ΡΟΛΟ ΣΨΝ ΥΛΕΓΜΟΝΨΔΨΝ ΠΑΡΑΓΟΝΣΨΝ ΣΗΝ ΑΝΑΠΣΤΞΗ ΣΨΝ ΕΠΙΠΛΟΚΨΝ ΣΟΤ ΙΝΟΤΛΙΝΟ- ΕΞΑΡΣΨΜΕΝΟΤ ΑΚΦΑΡΨΔΗ ΔΙΑΒΗΣΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΨΝ ΙΑΣΡΙΚΗ ΦΟΛΗ Π.Μ.. ςτισ ΒΑΙΚΕ ΙΑΣΡΙΚΕ ΕΠΙΣΗΜΕ ΡΟΛΟ ΣΨΝ ΥΛΕΓΜΟΝΨΔΨΝ ΠΑΡΑΓΟΝΣΨΝ ΣΗΝ ΑΝΑΠΣΤΞΗ ΣΨΝ ΕΠΙΠΛΟΚΨΝ ΣΟΤ ΙΝΟΤΛΙΝΟ- ΕΞΑΡΣΨΜΕΝΟΤ ΑΚΦΑΡΨΔΗ ΔΙΑΒΗΣΗ Κουτρουμϊνη Κων. Νικολύτςα (Α.Μ.: 1467) ΠΑΣΡΑ ΙΟΤΛΙΟ 2010

2 1 Αφιερωμένο εξαιρετικά στην οικογένεια και τους φίλους μου, που με στήριξαν και συνεχίζουν να με στηρίζουν σε κάθε μου βήμα

3 2 ΕΠΙΒΛΕΠΨΝ ΚΑΘΗΓΗΣΗ: Πϋτρου Παπαδϊκη Ελϋνη, Αναπληρώτρια Καθηγότρια Ανατομύασ, Διευθϑντρια Εργαςτηρύου Ανατομύασ Ιςτολογύασ Εμβρυολογύασ, Ιατρικόσ χολόσ Πανεπιςτημύου Πατρών. ΣΡΙΜΕΛΗ ΕΞΕΣΑΣΙΚΗ ΕΠΙΣΡΟΠΗ: Ελϋνη Πϋτρου - Παπαδϊκη, Αναπληρώτρια Καθηγότρια, Διευθϑντρια Εργαςτηρύου Ανατομύασ Ιςτολογύασ Εμβρυολογύασ, Ιατρικόσ χολόσ Πανεπιςτημύου Πατρών. Βαςιλικό Γκρϋκα πηλιώτη, Καθηγότρια Παιδιατρικόσ- Παιδιατρικόσ Ενδοκρινολογύασ, Τπεϑθυνη του Εργαςτηρύου και τησ Μονϊδασ τησ Παιδιατρικόσ Ενδοκρινολογύασ και ακχαρώδουσ Διαβότη, Παιδιατρικόσ Κλινικόσ, Ιατρικόσ χολόσ Πανεπιςτημύου Πατρών. Διονϑςιοσ Παπαχρόςτου, Επύκουροσ Καθηγητόσ, Εργαςτόριο Ανατομύασ Ιςτολογύασ Εμβρυολογύασ, Ιατρικόσ χολόσ Πανεπιςτημύου Πατρών.

4 3 1. ΠΡΟΛΟΓΟ- ΠΕΡΙΛΗΧΗ

5 4 ΠΡΟΛΟΓΟ Σο κεύμενο αυτϐ αποτελεύ τη μεταπτυχιακό εργαςύα τησ φοιτότριασ Νικολύτςασ Κων. Κουτρουμϊνη, η οπούα πραγματοποιόθηκε ςτα πλαύςια του μεταπτυχιακοϑ προγρϊμματοσ των Βαςικών Ιατρικών Επιςτημών τησ Ιατρικόσ χολόσ του Πανεπιςτημύου Πατρών και ολοκληρώθηκε τον Ιοϑλιο του τϐχοσ τησ εργαςύασ εύναι η διερεϑνηςη του ρϐλου που πιθανϊ διαδραματύζουν οι διαδικαςύεσ και οι παρϊγοντεσ τησ φλεγμονόσ ςτην εγκατϊςταςη και την εξϋλιξη των επιπλοκών του Ινςουλινο-εξαρτώμενου ακχαρώδη Διαβότη ςτα παιδιϊ. Σο πειραματικϐ ςκϋλοσ τησ εργαςύασ πραγματοποιόθηκε ςτο εργαςτόριο τησ Μονϊδασ Παιδιατρικόσ Ενδοκρινολογύασ και Διαβότη, τησ Παιδιατρικόσ κλινικόσ τησ Ιατρικόσ χολόσ του Πανεπιςτημύου Πατρών, ςε ςυνεργαςύα με το εργαςτόριο τησ Ανατομύασ-Ιςτολογύασ-Εμβρυολογύασ τησ Ιατρικόσ χολόσ του Πανεπιςτημύου Πατρών. Η δειγματοληψύα ϋγινε ςε αςθενεύσ τησ κασ Βαςιλικόσ Γκρϋκα πηλιώτη, ςτα εξωτερικϊ ιατρεύα τησ Παιδιατρικόσ Ενδοκρινολογύασ του Πανεπιςτημιακοϑ Νοςοκομεύου Πατρών (ΠΠΓΝ), ϋπειτα απϐ λεπτομερό ενημϋρωςη και γραπτό ςυγκατϊθεςη των γονϋων και των αςθενών. Πριν ςυνεχύςω με την παρουςύαςη τησ εργαςύασ, κρύνω απαραύτητο να ευχαριςτόςω θερμϊ ϐλουσ ϐςουσ με ςτόριξαν και με βοόθηςαν ςτο να ολοκληρώςω τη ςυγκεκριμϋνη εργαςύα. Αρχικϊ, θα όθελα να ευχαριςτόςω θερμϊ την κα Ελϋνη Πϋτρου - Παπαδϊκη για την ευκαιρύα που μου παρεύχε να ςυνεργαςτοϑμε. Η αμϋριςτη ςυμπαρϊςταςό τησ ςυνϋβαλε ουςιαςτικϊ ςτην εκπϐνηςη και την επιτυχό ολοκλόρωςη τησ εργαςύασ μου. Πυρόνα τησ ϋμπνευςησ τησ ιδϋασ του θϋματοσ, τησ οργϊνωςησ και τησ διεκπεραύωςησ αυτόσ τησ εργαςύασ αποτϋλεςε η κα Βαςιλικό Γκρϋκα - πηλιώτη, ςτην οπούα αξύζουν ιδιαύτερεσ ευχαριςτύεσ για την ϊρτια καθοδόγηςη και την αμϋριςτη ςτόριξη που μου παρεύχε. Η πολυετόσ εμπειρύα τησ, η αγϊπη τησ για την επιςτόμη τησ Ιατρικόσ και το μοναδικϐ διδακτικϐ τησ ταλϋντο αποτϋλεςαν για εμϋνα ανεκτύμητη πηγό γνώςεων και ϋμπνευςησ. Σην ευχαριςτώ πολϑ για την εμπιςτοςϑνη και την τιμό να με ςυμπεριλϊβει ςτην ερευνητικό τησ ομϊδα. Θα όθελα επύςησ να ευχαριςτόςω τισ υπεϑθυνεσ του εργαςτηρύου, κυρύεσ Ανδρϋα Παϐλα Ρϐχασ - Φιλ και Αλεξύα Καρβϋλα, για τη βοόθειϊ τουσ ςτην εκμϊθηςη και εφαρμογό τησ εργαςτηριακόσ μεθοδολογύασ, καθώσ και την ουςιαςτικό τουσ ςυμβολό ςτην ολοκλόρωςη τησ ςυγκεκριμϋνησ εργαςύασ. Επύςησ, ευχαριςτώ τον κ. Διονϑςιο Παπαχρόςτου για την υποςτόριξη και την ενθϊρρυνςη ωσ προσ την πραγματοπούηςη τησ διπλωματικόσ μου εργαςύασ, ϐπωσ επύςησ και για τισ καινοτϐμεσ επιςτημονικϋσ του ςυμβουλϋσ. Σϋλοσ, ευχαριςτώ θερμϊ τουσ υπϐλοιπουσ φοιτητϋσ που ςτελεχώνουν το εργαςτόριο τησ Παιδιατρικόσ Ενδοκρινολογύασ για τισ πολϑτιμεσ γνώςεισ που μοιρϊςτηκαν μαζύ μου καθώσ και την ευχϊριςτη ςυνεργαςύα που αναπτϑξαμε. Ιοϑλιοσ 2010 Νικολύτςα Κων. Κουτρουμϊνη

6 5 ΠΕΡΙΛΗΧΗ Ειςαγωγό: Ο ακχαρώδησ Διαβότησ τϑπου 1 (Δ1) αποτελεύ τη ςυχνϐτερη μορφό διαβότη ςτα παιδιϊ, ςυχνϊ ςυνοδεϑεται απϐ ςοβαρϋσ μικρο- και μακροαγγειακϋσ επιπλοκϋσ ενώ, η επύπτωςό του εμφανύζει ανηςυχητικϊ αυξητικό τϊςη τισ τελευταύεσ δεκαετύεσ. Η ενεργοπούηςη των μονοκυττϊρων, η χημειοταξύα τουσ (κϑριοσ χημειοτακτικϐσ πϊραγοντασ μονοκυττϊρων: MCP-1) και η μετατροπό τουσ ςε μακροφϊγα (δεύκτησ μακροφϊγων: CD68) θεωρεύται πωσ διαδραματύζουν προεξϋχοντα ρϐλο ςτην ανϊπτυξη των διαβητικών αγγειακών αλλοιώςεων. Η πλεονϊζουςα γλυκϐζη που υπϊρχει ςτο διαβότη, αλληλεπιδρώντασ μη ενζυματικϊ με πλόθοσ υποςτρωμϊτων, προκαλεύ την παραγωγό των AGEs (τελικϊ προώϐντα προχωρημϋνησ γλυκοζυλύωςησ) τα οπούα με τη ςειρϊ τουσ αςκοϑν τισ βλαπτικϋσ τουσ δρϊςεισ, εύτε αλληλεπιδρώντασ ϊμεςα με τα μϐρια τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ ό μϋςω ςϑνδεςησ ςτουσ κυτταρικοϑσ τουσ υποδοχεύσ (κυριϐτεροσ εκπρϐςωποσ: RAGE). Η ενεργοπούηςη του RAGE, διαμϋςου τησ ενεργοπούηςησ του μεταγωγικοϑ μονοπατιοϑ τησ πρωτεώνικόσ κινϊςησ Β (Akt2/PKB) και του μεταγραφικοϑ παρϊγοντα NF-κΒ, οδηγεύ ςτην αυξημϋνη ϋκφραςη προ-φλεγμονωδών [παρϊγοντασ νϋκρωςησ ϐγκου-α (TNFα), ιντερλευκύνη-6 (IL-6)] και προθρομβωτικών παραγϐντων [ιςτικοϑ παρϊγοντα (TF)], ςυμβϊλλοντασ κατ αυτϐ τον τρϐπο ςτην εμφϊνιςη ενδοθηλιακόσ δυςλειτουργύασ. Υραγμϐ ςτισ δρϊςεισ αυτϋσ αποτελεύ η διαλυτό μορφό του RAGE, srage, η οπούα ςυνδεϐμενη με τα AGEs τα οδηγεύ προσ αποδϐμηςη και εμποδύζει την ενδοκυττϊρια ςηματοδϐτηςη που πυροδοτοϑν τα AGEs. κοπϐσ / μεθοδολογύα: Προκειμϋνου να διερευνόςουμε τον πιθανϐ ρϐλο των διεργαςιών τησ φλεγμονόσ ςτην ανϊπτυξη των διαβητικών επιπλοκών, ςε μονοπϑρηνα κϑτταρα περιφερικοϑ αύματοσ 47 προεφηβικών και εφηβικών παιδιών (ηλικύασ 4-18 ετών) και 10 νεαρών ενηλύκων (ηλικύασ ετών) με Δ1 και 39 μη διαβητικών μαρτϑρων αντύςτοιχησ ηλικύασ, μελετόςαμε: 1) με PCR τη γονιδιακό ϋκφραςη: του MCP-1, του CD68, τησ Akt2, του TNF-α, τησ IL- 6 και του RAGE, 2) με ανοςοαποτϑπωςη κατϊ Western μετρόςαμε την πρωτεώνικό ϋκφραςη τησ Akt2, του RAGE και του TF, 3) τα επύπεδα πλϊςματοσ του srage με τη μϋθοδο τησ ELISA. Αποτελϋςματα: Η μελϋτη ϋδειξε ϐτι: (1) Σο srage α) όταν αυξημϋνο ςτουσ προεφηβικοϑσ μϊρτυρεσ ςε ςϑγκριςη με τουσ εφηβικοϑσ και νεαροϑσ ενόλικεσ μϊρτυρεσ, ενώ τα επύπεδα του όταν μειωμϋνα ςτουσ προεφηβικοϑσ διαβητικοϑσ ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ και β) εύχε μύα τϊςη μεύωςησ με τα αυξανϐμενα επύπεδα τησ HbA1c. (2) Η γονιδιακό ϋκφραςη του RAGE: α) ϋτεινε να αυξηθεύ ςτουσ προεφηβικοϑσ διαβητικοϑσ και αυξανϐταν ςημαντικϊ ςτουσ νεαροϑσ ενόλικεσ διαβητικοϑσ ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ και β) ςχετιζϐταν αρνητικϊ με την HbA1c ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ >18ετών. (3) Η πρωτεώνικό ϋκφραςη και των δϑο ιςομορφών του RAGE (46kDa και 80kDa) εμφϊνιςε μύα τϊςη μεύωςησ με την εξϋλιξη τησ εφηβεύασ (προεφηβικού > εφηβικού > νεαρού ενόλικεσ) ςτουσ μϊρτυρεσ, μεταβολϋσ που ακολοϑθηςαν και οι διαβητικού αςθενεύσ, αν και τα επύπεδα ϋκφραςησ ϋτειναν να εύναι πιο υψηλϊ. (4) Η 46ΚDa ιςομορφό RAGE: α) όταν αυξημϋνη ςτου νεαροϑσ ενόλικεσ διαβητικοϑσ και μειωμϋνη ςτουσ διαβητικοϑσ >13ετών με διϊρκεια διαβότη 5 ϋτη, ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ αλλϊ και τουσ αντύςτοιχησ ηλικύασ διαβητικοϑσ με

