικοποίηση αυτή δεν είναι απαραίτητη να γίνει διότι δεν υπεισέρχεται κάποιο σφάλµα από την διαδικασία παραγωγοποίησης των αµινοξέων, τα 239

245 οποία είναι σταθερά για την χρονική διάρκεια της διεξαγωγής των πειραµάτων, όπως είδαµε στο Α Μέρος της διδακτορικής διατριβής. Παρατηρώντας τα υδροδυναµικά διαγράµµατα των κανονικοποιηµένων τιµών φορτίου και ρεύµατος και συγκρίνοντάς τα µε τα αντίστοιχα µη κανονικοποιηµένα, παρατηρούµε ότι όντως τα αποτελέσµατα µε την κανονικοποίηση οµαλοποιούνται. Χαρακτηριστικά θα αναφέρουµε την περίπτωση της cys όπου τα δύο κύµατα οξείδωσης φαίνονται πολύ καθαρά µετά την κανονικοποίηση των τιµών. Επίσης η trp δείχνει να έχει δύο κύµατα οξείδωσης στα µη κανονικοποιηµένα διαγράµµατα. Όµως µετά την κανονικοποίηση του φορτίου φαίνεται να έχει ένα κύµα οξείδωσης. Αυτό σηµαίνει ότι το τοπικό ελάχιστο που φαίνεται στην καµπύλη στην πρώτη περίπτωση οφείλεται προφανώς σε πειραµατικό σφάλµα. Όσον αφορά τις υπόλοιπες ουσίες, η µορφή των υδροδυναµικών διαγραµµάτων είναι καλύτερη ( ιδιαίτερα του παραγώγου της 5htp), φαίνονται πιο ξεκάθαρα τα κύµατα οξείδωσής τους κατόπιν παραγωγοποίησης. 24

246 Πίνακας Β.Ι.1 : Τιµές ρευµάτων (I,nA) των µη παραγωγοποιηµένων (A) και παραγωγοποιηµένων αµινοξέων (B) στις διάφορες τιµές. A. Ουσίες Volt cys me-cys hcy 5htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr phe trp B. Ουσίες Volt cys me-cys hcy 5htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr phe trp

247 Πίνακας Β.Ι.2 : Τιµές φορτίου οξείδωσης (Q, nc) των (A) µη παραγωγοποιηµένων και (B) παραγωγοποιηµένων αµινοξέων στις διάφορες τιµές δυναµικών. A. Ουσίες Volt cys me-cys hcy 5htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr phe trp B. Ουσίες Volt cys me-cys hcy 5htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr phe trp

248 Πίνακας Β.Ι.3 : Τιµές φορτίου οξείδωσης (Α) και ρευµάτων οξείδωσης (Β) των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων κανονικοποιηµένες ως προς τις αντίστοιχες τιµές του UV, στις διάφορες τιµές δυναµικών. Α. Ουσίες Volt cys me-cys hcy 5htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr phe trp Β. Ουσίες Volt cys me-cys hcy 5htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr phe trp

249 Πίνακας Β.Ι.4: Τιµές δυναµικών οξείδωσης (V), δυναµικών µισού κύµατος (V) και τιµές ορικών ρευµάτων (na) των µη παραγωγοποιηµένων (Α) και των παραγωγοποιηµένων (Β) αµινοξέων. (Α) Ουσίες Ε ορ α κύµα οξείδωσης Ε ορ β κύµα οξείδωσης Ε 1/2 α κύµα οξείδωσης Ε 1/2 β κύµα οξείδωσης Ορικό ρεύµα cys me-cys hcy htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr phe trp (Β) Ουσίες Ε ορ α κύµα οξείδωσης Ε ορ β κύµα οξείδωσης Ε 1/2 α κύµα οξείδωσης Ε 1/2 β κύµα οξείδωση Ορικό ρεύµα cys εν λαµβάνετα me-cys ορικό ρεύµα hcy htp tyr m-tyr met εν λαµβάνετα ορικό ρεύµα me-tyr n-tyr phe εν λαµβάνετα ορικό ρεύµα trp

250 4, I / na 35, 3, 25, 2, 15, cys me-cys hcy 5htp tyr me-tyr 1, 5,,,4,5,6,7,8,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 E / V vs Ag/AgCl 35. I / na m-tyr n-tyr phe trp met E / V vs Ag/AgCl Σχήµα Β.Ι.4: Υδροδυναµικά διαγράµµατα παραγωγοποιηµένων αµινοξέων µε τιµές ρευµάτων οξείδωσης (I / na) ως προς τιµές δυναµικού. 245

251 3. Q / nc cys me-cys hcy 5htp tyr me-tyr E / V vs Ag/AgCl 35. Q / nc m-tyr n-tyr phe trp met E / V vs Ag/AgCl Σχήµα Β.Ι.5: Υδροδυναµικά διαγράµµατα παραγωγοποιηµένων αµινοξέων µε τιµές φορτίων οξείδωσης (Q / nc ) ως προς τιµές δυναµικού. 246

252 cys me-cys hcy 5htp tyr me-tyr E / V vs Ag/AgCl m-tyr n-tyr phe trp met E / V vs Ag/AgCl Σχήµα Β.Ι.6 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα αµινοξέων µε τιµές ρευµάτων οξείδωσης κανονικοποιηµένες µε τις αντίστοιχες τιµές του UV και διαιρεµένες µε το

253 7. Q / Integral UV cys me-cys hcy 5htp tyr me-tyr E / V vs Ag/AgCl m-tyr n-tyr phe trp met Q / Integral UV E / V vs Ag/AgCl Σχήµα Β.Ι.7 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα αµινοξέων µε τιµές φορτίων οξείδωσης κανονικοποιηµένες µε τις αντίστοιχες τιµές του UV. 248

254 Για µια πιο εποπτική σύγκριση της ηλεκτροχηµικής ανίχνευσης των παραγωγοποιηµένων και µη αµινοξέων θα παρατεθούν σε κοινά διαγράµµατα, Σχήµατα Β.Ι.8 και Β.Ι.9, τα µη κανονικοποιηµένα υδροδυναµικά διαγράµµατα των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων µε τα αντίστοιχα των ελεύθερων αµινοξέων, για να µπορεί να γίνει η σύγκριση των ορικών ρευµάτων. Στην περίπτωση των µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων, η κινητή φάση ήταν υδατικά διαλύµατα MeCN, ph=2.5, ιονικής ισχύος.2 Μ K 2 HPO 4 H 3 PO 4, αλλά το κάθε αµινοξύ µελετήθηκε σε διαφορετική συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή διότι για την αντίστοιχη µελέτη χρησιµοποιήθηκε ένα υδατικό διάλυµα όλων των αµινοξέων, και εφαρµόστηκε η µέθοδος της βαθµωτής έκλουσης (για συνθήκες βλ. αντίστοιχο κεφάλαιο Α Μέρος). Η περιεκτικότητα του οργανικού τροποποιητή ουσιαστικά δεν επηρεάζει αισθητά την οξείδωση των ουσιών, συνεπώς το γεγονός ότι οι συγκεντρώσεις του ΜeCN είναι διαφορετικές δεν αναµένεται να έχει κάποια επίδραση στην συγκεκριµένη µελέτη. Αρχικά, πρέπει να σηµειωθεί ότι, από τα 17 αµινοξέα που χρησιµοποιήθηκαν στο Α Μέρος της διατριβής χωρίς παραγωγοποίηαη, οξειδώνονται τα παρακάτω 12: 5htp, cys, hcy, dopa, me-dopa, trp, met, tyr, me-tyr, m-tyr, n-tyr και me-cys, ενώ µε την παραγωγοποίηση τα εξής 11 : 5htp, cys, hcy, trp, met, tyr, me-tyr, phe, m-tyr, n-tyr και me-cys. Επίσης, όπως αναφέρθηκε και στην αρχή, το πιο σηµαντικό είναι ότι ορισµένα αµινοξέα, όπως η dopa και η me-dopa, µε την παραγωγοποίηση δεν ανιχνεύονται ηλεκτροχηµικά λόγω των πολλών παραγώγων που δίνουν, ενώ άλλα αµινοξέα, όπως η phe, γίνεται ηλεκτροχηµικά ενεργή. Με την παραγωγοποίηση ουσιαστικά δεν φαίνεται να µεταβάλλεται ο µηχανισµός οξείδωσης των αµινοξέων, µε την έννοια ότι αµινοξέα που οξειδώνονται σε ένα ή δύο κύµατα, συνεχίζουν να οξειδώνονται µε τον ίδιο τρόπο και µετά την παραγωγοποίηση. Ουσιαστικά, δεν µπορεί να υποστηριχθεί ότι το συγκεκριµένο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης καθιστά τα αµινοξέα περισσότερο ή λιγότερο ευοξείδωτα. Και αυτό φαίνεται συγκρίνοντας τα δυναµικά µισού κύµατος, Ε 1/2, των µη 249

255 παραγωγοποιηµένων και των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων (Πίνακας B.I.4) ή αλλιώς την µετατόπιση των κυµάτων οξείδωσης. Υπάρχουν παραγωγοποιηµένα αµινοξέα όπου το Ε 1/2 µεταφέρεται σε σχέση µε τα ελεύθερα αµινοξέα, σε µικρότερες κατά τι τιµές δυναµικών όπως στην περίπτωση της cys, hcy, trp, n-tyr, ενώ υπάρχουν περιπτώσεις κατά τις οποίες µεταφέρεται κατά τι σε µεγαλύτερες τιµές δυναµικού όπως συµβαίνει πχ στην 5htp, tyr, m-tyr, me-tyr. Όµως αυτές οι µετατοπίσεις είτε σε χαµηλότερα είτε σε υψηλότερα δυναµικά είναι πολύ µικρές. Ουσιαστική διαφορά παρατηρείται στην περίπτωση της met όπου η παραγωγοποίηση ελαττώνει αισθητά την ικανότητα οξείδωσής της αφού σε αυτή την περίπτώση, και για την περιοχή τιµών δυναµικών που µελετάµε, δε λαµβάνει ορικό ρεύµα, εποµένως δεν µπορεί να υπολογιστεί το Ε 1/2, ενώ στην περίπτωση της µη παραγοντοποιηµένης δεν παρατηρείται κάτι τέτοιο αφού εµφανίζει ορικό ρεύµα ( για την συγκεκριµένη περιοχή τιµών δυναµικού που µελετάµε). Το παραπάνω γεγονός υποδεικνύει ότι η εισαγόµενη οµάδα του αντιδραστηρίου AQC (αµινοκινολίνη) δεν είναι ιδιαίτερα ηλεκτρενεργή. Και αυτό µπορεί να αποδειχθεί αν ληφθεί το υδροδυναµικό διάγραµµα του AQC µετά τη διαδικασία παραγωγοποίησής του, δηλαδή της παραγόµενης AMQ. Για το σκοπό αυτό παρασκευάσαµε ένα «λευκό» διάλυµα το οποίο δηλαδή περιέχει όλα τα συστατικά που προσθέτουµε για την παραγωγοποίηση των αµινοξέων, χωρίς όµως να προσθέσουµε κάποιο αµινοξύ. Στο Σχήµα B.I.1 απεικονίζεται το αντίστοιχο υδροδυναµικό διάγραµµα όπου φαίνεται ότι η οξείδωσή του ξεκινάει από τιµή δυναµικού ~,9V και µέχρι το δυναµικό 1,2V δεν λαµβάνει ορικό ρεύµα. Όµως, όλα τα παράγωγα των αµινοξέων έχουν τιµές Ε 1/2 από,95v και κάτω, µε εξαίρεση την n-tyr µε Ε 1/2 ίσο µε 1,5V. Συνεπώς η οµάδα AQC είναι λιγότερο ηλεκτρoενεργή από τα συγκεκριµένα αµινοξέα που οξειδώνονται. Όσο αφορά την περίπτωση της phe πριν την παραγωγοποίηση είναι ανενεργή και µετά την παραγωγοποίηση παρέχει σήµα οξείδωσης και σε συνδυασµό ότι οξειδώνεται σε υψηλό δυναµικό- ίδια συµπεριφορά µε το 25

