Evaluation of surface markers and related genes of the human umbilical cord derived Wharton s jelly mesenchymal stem cells

Transcript

1 Evaluation of surface markers and related genes of the human umbilical cord derived Wharton s jelly mesenchymal stem cells Homa Mohseni Kouchesfehani, Farnoosh Saraee 2,3, Masoud Maleki 4, Mahin Nikougoftar 5, Seyedeh Mahsa Khatami 3 ; Mohsen Sagha 6 PhD, Associate Professor, Department of Animal Sciences, School of Life Sciences, University of Kharazmi, Tehran, Iran 2 MSc, Department of Animal Sciences, School of Life Sciences, University of Kharazmi, Tehran, Iran 3 MSc, Research Laboratory for Embryology and Stem Cells, Department of Anatomical Sciences and Pathology, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran 4 PhD, Assistant Professor, Department of Biology, East Azerbaijan Sciences and Research Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran 5 PhD, Assistant Professor, Cord Blood Bank, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran 6 PhD, Assistant Professor, Research Laboratory for Embryology and Stem Cells, Department of Anatomical Sciences and Pathology, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran (Received January 5, 204; Accepted April 30, 204) Abstract Background and purpose: Umbilical cord derived Wharton's jelly is an enriched and accessible source of stem cells with highly proliferative and differentiation potential. This study aimed to evaluate the surface markers and related genes of the stem cells isolated from the human Wharton's jelly. Materials and methods: Explants of the human umbilical cord derived Wharton's jelly was dissected and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 20% Fetal bovine serum (FBS). Then, those cells migrated from explant's boundary were replated and passaged in DMEM containing 0% FBS. Finally, by using flowcytometry and (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) RT-PCR techniques different surface markers and related genes were analyzed. Results: 5-7 days post-plating, the stem cells initiated the migration from cultured explants and showed up to 80% densities on days 6-8. Light microscopy demonstrated two distinct cell populations including fibroblastlike and flat endothelial-like cells. Dual staining with flowcytometry also revealed that the cultured cells were found to be positive for CD44, CD73, CD90, CD05 and negative for CD34 and CD45. RT-PCR showed no changes in CD marker expression pattern during different passages. Conclusion: Human Wharton's jelly derived stem cells appear mesenchymal cell morphology and express related surface markers but no hematopoietic stem cell markers. Keywords: Wharton's jelly-derived stem cell, Explant culture, CD markers J Mazand Univ Med Sci 204; 24(2):??-?? (Persian).

2 پژوهشي دوره بيست و سوم شماره 2 ارديبهشت سال 393 ( - ) چكيده ارزيابي نشانگرهاي سطحي و ژنهاي وابسته به آنها در سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون بند ناف انساني هما محسني كوچصفهاني 2 فرنوش سرايي 3 مسعود ملكي 4 مهين نيكوگفتار 5 سيده مهسا خاتمي 6 محسن سقا سابقه و هدف: ژله وارتون بند ناف منبع غني و در دسترسي از سلولهاي بنيادي است كه قدرت تكثير و تمايز بالايي دارد. هدف از تحقيق حاضر ارزيابي نشانگرهاي سطحي و ژنهاي وابسته به آنها در سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون بود. مواد و روشها: قطعاتي از ژله وارتون بند ناف انساني تشريح و در محيط (Dulbecco's modified Eagle's medium) DMEM حاوي سرم جنين گاوي