7 6 διϊρκεια νϐςου >5 ϋτη, β) ϋτεινε να αυξηθεύ με τισ τϊξεισ HbA1c: 7%-8% τ και να μειωθεύ με τισ τϊξεισ HbA1c: 8-10%, και γ) ςυςχετύςθηκε θετικϊ με τη διϊρκεια διαβότη και με τα επύπεδα των τριγλυκεριδιών ςτο ςϑνολο των αςθενών. (5)Η 80ΚDa ιςομορφό του RAGE: α) εύχε μύα τϊςη αϑξηςησ ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ >13ετών με διϊρκεια διαβότη 5 ϋτη, ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ και τουσ διαβητικοϑσ αντύςτοιχησ ηλικύασ αλλϊ διϊρκεια νϐςου >5ϋτη, β) ςυςχετύςθηκε αρνητικϊ με την HbA1c ςε αςθενεύσ με διϊρκεια νϐςου 5ϋτη. (6) Σο MCP-1: α) ϋτεινε να αυξηθεύ ςτουσ διαβητικοϑσ ςε ςϑγκριςη με τουσ μϊρτυρεσ και ςυγκεκριμϋνα, η αϑξηςη όταν ςημαντικό ςτουσ διαβητικοϑσ με ςτϊδιο εφηβεύασ ΙΙ και V, β) ϋτεινε να αυξηθεύ με την HbA1c και αυξανϐταν ςημαντικϊ ςτουσ διαβητικοϑσ με περύμετρο κοιλύασ >75%. (7) Σο CD68: α) βρϋθηκε αυξημϋνο ςτα διαβητικϊ αγϐρια >18 ετών ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ, β) ϋτεινε να μειωθεύ ςτουσ διαβητικοϑσ >13ετών με διϊρκεια διαβότη >5ϋτη, ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχησ ηλικύασ μϊρτυρεσ και γ) ϋτεινε να μειωθεύ με τα αυξανϐμενα επύπεδα τησ HbA1c και ςτουσ διαβητικοϑσ με LDL>100 mg/dl. (8) To TNF-α ϋδειξε: α) ςημαντικό μεύωςη ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ ςε ςχϋςη με τουσ μϊρτυρεσ και ιδιαύτερα ςε αυτοϑσ που όταν 13ετών με διϊρκεια διαβότη >5 ϋτη και ςε αυτοϑσ με ηλικύα >18ετών, β) μύα τϊςη αϑξηςησ με τισ τϊξεισ HbA1c μϋχρι του 10%. (9) Η IL-6 ϋδειξε: α) ςημαντικό μεύωςη ςτουσ μϊρτυρεσ με την παρϊλληλη αϑξηςη τησ ηλικύασ, β) ςημαντικό αϑξηςη ςτουσ διαβητικοϑσ >18ετών ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ, γ) μύα τϊςη μεύωςησ ςτουσ διαβητικοϑσ 13ετών με διϊρκεια διαβότη >5ϋτη ςε ςχϋςη με τουσ ηλικιακϊ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ και δ) μύα ςημαντικό μεύωςη ςτουσ διαβητικοϑσ με HbA1c >10,1% ςε ςϑγκριςη με τισ υπϐλοιπϋσ τϊξεισ HbA1c. (10) Ο TF βρϋθηκε: α) ςημαντικϊ αυξημϋνοσ ςτα διαβητικϊ αγϐρια 13 ετών και ϋτεινε να αυξηθεύ ςτα διαβητικϊ αγϐρια >18ετών ςε ςχϋςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ, β) ςημαντικϊ μειωμϋνοσ ςτουσ διαβητικοϑσ με διϊρκεια νϐςου >5ϋτη και ϋτεινε να μειωθεύ ςτουσ διαβητικοϑσ με HbA1c>10,1% και ςε αυτοϑσ με LDL>100 mg/dl. (11) Η γονιδιακό ϋκφραςη τησ Akt2 ϋδειξε: α) ςημαντικό αϑξηςη ςτουσ προεφηβικοϑσ διαβητικοϑσ, β) ςημαντικό μεύωςη ςτουσ διαβητικοϑσ με LDL>100mg/dl και ςε αυτοϑσ με HbA1c >9%, ςε ςϑγκριςη με τουσ αντύςτοιχουσ μϊρτυρεσ. (12) Η πρωτεώνικό ϋκφραςη τησ Akt2 ϋδειξε: α) μύα τϊςη αϑξηςησ ςτουσ προεφηβικοϑσ διαβητικοϑσ και ςτουσ διαβητικοϑσ που βρύςκονται ςτισ τϊξεισ HbA1c: 7,1%- 9%, ενώ αυξανϐταν ςημαντικϊ ςτουσ διαβητικοϑσ με διϊρκεια διαβότη >5ϋτη, β) ςημαντικό αϑξηςη ςτουσ διαβητικοϑσ με LDL>100mg/dl. υμπϋραςμα: τα ϊτομα με Δ1, φαύνεται να υπϊρχει μια όπια διαδικαςύα χημειοταξύασ και ενεργοπούηςησ των μονοκυττϊρων, ωςτϐςο η ϋκφραςη των κυτταροκινών και των υπολούπων μορύων που εμπλϋκονται ςε αυτό δεν εύναι εντυπωςιακϊ αυξημϋνη ςε ςχϋςη με τουσ μϊρτυρεσ. Σο γεγονϐσ αυτϐ μπορεύ να ςχετύζεται αφενϐσ με τον καλϐ γλυκαιμικϐ και λιπιδαιμικϐ ϋλεγχο των αςθενών και αφετϋρου ςτην τροποποιημϋνη ανοςολογικό απϐκριςη που εμφανύζουν τα ϊτομα αυτϊ.

8 7 2. ΠΕΡΙΕΦΟΜΕΝΑ

9 8 1. ΠΡΟΛΟΓΟ / ΠΕΡΙΛΗΧΗ ΠΕΡΙΕΦΟΜΕΝΑ 7 3. ΕΙΑΓΨΓΗ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟ Μηχανιςμού ρϑθμιςησ γλυκϐζησ αύματοσ ακχαρώδησ Διαβότησ: Οριςμϐσ Αιτιολογύα - Κλινικό εικϐνα α) ακχαρώδησ Διαβότησ τϑπου 1 (Δ1). 22 β) ακχαρώδησ Διαβότησ τϑπου 2 (Δ2). 25 γ) ακχαρώδησ Διαβότησ τησ κϑηςησ Διαγνωςτικϊ κριτόρια Επιδημιολογύα Επιπλοκϋσ ακχαρώδη Διαβότη Οξεύεσ επιπλοκϋσ του Δ Φρϐνιεσ επιπλοκϋσ του Δ Παθογϋνεια διαβητικόσ αγγειοπϊθειασ Παρακολοϑθηςη (follow-up) αςθενών με Δ ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟ Μη ενζυματικό γλυκοζυλύωςη Γενικϊ Δρϊςεισ των AGEs. 45 Α) Εξωκυττϊριεσ δρϊςεισ των AGEs.. 45 Β) Ενδοκυττϊριεσ δρϊςεισ των AGEs Τποδοχϋασ των AGEs (RAGE) Γενικϊ Πλόρουσ μόκουσ RAGE (full-length RAGE) RAGE χωρύσ κυτταροπλαςματικό ουρϊ (dominant-negative RAGE) Διαλυτϋσ μορφϋσ RAGE (srage) Υλεγμονό & ακχαρώδησ Διαβότησ MCP CD Akt/PKB TNF-α.. 60

10 IL TF ΚΟΠΟ ΣΗ ΕΡΓΑΙΑ ΤΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αςθενεύσ υπϐ μελϋτη Απομϐνωςη Μονοπϑρηνων Κυτ. Περιφερικοϑ Αύματοσ (PBMCs) Απομϐνωςη RNA απϐ απομονωμϋνα PBMCs RT-PCR & PCR ςε απομονωμϋνα PBMCs Ανοςοαποτϑπωςη κατϊ Western ςε απομονωμϋνα PBMCs ELISA για srage ςε πλϊςμα Μϋθοδοσ εκτύμηςησ των αποτελεςμϊτων ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ ΤΖΗΣΗΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ 128

11 10 3. ΕΙΑΓΨΓΗ

12 Γενικϐ Μϋροσ Μηχανιςμού ρϑθμιςησ γλυκϐζησ αύματοσ. Η γλυκϐζη αποτελεύ τη βαςικό πηγό ενϋργειασ των ιςτών. Μπορεύ να προςϋλθει απϐ τη μεταγευματικό εντερικό απορρϐφηςη των δομικών ςτοιχεύων τησ τροφόσ (πρωτεϗνεσ, λιπύδια, υδατϊνθρακεσ), την ενδογενό γλυκογονϐλυςη και την ενδογενό γλυκονεογϋνεςη. [1] Σα μϐρια τησ γλυκϐζησ αφοϑ ειςαχθοϑν εντϐσ των κυττϊρων διαςπώνται προκειμϋνου να παραχθοϑν μϐρια τριφωςφορικόσ αδενοςύνησ (ATP) τα οπούα αποτελοϑν υψηλόσ ενεργειακόσ ςτϊθμησ μϐρια που κινητοποιοϑν πλόθοσ κυτταρικών διεργαςιών. Η γλυκϐζη μεταφϋρεται ςτουσ ιςτοϑσ μϋςω τησ κυκλοφορύασ τουσ αύματοσ. Τπϊρχει πλόθοσ ορμονών οι οπούεσ ρυθμύζουν το μεταβολιςμϐ τησ γλυκϐζησ, ϐπωσ η ινςουλύνη, η γλυκαγϐνη, η αμυλύνη, η ινκρετύνη (GLP-1), το γλυκοζοεξαρτώμενο ινςουλινοτρϐπο πεπτύδιο (GIP), η επινεφρύνη, η κορτιζϐλη και η αυξητικό ορμϐνη. Απϐ αυτϋσ τισ ορμϐνεσ οι ινςουλύνη και αμυλύνη εκκρύνονται απϐ τα β- παγκρεατικϊ κϑτταρα, η γλυκαγϐνη απϐ τα α-παγκρεατικϊ κϑτταρα και οι GLP-1, GIP απϐ τα L-κϑτταρα του εντϋρου. [2] Οι δρϊςεισ αυτών των ορμονών ςε ςχϋςη με τη ρϑθμιςη του μεταβολιςμοϑ τησ γλυκϐζησ φαύνονται ςτον Πύνακα 1 και την Εικϐνα 1. Πύνακασ 1: Δρϊςεισ των ρυθμιςτικών ορμονών τησ γλυκϐζησ. (S. L. Aronoff, 2004).

13 12 Εικϐνα 1: Ομοιϐςταςη τησ γλυκϐζησ: ρϐλοσ τησ ινςουλύνησ, τησ γλυκαγϐνησ, τησ αμυλύνησ και του GLP-1. (S. L. Aronoff, 2004). Η ινςουλύνη αποτελεύ κεντρικόσ ςημαςύασ ορμϐνη για τη ρϑθμιςη του μεταβολιςμοϑ των υδατανθρϊκων (ςϊκχαρα) ςτον οργανιςμϐ. Όπωσ ϋχει όδη αναφερθεύ, η ινςουλύνη παρϊγεται απϐ τα β-παγκρεατικϊ κϑτταρα και εμπλϋκεται ςτη μεύωςη των επιπϋδων τησ γλυκϐζησ ςτο αύμα μϋςω τησ επαγωγόσ τησ πρϐςληψόσ τησ απϐ τα κϑτταρα ιδύωσ του όπατοσ, των μυών και του λιπώδουσ ιςτοϑ. Η ινςουλύνη παρϊγεται απϐ τα β-κϑτταρα των νηςιδύων Langerhans τησ ενδοκρινοϑσ μούρασ του παγκρϋατοσ. Σο μϐριο τησ αποτελεύται απϐ μια Α (30αα) και μια Β (21αα)αλυςύδα οι οπούεσ ενώνονται μεταξϑ τουσ με τρεισ διςουλφιδικοϑσ δεςμοϑσ (S-S) ενώ, το γονύδιϐ τησ εδρϊζει ςτο χρωμϐςωμα 11. Αρχικϐ προώϐν τησ ϋκφραςησ του γονιδύου τησ ινςουλύνησ εύναι η προπροινςουλύνη, η οπούα εύναι μη ενεργό ορμϐνη. Η προπρο-ινςουλύνη εμπεριϋχει ϋνα ςηματοδοτικϐ πεπτύδιο (signal peptide) μόκουσ 24αα το οπούο εύναι απαραύτητο ώςτε να διαπερϊςει η ορμϐνη τισ κυτταρικϋσ μεμβρϊνεσ. τη ςυνϋχεια, η προπροινςουλύνη μεταφϋρεται ςτο ενδοπλαςματικϐ δύκτυο ϐπου μετϊ τη δρϊςη πρωτεαςών αποκϐπτεται το ςηματοδοτικϐ πεπτύδιο και παρϊγεται η προινςουλύνη. Η προ-ινςουλύνη αποτελεύται απϐ 3 δομϋσ: μια αμινο-τελικό Β αλυςύδα, μια καρβοξυ-τελικό αλυςύδα και ϋνα ςυνδετικϐ πεπτύδιο ενδιϊμεςα, το οπούο ονομϊζεται C-πεπτύδιο (Εικϐνα 2). το ενδοπλαςματικϐ δύκτυο των β-κυττϊρων, η προ-ινςουλύνη υφύςταται τη δρϊςη οριςμϋνων ειδικών πεπτιδαςών οι οπούεσ απομακρϑνουν το C-πεπτύδιο οπϐτε κατ αυτϐν τον τρϐπο παρϊγεται η ώριμη και ενεργό μορφό τησ ινςουλύνησ. Η ινςουλύνη και το C-πεπτύδιο, εντϐσ του ςυμπλϋγματοσ Golgi, αποθηκεϑονται με τη μορφό εκκριτικών κοκκύων τα οπούα παραμϋνουν ςτο κυτταρϐπλαςμα των β-κυττϊρων ϋωσ ϐτου αναπτυχθεύ το ερϋθιςμα που θα πυροδοτόςει την εξωκυττϊρωςό τουσ. [3,4] Εντϐσ των εκκριτικών κοκκύων η ινςουλύνη εύναι αποθηκευμϋνη με τη μορφό Zn 2+ κρυςτϊλλου, η ςταθερϐτητα του οπούου εξαρτϊται απϐ το ϐξινο ph του κοκκύου. Κατϊ την ςϑμπτυξη τησ μεμβρϊνησ του κοκκύου με την κυτταροπλαςματικό, το ph του κοκκύου εξιςώνεται με το ph του εξωκυττϊριου χώρου προκαλώντασ τη διϊλυςη του κρυςτϊλλου και την απελευθϋρωςη τησ ινςουλύνησ. Σο πρώτο ϐργανο που

14 13 εκτύθεται ςτη νϋο-ςυντιθϋμενη ορμϐνη εύναι το όπαρ ϐπου διαδραματύζονται οι κϑριεσ διεργαςύεσ παραγωγόσ και αποθόκευςησ των υδατανθρϊκων. [5] Εικϐνα 2: τϊδια ςϑνθεςησ τησ ινςουλύνησ : προπρο-ινςουλύνη (110 αα) προ-ινςουλύνη (86 αα) ινςουλύνη (51 αα). Σο C-πεπτύδιο προϋρχεται απϐ την κεντρικό αλληλουχύα. (Snustand et al, 1997) Σα ερεθύςματα που προκαλοϑν την ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ απϐ τα β-κϑτταρα εύναι: α) η γλυκϐζη και β) τα αμινοξϋα. Όςον αφορϊ ςτη γλυκϐζη, επειδό εύναι πολικϐ μϐριο απαιτεύται η διαμεςολϊβηςη ειδικών μεταφορϋων [glucose transporters (GLUTS)] για τη διϋλευςό τησ διαμϋςου τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ. την οικογϋνεια των GLUTs ανόκουν 13 πρωτεϗνεσ, διαφορετικϋσ για κϊθε ιςτϐ και ποικύλλουν ςτη δομό και τισ απαιτόςεισ τουσ ςε ιϐντα. Ο GLUT-1 εκφρϊζεται ςε πολλϊ εύδη μη ινςουλινοευαύςθητων κυττϊρων, εύναι μϐνιμα ςτην πλαςματικό μεμβρϊνη και επιτρϋπει την πρϐςληψη τησ γλυκϐζησ ςε βαςικϋσ ςυγκεντρώςεισ ινςουλύνησ. Ο GLUT-2 μεταφϋρει τη γλυκϐζη εντϐσ των β-κυττϊρων και των ηπατοκυττϊρων ενώ ο GLUT-3 επιτρϋπει την πρϐςληψη τησ γλυκϐζησ απϐ τουσ νευρώνεσ του κεντρικοϑ νευρικοϑ ςυςτόματοσ με μη ινςουλινοεξαρτώμενο τρϐπο. Ο GLUT-4 εκφρϊζεται ςτουσ ινςουλινοευαύςθητουσ ιςτοϑσ: ςκελετικοϑσ μϑεσ, μυοκϊρδιο και λιπώδησ ιςτϐσ. ε ςυνθόκεσ νηςτεύασ βρύςκεται ενδοκυττϊρια, ςε μικροςωμϊτια χαμηλόσ πυκνϐτητασ ενώ υπϐ τη δρϊςη τησ ινςουλύνησ μετακινεύται ςτην πλαςματικό μεμβρϊνη. τα ςυγκεκριμϋνα κϑτταρα επιβοηθητικϊ δρουν και ϊλλεσ ιςομορφϋσ των GLUTs ϐπωσ, οι GLUT8 και GLUT12 ςτο λιπώδη ιςτϐ και οι GLUT1, GLUT5 και GLUT12 ςτο μυώκϐ ιςτϐ. την κυτταρικό μεμβρϊνη των β-κυττϊρων του παγκρϋατοσ υπϊρχει ειδικϐσ μεταφορϋασ τησ γλυκϐζησ (GLUT-2) μϋςω του οπούου γύνεται διϊχυςη τησ γλυκϐζησ εντϐσ του κυττϊρου. Σα αυξημϋνα ενδοκυττϊρια επύπεδα τησ γλυκϐζησ γύνονται αντιληπτϊ απϐ το ϋνζυμο γλυκοκινϊςη το οπούο ςυνδϋει φωςφορικϊ οξϋα ςτα μϐρια τησ γλυκϐζησ. Ο ενδοκυττϊριοσ μεταβολιςμϐσ τησ γλυκϐζησ (η 6Ρ-γλυκϐζη υπϐκειται ςε γλυκϐλυςη ςτο κυτταρϐπλαςμα και εν ςυνεχεύα μπαύνει ςτον κϑκλο του Krebs ςτα μιτοχϐνδρια) επιφϋρει αϑξηςη των προώϐντων ATP, NADH, NADPH ενώ η αϑξηςη του λϐγου ATP / ADP οδηγεύ ςτο κλεύςιμο ΑΣΡ-ευαύςθητων διαϑλων καλύου (Κ + ). Αποτϋλεςμα αυτοϑ του γεγονϐτοσ εύναι η αϑξηςη των επιπϋδων του ενδοκυττϊριου Κ + και εκπϐλωςη των β-κυττϊρων. τη ςυνϋχεια, προκαλεύται διϊνοιξη ταςεο-ευαύςθητων διαϑλων αςβεςτύου (Ca ++ ) και ειςροό αςβεςτύου εντϐσ του β-κυττϊρου. Η αυξημϋνη ςυγκϋντρωςη του ενδοκυττϊριου αςβεςτύου προκαλεύ ςυςτολό μικρονηματύων ακτύνησ-μυοςύνησ και ςυνεπακϐλουθη ϊμεςη εξωκυττϊρωςη των κοκκύων με την προπαραςκευαςμϋνη ινςουλύνη και το C- πεπτύδιο. Επύςησ, η αυξημϋνη γλυκϐζη που αποτελεύ το ερϋθιςμα για την ϋναρξη

