Στοιχεία Mοριακής ιαγνωστικής των Γενετικών Νόσων: Τέσσερα Παραδείγµατα

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Στοιχεία Mοριακής ιαγνωστικής των Γενετικών Νόσων: Τέσσερα Παραδείγµατα"

Άδωνις Δυοβουνιώτης
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Στοιχεία Mοριακής ιαγνωστικής των Γενετικών Νόσων: Τέσσερα Παραδείγµατα Εύθραυστο Χ, Κυστική Ίνωση, Μυΐκη υστροφία Duchenne, Οικογενής Καρκίνος Μαστού-Ωοθηκών Λάµπρος Μαυρόγιαννης

2 Οπως η Συµβατική Εργαστηριακή ιαγνωστική; Ναι, αλλά Υπάρχουν ιαφορές Ανάλυση DNA για: Επιβεβαίωση/αποσαφήνιση/απόρριψη κλινικής διάγνωσης Εκτίµηση πιθανότητας εµφάνισης διαταραχής Εκτίµηση αναπαραγωγικού κινδύνου Κάποιες διαφορές Τυχόν αντίκτυπος πέραν του συγκεκριµένου ατόµου υνατότητα προσυµπτωµατικού ελέγχου Τρέχουσα θέση στην Ιατρική Ιστορία όχι µεγαλύτερη των ετών Αυξανόµενος αυτοµατισµός Πρακτικά, καλύπτει κλασικές Μεντελικές νόσους

αναπαραγωγικού κινδύνου Κάποιες διαφορές Τυχόν αντίκτυπος πέραν του συγκεκριµένου ατόµου υνατότητα

3 Παροχή Υπηρεσιών: Επαγγελµατικό Πλέγµα Μοντέλο διαµεσολάβησης Γενετικός Σύµβουλος (Νοσηλευτής) Άλλα ιαγνωστικά Εργαστήρια Άτοµο - Οικογένεια Κλινικός Γενετιστής (Ιατρός) Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής Άλλες Ιατρικές Ειδικότητες Εργαστήριο Κυτταρογενετικής

Άτοµο - Οικογένεια Κλινικός Γενετιστής (Ιατρός) Εργαστήριο

4 Κύριες Επαγγελµατικές Συνιστώσες Πολύπλευροι ρόλοι όχι αποκλειστικά επιστηµονικοί Επιστηµονικές πτυχές Κλινικές πτυχές Τεχνικές πτυχές ιαχειριστικές πτυχές

5 Κλινικές Πτυχές: Σενάρια Εκκίνησης ιαγνωστικά τέστ παρουσία συµπτωµάτων Επιβεβαίωση σαφούς κλινικής διάγνωσης ιερεύνηση ορισµένων κλινικών υποψιών ιαφοροδιαγνωστικός αποκλεισµός Προγνωστικά τέστ απουσία συµπτωµάτων Εξακρίβωση κατάστασης πιθανού φορέα Προσυµπτωµατικός έλεγχος Προγεννητικά και περιγεννητικά τέστ Συµβατική προγεννητική διάγνωση Προεµφυτευτική διάγνωση Έλεγχος νεογνών

Προγνωστικά τέστ απουσία συµπτωµάτων Εξακρίβωση κατάστασης πιθανού φορέα Προσυµπτωµατικός

6 Κλινικές Πτυχές: Αποτελέσµατα Η εργαστηριακή αναφορά Το προϊόν του διαγνωστικού εργαστηρίου Κύριο µέσο επικοινωνίας µε τους χρήστες των υπηρεσιών Τυποποιηµένα υποδείγµατα για τα συνήθη κλινικά σενάρια Επαγγελµατική και νοµική ευθύνη

επικοινωνίας µε τους χρήστες των υπηρεσιών Τυποποιηµένα

7 Τεχνικές Πτυχές: Εργαστηριακά Πρωτόκολλα Επιχειρησιακές διαδικασίες Αποτύπωση γενικών και εξειδικευµένων µεθόδων Ανά νόσο/γονίδιο: θεµελειώδεις πληροφορίες, διαγνωστική στρατηγική, τεχνική τεκµηρίωση, ερµηνευτικές κατευθύνσεις Πληρότητα, σαφήνεια αλλά και ευελιξία δυναµικό κείµενο Πλατφόρµα µεταβίβασης επεξεργασµένης γνώσης

διαγνωστική στρατηγική, τεχνική τεκµηρίωση, ερµηνευτικές κατευθύνσεις Πληρότητα,

8 Καταγραφή εργασίας Συµπλήρωση φύλλων εργασίας Τεχνικές Πτυχές: Ιχνηλασιµότητα Ανά τέστ: δείγµατα, παράµετροι και συνθήκες, αντιδραστήρια, ηµεροµηνία, υπεύθυνος Τουλάχιστον δύο επίπεδα ελέγχου των αποτελεµάτων

