ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ Διευθυντής Τμήματος: Μιχαήλ Κουτσιλιέρης, Καθηγητής ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝΤΑΙ ΑΠΟ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΜΕΣΟ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΝΕΥΡΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΕΠΑΓΟΜΕΝΟ ΑΠΟ ΓΛΟΥΤΑΜΙΝΙΚΟ ΟΞΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΘΑΝΑΤΟ» ΕΙΡΗΝΗ ΠΑΠΑΖΙΑΝ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΘΗΝΑ 2013

2 Ευχαριστίες Καταρχήν θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την δρ. Lesley Probert, Ερευνήτρια Α και επικεφαλής του τμήματος Μοριακής Γενετικής στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, η οποία ήταν η υπεύθυνη καθηγήτρια μου σε αυτή τη διπλωματική εργασία. Της οφείλω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ για την πολύτιμη ευκαιρία που μου έδωσε αναθέτοντάς μου αυτό το θέμα, την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου, τη σωστή και έμπειρη καθοδήγησή της καθώς και για το χρόνο που μου αφιέρωσε. Θα πρέπει παράλληλα να ευχαριστήσω τον δρ. Μιχαήλ Κουτσιλιέρη, Καθηγητή της Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών και επικεφαλή του μεταπτυχιακού Μοριακής και Εφαρμοσμένης Φυσιολογίας, ο οποίος με έφερε άμεσα σε επαφή με την δρ. Probert και μου έδωσε την ευκαιρία να πραγματοποιήσω τη διπλωματική μου εργασία στον τομέα που με ενδιέφερε πιο πολύ. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στην δρ. Μαρία Ευαγγελίδου, μεταδιδακτορική ερευνήτρια στο εργαστήριο της δρ.probert, η οποία ήταν επιβλέπουσα της διπλωματικής μου εργασίας και με μύησε στο κόσμο του πειράματος και της έρευνας κάνοντας τις πειραματικές διαδικασίες να φαντάζουν ευκολότερες και βοηθώντας με ουσιαστικά στη διεκπεραίωση αυτού του στόχου. Την ευχαριστώ επίσης για την ψυχολογική υποστήριξη και τις ατελείωτες στιγμές γέλιου που με βοηθούσαν να εφοδιαστώ από την αρχή με κουράγιο και υπομονή. Θα ήταν παράλειψή μου να μην ευχαριστήσω τη Μαρία Καραμίτα και Βάσω Κυραργύρη, υποψήφιοι διδάκτορες στο εργαστήριο της δρ.probert, οι οποίες ήταν δίπλα μου από την αρχή της διπλωματικής μου εργασίας σε όποια τυχόν απορία η δυσκολία είχα και συντέλεσαν σε μεγάλο βαθμό με τη σειρά τους στην ολοκλήρωση αυτού του έργου. Τις ευχαριστώ επίσης για όλη την ψυχολογική υποστήριξη, τις ώρες ξεκούρασης, συζήτησης αλλά και διασκέδασης που ήταν μια ευχάριστη απόδραση από τη δύσκολη καθημερινότητα των πειραμάτων. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Γιάννη Γρίβα και τη Νάντια Καβροχωριανού, υποψήφιοι διδάκτορες στην ομάδα της δρ. Σύλβα Χαραλάμπους, Ερευνήτριας Β και επικεφαλής της μονάδας Διαγονιδιακής Τεχνολογίας, οι οποίοι μου έμαθαν τεχνικές σχετικά με το χειρισμό πειραματόζωων αλλά και για τα ευχάριστα διαλείμματα γέλιου και χαλάρωσης. Τέλος, ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ ανήκει δικαιωματικά στην οικογένεια μου που πιστεύει πάντα σε μένα, στέκεται δίπλα μου και με στηρίζει με κάθε τρόπο.

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο ΜΥΕΛΟΣ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ Αιμοποίηση Κύτταρα του στρώματος του μυελού των οστών ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΑ ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ Ιστορία και ορισμός των ΜΒ Χαρακτηριστικά μόρια επιφάνειας των ΜΒ Ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των ΜΒ Τα ΜΒ στην επανόρθωση κατεστραμμένων ιστών ΜΒ και νευροπροστασία Επαγωγή της νευρογένεσης και ενεργοποίηση της αστρογλοίας Νευρικές συνάψεις Αντι-αποπτωτικές ιδιότητες Ανοσορυθμιστικές ιδιότητες Επαγωγή της αγγειογένεσης Φαινόμενα κυττάρων του δέκτη που επάγονται από τη μεταμόσχευση ΜΒ ΜΒ και καρκίνος Τα ΜΒ σε προκλινικές και κλινικές δοκιμές ΜΒ σε πειραματικά μοντέλα εγκεφαλικού ΜΒ στη σκλήρυνση κατά πλάκας Η ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΤΟ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Φλοιός του εγκεφάλου ΤΟ ΓΛΟΥΤΑΜΙΝΙΚΟ ΟΞΥ ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΟΥ Οι NMDA υποδοχείς AMPA και καϊνικοί ιονοτρόποι υποδοχείς...36 ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 62

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MB) είναι ένας πολυδύναμος υποπληθυσμός κυττάρων που μπορεί να απομονωθεί από διαφόρους ιστούς ενήλικου ατόμου και αποτελεί μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών, όπως σκλήρυνση κατά πλάκας και τραύμα στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ). Η θεραπευτική τους δράση παρόλο που είναι ελάχιστα κατανοητή αποδίδεται σε μηχανισμούς νευροπροστασίας και επιδιόρθωσης του ΚΝΣ, όπως επίσης και στη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος. Στη συγκεκριμένη μελέτη προκειμένου να διερευνηθεί ο τρόπος νευροπροστασίας των ΜΒ ερευνήσαμε τις επιδράσεις που έχει η παραμονή του θρεπτικού μέσου των ΜΒ για μεγάλο χρονικό διάστημα σε καλλιέργεια νευρώνων φλοιού ποντικού. Αρχικά, η νευροπροστασία που παρείχε το θρεπτικό μέσο ΜΒ στους νευρώνες συνδέθηκε με μειωμένη εισροή ιόντων ασβεστίου που επάγεται από το γλουταμινικό οξύ. Με τη βοήθεια ανοσοκυτταροχημείας παρατηρήσαμε την επίδρασή του θρεπτικού μέσου ΜΒ στους διαφόρους κυτταρικούς τύπους που συνυπάρχουν στην καλλιέργεια των νευρώνων, συμπεριλαμβανομένων των αστροκυττάρων και των πρόδρομων ολιγοδενδροκυττάρων. Τα αποτελέσματά μας φανερώνουν ότι τα ΜΒ δεν επηρέασαν τον αριθμό ή τη μορφολογία των νευρώνων. Συντέλεσαν, όμως, στη διατήρηση των επιπέδων των αστροκυττάρων, αλλά κυρίως των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων στην καλλιέργεια φαινόμενο το οποίο συνοδεύτηκε από μια τάση αύξησης του οlig2 που παρατηρήθηκε με RT-PCR ανάλυση. Επιπλέον, η παραμονή του θρεπτικού μέσου ΜΒ για τουλάχιστον 5 ημέρες στην καλλιέργεια νευρώνων συντέλεσε στη μείωση της διαμεμβρανικής έκφρασης των υπομονάδων GluR1 των AMPA γλουταμινικών υποδοχέων, ενώ τα ολικά επίπεδα των GluR1 στους νευρώνες παρέμειναν σταθερά. Τα αποτελέσματά μας αυτά δείχνουν ότι τα ΜΒ συμβάλλουν στη νευροπροστασία επηρεάζοντας τους γλουταμινικούς υποδοχείς και την επακόλουθη εισροή ιόντων, αλλά ρυθμίζουν επίσης το ποσοστό των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων και αστροκυττάρων στην νευρωνική καλλιέργεια. 1

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Ο ΜΥΕΛΟΣ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ Ο μυελός των οστών θεωρείται ανήκει στα πρωτογενή λεμφικά όργανα και αποτελεί το κύριο αιμοποιητικό όργανο, συνιστώντας περίπου το 4% της συνολικής μάζας του σώματος ενός ενήλικου ατόμου. Οι δύο τύποι που έχουν περιγραφεί είναι ο ερυθρός μυελός ο οποίος είναι αιμοποιητικά ενεργός και ο κίτρινος μυελός που αποτελεί τον αιμοποιητικά ανενεργό λιπώδη μυελό. Και οι δύο τύποι μυελού περιέχουν άφθονα αγγεία αίματος και τριχοειδή. Το μη αιμοποιητικό μικροπεριβάλλον παρέχει στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (Hematopoietic Stem Cells-HSCs) και στα αιμοποιητικά πρόδρομα κύτταρα ρυθμιστικά σήματα απαραίτητα για τη διατήρηση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των έτσι ώστε να παράγεται ο κατάλληλος αριθμός ώριμων αιμοκυττάρων κατά τη διάρκεια της ζωής [1]. Κατά τη γέννηση όλος ο μυελός είναι αιμοποιητικά ενεργός (κόκκινος) ενώ με την ηλικία όλο και περισσότερο τμήμα του μετατρέπεται σε ανενεργό (κίτρινο) έτσι ώστε στους ενηλίκους ο κόκκινος μυελός αποτελεί το 50% του μυελού. Ο αιμοποιητικός μυελός έχει τρείς βασικές λειτουργίες οι οποίες είναι: α) η αιμοποίηση, που περιλαμβάνει τη δημιουργία και απελευθέρωση κυττάρων του αίματος, όπως ερυθροκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, μονοκύτταρα, λεμφοκύτταρα και αιμοπετάλια, β) η φαγοκύτωση και αποικοδόμηση υλικού που βρίσκεται στην κυκλοφορία, όπως μικροοργανισμοί, μη φυσιολογικά ερυθροκύτταρα και λευκοκύτταρα, και γ) παραγωγή αντισωμάτων [2]. Ο μυελός των οστών περιέχει διάφορα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Περίπου 8-20% από τα μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού είναι λεμφοκύτταρα, με μια αναλογία των Τ και Β κυττάρων 5:1 και περίπου το 1% από τους μονοπύρηνους πληθυσμούς αντιπροσωπεύει τα πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα. Ο μυελός των οστών του ποντικιού περιέχει 1-5% CD3+ T λεμφοκύτταρα από τα οποία το 1,5% είναι CD4+ και το 2,0-3,5 CD8+ Τ λεμφοκύτταρα [3]. Επιπλέον, στο μυελό υπάρχουν CD11c+ δενδριτικά κύτταρα με ποσοστό 1-2% και 0,4-4% κύτταρα φυσικοί φονείς [4]. 2

6 1.1 Αιμοποίηση Το αιμοποιητικό σύστημα των υγειών ενηλίκων αποτελεί ένα σταθερό σύστημα ανανέωσης κυττάρων στο οποίο τα ώριμα ερυθροκύτταρα τα οποία χάνονται συνεχώς από την κυκλοφορία αντικαθιστούνται από την παραγωγή νέων κυττάρων αίματος με τον ίδιο ρυθμό. Αντίθετα, κατά την ανάπτυξη του εμβρύου και του παιδιού, ο ολικός αριθμός των αιμοποιητικών κυττάρων και των κυττάρων του αίματος αυξάνεται προοδευτικά με τον χρόνο. Τα νέα κύτταρα προέρχονται από ένα μικρό αριθμό αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων τα οποία έχουν την ιδιότητα να ωριμάζουν δημιουργώντας τον κάθε τύπο κυττάρου του αίματος αλλά και να δημιουργούν νέα βλαστοκύτταρα διατηρώντας τον αριθμό τους σταθερό. Τα αναπτυσσόμενα αιμοποιητικά κύτταρα παραμένουν σε αδρανή κατάσταση στον μυελό των οστών έως ότου δεχθούν το κατάλληλο ερέθισμα, διαφοροποιηθούν και απελευθερωθούν στο κολπώδες αγγειακό σύστημα. Τα σχεδόν ώριμα κύτταρα του αίματος εισέρχονται στην κυκλοφορία κυρίως μέσω των ενδοθηλιακών κυττάρων των αιμοφόρων αγγείων του μυελού[2]. Τα βλαστοκυττάρα και τα πρώιμα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα ρυθμίζονται από τη στενή σχέση που αναπτύσσουν με συγκεκριμένα κύτταρα του στρώματος και συστατικά του εξωκυττάριου υλικού και από την αλληλεπίδραση συγκεκριμένων υποδοχέων της επιφάνειάς τους με αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες. Οι τελευταίοι περιλαμβάνουν τον παράγοντα βλαστοκυττάρων (stem cell factor-steel factor), την ιντερλευκίνη-1 (IL-1) και την ιντερλευκίνη-6 (IL-6) για τα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα και τον παράγοντα βλαστοκυττάρων, την ιντερλευκίνη-3 (IL-3) και τον παράγοντα διέγερσης αποικίας κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-CSF) για τα πολυδύναμα μυελοειδή βλαστοκύτταρα. Οι αυξητικοί παράγοντες που επηρεάζουν τα προγονικά και πρόδρομα κύτταρα των λεμφοκυττάρων είναι οι παρακάτω: IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 και IL-11 για την Β-σειρά και IL-2, IL-3, IL-4 και IL-10 για την Τ-σειρά [2]. 1.2 Κύτταρα του στρώματος του μυελού των οστών Το στρώμα του μυελού των οστών αποτελεί το μικροπεριβάλλον των αιμοποιητικών κυττάρων και αποτελείται από πολλούς κυτταρικούς τύπους και 3

7 άφθονη εξωκυττάρια ουσία [5]. Έτσι το αιμοποιητικό σύστημα διατηρείται σε όλη τη διάρκεια ζωής του ατόμου. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών τόσο σε καλλιέργειες κυττάρων στρώματος από ποντίκι όσο και σε ανθρώπινες είναι η παρουσία επίπεδων γωνιωδών κυττάρων τα οποία έχουν οριστεί ως «κύτταρα του στρώματος του μυελού» (marrow stromal cells) και έχουν τον ακόλουθο φαινότυπο: τύπος κολλαγόνου IV(+), λαμινίνη(+), Stro-1(+) και CD45(-), Mac-1(-) και HLA-DR(-) [2]. Τα κύτταρα του στρώματος αποτελούν τον κυτταρικό πληθυσμό που στηρίζει τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα και τους απογόνους τους [6]. Στον μυελό των οστών, τα κύτταρα στρώματος του μικροπεριβάλλοντος των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων περιβάλλουν τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα και τους απογόνους τους. Τα κύτταρα του στρώματος παρέχουν το προστατευτικό μικροπεριβάλλον που υποστηρίζει τη διατήρηση και την αυτοανανέωση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. Επιπλέον, διατηρούν τα αποθέματα των βλαστοκυττάρων σταθερά προστατεύοντάς τα από την διαφοροποίηση και τα αποπτωτικά ερεθίσματα. Επίσης, το μικροπεριβάλλον των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του μυελού ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων καθώς και την απελευθέρωση των ώριμων απογόνων τους στο αγγειακό σύστημα. Επιπροσθέτως, στα κύτταρα του στρώματος του μυελού των οστών αποδίδονται η ρύθμιση της κατάστασης αδράνειας των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων μέσω της διατήρησης τους στην G0 φάση του κυτταρικού κύκλου, ο έλεγχος του πολλαπλασιασμού τους, η διαφοροποίηση και η στρατολόγηση τους στο αγγειακό μικροπεριβάλλον των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του μυελού [7]. Τα κύτταρα του στρώματος είναι εύκολο να ξεχωρίσουν στην καλλιέργεια, καθώς σχηματίζουν το προσκολλημένο συστατικό των μακροχρόνιων καλλιεργειών του μυελού. Τα κύτταρα αυτά συνθέτουν in vivo το μικροπεριβάλλον της αιμοποίησης [5]. (Εικόνα 1) 4

8 Εικόνα 1. Φυσικές λειτουργίες των ΜΒ στο μυελό των οστών. α) Τα ΜΒ (MSCs) μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα σκελετικών ιστών μέσα στην κοιλότητα του μυελού. β) Τα ΜΒ εκκρίνουν έναν αριθμό διαλυτών παραγόντων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της αιμοποίησης. γ) Με βάση την περιαγγειακή τους θέση τα ΜΒ μπορεί να εξυπηρετούν κυτταρικές λειτουργίες παρόμοιες με τα περικύτταρα που περιβάλλουν τα αγγεία του μυελού των οστών. δ) Τα ΜΒ διατηρούν το μηχανικό μικροπεριβάλλον του μυελού μέσω της έκκρισης και της ανακατασκευής της εξωκυττάριας ουσίας. (ECM: εξωκυττάρια ουσία) [8] 5

9 2. ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΑ ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (ΜΒ) αντιπροσωπεύουν έναν υποπληθυσμό κυττάρων του στρώματος του μυελού των οστών και μπορούν να διακριθούν από τα αιμοποιητικά κύτταρα από την ικανότητά τους να προσκολλούνται σε τρυβλία καλλιέργειας ιστών [9]. Ορίζονται ως πολυδύναμα μεσεγχυματικά κύτταρα του στρώματος [7] και είναι ένας ετερογενής πληθυσμός με μορφή ινοβλαστών. Αποτελούν το 0,01% των συνολικών κυττάρων του μυελού των οστών [9]. Σε καλλιέργειες χρησιμοποιώντας συγκεκριμένο θρεπτικό υλικό μπορεί να διαφοροποιηθούν σε οστό, λιπώδη ιστό, χόνδρο, ή μυϊκά κύτταρα [10]. Όταν καλλιεργούνται σε κλασσικό θρεπτικό υλικό που περιέχει 10% με 20% εμβρυικό ορό, σχηματίζουν πολλαπλές συστοιχίες διαφορετικής γενεαλογικής σειράς μέσα σε ένα τρυβλίο [11]. Όταν καλλιεργηθούν σε «θρεπτικό υλικό επαγωγής» χωρίς ορό το οποίο να περιέχει αυξητικούς παράγοντες και άλλες ουσίες όπως ινσουλίνη, δεξαμεθαζόνη και ινδομεθακίνη οδηγούνται σε διαφοροποίηση για την παραγωγή ενός συγκεκριμένου κυτταρικού τύπου (Εικόνα 2). Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι ακόμα και τα ΜΒ του μυελού που έχουν πλήρως διαφοροποιηθεί προς μια συγκεκριμένη κατεύθυνση μπορούν να διαφοροποιηθούν προς μια άλλη γραμμή αν τους προστεθεί «θρεπτικό υλικό επαγωγής» [12]. Τα ΜΒ διατηρούν αυτήν την ικανότητα διαφοροποίησης ακόμα και in vivo έχοντας την τάση να διαφοροποιούνται στον κυτταρικό τύπο του ιστού στον οποίο ενσωματώνονται. Αυτή η τάση μπορεί να κατευθύνεται από τοπικές κυττοκίνες και παράγοντες του μικροπεριβάλλοντος στο οποίο βρίσκονται [13]. In vivo ΜΒ ενήλικου τύπου έχουν τη δυνατότητα να διαφοροποιηθούν σε χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες, περικύτταρα, λιποκύτταρα, ινοβλάστες, κύτταρα του στρώματος του μυελού, καθώς και σε άλλους ιστούς μεσεγχυματικής προέλευσης. Παρόλο που ο μυελός των οστών αποτελεί την κύρια πηγή ΜΒ καθώς εκεί βρίσκονται σε μεγαλύτερη αφθονία και είναι και εύκολα προσβάσιμος, ΜΒ υπάρχουν και σε άλλους ιστούς όπως στον λιπώδη ιστό [14], στο περιόστεο [15], στην αρθρική μεμβράνη [16], στο μυ [17], στη δερμίδα [18], στο αίμα [19]. Η παρουσία ΜΒ σε ιστούς πέρα από τον μυελό των οστών υποδηλώνει την ύπαρξη κυτταρικών πληθυσμών με μικρότερη ικανότητα διαφοροποίησης. 6

