ΚΛΗΝΗΚΖ ΦΖΜΔΗΑ. πξσηείλεο πιάζκαηνο. ειεθηξνθφξεζε πξσηεηλψλ. έλδπκα

Transcript

1 ΚΛΗΝΗΚΖ ΦΖΜΔΗΑ πξσηείλεο πιάζκαηνο ειεθηξνθφξεζε πξσηεηλψλ έλδπκα

2 πξσηείλεο πιάζκαηνο γνλίδηα θσδηθνπνηνχλ ηε ζχλζεζε αλζξσπίλσλ πξσηετλψλ δηαθνξεηηθέο πξσηετλεο / θχηηαξν Ταπηνπνίεζε 300 δηαθνξεηηθψλ πξσηετλψλ ζην πιάζκα πξσηετλεο πξνζδηνξίδνληαη ζπλήζσο ζην πιάζκα γηα δαγλσζηηθνχο ζθνπνχο

3 πξσηείλεο - ακηλνμέα

4 πξσηείλεο πξσηετλεο : Σπγθεθξηκέλα ζηάδηα αλάπηπμεο Σπγθεθξηκέλεο θπζηνινγηθέο ή παζνινγηθέο ζπλζήθεο Γνκηθά ζπζηαηηθά θπηηάξσλ / ηζηψλ Δπδηάιπηεο ζε ελδνθπηηάξηα ή εμσθπηηάξηα πγξά Μεηαβνιή ζπγθέληξσζεο πξσηετλψλ ζε αζζελείο θαη πγηείο

5 πξσηείλεο Βηνινγηθά δείγκαηα : νξφο, πιάζκα, νχξα, CSF, ζάιην,ακληαθφ πγξφ, πεξηηνλατθφ, πιεπξηηηθφ πγξφ Σχλζεζε πξσηετλψλ : ήπαξ β-ιεκθνθχηηαξα νξκφλεο πξσηετληθήο θχζεσο (εμεηδηθεπκέλνη ηζηνί) Καηαβνιηζκφο πξσηετλψλ : ήπαξ (απψιεηα ζηαιηθνχ νμένο=ζήκα γηα θαηαζηξνθή) Αλσκαιίεο ζηελ πνζφηεηα : γελεηηθνί, ή είδνο πξσηετλεο θπζηνινγηθνί, παζνινγηθνί παξάγνληεο

6 Μεηαβνιέο ζπγθέληξσζεο πξσηεηλψλ ζην πιάζκα νθείινληαη : ηαρχηεηα πξσηεηλνζχλζεζεο ηαρχηεηα απνκάθξπλζεο δηαθνξά θαηαλνκήο επεξεάδεηαη : απφ ηελ νξζνζηαζία απφ ηελ αηκνιεςία

7 Μέζνδνη πξνζδηνξηζκνχ πξσηετλψλ Φσηνκεηξηθέο (κέζνδνο Bradford) Αλνζνρεκηθέο (ζνισζηκεηξία, λεθεινκεηξία, RIA, ELISA) Ζιεθηξνθφξεζε Αλνζνειεθηξνθφξεζε

8 Οιηθέο πξσηείλεο πιάζκαηνο Πιάζκα : πεξηέρεη ηλσδνγφλν (fibrinogen) mg/dl Πξσηετλεο νξνχ : g/dl Υπεξπξσηετλαηκία αθπδάησζε (δηάξξνηα, έκεηνη θ.η.ι.) ειιεηπήο θαηαθξάηεζε λεξνχ Υπνπξσηετλαηκία ππεξβνιηθή θαηαθξάηεζε λεξνχ ππεξβνιηθή ελδνθιέβηα ρνξήγεζε πγξψλ Γηαγλσζηηθή ζεκαζία : Πεξηνξηζκέλε, ζπλδπαζκφο κε άιιεο εμεηάζεηο

9 Ζιεθηξνθφξεζε απνηειεί κηα πνιχηηκε αλαιπηηθή κέζνδν γηα ην δηαρσξηζκφ ηνληζκέλσλ ζσκαηηδίσλ, θπξίσο βηνκαθξνκνξίσλ φπσο νη πξσηετλεο θαη ην DNA ρξεζηκνπνηείηαη επξχηαηα γηα δηαρσξηζκφ πεπηηδίσλ, πξσηετλψλ ηνπ πιάζκαηνο, ησλ αηκνζθαηξηλψλ, ησλ ηζνελδχκσλ, ησλ ιηπνπξσηετλψλ, αιιά θαη ζηελ έξεπλα γηα δηαρσξηζκφ θαη ηαπηνπνίεζε πξσηετλψλ, DNA, RNA απνηειεί έλα απφ ηα πην ζεκαληηθά θαη ζεκειηψδε εξγαιεία ζηελ εξγαζηεξηαθή δηαγλσζηηθή ηαηξηθή θαη ζηε κνξηαθή βηνινγία. βαζίδεηαη ζηελ θίλεζε θνξηηζκέλσλ ζσκαηηδίσλ κέζα ζ'έλα πγξφ κέζνλ ππφ ηελ επίδξαζε ειεθηξηθνχ πεδίνπ. Πρώτος ο Tiselius χρησιμοποίησε τη μέθοδο το 1937, για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών.