παράµετροι και συνθήκες, αντιδραστήρια, ηµεροµηνία,

9 ιαχειριστικές Πτυχές: Πληροφοριακή Υποστήριξη Σχεσιακή βάση δεδοµένων Αποθήκευση, ανάκτηση και επεξεργασία δεδοµένων

10 ιαχειριστικές Πτυχές: Ποιότητα Υπηρεσιών ιαπίστευση εργαστηρίου Από ανεξάρτητο φορέα Επιθεώρηση διαδικασιών, δειγµατοληπτικοί αναδροµικοί έλεγχοι, συµµετοχή σε εξωτερικό πρόγραµµα ελέγχου ποιότητας, ιστορικό Επαγγελµατική ρύθµιση Μεταπτυχιακό επίπεδο Προγράµµατα επαγγελµατικής εκπαίδευσης Άδεια ασκήσεως επαγγέλµατος

σε εξωτερικό πρόγραµµα ελέγχου ποιότητας, ιστορικό Επαγγελµατική ρύθµιση

11 Άµεση ανάλυση ύο Ριζικά ιαφορετικές Αναλυτικές Προσεγγίσεις Αντικείµενο: η αιτιακή αλλαγή στο DNA Οτρόπος: έλεγχος συγκεκριµένου γονιδίου(ων) για εκ των προτέρων άγνωστες ή για ήδη ταυτοποιηµένες µεταλλαγές Έµµεση ανάλυση Αντικείµενο: η γενωµική περιοχή πέριξ της µεταλλαγής Οτρόπος: µελέτη του προτύπου κληρονόµησης συνδεδεµένων πολυµορφικών δεικτών

ή για ήδη ταυτοποιηµένες µεταλλαγές Έµµεση ανάλυση Αντικείµενο: η γενωµική περιοχή

12 Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Τεχνικές σάρωσης ιερεύνηση γονιδιών για κάθε (ορατό!) µεταλλακτικό ενδεχόµενο Ανοικτού τύπου ερώτηµα αρνητικό αποτέλεσµα δεν επιτρέπει αποκλεισµό Τεχνικές ειδικής ανίχνευσης Ανάλυση για συγκεκριµένο µεταλλακτικό γεγονός Κλειστού τύπου ερώτηµα επιδέχεται διαζευκτικής απάντησης

) µεταλλακτικό ενδεχόµενο Ανοικτού τύπου ερώτηµα αρνητικό αποτέλεσµα δεν

13 Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Τεχνικές σάρωσης Προσδιορισµός αλληλουχίας (Sequencing) Μεταφορά και υβριδισµός κατά Southern (Southern blot)

14 Τεχνικές σάρωσης Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Αποδιατακτική υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (Denaturing high performance liquid chromatography; dhplc)

15 Τεχνικές σάρωσης Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Ανάλυση διαµορφωτικών πολυµορφισµών µονόκλωνου DNA (Single strand conformational polymorphism analysis; SSCP) Τέστ πρωτεΐνικής περιστολής (Protein truncation test; PTT)

strand conformational polymorphism analysis; SSCP)

16 Τεχνικές σάρωσης Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Ανάλυση γονιδιακής/εξονιακής δόσης: Πολυπλεγµένη συνδεο-εξαρτώµενη ενίσχυση ανιχνευτών (Multiplex ligation-dependent probe amplification; MLPA) Ανάλυση κατάστασης µεθυλίωσης

συνδεο-εξαρτώµενη ενίσχυση ανιχνευτών (Multiplex

17 Τεχνικές ειδικής ανίχνευσης Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Περιοριστική πέψη δηµιουργίαήαπώλειαθέσης αναγνώρισης PCR µε αλληλο-ειδικούς εκκινητές (Amplification refractory mutation system; ARMS)

18 Τεχνικές ειδικής ανίχνευσης Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Αλληλο-ειδικός ολιγονουκλεοτιδικός υβριδισµός (Allele specific oligonucleotides; ASOs) Αλληλο-ειδική ολιγονουκλεοτιδική σύνδεση (Oligonucleotide ligation assay; OLA)

specific oligonucleotides; ASOs) Αλληλο-ειδική

19 Τεχνικές ειδικής ανίχνευσης Άµεση Ανάλυση: τα Εργαλεία Έλεγχος αλληλικού µεγέθους