256 AQC- οδηγούµαστε στο συµπέρασµα ότι η οξείδωσή της προφανώς οφείλεται στην εισαγόµενη οµάδα του αντιδραστηρίου AQC. Επίσης, µια σηµαντική παρατήρηση προκύπτει µελετώντας τα ορικά ρεύµατα των αµινοξέων όπου φαίνεται ότι µετά την παραγωγοποίησή τους είναι κατά τι πιο αυξηµένα. Εξαίρεση αποτελεί µόνο η περίπτωση της cys, κατά την οποία µετά την παραγωγοποίηση το ορικό ρεύµα ελαττώνεται περίπου στο µισό. Όµως γενικά µπορεί να υποστηριχθεί ότι τα ορικά ρεύµατα πριν και µετά την παραγωγοποίηση είναι συγκρίσιµα. εδοµένου ότι οι συνθήκες είναι ίδιες και στις δύο αυτές περιπτώσεις και αποδεχόµενοι ότι ο µηχανισµός οξείδωσης των παραγώγων των αµινοξέων παραµένει ο ίδιος, θα µπορούσε να υποστηριχθεί ότι, παρόλο που το µόριο των αµινοξέων µεγαλώνει µετά την παραγωγοποίηση, ο συντελεστής διάχυσης τους πριν και µετά την παραγωγοποίηση δεν αλλάζει µε αποτέλεσµα τα ορικά ρεύµατα να παραµένουν περίπου ίδια ( τα οποία ελέγχονται από συνθήκες µεταφοράς µάζας). Τα αποτελέσµατα µε τα ορικά ρεύµατα καταγράφονται στους Πίνακες Β.Ι.4 Α και Β.Ι.4 Β για τα µη παραγωγοποιηµένα και τα παράγωγα των αµινοξέων, αντίστοιχα. Τέλος, µπορεί να υποστηριχθεί ότι το δυναµικό 1,1V είναι ένα καλό δυναµικό για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση και στην περίπτωση των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων, όπως και για τα µη παραγωγοποιηµένα, για τις περαιτέρω µελέτες, αφενός γιατί όλα τα αµινοξέα που οξειδώνονται παρέχουν ένα καλό σήµα σε αυτό το δυναµικό και αφετέρου δεν είναι ένα ιδιαίτερα ακραίο δυναµικό. 251

257 A. B. cys me-cys 35 3 cys cys-aqc 6 5 me-cys me-cys-aqc Q / C ,4,7 1 1,3 E (V) Q / C ,2 1,4 1,6 E (V) Γ.. hcy 5htp 3 25 hcy hcy-aqc htp 5htp-AQC 2 15 Q / C 15 1 Q / C 1 5 5,4,7 1 1,3 E (V),4,7 1 1,3 E (V) Σχήµα Β.Ι.8 : Υδροδυναµικά διαγράµµατα παραγωγοποιηµένων και µη αµινοξέων- τιµές φορτίου οξείδωσης, Q/nC, ως προς το δυναµικό Ε/V για τις ουσίες : Α. cys, Β. me-cys, Γ. hcy,.5htp. 252

258 A. B tyr tyr tyr-aqc 3 25 m-tyr m-tyr m-tyr-aqc 8 2 Q / C 6 Q / C ,4,7 1 1,3 E (V),4,7 1 1,3 E (V) Γ.. Q / C met met met-aqc 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 E (V) Ε. Στ. Q / C me-tyr me-tyr me-tyr-aqc,4,7 1 1,3 E (V) 25 2 n-tyr n-tyr n-tyr-aqc trp trp trp-aqc Q / C 1 Q / C ,7 1 1,3 1,6 E (V),5,8 1,1 1,4 E (V) Σχήµα Β.Ι.9 : Ό,τι και στο Σχήµα Β.Ι.8 αλλά για τα αµινοξέα Α.tyr, Β. m-tyr, Γ. met,. me-tyr, Ε. n-tyr, Στ.trp. 253

259 I / na E / V vs Ag/AgCl Σχήµα Β.Ι.1 : Υδροδυναµικό διάγραµµα µε τιµές ρεύµατος οξείδωσης (I, na) ως προς το δυναµικό Ε / V του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης AQC, µετά την διαδικασία παραγωγοποίησης, δηλαδή της AMQ. Μελέτη της απορρόφησης των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων στο UV Σύγκριση µε τα µη παραγωγοποιηµένα Όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω, τα παραγωγοποιηµένα και µη αµινοξέα µελετήθηκαν υπό ακριβώς τις ίδιες συνθήκες δηλ. είδος οργανικού τροποποιητή, τιµή ph, συγκέντρωση φέροντα ηλεκτρολύτη, θερµοκρασία στήλης. Το µόνο που διέφερε ήταν η συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή, του MeCN, και η στήλη, αφού στα παραγωγοποιηµένα χρησιµοποιήθηκε η Perfectsil και στα µη παραγωγοποιηµένα η MZ- AquaPerfect C18 5µΜ. Αυτοί οι δύο παράµετροι δεν επηρεάζουν την ανίχνευση των ουσιών. Το µόνο που αλλάζει είναι ο χρόνος έκλουσης των ουσιών και φυσικά το ύψος των κορυφών (όσο πιο µακριά εκλούεται µια ουσία τόσο πιο µικρή και ευρεία γίνεται η κορυφή). 254

260 Όµως το ολοκλήρωµα των κορυφών παραµένει σταθερό, όποια στήλη και αν χρησιµοποιηθεί. Για αυτό το λόγο και σε αυτήν την σύγκριση θα χρησιµοποιηθούν τα ολοκληρώµατα των κορυφών. Όσο αφορά τα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα, η ανίχνευσή τους πραγµατοποιήθηκε στα 2nm και στα 21 nm (βλ. κεφάλαιο Α.ΙΙ.3.3) χρησιµοποιώντας υδατικά διαλύµατα MeCN µε ph=2.5. Όλα τα αµινοξέα που µελετήθηκαν δίνουν απορρόφηση στο UV ( his, car, cys, crn, cre, mecys, hcy, met, dopa, tyr, m-tyr, me-dopa, phe, me-tyr, 5htp, n-tyr, trp). Τα αποτελέσµατα της ανίχνευσής τους στο UV δίνονται στον Πίνακα Β.Ι.5 για τα 13 όµως αµινοξέα που τελικά χρησιµοποιήθηκαν για σύγκριση µε τα αντίστοιχα παραγωγοποιηµένα αµινοξέα. Η ανίχνευση των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων πραγµατοποιήθηκε στα 254 nm, όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία [24, 27, 28]. Από τα αµινοξέα που µελετήθηκαν, δεν δίνουν όλα καλό σήµα στο UV. Πιο συγκεκριµένα, η 5htp παρέχει διπλή κορυφή µε την διαφορά ότι η πρώτη είναι µεγάλη συγκρίσιµη µε τις υπόλοιπες ενώ η δεύτερη είναι πολύ µικρή, σαν θόρυβος µε αποτέλεσµα να µην παρεµποδίζει την ανίχνευση των άλλων ουσιών. Όσον αφορά την me-cys, το παράγωγό της προφανώς δεν ήταν ιδιαίτερα σταθερό µιας και σε πολλές περιπτώσεις µετά από λίγο χρονικό διάστηµα από την παρασκευή του παρείχε διπλή και τριπλή κορυφή (για σύγκριση βλ. χρωµατογραφήµατα των σχηµάτων Β.Ι.18 και Β.Ι.19) Τέλος, το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης, και πιο συγκεκριµένα το AMQ που δηµιουργείται µετά την παραγωγοποίηση κατά την υδρόλυση του AQC, παρέχει στο UV µία τεράστια κορυφή ακριβώς στο χρόνο όπου εκλούονται οι ουσίες crn και cre, από τις οποίες στο χρωµατογράφηµα εµφανίζονται µόνο οι µύτες των κορυφών. Στον Πίνακα Β.Ι.5 παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα της απορρόφησης στο UV των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων σε αντιπαράθεση µε τα αποτελέσµατα των µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων. Από το συγκεκριµένο πίνακα παρατηρούµε ότι σε όλες τις περιπτώσεις η παραγωγοποίηση ενισχύει αισθητά το σήµα των αµινοξέων 255

261 το οποίο γίνεται από διπλάσιο µέχρι και 3 φορές πιο ενισχυµένο, όπως χαρακτηριστικά γίνεται στην περίπτωση της cys. Γενικά θα µπορούσε να υποστηριχθεί ότι η παραγωγοποίηση ευνοεί την ανίχνευση των αµινοξέων µε το UV µιας και τα σήµατα είναι σηµαντικά πιο αυξηµένα µε αποτέλεσµα µε αυτόν τον τρόπο να αυξάνονται και τα όρια ανίχνευσης των αµινοξέων. Το µόνο µειονέκτηµα που εµφανίζει αυτή η µέθοδος είναι ότι 4 αµινοξέα δεν µπορούν να ανιχνευθούν, όπως η dοpa, me-dopa οι οποίες δίνουν πολλά παράγωγα, η crn και η cre των οποίων το σήµα συµπίπτει µε το σήµα της AMQ. Πίνακας Β.Ι.5 : Ολοκληρώµατα κορυφών παραγωγοποιηµένων και µη αµινοξέων στο UV. Η ανίχνευση των ουσιών πραγµατοποιήθηκε στα 2 nm και στα 254 nm για τα ελεύθερα και τα παραγωγοποιηµένα αµινοξέα, αντίστοιχα. ΟΥΣΙΕΣ Μη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα Παραγωγοποιηµένα αµινοξέα his.4.36 car.6.16 cys.2.61 me-cys.5.55 hcy.2.46 met.2.53 tyr m-tyr phe.1.41 me-tyr htp.14.3 n-tyr.7.41 trp