15 14 ϐλων αυτών των διεργαςιών, προκαλεύ αυξημϋνη μεταγραφό και ϋκφραςη του γονιδύου τησ ινςουλύνησ προκειμϋνου να υπϊρξει περαιτϋρω παραγωγόσ τησ ορμϐνησ (Εικϐνα 3). Όπωσ προαναφϋρθηκε, εξύςου ςημαντικϐ διεγϋρτη τησ ινςουλινικόσ ϋκκριςησ αποτελοϑν τα αμινοξϋα τα οπούα προϋρχονται απϐ τισ λαμβανϐμενεσ με την τροφό πρωτεϗνεσ ό απελευθερώνονται απϐ τα επιθηλιακϊ κϑτταρα του εντϋρου. [6] υγκεκριμϋνα, προκαλεύται αϑξηςη τησ ϋκκριςησ τησ ινςουλύνησ απϐ τα β-κϑτταρα προκειμϋνου να επιτευχθεύ η ςϑνθεςη των πρωτεώνών και η μεταφορϊ των αμινοξϋων ςτα ϐργανα ςτϐχουσ ϐπωσ οι ςκελετικού μϑεσ. [7] Επύςησ, κατϊ τη διϊρκεια περιϐδων νόςτεωσ τα αμινοξϋα απελευθεροϑμενα απϐ τουσ ςκελετικοϑσ μϑεσ επιδροϑν ςτο ιςοζϑγιο των υδατανθρϊκων μϋςω επαγωγόσ τησ απελευθϋρωςησ τησ γλυκαγϐνησ απϐ τα α-κϑτταρα του παγκρϋατοσ με ςυνεπακϐλουθη επύδραςη ςτην ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ απϐ τα β-κϑτταρα. [8] Ακϐμα, τα αμονιξϋα πιθανϐν επηρεϊζουν την ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ μϋςω μηχανιςμοϑ ςτον οπούο εμπλϋκεται η ςϑνθεςη και δρϊςη τησ προερχϐμενησ απϐ τα L-κϑτταρα του εντϋρου, ινκρετύνησ. [9,10] Σϋλοσ, υπϊρχει ϋνασ μικρϐσ πληθυςμϐσ αμινοξϋων που δρουν ϊμεςα ςτα β-κϑτταρα του παγκρϋατοσ και προϊγουν ό ενιςχϑουν ςυνεργιςτικϊ την ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ. υγκεκριμϋνα, αυτϐ πραγματοποιεύται μϋςω: α)απευθεύασ αποπϐλωςησ τησ πλαςματικόσ μεμβρϊνησ ςε ουδϋτερο ph αλλϊ μϐνο επύ παρουςύασ γλυκϐζησ, β)ςυμμεταφορϊσ των αμινοξϋων με νϊτριο (Νa + ) εντϐσ των β-κυττϊρων και ςυνοδό ενεργοπούηςη ταςεοευαύςθητων διαϑλων Κ + και ϋκκριςη των κοκκύων ινςουλύνησ, [11,12] γ)μεταβολιςμοϑ των αμινοξϋων, ενδοκυττϊρια αϑξηςη του ΑΣΡ, κλεύςιμο των ΑΣΡεξαρτώμενων διαϑλων Κ +, [13] δ)πιθανό ανϊπτυξη μιτοχονδριακόσ ςηματοδϐτηςησ που επιδρϊ με τη ςειρϊ τησ ςτην ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ. [14,15] Απαραύτητο για τη φυςιολογικό ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ εύναι και ϋνα πλόθοσ μεταγραφικών παραγϐντων ϐπωσ ο HNF-1α, HNF-1β HNF-4α και PDX1/IPF1. Για κϊθε προαναφερθεύςα ςυνιςτώςα του μηχανιςμοϑ ϋκκριςησ τησ ινςουλύνησ ϋχουν περιγραφεύ μεταλλϊξεισ που προκαλοϑν διαταραχό ςτην ϋκκριςη τησ ορμϐνησ, ϐπωσ ςτο MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) και το νεογνικϐ διαβότη. [1,3] Εικϐνα 3: Μηχανιςμϐσ ϋκκριςησ τησ ινςουλύνησ απϐ τα β-παγκρεατικϊ κϑτταρα. (Sperling MA. 2006)

16 15 Η ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ απϐ τα β-παγκρεατικϊ κϑτταρα παρουςιϊζει διακυμϊνςεισ αναλϐγωσ των επιπϋδων τησ γλυκϐζησ ςτο αύμα και γύνεται κατϊ ώςεισ ακολουθώντασ τισ μεταβολϋσ του φορτύου τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ (εκπολώςεισ). υγκεκριμϋνα, η μεταγευματικό υπεργλυκαιμύα διεγεύρει την ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ η οπούα ακολουθεύ δϑο φϊςεισ: α) αρχικό ταχεύα ϋκκριςη προπαραςκευαςμϋνησ ινςουλύνησ, ακολουθοϑμενη απϐ β) αυξημϋνη ςϑνθεςη και απελευθϋρωςη τησ νεοςυντιθϋμενησ ινςουλύνησ. Μακρϊσ διαρκεύασ ϋκκριςη ινςουλύνησ παρατηρεύται εϊν οι ςυγκεντρώςεισ τησ γλυκϐζησ ςτο αύμα παραμϋνουν υψηλϋσ [2] (Εικϐνα 4). Εικϐνα 4: Υυςιολογικό ϋκκριςη ινςουλύνησ μεταγευματικϊ. (Laura Dean, 2004) Μετϊ τη διϋγερςη των β-κυττϊρων γύνεται η ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ η οπούα ακολουθεύ διφαςικϐ μοντϋλο και περιλαμβϊνει μια ταχεύα πρώτη φϊςη (διϊρκεια ~10 λεπτϊ) ακολουθοϑμενη απϐ μια ςυνεχό δεϑτερη φϊςη. Οι δϑο φϊςεισ οφεύλονται ςτην αϑξηςη του ενδοκυττϊριου αςβεςτύου (ϊρα και εξωκυττϊρωςη κοκκύων ινςουλύνησ) αρχικϊ ταυτϐχρονη ςε ϐλα τα β-κϑτταρα, ϐλων των νηςιδύων του παγκρϋατοσ ενώ ϋπειτα ταυτϐχρονη ςε ϐλα τα κϑτταρα ενϐσ νηςιδύου αλλϊ αςϑγχρονη μεταξϑ του ςυνϐλου των νηςιδύων. [3,16,17] Η ινςουλύνη δρα μϋςω τησ ςϑνδεςόσ τησ ςε ειδικϐ διαμεμβρανικϐ υποδοχϋα (ΙR). Αυτϐσ αποτελεύται απϐ δϑο εξωκυττϊριεσ α υπομονϊδεσ οι οπούεσ δεςμεϑουν την ορμϐνη και απϐ δϑο διαμεμβρανικϋσ β υπομονϊδεσ οι οπούεσ εύναι υπεϑθυνεσ για την ενδοκυττϊρια μεταγωγό του ςόματοσ (Εικϐνα 5). Ο υποδοχϋασ μϐλισ δεςμευτεύ με την ινςουλύνη αυτοφωςφορυλιώνεται και αποκτϊ δρϊςη κινϊςησ τυροςύνησ. Η αυτοφωςφορυλύωςη του υποδοχϋα προκαλεύ την ενεργοπούηςη του υποςτώματοσ ΙRS (Insulin Receptor Substrates) και εν ςυνεχεύα πολλαπλών ςηματοδοτικών μονοπατιών ςτα οπούα εμπλϋκεται πλόθοσ μορύων [πχ. Cbl (casitas B-lineage lymphoma) και CAP (Cbl-associated protein), PI3kinase, Akt/PKB] (Εικϐνα 6). [18]

17 16 Εικϐνα 5: χηματικό απεικϐνιςη του υποδοχϋα τησ ινςουλύνησ. Μετϊ την πρϐςδεςη τησ ινςουλύνησ ςτισ α υπομονϊδεσ ακολουθεύ αυτοφωςφορυλύωςη των β υπομονϊδων και μεταγωγό του ςόματοσ τησ ινςουλύνησ ςτο εςωτερικϐ του κυττϊρου. (University of Arizona, 2002). Εικϐνα 6: χηματικό απεικϐνιςη του μηχανιςμοϑ δρϊςησ τησ ινςουλύνησ. Η αυτωςφορυλύωςη του υποδοχϋα μετϊ τη ςϑνδεςη τησ ινςουλύνησ προκαλεύ την ενεργοπούηςη του υποςτώματοσ ΙRS (Insulin Receptor Substrates) και πολλαπλών ςηματοδοτικών μορύων τα οπούα ϋχουν κοινό κατϊληξη τη μετατϐπιςη του μεταφορϋα τησ γλυκϐζησ (GLUT) ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη και την ενδοκυττϊρωςη τησ γλυκϐζησ. (Saltiel and Kahn, 2001). Κοινό κατϊληξη ϐλων των μεταγωγικών μονοπατιών που κινητοποιεύ η ςϑνδεςη τησ ινςουλύνησ ςτον υποδοχϋα τησ εύναι η μετακύνηςη των μεταφορϋων τησ γλυκϐζησ (GLUTs) ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη και η μεταφορϊ τησ κυκλοφοροϑςασ γλυκϐζησ εντϐσ των κυττϊρων. Σελικώσ, επιτυγχϊνεται ρϑθμιςη των επιπϋδων τησ γλυκϐζησ ςτο αύμα, επαρκόσ τροφοδϐτηςη των ιςτών με την κυριϐτερη πηγό ενϋργειασ και προςταςύα του οργανιςμοϑ απϐ τισ βλαπτικϋσ επιδρϊςεισ τησ χρϐνιασ υπεργλυκαιμύασ.

18 17 ε διϊςτημα λύγων λεπτών ϋωσ ωρών, η ινςουλύνη μεταβϊλλοντασ την κατϊςταςη φωςφορυλύωςησ διαφϐρων ενζϑμων επιδρϊ ςτην ενεργϐτητϊ τουσ. ε διϊςτημα ημερών, η ινςουλύνη αυξϊνει τα επύπεδα πολλών μεταβολικών ενζϑμων μϋςω επαγωγόσ των αντιγραφικών, μεταγραφικών και μεταφραςτικών διαδικαςιών. [4] Θα πρϋπει να ςημειωθεύ πωσ υπϊρχει και μηχανιςμϐσ πρϐςληψησ τησ γλυκϐζησ που δεν εξαρτϊται απϐ τη δρϊςη τησ ινςουλύνησ. Αυτϐσ ο μηχανιςμϐσ ενεργοποιεύται και ςτουσ ινουλινο-ευαύςθητουσ ιςτοϑσ (όπαρ, μϑεσ, λιποκϑττρα) αλλϊ αποτελεύ μοναδικϐ τρϐπο πρϐςληψησ γλυκϐζησ απϐ τουσ μη-ινςουλινοεξαρτώμενου ιςτοϑσ (εγκϋφαλοσ, κϑτταρα αύματοσ, νευρικϊ κϑτταρα). Η μη ινςουλινο-εξαρτώμενη πρϐςληψη τησ γλυκϐζησ πραγματοπιεύται μϋςω μη ινςουλινο-εξαρτώμενων μεταφορϋων γλυκϐζησ ϐπωσ εύναι ο GLUT1 και ςε κατϊςταςη νόςτεωσ εύναι υπεϑθυνη για το 83% τησ διαθϋςιμησ γλυκϐζησ ςτον οργανιςμϐ. [19] Εκτϐσ απϐ τισ δρϊςεισ τησ ινςουλύνησ που αναγρϊφονται ςτον Πύνακα 1, η ινςουλύνη επιτελεύ και ϊλλεσ μεταβολικϋσ λειτουργύεσ ϐπωσ: Διϋγερςη τησ ςϑνθεςησ των λιπιδύων. Προαγωγό αποθόκευςησ των τριγλυκεριδύων ςτα λιποκϑτταρα. Προαγωγό τησ πρωτεώνοςϑνθεςησ ςτο όπαρ και τουσ μϑεσ. Επαγωγό του κυτταρικοϑ πολλαπλαςιαςμοϑ. [2]

19 ακχαρώδησ Διαβότησ: Οριςμϐσ Αιτιολογύα - Κλινικό εικϐνα Ο ακχαρώδησ Διαβότησ (Δ) αποτελεύ μια ομϊδα νοςημϊτων τα οπούα χαρακτηρύζονται απϐ αυξημϋνα επύπεδα γλυκϐζησ ςτο αύμα (υπεργλυκαιμύα). Προκαλεύται εξαιτύασ διαταραχών ςτην ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ, τη δρϊςη τησ ινςουλύνησ, ό και τα δϑο. υχνϊ ςυνοδεϑεται απϐ επιπλοκϋσ (μακρο-και μικροαγγειοπϊθεια). Ο Δ δεν αποτελεύ μια παθολογικό οντϐτητα αλλϊ ϋνα ςϑνολο αιτιολογικϊ διαφορετικών μεταβολικών διαταραχών. [20,21] Η ϑπαρξη τησ ςυγκεκριμϋνησ νοςολογικόσ οντϐτητασ εύναι γνωςτό απϐ την εποχό του αρχαύου Ελληνικοϑ, Κινεζικοϑ, Αιγυπτιακοϑ και Περςικοϑ πολιτιςμοϑ. Ϋδη απϐ το 400 π.φ. γύνεται περιγραφό αςθενών με γλυκιϊσ γεϑςησ οϑρα, απϐ Ινδοϑσ θεραπευτϋσ. Η γλυκϑτητα των οϑρων παρϋμεινε για αρκετοϑσ αιώνεσ ωσ ϋνα απϐ τα κϑρια διαγνωςτικϊ κριτόρια του Δ. Ο ϐροσ διαβότησ ειςόχθη απϐ τον Αρεταιϐ τον Καπαδϐκη περύπου το 250 π.φ., προϋρχεται απϐ το αρχαύο ελληνικϐ ρόμα διαβαίνειν και αναφϋρεται ςε ϋνα απϐ τα χαρακτηριςτικϊ ςυμπτώματα του διαβότη, την πολυουρύα. Ο ϐροσ ςακχαρώδησ προςτϋθηκε απϐ τον Thomas Willis (1675) και αναφϋρεται ςτη γλυκϑτητα των οϑρων που χαρακτηρύζει τουσ διαβητικοϑσ και οφεύλεται ςτα αυξημϋνα επύπεδα γλυκϐζησ ςτα οϑρα. Σο 1889, οι Joseph von Mering και Oskar Minkowski, παρατηρώντασ την ανϊπτυξη ςακχαρώδη διαβότη ςε ςκϑλουσ απϐ τουσ οπούουσ εύχε αφαιρεθεύ χειρουργικϊ το πϊγκρεασ, ςυνϋδεςαν για πρώτη φορϊ το πϊγκρεασ με την αιτύα ανϊπτυξησ του Δ. Η μετϋπειτα απομϐνωςη τησ ινςουλύνησ απϐ εκχϑλιςμα παγκρεατικοϑ ιςτοϑ (1921) και η παραγωγό αντι-διαβητικών φαρμακευτικών ςκευαςμϊτων, επϋφεραν ουςιαςτικϋσ αλλαγϋσ τϐςο ςτη θεραπευτικό αντιμετώπιςη και πρϐγνωςη τησ νϐςου, ϐςο και ςτο ερευνητικϐ ενδιαφϋρον περύ αποςαφόνιςησ των μηχανιςμών που διϋπουν την ανϊπτυξη του Δ και των επιπλοκών του. [22] Όπωσ ϋχει όδη αναφερθεύ, ο Δ αποτελεύ μια ομϊδα κλινικών οντοτότων οι οπούεσ ϋχουν κοινϐ χαρακτηριςτικϐ τα αυξημϋνα επύπεδα γλυκϐζησ ςτο αύμα. Τπϊρχουν πολλϋσ παθολογικϋσ καταςτϊςεισ που μποροϑν να οδηγόςουν ςτην ανϊπτυξη Δ και αναγρϊφονται ςτον Πύνακα 2. υνηθϋςτερεσ μορφϋσ Δ αποτελοϑν ο ακχαρώδησ Διαβότησ τϑπου 1 (Δ1), ο ακχαρώδησ Διαβότησ τϑπου 2 (Δ2) και ο ακχαρώδησ Διαβότησ τησ κϑηςησ. Παρακϊτω, θα αναλυθοϑν περαιτϋρω τα χαρακτηριςτικϊ των τριών αυτών νοςολογικών οντοτότων.