20 Ταξινοµήσεις των Γενετικών Νόσων Πολλαπλά και επικαλυπτόµενα σχήµατα διαφορετικές οπτικές γωνίες Κατά βασική παθοφυσιολογία Κατά (Μεντελικό) τρόπο κληρονόµησης Κατά όργανο/σύστηµα (και συµβατική ιατρική ειδικότητα αναφοράς) Κατά µεταλλακτικό φάσµα και συχνότητα παραποµπών

(Μεντελικό) τρόπο κληρονόµησης Κατά όργανο/σύστηµα (και συµβατική

21 Περιγραφικά στοιχεία Σύνδροµο ΕύθραυστουΧ Σύνδροµο διανοητικής καθυστέρησης Συνδεδεµένο µε τοχ, αλλά µε άτυποπρότυπο κληρονόµησης Γενετική Όχι σπάνιο Απώλεια λειτουργίας του γονιδίου FMR1 Παθοφυσιολογία Το προϊόν του FMR1 είναι πρωτεΐνη πρόσδεσης RNA και ρυθµιστής της µετάφρασης ρόλος στην πλαστικότητα των συνάψεων

22 Το γονίδιο FMR1 Σύνδροµο ΕύθραυστουΧ

23 Φάσµα µεταλλαγών Σύνδροµο ΕύθραυστουΧ Συντριπτική πλειοψηφία: τρινουκλεοτιδική επέκταση εντός της 5' µη-µεταφραζόµενης περιοχής, συνοδευόµενη από υπερµεθυλίωση Πρόδροµη κατάσταση: προ-µεταλλαγή gagcccgcgg ggggagggaa cagcgttgat cacgtgacgt ggtttcagtg tttacacccg cagcgggccg ggggttcggc ctcagtcagg cgctcagctc cgtttcggtt tcacttccgg tggagggccg cctctgagcg ggcggcgggc cgacggcgag cgcgggcggc ggcggtgacg gaggcgccgc tgccaggggg cgtgcggcag cgcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggaggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggctgggcct cgagcgcccg cagcccacct ctcgggggcg ggctcccggc gctagcaggg ctgaagagaa gatggaggag ctggtggtgg aagtgcgggg ctccaatggc gctttctaca aggtacttgg ctctagggca ggccccatct tcgcccttcc ttccctccct tttcttcttg gtgtcggcgg gaggcaggcc cggggccctc Σπάνια ελλείµατα και σπανιότερες σηµειακές µεταλλαγές Συχνότητα παραποµπών υσανάλογα υψηλή και συχνά µε ασαφείς, µηειδικές κλινικές ενδείξεις Χαµηλή ποσοστό ανίχνευσης θετικών

24 Σύνδροµο ΕύθραυστουΧ Εργαστηριακή στρατηγική Έλεγχος αλληλικού µεγέθους (PCR) Έλεγχος µεγέθους και µεθυλίωσης (Southern blot) EcoRI Probe CGG BstZI* 2.8kb EcoRI 5.2kb

25 Περιγραφικά στοιχεία Γενετική Κυστική Ίνωση Γενικευµένη δυσλειτουργία επιθηλίων πνεύµονες, πάγκρεας, αναπαραγωγικό Κλασική αυτοσωµατική υπολειπόµενη νόσος Κοινή σε Καυκάσιους πληθυσµούς υψηλή συχνότητα φορέων Απώλεια λειτουργίας του γονιδίου CFTR Παθοφυσιολογία Το προϊόν του CFTR είναι µεµβρανικός µεταφορέας Cl - βλάβη στην µεµβρανική διαπερατότητα

26 Το γονίδιο CFTR Κυστική Ίνωση

27 Φάσµα µεταλλαγών Κυστική Ίνωση Κυριαρχία της µεταλλαγής F508del (Καυκάσοι) Και ορισµένες άλλες σχετικά µη-σπάνιες Συχνότητα παραποµπών Υψηλή, από διάφορες κλινικές πηγές και για ποικιλία λόγων Μέσο ποσοστό ανίχνευσης θετικών και φορέων

28 Εργαστηριακή στρατηγική Κυστική Ίνωση Ταυτόχρονος έλεγχος για ένα πάνελ µεταλλαγών, συµπεριλαµβανοµένης της F508del ιάφορα συµπληρωµατικά τέστ Πλήρης σάρωση κωδικής περιοχής R117H 621+1G->T 1148T 711+1G->T 1078delT R334W R347H R347P A455E I507 F508 V520F G->A G542X S549R S549N G551D R553X R553T 21833AA->G 2184delA G->A G->A G->A R1162X 3659delC kb C->T 3876delA 3905InsT W1282T N1303K Exon3 Exon4 Exon5/ Intron5 Exon7 Exon9 Exon10 Intron8 Exon11 Exon11/ Intron12 Exon13Exon14/ Intron14 Exon16/ Intron16 Exon19 Exon20 Exon21 5/7/9 T SNP CBAVD-Reflex I506V SNP I507V SNP F508C SNP Mutation verification

29 OLA Κυστική Ίνωση Mutant Normal A G C Common Normal DNA Target G Ligation Normal-OLA Product Normal Mutant G A T Common Mutant DNA Target A Ligation Mutant-OLA Product Homozygous Normal Heterozygous Homozygous Mutant

30 Κυστική Ίνωση Εργαστηριακή στρατηγική Έλεγχος για το πάνελ µεταλλαγών (OLA) Εστίαση στη µεταλλαγή F508del (απλό PCR)?