serum) Fetal bovine يا (FBS 20 درصد كشت داده شد. سپس آن دسته از سلولهاي بنيادي مهاجرت كرده از كنارههاي اين قطعات دوباره در محيط DMEM حاوي 0 FBS درصد كشت و پاساژ داده شدند. در نهايت نشانگرهاي سطحي و ژنهاي وابسته به آنها در سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون به روش فلوسايتومتري و نيز RT-PCR reaction) (Reverse-transcriptase polymerase chain مورد بررسي قرار گرفت. يافتهها: 5-7 روز بعد از كشت سلولهاي بنيادي شروع به مهاجرت از قطعه بافتي كشت داده شده كردند و پس از 6-8 روز به تراكم سلولي 80 درصد رسيدند. مشاهدات ميكروسكوپي سلولهاي بنيادي در كشت اوليه دو جمعيت متفاوت سلولهاي شبه فيبروبلاستي و شبه اندوتليالي پهن را نشان داد. تحليل فلوسايتومتري به روش رنگآميزي دوگانه بيان نشانگرهاي سطحي CD44 CD90 CD73 و CD05 و عدم بيان CD34 و CD45 را در اين سلولها به تصوير كشيد. يافتههاي RT-PCR نيز نشان داد كه بيان اين نشانگرها در پاساژهاي مختلف تغييري نكرد. استنتاج: سلولهاي بنيادي ژله وارتون از مورفولوژي سلولهاي مزانشيمي برخوردار هستند و نشانگرهاي سطحي مربوط به آنها را بيان ميكنند. همزمان نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي خونساز در آنها بيان نميشود. واژههاي كليدي: سلولهاي بنيادي ژله وارتون كشت قطعهاي نشانگرهاي سطحي مقدمه سلولهاي بنيادي سلولهاي تمايز نيافتهاي هستند كه ويژگيهاي منحصر به فردي از جمله توانايي خودنوزايي (Self-renewal) و تمايز به انواع مختلف ردههاي سلولي بدن را دارند. از ديگر مشخصات سلولهاي بنيادي انعطافپذيري (Plasticity) بالاي آنها است به طوري كه يك سلول مولف مسي ول: محسن سقا - اردبيل: خيابان دانشگاه دانشگاه علوم پزشكي اردبيل دانشكده پزشكي گروه علوم تشريحي و پاتولوژي. دانشيار گروه علوم جانوري دانشكده علوم زيستي دانشگاه خوارزمي تهران ايران m.sagha@arums.ac.ir 2. كارشناسي ارشد گروه علوم جانوري دانشكده علوم زيستي دانشگاه خوارزمي تهران و آزمايشگاه تحقيقاتي جنينشناسي و سلولهاي بنيادي گروه علوم تشريحي و پاتولوژي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي اردبيل اردبيل ايران 3. استاديار گروه زيستشناسي دانشگاه آزاد اسلامي واحد علوم و تحقيقات تبريز تبريز ايران 4. استاديار بانك خون بند ناف مركز تحقيقات انتقال خون مو سسه عالي آموزشي و پژوهشي طب انتقال خون تهران ايران 5. كارشناسي ارشد آزمايشگاه تحقيقاتي جنينشناسي و سلولهاي بنيادي گروه علوم تشريحي و پاتولوژي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي اردبيل اردبيل ايران 6. استاديار آزمايشگاه تحقيقاتي جنينشناسي و سلولهاي بنيادي گروه علوم تشريحي و پاتولوژي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي اردبيل اردبيل ايران تاريخ دريافت: 392/0/5 تاريخ ارجاع جهت اصلاحات: 393/2/6 تاريخ تصويب: 393/2/0 2

3 نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون بنيادي قادر است پروفايل بيان ژني و فنوتيپ عملكردي متفاوتي از منشا اوليه خود به نمايش بگذارد. از اين رو به عنوان يك منبع سلولي مناسب جهت درمان بسياري از بيماريها به شمار ميروند كه طي سالهاي اخير توجه بسياري از محققين را به خود معطوف كردهاند (-3). سلولهاي بنيادي بر اساس منشا استخراج آنها در سه دسته قرار ميگيرند كه شامل سلولهاي بنيادي روياني cells) (Embryonic stem سلولهاي بنيادي جنيني cells) (Fetal stem و سلولهاي بنيادي بزرگسال ميباشند (4-6). سلولهاي بنيادي مزانشيمي با منشا مزودرمي از بخش استرومايي بافتهاي جنيني مانند قسمتهاي خاصي از جفت و بند ناف و يا از بافتهاي بزرگسال نظير بافت چربي خون محيطي مغز استخوان و غيره استخراج ميگردند (7 4). اين سلولها در بافت بند ناف از بخشهاي مختلفي از جمله عروق خوني (9 8) غشاي آمنيوتيك (0) و ژله وارتون ( 7) به دست ميآيند. ژله وارتون بافتي سرشار از سلولهايي با مورفولوژي مزانشيمي است و نخستين جداسازي و كشت سلولهاي شبه فيبروبلاستي از ژله وارتون انساني توسط مك الريوري گزارش شد (2). Mitchell و همكاران نيز ژله وارتون را به عنوان منبعي از سلولهاي بدوي كه توانايي تمايز به ساير ردههاي سلولي از جمله سلولهاي عصبي را دارند معرفي كردند (3). از آن زمان تاكنون از اين سلولها در مطالعات باليني مختلفي استفاده و توانايي تمايز اين سلول به سلولهاي عصبي سلولهاي ترشح كننده انسولين پانكراسي سلولهاي شبه كبدي و بافتهاي قلبي- عروقي نشان شده است. همچنين مشخص شده است كه سلولهاي بنيادي ژله وارتون در مهار رشد سرطان پستان تخمدان و استي وساركوم نيز نقش دارند.