10 Ηιεθηξνθόξεζε-βαζηθή ζπλδεζκνινγία Ηιεθηξνθνξεηηθό πιηθό Τροθοδοηικό δείγκα Σσζκεσή ηλεκηροθόρηζης

11 Θεσξεηηθή βάζε ηεο ηερληθήο Μόξηα πνπ θέξνπλ ειεθηξηθό θνξηίν θηλνύληαη πξνο ηελ άλνδν (+) ή ηελ θάζνδν (-) όηαλ ηνπνζεηεζνύλ ζε ειεθηξηθό πεδίν, αλάινγα κε ην θνξηίν πνπ δηαζέηνπλ. Οη πξσηετλεο θαη ηα λνπθιεηθά νμέα είλαη βηνκόξηα κε θπζηθνρεκηθέο ηδηόηεηεο ακθνιπηώλ, κπνξνύλ δειαδή λα ζπκπεξηθέξνληαη ηόζν σο νμέα όζν θαη σο βάζεηο. Οη νκάδεο πνπ ηνλίδνληαη θαη ζπκβάιινπλ ζηελ ακθνιπηηθή ηνπο ζπκπεξηθνξά αλήθνπλ θπξίσο ζηα πνιηθά ακηλνμέα (πξσηείλεο) ή θσζθνξηθέο νκάδεο (λνπθιεηθά νμέα). Κάζε ακηλνμύ κπνξεί λα θνξηηζζεί ζεηηθά ή αξλεηηθά αλάινγα κε ην pη ηνπ δηαιύκαηνο ζην νπνίν βξίζθεηαη,

12 Θεσξεηηθή βάζε ηεο ηερληθήο Κάζε πξσηετλε έρεη έλα ραξαθηεξηζηηθό ζεκείν ηεο θιίκαθαο ηνπ ph όπνπ δελ έρεη θαζαξό θνξηίν. Τν ζεκείν απηό θαιείηαη ηζνειεθηξηθό ζεκείν (isoelectric point, P.I.) θαη ε ηηκή ηνπ εμαξηάηαη από ηελ πεξηεθηηθόηεηα ηεο θάζε πξσηετλεο ζε αξηζκό θαη είδνο ακηλνμέσλ. Σην ηζνειεθηξηθό ζεκείν, νη πξσηετλεο δελ θηλνύληαη νύηε πξνο ηελ άλνδν νύηε πξνο ηελ θάζνδν θαηά ηελ ειεθηξνθόξεζε. Απηό δελ νθείιεηαη ζε έιιεηςε θνξηίνπ αιιά ζην όηη ην ζπλνιηθό θνξηίν ηνπ πξσηετληθνύ κνξίνπ είλαη κεδέλ. ε κεγάιε πιεηνςεθία ησλ πξσηετλώλ έρεη ηζνειεθηξηθά ζεκεία κηθξόηεξα ηνπ 8, άξα ζε αιθαιηθό πεξηβάιινλ (ph>8) ηα πεξηζζόηεξα πξσηετληθά κόξηα είλαη αξλεηηθά θνξηηζκέλα θαη θαηά ηελ ειεθηξνθόξεζε νδεύνπλ πξνο ηελ άλνδν (+).

13 Παξάγνληεο πνπ επεξεάδνπλ ηνλ ειεθηξνθνξεηηθό δηαρσξηζκό ph ζεξκνθξαζία έληαζε ηνπ ειεθηξηθνύ πεδίνπ είδνο ηνπ ειεθηξνθνξεηηθνύ πιηθνύ κέγεζνο θαη ζρήκα ηνπ βηνκνξίνπ θύζε ηνπ ξπζκηζηηθνύ δηαιύκαηνο

14 Τν είδνο ηνπ ειεθηξνθνξεηηθνύ πιηθνύ - Ηιεθηξνελδόζκσζε (Electroendosmosis) (-) ΚΑΘΟΔΟΣ βηνκόξην βηνκόξην βηνκόξην + + Αθίλεηα ζεηηθά θνξηία ξπζκηζηηθνύ δηαιύκαηνο Ηιεθηξνθνξεηηθό πιηθό (+) ΑΝΟΔΟΣ βηνκόξην Ηιεθηξνθνξεηηθό πιηθό

15 Αλίρλεπζε πξσηεηλώλ ζε ειεθηξνθόξεκα Πξσηείλεο νξνύ Amido Black (640 nm), Bromophenol Blue (600 nm), Coomassie Brilliant Blue (595 nm), Nigrosin (540 nm) PONCEAU-S (520 nm). δηαρσξηζκόο ηζνελδύκσλ ελδπκαηηθέο ελδεηθηηθέο αληηδξάζεηο κε NADH, ή ΝΑDPΗ, κε ηειηθό απνηέιεζκα ηελ παξαγσγή θνξκαδάλεο (570 nm). Ληπνπξσηετλεο Sudan Red 7B (540 nm) Oil Red O (520 nm) Sudan Black (600 nm) AgNO 3 (silver stain), κε θύξην πιενλέθηεκα ηελ αύμεζε ηεο επαηζζεζίαο, δηόηη ελώ κε ηε ρξσζηηθή Coomassie Blue ην óξην αλίρλεπζεο είλαi 1 κg, πξσηετλεο κε ηε ρξώζε αξγύξνπ κεηώλεηαη ζηα 10 ng. απηνξαδηνγξαθία

16 Ηιεθηξνθόξεζε πεθηήο αγαξόδεο (agarose gel electrophoresis) ρξεζηκνπνηείηαη επξύηαηα: ζην δηαρσξηζκό ησλ πξσηετλώλ ηνπ νξνύ ησλ ηζνελδύκσλ (LDH, CK, ALP, αηκνζθαηξηλώλ θ.α.) ησλ θιαζκάησλ ιηπνπξσηετλώλ ησλ λνπθιετληθώλ νμέσλ (DNA, RNA).