10 2.1 Ιστορία και ορισμός των ΜΒ Τα μη αιμοποιητικά μεσεγχυματικά πρόδρομα κύτταρα προερχόμενα από τον μυελό των οστών περιγράφηκαν αρχικά από τον Friedenstein και τους συνεργάτες του [21] στις αρχές της δεκαετίας του 1970, ο οποίος απομόνωσε μυελό των οστών και τον επώασε in vitro σε πλαστικές φλάσκες καλλιέργειας. Μετά από λίγες ημέρες παρατηρήθηκε ένας ετερογενής πληθυσμός από κύτταρα που προσκολλούνται. Κατά τη διάρκεια των πρώτων ημερών καλλιέργειας εμφανίστηκαν μικρές αποικίες από κύτταρα με μορφή ινοβλαστών τα οποία περιβάλλονταν από άλλους μονοπύρηνους κυτταρικούς τύπους. Αυτά τα κύτταρα με τη μορφή ινοβλαστών τα οποια σχηματίζουν αποικίες σε μονοστοιβάδες όταν καλλιεργηθούν ονομάστηκαν CFU-F (colony forming unit fibroblasts) (Εικόνα 2). Η φυσιολογική λειτουργία των CFU-F in vivo θεωρήθηκε αρχικά ότι ήταν η υποστήριξη της αιμοποίησης [22]. Με βάση αυτές τις ανακαλύψεις, ο Owen το 1985 [23] πρότεινε την ύπαρξη βλαστοκυττάρων του στρώματος τα οποία βρίσκονται στο δικό τους περιβάλλον και έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανανεώνονται και να παράγουν ώριμα κύτταρα στρώματος. Αυτά τα βλαστοκύτταρα παράγουν πρωτεΐνες εξωκυττάριας ουσίας και διαλυτούς παράγοντες για την υποστήριξη της αιμοποίησης και τη διατήρηση του μικροπεριβάλλοντος των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (Εικόνα 1). Τη δεκαετία του 1980 περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι τα κύτταρα που προσδιόρισε ο Friedenstein και οι συνεργάτες του είναι πολυδύναμα και δίνουν γένεση σε οστεοβάστες, χονδροκύτταρα και λιποκύτταρα [24]. Διαφορετικοί εξωτερικοί παράγοντες όπως αυξητικοί παράγοντες και το θρεπτικό υλικό καλλιέργειας μελετήθηκαν για την επιρροή τους στη συχνότητα και το μέγεθος αυτών των κυττάρων του στρώματος (CFU-Fs). Ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF), ο βασικός αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (bfgf), ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-βήτα (TGF-β) και ο αυξητικός παράγοντας παρόμοιος ινσουλίνης (IGF-1) μελετήθηκαν για την θετική τους επιρροή πάνω στα «CFU-F» [25, 26, 27]. Με βάση τις μελέτες του Friedenstein ο Caplan [9] περιέγραψε τη διαδικασία κυτταρικής διαφοροποίησης από ανώριμα κύτταρα ή βλαστοκύτταρα σε ώριμα κύτταρα μεσοδερμικής προέλευσης (λιποκύτταρα, χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες). Με αυτόν τον τρόπο ο Caplan εισήγαγε 7

11 τον όρο «μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα» για να περιγράψει αυτά τα κύτταρα με τα χαρακτηριστικά βλαστοκυττάρων. Ο ορισμός μεσέγχυμα αρχικά χρησιμοποιούταν για να περιγράψει τον εμβρυονικό χαλαρό μεσεγχυματικό ιστό που προέρχεται από το μεσόδερμα και μετατρέπεται σε αιμοποιητικό και συνδετικό ιστό. Εικόνα 2. ΜΒ και πολυδύναμα κύτταρα στρώματος. Το κυτταρικό κλάσμα πολλών οργάνων που προσκολλάται σε πλαστικές επιφάνειες περιέχει προγονικά κύτταρα στρώματος που δίνουν γένεση σε αποικίες με μορφολογία ινοβλαστών. Αυτή η κυτταρική ομάδα, γνωστή ως ινοβλάστες που δημιουργούν αποκίες (CFU-Fs), αντιστοιχεί σε ένα πολυδύναμο πληθυσμό προδρόμων κυττάρων, κυρίως ετερογενή, που βρίσκεται στα αιμοφόρα αγγεία όλων των ιστών που έχουν μελετηθεί μέχρι τώρα και έχει βρεθεί ότι εκφράζει ειδικούς δείκτες περικυττάρων (CD146, NG2 (γνωστό και ως CSPG4) και υποδοχέα-β αυξητικού παράγοντα αιμοπεταλίων (PDGFRβ)). Όταν καλλιεργούνται κάτω από τις κατάλληλες κυτταρικές πυκνότητες, οι αποικίες που προέρχονται από τα CFU-Fs μπορούν να απομονωθούν και να πολλαπλασιαστούν μετά από πολλαπλές διαιρέσεις in vitro (όπως δείχνει το κυρτό βέλος) χωρίς να χάσουν την πολυδύναμη μεσεγχυματική τους ιδιότητα. Αυτά τα καλλιεργούμενα κύτταρα αναφέρονται ως μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα ή αλλιώς ως πολυδύναμα μεσεγχυματικά κύτταρα του στρώματος. Η ιδιότητα που τα χαρακτηρίζει είναι η ικανότητα τους να διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες, κύτταρα λιπώδους ιστού και χονδροκύτταρα μετά από κατάλληλο ερέθισμα. Διαφοροποίηση σε διάφορους μη μεσεγχυματικούς ώριμους κυτταρικούς τύπους (όπως μυικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και νευρικά κύτταρα) έχει επίσης αναφερθεί in vitro αλλά αμφισβητείται αν συμμετέχει σημαντικά στην επιδιόρθωση του νευρικού ιστού in vivo. [20] Ενώ ο όρος μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα χρησιμοποιείται ευρέως κάποιοι ερευνητές προτιμούν τον όρο μεσεγχυματικά κύτταρα του στρώματος καθώς ο 8

12 ορισμός βλαστοκύτταρα αναφέρεται συνήθως σε συνδετικό ιστό που σχηματίζει το στηρικτικό ιστό ενός οργάνου [29]. Επιπλέον, μελετάται η σχέση των ΜΒ με άλλα κύτταρα του στρώματος όπως οι ινοβλάστες. Οι ινοβλάστες και τα ΜΒ έχουν μια ατρακτοειδή μορφή και εκφράζουν μια σειρά κοινών χαρακτηριστικών μορίων επιφάνειας. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης το γεγονός ότι τα ΜΒ και οι ινοβλάστες είναι στην πραγματικότητα δυναμικά κύτταρα με ίδια καταγωγή. Ωστόσο, τα ΜΒ παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές από τους ινοβλάστες [30] και συγκεκριμένα έχουν την ικανότητα διαφοροποίησης και την ιδιότητα να σχηματίζουν αποικίες. 2.2 Χαρακτηριστικά μόρια επιφάνειας των ΜΒ Το πιο κοινό χαρακτηριστικό μόριο επιφάνειας («δείκτης») των ΜΒ είναι ο δείκτης STRO-1 αφού έχει παρατηρηθεί ότι ο πληθυσμός των κυττάρων που είναι θετικός για το Stro-1 επίτοπο έχει την ικανότητα να διαφοροποιείται σε πολλαπλά κύτταρα μεσεγχυματικής καταγωγής τα οποία περιλαμβάνουν το στρώμα που υποστηρίζει τα αιμοποιητικά κύτταρα. Παρόλα αυτά η αποκλειστικότητα του δεν έχει αποδειχθεί ακόμα [30]. Άλλοι κυτταρικοί δείκτες επιφάνειας των ΜΒ είναι οι PDGFreceptor β, CD146, CD49b, CD105, CD73, CD200, CD271, SSEA-1 και ο SSEA-4, αλλά εκφράζονται επίσης και σε άλλους κυτταρικούς τύπους όπως ο PDGF-receptor β στα περικύτταρα και ο CD146 στα ενδοθηλιακά κύτταρα [31, 32]. Ένας κυτταρικός δείκτης ο οποίος χρησιμοποιείται ευρέως για την απομόνωση των ΜΒ από τα μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού των οστών είναι ο χαμηλής συγγένειας υποδοχέας NGF (p75 NGFR/CD271). Όπως αναφέρθηκε από τον Jones και τους συνεργάτες του ο CD271 φαίνεται να είναι ο πιο κατάλληλος κυτταρικός δείκτης για την απομόνωση των ΜΒ από τον μυελό [33]. 2.3 Ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των ΜΒ Μελέτες σε διάφορα είδη έδειξαν ότι τα ΜΒ έχουν ανοσοκατασταλτική δράση αφού αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων σε ανταπόκριση πολυκλωνικών και συγγενών πεπτιδίων. Επομένως, τα ΜΒ φαίνεται να έχουν ανοσορυθμιστική δράση στο μυελό των οστών. Σε αυτήν την αναστολή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων φαίνεται να εμπλέκονται διαλυτοί παράγοντες και 9

13 μηχανισμοί κυτταρικών αλληλεπιδράσεων από τα ΜΒ. Αναφέρεται ότι τα ΜΒ μπορούν να καταστείλουν Τ κύτταρα φυσικά και μνήμης σε απόκριση των συγγενών τους αντιγόνων αλλά αυτή η καταστολή δεν παρουσιάζει αντιγονοειδικότητα [34, 35]. Επιπλέον τα ΜΒ επάγουν την απόπτωση των Τ κυττάρων [36] καταστέλλουν την IFN-γ που παράγεται από τα Τ κύτταρα και αυξάνουν την έκκριση ιντερλευκίνης, και προάγουν τα ρυθμιστικά (Τreg) κύτταρα [37]. Η έκφραση πρώιμων δεικτών ενεργοποίησης όπως ο CD25 και ο CD69 στα Τ κύτταρα δεν επηρεάζεται από την παρουσία των ΜΒ αλλά η παραγωγή της IFN-γ μειώνεται. Τα ΜΒ ασκούν την ανασταλτική τους δράση στο επίπεδο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού χωρίς να εμπλέκονται στην αρχική ενεργοποίηση των Τ κυττάρων [38]. Η άμεση καταστολή της λειτουργίας των CD4 T κυττάρων (Τ βοηθητικά κύτταρα) εξαρτάται από την απελευθέρωση διαφόρων διαλυτών μορίων από τα ΜΒ, συμπεριλαμβανομένων της προσταγλανδίνης Ε2, της 2,3 διοξυγενάσης (IDO), του TGF-β1, του ηπατοκυτταρικού αυξητικού παράγοντα (HGF), της επαγώμενης συνθετάσης του νιτρικού οξέος (inos) και της οξυγενάσης της αίμης-1 (HO1). Επίσης, η αναστολή της κυτταροτοξικότητας των CD8+ Τ κυττάρων και της διαφοροποίησης των ρυθμιστικών Τ κυττάρων από την άμεση μεσολάβηση των ΜΒ σχετίζονται με την απελευθέρωση της διαλυτής HLS-G5 (shla-g5) από αυτά [39]. Μια άλλη ιδιότητα των ΜΒ είναι η αναστολή του πολλαπλασιασμού, η επιρροή της διαφοροποίησης, της παραγωγής αντισωμάτων και της χημειοτακτικής συμπεριφοράς των Β κυττάρων [40]. Επιπλέον, τα ΜΒ μπορεί να αναστείλουν τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων σε ανώριμα μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα (DCs), να αναστείλουν την παραγωγή του παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF) από τα δενδριτικά κύτταρα και να προάγουν την παραγωγή αντιφλεγμονωδών κυττοκινών όπως ιντερλευκίνης-10 (IL-10) από τα δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από μονοκύτταρα. Σε όλες αυτές τις παραπάνω διαδικασίες εμπλέκεται η προσταγλανδίνη Ε2 που παράγεται από τα ΜΒ. Η δράση των ΜΒ στα δενδριτικά κύτταρα αλλoιώνει την ενεργοποιητική δράση των ώριμων δενδριτικών κυττάρων στα ηρεμούντα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα και παρεμποδίζει την παρουσίαση των αντιγόνων στα Τ κύτταρα, τα οποία δεν μπορούν με την σειρά τους να μπουν σε διαδικασία πολλαπλασιασμού και κλωνικής επέκτασης [41]. 10

14 Επιπροσθέτως, τα ΜΒ καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό που προκαλείται από κυτταροκίνες και εμποδίζουν την παραγωγή κυτταροκινών και την κυτοτοξική δραστηριότητα των κυττάρων φυσικών φονιάδων (NK). Η δράση αυτή επιτυγχάνεται με την βοήθεια της προσταγλανδίνης Ε2, της 2,3 διοξυγενάσης και της shla-g5 που απελευθερώνονται από τα ΜΒ [42]. (Εικόνα 3) Μελέτες σε πειραματικά μοντέλα διαλεύκαναν περαιτέρω τον τρόπο δράσης των ΜΒ. Σε ένα μοντέλο οξείας νεφρικής ανεπάρκειας, η χορήγηση ΜΒ βοήθησε την αποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας μέσω της αναστολής της παραγωγής προφλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως η ιντερλευκίνη-1β (IL-1β), ο παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNF) και η ιντερφερόνη-γ (IFNγ) και μέσω ενός αντιαποπτωτικού αποτελέσματος στα κύτταρα-στόχους. Παρόμοια, σε ένα μοντέλο πνευμονικής ίνωσης, τα ΜΒ είχαν αντιφλεγμονώδη δράση καταστέλλοντας τα Τ κυττάρων που εξέφραζαν ιντερλευκίνη-1α και τα μακροφάγα που παράγουν παράγοντα νέκρωσης όγκων μέσω της απελευθέρωσης ανταγωνιστή του υποδοχέα της ιντερλεκίνης-1 (IL-1RA) [44]. 11

15 Εικόνα 3. Πιθανοί μηχανισμοί των αλληλεπιδράσεων των ΜΒ με τα ανοσοκύτταρα. Τα ΜΒ μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό και την κυτταροτοξικότητα των ηρεμούντων φυσικών φονικών (ΝΚ) κυττάρων όπως επίσης και την παραγωγή κυτταροκινών απελευθερώνοντας προσταγλανδίνη Ε2 (PGE2), ινδολεαμίνη, 2,3- διοξυγενάση (IDO) και διαλυτό HLA-G5(sHLA-G5). Ο θάνατος των ΜΒ από τα ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα περιλαμβάνει τη σύζευξη των κυτταρικών υποδοχέων επιφάνειας (παχιά μπλε γραμμή) που εκφράζονται στα ΝΚ κύτταρα με τους προσδέτες τους που εκφράζονται στα ΜΒ. Τα ΜΒ αναστέλλουν την διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε ώριμα μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα (DCs), θέτουν τα ώριμα DCs σε ένα ανώριμο στάδιο, αναστέλλουν την παραγωγή του παράγοντα νέκρωσης όγκων (ΤNF) από τα μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα και αυξάνουν την παραγωγή ιντερλευκίνης-10 (IL-10) από τα δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από μονοκύτταρα (pdcs). Η προσταγλανδίνη Ε2 που απελευθερώνεται από τα ΜΒ εμπλέκεται σε αυτές τις διαδικασίες. Ανώριμα DCs είναι ευάλωτα σε λύση από τα ΝΚ κύτταρα. Η άμεση αναστολή των CD4+ T κυττάρων από τα ΜΒ εξαρτάται από την απελευθέρωση διαφόρων διαλυτών παραγόντων, όπως της προσταγλανδίνης Ε2, της 2,3 διοξυγενάσης, του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού-βήτα (TGF-β), του ηπατοκυτταρικού αυξητικού παράγοντα (HGF), της επαγώμενης συνθετάσης του νιτρικού οξέος (inos) και της οξυγενάσης της αίμης-1 (HO1). Η αναστολή της κυταροτοξικότητας των CD8+ από τα ΜΒ και η άμεση διαφοροποίηση των ρυθμιστικών Τ κυττάρων από τα ΜΒ σχετίζονται με την απελευθέρωση του shla-g5 από τα ΜΒ. Επιπλέον, η ρύθμιση της παραγωγής της IL-10 από τα pdcs καταλήγει στην αυξημένη παραγωγή των ρυθμιστικών Τ κυττάρων μέσω ενός έμμεσου μηχανισμού. Η αναστολή των Β κυττάρων από τα ΜΒ φαίνεται να εξαρτάται από διαλυτούς παράγοντες και κυτταρική επαφή. Τέλος, τα ΜΒ καταστέλλουν την αναπνευστική έκρηξη και καθυστερούν την αυτόματη απόπτωση των ουδετερόφιλων μέσω της απελευθέρωσης ιντερλευκίνης-6 (IL-6) [43]. 12

16 2.4 Τα ΜΒ στην επανόρθωση κατεστραμμένων ιστών Τα ΜΒ αναγνωρίζονται ως ένας τύπος κυττάρων που συμμετέχει ενεργά στην επανόρθωση των ιστών. Όταν ένας ιστός τραυματίζεται τα ΜΒ από την κοντινή περιοχή ή από τον μυελό των οστών φαίνεται να μεταναστεύουν στον κατεστραμμένο ιστό. Όταν μεταναστεύσουν στην κατεστραμμένη περιοχή αλληλεπιδρούν στενά με διάφορα κύτταρα στρώματος και φλεγμονής έτσι ώστε να επιδιορθωθεί η βλάβη. Ο μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η επιδιόρθωση μέσω των ΜΒ είναι πολύπλοκος αλλά οι παράγοντες που προέρχονται από τα ΜΒ κατέχουν ένα σημαντικό ρόλο [45]. Η έκφραση κυτταρικών μορίων προσκόλλησης, υποδοχέων ιντεγκρινών και χημειοκινών στην επιφάνεια των ΜΒ ενισχύουν την ιδέα ότι μπορούν να μεταναστεύσουν κατά μήκος των ενδοθηλιακών κυτταρικών στρωμάτων και να ενσωματωθούν στους ιστούς, ιδιαιτέρως στους τραυματισμένους ή αυτούς με φλεγμονή, όπου βοηθούν την επούλωση του τραύματος και ενισχύουν την αναγέννηση του ιστού. Έρευνες αναφέρουν ότι ο τραυματισμένος ιστός εκφράζει συγκεκριμένους υποδοχείς και προσδέτες έτσι ώστε να διευκολύνει τη μεταφορά, την προσκόλληση και τη διήθηση των ΜΒ [46]. Τα ΜΒ από δότες μπορούν να αναπτυχθούν σε μεγάλες ποσότητες και να εγχυθούν σε δέκτες χωρίς να χρειάζεται να είναι συμβατός ο ιστός καθώς τα κύτταρα αυτά έχουν την ιδιότητα να μην γίνονται αντιληπτά από το ανοσοποιητικό σύστημα. Επειδή τα ΜΒ αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό εργαλείο για κυτταρική θεραπεία, χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία μιας σειράς ασθενειών σε πειραματικά μοντέλα ζώων. Μελέτες δείχνουν ότι τα ΜΒ συνεισφέρουν στην επιδιόρθωση του ιστού σε μοντέλα εμφράγματος του μυοκαρδίου [47], εγκεφαλικού [48], σε τραυματισμό του μηνίσκου [49] και σε ισχαιμία άκρων [50]. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι το ποσοστό των ΜΒ που εμφυτεύτηκε ήταν μικρό σε σχέση με τα κύτταρα του ιστού του δέκτη γεγονός που υποδηλώνει ότι η αποτελεσματικότητα αυτών των βλαστοκυττάρων εξαρτάται από τις δράσεις τους και όχι από απευθείας διαφοροποίηση. Ο Kinnaird και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι χρησιμοποιώντας θρεπτικό υλικό που προέρχεται από καλλιέργεια βλαστοκυττάρων επήγαγε τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη μετανάστευση των in vitro, και η ένεση θρεπτικού υλικού ΜΒ σε ποντίκι που είχε υποστεί ισχαιμία του πίσω άκρου 13

17 επανέφερε τη ροή του αίματος στο τραυματισμένο άκρο [51]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν προκύψει από μοντέλο με καρδιακό έμφραγμα και έχουν αναφερθεί μια σειρά από διάφορες αγγειογενετικές κυτταροκίνες που παράγονται από τα ΜΒ [52]. Διάφορες μελέτες αποδεικνύουν ότι τα ΜΒ μπορούν να εκκρίνουν μία σειρά αυξητικών παραγόντων όπως ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF), ο αυξητικός παράγοντας ινοβλάστών (FGF), ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-βήτα (TGF-β), o αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), ο αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF), ο ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας (IGF-1), η αγγειοποιητίνη-1 και ο παράγοντας που προέρχεται από το κυτταρικό στρώμα (SDF-1), πολλοί από τους οποίους ενεργοποιούνται από προφλεγμονώδη ερεθίσματα όπως ο TNF-α, λιποπολυσακχαρίτες, ή υποξία, μέσω του πυρηνικού παράγοντα NF-κΒ [30, 53]. 2.5 ΜΒ και νευροπροστασία Η άποψη ότι οι νευρώνες του ΚΝΣ δεν ανανεώνονται ποτέ έχει αλλάξει την τελευταία δεκαετία καθώς έρευνες έχουν δείξει βλαστοκύτταρα να μεταναστεύουν στον εγκέφαλο σε διάφορα μοντέλα τρωκτικών με τραύμα, όπως επίσης και νέους νευρώνες στον ιππόκαμπο ενήλικων ανθρώπων [54, 55]. Σήμερα τα ΜΒ θεωρούνται μια ελπιδοφόρα θεραπεία για τις νευροεκφυλιστικές ασθένειες, ειδικά εκείνες που είναι θανατηφόρες και δύσκολο να θεραπευτούν, παρέχοντας αυξητικούς παράγοντες για να ενισχύσουν την επιδιόρθωση και ίσως την παραγωγή νέων νευρώνων. Προτεινόμενες αναγεννητικές προσεγγίσεις περιλαμβάνουν την μεταφορά των ΜΒ μέσω ενδοεγκεφαλικής ή ενδοραχιαία έγχυση, ή μέσω της ενδορινικής οδού [54]. Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι τα ΜΒ εκκρίνουν μια σειρά κυταρροκινών και αυξητικών παραγόντων που συνεισφέρουν στην ενδογενή ανάπτυξη των νευρώνων, στην νευρογένεση και στην αγγειογένεση, ενισχύουν τις συναπτικές συνδέσεις και την επαναμυελίνωση των κατεστραμμένων αξόνων, μειώνουν την απόπτωση και ρυθμίζουν τη φλεγμονή κυρίως μέσω παρακρινών δράσεων (Εικόνα 4). Τα ανθρώπινα ΜΒ εκκρίνουν διάφορους νευροτροφικούς παράγοντες όπως ο εγκεφαλικά-προερχόμενος νευροτροφικός νευροτροφικός παράγοντας, ο παράγοντας (BDNF), νευρογλοιακά-προερχόμενος ο ακτινωτός νευροτροφικός 14