262 Μελέτη της φθορισµοµετρικής συµπεριφοράς των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων σύγκριση µε τα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα Η µελέτη της φθορισµοµετρικής συµπεριφοράς των παραγωγοποιηµένων και µη αµινοξέων έγινε και πάλι χρησιµοποιώντας ως κινητές φάσεις υδατικά διαλύµατα MeCN, και στήλες αυτές που αναφέρθηκαν στο πειραµατικό µέρος. Το µήκος κύµατος διέγερσης και εκποµπής για τα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα (όπως αναφέρθηκε στο Α Μέρος της διατριβής) είναι 22 nm και 32 nm, αντίστοιχα, ενώ τα αντίστοιχα για τα παραγωγοποιηµένα αµινοξέα όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία είναι 248 και 395 nm [19-35]. Από τα µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα, αυτά που µπορούν να ανιχνευτούν στον φθορισµοµετρικό ανιχνευτή είναι η dopa, me-dopa, 5htp, tyr, m-tyr, me-tyr και trp. Το σήµα που δίνουν τα συγκεκριµένα αµινοξέα, στην συγκέντρωση των 1µg/mL όπου γίνονται όλες οι µελέτες, είναι αρκετά υψηλό και για αυτό το λόγο χρησιµοποιήθηκε η χαµηλότερη δυνατή ευαισθησία, 3, και gain 2. Τα αποτελέσµατα καταγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.6 (διαιρεµένα µε το 1 για να αναφέρονται σε ίδιες συγκεντρώσεις µε τα παραγωγοποιηµένα αµινοξέα). Μετά την παραγωγοποίηση, τα αµινοξέα τα οποία µπορούν πλέον και φθορίζουν είναι τα ακόλουθα : his, car, cys, me-cys, hcy, tyr, m-tyr, met, me-tyr, phe και trp. Παρατηρούµε ότι η 5htp δεν φθορίζει πλέον. Όµως, τα αµινοξέα his, car, cys, me-cys, hcy, met και η phe, τα οποία δεν φθορίζουν ως ελεύθερα, µετά την παραγωγοποίηση µπορούν να ανιχνευτούν φθορισµοµετρικά. Όσο αφορά την n-tyr, το συγκεκριµένο αµινοξύ χωρίς παραγωγοποίηση δεν δίνει καθόλου σήµα. Μετά την παραγωγοποίηση φθορίζει, απλά το σήµα του είναι ορατό σε συγκεντρώσεις µεγαλύτερες από αυτές που χρησιµοποιήσαµε στην εργασία αυτή. Σε ενέσιµη συγκέντρωση 1µg/mL που χρησιµοποιήσαµε, παρέχει ένα πολύ µικρό σήµα το οποίο φαίνεται σαν θόρυβος στην βασική γραµµή. Ο λόγος που στις µελέτες µας δεν χρησιµοποιήσαµε µεγαλύτερη 257

263 συγκέντρωση για το συγκεκριµένο αµινοξύ είναι επειδή η ανίχνευσή του µε τους υπόλοιπους ανιχνευτές είναι ικανοποιητική και το σήµα του είναι της ίδιας τάξης µεγέθους µε τα σήµατα των υπόλοιπων αµινοξέων. Η µελέτη των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων διεξήχθη στην ίδια ευαισθησία και στο ίδιο gain (ευαισθησία 3 και gain 2) που χρησιµοποιήθηκαν και για τα ελεύθερα αµινοξέα ούτως ώστε να είναι εφικτή η µεταξύ τους σύγκριση. Τα αποτελέσµατα του Πίνακα Β.Ι.6 αναφέρονται σε ίδιες συγκεντρώσεις παραγωγοποιηµένων και µη αµινοξέων (δηλαδή 1 µg/ml). Αυτό που παρατηρούµε είναι ότι η παραγωγοποίηση γενικά ευνοεί την ανίχνευση µε τον φθορισµοµετρικό ανιχνευτή. Εκτός του γεγονότος ότι µε την παραγωγοποίηση ανιχνεύονται περισσότερα αµινοξέα, από τον Πίνακα Β.Ι.6 είναι φανερό ότι το και το σήµα τους είναι κατά πολύ πιο ενισχυµένο από το αντίστοιχο των ελεύθερων αµινοξέων. Τα µόνα προβλήµατα που δηµιουργεί η παραγωγοποίηση είναι στην περίπτωση της 5htp όπου το συγκεκριµένο αµινοξύ µετά την παραγωγοποίηση σταµατά να φθορίζει και στην περίπτωση της trp όπου το παράγωγο φθορίζει πολύ λιγότερο από όταν είναι σε ελεύθερη κατάσταση. 258

264 Πίνακας Β.Ι.6 : Ολοκληρώµατα κορυφών παραγωγοποιηµένων και µη αµινοξέων χρησιµοποιώντας το φθορισµοµετρικό ανιχνευτή. Το µήκος κύµατος διέγερσης και εκποµπής για τα µη παραγωγοποιηµένα 22 και 32 nm, αντίστοιχα, ενώ τα αντίστοιχα για τα παραγωγοποιηµένα αµινοξέα είναι 248 και 395nm. Ουσία Μη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα Παραγωγοποιηµένα αµινοξέα his car cys me-cys hcy htp tyr m-tyr met me-tyr n-tyr - - phe trp Βελτιστοποίηση της ανίχνευσης των παραγώγων των αµινοξέων µε τρεις ανιχνευτές σε σειρά : UV-FL-EC Η χρήση πολλών ανιχνευτών σε σειρά έχει πολλά πλεονεκτήµατα όσον αφορά την ανίχνευση και την ταυτοποίηση των ουσιών, για αυτό το λόγο και στις µελέτες µας διατηρήσαµε σε σειρά τρεις ανιχνευτές, ανιχνευτή UV-Vis, ηλεκτροχηµικό και φθορισµοµετρικό ανιχνευτή. Ένα από τα βασικότερα πλεονεκτήµατα είναι αυτό που αναφέρθηκε και πιο πάνω µε την κανονικοποίηση των υδροδυναµικών διαγραµµάτων. Ακόµη, µπορούµε να κάνουνε έλεγχο στην αξιοπιστία των ανιχνευτών, αν δηλαδή η απόκρισή τους είναι επαναλήψιµη ή αν όχι, αν αυτό οφείλεται στον ίδιο τον ανιχνευτή ή σε πειραµατικά σφάλµατα (πχ λόγω παραγωγοποίησης ή σταθερότητας των παραγώγων κτλ). Πιο συγκεκριµένα, γνωρίζουµε ότι από τους τρεις ανιχνευτές που 259

265 αναφέρθηκαν πιο πάνω, ο λιγότερο σταθερός είναι ο ηλεκτροχηµικός, διότι το ηλεκτρόδιο εργασίας µπορεί να παθητικοποιηθεί µετά από έναν αριθµό πειραµάτων. Η παθητικοποίηση του ηλεκτροδίου µπορεί να διαπιστωθεί µε την βοήθεια των άλλων δύο ανιχνευτών. Αν δηλαδή διατηρώντας και στους τρεις ανιχνευτές σταθερές τις ρυθµίσεις τους παρατηρήσουµε ότι το σήµα του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή ελαττώνεται ενώ των άλλων δύο είναι σταθερό, τότε αυτό αποδεικνύει ότι το ηλεκτρόδιο έχει παθητικοποιηθεί και θα πρέπει να ενεργοποιηθεί είτε µε ηλεκτροχηµικό καθαρισµό (εφαρµόζοντας υψηλές τιµές δυναµικών) είτε µε πλύση και ενεργοποίηση της επιφάνειας του µε τριβή. Αν όµως το σήµα και των άλλων δύο ανιχνευτών εµφανίζεται πεσµένο τότε αυτό σηµαίνει ότι υπάρχει πειραµατικό πρόβληµα όπως πχ η διαδικασία παραγωγοποίησης δεν ήταν επαναλήψιµη ή τα παράγωγα δεν είναι σταθερά. Όµως και σε αυτήν την περίπτωση, η χρήση των τριών ανιχνευτών σε σειρά βοηθάει στην ταυτοποίηση και γενικά στην ανάλυση των αµινοξέων διότι σε κάθε περίπτωση ο λόγος των σηµάτων των ουσιών στους διάφορους ανιχνευτές θα πρέπει να είναι σταθερός. Ιδιαίτερη αξία έχει η χρήση πολλών ανιχνευτών κατά τη διάρκεια όπου θέλουµε να πάρουµε τα υδροδυναµικά διαγράµµατα των ουσιών όπου λόγω της µεταβολής του δυναµικού έχουµε και µεταβολή στα σήµατα που παρέχει ο ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής. Αν τα σήµατα των άλλων ανιχνευτών είναι σταθερά τότε η µεταβολή του σήµατος στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή είναι πραγµατική λόγω µεταβολής του δυναµικού. Αν όµως µεταβάλλονται, τότε υπάρχει και πάλι πειραµατικό σφάλµα. Επίσης, υπάρχουν ουσίες οι οποίες δε δίνουν σήµα ή το σήµα τους παρεµποδίζεται σε έναν ανιχνευτή αλλά µπορούµε να τις ανιχνεύσουµε µε τη βοήθεια των άλλων και συνεπώς να τις ταυτοποιήσουµε και να τις προσδιορίσουµε ποσοτικά. Χαρακτηριστικά θα αναφέρουµε την his, της οποίας η κορυφή στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή συµπίπτει µε την διαταραχή από το σήµα παραγωγοποίησης µε αποτέλεσµα να µην διακρίνεται. Όµως στους άλλους δύο ανιχνευτές η his διακρίνεται κανονικά. Επίσης, η car στον ηλεκτροχηµικό εκλούεται στην ουρά της 26