17 Ηιεθηξνθόξεζε πεθηήο αγαξόδεο Ζ πεθηή αγαξφδεο σο ειεθηξνθνξεηηθφ πιηθφ απνηειείηαη απφ ππθλφ δηθηπν νπδέηεξσλ πνιπζαθραξηηψλ (επαλαιακβαλνκέλσλ κνλάδσλ αγαξφδεο), ησλ νπνίσλ νη αιπζίδεο ζρεκαηίδνπλ πφξνπο θαηά ην ζρεκαηηζκφ ηεο πεθηήο, Γηάιπκα αγαξφδεο ζε ζεξκνθξαζία ~100 ν C πνιπκεξίδεηαη δεκηνπξγψληαο έλα θνιινεηδέο δηάιπκα πνπ πήδεη ζε ζεξκνθξαζία κηθξφηεξε ησλ 45 ν C. Ζ πεθηή αγαξφδεο, ιφγσ ησλ κεγάισλ πφξσλ πνπ ζρεκαηίδνληαη θαηά ηνλ πνιπκεξηζκφ, απνηειεί έλα ηθαλνπνηεηηθφ ειεθηξνθνξεηηθφ πιηθφ πνπ δελ εκπνδίδεη ζηεξενρεκηθά ηελ ειεχζεξε κεηαθίλεζε ησλ βηνκαθξνκνξίσλ.

18 Ζιεθηξνθφξεζε πεθηήο αγαξφδεο α) ηξνθνδνηηθό β) ζπζθεπή γ) παξαζθεπή πεθηήο

19 Ηιεθηξνθόξεζε πξσηεηλώλ ηνπ νξνύ ζε πεθηή αγαξόδεο

20 Ηιεθηξνθόξεζε πξσηεηλώλ ηνπ νξνύ ζε πεθηή αγαξόδεο pre-albumin 2. Albumin 3. alpha 1-Acid- Glycoprotein 4. alpha 1-Antitrrypsin 5. Haptoglobin 6. alpha2 macroglobulin 7. Hemopexin 8. Transferrin 9. Complement 10. Gamma

21 πξνζνρή ε ειεθηξνθφξεζε πξσηεηλψλ κεξηθέο θνξέο δελ είλαη ρξήζηκε θαη κπνξεί λα απνβεί παξαπιαλεηηθή Γηα παξάδεηγκα ε έιιεηςε ηεο IgA ε πιένλ ζπρλή δηαηαξαρή ζπγγελνχο αλνζναλεπάξθεηαο ζπρλά δελ απνθαιχπηεηαη κε ηελ ειεθηξνθφξεζε

22 Πξειεπθσκαηίλε (prealbumin) MB Σχλζεζε ζην ήπαξ Γέζκεπζε ζπξνμίλεο θαη ηξτσδνζπξνλίλεο Φιεγκνλή Κίξξσζε ήπαηνο (κεησκέλε βηνζχλζεζε) Πξνζδηνξηζκφο : λεθεινκεηξία Κπθινηεξήο αλνζνδηάρπζε Gradial immunodifussion Γηαγλσζηηθή ζεκαζία : πεξηνξηζκέλε

23 Λεπθσκαηίλε (Αιβνπκίλε, Albumin) ΜΒ (580 ακηλνμέα) Κπξηψηεξε πξσηετλε ζην πιάζκα % Σχλζεζε ζην ήπαξ Κχξηνο βηνινγηθφο ξφινο : κεηαθνξά θαη απνζήθεπζε πνιιψλ νπζηψλ, πεγή ελδνγελψλ ακηλνμέσλ, δηαηήξεζε θνιινεηδσζκσηηθήο πίεζεο ζηνλ ελδναγγεηαθφ ρψξν, αχμεζε ηεο ξπζκηζηηθήο ρσξεηηθφηεηαο ηνπ νξνχ Γέζκεπζε θαη κεηαθνξά : ρνιεξπζξίλε, ειεχζεξα ιηπαξά νμέα, νξκφλεο (ζπξνμίλε, ηξησδνζπξνλίλε,θνξηηδφιε, αιδνζηεξφλε), θάξκαθα, θαηηφληα (Ca 2+ )

24 Λεπθσκαηίλε (Αιβνπκίλε, Albumin) Γηαγλσζηηθή ζεκαζία αχμεζε : κηθξή δηαγλσζηηθή ζεκαζία Υπναιβνπκηλαηκία: Αηειήο βηνζχλζεζε επαηηθή βιάβε, πεξηνξηζκέλε ιήςε πξσηετλψλ, Γπζαπνξξφθεζε Απμεκέλνο 2. απμεκέλνο κεηαβνιηζκφο ιφγσ θαηαζηξνθήο ηζηψλ θιεγκνλήο 3. Μεησκέλε απνξξφθεζε ακηλνμέσλ ιφγσ δπζαπνξξφθεζεο ή θαθήο δηαηξνθήο 4. Απψιεηα πξσηετλψλ ιφγσ : γεθξσηηθνχ ζπλδξφκνπ, δηαβήηε, εξπζεκαηψδε ιχθνπ νχξα, εληεξνπάζεηεο, θαξθίλνο εληέξνπ θφπξαλα