(4-6) ماهيت سلولهاي ردههاي مختلف به بيان مجموعه پيچيدهاي از پروتي ينهاي سطح سلولي به نام نشانگرهاي سطحي بستگي دارد كه سرنوشت تكويني اين سلولها را تعيين ميكنند. الگوي بيان اين نشانگرها در سلولهاي مختلف متفاوت است ( 7 ) به طوري كه اولين مشخصه مولكولي سلوله يا سطحي بنيادي مزانشيمي در شرايط كشت بيان نشانگرهاي CD90 CD73 CD44 و CD05 به همراه عدم بيان نشانگرهاي CD34 و CD45 ميباشد 8).( اغلب اين نشانگرهاي سطحي به عنوان گيرنده يا ليگاند در مسيرهاي پيام رساني مختلف عمل ميكنند و يا نقشهاي مهم ديگري نظير برقراري اتصالات سلولي دارند. به عنوان مثال آنتيژن CD44 كه گيرنده ماتريكس خارج سلولي 3 نيز ناميده ميشود با فيبرونكتين و كلاژن در ارتباط است و به اتصال سلول به سلول و سلول به ماتريكس كمك ميكند از اين رو نقش مهمي در چسبيدن و مهاجرت سلولي دارد. نشانگر سطحي CD73 نيز نوعي اكتو- 5 - نوكلي وتيداز است كه در مهاجرت سلوله يا بنيادي مزانشيمي و نيز تطبيق اين سلولها در مقابل سيستم ايمني نقش دارد. آنتيژن CD90 نوعي گليكوپروتي ين سطح سلولي است كه با حضور در بخش استرومايي بافتهايي همچون بند ناف اتصال سلول به سلول را باعث ميشود. از طرفي نشانگر TGF-β از اعضاي خانواده مسير پيامرساني CD05 (β (Transforming growth factor- است كه به عنوان يكي از اصليترين مولكولهاي اين مسير طي تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي عمل ميكند. حضور توأم آنتيژنهاي پيشگفته در سطح سلوله يا بنيادي براي اتصال آنها به كف ظروف كشت تكثير و تمايز آنها لازم است. نشانگرهاي CD34 نيز نوعي آنتيژنهاي سطح سلولي بيان شونده در سلولهاي بنيادي خونساز است كه در چسبندگي سلول به سلول و سلول به ماتريكس نقش دارد. آنتيژن CD45 نيز به عنوان نوعي گليكوپروتي ين سطح سلولي كه آنتيژن مشترك لكوسيتي LCA) يا (Leukocyte common antigen هم ناميده ميشود در تنظيم رشد و تمايز سلولي نقش دارد (9). در مطالعات گذشته جداسازي سلولهاي بنيادي مزانشيمي مشتق از ژله وارتون با استفاده از روشهاي كشت قطعهاي culture) (Explant و هضم آنزيمي و نيز ويژگيهاي مورفولوژيكي اين سلولها نشان داده شده است (2 20 ) اما 3

4 P A L E پژوهشي هما محسني كوچصفهاني و همكاران بررسي الگوي بيان نشانگرهاي سطحي اين سلولها در سطح پروتي ين و نيز ارزيابي تغييرات بيان ژني اين نشانگرها طي پاساژهاي مختلف سلولي در شرايط كشت آزمايشگاهي صورت نگرفت و يا در صورت انجام تنها به مطالعه تعداد معدودي از ژنها و نيز نشانگرهاي سطح سلولي با تكنيك فلوسايتومتري آن هم به روش تك رنگ (Monostaining) بسنده شده است كه نميتواند ارزيابي مولكولي جامعي در اين زمينه باشد. از آنجايي كه علاوه بر بررسي مورفولوژي سلولهاي كشت داده شده ارايه شواهد مولكولي مانند بيان نشانگرهاي سطحي سلولها نيز يكي از معيارهاي بسيار مهم در كشت سلولهاي بنيادي محسوب ميگردد و تا ييدي بر ماهيت مزانشيمي و بنيادي سلوله يا مشتق شده از ژله وارتون انساني در محيط آزمايشگاهي است اين مطالعه با هدف استخراج سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون به روش كشت قطعهاي و به دنبال آن بررسي تعدادي از مهمترين نشانگرهاي سطحي اين سلولها و نيز برخي از ژنهاي مربوط به آنها با استفاده از تكنيكهاي فلوسايتومتري به صورت رنگآميزي دوگانه staining) Dual و) RT-PCR (Reverse-transcriptase- polymerase chain reaction) انجام شد. مواد و روشها جداسازي و كشت سلولهاي بنيادي از ژله بند ناف پس از كسب رضايت مادران باردار بند ناف نوزادان سالم پس از انجام عمل سزارين جمعآوري شد و تحت