266 κορυφής του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης. Το γεγονός ότι η συγκεκριµένη κορυφή οφείλεται στην car επιβεβαιώνεται µε δύο τρόπους α) κάνοντας ένεση ενός δείγµατος µόνο µε το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης όπου φαίνεται ότι στην ουρά της κορυφής του ΑMQ δεν εµφανίζεται καµία κορυφή, και β) µε το γεγονός ότι σε αυτή την χρονική στιγµή και οι άλλοι δύο ανιχνευτές δίνουν σήµα που οφείλεται στην car. Η παραγοντοποιηµένη 5htp δεν παρέχει σήµα στο φθορισµοµετρικό ανιχνευτή, όµως η ανίχνευσή της είναι εφικτή µε την βοήθεια των δύο άλλων ανιχνευτών. Επίσης, από τα χρωµατογραφήµατα Β.Ι.12 και Β.Ι παρατηρούµε πως οι παραγοντοποιηµένες tyr και η 5htp στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή και στον ανιχνευτή UV εκλούονται πολύ κοντά, η µία κορυφή επικαλύπτει µέρος της άλλης, µε αποτέλεσµα να µην µπορούµε να τις ανιχνεύσουµε ποσοτικά µε ακρίβεια. Το γεγονός όµως ότι η 5htp στο φθορισµοµετρικό ανιχνευτή δε δίνει σήµα, οπότε η tyr εκλούεται µόνη της, δίνει τη δυνατότητα, γνωρίζοντας τον λόγο των κορυφών της tyr ανάµεσα στα σήµατα του φθορισµοµετρικού και του UV ή του ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή, να γίνεται πλήρης ποσοτικός διαχωρισµός αυτών των δύο αµινοξέων. Τέλος, µε την παραγωγοποίηση η me-cys στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή και στο UV παρέχει διπλή κορυφή µε αποτέλεσµα να µη µπορούµε να κάνουµε αφενός ποσοτική µελέτη και αφετέρου δε γνωρίζουµε ποια κορυφή οφείλεται στη συγκεκριµένη ουσία ή σε ένα άλλο πιθανό παραπροϊόν της αντίδρασης παραγωγοποίησης. Στο φθορισµοµετρικό ανιχνευτή όµως δεν παρουσιάζει την ίδια συµπεριφορά, παρέχει δηλαδή µία κορυφή και έτσι µπορεί να ανιχνευθεί και να ταυτοποιηθεί. Όλα όσα αναφέρονται στην συγκεκριµένη παράγραφο είναι εµφανή στα χρωµατογραφήµατα που παρέχονται πιο κάτω, και συγκεκριµένα στα χρωµατογραφήµατα των Σχηµάτων Β.Ι

267 Β.Ι.4.2 ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Στη συνέχεια, µετά τη µελέτη της συµπεριφοράς των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων όσο αφορά την ανίχνευσή τους, θα γίνει µια προσπάθεια για την πρόβλεψη της συγκράτησης των ουσιών κάτω από ισοκρατικές συνθήκες και συνθήκες βαθµωτής έκλουσης µε τελικό στόχο τη βελτιστοποίηση του διαχωρισµού τους. Σε αυτό το κεφάλαιο, θα προβλεφθεί η συγκράτηση των παραγώγων των αµινοξέων σε συνθήκες βαθµωτής έκλουσης χρησιµοποιώντας τόσο δεδοµένα από ισοκρατικές µετρήσεις όσο και δεδοµένα από µετρήσεις βαθµωτής έκλουσης και στη συνέχεια θα γίνει σύγκριση ώστε να ελέγξουµε ποια τεχνική παρέχει την καλύτερη πρόβλεψη. Επίσης, θα µελετηθεί αν από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης είναι εφικτό να προβλεφθεί η ισοκρατική συµπεριφορά των ουσιών. Όπως αναφέρθηκε και σε προηγούµενα κεφάλαια, ο χρόνος συγκράτησης µιας ουσίας, t R, υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης µπορεί να υπολογιστεί από την βασική Εξ. (1) [36] t R t t in t D dt t = 1 D + t in t k ϕ t k ϕ in (1) όπου k ϕ = (t ϕ - t )/t είναι ο συντελεστής συγκράτησης της ουσίας ο οποίος αντιστοιχεί σε µία σταθερή σύσταση κινητής φάσης ίσης µε φ, t ϕ t R(ϕ) είναι ο αντίστοιχος ισοκρατικός χρόνος συγκράτησης, t είναι ο νεκρός χρόνος της στήλης, δηλαδή ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση να διανύσει τη στήλη, t D είναι ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση για να διανύσει τη διαδροµή από το µίκτη µέχρι την αρχή της στήλης, ο οποίος στη βιβλιογραφία αναφέρεται ως dwell time, t in είναι µία επιπρόσθετη χρονική διάρκεια που ορίζεται από το πρόγραµµα και µπορεί να εκτείνει ή να µειώνει το αρχικό ισοκρατικό τµήµα του dwell time και ϕ in είναι η σύσταση της κινητής φάσης αυτού του αρχικού ισοκρατικού 262

268 τµήµατος. To k φi που περιγράφει την ισοκρατική συµπεριφορά των διαλυµένων ουσιών περιγράφεται από την παρακάτω εξ. (2) [37]: k c ϕ exp{ i ϕ = a } i (2) 1 + b ϕ i όπου οι παράµετροι a, b, και c αποτελούν προσαρµόσιµες παραµέτρους, οι οποίες µπορούν να υπολογιστούν από ισοκρατικά δεδοµένα καθώς και από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης. Ο προσδιορισµός αυτών των παραµέτρων από ισοκρατικά δεδοµένα πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια του προγράµµατος Solver του Excel, ενώ ο προσδιορισµός τους από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης πραγµατοποιήθηκε µε τον αλγόριθµο Levenberg- Marquardt τον οποίο τροποποιήσαµε βασιζόµενοι στους αλγόριθµους που προτάσσονται στην [38] σε συνδυασµό µε µία τυχαία επιλογή των κατάλληλων αρχικών τιµών. Η συνάρτηση κόστους η οποία ελαχιστοποιήθηκε µέσω του αλγόριθµου Levenberg-Marquardt, ήταν η εξής: f = N i = 1 ( t (exp) t ( calc ) ) R R 2 (3) όπου Ν είναι ο αριθµός των πειραµατικών σηµείων, t R (exp) είναι ο πειραµατικός χρόνος συγκράτησης µια συγκεκριµένης ουσίας και t R (calc) είναι ο θεωρητικός χρόνος συγκράτησης της ουσίας που υπολογίστηκε από την Εξ.(1). Στους υπολογισµούς, η περιοχή τιµών που χρησιµοποιήθηκαν ήταν: [,2] για το a και [,2] για τα b,c. Πρέπει να σηµειωθεί ότι ο συγκεκριµένος αλγόριθµος δοκιµάστηκε χρησιµοποιώντας πρότυπες εξισώσεις [38,39] : α) De Jong F1 µε περιοχή τιµών [-5,5], και β) εξισώσεις Rosenbrock R2, R3 και R5 µε την ίδια περιοχή τιµών. Παρατηρήθηκε ότι η σύγκληση σε λύση ήταν γρήγορη χωρίς κανένα πρόβληµα σε καµία περίπτωση. 263

269 Η εξίσωση (1) µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον υπολογισµό του t R ανεξάρτητα από τον τύπο της βαθµωτής έκλουσης (γραµµικό, πολυγραµµικό ή µε βήµατα). Προκειµένου να βελτιστοποιηθεί ο διαχωρισµός των 13 παραγωγοποιηµένων αµινοξέων που µελετήθηκαν, εφαρµόστηκε η µέθοδος της βαθµωτής έκλουσης. Για να φτάσουµε όµως στην βελτιστοποίηση του διαχωρισµού τους, θα πρέπει προηγούµενα να ελεγχθεί αν η χρήση ισοκρατικών δεδοµένων ή η χρήση δεδοµένων βαθµωτής έκλουσης παρέχουν ακριβείς προβλέψεις των χρόνων συγκράτησης των ουσιών υπό διάφορες συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. Για το σκοπό αυτό, η τακτική που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Αρχικά µελετήθηκε η ισοκρατική συµπεριφορά των αµινοξέων και µε την βοήθεια των δεδοµένων αυτών και του προγράµµατος Solver του Excel, υπολογίστηκαν οι παράµετροι a,b,c της εξίσωσης (2) και έπειτα προβλέφθηκαν οι χρόνοι συγκράτησης των ουσιών κάτω από διαφορετικές συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. Στη συνέχεια χρησιµοποιήσαµε µια σειρά δεδοµένων βαθµωτής έκλουσης, όπου ξεχωρίζουν όλα τα αµινοξέα, και έπειτα υπολογίσαµε και πάλι µε τη βοήθεια του αλγόριθµου που αναφέρθηκε πιο πάνω τις παραµέτρους a,b,c, και τέλος προβλέψαµε τους χρόνους συγκράτησης που προβλέφθηκαν και µε τη βοήθεια των ισοκρατικών δεδοµένων. Ισοκρατική µελέτη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων Η ισοκρατική µελέτη πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας υδατικά διαλύµατα MeCN συγκέντρωσης φ ίση µε,1,,13,,15,,2 και,25, ph = 2.5 και,2 Μ η ιονική ισχύς του φέροντα ηλεκτρολύτη (H 3 PO 4 K 2 HPO 4 ). Στον Πίνακα Β.Ι.7 καταγράφονται oι ισοκρατικοί χρόνοι συγκράτησης των ουσιών και στο Σχήµα Β.Ι.11 απεικονίζεται η καµπύλη των πειραµατικών τιµών του lnk ως προς το φ, όπου k είναι ο 264

270 συντελεστής συγκράτησης των ουσιών. Όπως φαίνεται στον Πίνακα Β.Ι.7 αλλά και στο Σχήµα Β.Ι.11, για τις ουσίες his και car δεν υπάρχουν οι τιµές για φ=,25 διότι στην σύσταση αυτή της κινητής φάσης εκλούονται πολύ γρήγορα και δεν µπορούν να παρθούν πειραµατικά µε ακρίβεια. Στη συνέχεια µε τη βοήθεια των ισοκρατικών δεδοµένων υπολογίστηκαν τα δεδοµένα a, b, c της Εξ. (2), καθώς και το f(min). Τα αποτελέσµατα καταγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.8. Είναι φανερό ότι η προσαρµογή των ισοκρατικών πειραµατικών δεδοµένων στην Εξ.(2) είναι πολύ ικανοποιητική, όπως προκύπτει από την τιµή f(min) (βλ. Εξ.(3). Πίνακας Β.Ι.7 : Ισοκρατικοί χρόνοι συγκράτησης των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων (t, min). Ουσίες φ =.1 φ =.13 φ =.15 φ =.2 φ =.25 his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp

271 ln k ,1,12,14,16,18,2,22,24 φ car cys me-cys 5htp met n-tyr trp 4,5 3,5 2,5 his hcy tyr m-tyr me-tyr phe 1,5 ln k,5 -,5-1,5-2,5-3,5,1,12,14,16,18,2,22,24 φ Σχήµα Β.Ι.11: Καµπύλες πειραµατικών τιµών του ln k ως προς φ MeCN. 266