25 Υπναιβνπκηλαηκία: Αηειήο βηνζχλζεζε επαηηθή βιάβε, ππνζηηηζκφο, Γπζαπνξξφθεζε Απμεκέλνο φγθνο θαηαλνκήο Υπεξελπδάησζε Απμεκέλε δηαπεξαηφηεηα ηξηρνεηδψλ Σεςαηκία Υπνμαηκία Απμεκέλε απέθθξηζε απνηθνδφκεζε Νεθξσηηθφ ζχλδξνκν Δληεξνπάζεηεο κε απψιεηα πξσηείλεο Δγθαχκαηα Αηκνξξαγία Καηαβνιηθέο θαηαζηάζεηο (βαξηά ζήςε, ππξεηφο, ηξαχκα, θαθνήζεο αζζέλεηα)

26 Λεπθσκαηίλε (Αιβνπκίλε, Albumin) Μέζνδνη πξνζδηνξηζκνύ 1. Πξάζηλν ηεο βξσκνθξεζόιεο (bromocresol green, BMG) 2. Ηιεθηξνθόξεζε 3. Αλνζνρεκηθνί πξνζδηνξηζκνί νη πξνζδηνξηζκνί ζην πιάζκα ρξεζηκνπνηνχληαη γηα λα εθηηκεζεί ε αληαπφθξηζε ηνπ αζζελνχο ζε δηαηηεηηθή ππνζηήξημε (γηα κεγάιν ρξνληθφ δηάζηεκα) ρξφλνο εκηδσήο αιβνπκίλεο ζην πιάζκα 20 εκέξεο έιεγρνο επαηηθήο ιεηηνπξγίαο θπζηνινγηθή ζηελ νμεία επαηίηηδα ρακειή ραξαθηεξηζηηθφ ρξφληαο επαηηθήο αζζέλεηαο

27 α1- αληηζξπςίλε o πξσηετλε νμείαο θάζεσο o θπζηθά απαληψκελνο αλαζηνιέαο πξσηεαζψλ : ζξπςίλε, ρπκνζξπςίλε, ειαζηάζε, θαιιηθξετλε, ξελίλε, θνιιαγελάζε o έιιεηςε α1-αληηζξπςίλεο ειεχζεξε θπθινθνξία ελεξγψλ πξσηενιπηηθψλ ελδχκσλ θαηαζηξνθή ζπλδεηηθνχ ηζηνχ ηνπ πλεχκνλα πλεπκνληθφ εκθχζεκα, θίξξσζε ήπαηνο o Μέζνδνη πξνζδηνξηζκνχ ειεθηξνθφξεζε λεθεινκεηξία

28 Γηαγλσζηηθή ζεκαζία α1 αληηζξπςίλεο Κιηληθέο ζπλέπεηεο δηαηαξαρψλ ηεο ζχλζεζεο ηεο α1 αληηζξπςίλεο Μπνξεί λα πξνθαιέζνπλ εκθχζεκα ζε λέα ειηθία (ιφγσ έιιεηςεο θπζηνινγηθήο λαζηνιήο ηνπ ελδχκνπ ειαζηάζε, γεγνλφο πνπ νδεγεί ζε απνδνκεηηθέο ιινηψζεηο ζηνλ πλεχκνλα) Νενγληθή επαηίηηδα Οκνδπγψηεο γηα ηε θπζηνινγηθή πξσηείλε Pi ΜΜ Τξηάληα αιιειφκνξθα ηνπ γνληδίνπ Αλεπάξθεηα θπξίσο νη νκνδπγψηεο γηα ην Ε αιιειφκνξθν PiΕΕ Σπρλφηεηα γνλνηχπνπ 1/3000 Διάηησζε 10-15% Ζ αηέιεηα νθείιεηαη ζε ππνθαηάζηαζε ελφο κφλν ακηλνμένο, ε νπνία νδεγεί ηελ ξσηείλε ζην ζρεκαηηζκφ ζπζζσκαησκάησλ, πνπ δελ κπνξνχλ λα εθθξηζνχλ απφ ν ήπαξ θαη πξνθαινχλ θαηαζηξνθή ηνπ ήπαηνο

29 Γηαγλσζηηθή ζεκαζία α1 αληηζξπςίλεο Δηεξνδπγψηεο δελ παξαηεξείηαη κεηαβνιή Γηάγλσζε κέζσ ηζνειεθηξηθήο εζηίαζεο ραξαθηεξίδεη ηηο παξαιιαγκέλεο πξσηείλεο Φξεζηκνπνηείηαη γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ησλ θαηλφηππσλ θαηά ηνλ πξνγελλεηηθφ έιεγρν