18 παράγοντας (GDNF) και ο νευρικός αυξητικός παράγοντας (NGF) [56]. Άλλο ένα σημαντικό θεραπευτικό αποτέλεσμα των ΜΒ μεσολαβείται από την έκκριση του τροφικού παράγοντα WNT-associated molecule secreted frizzled-related protein 2 (SFRP2), ο οποίος οδηγεί στη διάσωση των ισχαιμικών καρδιομυοκυττάρων και στην αποκατάσταση των κοιλιακών λειτουργιών [57]. In vitro πειράματα έδειξαν ότι νευρικά βλαστοκύτταρα που μεγαλώνουν παρουσία ΜΒ, ή σε θρεπτικό υλικό που προέρχεται από ΜΒ, παράγουν περισσότερους νευρώνες και ολιγοδενδροκύτταρα ενώ δίνουν γένεση σε λιγότερα αστροκύτταρα σε σχέση με εκείνα που μεγαλώνουν χωρίς την παρουσία ΜΒ [108]. Επιπλέον, σύμφωνα με την πρόσφατη έρευνα της Βούλγαρη-Κόκοτας [142] και των συνεργατών της, τα ΜΒ προστατεύουν τους νευρώνες από θάνατο προκαλούμενο από γλουταμινικό οξυ, μέσω της αναστολής της αύξησης της έκφρασης υπομονάδων του NMDAR και την αύξηση των επιπέδων των ιόντων ασβεστίου. Σε αυτήν την μελέτη χρησιμοποιήθηκαν in vitro και in vivo μοντέλα διεγερσιτοξικότητας του γλουταμινικού οξέος και διερευνήθηκαν οι νευροπροστατευτικές λειτουργίες των ΜΒ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το θρεπτικό μέσο των ΜΒ ανέστειλε την αύξηση της συγκέντρωσης του mrna των υπομονάδων NR1 και NR2 που επάγεται από το NMDA σε νευρώνες του φλοιού ποντικών, καθώς επίσης και τα επίπεδα ασβεστίου που επάγονται από το γλουταμινικό οξύ σε γαγγλιακά κύτταρα αμφιβληστροειδούς (ΓΚΑ) αρουραίου που επωάστηκαν με NMDA, δείχνωντας ότι ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους τα ΜΒ προστατεύουν τους νευρώνες από την διεγερσιτοξικότητα του γλουταμινικού οξέος είναι η μείωση της νευρικής ευαισθησίας στο γλουταμινικό οξύ. Επιροσθέτως, η Βούλγαρη-Κόκοτα και οι συνεργάτες της έδειξαν ότι η επώαση των νευρώνων με θρεπτικό μέσο ΜΒ για 24 ώρες μετέβαλε την έκφραση ενός αριθμού γονιδίων που είναι σημαντικά για τη συναπτική λειτουργία, και η μειωμένη κινητικότητα των ιόντων ασβεστίου που εξαρτάται από το NMDA, ενίσχυσε την άποψη ότι η νευροπροστασία που επάγεται από το θρεπτικό μέσο των ΜΒ σχετίζεται με μειωμένη νευρική δραστηριότητα. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε μια αύξηση της έκφρασης ενός μεγάλου αριθμού μορίων και ογκογονιδίων που σχετίζονται με βλαστοκύτταρα προτείνοντας ότι η νευροπροστασία μπορεί να σχετίζεται και με αυξημένη κυτταρική πλαστικότητα. 15

19 Εικόνα 4: Πιθανοί θεραπευτικοί μηχανισμοί της νευροπροστασίας από μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSCs). Τα ΜΒ εκκρίνουν μια ποικιλία νευροτροφικών παραγόντων που προωθούν την ενδογενή ανάπτυξη των νευρώνων, επάγουν την αγγειογένεση, τη νευρογένεση και την ενεργοποίηση της αστρογλοίας, ενισχύουν τη συναπτική επικοινωνία και την επαναμυελίνωση των αξόνων, μειώνουν την απόπτωση, και ρυθμίζουν την ενεργοποίηση της αστρογλοίας μέσω παρακρινικών δράσεων. [56] Επαγωγή της νευρογένεσης και ενεργοποίηση της αστρογλοίας Τα ΜΒ επάγουν τον πολλαπλασιασμό των ενδογενών νευρικών βλαστοκυττάρων στην υποκοιλιακή ζώνη (SVZ) και είναι απαραίτητα για την επιβίωση των νεογέννητων κυττάρων [59]. Έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται άμεσα στη διαφοροποίηση των νευρώνων αφού προσδεθούν σε τραυματισμένους ή παθολογικούς ιστούς και μπορούν να μεταναστεύσουν στο ΚΝΣ σε ένα περιορισμένο βαθμό [60]. Τα θεραπευτικά αποτελέσματα των ΜΒ αυξήθηκαν όταν γενετικά τροποποιημένα ΜΒ που εκφράζουν νευρογενίνη-1, ένα γονίδιο που κατευθύνει τη νευρική διαφοροποίηση, χορηγήθηκαν σε εγκεφαλική ισχαιμία [61]. Επιπλέον, τα ΜΒ αύξησαν την πλαστικότητα των κατεστραμμένων νευρώνων και ενεργοποίησαν τα αστρογλοιακά κύτταρα να παράγουν νευροτροφίνες [62]. Σε ένα ζωικό μοντέλο τραύματος του ΚΝΣ μεταμόσχευση κυττάρων του στρώματος του μυελού των οστών συντέλεσε στην ενδογενή επιδιόρθωση [63]. 16

20 2.5.2 Νευρικές συνάψεις Έρευνες έχουν δείξει ότι παράγοντες εξωκυττάριας ουσίας που παράγονται από τα ΜΒ συμβάλλουν στην επιδιόρθωση των νευρικών κυττάρων [64]. Ένα παράδειγμα τέτοιας ουσίας είναι η φιμπρονεκτίνη η οποία συμμετέχει σε μεγάλο βαθμό στην επιβίωση των νευρώνων, στην αξονική εκβλάστηση και την συναπτογένεση που ακολουθεί την εγκεφαλική ισχαιμία [65]. Επιπλέον, αξονική αύξηση και αναγέννηση μπορεί να προκληθεί από μόρια εξωκυττάριας ουσίας και μόρια κυτταρικής προσκόλλησης όπως ιντεγκρίνες, καδερίνες και σελεκτίνες [66]. (Εικόνα 5) Εικόνα 5. Οι νευροτροφικοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα ΜΒ επάγουν την νευρογένεση και τη συναπτική επικοινωνία μεταξύ κατεστραμμένων νευρώνων στον εγκέφαλο. (Α) Κατεστραμένοι νευρώνες μαζεύουν τους αξονές τους προς το σώμα και έτσι αποτρέπεται η αποτελεσματική επικοινωνία μεταξύ των νευρώνων στο δίκτυο των νευρώνων. (Β) Τα ΜΒ μπορούν να επάγουν την έκταση των αξόνων για να επανέλθει η κυτταρική επικοινωνία μεταξύ των νευρώνων εκκρίνοντας νευροτροφικούς παράγοντες. Επιπλέον, μειώνουν την φλεγμονή στην περιοχή της βλάβης στον εγκέφαλο, αυξάνουν την αγγείωση, μειώνουν τα επίπεδα των ελεύθερων ριζών και μειώνουν την απόπτωση των τοπικών νευρώνων. [73] 17

21 2.5.3 Αντι-αποπτωτικές ιδιότητες Σε ένα ζωικό μοντέλο απόφραξης της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας η ενδοφλέβια μεταμόσχευση ΜΒ μείωσε τα αποπτωτικά κύτταρα [63]. Αυτή η αντιαποπτωτική ιδιότητα των ΜΒ σε συνδυασμό με την ικανότητα τους να απελευθερώνουν νευροτροφικούς παράγοντες εξηγούν την λειτουργική ανάκαμψη ζωικών μοντέλων με εγκεφαλικό ή τραυματισμό του νωτιαίου μυελού [67] Ανοσορυθμιστικές ιδιότητες Όπως έχει ήδη αναφερθεί τα ΜΒ παρουσιάζουν ανοσορυθμιστικές ιδιότητες και έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία σκλήρυνσης κατά πλάκας και Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλοπάθεια (ΠΑΕ) [68]. Σε ισχαιμικό εγκέφαλο τα ΜΒ εκδήλωσαν επίσης την ανοσορυθμιστική τους δράση μείωνοντας τα επίπεδα των Ibα-1+ και ED1+ κυττάρων φλεγμονής [69]. Σε προηγούμενες μελέτες, ενδοφλέβια έγχυση ΜΒ σε αρουραίους με τραύμα του νωτιαίου μυελού μείωσε την προφλεγμονώδη κυτταροκίνη IL-1β και το ποσοστό της ενεργοποιημένης μικρογλοίας, αλλά αύξησε επίσης τα επίπεδα της αντιφλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-10, επιβεβαιώνοντας ότι τα ΜΒ συμμετέχουν ενεργά στην ανάρρωση αυτών των ζώων [70] Επαγωγή της αγγειογένεσης Σε πειραματικά μοντέλα καρδιαγγειακών νοσημάτων, όπως έμφραγμα του μυοκαρδίου και ισχαιμία άκρων, παρατηρήθηκε η έκκριση διαφόρων αγγειογενετικών κυτταροκινών από τα ΜΒ όπως ο αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυτττάρων, ο βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών, ο ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας 1 και ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας [52, 71]. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα ΜΒ μπορούν να εξομαλύνουν την ισχαιμική βλάβη ιστού, να παράγουν κυτταροκίνες που επάγουν την αγγειογένεση και πιθανότατα να διαφοροποιηθούν σε ενδοθηλιακά κύτταρα [72]. Επομένως, αυτές οι έρευνες τείνουν στο γεγονός ότι τα ΜΒ εκκρίνουν τροφικούς παράγοντες in vivo οι οποίοι συνεισφέρουν στην επιδιόρθωση του τραύματος ενεργοποιώντας την αγγειογένεση. 18

22 2.5.6 Φαινόμενα κυττάρων του δέκτη που επάγονται από τη μεταμόσχευση ΜΒ Όπως αναφέρθηκε παραπάνω τα ΜΒ εκκρίνουν μια σειρά από παράγοντες οι οποίοι δρουν θεραπευτικά. Επομένως, η θεραπευτική δράση των μεταμοσχευμένων ΜΒ μάλλον οφείλεται κυρίως σε παρακρινικές ενέργειες παρά στην άμεση κυτταρική αντικατάσταση [74]. Πράγματι έχει αποδειχθεί η δράση των ΜΒ δεν εξαρτάται από την μετανάστευσή τους και την ενσωμάτωσή τους στο προσβεβλημένο όργανο [143] και έτσι η μεταμόσχευση ΜΒ απευθείας στο ΚΝΣ μπορεί να μην είναι απαραίτητη για να ασκήσουν τη θεραπευτική τους δράση [142]. Επιπροσθέτως, τα μεταμοσχευμένα ΜΒ προκαλούν τα κύτταρα του δέκτη να παράγουν με τη σειρά τους διάφορες ευεργετικές πρωτεΐνες που συμβάλλουν στην ανάκαμψη του τραύματος σε διάφορες νευρολογικές ασθένειες όπως στο τραύμα του ΚΝΣ και στο τραύμα του νωτιαίου μυελού [63, 75]. 2.6 ΜΒ και καρκίνος Πολλοί ερευνητές πιστεύουν ότι τα ΜΒ μπορούν να συμβάλλουν στην προστασία του καρκινικού όγκου καθώς παρουσιάζουν αντιαποπτωτικές ιδιότητες, προωθούν την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση και καθιστούν τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακα [76]. Παρόλο που η ανοσορυθμιστική δράση των ΜΒ έχει πολλά πλεονεκτήματα και χρησιμοποιείται στη θεραπεία διαφόρων εκφυλιστικών ασθενειών και διαταραχών του ανοσοποιητικού συστήματος μπορεί επίσης να παρουσιάζει κάποιες αρνητικές επιδράσεις όπως η προώθηση καρκινικών όγκων. Ο Ren και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι η ανοσοκατασταλτική λειτουργία των ΜΒ πραγματοποιείται μέσω της ρύθμισης προφλεγμονώδων κυτταροκινών και μέσω της δράσης χημειοκινών και νιτρικού οξειδίου (ΝΟ) [77]. Η πρόκληση και ανάπτυξη ενός όγκου συνοδεύεται από προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες και τα ΜΒ δείχνουν τροπισμό για τους κυτταρικούς όγκους [78]. Για να μελετηθεί ο τρόπος δράσης των ΜΒ πάνω στους κυτταρικούς όγκους, παρατηρήθηκε η επίδραση τους στο φλεγμονώδες περιβάλλον των αναπτυσσόμενων όγκων Β16 κυττάρων μελανώματος και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες των ΜΒ βοηθούν τους όγκους να ξεφύγουν από την ανοσολογική επιτήρηση [79]. Συγκεκριμένα, έρευνες αποδεικνύουν ότι η παρουσία ενεργής ανοσολογικής αντίδρασης στο καρκινικό 19

23 περιβάλλον προσελκύει τα ΜΒ τα οποία εγκαθίστανται στους όγκους και ασκούν τις ανοσοκατασταλτικές τους λειτουργίες (Εικόνα 6). Εικόνα 6. Τα ΜΒ έχουν ένα τροπισμό για τους όγκους. Οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες μπορούν να επάγουν ανοσοκατασολή από τα ΜΒ. Τα ΜΒ σε ένα φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον όγκου μπορούν να έχουν ανοσοκατασταλτικές λειτουργίες, οι οποίες βοηθούν τους όγκους να διαφύγουν από την εποπτεία του ανοσοποιητικού συστήματος. [81] Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ενώ αρκετές μελέτες έχουν δείξει πως τα ΜΒ ενισχύουν την ανάπτυξη του όγκου και προάγουν την μετάσταση άλλες μελέτες δείχνουν πως καταστέλλουν την αύξηση του όγκου. Ο Khakoo και οι συνεργάτες του παρατήρησαν ότι τα ΜΒ είχαν αντικαρκινικές ιδιότητες σε ένα μοντέλο ποντικού με σάρκωμα Kaposi καταστέλλοντας τη δραστηριότητα της πρωτεϊνικής κινάσης β (ΑΚΤ) [80]. 20

24 Επιπλέον τα ΜΒ τροποποιούν την εξέλιξη των όγκων επηρεάζοντας την αγγείωση και την αγγειογένεση. Η δράση τους στην αγγείωση του όγκου είναι πολύπλοκη. Τα ΜΒ έχουν παρακρινή δράση εκκρίνοντας πολλούς προ-αγγειογόνους παράγοντες και κυτταροκίνες και μπορούν να συνεισφέρουν άμεσα στη δημιουργία αιμοφόρων αγγείων. Επιπλέον, τα ΜΒ συνεισφέρουν στην αγγειογένεση μέσω της διαφοροποίησης τους σε περικύτταρα και κύτταρα των τοιχωμάτων γύρω από τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου συμμετέχοντας έτσι στον σχηματισμό ενός ώριμου αγγειακού συστήματος [82]. 2.7 Τα ΜΒ σε προκλινικές και κλινικές δοκιμές Την τελευταία δεκαετία το ενδιαφέρον των επιστημόνων έχει στραφεί στη χορήγηση ΜΒ για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Οι ερευνητές μελετούν τη χρήση βλαστοκυττάρων σε ανθρώπους καθώς οι έρευνες σε μοντέλα ζώων έδειξαν κάποια θετικά αποτελέσματα. Εξαιτίας της ικανότητας των ΜΒ να πολλαπλασιάζονται με ταχείς ρυθμούς είναι δυνατό να παραχθούν μεγάλη ποσότητα κυττάρων για κλινική χρήση από μία μόνο παρακέντηση μυελού των οστών, ένα τμήμα ομφάλιου λώρου, ή ένα μικρό κομμάτι λιπώδους ιστού [83]. Από τη δεκαετία του 1990, τα καλλιεργούμενα ΜΒ άρχισαν να χρησιμοποιούνται για να μειώσουν την οξεία και χρόνια νόσο μοσχεύματος κατά ξενιστή σε ασθενείς που λάμβαναν αλλογενή μοσχεύματα αιματοποιητικών βλαστοκυττάρων και για να εξομαλύνουν τα κλινικά συμπτώματα σε ασθένειες ατελούς οστεογένεσης και αποθήκευσης γλυκογόνου [84, 85, 86]. Αρχικά, η ομάδα του Caplan ήταν η πρώτη που χορήγησε ενδοφλεβίως αυτόλογα ΜΒ σε ασθενείς, τα οποία είχαν πριν καλλιεργηθεί in vitro, προκειμένου να αξιολογηθεί πόσο ασφαλής είναι η χορήγησή τους στον άνθρωπο. Έως πενήντα εκατομμύρια κύτταρα ενέθηκαν με ασφάλεια στους ασθενείς [84]. Στη συνέχεια, ΜΒ χρησιμοποιήθηκαν σε κλινικές δοκιμές για την αντιμετώπιση ασθενειών όπως η ατελής οστεογένεση [85], η μεταχρωματική λευκοδυστροφία [86], το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου και η νόσος μοσχεύματος κατά του ξενιστή [37]. Σήμερα η αποτελεσματικότητα των ΜΒ μελετάται σε μία πληθώρα ασθενειών όπως έμφραγμα του μυοκαρδίου, καρκίνος, σακχαρώδη διαβήτη και νόσο του Crohn [87-90]. Η ανοσορυθμιστική ιδιότητα τους σε συνδυασμό 21

25 με τις ιστο-τροφικές ιδιότητες τους τα καθιστούν ικανά για τη θεραπεία αυτοάνοσων ασθενειών. Προκλινικά μοντέλα αυτοάνοσων ασθενειών δείχνουν τα ευεργετικά αποτελέσματα των ΜΒ σε τραυματισμένους ιστούς αναστέλλοντας την ανοσοφλεγμονή και προωθώντας την επισκευή του ιστού μέσω τροφικών και αντιαποπτωτικών μηχανισμών [90]. Ένα μεγάλο πλεονέκτημα των ΜΒ έναντι των εμβρυικών βλαστοκυττάρων είναι ότι μπορούν να απομονωθούν από ενήλικο άτομο. Με αυτόν τον τρόπο ξεπερνώνται τα ηθικά διλλήματα που υπάρχουν στην απομόνωση των εμβρυικών βλαστοκυττάρων τα οποία μπορούν να απομονωθούν μόνο από έμβρυα. Πληθυσμοί ΜΒ με παρόμοιες ιδιότητες έχουν εντοπιστεί σχεδόν σε όλους τους ιστούς των θηλαστικών και του ανθρώπου. Η καλύτερη πηγή ΜΒ για κλινικές δοκιμές είναι ο λιπώδης ιστός. Ο συγκεκριμένος ιστός είναι η πιο πλούσια πηγή μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων (100 φορές περισσότερο άφθονος σε ΜΒ από τον μυελό των οστών). Τα κύτταρα του στρώματος του λιπώδους ιστού και τα ΜΒ έχουν αρκετά κοινά χαρακτηριστικά αλλά και διαφορές στις πρωτεΐνες που εκφράζουν και την λειτουργία τους [14]. Τα ευρέως χρησιμοποιούμενα ζωικά μοντέλα ασθενειών στα οποία έχουν μελετηθεί τα ΜΒ είναι η νόσος μοσχεύματος κατά ξενιστή (GvHD), η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλοπάθεια (ΠΑΕ), η κολλαγονο- επαγόμενη αρθρίτιδα (CIA), οι φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου (IBD), ο τύπου 1 διαβήτης και ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (SLE) [90-94] (Πίνακας 1). Παρόλο που οι περισσότερες μελέτες δείχνουν επίδραση των ΜΒ σε Th1 οδηγούμενες ασθένειες, μερικές πρόσφατες έρευνες αποκαλύπτουν ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε Th2-τύπου ασθένειες, όπως σε μοντέλο ποντικού με άσθμα στις οποίες η επίδραση των ΜΒ περιλαμβάνει τον TGF-β και τα ρυθμιστικά Τ κύτταρα [95, 96]. Η αποτελεσματικότητα των ΜΒ σε αυτά τα ζωικά μοντέλα διαφέρει καθώς σε πολλές μελέτες η θεραπεία με ΜΒ επέφερε βελτίωση της ασθένειας, σε άλλες μελέτες είχε πολύ μικρό ή και καθόλου αποτέλεσμα ενώ σε κάποιες έρευνες η θεραπεία επιδείνωσε την ασθένεια [97]. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι οι έρευνες πάνω στη μεταμόσχευση ΜΒ δείχνουν ότι τα κύτταρα αυτά έχουν την ικανότητα να διαφεύγουν από την επίβλεψη του ανοσοποιητικού συστήματος. Αρχικές κλινικές δοκιμές αποδεικνύουν ότι αυτόλογα και αλλογενή ΜΒ μπορούν να μεταμοσχευθούν χωρίς απόρριψη από το 22