20 19 I. Σϑπου 1 Διαβότησ (καταςτροφό των β- κυττϊρων, απϐλυτη ϋλλειψη τησ ινςουλύνησ) A. Ανοςομεςολαβοϑμενοσ B. Ιδιοπαθόσ II. Σϑπου 2 Διαβότησ (ςυνδυαςμϐσ διαταραχόσ ςτην ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ και αντύςταςησ των ιςτών ςτη δρϊςη τησ) III. Ωλλοι ειδικού τϑποι: A. Γενετικέσ διαταραχέσ των β-κυττάρων 1. Φρωμϐςωμα 12, HNF-1α (MODY3) 2. Φρωμϐςωμα 7, γλυκοκινϊςη (MODY2) 3. Φρωμϐςωα 20, HNF-4α (MODY1) 4. Φρωμϐςωμα 13, επαγωγικϐσ παρϊγων τησ ινςουλύνησ (insulin promoter factor)-1 (IPF-1; MODY4) 5. Φρωμϐςωμα 17, HNF-1β (MODY5) 6. Φρωμϐςωμα 2, NeuroD1 (MODY6) 7. Μιτοχονδριακϐ DNA 8. Ωλλεσ B. Γενετικέσ διαταραχέσ ςτην έκκριςη τησ ινςουλίνησ 1. Σϑπου A αντύςταςη ςτην ινςουλύνη 2. Leprechaunism 3. ϑνδρομο Rabson-Mendenhall 4. Λιποατροφικϐσ Διαβότησ 5. Ωλλεσ C. Νβςοι εξωκρινογσ μοίρασ παγκρέατοσ 1. Παγκρεατύτιδα 2. Σραϑμα/Παγκρεατεκτομό 3. Νεοπλαςύα 4. Κυςτικό ύνωςη 5. Αιμοχρωμϊτωςη 6.Ωλλεσ D. Ενδοκρινοπάθειεσ 1. Ακρομεγαλύα 2. ϑνδρομο Cushing 3. Γλυκαγϐνωμα 4. Υαιοχρωμοκϑττωμα 5. Τπερθυρεοειδιςμϐσ 6. ωματοςτατύνωμα 7. Αλδοςτερύνωμα 8. Ωλλεσ E. Φάρμακο- ή χημικο- επαγώμενοσ 1. Vacor 2. Πενατμιδύνη 3. Νικοτινικϐ οξϑ 4. Γλυκοκορτικοειδό 5. Θυρεοειδικϋσ ορμϐνεσ 6. Δαζοξύδη 7. β-αδρνεργικού αγωνιςτϋσ 8. θειαζύδεσ 9. α-ιντερφερϐνη 11. Ωλλα F. Λοιμώξεισ 1. υγγενόσ ερθρϊ 2. Κυτταρομεγαλοιϐσ 3. Ωλλεσ G. Μη κοινέσ ανοςο-μεςολαβογμενεσ μορφέσ διαβήτη 1. ϑνδρομο Stiff-man 2. Αντιςώματα ϋναντι υποδοχϋα ινςουλύνησ 3. Ωλλεσ H. Άλλα γενετικά ςγνδρομα ςχετιζβμενα με διαβήτη 1. ϑνδρομο Down 2. ϑνδρομο Klinefelter 3. ϑνδρομο Turner 4. ϑνδρομο Wolfram 5. Αταξύα Friedreich 6. Φορεύα Huntington 7. ϑνδρομο Laurence-Moon-Biedl 8. Μυοτονικό δυςτροφύα 9. Πορφϑρα 10. ϑνδρομο Prader-Willi 11. Ωλλα IV. ακχαρώδησ Διαβότησ τησ κϑηςησ (GDM). Πύνακασ 2: Αιτιολογικό ταξινϐμηςη ακχαρώδη Διαβότη. (American Diabetes Association, 2006)

21 20 Η ςυμπτωματολογύα του Δ, οποιαςδόποτε αιτιολογύασ, αναπτϑςςεται εξαιτύασ τησ μειωμϋνησ δρϊςησ τησ ινςουλύνησ. Επακϐλουθο αυτόσ τησ μεταβολικόσ διαταραχόσ εύναι αφενϐσ ο εγκλωβιςμϐσ τησ γλυκϐζησ ςτην κυκλοφορύα (υπεργλυκαιμύα) και αφετϋρου η κυτταρικό αποςτϋρηςη τησ γλυκϐζησ. Όςον αφορϊ ςτην πρώτη παρϊμετρο, η μη μεταφορϊ τησ γλυκϐζησ εντϐσ των κυττϊρων ςυνεπϊγεται αϑξηςη τησ ςυγκϋντρωςησ τησ γλυκϐζησ ςε ϐλα τα υγρϊ του οργανιςμοϑ. Όταν η ςυγκϋντρωςη τησ γλυκϐζησ ςτο αύμα υπερβαύνει το νεφρικϐ ουδϐ αποβολόσ τησ (περύπου 10 mmol/l), η επαναρρϐφηςό τησ ςτο εγγϑσ εςπειραμϋνο ςωληνϊριο εύναι ελλιπόσ, και μϋροσ τησ παραμϋνει ςτα οϑρα (γλυκοζουρύα). Αυτϐ αυξϊνει την ωςμωτικό πύεςη των οϑρων και εμποδύζει την επαναρρϐφηςη του ϑδατοσ απϐ το νεφρϐ, με ςυνϋπεια την αυξανϐμενη παραγωγό οϑρων (πολυουρύα). Η απώλεια του ϐγκου αύματοσ αντικαθύςταται ωςμωτικϊ απϐ το ενδοκυττϊριο ϑδωρ και το ϑδωρ του ενδιϊμεςου ιςτοϑ, ςυνεπϊγοντασ αφυδϊτωςη και αυξημϋνη δύψα (πολυδιψύα). χετικϊ με τουσ υπϐλοιπουσ περιφερικοϑσ ιςτοϑσ, η ςυςςωρευϐμενη γλυκϐζη επηρεϊζει την ωςμωτικϐτητα και τη φυςιολογύα τουσ (πχ. φακϐσ οφθαλμών-θϐλωςη ϐραςησ) ενώ αυξϊνει και τον κύνδυνο των λοιμώξεων καθώσ αποτελεύ ϊριςτη πηγό θρεπτικών ςτοιχεύων για τουσ μικροοργανιςμοϑσ. Η μη εύςοδοσ και χρηςιμοπούηςη τησ γλυκϐζη απϐ τουσ ιςτοϑσ, ϋχει ωσ αποτϋλεςμα την κινητοπούηςη ϊλλων μεταβολικών διεργαςιών προκειμϋνου να διαςφαλιςθεύ η κυτταρικό ενεργειακό τροφοδϐτηςη. Ρϐλο κυριϐτερησ πηγόσ ενϋργειασ αναλαμβϊνουν τα λιπαρϊ οξϋα, η διϊςπαςη των οπούων ςτα ηπατοκυτταρικϊ μιτοχϐνδρια προκαλεύ την παραγωγό κετονικών ςωμϊτων. [23] Εικϐνα 7: χϋςη μεταξϑ μεταβολιςμοϑ γλυκϐζησ και λιπαρών οξϋων κα η παραγωγό των κετονικών ςωμϊτων ςτα ηπατοκϑτταρα. (Laffel L.,1999) Κυρύωσ παρϊγονται τα κετονικϊ ςώματα ακετοξικϐ (AcAc) και 3-βυδροξυβουτυρικϐ (3HB), ενώ το τρύτο κετονικϐ ςώμα, η ακετϐνη, παρϊγεται ςε λιγϐτερα ποςϊ (Εικϐνα 7). Ο ρϐλοσ των κετονικών ςωμϊτων εύναι η απϐδοςη τησ

22 21 ενϋργειασ που παρϊγεται ςτο όπαρ μϋςω των λιπαρών οξϋων, ςτα υπϐλοιπα ϐργανα του ςώατοσ (εγκϋφαλοσ, καρδιϊ, νεφρού, ςκελετικού μϑεσ) κατϊ τη διϊρκεια περιϐδων που εύναι μειωμϋνη ό ανεπαρκόσ η διϊθεςη ό η χρόςη των υδατανθρϊκων. Η αυξημϋνη κατανϊλωςη των ενεργειακών αποθεμϊτων προκαλεύ απώλεια βϊρουσ και αύςθημα πεύνασ ςτουσ αςθενεύσ με ςυνεπακϐλουθη πολυφαγύα. Επύ οξεύασ και ςοβαρόσ ςυςςώρευςησ κετονικών ςωμϊτων, αναπτϑςςεται διαβητικό κετοξϋωςη (ΔΚ) κατϊ την οπούα ο λϐγοσ των δϑο κυριϐτερων κετονών (3HB : AcAc) μεταβϊλλεται απϐ 1 : 1 φυςιολογικϊ ςε 10 : 1. Η ακετϐνη που παρϊγεται απϐ την αυτϐματη αποκαρβοξυλύωςη του AcAc [24,25] ευθϑνεται για την χαρακτηριςτικό οςμό τησ αναπνοόσ των διαβητικών αςθενών με κετοξϋωςη. υνοδϊ ςυμπτώματα τησ ΔΚ εύναι: ταχεύα, βαθειϊ αναπνοό γνωςτό ωσ αναπνοό Kussmaul, πολυουρύα, ναυτύα, ϋμετοι, κοιλιακϐ ϊλγοσ και διαταραχό ςυνεύδηςησ (εχθρικϐτητα και μανύα ό ςϑγχυςη και λόθαργοσ ϋωσ και κώμα) (Εικϐνα 8). Η ΔΚ εύναι ςυνόθησ ςτα ϊτομα με Δ1 ενώ μπορεύ να αποτελϋςει την πρώτη κλινικό εκδόλωςη τησ νϐςου ςε αυτοϑσ. Η εγκατϊςταςη των ςυμπτωμϊτων εύναι ςυνόθωσ οξεύα ςτο Δ1 ενώ ςτο Δ2 μπορεύ να παρϋλθουν πολλϊ ϋτη απϐ την ϋναρξη τησ νϐςου μϋχρι να γύνει κλινικϊ ϋκδηλη. Η διϊγνωςη τύθεται με τη μϋτρηςη των επιπϋδων γλυκϐζησ ςτο πλϊςμα (βλϋπε παρακϊτω). πανιϐτερα, η ςοβαρό υπεργλυκαιμύα μπορεύ να οδηγόςει ςε υπερωςμωτικϐ μη κετωτικϐ ςϑνδρομο το οπούο εύναι πιο ςυχνϐ ςτα ϊτομα με Δ2 και χαρακτηρύζεται απϐ εξεςημαςμϋνη απώλεια ϑδατοσ και κύνδυνο αφυδϊτωςησ. Η χρϐνια υπεργλυκαιμύα, τϋλοσ, προκαλεύ μακροχρϐνιεσ βλϊβεσ και δυςλειτουργύεσ ςε ποικιλύα κυττϊρων, ιςτών και οργϊνων οδηγώντασ ςτη ανϊπτυξη τησ διαβητικόσ μικρο- και μακρο- αγγειοπϊθειασ.

23 22 Εικϐνα 8: Κλινικό εικϐνα του ςακχαρώδη διαβότη. (Davidson's Principles and Practice of Medicine, Chilvers, Colledge, Hunter, C. Haslett, Nicholas A. Boon, 19 th edition) α ακχαρώδησ Διαβότησ τϑπου 1 (Δ1) Ονομϊζεται και Ινςουλινο-εξαρτώμενοσ ακχαρώδησ Διαβότησ (IDDM). Φαρακτηρύζεται απϐ πλόρη ϋκπτωςη τησ λειτουργύασ και τησ εκκριτικόσ ικανϐτητασ των β-παγκρεατικών κυττϊρων. υνϋπεια αυτόσ τησ διαταραχόσ εύναι η πλόρησ ϋλλειψη ςτην ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ, που υποδηλώνεται απϐ τα χαμηλϊ ό μη ανιχνεϑςιμα επύπεδα του C- πεπτιδύου ςτο πλϊςμα. [2,26] Εξαιτύασ τησ ςυνολικόσ ϋκπτωςησ ςτη λειτουργύα των β-κυττϊρων, επϋρχεται διαταραχό και τησ ςυνεκκρινϐμενησ ορμϐνησ που εμπλϋκεται ςτο μεταβολιςμϐ