30 Έιιεηςε α1 αληηζξπςίλεο Κχξην ζπζηαηηθφ ηεο α1 δψλεο ζηελ ειεθηξνθφξεζε Οκνδπγψηεο. Μείσζε Δηεξνδπγψηεο δελ παξαηεξείηαη κεηαβνιή Γηάγλσζε κέζσ ηζνειεθηξηθήο εζηίαζεο ραξαθηεξίδεη ηηο παξαιιαγκέλεο πξσηείλεο Φξεζηκνπνηείηαη γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ησλ θαηλφηππσλ Πξνγελλεηηθφο έιεγρνο κε ηελ αληίδξαζε PCR, εληζρχνληαο ην εκβξπτθφ DNA

31 α2-πεξηνρή Απηνζθαηξίλε (haptoglobin, HAP) πξσηείλε νμείαο θάζεο Γέζκεπζε ειεχζεξεο αηκνζθαηξίλεο πνπ απειεπζεξψλεηαη ζην πιάζκα θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ελδναγγεηαθήο αηκφιπζεο (2 κφξηα) ηα ζχκπινθα αηκνζθαηξίλεο απηνζθαηξίλεο απνκαθξχλνληαη κέζσ ηνπ ελδνζειηαθνχ ζπζηήκαηνο θαη έρνπκε κείσζε ησλ επηπέδσλ ηεο απηνζθαηξίλεο Γέζκεπζε κέζσ α-αιπζίδαο δελ δεζκεχεη κεζαηκνζθαηξίλε, αίκε Πξνζηαηεχεη ηνλ νξγαληζκφ κέζσ παξεκπφδηζεο απψιεηαο αηκνζθαηξίλεο ζηα νχξα Γηαηήξεζε ηνπ ζηδήξνπ ζηνλ νξγαληζκφ Φακειέο ζπγθεληξψζεηο παξαηεξνχληαη ζε ρξφληα επαηνπάζεηα, κεηαζηαηθή λφζν θαη βαξηά ζήςε

32 mw: % πδαηάλζξαθεο, pi 5,4 Γέζκεπζε& παξεκπφδηζε } δξάζεο ελδνπεπηαζψλ πξσηεαζψλ (πιαζκίλε, πεςίλε, ζξπςίλε, ρπκνζξπςίλε) Γηαγλσζηηθή} λεθξσζηθφ ζχλδξνκν ζεκαζία α2- Μαθξνζθαηξίλε πεξηνξηζκέλε Μέζνδνη } αλνζνρεκηθέο Πξνζδηνξηζκνχ λεθεινκεηξία ειεθηξνθφξεζε

33 Σεξνπινπιαζκίλε (Ceruloplasmin) α2- γιπθνπξσηεΐλε, πξσηείλε νμείαο θάζεο mw: άηνκα Cu / θεξνπινπιαζκίλε / 95% ραιθνύ 10% πδαηάλζξαθεο, pi 4,4 βηνινγηθή δξάζε νμεηδάζε (ππνζηξώκαηα: πνιπακίλεο, πνιπθαηλόιεο ) Fe(II) Fe(III) βηνζύλζεζε: ήπαξ Δξά σο αληηνμεηδσηηθό (Τν θπξηόηεξν αληηνμεηδσηηθό ζην πιάζκα καδί κε ηελ ηξαλζθεξίλε) Παξεκπόδηζε ηεο ππεξνμείδσζεο ησλ ιηπηδίσλ θαη παξαγσγή ειεπζέξσλ ξηδώλ ζε θαηαζηάζεηο θιεγκνλήο

34 Σεξνπινπιαζκίλε (Ceruloplasmin) πξσηείλε νμείαο θάζεο αλεπάξθεηα θεξνπινπιαζκίλεο (λόζνο Wilson) Αύμεζε ζπγθέληξσζεο ζηελ εγθπκνζύλε Αύμεζε ζπγθέληξσζεο κεηά από ιήςε αληηζπιιεπηηθώλ πνπ πεξηέρνπλ πςειά πνζά νηζηξνγόλσλ

35 Τξαλζθεξξίλε / Σηδεξνθπιιίλε β- ζθαηξίλε Κχξηνο κεηαθνξέαο ηνπ ζηδήξνπ ζηα δηάθνξα δηακεξίζκαηα ηνπ νξγαληζκνχ Φπζηνινγηθά θνξεζκέλε θαηά 30% Αηκνρξσκάησζε 100% 2 κφξηα Fe 3+ / κφξην ηξαλζθεξξίλεο mw: % πδαηάλζξαθεο, pi 5,5-5,9 βηνζχλζεζε ήπαξ Έιιεηςε Fe 3+ Τξαλζθεξξίλεο, Αλαηκία Νεθξσζηθφ Σχλδξνκν } απψιεηεο πξσηεΐλεο => Τξαλζθεξξίλεο εληεξνπάζεηεο

36 γ- Σφαιρίνες (Ανοσοσφαιρίνες) IgA: 10-15% / / 10% πδαηάλζξαθεο IgG: 70-75% / / IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgM: 5-10% / / 10% πδαηάλζξαθεο IgE: 5-10% / / 15% πδαηάλζξαθεο IgD: 1% / / 12% πδαηάλζξαθεο

37 Φαξαθηεξηζηηθέο ηδηφηεηεο ησλ ηάμεσλ ησλ αλνζνζθαηξηλψλ

38 γ- Σθαηξίλεο (Αλνζνζθαηξίλεο) Πνιπθισληθή ππεξγακκαζθαηξηλαηκία Λνηκψμεηο αληηζσκάησλ ζηνλ νξφ Μνλνθισληθή ππεξγακκαζθαηξηλαηκία λενπιαζία Β- ιεκθνθχηηαξν κνλνθισληθφ αληίζσκα Πνιιαπινχλ κπέισκα