31 Περιγραφικά στοιχεία Γενετική Μυΐκη υστροφία Duchenne/Becker Προϊούσα µυϊκή αδυναµία, απώλεια µυϊκής µάζας θανατηφόρος (Duchenne) ή ηπιότερος (Becker) Συνδεδεµένο µε τοχ, ορισµένοι φορείς έχουν συµπτώµατα Σχετικά κοινή Απώλεια λειτουργίας του γονιδίου DMD πλήρης (Duchenne) ή µερική (Becker) Παθοφυσιολογία Το προϊόν του DMD είναι δοµική πρωτεΐνη απαραίτητη για την ακεραιότητα της µεµβράνης του µυϊκού κυττάρου

32 Το γονίδιο DMD Μυΐκη υστροφία Duchenne/Becker

33 Φάσµα µεταλλαγών Μυΐκη υστροφία Duchenne/Becker Ελλείµατα (>1 εξόνια): ~60% ιπλασιασµοί (>1 εξόνια): ~7% Σηµειακές µεταλλαγές: ~33% Ισχυρή συσχέτιση γονοτύπου-φαινοτύπου Συχνότητα παραποµπών Σηµαντική αποτελεσµατικό κλινικό φιλτράρισµα Σηµαντικό ποσοστό ανίχνευσης θετικών και φορέων

34 Μυΐκη υστροφία Duchenne/Becker Εργαστηριακή στρατηγική Πλήρης ανάλυση εξονιακής δόσης (MLPA) Έµµεση ανάλυση απλοτύπων µεπεριορισµούς Σάρωση για σηµειακές µεταλλαγές δυσχερής...

35 MLPA Μυΐκη υστροφία Duchenne/Becker

36 Μυΐκη υστροφία Duchenne/Becker Εργαστηριακή στρατηγική Πλήρης ανάλυση εξονιακής δόσης (MLPA)??

37 Οικογενής Καρκίνος Μαστού-Ωοθηκών Περιγραφικά στοιχεία Γενετική Κλάσµα της συνολικής συχνότητας µικρή πρόοδος στην εξακρίβωση µεταλλαγών σε σποραδικές περιπτώσεις Αυτοσωµατική επικρατής µε ατελές πρότυπο Σχετικά κοινή Απώλεια λειτουργίας των γονιδίων BRCA1 ή BRCA2 Παθοφυσιολογία Το προϊόντα των BRCA1 και BRCA2 είναι πυρηνικές πρωτεΐνες µε πολλαπλούς ρόλος

38 Το γονίδιο BRCA1 Οικογενής Καρκίνος Μαστού-Ωοθηκών

39 Φάσµα µεταλλαγών Οικογενής Καρκίνος Μαστού-Ωοθηκών Ευρύτατο: µεταλλαγές που διαταρράσουν τις κωδικές περιοχές, ελλείµατα, υποκταστάσεις Συχνότητα παραποµπών Ποικίλει προαπαιτεί λεπτοµερή κλινική αξιολόγηση Μέσο ποσοστό ανίχνευσης θετικών

40 Οικογενής Καρκίνος Μαστού-Ωοθηκών Εργαστηριακή στρατηγική Έλεγχος σχετικά κοινών µεταλλαγών στον τοπικό πληθυσµό Έλεγχος ενός µεγάλου εξονίου για µεταλλαγές που διαταρράσουν την κωδική περιοχή (PTT) Έλεγχος για ελλείµµατα Πλήρης σάρωση

41 Οικογενής Καρκίνος Μαστού-Ωοθηκών Εργαστηριακή στρατηγική

Σχετικά έγγραφα

Προγεννητικός Μοριακός Καρυότυπος. Η τεχνολογία αιχμής στη διάθεσή σας για πιο υγιή μωρά

Προγεννητικός Μοριακός Καρυότυπος Η τεχνολογία αιχμής στη διάθεσή σας για πιο υγιή μωρά Η νέα εποχή στον Προγεννητικό Έλεγχο: Μοριακός Καρυότυπος - array CGH - Συγκριτικός γενωμικός υβριδισμός με μικροσυστοιχίες