24 23 τησ γλυκϐζησ, τησ αμυλύνησ. Αποτϋλεςμα εύναι η περαιτϋρω διαςϊλευςη τησ ομοιοςταςύασ του μεταβολιςμοϑ τησ γλυκϐζησ ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ. [27] Αποτελεύ το 5% του ςυνϐλου των περιπτώςεων Δ, παραμϋνει η ςυχνϐτερη μορφό Δ ςτα παιδιϊ [28,29] ενώ, θεωρεύται πωσ ϋωσ το ϋτοσ 2020 θα ϋχει διπλαςιαςτεύ η επύπτωςό του ςτα παιδιϊ ηλικύασ <5 ετών. [30] Τποδιαιρεύται ςε 2 κατηγορύεσ αναλϐγωσ τησ υπϊρξεωσ αυτοϊνοςησ αιτιολογύασ ό μη: ακχαρώδησ Διαβότησ 1Α (95% των περιπτώςεων με Δ1) ακχαρώδησ Διαβότησ 1Β (5% των περιπτώςεων με Δ1) Παρατηρεύται κυρύωσ ςτην παιδικό και εφηβικό ηλικύα, ωςτϐςο μπορεύ να παρουςιαςθεύ ςε οποιαδόποτε ηλικιακό ομϊδα. Μπορεύ κλινικϊ να εμφανιςθεύ αιφνιδύωσ και πρώτη εκδόλωςό του να αποτελεύ η διαβητικό κετοξϋωςη και το κώμα. Προκαλεύται κυρύωσ εξαιτύασ κυτταρο-διαμεςολαβοϑμενησ αυτοϊνοςησ καταςτροφόσ των β-κυττϊρων του παγκρϋατοσ [31,32] (Εικϐνα 9). Φαρακτηριςτικϐ παθολογοανατομικϐ εϑρημα ςε παγκρεατικϐ ιςτϐ ατϐμων με πρϐςφατα διαγνωςμϋνο Δ1 εύναι η ϑπαρξη φλεγμονόσ των νηςιδύων (ινςουλινύτισ), [33,34] η οπούα ςυνοδεϑεται απϐ διόθηςη των νηςιδύων απϐ Σ- λεμφοκϑτταρα [35] και υπερϋκφραςη δεικτών αντιγονοπαρουςύαςησ του μεύζονοσ ςυςτόματοσ ιςτοςυμβατϐτητασ (MHC), [34, 36] υποδηλώνοντασ την αυτοϊνοςη φϑςη τησ διαταραχόσ. Δεύκτη τησ αυτοϊνοςησ καταςτροφόσ των β-κυττϊρων αποτελεύ επύςησ η ϑπαρξη αυτοαντιςωμϊτων ϋναντι των νηςιδύων του παγκρϋατοσ (ICAs), τησ ινςουλύνησ (IAAs), τησ δεοξυκαρβοξυλϊςησ του γλουταμικοϑ οξϋοσ (GAD65) και τησ τυροςινικόσ φωςφατϊςησ ΙΑ-2 και ΙΑ-2β. Σα αυτοαντιςώματα εύναι παρϐντα ςτο 85-90% των ατϐμων ςτα οπούα διαγιγνώςκεται ο Δ1. [37,38] Η ϑπαρξό τουσ ορύζει τη διϊγνωςη του ακχαρώδη Διαβότη τϑπου 1Α ενώ, η εμφϊνιςό τουσ ςυνόθωσ προηγεύται τησ εμφϊνιςησ του Δ1 κατϊ μερικοϑσ μόνεσ ό ϋτη. Όμωσ, ςημαντικϐτερη προγνωςτικό αξύα για την εκδόλωςη ςακχαρώδη διαβότη ϋχει ο αριθμϐσ των αντιςωμϊτων και ϐχι η ταυτϐτητα εκϊςτοτε αντιςώματοσ. [39] Σα αυτοαντιςώματα του Δ1 μπορεύ να εύναι παρϐντα ακϐμα και απϐ το πρώτο ϋτοσ ζωόσ [40] ενώ, αποτελοϑν διαφοροδιαγνωςτικϐ δεύκτη του Δ1 που εγκαθύςταται ςε μεγαλϑτερησ ηλικύασ ϊτομα, μια κλινικό οντϐτητα που ονομϊζεται LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adult) ό SPIDDM (Slow Progressive Insulin Dependent Diabetes Mellitus). υχνϊ, αρχικϊ τύθεται λανθαςμϋνα η διϊγνωςη του διαβότη τϑπου 2 (Δ2), ωςτϐςο η ϑπαρξη αντιςωμϊτων, τυπικϊ αντι- GAD65 (5-10%) ό αντι- IA-2 (2-4%), βοηθϊ ςτην οριςτικό και ορθό διϊγνωςη τησ νϐςου.

25 24 Εικϐνα 9: Μοντϋλο παθογϋνεςησ Δ1 βαςιζϐμενο ςε γενετικϋσ αιτιολογικϋσ μελϋτεσ. [von Herrath, M. (2009)] Γενετικϊ, θεωρεύται πολυγονιδιακϐ νϐςημα ωςτϐςο ϋχει παρατηρηθεύ ιςχυρό ςυςχϋτιςη με οριςμϋνουσ γενετικοϑσ τϐπουσ: [41,42] Η πιο ιςχυρό ςυςχϋτιςη ϋχει βρεθεύ με τα γονύδια του μεύζονοσ ςυςτόματοσ ιςτοςυμβατϐτητασ, MHC (IDDM1) που εδρϊζονται ςτο χρωμϐςωμα 6p21.3. [43] Επύςησ, επιρρϋπεια ςτην εμφϊνιςη Δ1 ϋχει ςυςχετιςθεύ ιςχυρϊ με την κληρονϐμηςη των αλληλϐμορφων DR3, DR4, DQ2, DQ8 των ανθρώπινων λευκοκυτταρικών αντιγϐνων (HLA). Περιςςϐτεροι απϐ το 90% των ατϐμων με Δ1 εκφρϊζουν εύτε το αλλόλιο DR3DQ2 ό το DR4DQ8. τα παιδιϊ με Δ1 ηλικύασ <5 ετών εύναι πιο ςυχνϐσ (50%) ο ετεροζυγωτικϐσ γονϐτυποσ (DR3/DR4). Ο γονϐτυποσ HLA-DR3/4 DQ8 ςχετύζεται με υψηλϐτερο κύνδυνο για αυτοϊνοςη διαταραχό των β-κυττϊρων. [26] Ακϐμα, υπϊρχουν περύπου ϊλλοι 20 μη-hla γενετικού τϐποι που ςυνεπϊγονται ευπϊθεια ςτο Δ1. Ο πιο καλϊ μελετημϋνοσ εύναι ο γενετικϐσ τϐποσ τησ ινςουλύνησ (IDDM2) ςτο χρωμϐςωμα 11p5.5 και ςυμβϊλλει περύπου ςτο 10% των οικογενών μορφών τησ νϐςου. [44] Επιπλϋον, πολυμορφιςμού ςτην 6,1 kb 3 περιοχό του ρυθμιςτικοϑ γονιδύου των Σ-λεμφοκυττϊρων CTLA-4 (IDDM12) ςτο χρωμϐςωμα 2q22 υποδεικνϑουν μια γενικϐτερη επιρρϋπεια ςτα αυτοϊνοςα νοςόματα, ςυμπεριλαμβϊνοντασ και το Δ1. [45] Όπωσ προαναφϋρθηκε, τα ϊτομα με Δ1 εμφανύζουν μεγαλϑτερο κύνδυνο για εμφϊνιςη και ϊλλων αυτοϊνοςων νοςημϊτων ϐπωσ νϐςοσ Graves, θυρεοειδύτιδα Hashimoto, νϐςοσ Addison, κοιλιοκϊκη, αυτοϊνοςη ηπατύτιδα κ.ϊ. Αυτϐ το γεγονϐσ ενιςχϑει την ϊποψη πωσ ο Δ1 αναπτϑςςεται ςτα πλαύςια μιασ γενικϐτερησ διαταραχόσ τησ ανοςολογικόσ απϐκριςησ του οργανιςμοϑ. [46] Αιτιολογικϊ ϋχει ςυςχετιςθεύ με ϑπαρξη γενετικόσ προδιϊθεςησ για αυτοϊνοςη αντύδραςη του οργανιςμοϑ, ωςτϐςο ςυχνϊ δε ςυνυπϊρχει επιβαρυμϋνο οικογενειακϐ ιςτορικϐ. Επιπλϋον, η μη απϐλυτη ανϊπτυξη Δ1 ςε μονοζυγωτικοϑσ αςθενεύσ (μϐνο 30-50%) [47] καταδεικνϑει τη ςυμμετοχό και

26 25 περιβαλλοντικών παραγϐντων ςτην εγκατϊςταςη και την εξϋλιξη τησ νϐςου επύ υπϊρξεωσ κατϊλληλου γενετικοϑ υποβϊθρου. Τπϊρχουν αςαφό δεδομϋνα που ςυςχετύζουν το Δ1 με οριςμϋνεσ περιβαλλοντικϋσ τοξύνεσ [48], ςυςτατικϊ των τροφών και φαρμακευτικϋσ ουςύεσ. Μελϋτεσ ςχετικϊ με το ρϐλο τησ πρώιμησ λόψησ αγελαδινοϑ [49] ό μητρικοϑ γϊλακτοσ, των περιβαλλοντικών λοιμώξεων ό των εμβολιαςμών ςτην ανϊπτυξη του Δ1 δεν απϋδειξαν κϊποια ςαφό ςϑνδεςη. [50,51] Επύςησ, ϋχει δοθεύ ςημαςύα ςτο ρϐλο που διαδραματύζουν ςτην ανϊπτυξη Δ1 οριςμϋνοι ιού. [52] Η διαφορετικό κατανομό τησ επύπτωςησ του Δ1 κατϊ τη διϊρκεια του ϋτουσ αλλϊ και μεταξϑ των χωρών, καθώσ και η ςυχνό προΰπαρξη λούμωξησ κατϊ τη διϊγνωςη του Δ1 ενιςχϑει το ρϐλο των ιών ςτην εγκατϊςταςη τησ νϐςου. Η ςυγγενόσ ερυθρϊ ςχετύζεται ιςχυρϊ με το Δ1 καθώσ 20% των παιδιών που προςβϊλλονται αναπτϑςςουν Δ1. Επιπλϋον οι εντεροιού, και ειδικϊ ο coxsackie B4, φαύνεται να εμπλϋκονται ςημαντικϊ ςτην παθογϋνεια του Δ1. [53,54] Δεν εύναι πλόρωσ αποςαφηνιςμϋνο εϊν η βλϊβη των β-κυττϊρων κατϊ τα διϊρκεια τησ λούμωξησ προκαλεύται απϐ ϊμεςη κυτταρικό λϑςη προκαλοϑμενη απϐ τουσ ιοϑσ, απϐ διαςταυροϑμενη ανοςολογικό απϊντηςη ό απϐ εμμϋνουςα φλεγμονό και ςυνοδό καταςτροφό των β-κυττϊρων. [53] Θεραπευτικϊ, απαιτεύται εξ αρχόσ η χορόγηςη εξωγενοϑσ ινςουλύνησ. [21,20] Τπϊρχουν διϊφορα ςκευϊςματα ανϊλογα ινςουλύνησ που διαφϋρουν ςτο χρϐνο ϋναρξησ τησ δρϊςησ τουσ και ςτη ςυνολικό διϊρκειασ αυτόσ: o Τπερταχεύασ δρϊςησ ινςουλύνη (ϋναρξη δρϊςησ: 5-10 λεπτϊ, μϋγιςτη δρϊςη: ½-1 ώρα, δρϊςη ϋωσ: 4 ώρεσ). o Κανονικόσ ό βραχεύασ δρϊςησ ινςουλύνη (ϋναρξη δρϊςησ: 30 λεπτϊ, μϋγιςτη δρϊςη: 2-3 ώρεσ, δρϊςη ϋωσ: 6 ώρεσ). o Ενδιϊμεςησ δρϊςησ ινςουλύνη (ϋναρξη δρϊςησ: 2-4 ώρεσ, μϋγιςτη δρϊςη: 6-8 ώρεσ, δρϊςη ϋωσ: ώρεσ). o Παρατεταμϋνησ δρϊςησ ινςουλύνη (ϋναρξη δρϊςησ: 6-10 ώρεσ, δρϊςη ϋωσ: 24 ώρεσ). Εφαρμϐζονται διϊφορα ςχόματα χορόγηςησ τησ ινςουλύνησ, αναλϐγωσ των κοινωνικών αναγκών του αςθενοϑσ και του γλυκαιμικοϑ του ελϋγχου. κοπϐσ εύναι η διατόρηςη τησ φυςιολογικόσ διακϑμανςησ των επιπϋδων γλυκϐζησ κατϊ τη διϊρκεια του εικοςιτετραώρου. o υμβατικϊ ςχόματα: χόμα 1 ϋνεςησ/ημϋρα: μακρϊσ διαρκεύασ (24ωρη) ινςουλύνη. χόμα 2 ενϋςεων/ημϋρα: κρυςταλλικό ινςουλύνη και μακρϊσ διαρκεύασ δρϊςησ ινςουλύνη. o Εντατικοποιημϋνο ςχόμα: ανϊλογα ινςουλύνησ πριν απϐ κϊθε γεϑμα β ακχαρώδησ Διαβότησ τϑπου 2 (Δ2) Εύναι γνωςτϐσ και ωσ Μη Ινςουλινο-εξαρτώμενοσ ακχαρώδησ Διαβότησ (NIDDM) ό και παλαιϐτερα ωσ ακχαρώδησ Διαβότησ των ενηλύκων.

27 26 το Δ2 ςυνυπϊρχει διαταραχό ςτην ϋκκριςη και τη δρϊςη τησ ινςουλύνησ. [55] υγκεκριμϋνα, ο Δ2 χαρακτηρύζεται απϐ ϑπαρξη αντύςταςησ των ιςτώνςτϐχων (όπαρ, ςκελετικού μϑεσ) ςτη δρϊςη τησ ινςουλύνησ ςε ςυνδυαςμϐ με ποικύλησ βαρϑτητασ (ϋωσ και απϐλυτη) διαταραχό ςτην ϋκκριςη τησ ορμϐνησ απϐ τα β-παγκρεατικϊ κϑτταρα. Η ςυνυπϊρχουςα παχυςαρκύα προκαλεύ ανϊπτυξη περιφερικόσ αντύςταςησ ςτη δρϊςη τησ ινςουλύνησ [56-59] ωςτϐςο, για την ανϊπτυξη Δ2 απαιτεύται η ϑπαρξη και διαταραχόσ ςτην εκκριτικό ικανϐτητα των β-κυττϊρων. Ϊχει παρατηρηθεύ πωσ ςτο Δ2 εμφανύζονται μεταβολϋσ ςτον κϑκλο ϋκκριςησ τησ ινςουλύνησ, ελαττωμϋνη ςυχνϐτητα εκκριτικών ώςεων τησ ινςουλύνησ, καθυςτϋρηςη τησ απϐκριςησ των β- κυττϊρων ςτην ϊνοδο των επιπϋδων γλυκϐζησ και/ ό απώλεια αναγνώριςησ τησ γλυκϐζησ ωσ διεγϋρτη. [60] Αποτελεύ τη ςυχνϐτερη μορφό Δ ςτο Δυτικϐ κϐςμο (90-95% των περιπτώςεων με Δ). [61] Εύναι πολυπαραγοντικϐ νϐςημα, μη πλόρωσ διευκρινιςμϋνησ αιτιολογύασ. Κατϊ κανϐνα ςυνυπϊρχει παχυςαρκύα ό αυξημϋνη εναπϐθεςη λύπουσ ενδοκοιλιακϊ κατϊ τη διϊγνωςη (90%). πϊνια παρουςιϊζεται κετοξϋωςη. Παρατηρεύται βαθμιαύα εμφϊνιςη των ςυμπτωμϊτων και για αυτϐ το λϐγο ςυχνϊ παραμϋνει αδιϊγνωςτοσ για αρκετϊ χρϐνια. Εμφανύζεται ςυνόθωσ ςε μϋςησ και μεγαλϑτερησ ηλικύασ ϊτομα, αν και αυτϐ τεύνει να ανατραπεύ τα τελευταύα χρϐνια κυρύωσ λϐγω τησ αυξημϋνησ εμφϊνιςησ τησ παχυςαρκύασ ςτον παιδικϐ πληθυςμϐ. ε αυτϐν τον τϑπο διαβότη παύζει ςημαντικϐ ρϐλο η γενετικό προδιϊθεςη. Επιπλϋον υπϊρχουν και μονογονιδιακϋσ, μενδελικϊ κληρονομοϑμενεσ μορφϋσ του Δ2. Μετϊλλαξη ςτο γονύδιο KIR6.2 ευθϑνεται για την εμφϊνιςη του Νεογνικοϑ ακχαρώδη Διαβότη. [62] Μετϊλλαξη ςτο γονύδιο PPARγ προκαλεύ το ςϑνδρομο αντύςταςησ ςτη ςϑνδεςη του PPARγ (PPARγ ligand resistance syndrome) [63] το οπούο χαρακτηρύζεται απϐ ςοβαρό ινςουλινο-αντύςταςη και εκδηλώςεισ παρϐμοιεσ με το μεταβολικϐ ςϑνδρομο. το ςϑνδρομο MODY (Μaturity Οnset Diabetes of Youth) παρατηρεύται πρώιμη εγκατϊςταςη υπεργλυκαιμύασ και ϋκπτωςη ςτη λειτουργύα των β-κυττϊρων. [64] Ϊχει παρϐμοια αλλϊ ηπιϐτερη κλινικό εικϐνα με του Δ2 και αφορϊ το 2-5% των ατϐμων νεαρόσ ηλικύασ με Δ2. Κληρονομεύται με αυτοςωμικϐ επικρατό τρϐπο ενώ ενοχοποιοϑνται 6 ϋωσ τώρα γνωςτϋσ μεταλλϊξεισ: HNF-4-α, γονύδιο τησ γλυκοκινϊςησ, HNF-1-α, IPF-1, HNF-1-β και NEUROD1. [65-69,71] Οι περιςςϐτερεσ περιπτώςεισ Δ2 ςε νϋουσ διαγιγνώςκεται κατϊ την εφηβεύα, γεγονϐσ που πιθανϐν ςχετύζεται εν μϋρει με τη φυςιολογικό εμφϊνιςη αντύςταςησ ςτην ινςουλύνη (~30%) ςε αυτό την περύοδο. [72] Σα κορύτςια εμφανύζουν περύπου 1,7 φορϋσ μεγαλϑτερο κύνδυνο απϐ τα αγϐρια να αναπτϑξουν Δ2. [73] Παρϊγοντεσ κινδϑνου για την εμφϊνιςη Δ2 αποτελοϑν: Ηλικύα >45 ϋτη (αν και η νεαρό ηλικύα πλόττεται εξύςου ςυχνϊ πλϋον). Παχυςαρκύα (>120% του ιδανικοϑ βϊρουσ).