26 ανοσοποιητικό σύστημα [98, 99]. Ανθρώπινα ΜΒ μπορούν να ενσωματωθούν και να παραμείνουν σε πολλούς ιστούς σε προγενέθλιο ή ενήλικο πρόβατο χωρίς να απορριφθούν [100]. Επίσης, ΜΒ που ενέθηκαν σε μπαμπουίνους επιμήκυναν τη ζωή μεταμοσχευμάτων δέρματος και κατέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων με ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [34], ενώ ΜΒ που ενέθηκαν σε ποντίκια κατέστειλαν την ανοσολογική απάντηση, επιτρέποντας την ανάπτυξη καρκινικών όγκων [102]. Πίνακας 1. Βιολογικές δράσεις των ΜΒ σε προκλινικά μοντέλα ασθενειών. CNS: κεντρικό νευρικό σύστημα, EAE: Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλοπάθεια, HSC, αιματοποιητικά βλαστοκύτταρα, IGF1: αυξητικός παράγοντας παρόμοιος ινσουλίνης, IL: ιντερλετκίνη, MSC: ΜΒ, SFRP2: εκκρινόμενη πρωτείνη που σχετίζεται με αναδίπλωση.[103] 23

27 2.7.1 ΜΒ σε πειραματικά μοντέλα εγκεφαλικού Πειραματικά μοντέλα ζώων με εγκεφαλικό στα οποία χορηγήθηκαν ΜΒ είτε απευθείας στον εγκέφαλο κατεστραμμένης περιοχής και είτε ενδοφλεβίως παρουσίασαν μείωση της βελτίωση των νευρολογικών διαταραχών. Έρευνες αναφέρουν ότι τα ΜΒ ρυθμίζουν τον κυτταρικό θάνατο μέσω της απελευθέρωσης τροφικών παραγόντων όπως επίσης μέσω της μετατροπής του μεσοκυττάριου χώρου των αστροκυττάρων η οποία επιτρέπει σε αυτά τα κύτταρα να ανταποκρίνονται πιο αποτελεσματικά στη ρύθμιση της βλάβης. Επιπλέον, αυξάνουν την έκφραση του tpa (ενεργοποιητής του πλασμινογόνου) στα αστροκύτταρα γύρω από την περιοχή του τραύματος και έτσι αυξάνουν τη νευροπροστασία και την νευριτική αύξηση [104] ΜΒ στη σκλήρυνση κατά πλάκας Η πιο διαδεδομένη χρήση των ΜΒ είναι αυτή στη σκλήρυνση κατά πλάκας. Η σκλήρυνση κατά πλάκας είναι μία φλεγμονώδης ασθένεια του ΚΝΣ που χαρακτηρίζεται από παρατεταμένη κυτταρική διήθηση του ανοσοποιητικού συστήματος, απομυελίνωση και καταστροφή των νευρώνων. Ένεση ΜΒ από τον μυελό των οστών σε ζώα με χρόνια ή υποτροπιάζουσα ΠΑΕ, που είναι το πιο καλά χαρακτηρισμένο μοντέλο σκλήρυνσης κατά πλάκας και προκαλείται από ανοσοποίηση με συγκεκριμένες πρωτεΐνες μυελίνης όπως το πεπτίδιο MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein), οδήγησε σε εμφανή μείωση των λειτουργικών ανωμαλιών και σε μακροπρόθεσμη ανάκαμψη, μέσω της ανοσορύθμισης και νευροπροστασίας [103, 105, 106]. Συγκεκριμένα, τα μεταμοσχευμένα ΜΒ συγκεντρώνονται στις περιοχές της απομυελίνωσης και φαίνεται ότι αναστέλλουν την φλεγμονή που προκαλείται από τα Τ κύτταρα, την απομυελίνωση των νευρώνων και την καταστροφή των αξόνων. Επίσης, μειώνεται σημαντικά η διήθηση στο ΚΝΣ των Τ και Β κυττάρων και των μακροφάγων [107]. Ιστολογική παρατήρηση των απομυελινωμένων αξόνων στο νωτιαίο μυελό ζώων στα οποία χορηγήθηκαν ΜΒ σε σύγκριση με εκείνα που δεν χορηγήθηκαν φανέρωσε σημαντικές αλλαγές. Για παράδειγμα, το ποσοστό της αστρογλοίωσης μειώθηκε με την παρουσία των ΜΒ και ο αριθμός των ολιγοδενδροκυττάρων και των προγόνων τους αυξήθηκε σημαντικά [106]. Πειράματα με ανθρώπινα ΜΒ από μυελό των οστών που χορηγήθηκαν σε μοντέλα ΠΑΕ μετανάστευσαν στο ΚΝΣ και ρύθμισαν τη πορεία της νόσου, την 24

28 ανοσολογική απάντηση, μείωσαν την έκταση της βλάβης και αύξησαν το ποσοστό των ολιγοδενδροκυττάρων σε αυτήν την περιοχή. Νευροσφαίρες που απομονώθηκαν από ζώα που τους χορηγήθηκαν ΜΒ έδωσαν γένεση σε περισσότερα ολιγοδενδροκύτταρα και λιγότερα αστροκύτταρα σε σχέση με τα ζώα αναφοράς [144]. Οι παρενέργειες που έχουν αναφερθεί από τη χρήση των ΜΒ ως θεραπεία στη σκλήρυνση κατά πλάκας σε κλινικές μελέτες φάσης 1 δεν χαρακτηρίζονται ως σοβαρές και είναι οι εξής: ιατρογενής μηνιγγίτιδα πονοκέφαλος, παροδική εγκεφαλοπάθεια και πυρετός [ ]. Ωστόσο, παρατηρήθηκε πρόσφατα ότι η ενδεγκεφαλοκοιλιακή έγχυση ΜΒ σε ποντίκια με ΠΑΕ σοβαρής μορφής επάγει το σχηματισμό κυτταρικών μαζών στο εγκεφαλικό παρέγχυμα [112]. Τα ΜΒ που χορηγήθηκαν σε αυτά τα ζώα προέρχονταν από πρώιμες καλλιέργειες in vitro και φυσιολογικό καρυότυπο και η μάζα που σχηματίστηκε σχετιζόταν με την κυτταρική πυκνότητα και όχι με τον τρόπο χορήγησης των κυττάρων ή το βαθμό φλεγμονής. Οι μάζες χαρακτηρίζονταν από τοπική εισβολή φλεγμονωδών κυττάρων (T-κύτταρα, Bκύτταρα, μικρογλοία) (πιθανό σημάδι ανοσολογικής απόρριψης), απομυελίνωση, απώλεια αξόνων και αυξημένη απόθεση κολλαγόνου-ινονεκτίνης. Ωστόσο, φαίνεται ότι οι μάζες αυτές δεν είναι όγκοι αλλά μάζες ΜΒ που είναι παρόμοιες με μεσεγχυματικούς ιστούς. Επιπροσθέτως, η μελέτη αυτή υποστηρίζει την άποψη ότι τα ΜΒ όταν βρεθούν στον εγκέφαλο δε μετατρέπονται σε νευρώνες ή άλλα κύτταρα του ΚΝΣ. 25

29 3. Η ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Ο ανθρώπινος εγκέφαλος εμπεριέχει ένα εξαιρετικά πολυσύνθετο δίκτυο κυττάρων, οι λειτουργίες του οποίου είναι υπεύθυνες για τη δημιουργία των σκέψεων, της μνήμης, τον έλεγχο των δραστηριοτήτων του σώματος και των συναισθημάτων. Αυτό το έργο επιτελείται από τους περίπου νευρώνες του εγκεφάλου, οι οποίοι συναντιούνται μεταξύ τους σε ως 1015 σημεία. Οι νευρώνες παρουσιάζουν μια ποικιλία μεγεθών και μορφών αλλά οι περισσότεροι από αυτούς αποτελούνται από 4 μέρη: 1) το κυτταρικό σώμα, 2) τους δενδρίτες, 3) έναν άξονα και 4) τις αξονικές απολήξεις (Εικόνα 7). Το κυτταρικό σώμα του νευρώνα περιέχει πυρήνα και ριβοσώματα, φέρει δηλαδή τη γενετική πληροφορία και τα απαραίτητα οργανίδια για την πρωτεϊνοσύνθεση. Οι δενδρίτες ξεκινούν από το κυτταρικό σώμα και σχηματίζουν εκβλαστήσεις. Οι δενδρίτες μαζί με το κυτταρικό σώμα λαμβάνουν τα εισερχόμενα σήματα που έρχονται από τους άλλους νευρώνες αλλά έχουν πολύ σημαντικότερο ρόλο οι δενδρίτες από το κυτταρικό σώμα σε αυτήν τη διαδικασία. Οι δενδρίτες έχουν τέτοια διαμόρφωση ώστε να υποδέχονται ένα μεγάλο αριθμό τελικών απολήξεων από άλλα κύτταρα. Οι δενδρίτες πολλών νευρώνων έχουν τις δενδριτικές άκανθες, οι οποίες είναι ακανθοειδείς αποφύσεις και είναι εξειδικευμένες για συναπτικές συνδέσεις. Ο άξονας (ή νευρική ίνα) είναι μια μονήρης μακριά αποφυάδα που εκτείνεται από το κυτταρικό σώμα μέχρι τα κύτταρα στόχους. Το μήκος τους μπορεί να είναι από μερικά μικρόμετρα έως πάνω από ένα μέτρο. Το αρχικό τμήμα του άξονα, δηλαδή αυτό που βρίσκεται κοντά στο κυτταρικό σώμα μαζί με το τμήμα του σώματος που συνδέεται ο άξονας, είναι η «ζώνη πυροδότησης», όπου στους περισσότερους νευρώνες γεννιούνται τα ηλεκτρικά σήματα που ταξιδεύουν κατά μήκος του άξονα ή κατά μήκος των δενδριτών μακριά από το κυτταρικό σώμα. Ο κύριος άξονας μπορεί να έχει διακλαδώσεις κατά την πορεία του που ονομάζονται παράπλευροι άξονες. Κοντά στις απολήξεις παρατηρούνται περαιτέρω διακλαδώσεις. Οι άξονες με διάμετρο μεγαλύτερη από 1μm καλύπτονται από μυελίνη η οποία αποτελείται από 20 έως 200 στρώματα κυτταρικής μεμβράνης, υψηλής διαφοροποίησης, περιτυλιγμένη γύρω από τον άξονα και τα οποία προέρχονται από ένα γειτονικό υποστηρικτικό κύτταρο. Στο 26

30 ΚΝΣ τα κύτταρα που σχηματίζουν τη μυελίνη ονομάζονται ολιγοδενδροκύτταρα (ένας τύπος νευρογλοίας ή απλά κυττάρων γλοίας) ενώ στο περιφερικό νευρικό σύστημα αποκαλούνται κύτταρα Schwann. Τα κομβία του Ranvier αναφέρονται στα διαστήματα μεταξύ προκείμενων τμημάτων όπου η κυτταροπλασματική μεμβράνη του άξονα είναι εκτεθειμένη στο εξωκυττάριο υγρό. Η επικάλυψη με μυελίνη λειτουργεί ως ηλεκτρικό μονωτικό και συντελεί στην επιτάχυνση της αγωγής των ηλεκτρικών σημάτων κατά μήκος του άξονα και εξοικονομεί ενέργεια (Εικόνα 7). Κάθε κλάδος τερματίζει σε μία αξονική απόληξη που είναι υπεύθυνη για την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών. Εναλλακτικά, μερικοί νευρώνες απελευθερώνουν τους χημικούς νευροδιαβιβαστές από μία σειρά διογκωμένων περιοχών κατά μήκος του άξονα που είναι γνωστές ως κιρσώδεις ανευρύνσεις. [113] Εικόνα 7: Η δομή ενός τυπικού νευρώνα με μυελίνη. (terminal buttons:τελικά κομβία)[114] Η κυτταρολογία του νευρώνα είναι στενά σχετιζόμενη με την λειτουργία διαφόρων τμημάτων. Το κυτταρικό σώμα είναι το τροφικό κέντρο του κυττάρου και εφοδιάζει τους δενδρίτες και τους άξονες για τις λειτουργικές και μεταβολικές 27

31 ανάγκες. Αυτό επιτρέπει στις δυο προηγούμενες δομές να είναι ολοκληρωτικά αφοσιωμένες στις πολύ εξειδικευμένες λειτουργίες τους. Τα αστροκύτταρα και τα ολιγοδενδροκύτταρα είναι τα δύο κύρια είδη κυττάρων γλοίας του κεντρικού νευρικού συστήματος. Προέρχονται από το πρωτόγονο νευροεξώδερμα, όπως και οι νευρώνες. Αστροκύτταρα εντοπίζονται σε όλα τα μέρη του ΚΝΣ ενώ χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Τα προτοπλασμικά αστροκύτταρα (protoplasmic) εντοπίζονται στην φαιά ουσία. Εξαιτίας της θέσης τους μεταξύ των διασυνδεδεμένων νευρώνων, έχουν μία περισσότερο εκλεπτισμένη και οφιοειδή μορφολογία συγκριτικά με τα ινώδη (fibrillary) αστροκύτταρα της λευκής ουσίας. Τα ινώδη αστροκύτταρα έχουν μακριές, σχετικά ευθύγραμμες αποφυάδες και περιέχουν πολύ περισσότερα ινίδια γλοίας από τα προτοπλασμικά αστροκύτταρα. Ολόκληρος ο νευρώνας μαζί με τον άξονα και τους δενδρίτες καλύπτεται από την κυτταρική μεμβράνη. Η μεμβράνη έχει πάχος περίπου 8-10nm. Η μεμβράνη είναι ημιπερατή, διότι οι πρωτεΐνες οι ενσωματωμένες στο διμοριακό λιπιδικό στρώμα κάνουν τη μεμβράνη διαπερατή για πολλές ουσίες και είναι υπεύθυνες για τη λειτουργική δραστηριότητα της. Κάποιες από τις πρωτεΐνες αυτές λειτουργούν ως δίοδοι ιόντων, προσφέροντας το κατάλληλο περιβάλλον ώστε ιόντα, μαζί με τα μόρια νερού που τα ακολουθούν, να διέρχονται από μέσα τους. Αυτές οι δίοδοι έχουν κατέχουν κεντρικό ρόλο στη λειτουργία των νευρικών κυττάρων. Μπορούν να χωριστούν σε διόδους ελεγχόμενες από τάση, σε χημικά ελεγχόμενες διόδους και σε μη ελεγχόμενες διόδους, δηλαδή αντίστοιχα ιοντικές διόδους που ανοίγουν ή κλείνουν ανάλογα με την τάση που τους επιβάλλεται διαμεμβρανικά, ανάλογα με την παρουσία κάποιων χημικών ουσιών και των χημικών φαινομένων που τις συνοδεύουν ή τέλος διόδους που δεν ελέγχονται από εξωτερικές συνθήκες. Κατά μήκος της μεμβράνης των κυττάρων διατηρείται, σε κατάσταση ηρεμίας, μια διαφορά ηλεκτρικού δυναμικού, τέτοια ώστε το εσωτερικό του κυττάρου να βρίσκεται σε αρνητικό δυναμικό ως προς τον εξωτερικό χώρο. Στην περίπτωση των νευρικών και μυϊκών κυττάρων, αυτό το δυναμικό ηρεμίας είναι της τάξης των λίγων δεκάδων mv ( -70 mv) και οφείλεται στην άνιση κατανομή ιόντων μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνης, η οποία κατανομή διατηρείται από τη μεταβολική δραστηριότητα του κυττάρου. Αυτό σημαίνει ότι σε κατάσταση ηρεμίας το εσωτερικό 28

32 του νευρώνα είναι αρνητικά φορτισμένο σε σχέση με το εξωτερικό. Τα δυναμικά τα οποία μετρούμε μεταξύ δύο ηλεκτροδίων στην εξωτερική δερματική επιφάνεια του κεφαλιού οφείλονται ουσιαστικά σε ρεύματα ιόντων διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης των νευρώνων που συμμετέχουν στην εκάστοτε εγκεφαλική διεργασία. Τα ρεύματα αυτά διαχέονται στην περιοχή από τα σημεία δημιουργίας τους έως την εξωτερική δερματική επιφάνεια, διότι ο εγκεφαλικός ιστός, οι μήνιγγες, το κρανίο και το δέρμα άγουν το ηλεκτρικό ρεύμα. Υπάρχουν δύο είδη διαμεμβρανικής ρευματικής ροής, που σχετίζονται με τη μετάδοση και επεξεργασία πληροφοριών μεταξύ των νευρώνων και προκαλούν τα εξής διαφορετικής φύσης δυναμικά: το δυναμικό δράσης (action potential) και το μετασυναπτικό δυναμικό (Post Synaptic Potential - PSP). Το δυναμικό δράσης προκαλεί πάντα αποπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης και επομένως ενεργοποίηση του νευρώνα ενώ το μετασυναπτικό δυναμικό μπορεί να είναι μετασυναπτικό δυναμικό διέγερσης (excitatory PSP - EPSP) όταν πρικαλεί αποπόλωση, ή μετασυναπτικό δυναμικό καταστολής ή αναστολής (inhibitory PSP IPSP), διότι διαδιδόμενο προς το σώμα και αθροιζόμενο με άλλες συνεισφορές από διαφορετικές συνάψεις δεν διευκολύνει ενδεχόμενη αποπόλωση του νευρώνα. Το σύνολο των ηλεκτροχημικών επιδράσεων από νευρώνα σε νευρώνα, αθροιζόμενο για όλες τις περιοχές του εγκεφάλου, δημιουργεί αυτό που ονομάζουμε εγκεφαλική λειτουργία [115,116]. 29

33 4. ΤΟ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Ολόκληρο το νευρικό σύστημα των σπονδυλωτών αναπτύσσεται από το εξώδερμα, την εξώτατη στιβάδα του πρώιμου εμβρύου. Αρχικά, το νευρικό σύστημα εμφανίζεται ως κυλινδρικό επιθήλιο, που ονομάζεται νευρική πλάκα (εξωδερμικά κύτταρα που δεν αποκτούν νευρικές ιδιότητες δημιουργούν την επιδερμίδα). Μετά τον σχηματισμό της, η νευρική πλάκα εμφανίζει επιμέρους διαφοροποίηση κατά μήκος του προσθιοπίσθιου άξονά της. Την ίδια χρονική περίοδο, η νευρική πλάκα αναδιπλώνεται για να σχηματίσει μια σωληνοειδή δομή, τον νευρικό σωλήνα. Το ΚΝΣ του ενήλικου ατόμου μπορεί να διαιρεθεί σε επτά ανατομικές περιοχές, καθεμία από τις οποίες αναπτύσσεται από μια ιδιαίτερη περιοχή του νευρικού σωλήνα. Οι επτά κύριες περιοχές είναι: 1) ο νωτιαίος μυελός 2) ο προμήκης μυελός 3) η γέφυρα 4) η παρεγκεφαλίδα 5) ο μέσος εγκέφαλος 6) ο διάμεσος εγκέφαλος και 7) τα εγκεφαλικά ημισφαίρια. Καθένα από τα επτά μέρη είναι αμφίπλευρο. Η κύρια διαφορά στην αρχιτεκτονική του ΚΝΣ σε σύγκριση με άλλες περιοχές του σώματος, είναι το γεγονός ότι κάθε νευρώνας καταλαμβάνει μία μοναδική θέση στο δίκτυο του ΚΝΣ, η οποία προκύπτει από την ιεραρχημένη ανάπτυξη του ΚΝΣ. Στις περισσότερες περιοχές όπως ο εγκεφαλικός φλοιός, τα κύτταρα των βαθύτερων στοιβάδων σχηματίζονται πρώτα και ακολουθούν αυτά των εξωτερικών στοιβάδων. Υπάρχουν όμως και εξαιρέσεις σε αυτόν τον κανόνα. Στον εγκεφαλικό φλοιό για παράδειγμα, η κοκκιώδης κυτταρική στοιβάδα σχηματίζεται από εσωτερική μετανάστευση κυττάρων από τις εξωτερικές βλαστικές στοιβάδες. Η καθοδήγηση των μεταναστευόντων νευρώνων γίνεται από τα ακτινωτά κύτταρα γλοίας [115]. 4.1 Φλοιός του εγκεφάλου Ο φλοιός του εγκεφάλου έχει κεντρικό ρόλο στη μάθηση και στη διαδικασία των συναισθημάτων. Είναι μια αμφίπλευρη δομή που σχηματίζεται στην κορυφή των δύο ημισφαιρίων και αποτελείται από νευρώνες, αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα, αγγεία αίματος και επένδυμα. Το στρώμα του επενδύματος έρχεται σε επαφή με το εγκεφαλονωτιαίο υγρό της αριστερής κοιλίας και η εξωτερική επιφάνεια του φλοιού καλύπτεται από μήνιγγες. Υπάρχουν 2 κύριοι τύποι νευρώνων 30