272 Πίνακας Β.Ι.8: Τιµές των προσαρµόσιµων παραµέτρων a, b, c της Εξ.(2) από την προσαρµογή των ισοκρατικών δεδοµένων του Πίνακα Β.Ι.7. Ουσίες f(min) a b c his 3.3E ± ±.1 car 1.8E ± ±.1 cys 3.5E ± ± ± 81 me-cys 1.3E ± ± ± 3 hcy 3.6E ± ± ± 6.3 5htp 1.5E ± ± ± 14 tyr 8.1E ± ± ± 26 met 5.3E ± ±.6 15 ± 1 m-tyr 9.9E ± ± ± 13 me-tyr 5.9E ± ± ± 11 n-tyr 1.5E ± ± ± 5.1 phe 2.7E ± ± ± 13 trp 2.8E Πρόβλεψη της συγκράτησης των παραγώγων των αµινοξέων κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης Βελτιστοποίηση του διαχωρισµού τους Στη συνέχεια αναλύθηκαν τα δεδοµένα συγκράτησης των παραγώγων των αµινοξέων κάτω από τις συνθήκες βαθµωτής έκλουσης που περιγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.9. Στον Πίνακα Β.Ι.1 απεικονίζονται οι πειραµατικοί χρόνοι συγκράτησης των αµινοξέων που προέκυψαν από όλα τα παραπάνω προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης, t R (exp), οι προβλεπόµενοι χρόνοι συγκράτησης των ουσιών, t R (cal), χρησιµοποιώντας τις παραµέτρους a,b,c του Πίνακα Β.Ι.8 ( ισοκρατικά δεδοµένα), το επί τοις εκατό σφάλµα της πρόβλεψης καθώς και ο µέσος όρος των σφαλµάτων. Οι προβλεπόµενοι χρόνοι συγκράτησης t R (calc) υπολογίστηκαν µε την βοήθεια της Εξ. (1). Πρέπει να τονιστεί ότι η στήλη αρχικά, πριν να ξεκινήσει η βαθµωτή έκλουση, αφήνονταν να ισορροπήσει για αρκετή ώρα, ~3min, στην αρχική κινητή φάση, φ=

273 Πίνακας Β.Ι.9: Προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης που εφαρµόστηκαν. Τύποι βαθµωτής έκλουσης: ϕ in ϕ 1 ϕ 2 ϕ 3 t in* t 1 t 2 t 3 *οι χρόνοι σε min (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) , , Παρατηρώντας τον Πίνακα Β.Ι.1 οδηγούµαστε στο συµπέρασµα ότι οι προβλέψεις των χρόνων συγκράτησης των ουσιών από ισοκρατικά δεδοµένα είναι αρκετά ικανοποιητικές µια και οι αποκλίσεις από τις θεωρητικές τιµές είναι πολύ µικρές. Στην συνέχεια, θα γίνει µία προσπάθεια να προβλεφθούν οι χρόνοι συγκράτησης των ουσιών κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης από δεδοµένα που πάρθηκαν από άλλους τύπους βαθµωτής έκλουσης. Έτσι, ως αρχικούς χρόνους συγκράτησης θα χρησιµοποιηθούν αυτοί που προκύπτουν από τα προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης (1), (2), (3) και (4), οι πειραµατικοί χρόνοι των οποίων καταγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.1. Από τα δεδοµένα αυτά θα υπολογιστούν οι παραµέτροι a, b και c της Εξ. (2), και έπειτα θα γίνει µία προσπάθεια να προβλεφθούν οι χρόνοι συγκράτησης των ουσιών στα προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης (5), (6) και (7). Οπότε, για τα συγκεκριµένα χρωµατογραφικά δεδοµένα που πάρθηκαν µε τα προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης τύπου (5), (6) και (7), θα είναι δυνατόν να γίνει µία σύγκριση και να ελεγχθεί το πως προβλέπονται καλύτερα, χρησιµοποιώντας δηλαδή ισοκρατικά δεδοµένα ή δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης τύπου (1), (2), (3) και (4). Κατά τον υπολογισµό των παραµέτρων a, b και c της Εξ. (2) από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης, εφαρµόστηκαν δύο µέθοδοι 268

274 Πίνακας Β.Ι.1: Πρόβλεψη χρόνων συγκράτησης των παραγώγων των αµινοξέων κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης που περιγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.9. Η πρόβλεψη έγινε µε τα a,b,c του Πίνακα Β.Ι.8. Τύποι βαθµωτής έκλουσης Ουσίες t R (exp) t R (cal) % error t R (exp) t R (cal) % error t R (exp) t R (cal) % error t R (exp) t R (cal) % error his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr ntyr phe trp M.O Τύποι βαθµωτής έκλουσης Ουσίες t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) % error t R (exp) t R (cal) % error 269 his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp M.O

275 προσαρµογής: α) αρχικά θεωρήθηκε ότι η Εξ. (2) είναι γραµµική συνάρτηση, δηλαδή εξίσωση πρώτου βαθµού, συνεπώς θα πρέπει η παράµετρος b να είναι ίση µε µηδέν. Oπότε ουσιαστικά έπρεπε να υπολογιστούν 2 παραµέτροι (a και c) χρησιµοποιώντας 4 πειραµατικές τιµές για κάθε ουσία που αντιστοιχούν στους τέσσερις τύπους βαθµωτής έκλουσης. Τα αποτελέσµατα της συγκεκριµένης προσαρµογής των πειραµατικών δεδοµένων βαθµωτής έκλουσης, καταγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.11. β) στη συνέχεια θεωρήθηκε ότι η Εξ. (2) είναι δευτέρου βαθµού, ως έχει δηλαδή µε b. Ουσιαστικά, πρέπει να υπολογιστούν 3 παραµέτροι (a, b, c) χρησιµοποιώντας τέσσερα πειραµατικά δεδοµένα. Τα αντίστοιχα αποτελέσµατα καταγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.12. Χρησιµοποιώντας τις τιµές των παραπάνω παραµέτρων, προβλέφθηκαν οι χρόνοι συγκράτησης των ουσιών υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης (5), (6) και (7), εις τρόπον ώστε να γίνει σύγκριση και µε την πρόβλεψη των ίδιων δεδοµένων βαθµωτής έκλουσης από ισοκρατικά δεδοµένα. Τα αποτελέσµατα των προβλέψεων για τους δύο τρόπους προσαρµογής που εφαρµόστηκαν ( γραµµική και συνάρτηση δευτέρου βαθµού της Εξ.(2)) καταγράφονται στους Πίνακες Β.Ι.13 και Β.Ι.14 αντίστοιχα. Στους συγκεκριµένους Πίνακες και ιδιαίτερα από το µέσο επί τοις εκατό σφάλµα προκύπτει το συµπέρασµα ότι οι προβλέψεις είναι καλές. Συγκρίνοντας τις προβλέψεις που πραγµατοποιήθηκαν από ισοκρατικά δεδοµένα και από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης, και πιο συγκεκριµένα, συγκρίνοντας το µέσο επί τοις εκατό σφάλµα που εισάγει η κάθε µέθοδος καταλήγουµε στο συµπέρασµα ότι η πρόβλεψη από δεδοµένα υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης, γενικά υπερτερεί της αντίστοιχης από ισοκρατικά δεδοµένα, µια και το µέσο επί τοις εκατό σφάλµα είναι αρκετά µικρότερο. Ποιο συγκεκριµένα, η περίπτωση κατά την οποία θεωρούµε ότι b υπερτερεί και στις τρεις προβλέψεις των προγραµµάτων βαθµωτής έκλουσης από τις αντίστοιχες προβλέψεις µε 27

276 Πίνακας Β.Ι.11 : Τιµές παραµέτρων a, b,c της Εξ.(2) µε b= που προέκυψαν από την προσαρµογή των πειραµατικών δεδοµένων υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης τύπου (1), (2), (3) και (4) του Πίνακα Β.Ι.1. Ουσία f(min) a b c his carn cys 8.E ± ±.8 me-cys 2.5E ± ±1.3 hcy 2.2E-2 4.4± ±1.1 5htp 1.7E ± ±.9 tyr 2.5E ± met 1.5E ± ±.7 m-tyr 1.9E ± ±.8 me-tyr 2.4E-3 5.1± ±.3 n-tyr 3.2E ± ±.3 phe 3.E-1 7.7± ±4.3 trp 3.1E ± ±.3 Πίνακας Β.Ι.12 : Τιµές παραµέτρων a, b,c της Εξ.(2) µε b που προέκυψαν από την προσαρµογή των πειραµατικών δεδοµένων υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης τύπου (1), (2), (3) και (4) του Πίνακα Β.Ι.1. Ουσία f(min) a b c his carn cys 9.6E-3 9, me-cys 9.E hcy 3.8E htp 5.1E tyr 8.2E met 3.9E m-tyr 1.4E me-tyr 4.7E n-tyr 4.7E phe 3.E trp 4.3E

277 Πίνακας Β.Ι.13 : Προβλέψεις χρόνων συγκράτησης των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης (5), (6) και (7) που περιγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.9. Η πρόβλεψη έγινε µε τα a,b,c του Πίνακα Β.Ι.11. Τύποι βαθµωτής έκλουσης Ουσίες t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp M.O

278 Πίνακας Β.Ι.14 : Προβλέψεις χρόνων συγκράτησης των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης (5), (6) και (7) που περιγράφονται στον Πίνακα Β.Ι.9. Η πρόβλεψη έγινε µε τα a,b,c του Πίνακα Β.Ι.12. Τύποι βαθµωτής έκλουσης Ουσίες t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp M.O

279 ισοκρατικά δεδοµένα. Η περίπτωση όπου θεωρούµε ότι b=, υπερτερεί στην πρόβλεψη των προγραµµάτων βαθµωτής έκλουσης (6) και (7) αλλά όχι στην πρόβλεψη του (5), συγκριτικά µε την πρόβλεψη από ισοκρατικά δεδοµένα. Σε καµία περίπτωση όµως, η πρόβλεψη από ισοκρατικά δεδοµένα δεν µπορεί να υποστηριχθεί ότι δεν είναι πολύ καλή και δε µπορεί να χρησιµοποιηθεί αποτελεσµατικά. Όσο αφορά τη σύγκριση ανάµεσα στις δύο περιπτώσεις προβλέψεις προγραµµάτων βαθµωτής έκλουσης από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης, οι προβλέψεις που προκύπτουν θεωρώντας την εξίσωση (2) ως εξίσωση δευτέρου βαθµού, δηλ. b, φαίνονται να είναι γενικά καλύτερες από τις αντίστοιχες που προκύπτουν θεωρώντας b=, µε εξαίρεση την πρόβλεψη του προγράµµατος (7), όπου η δεύτερη περίπτωση υπερτερεί σε µικρό βαθµό. Γενικά, προκύπτει το συµπέρασµα ότι οι προβλέψεις χρόνων συγκράτησης ουσιών υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης από άλλα δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης υπερτερούν από τις αντίστοιχες που προκύπτουν από ισοκρατικά δεδοµένα. Και αυτό οφείλεται στο ότι προβλέπονται χρόνοι συγκράτησης βαθµωτής έκλουσης χρησιµοποιώντας οµοειδή δεδοµένα δηλ. δεδοµένα που προκύπτουν και αυτά από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης, τα οποία προφανώς ενέχουν την συµπεριφορά των συνθηκών που επικρατούν κατά την βαθµωτή έκλουση και λαβαίνουν υπόψη τους παραµέτρους που δεν µπορούν τα ισοκρατικά δεδοµένα, όπως για παράδειγµα την µεταβολή της στατικής φάσης κατά την µεταβολή της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή ή και πιθανόν άλλες παραµέτρους, όπως προβλήµατα ισορροπίας (βλ. Κεφάλαιο Α.IV). Επιπλέον, για τον προσδιορισµό των παραµέτρων a,b,c καλύτερα να χρησιµοποιείται η εξίσωση δευτέρου βαθµού (b ). Στο σηµείο αυτό θα πρέπει να τονιστεί ότι η πρόβλεψη είναι καλύτερη όταν προσπαθούµε να προβλέψουµε χρόνους συγκράτησης υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης εντός των χρονικών ορίων που χρησιµοποιούνται για τον προσδιορισµό των παραµέτρων a, b και c. Αν όµως χρειάζεται να προβλεφθούν προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης µε χρόνους συγκράτησης πολύ µεγαλύτερους από τους αντίστοιχους που έχουν τα προγράµµατα 274