28 27 Οικογενειακϐ ιςτορικϐ Δ2 ςε πρώτου βαθμοϑ ςυγγενεύσ. Ιςτορικϐ διαταραγμϋνησ ανοχόσ ςτη γλυκϐζη (IGT) ό διαταραγμϋνησ γλυκϐζησ νηςτεύασ (IFG). Τπϋρταςη (>140/90 mm Hg) ό δυςλιπιδαιμύα (HDL-χοληςτερϐλη <40 mg/dl ό τριγλυκερύδια >150 mg/dl). Ιςτορικϐ διαβότη κυόςεωσ ό γϋννηςη βρϋφουσ βϊρουσ >4kg. ϑνδρομο πολυκυςτικών ωοθηκών (προκαλεύ ινςουλινο-αντύςταςη). Ϊχει παρατηρηθεύ αϑξηςη του κινδϑνου για εμφϊνιςη Δ2 ςε ϊτομα με μικρό διϊρκεια ϑπνου (<5 ώρεσ). [74] Θεραπευτικϊ, δύνεται μεγϊλη βϊςη ςτην αντιμετώπιςη τησ ςυχνϊ ςυνυπϊρχουςασ παχυςαρκύασ με ϊςκηςη και δύαιτα καθώσ επύςησ και ςτη ρϑθμιςη των υπολούπων παραγϐντων κινδϑνου για την ανϊπτυξη αθηρωμϊτωςησ που μπορεύ να υπϊρχουν (αρτηριακό υπϋρταςη, δυςλιπιδαιμύα, κϊπνιςμα κ.ϊ.). Επιπροςθϋτωσ, χρηςιμοποιοϑνται αντιγλυκαιμικϊ φϊρμακα τα οπούα διαφϋρουν χωρύζονται ανϊλογα με τον κϑριο μηχανιςμϐ δρϊςησ ωσ προσ το μεταβολιςμϐ τησ γλυκϐζησ: [27,75] επαγωγό τησ ϋκκριςη τησ ινςουλύνησ απϐ τα β-κϑτταρα (ςουλφονυλουρύεσ, μεγλιτιδύνεσ), αϑξηςη τησ ευαιςθηςύα των ιςτών ςτη δρϊςη τησ ινςουλύνησ (διγουανύδια, θειαζολιδινεδιϐνεσ), μεύωςη ςτην απορρϐφηςη τησ γλυκϐζησ ςτο ϋντερο (αναςτολεύσ α- γλυκοςιδϊςησ) ανϊλογα πεπτιδύων που εμπλϋκονται ςτο μεταβολιςμϐ των υδατανθρϊκων: ανϊλογα ινκρετύνησ: GLP1 ανϊλογα ό αγωνιςτϋσ / GIP ανϊλογα DPP-4 αναςτολεύσ ανϊλογα αμυλύνησ. Δεν απαιτεύται (τουλϊχιςτον εξ αρχόσ) η χορόγηςη εξωγενοϑσ ινςουλύνησ. υχνϊ γύνεται ςυγχορόγηςη αντιδιαβητικοϑ διςκύου (πχ. διγουανύδιομετφορμύνη) και ινςουλύνησ (ςυμβατικϐ ςχόμα 1-2 ενϋςεων). τον Πύνακα 3, αναγρϊφονται ςυνοπτικϊ τα κυριϐτερα χαρακτηριςτικϊ του Δ1 και Δ2.

29 28 ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΔΙΑΒΗΣΗ τϑπου 1 ΔΙΑΒΗΣΗ τϑπου 2 Συπικό ηλικύα εμφϊνιςησ Παιδικό ηλικύα & εφηβεύα Ενόλικεσ (>40 ετών) * Γενετικό Προδιϊθεςη Φαμηλό Τψηλό Αντύςωμα ϋναντι β- Παρϐντα (90-95%) Απϐντα κυττϊρων ωματοδομό Υυςιολογικό/λεπτό Παχϑςαρκη Ινςουλύνη πλϊςματοσ / C-πεπτύδιο Φαμηλό / Απϐν Τψηλό / Τψηλό Κϑρια μεταβολικϊ χαρακτηριςτικϊ Ανεπϊρκεια ινςουλύνησ Ινςουλινο θεραπεύα Καλό ανταπϐκριςη Αναγκαύα Υϊρμακα που επϊγουν Όχι καλό ανταπϐκριςη ϋκκριςη ινςουλύνησ Μεταβολικϐ ςϑνδρομο & μη ευαιςθηςύα ςε ινςουλύνη Απαιτοϑνται υψηλϋσ δϐςεισ Καλό ανταπϐκριςη *Αυξημϋνη εμφϊνιςη του Δ2 και ςτα παιδιϊ πλϋον. Πύνακασ 3: Κυριϐτερα χαρακτηριςτικϊ Δ1 και Δ2. (Hans Reinauer, 2002) γ ακχαρώδησ Διαβότησ τησ κϑηςησ ϑμφωνα με την Αμερικανικό Διαβητολογικό Εταιρύα (ADA) ο διαβότησ κϑηςησ ορύζεται ωσ οποιουδόποτε βαθμοϑ διαταραχό ςτην ανοχό ςτη γλυκϐζη η οπούα διαπιςτώθηκε για πρώτη φορϊ κατϊ τη διϊρκεια τησ εγκυμοςϑνησ. Η διϊγνωςη ιςχϑει και ςτην περύπτωςη που η διαταραχό διατηρεύται και μετϊ το πϋρασ τησ εγκυμοςϑνησ ό πιθανολογεύται η ϑπαρξό τησ πριν την εγκυμοςϑνη αλλϊ η εντϐπιςό τησ κατϊ τη διϊρκεια αυτόσ. [76] Ο ϋλεγχοσ για διαβότη κατϊ τη διϊρκεια τησ κϑηςησ περιλαμβϊνει τεςτ ανοχόσ ςτη γλυκϐζη (OGTT) διϊρκειασ 1 ώρασ, με χορόγηςη απϐ του ςτϐματοσ 50 gr γλυκϐζη, κατϊ την 24η-28η εβδομϊδα κϑηςησ. Επύ εμφανύςεωσ ςυγκϋντρωςησ γλυκϐζησ πλϊςματοσ 1 ώρα μετϊ το τεςτ >140mg/dl (7.8mmol/L) πραγματοποιεύται διαγνωςτικό OGTT μεγαλϑτερησ διϊρκειασ, με χορόγηςη εύτε 100 gr γλυκϐζη (διϊρκεια 3-ώρεσ, αυτϐ εφαρμϐζεται κυρύωσ ςτισ ΗΠΑ) ό 75 gr γλυκϐζη [διϊρκεια 2-ώρεσ, World Health Organization (WHO)]. Αφορϊ το 4% των κυόςεων ςτισ ΗΠΑ. Παρϊγοντεσ κινδϑνου αποτελεύ η μαϑρη φυλό, η Νοτιοανατολικό Αςιατικό και Ινδικό καταγωγό, η ηλικύα >35ετών και η παχυςαρκύα. [77] Η εμφϊνιςη του διαβότη κατϊ τη διϊρκεια τησ κϑηςησ οφεύλεται πιθανϐν ςτο αυξημϋνο ςωματικϐ βϊροσ και τισ αλλαγϋσ των μεταβολικών αναγκών ςτην περύοδο αυτό, που οδηγοϑν ςτην ανϊπτυξη αντύςταςησ ςτην ινςουλύνη και δυςλειτουργύα των β-κυττϊρων. ε μοριακϐ επύπεδο, αυτϐ αντιςτοιχεύ ςε διαταραγμϋνη μεταγωγό ςόμτοσ δια μϋςου του υποδοχϋα τησ ινςουλύνησ, ςτουσ μϑεσ και το λιπώδη ιςτϐ. ημαντικϐ ρϐλο ςε αυτό τη διαδικαςύα διαδραματύζει το μϐριο p85α, το οπούο παρεμποδύζει την αλληλεπύδραςη του υποςτρώματοσ του υποδοχϋα τησ ινςουλύνησ (IRS) με το ενδιϊμεςο

30 29 ςηματοδοτικϐ μϐριο PI3κινϊςη και προκαλεύ τελικϊ τη διαταραγμϋνη ενδοκυττϊρια πρϐςληψη τησ γλυκϐζησ απϐ τουσ μεταφορεύσ τησ (GLUT4). [78,79] υνόθωσ μετϊ τον τοκετϐ οι μοριακϋσ διαταραχϋσ αποκαθύςτανται και ο διαβότησ υποχωρεύ. Ψςτϐςο παραμϋνει μεγϊλη πιθανϐτητα (>75%) ανϊπτυξησ Δ2 ςε δεϑτερο χρϐνο εϊν δεν εφαρμοςθεύ ςυςτηματικό δύαιτα και ϊςκηςη. [80] Διαγνωςτικϊ κριτόρια Παρϊ τη γνώςη για τη ςυμπτωματολογύα του Δ όδη απϐ την αρχαιϐτητα, πιο ςαφόσ προςδιοριςμϐσ τησ νϐςου εντοπύζεται ςτισ αρχϋσ του περαςμϋνου αιώνα. Ϊκτοτε τα κριτόρια που χρηςιμοποιοϑνται για τη διϊγνωςη του Δ ϋχουν τροποποιηθεύ αρκετϋσ φορϋσ. ϑμφωνα με τον Παγκϐςμιο Οργανιςμϐ Τγεύασ (WHO, 2006) η διϊγνωςη του Δ τύθεται ϐταν πληρεύται ϋνα εκ των τριών κριτηρύων: i. υμπτωματολογύα του διαβότη ςυν περιςταςιακϊ ςυγκϋντρωςη γλυκϐζησ αύματοσ 200 mg/dl (11.1 mmol/l). Περιςταςιακϊ εννοεύται οποιαδόποτε ςτιγμό τησ ημϋρασ χωρύσ να λαμβϊνεται υπϐψη η διϊρκεια λόψησ του τελευταύου γεϑματοσ. Η κλαςςικό ςυμπτωματολογύα του Δ περιλαμβϊνει ςυνόθωσ πολυουρύα, πολυδιψύα και ανεξόγητη απώλεια βϊρουσ. Ή ii. Γλυκϐζη πλϊςματοσ νηςτεύασ 126 mg/dl (7.0 mmol/l). Νηςτεύα θεωρεύται η μη λόψη τροφόσ για 8 ώρεσ. Ή iii. Γλυκϐζη 200 mg/dl (11.1 mmol/l) μετϊ απϐ 2 ώρεσ κατϊ τη διϊρκεια μιασ OGTT (Oral Glucose Tolerance Test). To test πρϋπει να πραγματοποιεύται βϊςει των οδηγιών του WHO, δηλαδό χορόγηςη γλυκϐζησ που εμπεριϋχει ανϊλογο 75γρ. ϊνυδρησ γλυκϐζησ διαλυμϋνησ ςε νερϐ. * Επύ απουςύασ αναμφύβολησ υπεργλυκαιμύασ, τα ανωτϋρω κριτόρια θα πρϋπει να επιβεβαιωθοϑν με επανϊληψη των μετρόςεων ςε διαφορετικό ημϋρα. τον παιδιατρικϐ πληθυςμϐ ιςχϑουν τα ύδια κριτόρια γλυκαιμικόσ κατϊςταςησ για τη διϊγνωςη του διαβότη ϐπωσ και ςτουσ ενόλικεσ. ε αυτό την ηλικύα εύναι πολϑ ςημαντικό η διαφοροδιϊγνωςη μεταξϑ των υποτϑπων του διαβότη. ε παιδιϊ ηλικύασ <10 ετών εμφανύζεται ςχεδϐν πϊντα Δ1, ωςτϐςο λϐγω τησ αυξανϐμενησ επύπτωςησ τησ παχυςαρκύασ ο Δ2 εμφανύζεται πλϋον ςε μεγϊλο ποςοςτϐ και ςε νεαρϋσ ηλικύεσ, κυρύωσ >15 ετών. Ο διαχωριςμϐσ των κλινικών οντοτότων επιτυγχϊνεται με τον ϋλεγχο των επιπϋδων του C-πεπτιδύου και των αντιςωμϊτων χαρακτηριςτικών για Δ1 καθώσ και με τη λόψη αναλυτικοϑ οικογενειακοϑ ιςτορικοϑ που ςυχνϊ αποκαλϑπτει κϊποια προδιϊθεςη για ςϑνδρομο MODY, Δ1 ό Δ2. [21,81,82] Η διαγνωςτικό προςπϋλαςη του Δ κϑηςησ αναφϋρεται παραπϊνω (κεφ γ).