34 του φλοιού. Περίπου το 80% είναι νευρώνες προβολής που είναι διεγερτικά κύτταρα που χρησιμοποιούν το γλουταμινικό οξύ σαν νευροδιαβιβαστή. Οι άξονές τους εκτείνονται σε μακριές αποστάσεις μέχρι τους συναπτικούς στόχους. Οι υπόλοιποι (~20%) είναι τοπικοί νευρώνες κυκλώματος (διάμεσοι νευρώνες), οι οποίοι είναι ανασταλτικά κύτταρα που χρησιμοποιούν το GABA ως νευροδιαβιβαστή. Γενικά, οι άξονές τους συνάπτονται με κοντινούς νευρώνες [58]. 31

35 5. ΤΟ ΓΛΟΥΤΑΜΙΝΙΚΟ ΟΞΥ ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΟΥ Το γλουταμινικό οξύ είναι ο κύριος διεγερτικός νευροδιαβιβαστής του ΚΝΣ των θηλαστικών. Αποτελεί παράγωγο του κύκλου του Krebs του ενδιάμεσου μεταβολισμού. Ο διαβιβαστής γλουταμινικό οξύ βρίσκεται χωριστά από το μεταβολικό γλουταμινικό οξύ στα συναπτικά κυστίδια. Από το γλουταμινικό οξύ συντίθεται το GABA σε μία αντίδραση η οποία καταλύεται από την αποκαρβοξυλάση του γλουταμινικού οξέος. Το GABA απαντάται σε υψηλές συγκεντρώσεις σε ολόκληρο το ΚΝΣ και ανιχνεύεται και σε άλλους ιστούς (ειδικότερα στα κύτταρα των νησίδων του παγκρέατος και στα επινεφρίδια). Θεωρείται ότι το GABA είναι ο μείζων ανασταλτικός διαβιβαστής σε πολλές περιοχές του εγκεφάλου, όπως σε διάφορους ανασταλτικούς διάμεσους νευρώνες και στα κοκκοειδή κύτταρα του οσφρητικού λοβού [101]. Το γλουταμινικό οξύ αφού απελευθερωθεί από τα συναπτικά κυστίδια μέσω Ca2+-εξαρτώμενης εξωκύτωσης προσδένεται και ενεργοποιεί μια οικογένεια ιονοτρόπων υποδοχέων (iglurs) που πήραν την ονομασία τους από τους εξωγενείς αγωνιστές που είναι εκλεκτικοί για κάθε τύπο και περιλαμβάνουν το α-αμινο-3υδροξυ-5-μεθυλο-4-ισοξαζολοπροπιονικό οξύ (AMPA), το καϊνικό (kainate) και το Νμεθυλο-D-ασπαρτικό (NMDA) (Εικόνα 8). Κάθε ένας από αυτούς τους υποδοχείς είναι πολυμερικές συναθροίσεις μίας η περισσοτέρων υπομονάδων και υπάρχει ένας αριθμός διαφορετικών υπομονάδων που οφείλεται σε εναλλακτικό μάτισμα του RNA ή διόρθωσης του RNA που καταλήγει σε αλλαγή μιας βάσης και επακόλουθη αλλαγή ενός αμινοξέος [117]. Επιπλέον, το γλουταμινικό οξύ ενεργοποιεί μία οικογένεια υποδοχέων G πρωτεϊνών που αναφέρονται ως μεταβαλοτρόποι γλουταμινικοί υποδοχείς (mglurs) [118]. Και οι 2 κατηγορίες υποδοχέων βρίσκονται σε διάφορα σημεία μιας διεγερτικής σύναψης, συμπεριλαμβανομένου του προσυναπτικού άκρου, του μετασυναπτικού άκρου και των αστροκυττάρων που περιβάλουν τη σύναψη [119]. Επιπροσθέτως, αυτοί οι υποδοχείς βρίσκονται και σε άλλα κύτταρα του ΚΝΣ. Το γεγονός ότι μερικοί από αυτούς τους υποδοχείς βρίσκονται σε διάφορα σημεία σχετίζεται με το ότι λειτουργούν σαν αισθητήρες της συγκέντρωσης του γλουταμινικού οξέος. Για παράδειγμα, ενεργοποίηση κάποιων προσυναπτικών νευρώνων καταστέλλει την απελευθέρωση γλουταμινικού οξέος. Επιπλέον, έρευνες δείχνουν ότι τα διεγερτικά σήματα από κύτταρο σε κύτταρο δεν περιορίζονται μόνο 32

36 μεταξύ των νευρώνων, αλλά και τα αστροκύτταρα απελευθερώνουν γλουταμινικό οξύ και εκφράζουν γλουταμινικούς υποδοχείς [120]. Τα ολιγοδενδροκύτταρα εκφράζουν επίσης γλουταμινικούς υποδοχείς [121]. Το γλουταμινικό οξύ όπως απελευθερώνεται από τα συναπτικά κυστίδια απορροφάται και πάλι από τον εξωκυττάριο χώρο μέσω μιας οικογένειας Na+εξαρτώμενων μεμβρανικών μεταφορέων υψηλής συγγένειας όπως οι EAAC1 (EAAT3) και EAAT4, που βρίσκονται κυρίως στους νευρώνες, και οι GLT-1 (GAAT2) και GLAST (GAAT1) που εκφράζονται κυρίως στα κύτταρα γλοίας [122]. Υπό ορισμένες προϋποθέσεις, η διαταραχή της ισορροπίας διεγερτικών διαβιβαστών, όπως είναι το γλουταμινικό οξύ, συντελεί στην εμφάνιση νόσων. Η υπερβολική ποσότητα γλουταμινικού οξέος είναι πολύ τοξική για τους νευρώνες. Δεδομένου ότι το γλουταμινικό οξύ είναι ο κύριος διεγερτικός διαβιβαστής στον εγκέφαλο, τα περισσότερα εγκεφαλικά κύτταρα έχουν υποδοχείς για το μόριο αυτό. Σε ιστοκαλλιέργειες, ακόμη και μια σύντομη έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις γλουταμινικού αρκεί για να νεκρώσει πολλούς νευρώνες, φαινόμενο που ονομάζεται διεγερσιτοξικότητα του γλουταμινικού. Μολονότι η διεγερσιτοξικότητα του γλουταμινικού μπορεί να οφείλεται εν μέρει στους άλλους τύπους υποδοχέων γλουταμινικού, θεωρείται ότι είναι αποτέλεσμα υπερβολικής εισροής Ca2+ δια μέσου διαύλων που ενεργοποιούνται από το NMDA σε πολλούς τύπους κυττάρων. Υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Ca2+ μπορεί να ενεργοποιούν ασβεστιοεξαρτώμενες πρωτεάσες και να παράγουν ελεύθερες ρίζες, οι οποίες είναι τοξικές για το κύτταρο [124]. Ο θάνατος που επάγεται οδηγεί σε νέκρωση και απόπτωση. Η συνεισφορά του κάθε τύπου θανάτου στην διεγερσιτοξικότητα σχετίζεται με τη σφοδρότητα της αύξησης της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης ασβεστίου. Πιο έντονες μεταβολές κινούν την νέκρωση, ενώ σχετικά ήπιες αυξήσεις επάγουν απόπτωση [125]. Η τοξικότητα του γλουταμινικού μπορεί να συμβάλλει στην καταστροφή κυττάρων μετά από αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, στην νέκρωση κυττάρων που παρατηρείται κατά τις επίμονες κρίσεις επιληψίας και σε εκφυλιστικά νοσήματα, όπως η χορεία του Huntington. Ουσίες που δεσμεύουν επιλεκτικά τον υποδοχέα NMDA παρέχουν πιθανώς προστασία κατά των τοξικών επιδράσεων του γλουταμινικού και αποτελούν αντικείμενο κλινικών μελετών [116]. 33

37 Εικόνα 8. Οι ιονοτροπικοί γλουταμινικοί υποδοχείς, Ν-μεθυλο-D-ασπαρτικό (NMDA), καϊνικό και α-αμινο-3υδροξυ-5-μεθυλο-4-ισοξαζολοπροπιονικό οξύ (AMPA), μεσολαβούν στη γρήγορη μετάδοση, αλλά επίσης μεσολαβούν και στις δοσοεξαρτώμενες αλλαγές απαραίτητες για τη νευρική πλαστικότητα. Οι κυστοειδής μεταφορείς (νglut1 και νglut2) φορτώνουν γλουταμινικό οξύ σε κυστίδια προσυναπτικά. Οι γλοιακοί, αστροκυτταρικοί και μετασυναπτικοί μεταφορείς γλουταμινικού (διεγερτικοί μεταφορείς αμινοξέων, ΕΑΑΤ1-5) πιστεύεται ότι μεσολαβούν στην πρόσληψη του γλουταμινικού οξέος και έτσι στο τερματισμό της συναπτικής διαβίβασης. Οι μεταβαλοτρόποι γλουταμινικοί υποδοχείς βρίσκονται σε διάφορες συναπτικές θέσεις και λειτουργούν προ και μετασυναπτικά για να ρυθμίσουν την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών και τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα, αντίστοιχα. Για παράδειγμα, η ομάδα ΙΙ mglu (mglu2/3) αγωνιστών υποδοχέων πιθανότατα εξυπηρετεί στην διέγερση των mglu αυτοϋποδοχέων για να καταστείλουν τη διεγερτική νευροδιαβίβαση σε συγκεκριμένες συνάψεις στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Σε αντίθεση, οι mglu5 ανταγωνιστές των υποδοχέων μπορεί να καταστέλλουν την mglu5-μεσολαβούμενη διακίνηση ρευμάτων ιόντων από τους NMDA υποδοχείς και πιθανώς να διαταράξουν τη δημιουργία διαδικασιών μνήμης που σχετίζονται με στρεσογόνες καταστάσεις. GABA:γ- αμινοβουτυρικό οξυ.[123] 5.1 Οι NMDA υποδοχείς Οι NMDA υποδοχείς είναι ετερομερή σύμπλοκα που αποτελούνται από τις NR1, NR2 και NR3 υπομονάδες. Αυτές συναθροίζονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο για να σχηματίσουν λειτουργικά κανάλια με διαφορετικές φυσιολογικές και 34

38 φαρμακευτικές ιδιότητες καθώς και διαφορετικά πρότυπα συναπτικής στόχευσης. Ακόμα περισσότερη μοριακή ποικιλομορφία προκύπτει από το εναλλακτικό μάτισμα της NR1 υπομονάδας [126]. Οι NMDA υποδοχείς είναι σε υψηλό βαθμό διαπερατοί από τα ιόντα ασβεστίου (Ca2+). Η είσοδος Ca2+ από τους NMDA υποδοχείς είναι απαραίτητη για την συναπτογένεση, την αναδιοργάνωση των συνάψεων που σχετίζεται με την εμπειρία καθώς και για μακροχρόνιες αλλαγές στην συναπτική αποτελεσματικότητα. Το κανάλι του NMDA μπορεί να μπλοκαριστεί από τον ανταγωνιστή του υποδοχέα τον (+)ΜΚ801, με αποτέλεσμα την μείωση του ρεύματος Ca2+ μέσα στο κύτταρο και τη διακοπή της ενεργοποίησης των ενζυμικών συστημάτων [127]. Η ταυτότητα της NR2 υπομονάδας καθορίζει πολλές από τις βιοφυσικές και φαρμακολογικές ιδιότητες των NMDA υποδοχέων ενώ μπορεί να επηρεάσει την συνάθροιση των NMDA υποδοχέων, την μετέπειτα μεταγωγή σήματος, την κίνηση των υποδοχέων και την συναπτική στόχευση. Η NR2A υπομονάδα δείχνει μικρότερη συγγένεια για το γλουταμινικό οξύ, γρηγορότερη κινητική, μεγαλύτερο ενδεχόμενο ανοιχτού καναλιού και πιο έντονη απ-ευαισθητοποίηση που εξαρτάται από τα Ca2+, από τον NR2B. Οι NR2C και NR2D υπομονάδες χαρακτηρίζονται από ανοίγματα χαμηλής αγωγιμότητας και μειωμένη ευαισθησία στο μπλοκάρισμα από ιόντα μαγνησίου (Mg2+). H NR3 υπομονάδα εμφανίζει μειωμένη διαπερατότητα σε ιόντα ασβεστίου και μειωμένη έκφραση επιφανείας [126, 128]. Οι NMDA υποδοχείς που βρίσκονται στις συνάψεις οργανώνονται δομικά σε ένα μεγάλο μακρομοριακό σύμπλοκο μεταγωγής σήματος. Σε αυτά τα σύμπλοκα υπάρχουν και πρωτεΐνες-προσαρμοστές οι οποίες συνδέουν τους υποδοχείς με κινάσες, φωσφατάσες και άλλες πρωτεΐνες καθώς και με μεταβολοτρόπους υποδοχείς γλουταμινικού οξέος (mglurs) [129]. Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι ο αριθμός των NMDA υποδοχέων που βρίσκονται στην σύναψη και η σύστασή τους ως προς τις υπομονάδες δεν είναι στατική, αλλά μεταβάλλεται δυναμικά με έναν κυτταροειδικό και συναπτο-ειδικό τρόπο κατά την ανάπτυξη και σε απόκριση της ενεργότητας των νευρώνων ή της αισθητικής εμπειρίας [129]. Έρευνες που εξετάζουν τα Ca2+-εξαρτώμενα μονοπάτια που ξεκινούν από την ενεργοποίηση των NMDA υποδοχέων μπορούν να βοηθήσουν στη διαλεύκανση του 35

39 τρόπου δράσης των φαρμάκων σε μοντέλα νευροφλεγμονής. Επειδή οι NMDA υποδοχείς εκφράζονται στην επιφάνεια των ολιγοδενδροκυττάρων και της μεμβράνης μυελίνης μπορούν, αν ενεργοποιηθούν μη φυσιολογικά, να συμβάλλουν στην αποικοδόμηση της μυελίνης [130]. Μελέτες έδειξαν ότι αγωγή των bend3 κυττάρων με (+) ΜΚ-801 καταστέλλει την γλουταμινικο-επαγώμενη απελευθέρωση υπεροξεινιτρικού [140]. Επιπλέον, θεραπεία της ΠΑΕ των ζώων με ΜΚ-801 μείωσε την αύξηση των επιπέδων της πολυαμινικής πουτρεσκίνης στο ΚΝΣ που οφείλεται στην ασθένεια [141]. 5.2 AMPA και καϊνικοί ιονοτρόποι υποδοχείς Οι μετασυναπτικοί AMPA υποδοχείς συμμετέχουν στη γρήγορη γλουταμινική ανταπόκριση με χαμηλή διαπερατότητα Ca2+. Ο υποδοχέας αποτελείται από 4 υπομονάδες, GluR1 μέχρι GluR4, οι οποίες κατανέμονται σε όλο το ΚΝΣ και κάθε μια μπορεί να εκφραστεί σε 2 τύπους που ονομάζονται «flip» και «flop» [131]. Οι υποδοχείς AMPA συνεντοπίζονται μαζί με τους NMDA υποδοχείς γεγονός που δείχνει τη λειτουργική σχέση μεταξύ τους. Πράγματι, η ενεργοποίηση του AMPA προκαλεί κυτταρική εκπόλωση και άνοιγμα των καναλιών του NMDA με εισροή Ca2+. Φαρμακολογικές μελέτες έχουν δείξει τη συμμετοχή των υποδοχέων AMPA σε διάφορες ασθένειες του ΚΝΣ, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφαλικού, του τραύματος του εγκεφάλου και στη νόσο του Πάρκινσον [132]. Οι καϊνικοί υποδοχείς σχετίζονται στενά με τους AMPA υποδοχείς και εμπλέκονται στην προ- και μετα-συναπτική νευροδιαβίβαση. Ο υποδοχέας τους αποτελείται από 5 υπομονάδες σε 2 οικογένειες, GluR5 μέχρι GluR7 και ΚΑ1,ΚΑ2. Ομοιότητες υπάρχουν με τους AMPA υποδοχείς (30-35%) και τους NMDA (10-20%) και κάποιες μελέτες ισχυρίζονται ότι το GluR5 είναι μέλος της οικογένειας AMPA [133135]. Οι AMPA και οι καϊνικοί υποδοχείς έχουν διαφορετικούς ρόλους στον εγκέφαλο. Οι AMPA υποδοχείς συμμετέχουν στη γρήγορη διαβίβαση της πλειοψηφίας των διεγερτικών νευροδιαβιβαστών και είναι από τα βασικά κυτταρικά συστατικά των διαδικασιών μνήμης και μάθησης. Ωστόσο, υπερενεργοποίηση των AMPA υποδοχέων μπορεί να είναι επιβλαβής για το νευρικό σύστημα, προκαλώντας σπασμούς ή θάνατο 36

40 των νευρώνων. Οι υποδοχείς καϊνικού οξέος εξυπηρετούν περισσότερο ρυθμιστικούς ρόλους, συντονίζοντας την ισορροπία μεταξύ νευρικής διέγερσης και αναστολής [136]. Μη ανταγωνιστικοί αναστολείς υποδοχέων AMPA, όπως το talampanel μειώνουν την υπερδιέγερση και δυνητικά επιβραδύνουν τον νευροεκφυλισμό [137]. Προκλινικές μελέτες δείχνουν ότι οι καϊνικοί υποδοχείς αποτελούν έναν αξιόλογο στόχο για τη δημιουργία φαρμάκων. Ανταγωνιστές των AMPA/καϊνικών υποδοχέων είναι προστατευτικοί in vitro και in vivo σε ισχαιμικά, τραυματικά και αυτοάνοσα μοντέλα βλάβης της φαιάς ουσίας. Αντιστρόφως, ενεργοποίηση των AMPA/καϊνικών υποδοχέων, ή αύξηση των επίπεδων του εξωκυττάριου γλουταμινικού οξέος μπλοκάροντας τους γλουταμινικούς μεταφορείς, προκαλεί βλάβη στους άξονες ή στα ολιγοδενδροκύτταρα [138, 139]. 37