280 βαθµωτής έκλουσης που χρησιµοποιούνται για την εύρεση των παραµέτρων αυτών, καλύτερα είναι να χρησιµοποιούνται ισοκρατικά δεδοµένα από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης, διότι σε αντίθετη περίπτωση οι προβλέψεις δεν θα είναι ικανοποιητικές. Ένα µικρό δείγµα αυτού που αναφέρεται πιο πάνω παρουσιάζεται στο αµέσως επόµενο υποκεφάλαιο «Πρόβλεψη της ισοκρατικής συµπεριφοράς των παραγώγων των αµινοξέων από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης», όπου σε αυτήν την περίπτωση από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης δεν προβλέπεται η συµπεριφορά των ουσιών κάτω από άλλες συνθήκες βαθµωτής έκλουσης, αλλά η ισοκρατική συµπεριφορά τους σε διάφορες συγκεντρώσεις οργανικού τροποποιητή, δηλαδή προβλέπεται κάτι µε χρονική διάρκεια πολύ µεγαλύτερη από αυτήν που έχουν τα δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης που παρέχουν τις παραµέτρους a, b και c. Στα Σχήµατα Β.Ι.12, Β.Ι.15 και Β.Ι.16 απεικονίζονται τα χρωµατογραφήµατα των προγραµµάτων βαθµωτής έκλουσης τύπου (2) (3) και (4), τα οποία πάρθηκαν χρησιµοποιώντας σε σειρά τους ανιχνευτές UV-Vis και φθορισµοµετρικό. Το χρωµατογράφηµα της βαθµωτής έκλουσης τύπου (2) παρουσιάζεται σε ανεπτυγµένη µορφή στα Σχήµατα Β.Ι.13 και Β.Ι.14 για να φανούν καλύτερα οι κορυφές. Στα σχήµατα Β.Ι.17, Β.Ι.18 και Β.Ι.19 απεικονίζονται τα χρωµατογραφήµατα των προγραµµάτων βαθµωτής έκλουσης τύπου (5), (6) και (7) στα οποία χρησιµοποιήθηκαν σε σειρά και οι τρεις ανιχνευτές (UV- ηλεκτροχηµικός-φθορισµοµετρικός ). Πρέπει να σηµειωθεί ότι τον βέλτιστο διαχωρισµό τον παρέχει το πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης (7), διότι διαχωρίζει πολύ καλά όλες τις ουσίες στη µικρότερη δυνατή χρονική διάρκεια. Η βαθµωτή έκλουση (7) που παρέχει τον βέλτιστο διαχωρισµό βρέθηκε υπολογιστικά µε κατάλληλο αλγόριθµο που στηρίχθηκε στις παραµέτρους a,b,c του Πίνακα Β.Ι

281 Α his cys me-cys hcy tyr met UV / AU car 5htp m-tyr me-tyr n-tyr phe trp t / min Β phe FL cys me-cys hcy tyr met m-tyr me-tyr his car t / min Σχήµα Β.Ι.12 : Χρωµατογράφηµα των 13 παραγώγων των αµινοξέων που πάρθηκε κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης τύπου (2) (βλ. Πίνακα Β.Ι.9) και µε την χρησιµοποίηση σε σειρά ανιχνευτή UV (Α) και φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β). 276

282 Α. UV / AU his car t / min Β. 6 5 his FL 4 3 car t / min Σχήµα Β.Ι.13 : Τα πρώτα 5 min των χρωµατογραφηµάτων του Σχήµατος Β.Ι.12 χρησιµοποιώντας σε σειρά ανιχνευτή UV (Α) και φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β). 277

283 Α. UV / AU cys me-cys hcy tyr met m-tyr 5htp phe me-tyr n-tyr trp t / min Β. FL phe hcy met m-tyr me-cys cys tyr me-tyr t / min Σχήµα Β.Ι.14 : Τα τελευταία 11 min των χρωµατογραφηµάτων του Σχήµατος Β.Ι.12 χρησιµοποιώντας σε σειρά ανιχνευτή UV (Α) και φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β). 278

284 A..1.9 his.8 me-cys UV / AU car cys hcy tyr 5htp met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp t / min Β phe me-cys hcy met m-tyr FL 8 6 his cys tyr me-tyr 4 car t / min Σχήµα Β.Ι.15 : Χρωµατογράφηµα των 13 παραγώγων των αµινοξέων που πάρθηκε κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης του τύπου (3) (βλ. Πίνακα Β.Ι.9) και µε την χρησιµοποίηση σε σειρά ανιχνευτή UV (Α) και φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β). 279

285 Α his me-cys.7 car tyr UV / AU cys hcy met m-tyr 5htp me-tyr n-tyr phe trp t / min Β phe 14 FL his car cys me-cys hcy met tyr me-tyr m-tyr t / min Σχήµα Β.Ι.16 : Χρωµατογράφηµα των 13 παραγώγων των αµινοξέων που πάρθηκε κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης του τύπου (4) (βλ. Πίνακα Β.Ι.9) και µε την χρησιµοποίηση σε σειρά ανιχνευτή UV (Α) και φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β). 28

286 Α..1.8 his UV / AU car me-cys cys met m-tyr hcy n-tyr tyr me-tyr phe 5htp trp t / min Β. 6 5 me-tyr phe 4 m-tyr FL 3 2 his car cys met hcy me-cys tyr t / min Γ. 12 cys m-tyr I / na car 5htp hcy tyr n-tyr me-tyr me-cys met trp t / min Σχήµα Β.Ι.17 : Χρωµατογράφηµα των 13 παραγώγων των αµινοξέων που πάρθηκε κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης του τύπου (5) (βλ. Πίνακα Β.Ι.9) και µε την χρησιµοποίηση σε σειρά ανιχνευτή UV (Α), φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β) και ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή (Γ). 281

287 Α..1.8 his UV / AU.6.4 car cys me-cys hcy tyr 5htp met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp t / min Β. 6 5 phe 4 FL his car hcy me-cys cys met tyr m-tyr me-tyr t / min Γ. I / na car 5htp cys hcy me-cys tyr mtyr met me-tyr phe t / min Σχήµα Β.Ι.18 : Χρωµατογράφηµα των 13 παραγώγων των αµινοξέων που πάρθηκε κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης του τύπου (6) (βλ. Πίνακα Β.Ι.9) και µε την χρησιµοποίηση σε σειρά ανιχνευτή UV (Α), φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β) και ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή (Γ). 282

288 Α his me-cys UV / AU car cys hcy tyr 5htp met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp t / min Β. 1 phe 8 met m-tyr me-cys FL 6 cys hcy tyr me-tyr 4 his car t / min Γ htp trp I / na car cys hcy tyr m-tyr 8 me-cys met me-tyr n-tyr phe t / min Σχήµα Β.Ι.19 : Χρωµατογράφηµα των 13 παραγώγων των αµινοξέων που πάρθηκε κάτω από τις βέλτιστες συνθήκες βαθµωτής έκλουσης του τύπου (7) (βλ. Πίνακα Β.Ι.9) και µε την χρησιµοποίηση σε σειρά ανιχνευτή UV (Α), φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (Β) και ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή (Γ). 283

289 Πρόβλεψη της ισοκρατικής συµπεριφοράς των παραγώγων των αµινοξέων από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης Στη συνέχεια θα γίνει µία προσπάθεια να µελετήσουµε την αντίθετη διαδικασία, δηλαδή να προβλέψουµε ισοκρατικούς χρόνους συγκράτησης των ουσιών χρησιµοποιώντας δεδοµένα από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης. Όπως αναφέρθηκε, οι τιµές των παραµέτρων a, b,c προσδιορίζονται από την εξίσωση (2) µε δύο τρόπους α. θεωρώντας ότι είναι γραµµική συνάρτηση ( b=), και β) θεωρώντας ότι είναι συνάρτηση δευτέρου βαθµού (b ). Με την βοήθεια των παραµέτρων αυτών, οι οποίες δίνονται στους Πίνακες Β.Ι.11 και Β.Ι.12, αντίστοιχα, θα προβλεφθεί η ισοκρατική συµπεριφορά των ουσιών σε συγκέντρωση φ του οργανικού τροποποιητή, ΜeCN, ίση µε α),1 β),13, γ),15 δ),2 και ε),25. Οι προβλεπόµενοι και οι πειραµατικοί χρόνοι συγκράτησης, καθώς και οι επί τοις εκατό αποκλίσεις και ο µέσος όρος των αποκλίσεων καταγράφονται στους Πίνακες Β.Ι.15 και Β.Ι.16. Στους συγκεκριµένους πίνακες, είναι φανερό ότι η πρόβλεψη δεν είναι καθόλου καλή µια και οι αποκλίσεις των προβλέψεων είναι πολύ µεγάλες. Και µάλιστα παρατηρείται ότι ο µέσος όρος των αποκλίσεων ελαττώνεται καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή, καθώς δηλαδή οι ουσίες εκλούονται ολοένα και γρηγορότερα. Το γεγονός αυτό ήταν αναµενόµενο διότι όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης είναι δυνατό να προβλεφθούν χρόνοι συγκράτησης σε άλλες συνθήκες έκλουσης µόνο όταν οι προβλεπόµενοι χρόνοι είναι στην περιοχή αυτών που χρησιµοποιήθηκαν για την πρόβλεψη. 284

290 Πίνακας Β.Ι.15 : Πρόβλεψη ισοκρατικών χρόνων συγκράτησης από τα a, b, c που δίνονται στον Πίνακα Β.Ι.11 φ Ουσία t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp M.O φ.2.25 Ουσία t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp M.O