39 γ- Σθαηξίλεο (Αλνζνζθαηξίλεο)

40 IgM Ζ ζύνθεζη ηης IgM αξρίδεη θαηά ηα ηειεπηαία ζηάδηα ηεο εκβξπηθήο δσήο Δίλαη ε πξψηε απφ ηηο αλνζνζθαηξίλεο πνπ ζρεκαηίδεηαη κεηά απφ αληηγνληθή δηέγεξζε Σε ελήιηθα απνηειεί ην 10% ησλ θπθινθνξνχλησλ αλνζνζθαηξηλψλ Ζ αχμεζή ηεο δηεγείξεηαη απφ ηελ παξνπζία μέλσλ αληηζσκάησλ Μπνξεί λα ζπλδεζεί θαη λα ελεξγνπνηήζεη ην ζχζηεκα ηνπ ζπκπιεξψκαηνο

41 Μεηαβνιέο ζηε ζπγθέληξσζε ησλ αλνζνζθαηξηλψλ αλάινγα κε ηελ ειηθία

42 Ηιεθηξνθόξεζε πξσηεηλώλ ηνπ νξνύ ζε πεθηή αγαξόδεο

43 Ηιεθηξνθόξεζε πξσηεηλώλ ηνπ νξνύ ζε πεθηή αγαξόδεο

44 έλδπκα Ζ κλινική ή διαγνωζηική ελδπκνινγία είλαη ε εθαξκνγή ηεο επηζηήκεο ησλ ελδχκσλ ζηε δηάγλσζε θαη ηε ζεξαπεία ησλ αζζελεηψλ, πξνζδηνξίδνληαο ηηο ζπγθεληξψζεηο ή ηηο ελεξγφηεηεο ησλ ελδχκσλ ζηα βηνινγηθά πγξά ησλ αζζελψλ. Τα έλδπκα είλαη πξσηεΐλεο κε θαηαιπηηθέο ηδηφηεηεο, νη νπνίεο εθδειψλνληαη κε εηδηθή ελεξγνπνίεζε ησλ αληηζηνίρσλ ππνζηξσκάησλ ηνπο. Βάζε γηα ηελ αλάπηπμε ησλ κεζφδσλ ελδπκηθήο αλάιπζεο απνηεινχλ νη ραξαθηεξηζηηθέο απηέο θαηαιπηηθέο ηδηφηεηεο ησλ ελδχκσλ.

45 έλδπκα V K max m [ S] k obs [ S]

46 έλδπκα

47 έλδπκα

48 έλδπκα

49 Δπίδξαζε ηνπ pζ ζηελ ηαρχηεηα κηαο ελδπκηθήο αληηδξάζεσο Τεηαγκέλε: ηαρχηεηα εκθάληζεο ησλ πξντφλησλ Τεηκεκέλε: pζ

50 Δπίδξαζε ηνπ pζ ζηελ ηαρχηεηα κηαο ελδπκηθήο αληηδξάζεσο Τεηαγκέλε: ηαρχηεηα εκθάληζεο ησλ πξντφλησλ Τεηκεκέλε: pζ

51 Δπίδξαζε ηνπ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο ζηελ ηαρχηεηα κηαο ελδπκηθήο αληηδξάζεσο Τεηαγκέλε: ηαρχηεηα εκθάληζεο ησλ πξντφλησλ Τεηκεκέλε: pζ

52 Δπίδξαζε ηεο ζεξκνθξαζίαο επί ησλ θακππιψλ ηαρχηεηαο ελδπκηθήο αληηδξάζεσο

53 επίδξαζε ηεο ζεξκνθξαζίαο επί ηεο ηαρχηεηαο ηεο κε ελδπκηθήο θαη ηεο ελδπκηθήο - θαηαιπηηθήο αληίδξαζεο.

54 Δλδπκηθή ελεξγφηεηα θαη κνλάδεο εθθξάζεσο ηεο Ζ πνζφηεηα ελφο ελδχκνπ πνπ ππάξρεη ζ' έλα βηνινγηθφ δείγκα νξηζκέλνπ φγθνπ (π.ρ. νξνχ) κπνξεί λα ππνινγηζηεί θπξίσο κεηά ηε κέηξεζε ηεο ελεξγφηεηάο ηνπ, δει. ηελ επίδξαζε ηνπ πάλσ ζηελ ηαρχηεηα ηεο ζπγθεθξηκέλεο αληηδξάζεσο πνπ θαηαιχεη. Ζ ελδπκηθή ελεξγφηεηα εμαξηάηαη ζεκαληηθά απφ παξάγνληεο, φπσο ε ζεξκνθξαζία, ην pζ, ε θχζε θαη ε ζχζηαζε ηνπ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο, ε ζπγθέληξσζε ηνπ ππνζηξψκαηνο (θαζψο θαη ε θχζε ηνπ, φπνπ ε εμεηδίθεπζε ηνπ ελδχκνπ επηηξέπεη πνηθηιία ππνζηξσκάησλ) θαη ε παξνπζία ελεξγνπνηεηψλ ή αλαζηνιέσλ. Έηζη ε ζεκαζία ησλ κνλάδσλ εθθξάζεσο ηεο ελδπκηθήο ελεξγφηεηαο θαη ν αξηζκφο ησλ κνλάδσλ πνπ θαηαγξάθνληαη γηα νξηζκέλν δείγκα κπνξνχλ λα εξκελεπζνχλ κφλν αλ είλαη γλσζηή ε κέζνδνο πξνζδηνξηζκνχ πνπ ρξεζηκνπνηείηαη.