41 ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Τα ΜΒ είναι ένας πολυδύναμος υποπληθυσμός κυττάρων του μυελού των οστών και μπορεί να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα μεσοδερμικής προέλευσης, όπως λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα, όπως επίσης και κύτταρα εμβρυικής προελεύσεως. Επιπλέον, τα ΜΒ μπορούν να αλληλεπιδράσουν με κύτταρα που συμμετέχουν στην έμφυτη και επίκτητη ανοσοσία, ρυθμίζοντας πολλές λειτουργίες απόκρισης. Την τελευταία δεκαετία το ενδιαφέρον των επιστημών έχει στραφεί στη χρήση των ΜΒ για τη θεραπεία διαφόρων πειραματικών μοντέλων ασθενειών όπως της ΠΑΕ, του τραύματος του ΚΝΣ και του εγκεφαλικού. Στην Αμερική αυτά τα βλαστοκύτταρα χρησιμοποιούνται σήμερα σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους με έμφραγμα μυοκαρδίου, ισχαιμία άκρων, σε νόσο μοσχεύματος κατά του ξενιστή καθώς και σε αυτοάνοσες ασθένειες [73]. Το γεγονός ότι τα ΜΒ μπορούν να απομονωθούν από μυελό των οστών ή λιπώδη ιστό ενήλικου ατόμου τα καθιστά ένα εύχρηστο θεραπευτικό εργαλείο καθώς ξεπερνιούνται ηθικά διλλήματα που υπάρχουν στην απομόνωση των εμβρυικών βλαστοκυττάρων τα οποία προέρχονται μόνο από έμβρυα. Ένα ακόμη πλεονέκτημα των ΜΒ έναντι άλλων βλαστοκυττάρων είναι ότι έχουν την ικανότητα να διαφεύγουν από την επίβλεψη του ανοσοποιητικού συστήματος και έτσι ξεπερνιέται ο αυξημένος κίνδυνος απόρριψης που παρουσιάζουν τα νευρικά βλαστοκύτταρα. Τα τελευταία χρόνια διάφορες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με την πιθανή θεραπευτική δράση των ΜΒ σε ασθένειες του ΚΝΣ. Η πιο διαδεδομένη άποψη είναι ότι τα ΜΒ δρουν κυρίως παρακρινικά αντί μέσω άμεσης κυτταρικής αντικατάστασης [74]. Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι τα ΜΒ εκκρίνουν μια σειρά κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων που συνεισφέρουν στην ενδογενή ανάπτυξη των νευρώνων, τη νευρογένεση και την αγγειογένεση, ενισχύουν τις συναπτικές συνδέσεις και την επαναμυέλωση των κατεστραμμένων αξόνων, μειώνουν την απόπτωση και ρυθμίζουν τη φλεγμονή κυρίως μέσω παρακρινών δράσεων. Ακόμη, φαίνεται ότι τα ΜΒ επάγουν άμεση νευροπροστασία μέσω της έκκρισης τροφικών παραγόντων [62]. 38

42 Πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι τα ΜΒ ποντικού προστατεύουν τους νευρώνες από κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από γλουταμινικό οξύ μέσω της μείωσης της έκφρασης γλουταμινικών υποδοχέων και της μείωσης του γλουταμινικού θανάτου που προκαλείται από εισροή ιόντων ασβεστίου. Επιπλέον, η έκθεση των νευρώνων για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο ΜΒ ήταν αρκετή για να μεταβάλλει την γονιδιακή έκφραση των νευρωνικών καλλιεργειών προς έναν μηώριμο φαινότυπο [142]. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να ερευνήσουμε περαιτέρω τη νευροπροστατευτική επίδραση του θρεπτικού μέσου ΜΒ όταν παραμείνει για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στην καλλιέργεια εμβρυικών νευρώνων του φλοιού, έτσι ώστε να παρατηρήσουμε τις επιδράσεις των ΜΒ στη μορφολογία και τη λειτουργία των νευρώνων μετρώντας την είσοδο των ιόντων ασβεστίου με απεικόνιση ζωντανών κυττάρων και πραγματοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία για γλουταμινικούς υποδοχείς. Μελετήσαμε επίσης, μέσω ανοσοκυτταροχημείας, την επίδραση του θρεπτικού μέσου ΜΒ στους διαφόρους κυτταρικούς πληθυσμούς που συνυπάρχουν στην καλλιέργεια των νευρώνων, συμπεριλαμβανομένων των αστροκυττάρων, των πρόδρομων ολιγοδενδροκυττάρων και των νευρώνων, όταν οι καλλιέργειες εκτεθούν σε θρεπτικό μέσο ΜΒ για μεγάλο χρονικό διάστημα (έως 7 ημέρες) και συσχετίσαμε αυτές τις αλλαγές με αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μέσω ποσοτικής γονιδιακής έκφρασης με RT-PCR. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε περαιτέρω τους μηχανισμούς με τους οποίους το θρεπτικό μέσο ΜΒ ασκεί τις ευεργετικές του ικανότητες στο ΚΝΣ σε διάφορα μοντέλα νευροεκφυλισμού. 39

43 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Έγκυα θηλυκά C57BL/6 ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση εμβρύων ημέρας Ε14.5 και την επακόλουθη αφαίρεση νευρώνων του φλοιού. Όλα τα ζώα διατηρήρηθηκαν σε ειδικές συνθήκες, απαλλαγμένες από παθογόνους παράγοντες, στις εγκαταστάσεις πειραματοζώων του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ και όλες οι πειραματικές διαδικασίες ήταν εγκεκριμένες από τις εθνικές αρχές και ανταποκρίνονταν στις κατευθυντήριες γραμμές της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Κυτταροκαλλιέργειες και πειραματικές διεργασίες Μεσεγχυματικά Βλαστοκύτταρα (ΜΒ) Τα ΜΒ είχαν απομονωθεί από τον μυελό των οστών C57BL/6 βάσει της ικανότητά τους να προσκολλώνται στις πλαστικές επιφάνειες, όπως έχει περιγραφεί προηγούμενα [21, 145]. Για τα in vitro πειράματα τα ΜΒ χρησιμοποιήθηκαν μετά το 6ο passage όταν η καλλιέργεια τους περιείχε >98% Sca1+, CD44+, CD11b ΜΒ, όπως είχε εκτιμηθεί με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας αντισώματα για τους δείκτες επιφανείας Sca1 (clone E ), CD44 (clone IM7) και CD11b (clone M1/70) (BD Biosciences) και το FACSCalibur με λογισμικό CellQuest (BD Biosciences). Η ανακαλλιέργεια γίνεται κάθε 2-4 ημέρες και τα κύτταρα στρώνονται με συγκέντρωση κύτταρα/cm2, κύτταρα/cm2 ή κύτταρα/cm2 σε φλάσκες των 75cm ειδικές για ΜΒ. Συγκεκριμένα αφού τα κύτταρα ξεπλυθούν με PBS επωάζονται για 2 λεπτά με διάλυμα 0.1% θρυψίνης 1mM EDTA (1Χ) για την αποκόλληση των κυττάρων από τον πυθμένα της φλάσκας κυτταροκαλλιέργειας και φυγοκεντρούνται στις στροφές για 10 λεπτά. Ακολουθεί επαναδιαλυτοποίηση τους σε MEM Alpha-1 (10% FBS (Εμβρυικός Ορός Βοειδών), 1% γλουταμίνη, 1% ΠενικιλίνηΣτρεπτομυκίνη, 1/1000 Fungi 2 (αντιμυκιτιακό)). Το διάλυμα MEM Alpha 1 περνάει από φίλτρο λόγω της ευαισθησίας των ΜΒ. Προστίθεται επίσης FGF (basic fibroblast growth factor) με συγκέντρωση 2%. Η φύλαξη των ΜΒ γίνεται σε διάλυμα DMSO 10% σε FBS με σταδιακή ψύξη στους -80 C (2-3 ημέρες) και κατόπιν μεταφορά τους στο υγρό άζωτο. Η επαναφορά των ΜΒ 40

44 σε θερμοκρασία καλλιέργειας απαιτεί γρήγορη απόψυξη των κυττάρων στους 37 C και απομάκρυνση του DMSO με φυγοκέντρηση. Τα ΜΒ χρησιμοποιήθηκαν για την απόκτηση θρεπτικού μέσου ΜΒ (MSC-CM) το οποίο προέκυψε από την καλλιέργεια των ΜΒ ( κύτταρα/cm2) σε DMEM με υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης για 24 ώρες και χρησιμοποιήθηκε φρέσκο ή αφού παγώθηκε και ξεπαγώθηκε (με τα ίδια αποτελέσματα) αντικαθιστώντας το 75% του θρεπτικού μέσου των νευρώνων. Πριν την προσθήκη του DMEM στην καλλιέργεια των ΜΒ τα κύτταρα ξεπλύθηκαν πρώτα μία φορά για να απομακρυνθεί αποτελεσματικά ο FGF (basic fibroblast growth factor) που υπάρχει στο θρεπτικό υλικό των ΜΒ. Νευρώνες του φλοιού Δημιουργήθηκαν καλλιέργειες νευρώνων του φλοιού από έμβρυα ποντικών, ημέρας Ε14.5, βάσει παλιότερων πρωτοκόλλων με μικρές τροποποιήσεις [146]. Συγκεκριμένα με τη χρήση αποστειρωμένων εργαλείων τα έμβρυα των ποντικιών απομακρύνονται από τους εμβρυϊκούς σάκους τους και τοποθετούνται σε τρυβλίο με διάλυμα HBSS (το οποίο περιέχει 10% HEPES buffer και 1% Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη(Pen-Strep). Αφού αποκοπούν τα κεφάλια πραγματοποιείται με τη βοήθεια στερεοσκοπίου σε απαγωγό εστία, αφαίρεση της επιδερμίδας, της κρανιακής κάψας, των μηνίγγων και κατόπιν διαχωρισμός των δύο ημισφαιρίων και απομόνωση του εγκεφαλικού φλοιού. Η συλλογή των φλοιών γίνεται σε διάλυμα HBSS στο οποίο προστίθεται θρυψίνη 2,5% 1/1.000 για τη διάλυση του ιστού και ακολουθεί επώαση σε υδατόλουτρο των 37 C για 20 λεπτά. Στη συνέχεια γίνεται απενεργοποίηση της θρυψίνης με ίση ποσότητα διαλύματος HBSS και φυγοκέντρηση στις στροφές για 10 λεπτά. Αφαιρείται το υπερκείμενο, το ίζημα με τα κύτταρα επαναδιαλύεται σε DMEM με υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης (5% ορό από έμβρυο βοοειδούς (FBS), 5% ορό από άλογο(horse serum), 1% Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη, 1% γλουταμίνη) και τα κύτταρα στρώνονται σε πλάκες κυτταροκαλλιέργειας 24 φρεατίων που είχαν προηγουμένως επιστρωθεί με πολυλυσίνη-d μια ημέρα πριν την επίστρωση των νευρώνων και την επομένη ξεπλύθηκαν με ενέσιμο νερό και προεπωάστηκαν στον κλίβανο επώασης με DMEM υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης. Την 6η ημέρα in vitro (DIV6), η διαίρεση των μη-νευρικών κυττάρων εμποδίστηκε με την προσθήκη 10 μm αραβινόζης-c (arabinose-c ή ara-c) η οποία παρέμεινε στην καλλιέργεια μέχρι την 9η μέρα in vitro (DIV 9) στην οποία έγινε αλλαγή του θρεπτικού μέσου με θρεπτικό μέσο ΜΒ για 1, 2, 5 ή 7 ημέρες η θρεπτικό μέσο αναφοράς. Η συγκέντρωση των αστροκυττάρων στην καλλιέργεια των νευρώνων όπως υπολογίστηκε με ανοσοκυτταροχημεία 41

45 χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι του glial fibrillary acidic πρωτεΐνη (GFAP) φτάνει το 9% την 9η ημέρα in vitro. Πρόκληση κυτταρικού θανάτου στους νευρώνες του φλοιού. Σε νευρώνες του φλοιού εμβρύων ποντικού 10ης ημέρας in vitro (στους οποίους την 9η ημέρα vitro είχε προστεθεί το θρεπτικό μέσο ΜΒ ή απλό) επάχθηκε διεγερσιτοξικός θάνατος με έκθεσή τους σε 50 μm N-Methyl-D-Aspartic acid (NMDA) (Sigma-Aldrich; M3262) και προσθήκη 10 μm γλυκίνης για 24 ώρες [147]. Ο θάνατος μετρήθηκε την 11η ημέρα χρησιμοποιώντας WST-1 assay (Roche), Hoechst ή με τη μέθοδο LDH (cytotoxicity detection kit)(roche). Το WST-1 assay χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της μείωσης των επιπέδων της ενεργότητας της μιτοχονδριακής δεϋδρογονάσης ενώ μέσω της χρώσης Hoechst υπολογίζεται ο λόγος των πυκνωτικών πυρήνων στο σύνολο του νευρικού πληθυσμού. Η μέθοδος LDH μετράει τα επίπεδα της γαλακτικής δεϋδρογονάσης, ενός κυτοπλασμικού ενζύμου που βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα αλλά απελευθερώνεται μόνο όταν η πλασματική μεμβράνη καταστρέφεται. o WST-1 Το WST- 1 assay μετράει ένζυμα κυτταρικού μεταβολισμού που μειώνουν το υδατοδιάλυτο τετραζόλιο της χρώσης WST-1 μετατρέποντάς το σε αδιάλυτη φορμαζάνη δίνοντας ένα χρώμα που μπορεί να μετρηθεί. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για τη μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όπως επίσης και του κυτταρικού θανάτου. Το WST-1 προστίθεται στην καλλιέργεια σε συγκέντρωση 10% και τα κύτταρα αφήνονται στον κλίβανο επώασης (37 C) για μία ώρα. Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 450 nm και αμέσως μετά στα 630 nm. o Hoechst Με τη χρώση Hoechst μετράται ο θάνατος των κυττάρων μέσω του λόγου των πυκνωτικών πυρήνων στο σύνολο του νευρικού πληθυσμού. Σε μονιμοποιημένα κύτταρα, τα οποία έχουν μονιμοποιηθεί με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS (ph 7.4), αφού γίνουν 2-3 πλύσεις με PBS προστίθεται μεθανόλη για 10 λεπτά στους 4 C. Έπειτα πραγματοποιούνται 3 πλύσεις των 10 λεπτών με PBS και τοποθετείται το αντιδραστήριο Hoechst 1/5000 σε PBS για 15 λεπτά σε σκοτάδι στους 4 C. Τα κύτταρα ξεπλένονται με PBS (3x10 λεπτά) και παρατηρούνται σε μικροσκόπιο φθορισμού. 42

46 o LDH Το αντιδραστήριο LDH μετράει τη δραστηριότητα της γαλακτικής δεϋδρογονάσης το οποίο είναι ένα ένζυμο που καταλύει την αλληλομεταροπή του πυροσταφυλικού και του γαλακτικού στο τελικό στάδιο της γλυκόλυσης. Η μέτρηση των υπερκειμένων των κυττάρων χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων του κυτταρικού θανάτου. Για την πραγματοποίηση της μεθόδου αυτής συλλέγονται τα υπερκείμενα των κυττάρων και τοποθετούνται εις διπλούν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων. Για το κάθε δείγμα αναμιγνύεται ποσότητα 100 μl υπερκειμένου με 100 μl από το μείγμα που προκύπτει κατόπιν ανάμειξης των αντιδραστηρίων της μεθόδου στις αναλογίες που περιγράφονται από τον κατασκευαστή. Εν συνεχεία ακολουθεί επώαση σε σκοτάδι για 15 και 30 λεπτά και επακόλουθη φωτομέτρηση στα 490nm στους ίδιους χρόνους. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε φωτομέτρηση στα 600nm για την κανονικοποίηση των τιμών. Ανοσοκυτταροχημεία Καλλιέργειες με νευρικά κύτταρα του φλοιού αναπτύχθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες 8 φρεατίων, είτε σε πλαστικές καλυπτρίδες προσαρμοσμένες σε πλάκες κυτταροκαλλιέργειας 48 φρεατίων, σε DMEM με υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης (παρουσία FBS) μέχρι DIV 9 όπου προστέθηκε θρεπτικό μέσο από ΜΒ ή θρεπτικό μέσο αναφοράς για 2, 5 ή 7 ημέρες. Τα κύτταρα αφού ξεπλύθηκαν από το θρεπτικό υλικό με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS (ph 7.4) στους 4 C για 20 min. Ακολούθησαν 3 πλύσεις των 10 λεπτών με PBS και μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων με Blocking Buffer (10% FBS και 0,3% Triton, σε PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν 3 φορές με PBS για 10 λεπτά. Στη συνέχεια έγινε ανοσοσήμανση των κυττάρων για 16 ώρες με τα εξής αντισώματα: mouse anti-neuronal nuclei (NeuN) monoclonal antibody (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού) (1/300; Chemicon), rabbit anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) polyclonal antibody (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού) (1/400; DAKO), rabbit anti-ng2 chondroitin sulfate proteoglycan polyclonal antibody (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού) (1/200; Millipore) ή mouse anti-glutamate receptor 1 Antibody (GluR1) (αντίσωμα ποντικού) (1/50;Millipore). Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκαν 3 πλύσεις των 10 λεπτών με PBS και προστέθηκε το δευτερογενές αντίσωμα goat anti-mouse (αντι-ποντικού από κατσίκα) (1/1000;Molecular Probes) ή anti-rabbit Alexa Fluor 568 (κόκκινο) (1/1000; Molecular Probes) για μία ώρα. Οι πυρήνες χρώσθηκαν με 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) για 5 λεπτά 43

47 αμέσως μετά το δεύτερο αντίσωμα και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS (3x10 λεπτά). Έπειτα τοποθετήθηκε μια σταγόνα Moviol πάνω στην καλυπτρίδα η οποία προσαρμόστηκε στα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες 8 φρεατίων, ή τοποθετήθηκε Moviol σε πλακάκια και τοποθετήθηκαν πάνω τους οι πλαστικές καλυπτρίδες πάνω στις οποίες είχαν αναπτυχθεί τα κύτταρα. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού ευρέως πεδίου ή συνεστιακό και τα λογισμικά απεικόνισης Cell^A (Olympus) και Image Pro αντίστοιχα χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση. Η αναλογία των ανοσο-θετικών κυττάρων σε κάθε συνθήκη καλλιέργειας υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος ±SEM των ποσοστών εκφρασμένων στους φυσιολογικούς πυρήνες που χρώσθηκαν με DAPI, από 10 τυχαία επιλεγμένα. Τα πεδία περιείχαν από κύτταρα. Όσον αφορά τη χρώση με GluR1 μετρήθηκε η ένταση φθορισμού χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image Pro τυχαίων νευρώνων από κάθε πεδίο. Τα αποτελέσματα που φαίνονται προέρχονται από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα εκ των δύο ή τριών ανεξάρτητων. Απεικόνιση ιόντων ασβεστίου Νευρώνες του φλοιού εμβρύων ποντικών επωάστηκαν την 9η ημέρα καλλιέργειας σε θρεπτικό μέσο αναφοράς ή θρεπτικό μέσο από ΜΒ για 24 ώρες και κατόπιν προστέθηκαν 100 μm NMDA και 10μΜ γλυκίνη για 12 επιπλέον ώρες. Στη συνέχεια, αφού αφαιρέθηκε το θρεπτικό υλικό των νευρώνων και ξεπλύθηκαν τα κύτταρα, προστέθηκε οξυγονωμένο ρυθμιστικό διάλυμα με ph 7,4 (2% HEPES buffer, 0,1% CaCl2 1Μ και 0,1% MgSO4 1M σε HBSS) στο οποίο διαλύθηκαν 5μM Fura Red AM και 5μΜ Fluo-4 AM (Invitrogen, Molecular Probes) και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε σκοτάδι. Το Fluo-4 και το Fura Red είναι οι δείκτες ασβεστίου. Το Fluo-4, το οποίο διεγείρεται στα 488nm και απορροφάται στα 520 nm, μετράει το Ca2+ στο εσωτερικό του κυττάρου, ενώ το Fura Red που διεγείρεται στα 488nm και απορροφάται στα nm προσδένεται στο ελεύθερο εξωκυττάριο Ca2+. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με οξυγονωμένο ρυθμιστικό διάλυμα για τη διαδικασία της απεστεροποίησης. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε θάλαμο μικροσκοπίου όπου έγινε βιντεοσκόπηση των ζωντανών κυττάρων μήκους 3 περίπου λεπτών με μικροσκόπιο φθορισμού Olympus Time lapse ΙX81 Cell-R ( live cell imaging ) κατά τη διάρκεια του οποίου προστέθηκαν γλουταμινικό οξύ 200 μμ και 10μΜ γλυκίνη στο διάλυμα του πειράματος και καταγράφηκε η είσοδος και η επακόλουθη έξοδος του ασβεστίου μέσα στα κύτταρα. Τα φίλτρα φθορισμού του μικροσκοπίου που χρησιμοποιήθηκαν είναι FITC (485) και C5 (650). Τα 44