291 Πίνακας Β.Ι.16 : Πρόβλεψη ισοκρατικών χρόνων συγκράτησης από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης που δίνονται στον Πίνακα Β.Ι.12, θεωρώντας ότι η Εξ.2 είναι δευτέρου βαθµού (b ). φ Ουσία t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp M.O φ.2.25 Ουσία t R (exp) t R (cal) %error t R (exp) t R (cal) %error his car cys me-cys hcy htp tyr met m-tyr me-tyr n-tyr phe trp M.O

292 Β.Ι.5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συνοψίζοντας, τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τη µελέτη της βελτιστοποίησης του διαχωρισµού και της ανίχνευσης 13 παραγώγων των αµινοξέων (his, car, cys, me-cys, hcy, 5htp, tyr, met, m-tyr, me-tyr, n- tyr, phe και trp) µε το AQC, καταλήγουµε στα παρακάτω συµπεράσµατα: 1. Η ανίχνευση των παραγώγων των αµινοξέων έγινε µε χρήση τριών ανιχνευτών σε σειρά : UV (254nm), φθορισµοµετρικό (λ ex =248nm, λ em =395nm) και ηλεκτροχηµικό (1,1 V ως προς Ag/AgCl). Από τα χρωµατογραφήµατα που καταγράφηκαν µε τους τρεις ανιχνευτές φαίνεται ότι καλύτερη είναι η φθορισµοµετρική ανίχνευση επειδή η αρχική διαταραχή που οφείλεται στο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης είναι πολύ µικρή και οι κορυφές των ουσιών που καταγράφονται είναι πιο ξεκάθαρες. Όµως στο φθορισµοµετρικό ανιχνευτή δεν ανιχνεύονται τα ακόλουθα αµινοξέα : 5htp, n-tyr και trp (η trp ανιχνεύεται µε πολύ µικρή ευαισθησία). Αντίθετα στο UV ανιχνεύονται και τα 13 αµινοξέα : his, car, cys, me-cys, hcy, 5htp, tyr, met, m-tyr, me-tyr, n-tyr, phe και trp. Όµως υπάρχει µια µεγάλη αρχική διαταραχή που σε µερικές κινητές φάσεις µπορεί να καθιστά αδύνατη την ανίχνευση των αµινοξέων που εκλούονται στην αρχή του χρωµατογραφήµατος. Τέλος, στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, είναι δυνατή η ανίχνευση των 12 από τα 13 αµινοξέα που µελετήσαµε και αυτό γιατί η his καλύπτεται από τη µεγάλη διαταραχή που καταγράφεται στην αρχή του χρωµατογραφήµατος. Επίσης, τα αµινοξέα me-cys, met και phe δίνουν µικρές σχετικά κορυφές και συνεπώς οι παραπάνω ουσίες δεν µπορούν να ανιχνευθούν µε µεγάλη ακρίβεια στον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή. 2. Η σύγκριση της ανίχνευσης των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων µε τα αντίστοιχα ελεύθερα- µη παραγωγοποιηµένα αµινοξέα- οδήγησε στα ακόλουθα συµπεράσµατα : 287

293 α. Η ανίχνευση µε το UV βελτιώθηκε κατά πολύ µετά την παραγωγοποίηση, δεδοµένου ότι αυξήθηκε πολύ η απορρόφηση των ουσιών και η ανίχνευση έγινε στα 254nm σε σχέση µε το µήκος κύµατος που χρησιµοποιήθηκε για την ανίχνευση των ελεύθερων αµινοξέων που ήταν στη δύσκολη περιοχή των nm. Το µόνο µειονέκτηµα της ανίχνευσης των παραγώγων των αµινοξέων µε UV ήταν η µεγάλη αρχική διαταραχή που καταγράφεται στην αρχή του χρωµατoγραφήµατος. β. Όσον αφορά την ανίχνευση µε τον ηλεκτροχηµικό ανιχνευτή, αυτή παρουσιάζει το ίδιο µειονέκτηµα µε το UV όσον αφορά την αρχική διαταραχή, ενώ κατά τα άλλα είναι εντελώς συγκρίσιµη µε την ηλεκτροχηµική ανίχνευση των µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων µε µοναδικό πλεονέκτηµα ότι το παράγωγο της phe είναι ηλεκτροχηµικά ενεργό ενώ χωρίς παραγωγοποίηση δεν µπορεί να ανιχνευτεί ηλεκτροχηµικά. γ. Τέλος, µετά την παραγωγοποίηση είναι δυνατή η φθορισµοµετρική ανίχνευση των αµινοξέων his, car cys, me-cys, hcy, met και phe, που δεν ήταν δυνατή χωρίς παραγωγοποίηση, ενώ αντίθετα τα παράγωγα των αµινοξέων 5htp και trp σχεδόν παύουν να φθορίζουν. Στο σηµείο αυτό θα πρέπει να διευκρινιστεί ότι ακόµη και αν πλεονεκτεί η ανίχνευση των παραγωγοποιηµένων αµινοξέων σε σχέση µε την ανίχνευση τους χωρίς παραγωγοποίηση, σε καµία περίπτωση δεν θα πρέπει να προτιµάται να γίνεται η ανάλυση µε παραγωγοποίηση των αµινοξέων που µπορούν να προσδιοριστούν άµεσα. Και αυτό γιατί η διαδικασία της παραγωγοποίησης εισάγει µία µη επιθυµητή πολυπλοκότητα στην µέθοδο ανάλυσης και επιπλέον πάντα ενέχει προβλήµατα επαναληψιµότητας και απόδοσης. 3. Η χρήση τριών ανιχνευτών σε σειρά έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήµατα : ευκολότερη ταυτοποίηση των ουσιών, πιο αξιόπιστος ποσοτικός προσδιορισµός των αναλυόµενων ουσιών, και τέλος διευκόλυνση στην µελέτη της ηλεκτροχηµικής συµπεριφοράς των ενώσεων που αναλύονται, δηλαδή στην λήψη των υδροδυναµικών διαγραµµάτων. 288

294 4. Ο διαχωρισµός των 13 παραγώγων των αµινοξέων έγινε µέσα σε 2min υπό συνθήκες βαθµωτής έκλουσης µεταβολής του MeCN στην κινητή φάση - που προσδιορίστηκαν µε έναν αλγόριθµο Levenberg- Marquart που αναπτύχθηκε στο εργαστήριό µας. Για την εύρεση όµως των βέλτιστων συνθηκών διαχωρισµού προηγήθηκε µία εκτενής µελέτη δυνατότητας πρόβλεψης της συγκράτησης των παραγώγων των αµινοξέων κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης, τόσο από ισοκρατικά δεδοµένα όσο και από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης. Η µελέτη αυτή έδειξε ότι οι χρόνοι έκλουσης ή συγκράτησης των αναλυόµενων ουσιών από την χρωµατογραφική στήλη κάτω από συνθήκες βαθµωτής έκλουσης µπορούν να προβλέπονται ικανοποιητικά τόσο από ισοκρατικά δεδοµένα όσο και από δεδοµένα βαθµωτής έκλουσης, υπό την προϋπόθεση ότι οι χρόνοι έκλουσης που θα προβλεφθούν να βρίσκονται µέσα στην περιοχή των αντίστοιχων χρόνων έκλουσης που χρησιµοποιούνται για την πρόβλεψη. Επιπλέον, για την πρόβλεψη αυτή είναι δυνατή η χρήση µιας γραµµικής σχέσης που περιγράφει την ισοκρατική συµπεριφορά των ενώσεων : ln k φi = a c φ i, αντί της πιο αυστηρής σχέσης ln k φi = a c φ i / (1 + b φ i ). Το παραπάνω συµπέρασµα έχει άµεση πρακτική εφαρµογή γιατί επιτρέπει την βελτιστοποίηση ενός διαχωρισµού από τρία µόνο χρωµατογραφήµατα που παίρνονται κάτω από τρεις διαφορετικές συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. ηλαδή, δεν είναι απαραίτητη η πειραµατική µελέτη της ισοκρατικής συµπεριφοράς των αναλυόµενων ουσιών που είναι πολύ επίπονη και χρονοβόρα. 5. Η πρόβλεψη τέλος της συγκράτηση των ουσιών κάτω από ισοκρατικές συνθήκες δεν είναι δυνατή από µετρήσεις που γίνονται µε συνθήκες βαθµωτής έκλουσης. 289

295 Β.Ι.6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] J. Vendrell and F.X. Aviles, J. Chromatogr., 358 (1986) 41 [1]S. Einarrson, B. Joseffson and S. lagerkvist, J. chromatogr., 282 (1983) 69 [3] M.C. Roach and M.D. Harmony, Anal. Chem., 59 (1987) 411 [4] S.A. Cohen and D.J.Strydom, Anal. Biochem.,174 (1988) 1 [5] D.R.Koop, E.T. Morgan, G.E. Tarr and M.J. Coon, J. Biol. Chem., 257 (1982) 8472 [6] D.W. Hill, F.H. Walters, T.D. Wilson and J.D Stuart, Anal.Chem.,51 (1979)1338 [7] M.Roth, Anal.Chem., 43 (1971)88 [8] H.Umagat, P.Kucera and L.F. Wen, J. Chromatogr., 239 (1982) 463 [9] M. Roth, A. Hampai, J. Chromatogr., 83 (1973) 353 [1] Y. Tapuhi, D.E. Schmidt, W. Lindner and B.L. Karger, Anal. Biochem., 115 (1981) 123 [11] E.M. Koroleva, V. G. Meltsev, B.G. Belenkii and M. Viska, J. Chromatogr., 242 (1982) 145 [12] M. Weigele, S. L. debernado, T.P. Tergi and W. Leimgruber, J. Am. Chem. Soc., 94(1972) 5927 [13] M. Rubenstein, S. Chen-kiang, S. Stein and S. Underfriend, Anal. Biochem., 95(1979) 117 [14] J.Y. Chang, R. Knecht and D.J. Braun, Biochem.23 (1982) 83 [15] H.A. Moye and A. J. Boning Jr., Anal. Lett., 12 (1979) 25 [16] Y. Watanabe and K. Imai, J. Chromatogr.239 (1982) 723 [17] ] Y. Watanabe and K. Imai, Anal. Biochem., 116 (1981) 471 [18] B.K. Matuszewski, R.S Givens, K. Srinivasachar, R.G. Carlson and T. Higuchi, Anal. Chem., 59 (1987) 112 [19] P.de Montigny, J.F. Stobaugh, R.S. Givens, R.G. Carlson, K. Srinivasachar, L.A. Sterson and T. Higuchi, Anal. Chem., 59 (1987) 196 [2] S.A. Cohen, D. P. Michaud, Anal. Biochem. 211 (1993)