55 Δλδπκηθή ελεξγφηεηα θαη κνλάδεο εθθξάζεσο ηεο Ζ ζπλεζέζηεξε ελδπκηθή κνλάδα είλαη ε Γηεζλήο Μνλάδα (IU) πνπ δείρλεη ηνλ «αξηζκφ ησλ (κmol) ηνπ ππνζηξψκαηνο, πνπ κεηαηξέπνληαη αλά ιεπηφ (min), θάησ απφ θαζνξηζκέλεο ζπλζήθεο ηεο αληηδξάζεσο». Ο αλσηέξσ νξηζκφο ηεο IU δελ αλαθέξεηαη ζε ζπγθεθξηκέλν φγθν βηνινγηθνχ δείγκαηνο, γηαπηφ φηαλ είλαη αλαγθαίν λα εθθξαζηεί ε ζπγθέληξσζε ηεο ελδπκηθήο ελεξγφηεηαο (φπσο ζπλήζσο γίλεηαη ζηελ θιηληθή ρεκεία) πξέπεη λα πξνζηεζεί ν φξνο ηνπ φγθνπ, π.ρ. IU/L ή miu/ml. ε δηεζλήο κνλάδα δελ ππνλνεί θακία ζπγθεθξηκέλε ζεξκνθξαζία γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ, πνπ πξέπεη λα αλαθέξεηαη νχηε αθφκα ππάξρεη ζπκθσλεκέλε πξφηππε ζεξκνθξαζία γηα ηηο ζπλήζεηο κεηξήζεηο πνπ γίλνληαη ζηελ θιηληθή ελδπκνινγία. Μηα κνλάδα ελδπκηθήο ελεξγφηεηαο, ζχκθσλα κε ην Γηεζλέο Σχζηεκα Μνλάδσλ (SI), είλαη ην katal (Kat): «ε πνζφηεηα ηεο ελεξγφηεηαο ηνπ ελδχκνπ πνπ κεηαηξέπεη έλα γξακκνκφξην (mol) ππνζηξψκαηνο αλά δεπηεξφιεπην (s) θάησ απφ νξηζκέλεο ζπλζήθεο». 1kat = 6x 107 1U ή 1IU = 16,67 nkat

56 Πξνυπνζέζεηο γηα ηε ρξήζε ελδπκηθνχ πξνζδηνξηζκνχ ζηελ θιηληθή δηαγλσζηηθή, (κέζνδνο ξνπηίλαο) 1. Ζ κέζνδνο πξνζδηνξηζκνχ λα είλαη ηερληθά απιή, ηθαλνπνηεηηθήο αθξίβεηαο θαη επαλαιεπηηθφηεηαο, θαη λα κελ απαηηεί πνιχ ρξφλν, γηα λα κπνξεί λα γίλεηαη κεγάινο αξηζκφο αλαιχζεσλ ζε ινγηθφ ρξφλν. 2. Τν απνηειέζκαηα πξέπεη λα είλαη θαζνξηζκέλα, κε φζν ην δπλαηφ κηθξφηεξε επηθάιπςε κεηαμχ θπζηνινγηθψλ θαη παζνινγηθψλ ηηκψλ. 3. Τν έλδπκν πξέπεη λα βξίζθεηαη ζην αίκα, ζηα νχξα ή ζε άιιν πγξφ ηνπ ζψκαηνο, απ' φπνπ λα είλαη εχθνιν λα ιεθζεί κε επεκβαηηθά 4. Ζ κέζνδνο πξνζδηνξηζκνχ δελ πξέπεη λ' απαηηεί πνιχπινθα φξγαλα.

57 Πξνυπνζέζεηο γηα ηε ρξήζε ελδπκηθνχ πξνζδηνξηζκνχ ζηελ θιηληθή δηαγλσζηηθή, (κέζνδνο ξνπηίλαο) Α) Μέζνδνο πξνζδηνξηζκνχ: Απιή - ηαρεία Αθξίβεηα Δπαλαιεςηκφηεηα Απιή νξγαλνινγία (πρ θαζκαηνθσηνκεηξηθή) Β) κηθξή αιιειεπηθάιπςε θπζηνινγηθψλ - παζνινγηθψλ ηηκψλ

58 Καηεγνξίεο ελδχκσλ ζην αίκα Καηεγνξίεο ελδχκσλ Αηκαηνγελή: Δηδηθά γηα ην πιάζκα Με αηκαηνγελή: Απεθθξηλφκελα Κπηηαξηθά Παξαδείγκαηα Πξσηεάζεο ζεξίλεο: ζξνκβίλε, παξάγνληαο x, παξάγνληαο xy Ληπάζε, α-ακπιάζε (απφ ζηεινγφλνπο αδέλεο θαη πάγθξεαο) ρνιηλεζηεξάζε, Πξνζηαηηθή φμηλε θσζθαηάζε Γαιαθηηθή αθπδξνγνλάζε, ακηλνηξαλζθεξάζεο, αιθαιηθή