31 30 Η ΟGTT (Oral Glucose Tolerance Test), γνωςτό και ωσ καμπϑλη ςακχϊρου, εύναι μια εξϋταςη εκτύμηςησ τησ δυνατϐτητασ μεταβολιςμοϑ τησ γλυκϐζησ απϐ τον οργανιςμϐ. Αποτελεύ διαγνωςτικό δοκιμαςύα που χρηςιμοποιεύται για την ανύχνευςη και την εκτύμηςη τησ βαρϑτητασ των διαταραχών ςτην ομοιοςταςύα τησ γλυκϐζησ. Βϊςει των αποτελεςμϊτων τησ OGTT τα ϊτομα διαχωρύζονται ςε φυςιολογικϊ, ςε ϊτομα με παθολογικό ανοχό ςτην ινςουλύνη (Impaired Glucose Tolerance, IGT) και ςε αυτϊ με ςακχαρώδη διαβότη. Αυτϋσ οι διαταραχϋσ (ινςουλύνο-αντύςταςη) εκτιμώνται με την μϋτρηςη τησ γλυκϐζησ αύματοσ ςε περιφερικό φλϋβα πριν και 2 ώρεσ μετϊ την ϋναρξη τησ δοκιμαςύασ OGTT. υγκεκριμϋνα: Προετοιμαςύα αςθενοϑσ: 3 ημϋρεσ ελεϑθερη δύαιτα πλοϑςια ςε υδατϊνθρακεσ και ϊςκηςη. Μη λόψη φαρμακευτικόσ αγωγόσ κατϊ την ημϋρα τησ εξϋταςησ. 12 ώρεσ νηςτεύα. Αποφυγό καπνύςματοσ. Φορόγηςη διαλϑματοσ γλυκϐζησ: o Ενόλικεσ: 75g γλυκϐζησ ςε ml νεροϑ. o Παιδιϊ: 1,75g γλυκϐζησ /kg βϊρουσ με μϋγιςτο τα 75g γλυκϐζησ. Μϋτρηςη γλυκϐζησ πλϊςματοσ ςτουσ χρϐνουσ: 0, 30, 60, 90 και 120 λεπτϊ απϐ τη χορόγηςη του διαλϑματοσ γλυκϐζησ. Μπορεύ να μετρηθεύ επιπροςθϋτωσ και η γλυκϐζη των οϑρων ςε περύπτωςη υπεργλυκαιμύασ. Εκτύμηςη αποτελεςμϊτων: ΚΑΣΗΓΟΡΙΕ ΔΙΑΣΑΡΑΦΗ ΜΕΣΑΒΟΛΙΜΟΤ ΓΛΤΚΟΖΗ ΥΤΙΟΛΟΓΙΚΟ Νηςτεύα 2ώρεσ μετϊ τη χορόγηςη δ/τοσ 75gr Glu ΔΙΑΣΑΡΑΓΜΕΝΗ ΑΝΟΦΗ ΣΗ ΓΛΤΚΟΖΗ (IGT)- (προδιαβότησ) Νηςτεύα ό/και 2ώρεσ μετϊ τη χορόγηςη δ/τοσ 75gr Glu ΑΚΦΑΡΨΔΗ ΔΙΑΒΗΣΗ Νηςτεύα ό/και 2ώρεσ μετϊ τη χορόγηςη δ/τοσ 75gr Glu ΔΙΑΣΑΡΑΓΜΕΝΗ ΓΛΤΚΟΖΗ ΝΗΣΕΙΑ Νηςτεύα ό/και 2ώρεσ μετϊ τη χορόγηςη δ/τοσ 75gr Glu ΤΓΚΕΝΣΡΨΗ ΓΛΤΚΟΖΗ ςε mg/dl (mmol/l) ( ) < 140 (7.8) ( ) ( ) >126 (7.0) > 200 (11.1) ( ) <140 (7.8) (American Diabetes Association. 2009)

32 31 Η ανωτϋρω διαδικαςύα αναφϋρεται ςτην κλαςςικό OGTT. Τπϊρχει επύςησ και η εξελιγμϋνη OGTT, η οπούα διαρκεύ 180 λεπτϊ και η μϋτρηςη τησ γλυκϐζησ αύματοσ γύνεται ςτουσ χρϐνουσ: 0, 30, 60, 90, 120 και 180 λεπτϊ. τουσ αντύςτοιχουσ χρϐνουσ, εκτϐσ απϐ τη γλυκϐζη ελϋγχονται και τα επύπεδα τησ ινςουλύνησ και του C-πεπτιδύου ςτο πλϊςμα. Ακϐμα, ϋχει βρεθεύ πωσ ςτον παιδιατρικϐ πληθυςμϐ ο ϋλεγχοσ των επιπϋδων του C-πεπτιδύου (παρϊ των επιπϋδων τησ γλυκϐζησ) ςτο χρϐνο των 15 λεπτών κατϊ τη διϊρκεια μιασ δοκιμαςύασ OGTT αντικατοπτρύζει τη λειτουργύα των β- κυττϊρων του παγκρϋατοσ και ςυνεπώσ κατ αυτϐ τον τρϐπο εκτιμϊται η πρώτη φϊςη ϋκκριςησ τησ ινςουλύνησ. [83] Η ανοχό ςτη γλυκϐζη μπορεύ επύςησ να εκτιμηθεύ με δοκιμαςύα κατϊ την οπούα η χορόγηςη τησ γλυκϐζησ γύνεται ενδοφλεβύωσ (IVGTT). Με αυτό τη δοκιμαςύα ελϋγχεται η ανταπϐκριςη του οργανιςμοϑ ςτο γλυκαιμικϐ φορτύο και η πρώτη φϊςη ϋκκριςησ τησ ινςουλύνησ απϐ το πϊγκρεασ. Σϋλοσ, αξιϐπιςτη μϋθοδοσ εκτύμηςησ τησ αντύςταςη των ιςτών ςτη δρϊςη τησ ινςουλύνησ αποτελεύ το "hyperinsulinemic euglycemic clamp", το οπούο ωςτϐςο δεν χρηςιμοποιεύται ςτην καθημερινό κλινικό πρϊξη αλλϊ κυρύωσ ερευνητικϊ. Κατϊ τη διϊρκεια τησ δοκιμαςύασ, χορηγεύται ενδοφλεβύωσ ινςουλύνη ( mu/m 2 /λεπτϐ) καθώσ επύςησ και γλυκϐζη 20% προκειμϋνου να αντιςταθμιςτεύ η δρϊςη τησ χορηγοϑμενησ ορμϐνησ. κοπϐσ εύναι η διατόρηςη ευγλυκαιμύασ (γλυκϐζη πλϊςματοσ: mmol/l) κατϊ τη διϊρκεια ϋγχυςησ τησ ινςουλύνησ και για αυτϐ γύνεται μϋτρηςη τησ γλυκϐζησ αύματοσ κϊθε 5-10 λεπτϊ. Η ςυνολικό διϊρκεια τησ διαδικαςύασ εύναι 2 ώρεσ ενώ, το ποςϐ τησ χορηγοϑμενησ γλυκϐζησ ςτα τελευταύα 30 λεπτϊ εύναι ενδεικτικϐ τησ ινςουλινο-ευαιςθηςύασ του οργανιςμοϑ. [84] Επιδημιολογύα ακχαρώδη Διαβότη Η επύπτωςη του Δ ςε ϐλεσ τισ ηλικιακϋσ ομϊδεσ παγκοςμύωσ υπολογύςτηκε περύπου ςτο 2.8% κατϊ το ϋτοσ 2000, ενώ θεωρεύται πωσ θα φθϊςει το 4.4.% ϋωσ το ϋτοσ Ο ςυνολικϐσ αριθμϐσ των ατϐμων που πϊςχουν απϐ Δ προβλϋπεται πωσ θα αυξηθεύ απϐ 171 εκατομμϑρια (2000) ςε 366 εκατομμϑρια (2030). Θεωρεύται πωσ 50% των ατϐμων με Δ παραμϋνουν αδιϊγνωςτοι ςυνεπώσ το ςϑνολο των διαβητικών εκτιμϊται διπλϊςιο αυτοϑ που προαναφϋρθηκε! [20,85] Ο Δ2 αποτελεύ τη ςυχνϐτερη μορφό διαβότη (95% των περιπτώςεων). [61] Η παχυςαρκύα αποτελεύ ιςχυρϐ παρϊγοντα ενύςχυςησ τησ αυξανϐμενησ επύπτωςησ του Δ ωςτϐςο, ακϐμα κι αν παραμεύνει ςταθερό η εξϊπλωςη τησ παχυςαρκύασ ϋωσ το 2030 θεωρεύται πωσ ο αριθμϐσ των διαβητικών αςθενών θα υπερδιπλαςιαςθεύ εξαιτύασ τησ γόρανςησ του πληθυςμοϑ και τησ αςτικοπούηςησ. [20,85] Η εμφϊνιςη του Δ εύναι πιο ςυχνό ςτισ χώρεσ τησ Ινδύασ, Κύνασ, ΗΠΑ, Ινδονηςύασ, Ρωςύασ, Ιαπωνύασ, Πακιςτϊν, Βραζιλύασ και Ιταλύασ. Ο Δ αποτελεύ την ϋβδομη αιτύα θανϊτου [86] [ενώ περύπου 4 εκατομμϑρια θϊνατοι ετηςύωσ αποδύδονται ςτισ επιπλοκϋσ του. [87] ϑμφωνα με δημογραφικϊ ςτοιχεύα [86], η εμφϊνιςη ακχαρώδη Διαβότη ςε νϋουσ ηλικύασ <20 ετών ςτισ ΗΠΑ αφορϊ το 0,22% τησ αντύςτοιχησ ηλικιακόσ ομϊδασ ( ϊτομα) ενώ, 2 εκατομμϑρια ϋφηβοι ό 1 ςτουσ 6 υπϋρβαρουσ ϋφηβουσ, ηλικύασ ετών εμφανύζει προδιαβότη. Η δραματικό αϑξηςη τησ παχυςαρκύασ ςτα παιδιϊ και τουσ εφόβουσ τα

33 32 τελευταύα ϋτη (Εικϐνα 10) ευθϑνεται για την αντύςτοιχη αϑξηςη του Δ2 ςε αυτϐ τον πληθυςμϐ. [88,89] Εικϐνα 10: Επύπτωςησ τησ παχυςαρκύασ ςε παιδιϊ και ϋφηβουσ τα τελευταύα 30 ϋτη. Παρ ϐλα αυτϊ ϐμωσ, ο Δ1 ςυνεχύζει να αποτελεύ τη ςυχνϐτερη μορφό διαβότη ςτισ μικρϐτερεσ ηλικύεσ, προςβϊλλοντασ 8-40: παιδιϊ και εφόβουσ. [28,29,90] Η ςυχνϐτερη εμφϊνιςη του Δ1 παρατηρεύται ςτη Υινλανδύα και τη αρδηνύα (40: παιδιϊ) [316-7]. Ετηςύωσ παρατηρεύται αϑξηςη ςτην επύπτωςη του Δ1 ςτα παιδιϊ κατϊ μϋςο ϐρο κατϊ 5%, με μεγαλϑτερη επιβϊρυνςη τησ ηλικιακόσ ομϊδασ 0-4ετών.

34 Επιπλοκϋσ του ακχαρώδη Διαβότη Όπωσ προαναφϋρθηκε, ςτα κυριϐτερα ςυμπτώματα του Δ ανόκει η πολυουρύα, η πολυδιψύα και η απώλεια βϊρουσ ενώ η μακροχρϐνια υπεργλυκαιμύα αυξϊνει την επιρρϋπεια των διαβητικών αςθενών ςτην ανϊπτυξη λοιμώξεων. Ο Δ ϐμωσ, ςυνοδεϑεται απϐ επιπλοκϋσ οι οπούεσ μπορεύ να εύναι οξεύεσ και μακροχρϐνιεσ Οξεύεσ επιπλοκϋσ του Δ τισ οξεύεσ επιπλοκϋσ του Δ περιλαμβϊνεται η οξεύα απορρϑθμιςό του, η οπούα μπορεύ να οδηγόςει ςε κετοξϋωςη ό μη κετωςικϐ υπερωςμωτικϐ ςϑνδρομο και τελικϊ ςε κώμα, καταςτϊςεισ που μποροϑν να αποβοϑν απειλητικϋσ για το διαβητικϐ αςθενό. Η διαβητικό κετοξϋωςη εύναι πιο ςυχνό ςτο Δ1, ενώ μπορεύ να αποτελϋςει την πρώτη του κλινικό εκδόλωςη. Η θνηςιμϐτητα αγγύζει το 10-15% ενώ τα πιο ςυχνϊ κλινικϊ χαρακτηριςτικϊ τησ διαβητικόσ κετοξϋωςησ εύναι: ναυτύα, ϋμετοσ, οξϑ κοιλιακϐ ϊλγοσ, θϊμβοσ ϐραςη, αφυδϊτωςη, υπϐταςη, ϋντονη ϋνδεια για αϋρα (αναπνοό Kussmaul), απϐπνοια ακετϐνησ, ςϑγχυςη, κώμα (10%). Η παθοφυςιολογύα τησ διαβητικόσ κετοξϋωςησ αναπτϑςςεται ςτην Εικϐνα 11. ΙΝΟΤΛΙΝΟΠΕΝΙΑ ΤΠΕΡΓΛΤΚΑΙΜΙΑ *μειωμϋνη χρηςιμοπούηςη Glu περιφερικϊ *αυξημϋνη γλυκογονϐλυςη *αυξημϋνη γλυκονεογϋνεςη ΛΙΠΟΛΤΗ *αϑξηςη ελεϑθερων λιπαρών οξϋων *αϑξηςη οξεύδωςησ λ. οξϋων *γλυκοζουρύα *ωςμωτικό διοϑρηςη *αφυδϊτωςη *υποογκαιμύα & αιμοςυμπϑκνωςη *προνεφρικό αζωθαιμύα *αϑξηςη γλοιϐτητασ αύματοσ *κετογϋνεςη *κετοναιμύα *κετοξϋωςη *shock ΟΞΕΩΗ *μικροθρομβώςεισ/ δ/χό μικροκυκλοφορύασ ΓΑΛΑΚΣΙΚΗ ΟΞΕΩΗ Εικϐνα 11: Παθοφυςιολογύα διαβητικόσ κετοξϋωςησ. (Τροποποίηςη ςχήματοσ από: Abbas E Kitabchi, 2009) Όςον αφορϊ ςτο μη κετωςικϐ υπερωςμωτικϐ ςϑνδρομο, αφορϊ ςυνόθωσ ηλικιωμϋνουσ με μη διαγνωςμϋνο Δ οι οπούοι λϐγω αφυδϊτωςησ εμφανύζουν: Βαριϊ υπεργλυκαιμύα (>900mg/dl) Αυξημϋνη ωςμωτικϐτητα αύματοσ

35 34 Βαριϊ αφυδϊτωςη Προνεφρικό ουραιμύα Όχι ςημαντικό υπερκετοναιμύα ό οξϋωςη Η κατϊςταςη αυτό ςχετύζεται με υψηλό θνηςιμϐτητα (ωσ 50%). Ωλλη μια οξεύα επιπλοκό του Δ αποτελεύ η υπογλυκαιμύα, η οπούα ςυνόθωσ γύνεται κλινικϊ ϋκδηλη ςε επύπεδα γλυκϐζησ <65mg/dl. ε ϊτομα με αυςτηρϊ ρυθμιςμϋνο Δ τα ςυμπτώματα εμφανύζονται ςε ακϐμα χαμηλϐτερα επύπεδα γλυκϐζησ αύματοσ. Η υπογλυκαιμύα εύναι πιο ςυχνό ςτα ϊτομα με Δ1 και ςε αυτϊ με Δ2 που λαμβϊνουν ςουλφονυλουρύεσ (p.os αντιδιαβητικϊ διςκύα). Η ςυμπτωματολογύα τησ υπογλυκαιμύασ προϋρχεται απϐ: Αυτϐνομο Νευρικϐ ϑςτημα: o Εφύδρωςη o Σρϐμοσ o Αύςθημα παλμών o Αύςθημα πεύνασ o Ωγχοσ Νευρογλυκοπενύα: o ϑγχυςη o Τπνηλύα o Δυςχϋρεια λϐγου o Αδυναμύα ςυγκϋντρωςησ o Αςυνϋργια o Χυχικϋσ μεταβολϋσ Μη ειδικϊ: o Ναυτύα o Κϊματοσ o Κεφαλαλγύα τα παιδιϊ, εύναι πιο ςυχνό η εμφϊνιςη των αλλαγών ςυμπεριφορϊσ ενώ ςτουσ ηλικιωμϋνουσ τα νευρολογικϊ ςυμπτώματα. Η ςοβαρό υπογλυκαιμύα μπορεύ να οδηγόςει ςε κώμα, ςπαςμοϑσ, εγκεφαλικό ιςχαιμύα, καρδιακό αρρυθμύα ό/και ιςχαιμύα, ωσ και ςε θϊνατο. [91] Φρϐνιεσ επιπλοκϋσ του Δ Μακροπρϐθεςμα ςτο Δ αναπτϑςςονται βλϊβεσ οι οπούεσ αφοροϑν τα μεςαύουμεγϊλου μεγϋθουσ (μακρο-αγγειοπϊθεια) καθώσ και τα μικροϑ (μικροαγγειοπϊθεια) μεγϋθουσ αγγεύα. Όςον αφορϊ ςτη μακρο-αγγειοπϊθεια, μπορεύ να προςβϊλλει τα ςτεφανιαύα αγγεύα (ιςχαιμικό νϐςοσ καρδιϊσ), τα αγγεύα του εγκεφϊλου (αγγειοεγκεφαλικϊ επειςϐδια) ό τα περιφερικϊ αγγεύα (περιφερικό αγγειοπϊθεια-ςυμβολό ςτην ανϊπτυξη διαβητικοϑ ποδιοϑ). Η καρδιαγγειακό νϐςοσ αποτελεύ περύπου το 50% των θανϊτων των διαβητικών αςθενών ςτισ βιομηχανοποιημϋνεσ χώρεσ. Σα αγγειοεγκεφαλικϊ επειςϐδια εμφανύζονται με 2-4 φορϋσ μεγαλϑτερη ςυχνϐτητα ςτα ϊτομα με Δ. [87]