شرايط استريل در داخل نرمال سالين قرار داده شد و بلافاصله به كمك فلاسك حاوي يخ به آزمايشگاه منتقل گرديد. جداسازي سلولهاي بند ناف انساني به روش كشت قطعهاي بافت و طي 6 ساعت اول بعد از زايمان صورت گرفت. در اين روش جهت ضد عفوني ابتدا بند ناف به مدت 30 ثانيه در معرض الكل 70 درصد قرار گرفت و به دنبال آن دو بار با بعد از جداسازي غشاي آمنيوني و عروق خوني قطعات كوچكي به حجم تقريبي 5 ميليمتر مكعب از ناحيه ژله وارتون برش داده شدند كه پس از شستشو با - PBS به محيط كشت (PAA حاوي ) DMEM low glucose درصد سرم جنيني گاو FBS) يا (Fetal bovine serum -0) -00) (PAA و درصد پني سيلين/ استرپتومايسين (PAA در فلاسكهايكشت سلولي T25 انتقال داده شدند. كشت اوليه اين قطعات بافتي در داخل انكوباتور داراي CO 2 در شرايط دمايي 37 درجه سانتيگراد و 5 درصد CO 2 صورت گرفت و محيط كشت فلاسكها هر سه روز يك بار تعويض گرديد. 6-8 روز بعد به دنبال خروج تعداد بسيار زيادي از سلولها از اطراف بافتهاي كشت داده شده اوليه اين قطعات بافتي خارج گرديد و جهت جداسازي سلولها از كف فلاسك و نيز كشت مجدد آنها اين سلولها به مدت 7-5 دقيقه تحت تا ثير -003) Trypsin/ EDTA (PAA 0/05 (Trypsin/ Ethylenediaminetetraacetic acid) درصد قرار گرفتند. سلولهاي جدا شده بار ديگر در فلاسكهاي T25 كشت داده شدند تا توزيع يكنواختي از آنها به دست آيد. اين مرحله به عنوان پاساژ صفر در نظر گرفته شد. سپس به ازاي هر 5-7 روز كشت پس از اين كه تراكم سلولي به درصد رسيد سلولها در محيط كشت DMEM low glucose حاوي 0 درصد سرم جنيني گاو و درصد پنيسيلين/ استرپتومايسين پاساژ داده شدند. Immunophenotyping سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون انساني با فلوسايتومتري بيان نشانگرهاي سطحي CD73 CD90 CD05 CD44 CD45 و CD34 در سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون به روش فلوسايتومتري مورد بررسي قرار گرفت. سلولهاي بنيادي پاساژ دوم پس از دوبار شستشو با - PBS با استفاده از 0/05 Trypsin/EDTA درصد از كف فلاسك - PBS (Phosphate buffered saline) شستشو داده شد. 4

5 T نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون جدا گرديدند و در نهايت تك سلولي شدند. ابتدا 50 ميكروليتر از اين سلولها با 5 ميكروليتر از آنتيباديهاي ايزوتايپ كنترل شامل :MOPC-3C) Clone IgG-FITC (BD Pharmingen و :MOPC-3C) Clone IgG-PEو (BD Pharmingen همچنين آنتيباديهاي CD34-PE (BD Pharmingen Clone :563) CD44-FITC (BD Pharmingen Clone :G44-26) CD45-FITC (BD Pharmingen Clone :2D) CD73-PE (BD Pharmingen Clone :AD2) :5E0) Clone CD90-FITC (BD Pharmingen و :266) Clone CD05-FITC (BD Pharmingen به مدت سي دقيقه در 4 درجه سانتيگراد مجاور شدند. پس از واكنش 50 ميكروليتر از محلول پارافرمالدي يد 4 درصد به سوسپانسيون سلولي اضافه شد سپس سلولها با بافر - PBS شستشو داده شدند و در نهايت نمونهها با دستگاه فلوسايتومتري Partec PAS III و با استفاده از نرمافزار 2/4e Flomax مورد آناليز قرار گرفتند. 9424) نسخهبرداري معكوس واكنش زنجيرهاي پليمراز (RT-PCR) استخراج RNA كل سلول با استفاده از محلول ترايزول (Sigma طبق دستورالعمل شركت سازنده صورت گرفت. غلظت RNA استخراج شده با دستگاه نانودراپ تعيين گرديد و يك ميكروگرم از RNA كل جهت سنتز (Complementary DNA) cdna با كيت ( 622 ReverseAid TM first strand cdna (synthesis fermentase در حجم نهايي 20 ميكروليتر مورد استفاده قرار گرفت. توالي پرايمرها و طول قطعات تكثير يافته در جدول شماره آمده است. محصولات PCR بر روي ژلهاي آگار /2 درصد حاوي اتيديوم برومايد μg/ml) 0/5) الكتروفورز شدند و باند ايجاد شده به كمك نور (Ultraviolet) UV به كمك دستگاه Uvidoc; UK مشاهده شد. كليه پرايمرهاي مربوط از شركت Bioneer كره جنوبي خريداري شد. جمعآوري نمونههاي مورد مطالعه و كشت قطعهاي آنها و نيز انجام RT-PCR براي ژنهاي مورد نظر حداقل در سه تكرار مستقل از هم صورت گرفت. يافتهها ويژگيهاي مورفولوژيكي به دنبال جداسازي قطعات