48 αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό απεικόνισης Cell^R (Olympus) επιλέγοντας κύτταρα (Region of Interest ROIS) στα οποία το πρόγραμμα μέτρησε την αναλογία έντασης φθορισμού του Fluo-4/Fura Red σε κάθε χρονική στιγμή των λήψεων εικόνων. Ποσοτική ανάλυση γονιδιακής έκφρασης με Real-time PCR (qrt-pcr) Συνολικό RNA απομονώθηκε από νευρώνες του φλοιού εμβρύων ποντικού 11ης, 14ης και 16ης ημέρας κατόπιν καλλιέργειας σε θρεπτικό μέσο ΜΒ ή θρεπτικό μέσο αναφοράς για 2, 5 η 7 ημέρες αντίστοιχα. Η απομόνωση του συνολικού RNA πραγματοποιήθηκε με TRIzol (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συνολικό RNA νευρώνων από DIV 9 απομονώθηκε ως δείγμα ελέγχου. o Απομόνωση RNA από καλλιέργεια νευρώνων του φλοιού. Αφού λυθούν τα κύτταρα με TRIzol χρησιμοποιούνται υπέρηχοι υψηλής συχνότητας για το σπάσιμο των μεμβρανών των κυττάρων. Στη συνέχεια προστίθεται 1/5 του όγκου τους χλωροφόρμιο και κατόπιν ανάδευσης φυγοκεντρούνται στις στροφές, στους 4 C για 15 λεπτά. Συλλέγεται η πάνω φάση και προστίθεται ½ της αρχικής ποσότητας φαινόλη. Φυγοκεντρούνται (στις ίδιες συνθήκες με προηγουμένως), αφαιρείται η πάνω φάση και προστίθεται ισοπροπανόλη ( ½ της αρχικής ποσότητας). Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις στροφές, στους 4 C για 25 λεπτά, αφαιρείται το υπερκείμενο και το ίζημα επαναδιαλύεται σε 70% αιθανόλη. Στη συνέχεια, φυγοκεντρούνται όπως προηγουμένως, αφαιρείται και πάλι το υπερκείμενο και αφού στεγνώσει το ίζημα ενυδατώνονται με DEPC νερό (20 μl). Έπειτα, για να διαπιστωθεί η καθαρότητα του DNA και του RNA που έχει απομονωθεί ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης συγκέντρωσης 1,3%. Επίσης, φωτομετρείται η συγκέντρωση του RNA με μηχάνημα NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Εν συνεχεία τα δείγματα υποβάλλονται σε αποικοδόμηση του DNA με τη χρήση ειδικού ενζύμου DNAse. Σε 3 μgr συγκέντρωσης δείγματος προστίθενται 3 μl DNAse Buffer και 1 μl DNAse και επωάζονται για 30 με 40 λεπτά στους 37 C. Στη συνέχεια προστίθενται 180 μl DEPC νερού και 200 μl φαινόλης και τα δείγματα φυγοκεντρούνται στις στροφές, στους 4 C για 15 λεπτά. Συλλέγεται το υπερκείμενο στο οποίο προστίθενται 200μl ισοαμυλικής αλκοόλης/χλωροφορμίου και φυγοκεντρούνται στις ίδιες συνθήκες με προηγουμένως. Ακολούθως συλλέγεται και πάλι το υπερκείμενο στο οποίο προστίθενται 400 μl αιθανόλης 100% και 60 μl οξικού νατρίου και τα δείγματα αφήνονται στους -80 C για 16 ώρες. Έπειτα, φυγοκεντρούνται στις στροφές, στους 4 C για 30 λεπτά, αφαιρείται το υπερκείμενο, 45

49 προστίθεται αιθανόλη 70% και φυγοκεντρούνται στις ίδιες συνθήκες με προηγουμένως. Αφού αφαιρεθεί και πάλι το υπερκείμενο και στεγνώσει το ίζημα, ενυδατώνονται με 10 μl DEPC νερού. Τα δείγματα φωτομετρούνται και τηλεκτροφορούνται όπως παραπάνω. Για την qrtpcr τα δείγματά αραιώθηκαν έτσι ώστε να έχουν τελική συγκέντρωση 40ng/μl. Στην συνέχεια, έγινε ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας το kit QuantiFastTM SYBR green RT-PCR (Qiagen Inc) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. QuantiTect Primer Assays χρησιμοποιήθηκαν για Olig2, ο οποίος είναι ένας δείκτης για πρόδρομα ολιγοδενδροκύτταρα (oligodendrocyte lineage transcription factor, QT ) και Snap25 που έιναι δείκτης της νευρικής συναπτικής ακεραιότητας (synaptosomal-associated protein. QT ) (Qiagen Inc). Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με την έκφραση γονιδίου Gusb (QT ). Όλες οι αντιδράσεις έγιναν με μηχάνημα LightCycler (Roche, Mannheim, Germany). Στο τέλος κάθε κύκλου έγινε ανάλυση καμπυλών τήξης προκειμένου να επιβεβαιωθεί η ακεραιότητα και η ομογένεια των προϊόντων της PCR. Οι καμπύλες αναφοράς δημιουργήθηκαν σχεδιάζοντας τις τιμές του οριακού κύκλου (threshold cycle -CT) έναντι του λογαρίθμου των διαδοχικών αραιώσεων της συγκέντρωσης του RNA που απομονώθηκε από τα κύτταρα. Η μέθοδος των ελάχιστων τετραγώνων χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό των τιμών Α και Β από την εξίσωση: CT=A Log(CRNA)+B. Ο συντελεστής προσδιορισμού ήταν μεγαλύτερος από Στατιστική ανάλυση Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα Sigma Stat 3.5. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Το Student's t test εφαρμόστηκε για τον έλεγχο της στατιστικής εγκυρότητας των αποτελεσμάτων στις πειραματικές διαδικασίες, για την επιβίωση νευρώνων του φλοιού όπως μετρήθηκε με χρώση Hoechst και WST-1 assay, για τα ενδοκυττάρια επίπεδα ιόντων ασβεστίου που επάγει το γλουταμινικό οξύ και στα πειράματα ανοσοκυτταροχημείας. Τα σχετικά επίπεδα mrna ανάμεσα στους νευρώνες που προστέθηκε θρεπτικό μέσο ΜΒ και στους νευρώνες που προστέθηκε θρεπτικό μέσο αναφοράς συγκρίθηκαν με Student's t test ή Mann Whitney. Τιμές του p 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. 46

50 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Βελτιστοποιήσεις συνθηκών προς την επίτευξη μακροπρόθεσμων καλλιεργειών εμβρυικών νευρώνων του φλοιού ποντικού. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ώστε να επιτευχθούν ο καλύτερες δυνατές συνθήκες καλλιέργειας των εμβρυικών νευρώνων του φλοιού έτσι ώστε να διατηρηθούν τα κύτταρα υγιή τουλάχιστον μέχρι την 16η ημέρα καλλιέργειας in vitro (DIV 16). Με βάση τη βιβλιογραφία οι νευρώνες του φλοιού μετά τη 12η ημέρα in vitro (DIV 12) διατηρούνται σε θρεπτικό μέσο χωρίς εμβρυικό ορό βοοειδούς (FBS) [147]. Για να διερευνήσουμε αν ο εμβρυικός ορός βοοειδούς αποτελεί τοξικό παράγοντα για την καλλιέργεια μετά τη 12 ημέρα ή αν η καλλιέργεια των νευρώνων παύει απλά να εξαρτάται από τον ορό για τη διατήρησή της πραγματοποιήθηκε παρατήρηση της βιωσιμότητας των νευρώνων σε διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Συγκεκριμένα εμβρυικοί νευρώνες του φλοιού καλλιεργήθηκαν στο προβλεπόμενο θρεπτικό μέσο μέχρι την 10η ημέρα in vitro όπου στη συνέχεια το θρεπτικό τους μέσο αντικαταστήθηκε κατά 75% από θρεπτικό μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό, ή χωρίς ορό αλλά με Β27, έναν εμπορικό αυξητικό παράγοντα νευρώνων, ή χωρίς ορό βοοειδούς αλλά με ορό αλόγου (HS) 5%, ή με 2% ορό βοοειδούς και 2% ορό αλόγου, ή από το προβλεπόμενο θρεπτικό μέσο. Σε κάποια φρεάτια το θρεπτικό μέσο δεν αντικαταστήθηκε καθόλου, σε κάποια άλλα έγινε σταδιακή αφαίρεση του ορού, ενώ σε κάποια άλλα πραγματοποιήθηκε η αλλαγή των συνθηκών τη 12η ημέρα in vitro αντί για τη 10η. Το πείραμα τερματίστηκε την 20η ημέρα in vitro. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε καλή κατάσταση μέχρι την 20η ημέρα ανεξαρτήτως συνθηκών καλλιέργειας. Ωστόσο, τα κύτταρα στα οποία αφαιρέθηκε ο ορός, είτε σταδιακά είτε απευθείας, ήταν σε ελαφρώς καλύτερη κατάσταση από εκείνα που είχαν ορό. Επιπροσθέτως, αλλαγή του θρεπτικού τους υλικού κατά τη 10η ημέρα και έπειτα κατά την 14η κρίθηκε ότι ήταν ευνοϊκή για τα κύτταρα. Επομένως, ο ορός δεν αποτελεί τοξικό παράγοντα για τα κύτταρα μετά τη 12η ημέρα in vitro και επιπλέον ο ορός παύει να είναι απαραίτητος για τα κύτταρα ήδη από την 10η ημέρα καλλιέργειας. Επιπλέον, πειράματα σε κύτταρα 9ης ημέρας καλλιέργειας έδειξαν ότι μπορούν να διατηρηθούν και από DIV 9 χωρίς ορό. Αυτά τα αποτελέσματα στηρίζουν τη δημιουργία ερευνητικών πρωτοκόλλων στα οποία μέσο καλλιέργειας ΜΒ χωρίς ορό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μακροπρόθεσμες καλλιέργειες νευρώνων. 47

51 Το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ΜΒ προκαλεί νευροπροστασία από τη διεγερσιτοτοξικότητα του γλουταμινικού οξέος σε καλλιέργειες εμβρυικών νευρώνων φλοιού ποντικού Η διεγερσιτοξικότητα του NMDA, η οποία προκαλείται από την εισροή ιόντων ασβεστίου μέσω του NMDA υποδοχέα, χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο νευροεκφυλισμού στους εμβρυικούς νευρώνες του φλοιού ποντικού. Οι νευρώνες έγιναν ευαίσθητοι στον NMDA από την 10η ημέρα in vitro [147] και μάλιστα διαπιστώθηκε ότι όσο αυξάνεται η ημέρα της καλλιέργειας τα κύτταρα γίνονται όλο και πιο ευαίσθητα στον θάνατο που προκαλείται από τον NMDA φτάνοντας θάνατο της τάξης του 100% όταν ο NMDA προστίθεται σε καλλιέργεια 19ης ημέρας in vitro για 24 ώρες. Ο NMDA προκάλεσε τον διεγερσιτοτοξικό θάνατο των νευρώνων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, όπως έδειξε το WST-1 assay 24 ώρες μετά την επώαση των κυττάρων. Η ενεργότητα της μιτοχονδριακής δεϋδρογονάσης ήταν μειωμένη ενώ ο θάνατος των νευρώνων αναστάλθηκε από τον μη- ανταγωνιστικό ανταγωνιστή του NMDA υποδοχέα, MK-801 (Εικόνα 1Α). Σε όλα τα πειράματα διεγερσιτοτοξικότητας σε εμβρυικούς νευρώνες φλοιού που ακολούθησαν ο NMDA προστέθηκε σε συγκέντρωση 50μΜ μαζί με 10μΜ γλυκίνη για 24 ώρες. Εξετάστηκε επίσης αν η διεγερσιτοτοξική δράση του NMDA επηρεάζεται όταν οι νευρώνες καλλιεργούνται σε διαφορετικές συνθήκες (βλέπε προηγούμενη παράγραφο) και βρέθηκε ότι παραμένει ανεπηρέαστη (Εικόνα 1Β). Έπειτα ορίσαμε ότι το θρεπτικό μέσο ΜΒ που θα συλλεχθεί από καλλιέργεια των ΜΒ για 24 ώρες θα παραμείνει στην καλλιέργεια των εμβρυικών νευρώνων του φλοιού ποντικού για 7 ημέρες έτσι ώστε να παρατηρηθούν οι πιθανές αλλαγές που προκαλούν οι διαλυτοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα ΜΒ στους νευρώνες. Το θρεπτικό μέσο ΜΒ θα προστεθεί στην καλλιέργεια των νευρώνων την 9η ημέρα in vitro (DIV 9) οπού θα θεωρηθεί ως ημέρα 0 (DAY 0) και θα παραμείνει για 7 ημέρες. Μετά από 2 (DIV 11), 5 (DIV 14) και τέλος 7 (DIV 16) ημέρες από την προσθήκη του θρεπτικού μέσου ΜΒ θα μελετώνται οι πιθανές αλλαγές στους νευρώνες σε μορφολογικά και λειτουργικά επίπεδα όπως επίσης και σε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Προκειμένου να διατηρηθούν οι νευρώνες σε όσο το δυνατόν καλύτερη κατάσταση το διάστημα των 7 ημερών που θα παραμείνουν με το θρεπτικό μέσο ΜΒ έγινε έλεγχος της νευροπροστασίας θρεπτικού μέσου ΜΒ που έχει συλλεχθεί έπειτα από καλλιέργεια των ΜΒ σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες. Αυτά τα ΜΒ που καλλιεργήθηκαν χωρίς ορό παρέμειναν ζωντανά, αλλά μορφολογικά δεν φαίνονταν υγιή καθώς είχαν συρρικνωθεί και οι κυτταροπλασματικές αποφυάδες τους είχαν τραβηχτεί προς το σώμα του κυττάρου. Το θρεπτικό μέσο από αυτά τα ΜΒ αποδείχτηκε ότι δεν είναι νευροπροστατευτικό αφού δεν προστατεύει τις καλλιέργειες των νευρώνων από τον θάνατο που προκαλεί ο NMDA όπως 48

52 αποδεικνύεται από την χρώση Hoechst και την επακόλουθη μέτρηση των πυκνωτικών πυρήνων, όπως επίσης και από τη μέτρηση της γαλακτικής δεϋδρογονάσης μέσω της μεθόδου LDH (Εικόνα 2). Η πειραματική διαδικασία που χρησιμοποιούσαμε κάθε φορά για τον έλεγχο της νευροπροστατευτικότητας κατά του NMDA ήταν συγκεκριμένη και περιελάμβανε την τοποθέτηση του θρεπτικού μέσου ΜΒ στους νευρώνες την 9 η ημέρα καλλιέργειας in vitro (ώρα 0), την προσθήκη του NMDA μετά από 24 ώρες και τη μέτρηση του θανάτου μετά από 48 ώρες. Εικόνα 1: Έλεγχος διεγερσιτοτοξικής δράσης του NMDA σε διάφορες συνθήκες in vitro. Ο διεγερσιτοτοξικός η θάνατος την 10 ημέρα καλλιέργειας in vitro στις πρωτογενείς καλλιέργειες εμβρυικών νευρώνων φλοιού ποντικού (Ν) καθορίστηκε από τη μέτρηση των μειωμένων επιπέδων της ενεργότητας της μιτοχονδριακής δεϋδρογονάσης σύμφωνα με WST-1 assay (Α) και των αυξημένων ποσοστών των πυκνωτικών πυρήνων με τη χρώση Hoechst (Β). (Α) Ο NMDA προστέθηκε (50 μμ ή 100 μμ) προστέθηκε μαζί με γλυκίνη (10μΜ) και προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενο διεγερσιτοτοξικό θάνατο των νευρώνων ο οποίος αναστάλθηκε με τον ΜΚ801 (10μΜ), έναν εξειδικευμένο αναστολέα του NMDA. 50μM NMDA μαζί με 10μΜ γλυκίνης επιλέχθηκαν για όλα τα επόμενα πειράματα διεγερσιτοτοξικότητας σε νευρώνες φλοιού ποντικού. (Β) Διεγερσιτοτοξικός θάνατος από NMDA σε νευρώνες που καλλιεργούνται στο προβλεπόμενο θρεπτικό υλικό καλλιέργειας νευρώνων φλοιού με εμβρυικό ορό βοειδούς και ορό αλόγου (FBS), χωρίς (-FBS) ή χωρίς αλλά με Β27, ένα συμπλήρωμα θρεπτικού υλικού απαλλαγμένο από ορό (Β27). Η διεγερσιτοτοξική δράση του NMDA παραμένει ανεπηρέαστη από τις συγκεκριμένες συνθήκες καλλιέργειας των νευρώνων σύμφωνα με τη μέτρηση των πυκνωτικών πυρήνων με τη χρώση Hoechst. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσοι όροι +/- το τυπικό σφάλμα από διπλά δείγματα (Α) ή τριπλά δείγματα (Β) ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος. *, p<0,05, **, p<0,005, ***, p<0,001 για τις συγκρίσεις που δείχνονται. 49

53 Εικόνα 2: Θρεπτικό μέσο από 24ωρη καλλιέργεια ΜΒ σε θρεπτικό υλικό χωρίς ορό (εμβρυικό βοειδούς ή αλόγου) δεν προστατεύει τους νευρώνες ποντικού από διεγερσιτοτοξικό θάνατο γλουταμινικού in vitro. Το θρεπτικό μέσο ΜΒ (MSC-CM) προστίθεται στους πρωτογενείς νευρώνες φλοιού ποντικού (Ν) την 9 ημέρα καλλιέργειας in vitro και μετά η από 24 ώρες (10 ημέρα καλλιέργειας) προστίθενται 50μΜ NMDA και 10 μμ γλυκίνης. 24 ώρες μετά μελετάται ο διεγερσιτοτοξικός θάνατος με βάση τη μέτρηση των ποσοστών των πυκνωτικών πυρήνων με τη χρώση Hoechst (Α,B) και της γαλακτικής δεϋδρογονάσης (Γ) με τη μέθοδο LDH. Ο διεγερσιτοτοξικός θάνατος αναστέλλεται από τον ΜΚ801 (10μΜ). (Α) Θρεπτικό μέσο ΜΒ που αναπτύσσονται για 24ώρες χωρίς ορό (-FBS) ή χωρίς όρο αλλά με Β27 (-FBS+B27), ενός συμπληρώματος απαλλαγμένο από ορό (Β), δεν προστατεύει τους νευρώνες από το διεγερσιτοτοξικό θάνατο του NMDA σύμφωνα με τα αυξημένα ποσοστά πυκνωτικών πυρήνων (Α,Β) με Hoechst και της γαλακτικής δευδρογονάσης με LDH (Γ). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται προέρχονται από το μέσο όρο +/- το τυπικό σφάλμα από διπλά δείγματα (Β) ή τριπλά δείγματα (Α,Γ) ενός (Β,Γ) ή ενός αντιπροσωπευτικού εκ των δύο (Β,Γ) πειραμάτων. *, p<0,05, **, p<0,005, ***, p<0,001 για τις συγκρίσεις που δείχνονται. Αντιθέτως το θρεπτικό μέσο ΜΒ που προέρχεται από 24ωρη καλλιέργεια ΜΒ σε θρεπτικό μέσο με ορό αποδείχτηκε νευροπροστατευτικό σύμφωνα με τη διατήρηση της 50

54 ενεργότητας της μιτοχονδριακής δεϋδρογονάσης στο WST-1 assay και το μειωμένο αριθμό πυκνωτικών πυρήνων με τη χρώση Hoechst σε σχέση με τα κύτταρα αναφοράς (Εικόνα 3). Η μέθοδος LDH δεν μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της νευροπροστατευρικότητας αυτών των θρεπτικών μέσων ΜΒ καθώς ο ορός που περιέχουν διαστρεβλώνει τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου. Τα διαφορετικά θρεπτικά μέσα ΜΒ χρειαζόταν να ελεγχθούν κάθε φορά για τις νευροπροστατευτικές τους ιδιότητες καθώς φαίνεται ότι δείχνουν διαφορετικά επίπεδα νευροπροστασίας. Η μέθοδος ρουτίνας που χρησιμοποιήσαμε για αυτόν το σκοπό ήταν η χρώση Hoechst και η επακόλουθη μέτρηση των πυκνωτικών πυρήνων. Εικόνα 3. Οι παράγοντες που εκκρίνονται από τα ΜΒ προστατεύουν τους νευρώνες του φλοιού από τον η γλουταμινικό διεγερσιτοτοξικό θάνατο in vitro. O διεγερσιτοτοξικός θάνατος τη 10 ημέρα in vitro σε πρωτογενείς νευρώνες του φλοιού ποντικού (N) καθορίστηκε από τη μέτρηση των μειωμένων επιπέδων της ενεργότητας της μιτοχονδριακής δεϋδρογονάσης σύμφωνα με το WST-1 assay (Α) και των αυξημένων ποσοστών των πυκνωτικών πυρήνων με τη χρώση Hoechst (Β). Οι νευρώνες που καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες με θρεπτικό μέσο ΜΒ (Ν+MSCCM) προστατεύτηκαν από το διεγερσιτοτοξικό θάνατο του NMDA (50μΜ NMDA και 10μΜ γλυκίνη) σύμφωνα με το WST-1 assay (A) και το Hoechst (B). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται προέρχονται από το μέσο όρο +/- το τυπικό σφάλμα από τριπλά δείγματα ενός αντιπροσωπευτικού εκ των τριών (Α) ή εκ των τεσσάρων (Β) πειραμάτων. *,p<0,05, **, p<0,005, ***, p<0,001 για τις συγκρίσεις που δείχνονται. 51