296 [21] J. Yu, G. Li, I.S. Krull and S.A. Cohen, J. Chromatogr., 658 (1994) 249 [22] K.M. De antonis, P.R. Brown, Y.F. Cheng and S.A. Cohen, J. Chromatogr., 661 (1993) 279 [23] G.-D. Li, I.S. Krull, S.A. Cohen, J. Chromatogr. A, 724 (1996) 147 [24] Nimura N., Iwaki K., Kinoshita T., Takeda K. and Ogura H. (1986) Anal. Chem. 58, [24] M. Du, W. Wu, N. Ercal, Y. Ma, J. Chromatogr. B, 83 (24) 321 [25] L. Bosch, A. Alegria, R. Farre, J. Chromatogr. B, 831 (26) 176 [26] C. Cooper, N. Packer, K. Williams Amino Acid Analysis Protocols [27] D. J. Strydom, S.A. Cohen, Anal. Biochem. 222 (1994) 19 [28] J. F. Ovalles, M.d.R. Brunetto, M. Gallignani, J. Pharmac. αnd Biomedical Analysis 39 (25) 294 [29] J. Diaz, J. Ll. Lliberia, L. Comellas, F. Broto-Puig, J. Chromatogr. A, 719 (1996) 171 [3] M. Reverter, T. Lundh. J. E. Lindberg, J. Chromatogr. B, 696 (1997) 1 [31] A. Bouchereau, C. Duhaze, J.Martin-tanguy, J. P. Guegan, F. Larher, J. Chromatogr. A, 836 (1999) 29 [32 H. Liu, M.C. Sanuda-Pena, J. D. Harvey-White, S. Karla, S.A. Cohen, J. Chromatogr. A, 828 (1998) 383 [33] C.v Wandelen, S.A. Cohen, J. Chromatogr. A, 763 (1997) 11 [34] N.Shindo, S. Nojima, T. Fujimura, H. Taka, R. Mineki, K. Murayama, Anal. Biochem. 249 (1997) 79 [35] H. Wang, J. Li, X. Liu, T-X. Yang, H-S. Zhang. Anal. Biochem. 281 (2) 15 [36] P.Nikitas, A.Pappa-Louisi, Anal. Chem., 77 (25) 567. [37]A.Pappa-Louisi, P.Nikitas, P.Balkatzopoulou, C.Malliakas, J.Chromatogr. A, 133 (24) 29. [38] W.H. Press, S.A. Teukolsky, W.T. Vetterling, B.P. Flannery, Numerical Recipes in C, Second Edition, Cambridge University Press, Cambridge

297 [39] Z. Michalewicz, Genetic algorithms+data structures=evolution Programs, (Springer, 3d edn, 1996) [4] Y.S. The, G.P. Rangaiah, Comput. Chem. Eng.,27 (23)

298 EXTENDED SUMMARY The purpose of the present PhD is the optimization of determination of amino acids in their underivatized form or after pre-column derivatization by HPLC. As concerned the optimization of detection of underivatized amino acids, it was achieved by the combined use of a dual UV absorbance at 19-21nm, fluoroscesce at λex/λem=22/32 and a multiple electrochemical detection at 1.1V vs Ag/AgCl in series. Thus, 18 underivatized amino acids and related compounds : L-histidine (his), L- cysteine (cys), creatine (crn), S-methyl-L-cysteine (me-cys), DLhomocysteine (hcy), L-methionine (met), beta-(3,4-dihydroxyphenyl)-lalanine (dopa), L-tyrosine (tyr), DL-m-tyrosine (m-tyr), L-a-methyl-dopa (me-dopa), L-phenylanine (phe), DL-alpha-methyltyrosine (me-tyr), 5- hydroxy-tryptophan (5htp), 3-nitro-L-tyrosine (n-tyr) and L-tryptophan (trp), L-cystathionine (cysta), L-carnosine (car), and creatinine (cre) were simultaneously analysed with each detector. By using all these detection modes in series, positive peak identification can be obtained in a single chromatographic run. In order to optimise the analysis of amino acids the influence of organic modifier concentration on the separation and detection characteristics of the underivatized amino acids and related compounds was determined. In addition the use of a dual electrode consisting of a conventional size (3 mm diameter) glassy carbon electrode and of two carbon microfibers (3µm thick;.5cm exposed length) placed in the in the flow cell of the HPLC was studied. This study showed that both macro- and micro- electrodes gave good quality responses but a slightly better baseline as well as sign/noise characteristics occurred at the microfibers. The optimal conditions for the separation of the above 18 underivatized amino acids by reversed phase columns were found out using a genetic algorithm developed during the present PhD. In more 293

299 details, we adopted a new mathematical treatment concerning multilinear gradients, i.e. continuous gradients consisting of a certain number of linear portions. According to this treatment the experimental ln k vs. ϕ curve, where k is the retention factor of a sample solute under isocratic conditions and ϕ is the volume fraction of the organic modifier in the water-organic mobile phase, is subdivided into a finite number of linear portions resulting in simple analytical expressions for the solute gradient retention time. These expressions of the retention time are directly used in an optimisation technique based on genetic algorithms. This technique involves first the determination of the theoretical dependence of k upon ϕ by means of gradient measurements, which in turn is used by the genetic algorithm for the prediction of the best gradient profile, i.e. the best variation pattern of φ that leads to optimum separation of 18 underivatized amino acids at different values of the total elution time. However a prerequisite for an effective application of any optimization technique is a satisfactory accuracy of the retention times predicted under gradient conditions. For this reason the fundamental equations and conditions for linear and stepwise gradient elution in reversed phase liquid chromatography were applied to a mixture of amino acids in their underivatized form in aqueous mobile phases modified by 2- propanol, acetonitrile or methanol. It was found in all cases systematic deviations between experimental and calculated retention times, which are prominent in 2-propanol, reduced in acetonitrile and practically negligible in methanol. These deviations appear within a chromatogram just after the first change in the composition of the mobile phase reaches the detector and last ca 5 minutes, where the magnitude of errors reduces exponentially with time. Based on these observations we proposed a simple way to correct the calculated from the gradient elution theory retention times of sample solutes. The origin of the discrepancies between theory and experiment was attributed to two conflicting processes: a) a solvent demixing process that acts during the early part of gradient elution and yields to an increase in the solute retention, and 294

300 b) a slow change in stationary phase conformation as a result of change in mobile phase composition during gradient elution resulting to a decrease in solute retention. Finally, it was found the optimal conditions of separation and detection of amino acids after pre-column derivatization with 6- aminoquinolyl-n-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC). For this purpose it was determined the best gradient profile that leads to the optimum separation of a mixture of AQC-derivatized amino acids by using a lab made Levenberg-Marquardt algorithm. As concerned the optimization of AQC derivatives of amino acids it was achieved by recording in series a UV absorbance at 254nm, a fluorescence at λex/λem=248/345 and an electrochemical sign at 1.1V vs Ag/AgCl. Additionally an extensive comparison was conducted between the detection of amino acids in their underivatized form and after derivatization with AQC reagent. The conclusion of this study was that the UV absorbance, fluorescence and electrochemical activity of AQC-derivatives were generally improved in comparison to the free amino acids. However, analysis of some amino acids without derivatization should be preferred for ease and convenience especially when the analysis of whole amino acids is not necessary for some specific purposes. 295

301 296

302 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 297

303 298

304 ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΣΥΝΕ ΡΙΑ ΠΟΥ ΠΡΟΕΚΥΨΑΝ ΑΠΟ ΤΗ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Μέχρι σήµερα προέκυψαν από τη διδακτορική διατριβή 3 δηµοσιεύσεις στο περιοδικό Journal of Chromatography A και 8 ανακοινώσεις σε διεθνή συνέδρια. Παρακάτω δίνονται οι δηµοσιεύσεις αυτές και οι ανακοινώσεις στα συνέδρια. ηµοσιεύσεις διδακτορικής διατριβής 1. Multilinear gradient elution optimisation in reversedphase liquid chromatography using genetic algorithms P. Nikitas, A. Pappa-Louisi*, P. Agrafiotou J. Chromatogr. A,112 (26) Column equilibration effects in gradient elution in reversed-phase liquid chromatography A. Pappa-Louisi*, P. Nikitas, P. Agrafiotou J. Chromatogr. A,1127 (26) Characterization of a simple electrochemical detector for HPLC and FIA based on carbon microcylinder electrodes P.Agrafiotou, S.Sotiropoulos Anal. Chim.Acta 497 (23)

305 Ανακοινώσεις διδακτορικής διατριβής σε διεθνή συνέδρια 1. Analysis of underivatized amino acids by HPLC with on line UV absorbance and electrochemistry at carbon electrodes A. Pappa-Louisi*, S. Sotiropoulos and P. Agrafiotou 54 th Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry, Thessaloniki, Greece, September Ανίχνευση και διαχωρισµός µε HPLC µη παραγωγοποιηµένων αµινοξέων Α. Παππά Λουίζη*, Π. Νικήτας, Π. Αγραφιώτου 8ο Συνέδριο Χηµείας Ελλάδος-Κύπρου, Θεσσαλονίκη A genetic algorithm used for optimisation of sectionally linear gradient elution in reversed-phase liquid chromatography P. Nikitas, A. Pappa-Louisi*, P. Agrafiotou and A. Papageorgiou 29 ο International symposium on HPLC, Stockholm, Sweden, 26-3 June Optimal conditions for simultaneous HPLC determination of anderivatized amino acids with on line dual UV absorbance, fluorescence and multiple electrochemical detection A. Pappa-Louisi*, S. Sotiropoulos, P. Nikitas and P. Agrafiotou 29 ο International symposium on HPLC, Stockholm, Sweden, 26-3 June 25 3

306 5. A genetic algorithm used for optimisation of stepwise gradient elution in reversed-phase liquid chromatography P. Nikitas, A. Pappa-Louisi*, P. Agrafiotou and A. Papageorgiou 1 st International Conference on Experiments/Process/System Modelling/Simulation/Optimisation, 6-9 Jule 25, Athens, Greece 6. A genetic algorithm used for prediction of stepwise gradient elution in reversed-phase liquid chromatography taking into account column equilibrium effects A. Pappa-Louisi*, P. Nikitas, P. Agrafiotou, P. Balkaltzopoulou and A. Papageorgiou Instrumental Methods of Analysis, Modern Trends and Applications 2-6 October 25, Iraklio, Greece. 7. Computer Simulations for stepwise gradient elution in reversed-phase liquid chromatography exhibiting column non-equilibrium Pappa-Louisi*, P. Nikitas,, P. Agrafiotou and J. Stafiej 1 st European Chemistry Congress, August 26, Budapest, Hungary. 8. Column equilibration effects in gradient elution in reversed-phase liquid chromatography Pappa-Louisi*, P. Nikitas,, P. Agrafiotou 5 th Aegean Analytical Chemistry Days, 5-8 October 26, Thessaloniki, Greece. 31

307 32

308 Η συγκεκριµένη ιδακτορική ιατριβή χρηµατοδοτήθηκε από την Ευρωπαϊκή Ένωση/Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταµείο (ΕΠΕΑΕΚ/ΕΚΤ) στα πλαίσια των υποτροφιών βασικής έρευνας «Ηράκλειτος» µε επιστηµονικό υπεύθυνο την Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Α. Παππά Λουίζη. 33