بافتي بند ناف و كشت اوليه آنها در فلاسك (تصوير شماره A) بعد از 7-9 روز سلولهاي بنيادي مزانشيمي انساني شروع به جدا شدن از اطراف اين قطعات نمودند و به كف فلاسك چسبيدند (تصوير شماره B). پس از گذشت 6-8 روز تعداد زيادي از سلولهاي بنيادي از قطعه بافتي اوليه كشت داده شده جدا شدند و كف فلاسك را پوشاندند (تصوير شماره C). در پايان روز 6-8 پس از برداشتن قطعه بافتي و كشت مجدد سلولهاي چسبيده به فلاسك دو نوع سلول با مورفولوژي مشخص در آنها مشاهده گرديد دستهاي به صورت سلولهاي كوچك مسطح با مورفولوژي شبيه به سلولهاي اندوتليالي بودند و گروه دوم ظاهر دوك مانند شبيه به سلولهاي فيبروبلاستي داشتند (تصوير شماره D). جدول شماره : توالي پرايمرهاي مورد استفاده طول محصول دماي اتصال و تعداد چرخه پرايمرها Gene Primer Sequence (5 toward 3 ) Size (bp) Annealing Temperature (ºC) Forward: CATCACCATCTTCCAGGAGC GAPDH Reverse: CCTGCTTCACCACCTTCTTG CD 34 Forward: CAGCTGTGCGGAGTTTAAGA Reverse: CCGTTTTCCGTGTAATAAGG 4 50 CD 90 Forward: CATTCTCAGCCACAACCAAA Reverse: CCTTTGTAGCCCTCTCCACT CD 05 Forward: GCCAGCATTGTCTCACTTCA Reverse: TGGAAAGAGAGGCTGTCCAT Bp = Base pair Cycle

6 پژوهشي هما محسني كوچصفهاني و همكاران تصوير شماره : كشت اوليه و پاساژ سلوله يا بنيادي مشتق از ژله وارتون بند ناف (A: كشت قطعه بافتي اوليه ژله وارتون و (B: جدا شدن و مهاجرت اوليه اين سلولها پس از 9-7 روز كشت (C: تكثير و گسترش سلوله يا بنيادي در روزهاي 6-8 و (D: كشت مجدد اين سلولها پس از حذف قطعه بافتي اوليه در روزهاي 6-8. كادر سلولي بالا و راست اين تصوير سلولهايي با مورفولوژي شبه اندوتليالي (علامت پيكان سفيد) و شبه فيبروبلاستي (علامت پيكان تيره) را نشان ميدهد (E: تكثير و گسترش سلوله يا بنيادي در انتهاي پاساژ صفر (5-7 روز پس از كشت مجدد سلولها) و (F: تراكم بيشتر سلولهايي با مورفولوژي شبه فيبروبلاستي در پاساژ دوم µm).(scale bar = 200 به دنبال تكثير و گسترش سلولها در انتهاي پاساژ صفر (تصوير شماره E) و پاساژ مجدد آنها از ميزان جمعيت سلولهاي با مورفولوژي اندوتليالي كاسته شد و در عوض سلولهايي كه مورفولوژي شبه فيبروبلاستي داشتند باقي ماندند و تكثير يافتند (تصوير شماره F). آناليز فلوسايتومتري از تكنيك فلوسايتومتري به صورت رنگآميزي دوگانه براي تعيين خصوصيت نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون بند ناف در پاساژ دوم استفاده شد (تصوير شماره 2). همانطور كه جدول شماره 2 نشان ميدهد 69/5 درصد سلولهاي بنيادي نشانگرهاي CD44/CD73 را به صورت توأم بيان كردند. همچنين اين بررسيها نشان داد كه بيان توأم نشانگرهاي CD90 و CD05 در اين سلولها 74/05 درصد بود. با اين حال كمتر از 0/5 درصد اين سلولها توانستند بيان توأمي از CD34 و CD45 داشته باشند. آناليز RT-PCR آناليز بيان ژنهاي مربوط به نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون يعني CD05 و CD90 و نيز نشانگر سطحي مربوط به سلولهاي بنيادي خونساز (CD34) به روش RT-PCR نشان داد كه در سلولهاي استخراج شده ژنهاي نشانگر سلولهاي بنيادي مزانشيمي از جمله CD90 و CD05 در پاساژ صفر و به دنبال آن در پاساژهاي دو و چهار بيان خوبي داشتند در حالي كه ژن نشانگر سلولهاي بنيادي خونساز CD34 در هيچ كدام از پاساژهاي سلولي بيان نشد (تصوير شماره 3). 6

7 نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون Gate: R Q:.44% Q2: 0.82% 200 SSC - 50 FL IgG-FITC 0 Q3: 97.67% Q4: 0.07% 50 R FSC - FL2 IgG-PE 0 0 Gate: R Gate: R Q: 7.43% Q2: 0.7% Q: 0.07% Q2: 69.5% 0 Gate: R Q: 0.00% Q2: 74.05% FL CD45-FITC 0 Q3: 92.09% Q4: 0.30% FL CD44-FITC 0 Q3: 0.07% Q4: 30.7% FL CD05-FITC 0 Q3:.65% Q4: 24.30% 0 0 FL2 CD34-PE بنيادي مزانشيمي ژله وارتون بند ناف انساني FL2 CD73-PE FL2 CD90-PE تصوير شماره 2: درصد بيان نشانگرهاي سطحي CD44 CD45 CD73 CD90 CD05 و CD34 سلوله يا R منطقه Gating سلوله يا بنيادي را بر مبناي پراكنش سلولها از نظر اندازه سلولي FSC) يا (Forward scatter و نيز ميزان كمپلكسيتي SSC) يا (Side scatter آنها نشان ميدهد. IgG FITC و IgG-PE آنتيباديه يا ايزوتايپ كنترل كونژوگه شده به ترتيب با FITC و PE ميباشند. Q و Q4 درصد بيان هر يك از نشانگرهاي سطحي را به تنهايي و Q2 درصد بيان توأم اين نشانگرها را نشان ميدهند. Q3 نشان دهنده درصد عدم بيان نشانگرها در سلوله يا بنيادي است. جدول شماره 2: درصد بيان انواع نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون بند ناف انساني به صورت منفرد و توأم نوع نشانگر سطحي سلولهاي بيان كننده (درصد) تصوير شماره 3: بيان ژنهاي مربوط به نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون CD05 و CD90 و عدم بيان ژن نشانگر سطحي سلولهاي بنيادي خونساز CD34 در پاساژهاي صفر (P0) دو (P2) و چهار (P4). GAPDH dehydrogenase) (Glyceraldehyde 3-phosphate ژن خانگي ميباشد. 69 /22 99 /86 69 /5 98 /35 74 /05 74 /05 0 /47 7 /60 0 /7 CD 44 CD 73 CD 44 / CD 73 CD 90 CD 05 CD 05 /CD 90 CD 34 CD45 CD 45 / CD 34 بحث در زمينه بررسي مورفولوژيكي روشهاي جداسازي ويژگيهاي فنوتيپي و قدرت تمايزي سلولهاي بنيادي مزانشيمي از ژله وارتون مطالعات زيادي صورت گرفته است (7). در تحقيق حاضر پس از جداسازي اين سلولها از بافت ماتريكس بند ناف به روش كشت قطعهاي نشانگرهاي سطحي و ژنهاي وابسته به آنها مورد بررسي قرار گرفتند تا هويت بنيادي و مزانشيمي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون در شرايط آزمايشگاهي به اثبات برسد. مطالعات نشان ميدهند كه در مقايسه با روش استخراج 7

8 پژوهشي هما محسني كوچصفهاني و همكاران آنزيمي هر چند مدت زمان خروج سلولهاي بنيادي از كشت اوليه بافتي در روش كشت قطعهاي بيشتر است اما ميزان آسيب سلوليكم است و سلولها توان حيات بيشتري دارند و حتي از سرعت تكثير و فعاليت زيستي بالايي نيز برخوردارند (22 3). 8 نتايج تحقيق حاضر نيز حاكي از آن بود كه با استفاده از روش كشت قطعهاي طي 5-7 روز اول سلولها از قطعات بافتي جدا شدند و پس از مهاجرت به كف فلاسك چسبيدند به طوري كه در روز هجدهم در اطراف هر قطعه بافتي تراكم سلولي فراواني ايجاد شد كه اين سلولها پس از جداسازي نيز از قدرت تكثير بالايي برخوردار بودند و ظرف مدت 5-7 روز به تراكم سلولي درصد براي پاساژ دادن رسيدند. مطالعات حاكي از وجود دو نوع مورفولوژي سلولي متفاوت در سلولهاي بنيادي بند ناف در مراحل اوليه چسبيدن به كف ظروف كشت است كه شامل يك جمعيت از سلولهاي كوچك مسطح با مورفولوژي شبه اندوتليالي و نيز جمعيتي از سلولهاي شبه فيبروبلاستي دوك مانند ميباشند. اين سلولها بيان متفاوتي از ژنهاي مربوط به رشتههاي بينابيني را نشان ميدهند (24 23). در مطالعه حاضر نيز در كشتهاي اوليه دو نوع مورفولوژي پيشگفته از سلولهاي بنيادي مشاهده شد. به دنبال افزايش تعداد پاساژ جمعيت غالب سلولي از نوع سلولهايي با مورفولوژي شبه فيبروبلاستي بود. شايد اين امر به دليل استفاده از محيط حداقلي براي رشد سلولهاي بنيادي مزانشيمي بند ناف و فقدان عوامل رشد سلولهاي اندوتليالي در محيط كشت باشد (24 23). سلولهاي ردههاي مختلف مجموعه پيچيدهاي از گليكوپروتي ينهاي غشايي را بيان ميكنند كه از آنها ميتوان در جهت شناسايي و تعيين هويت سلولي استفاده نمود. اين نشانگرهاي سطحي در ايجاد تعاملات بين سلولها و نيز اتصال سلولها به ماتريكس خارج سلولي و حتي در تعيين سرنوشت تكويني سلولها نقش دارند. براي نمونه خصوصيت مولكولي سلولهاي بنيادي مزانشيمي به واسطه حضور نشانگرهاي سطحي CD05 CD90 CD44 و نيز عدم بيان نشانگرهاي CD34 و CD45 صورت ميگيرد 2).(7 6 7 كشت سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون در شرايط آزمايشگاهي ميتواند مدل سلولي مناسبي در جهت كشف بيولوژي عملكردي و رفتار تمايزي اين سلولها در بدن و نيز بهرهوري مناسب از آنها براي مقاصد درماني باشد از اين رو علاوه بر مطالعات مورفولوژيكي بررسي الگوي بياني نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي و ژنهاي وابسته به آنها در اين سلولها ضروري است. مطالعات انجام شده توسط محققين نشان ميدهد كه سلولهاي بنيادي استخراج شده از ژله وارتون همانند ساير سلولهاي بنيادي مزانشيمي بيان شديدي از نشانگرهاي سطحي CD90 CD44 و CD05 را عرضه ميكنند در حالي كه نشانگرهاي سطحي سلولهاي خونساز CD34 و CD45 در اين سلولها بيان نميشوند 7).