59 Αχμεζε ηεο ελδπκηθήο ελεξγφηεηαο ζηα βηνινγηθά πγξά (νξφο πιάζκα) Μπορεί να οφείλεται σε : Ηλικία, φύλο, βάρος Νεογνά-παιδιά 3-6 ετών ALP αύξηση κατά 2-3 φορές Μεταβολική καταστροφή ---- αναγέννηση κυττάρων Παθολογικές καταστάσεις: Διαπερατότητα κυτταρικής μεμβράνης Ανοξία Φάρμακα Άυξηση Κ+ Φλεγμονή (μικρού ΜΒ ένζυμα)

60 Δμέηαζε νκάδσλ ελδχκσλ γηα ηε δηάγλσζε αζζελεηψλ νξγάλσλ ή ζπζηεκάησλ. Όξγαλν ή Σχζηεκα Καξδηά θαη θπθινθνξηαθφ ζχζηεκα Πάγθξεαο Οζηά Οπξνπνηεηηθφ ζχζηεκα Αζζέλεηα / νκάδα δηαγλσζηηθψλ ελδχκσλ νμέα εκθξάγκαηα κπνθαξδίνπ: Γηάγλσζε: CK, CKΜB, AST, LDH, Τξνπνλίλε θαξδηαθή αλεπάξθεηα : BNP/proBNP Ομεία παγθξεαηίηηδα, παξνμπζκφο παγθξεαηίηηδαο: α-ακπιάζε Ληπάζε, θσζθνιηπάζε α. ζξπςίλε Οζηηθέο αζζέλεηεο: ALP Καξθίλνη Πξνζηάηε ACP, PSA, PAP Ζ ACP ζηα νχξα 50 θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηνλ νξφ. Μεηά ηνλ επλνπρηζκφ ή αθαίξεζε πξνζηάηε ε ACP είλαη ρακειή

61 Καηαλνκή θαη θιηληθέο εθαξκνγέο ησλ δηαγλσζηηθψο ζεκαληηθψλ ελδχκσλ Έλδπκν Κύξηεο Πεγέο Κύξηεο Κιηληθέο εθαξκνγέο Ομηλε θσζθαηάζε Αιαληθή ακηλνηξαλζθεξάζε Αιθαιηθή θσζθα-ηάζε Ακπιάζε Αζπαξηηθή ακηλνηξαλζθεξάζε Χνιελεζηεξάζε Κξεαηηληθή θηλάζε γ-γινπηακηληθή ηξαλζθεξάζε Γαιαθηηθή αθπδξνγνλάζε 5-Ννπθιενηηδάζε ζξπςίλε PSA CK-MB Πξνζηάηεο, εξπζξνθύηηαξα Ήπαξ, ζθειεηηθνί κπο, θαξδηά Ήπαξ, νζηά, έληεξα, πια-θνύληαο, λεθξό Σηεινγόλνη αδέλεο, πάγθξεαο Ήπαξ, ζθειεηηθνί κπο, θαξδηά, λεθξόο, εξπζξνθύη-ηαξα Ήπαξ Σθειεηηθνί κπο, εγθέθαινο, θαξδηά, καιαθνί κπο Ήπαξ, λεθξό Καξδηά, ήπαξ, ζθειεηηθνί κπο, εξπζξνθύηηαξα Ηπαηνρνιηθνί αγσγνί Πάγθξεαο Πξνζηάηεο Καξδηά Καξθίλσκα πξνζηάηε, νζηηθέο αζζέλεηεο Ηπαηηθέο παξεγρπκαηηθέο αζζέλεηεο νζηηθέο αζζέλεηεο, επαηνρνιηθέο αζζέλεηεο Παγθξεαηηθέο αζζέλεηεο Έκθξαγκα κπνθαξδίνπ, επαηηθέο παξεγρπκαηηθέο αζζέλεηεοο, κπτθέο αζζέλεηεο Ηπαηηθέο παξεγρπκαηηθέο αζζέλεηεο, δειεηεξίαζε από νξγνλνθσζθνξηθά εληνκν-θηόλα Έκθξαγκα κπνθαξδίνπ, κπτθέο αζζέλεηεο, Ηπαηνρνιηθέο αζζέλεηεο, αιθννιηζκόο Έκθξαγκα κπνθαξδίνπ, αηκόιπζε, επαηηθέο παξεγρπκαηηθέο αζζέλεηεο Ηπαηνρνιηθέο αζζέλεηεο Παγθξεαηηθέο αζζέλεηεο Καξθίλνο πξνζηάηε Έκθξαγκα ηνπ κπνθαξδίνπ

62 Καξδηαθνί δείθηεο

63 Καξδηαθνί δείθηεο Ηζνέλδπκα CK

64 Ηζνέλδπκα LDH

65 Βαζκηαίεο κεηαβνιέο ζπγθεληξψζεσλ κεηαμχ ηζηψλ θαη νξνχ γηα ηελ αζπαξηηθή ακηλνηξαλζθεξάζε, γηα ηελ αιαληθή ακηλνηξαλζθεξάζε θαη γηα ηελ θξεαηηληθή θηλάζε