55 Τα ΜΒ μειώνουν την είσοδο των ιόντων ασβεστίου που επάγεται από το γλουταμινικό οξύ Για να διαπιστώσουμε την πιθανή επίδραση των ΜΒ στις λειτουργίες των νευρώνων μετρήσαμε την επίδραση του θρεπτικού μέσου των ΜΒ στην εισροή ιόντων ασβεστίου που προκαλεί το γλουταμινικό οξύ σε εμβρυικούς νευρώνες του φλοιού ποντικού. Συγκεκριμένα, σε καλλιέργεια νευρώνων 9ης ημέρας προστέθηκε θρεπτικό μέσο ΜΒ και έπειτα από 24 ώρες προστέθηκαν 100 μm NMDA (και 10μΜ γλυκίνη) για 12 επιπλέον ώρες αφού σύμφωνα με τη Βούλγαρη-Κόκοτα και τους συνεργάτες της η έκθεση σε NMDA ήταν απαραίτητη για την επαγωγή της συνεχής έκφρασης των υπομονάδων του NMDAR και την εισροή ιόντων ασβεστίου που επάγεται από το γλουταμινικό οξύ σε γαγγλιακά κύτταρα αμφιβληστροειδούς (ΓΚΑ) από αρουραίο [142]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα ΜΒ επέφεραν παρόμοιες λειτουργικές τροποποιήσεις στους εμβρυικούς νευρώνες του φλοιού ποντικού σε σχέση με τα ΓΚΑ αρουραίου. Μετρήσεις της αύξησης των ιόντων ασβεστίου που επάγεται από το γλουταμινικό οξύ με απεικόνιση Fura Red και Fluo-4 έδειξε ότι η εισροή ιόντων ασβεστίου αναστάλθηκε σε μεγάλο βαθμό σε επωασμένους νευρώνες με θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ΜΒ σε αντίθεση με τους νευρώνες αναφοράς. Επομένως, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα ΜΒ παράγουν διαλυτούς παράγοντες που επάγουν νευροπροστασία κατά της διεγερσιτοτοξικότητας του γλουταμινικού οξέος λόγω της μειωμένης εισόδου ασβεστίου από τους γλουταμινικούς υποδοχείς. (Εικόνα 7Γ) Το θρεπτικό μέσο ΜΒ εμποδίζει την μείωση των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων σε νευρωνικές καλλιέργειες και μειώνει την έκφραση των υπομονάδων GluR1 των AMPA γλουταμινικών υποδοχέων στις μεμβράνες των νευρώνων. Με σκοπό να προσδιορίσουμε αν η μακροπρόθεσμη επώαση των εμβρυικών νευρικών κυττάρων του φλοιού με θρεπτικό μέσο ΜΒ έχει επιπτώσεις στη μορφολογία των νευρώνων είτε στην εκπροσώπηση των διαφορετικών κυτταρικών τύπων μέσα στην καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκαν ειδικά κυτταρικά αντισώματα δείκτες. Καλλιέργειες νευρώνων αναπτύχθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες και χρώσθηκαν με αντισώματα έναντι πρωτεϊνώνδεικτών όπως το anti-neuronal nuclei (NeuN) για τους μετα-μιτωτικούς νευρώνες, το anti-gfap για τα ώριμα αστροκύτταρα και νέους νευρώνες, το anti-ng2 για τα πρόδρομα ολιγοδενδροκύτταρα (και ίσως για τα νευρικά βλαστοκύτταρα) και το anti-glur1 για την υπομονάδα GluR1 των AMPA υποδοχέων. Όπως αναφέραμε και προηγουμένως, το θρεπτικό μέσο ΜΒ προστέθηκε την 9η ημέρα καλλιέργειας in vitro των νευρώνων (ημέρα 0) και παρέμεινε για 7 ημέρες. Μετά από 2 (DIV 11), 5 (DIV 14) και τέλος 7 (DIV 16) ημέρες από την 52

56 προσθήκη του θρεπτικού μέσου ΜΒ πραγματοποιήθηκε η χρώση με τα αντισώματα έναντι των παραπάνω πρωτεϊνικών δεικτών. Όσον αφορά το δείκτη NeuN o αριθμός των κυττάρων που χρώσθηκε αναλογικά με το συνολικό αριθμό των πυρήνων που χρώσθηκαν με DAPI δε διέφερε στα κύτταρα σε θρεπτικό μέσο ΜΒ και στο θρεπτικό μέσο αναφοράς. (Εικόνα 4). Επιπλέον, η μορφολογία των νευρώνων δεν τροποποιήθηκε με την προσθήκη θρεπτικού μέσου ΜΒ. Επομένως, ουσίες που εκκρίνονται από τα ΜΒ δεν μεταβάλουν τον αριθμό ή τη μορφολογία των καλλιεργούμενων νευρώνων. Εικόνα 4. Θρεπτικό μέσο ΜΒ δεν μεταβάλει τον αριθμό ή τη μορφολογία των καλλιεργούμενων νευρώνων. Το η μέσο ΜΒ (MSC-CM) προστέθηκε στην καλλιέργεια πρωτογενών νευρώνων του φλοιού ποντικού (Ν) την 9 ημέρα in vitro (DIV 9) οπού θεωρήθηκε ως ημέρα 0 (DAY 0). Μετά από 2 (DIV 11) και 7 (DIV 16) ημέρες από την προσθήκη του θρεπτικού μέσου ΜΒ μελετήθηκαν με ανοσοκυτταροχημεία και χρώση NeuN ο αριθμός των νευρώνων. Το ίδιο πειραματικό πρωτόκολλο τηρήθηκε και στα ακόλουθα πειράματα. (Α) Ποσοστά των πυρήνων που χρώσθηκαν με NeuN προς το σύνολο των πυρήνων με χρώση DAPI σε νευρώνες φλοιού χωρίς θρεπτικό μέσο (Ν) και σε εκείνους που προστέθηκε θρεπτικό μέσο ΜΒ (N+MSC-CM). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται προέρχονται από το μέσο όρο +/- το τυπικό σφάλμα 10 τυχαία επιλεγμένων οπτικών πεδίων από ένα αντιπροσωπευτικό εκ των δύο (Β,Γ) πειραμάτων. 53

57 Η χρώση με το δείκτη anti-gfap έδειξε ότι στα κύτταρα με θρεπτικό μέσο αναφοράς τα επίπεδα των GFAP+ κυττάρων μειώθηκαν κατά 2/3 την 2η ημέρα του πειράματος (DIV 11) και σχεδόν μηδενίστηκαν την 7η ημέρα (DIV 16), ενώ στα κύτταρα που επωάστηκαν με θρεπτικό μέσο ΜΒ είχαμε μια σχετική διατήρηση των επιπέδων των GFAP+ κυττάρων, τα οποία μειώθηκαν μόνο κατά 1/3 τη 2η ημέρα(div 11). Σε όλα τα πειράματα η αραβινόζη-c (ara C) που αναστέλλει την ανάπτυξη των αστροκυττάρων είχε προστεθεί στην καλλιέργεια 3 ημέρες πριν την έναρξη του πειράματος (DIV 6) και αφαιρέθηκε όταν ξεκίνησε το πείραμα. Όταν επαναλάβαμε το πείραμα αλλά προσθέσαμε λίγο μικρότερη ποσότητα ara-c (8μΜ), για να διατηρηθούν τα αστροκύτταρα και την 7η ημέρα του πειράματος (DIV 16),διαπιστώσαμε ότι στα κύτταρα με το θρεπτικό μέσο αναφοράς τα επίπεδα των GFAP+ κυττάρων παραμένουν σταθερά με το χρόνο και ίσως μειώνονται την 7η ημέρα του πειράματος (DIV 16), ενώ στα κύτταρα που προστέθηκε θρεπτικό μέσο ΜΒ φαίνεται μια μικρή αύξηση των επιπέδων των GFAP+ κυττάρων η οποία ξεκινάει από τη 2η ημέρα και διατηρείται και την 7η ημέρα (DIV 16). Επομένως, παράγοντες που εκκρίνονται από τα ΜΒ βοηθούν τα αστροκύτταρα να επανακάμψουν μετά την αφαίρεση του ara-c και έτσι διατηρούνται σε κάποιο βαθμό τα επίπεδα των αστροκυττάρων όσο αυξάνεται η ημέρα της καλλιέργειας συγκριτικά με τα κύτταρα αναφοράς, ή ακόμα όταν στα κύτταρα αναφοράς τα επίπεδα των αστροκυττάρων παραμένουν σταθερά με το πέρασμα του χρόνου το μέσο ΜΒ συνεισφέρει σε μία ελαφριά αύξηση των αστροκυττάρων (Εικόνα 5). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι σε αυτή τη μελέτη ένα ποσοστό κυττάρων NG2+ της τάξεως του 5% παρατηρήθηκε στις πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων. Το NG2 χρησιμοποιείται συνήθως σαν δείκτης των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων αλλά εκφράζεται επίσης και στα περικύτταρα στον εγκέφαλο και πιθανώς και στα νευρικά βλαστοκύτταρα. Παρόλο που η ακριβής ταυτότητα αυτών των NG2+ κυττάρων αναμένεται να εξακριβωθεί σε μελλοντικές μελέτες, στην παρούσα εργασία έδειξαν χαρακτηριστική μορφολογία προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων (Εικόνα 6) επομένως τα αναφέρουμε ως πρόδρομα ολιγοδενδροκύτταρα παρακάτω. Επιπλέον, θετική επίδραση είχε το θρεπτικό μέσο ΜΒ στα κύτταρα που χρώσθηκαν με anti-ng2. Ενώ στα κύτταρα με το θρεπτικό μέσο αναφοράς τα επίπεδα των NG2+ κυττάρων παρουσίασαν μείωση σε σχέση με το χρόνο, η οποία γίνεται ακόμη πιο έντονη την 7η ημέρα του πειράματος (DIV 16), το θρεπτικό μέσο ΜΒ βοήθησε την διατήρηση των επιπέδων των NG2 φαινόμενο το οποίο έγινε αντιληπτό μετά την παραμονή του μέσου ΜΒ στην καλλιέργεια των κυττάρων για 7 ημέρες. (Εικόνα 6Α) Επομένως, το θρεπτικό μέσο ΜΒ συνεισφέρει σε μια σχετική διατήρηση των επιπέδων των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων στην καλλιέργεια των νευρώνων όσο αυξάνεται η ημέρα της καλλιέργειας. 54

58 Όσον αφορά το δείκτη GluR1 πραγματοποιήθηκαν 2 διαφορετικές διαδικασίες χρώσης. Στην πρώτη το Blocking buffer είχε την κανονική σύσταση με περιεκτικότητα σε Triton 0,3% για τη διείσδυση του αντισώματος και στο εσωτερικό του κυττάρου, ενώ στη δεύτερη χρώση δε χρησιμοποιήθηκε Triton έτσι ώστε να δεσμευτεί το αντίσωμα μόνο στη μεμβράνη των κυττάρων (μεμβρανικό GluR1). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της πρώτης χρώσης δε φαίνεται να υπάρχουν σημαντικές διαφορές στα ολικά επίπεδα του GluR1 ανάμεσα στα κύτταρα που παρέμειναν με θρεπτικό μέσο ΜΒ και στα κύτταρα αναφοράς (Εικόνα 7Α). Όμως, αυτό που διαπιστώθηκε κατόπιν παρατήρησης στο συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού από τομές στη μέση των κυττάρων ήταν ότι το GluR1 φαινόταν να εντοπίζεται σε διαφορετικές θέσεις στα κύτταρα με θρεπτικό μέσο ΜΒ σε σχέση με τα κύτταρα με θρεπτικό μέσο αναφοράς και συγκεκριμένα στα κύτταρα με θρεπτικό μέσο ΜΒ οι υπομονάδες GluR1 συγκεντρώνονταν στο εσωτερικό του κυττάρου ακριβώς μέσα από την πλασματική μεμβρανη. Για αυτό το λόγο πραγματοποιήσαμε τη δεύτερη διαδικασία χρώσης, σύμφωνα με την οποία το θρεπτικό μέσο ΜΒ μείωσε σε μεγάλο βαθμό την παρουσία του μεμβρανικού GluR1 σε σχέση με τα κύτταρα αναφοράς (Εικόνα 7Β). Η μείωση αυτή παρατηρήθηκε από την 5η ημέρα παρουσίας του θρεπτικού μέσου ΜΒ στην καλλιέργεια των κυττάρων. Επομένως, οι διαλυτοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα ΜΒ μειώνουν την έκφραση ή τη στρατολόγηση των AMPA υποδοχέων στη εξωτερική μεμβράνη των νευρικών κυττάρων. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ημιποσοτική qrt-pcr για να συγκρίνουμε στους ίδιους χρόνους στις 2 ομάδες κυττάρων την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν Snap 25, η οποία είναι μία πρωτεΐνη SNARE που συμμετέχει στη ρύθμιση της συναπτικής επικοινωνίας μεταξύ των νευρώνων, και Olig2 ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την γένεση των ολιγοδενδροκυττάρων από νευρικά πρόδρομα κύτταρα και εκφράζεται φυσιολογικά στα ώριμα ολιγοδενδροκύτταρα και στα εμβρυονικά πρόδρομα ολιγοδενδροκύτταρα [148]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας τα επίπεδα του δείκτη Snap 25 ήταν παρόμοια στα κύτταρα που επωάστηκαν με θρεπτικό μέσο ΜΒ και σε αυτά που επωάστηκαν με θρεπτικό μέσο αναφοράς δείχνοντας ότι διαλυτοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα ΜΒ δεν φαίνεται να επηρεάζουν την ακεραιότητα των συνάψεων των νευρώνων στην καλλιέργεια επιβεβαιώνοντας ότι η μακροπρόθεσμη καλλιέργεια νευρώνων του φλοιού με θρεπτικό μέσο ΜΒ δεν αλλάζει το γενικό φαινότυπο των νευρώνων. Όσον αφορά το δείκτη Olig2 υπάρχει μια τάση αύξησης των επιπέδων του τη 2η ημέρα καλλιέργειας των νευρώνων με θρεπτικό μέσο ΜΒ και μία ακόλουθη τάση μείωσης του δείκτη αυτού στην 5η ημέρα συγκριτικά με τους νευρώνες αναφοράς (Εικόνα 6Β). Αυτή η τάση αύξησης του δείκτη Olig2 ενισχύει το αποτέλεσμα της ανοσοκυτταροχημείας όσον αφορά το δείκτη NG2. 55

59 Επομένως, τα ΜΒ προκαλούν μία τάση αύξησης του μεταγραφικού παράγοντα που ρυθμίζει τη γένεση των ολιγοδενδροκυττάρων από νευρικά πρόδρομα κύτταρα και μια επακόλουθη αύξηση των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων. Εικόνα 5. Τα επίπεδα των αστροκυττάρων διατηρούνται από την παρουσία του θρεπτικού μέσου ΜΒ στην καλλιέργεια των νευρώνων in vitro. 2 (DIV 11), 5 (DIV 13) και 7 (DIV 16) ημέρες μετά από την προσθήκη του θρεπτικού μέσου ΜΒ (MSC-CM) στην καλλιέργεια των πρωτογενών νευρώνων του φλοιού ποντικού (Ν) μελετήθηκαν με ανοσοκυτταροχημεία τα επίπεδα των κυττάρων που βάφτηκαν με χρώση GFAP προς το σύνολο των κυττάρων που χρώσθηκαν με DAPI. (A) Το θρεπτικό μέσο ΜΒ διατηρεί σε κάποιο βαθμό τα επίπεδα των GFAP+ κυττάρων κυρίως την ημέρα 2 (DIV 11) του πειράματος. Η αραβινόζη-c (ara-c) προστέθηκε στους νευρώνες την 6 ημέρα καλλιέργειας (DIV 6) σε συγκέντρωση 10μΜ. (Β) Όταν προστεθεί μικρότερη συγκέντρωση ara-c στα κύτταρα η την 6 ημέρα καλλιέργειας(div 6) φαίνεται ότι το θρεπτικό μέσο ΜΒ αυξάνει σε κάποιο βαθμό τα επίπεδα των + η GFAP κυττάρων ή αλλιώς συνεισφέρει στην επανάκαμψη τους μετά την αφαίρεση του ara-c την 9 ημέρα καλλιέργειας όπου ξεκινάει το πείραμα (Day 0). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται προέρχονται από το μέσο όρο +/- το τυπικό σφάλμα 10 τυχαία επιλεγμένων οπτικών πεδίων από ένα πείραμα (Α) ή ένα αντιπροσωπευτικό εκ των δύο πειραμάτων (Β,Γ). **, p<0,005, ***, p<0,001 για τις συγκρίσεις που δείχνονται. 56

60 Εικόνα 6. Θρεπτικό μέσο ΜΒ συνεισφέρει στη διατήρηση των επιπέδων των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων στην καλλιέργεια των νευρώνων. 2 (DIV 11), 5 (DIV 13) και 7 (DIV 16) ημέρες μετά από την προσθήκη του θρεπτικού μέσου ΜΒ (MSC-CM) στους πρωτογενείς νευρώνες φλοιού ποντικού (Ν) μελετήθηκαν με ανοσοκυτταροχημεία τα επίπεδα των κυττάρων που βάφτηκαν με χρώση NG2 προς το σύνολο των κυττάρων που χρώσθηκαν με DAPI (Α) όπως επίσης μελετήθηκαν και τα επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα Οlig2, ο οποίος ρυθμίζει τη γένεση των ολιγοδενδροκυττάρων από νευρικά πρόδρομα κύτταρα, με RT-PCR (Β). (Α) Νευρώνες του φλοιού στους οποίους η προστέθηκε θρεπτικό μέσο ΜΒ διατηρούν τα επίπεδα των προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων κυρίως την 7 ημέρα μετά την προσθήκη μέσου ΜΒ (DIV 16) όπως έδειξε η ανοσοκυτταροχημεία. (Β) RT-PCR για Οlig2 που φανερώνει μια τάση των νευρώνων που καλλιεργούνται με μέσο ΜΒ (Ν+MSC-CM) να αυξάνουν ελαφρώς το μεταγραφικό η παράγοντα Olig2 την 2 ημέρα του πειράματος (DIV 14) σε σχέση με τα κύτταρα αναφοράς. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται προέρχονται από το μέσο όρο +/- το τυπικό σφάλμα από 10 τυχαία επιλεγμένα οπτικά πεδία ενός αντιπροσωπευτικού εκ των τριών πειραμάτων (Α) και από το μέσο όρο +/- τυπικό σφάλμα τριών πειραμάτων (Β). *, p<0,05, ***, p<0,001 για τις συγκρίσεις που δείχνονται. 57

61 Εικόνα 7. Η νευροπροστασία από το θρεπτικό μέσο ΜΒ εμπλέκει τη μείωση της έκφρασης των μεμβρανικών GluR1 υπομονάδων και της ανταπόκρισης του ασβέστιου στο γλουταμινικό οξύ. 2 (DIV 11), 5 (DIV 13) και 7 (DIV 16) ημέρες μετά από την προσθήκη του θρεπτικού μέσου ΜΒ (MSC-CM) στην καλλιέργεια των πρωτογενών νευρώνων του φλοιού ποντικού (Ν) μελετήθηκαν με ανοσοκυτταροχημεία η ένταση φθορισμού του GluR1. (A) Τα ολικά επίπεδα του GluR1 ανάμεσα στα κύτταρα που παρέμειναν με θρεπτικό μέσο ΜΒ (Ν+MSC-CM) και στα κύτταρα αναφοράς (N) δεν παρουσίασαν διαφορά. (Β) το θρεπτικό μέσο ΜΒ μείωσε σε μεγάλο βαθμό την παρουσία των η μεμβρανικών υπομονάδων GluR1 σε σχέση με τα κύτταρα αναφοράς φαινόμενο το οποίο έγινε έντονο την 7 ημέρα του πειράματος (DIV 16). Για να δεσμευτεί το αντίσωμα μόνο στη μεμβράνη των κυττάρων δε χρησιμοποιήθηκε καθόλου Triton κατά τη διαδικασία χρώσης. (Γ) Απεικόνιση ιόντων ασβεστίου ύστερα από 2+ επαγωγή με γλουταμινικό οξύ, όπως μετρήθηκαν από τη σήμανση με Fura-Red για το ελεύθερο Ca και Fluo-4 για 2+ το Ca στο εσωτερικό του κυττάρου σε νευρώνες που καλλιεργήθηκαν με θρεπτικό μέσο ΜΒ (Ν+MSC-CM) ή χωρίς (N) και με προσθήκη NMDA για 12 ώρες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται προέρχονται από το μέσο όρο +/το τυπικό σφάλμα από 6 τυχαία επιλεγμένα οπτικά πεδία και ανάλυση 5 κύτταρων από κάθε πεδίο ενός πειράματος (Α,Β) και από το μέσο όρο +/- τυπικό σφάλμα τριών πειραμάτων από ένα αντιπροσωπευτικό εκ των τεσσάρων πειραμάτων (Γ). ***, p<0,001 για τις συγκρίσεις που δείχνονται. 58