(3 نتايج حاصل از مطالعات حاضر كه با روشهاي فلوسايتومتري و RT-PCR صورت گرفت نيز با گزارشهاي ارايه شده مطابقت دارد. نتايج فلوسايتومتري تحقيق حاضر نشان داد كه بيش از 98 درصد سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون نشانگرهاي سطحي CD73 و CD90 و حدود 70 درصد سلولها نشانگرهاي سطحي CD44 و CD05 را بيان كردند. در مقابل ميزان بيان نشانگرهاي CD34 و CD45 در سلولهاي بنيادي جداسازي شده كمتر از 8 درصد بود. نتايج به دست آمده در تحقيق حاضر با مطالعه صالحينژاد و همكاران همخواني داشت. آنها نيز بيان نشانگرهاي سطحي CD90 CD73 CD44 و CD05 را در سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون به ترتيب 55/8 74/5 93/0 و 83/0 درصد گزارش كردند در حالي كه ميزان بيان CD34 و CD45 به ترتيب 5/4 و 0/4 درصد بود (3). محققين مختلفي از جمله Ishige و همكاران (8) Fong و همكاران (25) و (26) Quintiliano سلولهاي بنيادي ژله وارتون انساني را از نظر بيان نشانگرهاي سطحي مختلفي بررسي كرده بودند. يافتههاي آنها نيز تا ييد ميكند كه اين سلولها CD90 CD73 CD44 CD29 CD3 - - CD34 CD3 - CD05 و CD45 هستند 8).(

9 نشانگرهاي سطحي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون درصد حضور كم نشانگرهاي CD34 و CD45 در كشت سلولهاي بنيادي ژله وارتون باعث اطمينان از عدم آلودگي آنها با سلولهاي خونساز ميباشد چرا كه اين آنتيژنها با حضور در سطح سلولهاي بنيادي خونساز در چسبندگي اين سلولها نقش دارند و به عنوان تنظيم كننده رشد و تمايز سلولي عمل ميكنند (9). مطالعات نشان ميدهد كه با افزايش پاساژ و تعويض مداوم محيط كشت همين مقدار كم سلولهاي CD34 و CD45 مثبت نيز كاهش مييابد (27). نتايج RT-PCR مطالعه حاضر نيز نشان داد كه در سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون نشانگرهاي CD90 و CD05 توانستند در طي پاساژهاي مختلف با شدت مشابهي بيان شوند در حالي كه هيچ گونه بياني از نشانگر سطحي سلولهاي خونساز (CD34) حتي در پاساژهاي پايينتر مانند پاساژ سلولي صفر و دو مشاهده نشد. اين عدم تغيير بيان نشانگرها در پاساژهاي مختلف ميتواند گوياي اين واقعيت باشد كه سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون با افزايش تعداد پاساژ وارد مرحله تمايز نميشوند و همچنان حالت بنيادي خود را حفظ ميكنند. در مجموع ميتوان اذعان داشت كه ژله وارتون بند ناف يك منبع غني و در دسترس از سلولهاي بنيادي است كه با استفاده از تكنيك كم هزينه كشت قطعهاي ژله وارتون به دست ميآيند. ارزيابي مولكولي سلولهاي بنيادي مزانشيمي ژله وارتون نشان ميدهد كه اين سلولها قادر به بيان شديدي از نشانگرهاي سطحي CD90 CD73 CD44 و CD05 در شرايط كشت آزمايشگاهي هستند و در عين حال بيان نشانگرهاي سلولهاي بنيادي خونسازCD34 و CD45 در درصد بسيار كمي از آنها مشاهده ميشود. سپاسگزاري نويسندگان مقاله مراتب تشكر و قدرداني خود را از بيمارستان آرتاي اردبيل و همكاري صميمانه آقاي دكتر كمالالدين حميدي پزشكان و پرسنل محترم اتاق عمل اين بيمارستان كه در جمعآوري بند ناف نوزادان ما را ياري نمودند و نيز مساعدتهاي آقاي مهدي عدالتي فتحآبادي اعلام ميدارند. References. Fortier LA. Stem cells: classifications, controversies, and clinical applications. Vet Surg 2005; 34(5): Bongso A, Richards M. History and perspective of stem cell research. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2004; 8(6): Salehinejad P, Alitheen NB, Ali AM, Omar AR, Mohit M, Janzamin E, et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton's jelly. In Vitro Cell Dev Biol Anim 202; 48(2): Li L, Xie T. Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol 2005; 2: Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 98; 78(2): O'Donoghue K, Fisk NM. Fetal stem cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2004; 8(6): Weiss ML, Troyer DL. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev 2006; 2(2): Ishige I, Nagamura-Inoue T, Honda MJ, Harnprasopwat R, Kido M, Sugimoto M, et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. Int J Hematol 2009; 90(2): Qiao C, Xu W, Zhu W, Hu J, Qian H, Yin Q, et al. Human mesenchymal stem cells isolated from the umbilical cord. Cell Biol Int 2008; 32(): Jeschke MG, Gauglitz GG, Phan TT, Herndon DN, Kita K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal 20; 4: Karahuseyinoglu S, Cinar O, Kilic E, Kara F, Akay GG, Demiralp DO, et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys. Stem Cells 2007; 25(2): La RG, Anzalone R, Corrao S, Magno F, Loria T, Lo IM, et al. Isolation and characterization of Oct- 4/HLA-G mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol 2009; 3(2): Mitchell KE, Weiss ML, Mitchell BM, Martin P, 9

10 پژوهشي هما محسني كوچصفهاني و همكاران Davis D, Morales L, et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells 2003; 2(): Yoon HH, Jung BY, Seo YK, Song KY, Park JK. In vitro hepatic differentiation of umbilical cordderived mesenchymal stem cell. Process Biochemistry 200; 45(2): Semenov OV, Breymann C. Mesenchymal Stem Cells Derived from Wharton's Jelly and their Potential for Cardio-Vascular Tissue Engineering. The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal, 20; 4: Taghizadeh RR, Cetrulo KJ, Cetrulo CL. Wharton's Jelly stem cells: future clinical applications. Placenta 20; 32(Suppl 4): S3-S Zola H, Swart B, Banham A, Barry S, Beare A, Bensussan A, et al. CD molecules human cell differentiation molecules. J Immunol Methods 2007; 39(-2): Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 999; 284(54): Boxall SA, Jones E. Markers for Characterization of Bone Marrow Multipotential Stromal Cells. Stem Cells International 202; 202: Zahri S, Maleki M, Hamidi K, Khatami SM. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord Wharton's jelly Stem Cells. J Ardabil Univ Med Sci 203; 3(47): (Persian). 2. Ebrahimi Vosta Kalaee S, Shirmohamadi M, Bakhtiari M. Administration of Human Umbilical Cord Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells on Rat Sciatic Nerve Regeneration. J Babol Univ Med Sci 203; 5(2): (Persian). 22. Walker KE. Effects of isolation methods on proliferation and GD2 expression by porcine umbilical cords stem cells [Thesis]. Manhattan, KS: Kansas State University; Kestendjieva S, Kyurkchiev D, Tsvetkova G, Mehandjiev T, Dimitrov A, Nikolov A, et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord. Cell Biol Int 2008; 32(7): Marzban M, Bakhtiary M, Mehdizadeh M, Taghi Joghataei M, Khoei S, Pirhajati Mahabadi V, et al. Intravenous injection of human umbilical cord matrix stem cell (Wharton Jelly Stem Cell) provides functional recovery in a rat model of traumatic brain injury. Cell J Yakhteh 200; 2(): (Persian). 25. Fong CY, Richards M, Manasi N, Biswas A, Bongso A. Comparative growth behaviour and characterization of stem cells from human Wharton's jelly. Reprod Biomed Online 2007; 5(6): Quintiliano K. Comparing two human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation protocols [Thesis]. Porto Alegre, Brazil: Federal University of Rio Grande do Sul; Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells 2007; 25():