36 35 υνϋπεια τησ μικρο-αγγειοπϊθειασ εύναι η ανϊπτυξη διαταραχόσ ςτη λειτουργύα οργϊνων που αιματώνονται ωσ επύ των πλεύςτων απϐ τϋτοιου εύδουσ αγγεύα. Αποτϋλεςμα εύναι η εμφϊνιςη διαβητικόσ νεφροπϊθειασ και τελικϊ νεφρικόσ ανεπϊρκειασ, διαβητικόσ αμφιβληςτροειδοπϊθειασ και τϑφλωςησ, διαβητικόσ νευροπϊθειασ και διαβητικοϑ ποδιοϑ (ϋλκη κϊτω ϊκρων & ακρωτηριαςμϐσ) ό/και αρθροπϊθειασ Charcot, νευροπϊθεια του αυτϐνομου νευρικοϑ ςυςτόματοσ και γαςτρεντερικϋσ, καρδιαγγειακϋσ, ουρολογικϋσ και ςεξουαλικϋσ δυςλειτουργύεσ. [20,21] Η διαβητικό νευροπϊθεια αποτελεύ την πιο ςυχνό επιπλοκό του Δ και θεωρεύται ϐτι 60-70% των διαβητικών αςθενών προςβϊλλονται απϐ μϋτρια ϋωσ ςοβαρό νευρικό διαταραχό. Η διαβητικό αμφιβληςτροειδοπϊθεια ϋχει βρεθεύ πωσ οδηγεύ ςε τϑφλωςη περύπου το 2% των αςθενών με διαβότη διϊρκειασ ϊνω των 15 ετών ενώ, περύπου 10% αυτών αναπτϑςςουν ποικύλησ βαρϑτητασ διαταραχό ςτην ϐραςη. Επύςησ, ο διαβότησ αποτελεύ τη ςυχνϐτερη αιτύα μη τραυματικοϑ ακρωτηριαςμοϑ των κϊτω ϊκρων. Σϋλοσ, η νεφρικό ανεπϊρκεια αποτελεύ μια ςυχνό κατϊληξη τησ νεφρικόσ βλϊβησ που επιφϋρει ο διαβότησ και ςχετύζεται με την χρονιϐτητα και την αυςτηρό ρϑθμιςό του. [87] το Δ1 εύναι πιο ςυχνό η εμφϊνιςη τησ μικρο-αγγειοπϊθειασ ωςτϐςο, επύ ςυνυπϊρξεωσ παχυςαρκύασ ό δυςλιπιδαιμύασ αυξϊνεται ο κύνδυνοσ ανϊπτυξησ και μακρο-αγγειοπϊθειασ. Σο τελευταύο εύναι η αιτύα για την οπούα η μακροαγγειοπϊθεια αποτελεύ την πιο ςυχνό μορφό επιπλοκών ςτα ϊτομα με Δ2. Εκτιμϊται πωσ διαμεςολαβεύται διϊςτημα αρκετών ετών απϐ την ϋναρξη των μεταβολικών αλλαγών του Δ μϋχρι την εγκατϊςταςη των αγγειακών διαταραχών. το Δ2, λϐγω τησ όπιασ ειςβολόσ των ςυμπτωμϊτων και του μεγϊλου ποςοςτοϑ των αδιϊγνωςτων ατϐμων, ςυχνϊ υπϊρχει όδη κϊποια αγγειακό δυςλειτουργύα κατϊ τη διϊρκεια τησ διϊγνωςησ τησ νϐςου Παθογϋνεια τησ διαβητικόσ αγγειοπϊθειασ. Η ανϊπτυξη αυτόσ τησ μακρο-αγγειοπϊθειασ οφεύλεται ςτη διαταραγμϋνη ομοιϐςταςη του μεταβολιςμοϑ των λιπιδύων και τησ αρτηριακόσ πύεςησ με ςυνϋπεια την αυξημϋνη επύπτωςη τησ αθηροςκλόρωςησ ςτα αγγεύα των διαβητικών αςθενών. [21] Η αθηροςκλόρυνςη που ςχετύζεται με το διαβότη θεωρεύται πιο ςοβαρόσ μορφόσ αθηρωμϊτωςη, λϐγω τησ πρώιμησ εγκατϊςταςό τησ. Οι παθοφυςιολογικού μηχανιςμού που εμπλϋκονται ςτην ανϊπτυξη τησ μακροαγγειοπϊθειασ εύναι πολλαπλού και περύπλοκοι, και περιλαμβϊνουν: αιμοςτατικϋσ διαταραχϋσ, ενδοθηλιακό δυςλειτουργύα, οξειδωτικϐ stress, ποςοτικϋσ και ποιοτικϋσ ανωμαλύεσ των λιποπρωτεώνών, εν μϋρει η υπερινςουλιναιμύα και η δρϊςη αυξητικών παραγϐντων. [92] ϑμφωνα με τισ μελϋτεσ DCCT (Diabetes Control and Complications Trial Research) και UKPDS (UK Prospective Diabetes Study), η υπεργλυκαιμύα αποτελεύ τον πιο ιςχυρϊ ςυνδεδεμϋνο παρϊγοντα με την ανϊπτυξη των μικροαγγειοπαθητικών επιπλοκών του Δ. [93,94] Η χρϐνια υπεργλυκαιμύα που χαρακτηρύζει το Δ προκαλεύ τη δομικό και λειτουργικό τροποπούηςη οριςμϋνων μορύων, επηρεϊζοντασ κατϊ αυτϐ τον τρϐπο την ενεργϐτητα των μεταγωγικών μονοπατιών ςτα οπούα εμπλϋκονται και τισ αντύςτοιχεσ κυτταρικϋσ λειτουργιϋσ. Παρϐτι η υπεργλυκαιμύα εύναι καθολικό ςτο διαβητικϐ οργανιςμϐ, εντοϑτοισ μϐνο οριςμϋνα κϑτταρα (ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, λεύα μυώκϊ κϑτταρα, μεςαγγειακϊ

37 36 κϑτταρα του νεφρικοϑ ςπειρϊματοσ, νευρικϊ κϑτταρα και κϑτταρα Schwann) υπϐκεινται ςτισ βλαπτικϋσ επιδρϊςεισ τησ. Αυτϐ οφεύλεται ςτο γεγονϐσ ϐτι, τα ςυγκεκριμϋνα κϑτταρα παρϐτι εκτύθενται ςτην υπεργλυκαιμύα δεν αναςτϋλλουν την εύςοδο τησ γλυκϐζησ εντϐσ αυτών, με αποτϋλεςμα τα αυξημϋνα επύπεδα τησ γλυκϐζησ ενδοκυτταρύωσ. [95,96] Αποτϋλεςμα τησ αυξημϋνησ ενδοκυττϊριασ ςυγκϋντρωςησ τησ γλυκϐζησ ςε αυτϊ τα κϑτταρα εύναι η επαγωγό 4 κυρύωσ μεταγωγικών μονοπατιών. υγκεκριμϋνα: 1) Μονοπϊτι τησ ρεδουκτϊςησ τησ αλδϐζησ / πολυολών. Η ρεδουκτϊςη τησ αλδϐζησ φυςιολογικϊ μειώνει τισ τοξικϋσ αλδεΰδεσ ςτον οργανιςμϐ, μετατρϋποντϊσ τεσ ςε ανενεργϋσ αλκοϐλεσ. Όμωσ, επύ υπϊρξεωσ αυξημϋνων ενδοκυττϊριων επιπϋδων γλυκϐζησ, η ρεδουκτϊςη τησ αλδϐζησ επύςησ μειώνει τη γλυκϐζη μετατρϋποντϊσ τη ςε ςορβιτϐλη (η οπούα εν ςυνεχεύα οξειδώνεται προσ φρουκτϐζη). Κατϊ τη διϊρκεια αυτόσ τησ διαδικαςύασ ϐμωσ η ρεδουκτϊςη τα αλδϐζησ καταναλώνει το ςυμπαρϊγοντα NADPH, [97] ο οπούοσ επιτελεύ μεύζονα ρϐλο ςτη ςϑνθεςη ενϐσ ςημαντικοϑ ενδοκυττϊριου αντιοξειδωτικοϑ, τη γλουταθειϐνη (Εικϐνα 12) υνεπώσ, η υπεργλυκαιμύα του Δ επϊγει το μονοπϊτι των πολυολών και τελικϊ το ενδοκυττϊριο οξειδωτικϐ stress λϐγω τησ προκαλοϑμενησ μεύωςησ ςτα επύπεδα τησ γλουταθειϐνησ. [98] Εικϐνα 12: Επαγωγό του μονοπατιοϑ των πολυολών λϐγω υπεργλυκαιμύασ. (Brownlee M: 2001). 2) Μονοπϊτι των εξωςαμινών. Ο φυςιολογικϐσ αερϐβιοσ καταβολιςμϐσ τησ γλυκϐζησ (γλυκϐλυςη) περιλαμβϊνει την αρχικό μετατροπό τησ ςε γλυκϐζη-6-φωςφορικϐ ϊλασ, μετϊ ςε φρουκτϐζη-6-φωςφορικϐ ϊλασ και ϋπειτα λαμβϊνει χώρα το υπϐλοιπο γλυκολυτικϐ μονοπϊτι (Εικϐνα 13). Ψςτϐςο, ςε καταςτϊςεισ υπεργλυκαιμύασ, μϋροσ του φρουκτϐζη-6-φωςφορικοϑ ϊλατοσ εκτρϋπεται προσ ϋνα ϊλλο μεταγωγικϐ μονοπϊτι ϐπου το ϋνζυμο GFAT (Glutamine: Fructose-6 Phosphate Amido Transferase) μετατρϋπει το ϊλασ ςε γλουταμινϊςη-6-φωςφορικϐ ϊλασ και τελικϊ ςε UDP (διφωςφορικϐ ϊλασ τησ ουριδύνησ) N-ακετυλο γλυκοςαμύνη. υχνϊ αυτϐ οδηγεύ ςε παθολογικό

38 37 γονιδιακό ϋκφραςη ϐπωσ, αϑξηςη ϋκφραςησ του TGF-β1 (Σransforming Growth Factor-β1) και του πλαςμινογϐνου, ςυμβϊλλοντασ ςτην ενδοθηλιακό βλϊβη που αναπτϑςςεται ςτα αγγεύα των διαβητικών αςθενών. [99] Εικϐνα 13: Επαγωγό μονοπατιοϑ εξωςαμινών λϐγω υπεργλυκαιμύασ. (Brownlee M: 2001). 3) Μονοπϊτι τησ διακυλο-γλυκερϐλησ (DAG) και τησ β2 πρωτεώνικόσ κινϊςησ C (β2 PKC). Λϐγω τησ αυξημϋνησ ενδοκυττϊριασ ςυγκϋντρωςησ τησ γλυκϐζησ ςτο Δ, αυξϊνεται η ςϑνθεςη του μορύου τησ διακυλο-γλυκερϐλησ (DAG). H DAG εύναι ςημαντικϐσ ςυμπαρϊγοντασ ενεργοπούηςησ των ιςομορφών β, δ και α τησ πρωτεινκόσ κινϊςησ C (PKC). Καθώσ η τελευταύα ενεργοποιεύται ςτα πλαύςια τησ υπεργλυκαιμύασ, ποικιλύα γονιδύων υπϐκεινται μεταβολϋσ ςτην ϋκφραςό τουσ με δυςμενεύσ κυτταρικϋσ/ιςτικϋσ επιπτώςεισ (Εικϐνα 14). [ ] Εικϐνα 14: Επαγωγό μονοπατιοϑ DAG/PKC λϐγω υπεργλυκαιμύασ. (Diabetes, American Diabetes Association, 2005)

39 38 4) Μονοπϊτι τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ. Η υπεργλυκαιμύα που χαρακτηρύζει το Δ οδηγεύ ςτη μη ενζυματικό αλληλεπύδραςη τησ πλεονϊζουςασ γλυκϐζησ με ποικιλύα κυτταρικών μορύων, επηρεϊζοντασ κατϊ αυτϐ τον τρϐπο τη δομό αλλϊ και τη λειτουργύα τουσ. υγκεκριμϋνα, η καρβοξυλικό ομϊδα τησ γλυκϐζησ ςυνδϋεται μη ενζυματικϊ με τισ αμινομϊδεσ των πρωτεώνών, των λιπιδύων και των νουκλεινικών οξϋων. Αρχικϐ(εντϐσ διαςτόματοσ ωρών) αποτϋλεςμα αυτόσ τησ αντύδραςησ εύναι η δημιουργύα των βϊςεων Schiff. Αυτϋσ οι δομϋσ εύναι αναςτρϋψιμεσ ωςτϐςο επύ εμμϋνουςασ (διϊρκεια ημερών) υπεργλυκαιμύασ και μακροχρϐνιασ διατόρηςησ τησ προαναφερθεύςασ αντύδραςησ παρϊγονται τα πιο ςταθερϊ - μη αναςτρϋψιμα ςωματύδια Amandori. Σελικό κατϊληξη (περύοδοσ εβδομϊδων) αυτόσ τησ αντύδραςησ εύναι η δημιουργύα των, επύςησ μη αναςτρϋψιμων, τελικών προώϐντων προχωρημϋνησ γλυκοζυλύωςησ (Advanced Glycation End-products, AGEs) (Εικϐνα 15). [106] Η αντύδραςη αυτό εύναι όδη γνωςτό απϐ το 1912 ωσ Maillard ό browning αντύδραςη, εξαιτύασ τησ παρατόρηςησ πωσ ϐταν τα αμινοξϋα θερμαύνονται υπϐ την παρουςύα ςακχϊρων εμφανύζουν ϋνα χαρακτηριςτικϐ κύτρινο-καφϋ χρώμα. [107,108] Εικϐνα 15: Μηχανιςμϐσ δημιουργύασ των AGEs. υνολικϐ αποτϋλεςμα ϐλων των προαναφερθειςών μεταβολών των 4 μεταγωγικών μονοπατιών εύναι η αγγειακό δυςλειτουργύα. Δηλαδό, η διαταραγμϋνη ρϑθμιςη τησ διαςτολόσ/ςϑςπαςησ των αγγεύων, η αυξημϋνη αγγειακό διαπερατϐτητα, η κυτταρικό δυςλειτουργύα και η αλλαγό των ιδιοτότων τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ. υνεπακϐλουθο εύναι η διαςϊλευςη τησ φυςιολογικόσ αιμϊτωςησ, ϊρα και λειτουργύασ, των ιςτών/οργϊνων και η εμφϊνιςη των χρϐνιων επιπλοκών του Δ (Εικϐνα 16).

40 39 Εικϐνα 16: ϑνοψη μηχανιςμών ανϊπτυξησ χρονύων επιπλοκών του Δ. Παρϐτι ϋχει διαπιςτωθεύ η υπερλειτουργύα αυτών των 4 μεταγωγικών μονοπατιών ςτο Δ, δεν ϋχει εντοπιςθεύ επακριβώσ το κοινϐ ςτοιχεύο που επηρεϊζουν. Ψςτϐςο, διαφαύνεται πωσ κοινό κατϊληξη και των 4 μονοπατιών εύναι η υπερπαραγωγό υπεροξειδύων απϐ τη μιτοχονδριακό αλυςύδα ηλεκτρονύων. Υαύνεται πωσ ςε ϐλα τα προςβεβλημϋνα απϐ την υπεργλυκαιμύα κϑτταρα παρουςιϊζονται αυξημϋνα επύπεδα ενεργών ριζών οξυγϐνου (ROS), δεύγμα οξειδωτικϐυ stress. [99,109] Πιο αναλυτικϊ, λϐγω τησ αυξημϋνησ ενδοκυττϊριασ ςυγκϋντρωςησ, περιςςϐτερη γλυκϐζη οξειδώνεται ςτον κϑκλο του τρικαρβοξυλικοϑ οξϋοσ (TCA κϑκλοσ ό κϑκλοσ του Krebs). Η ςυνεπακϐλουθη αυξημϋνη παραγωγό ηλεκτρονύων (e - ) ϋχει ςαν αποτϋλεςμα την ώθηςη των δοτών e - (NADH και FADH2) προσ τη μιτοχονδριακό αλυςύδα μεταφορϊσ των e -. Σελικϐ αποτϋλεςμα εύναι η αϑξηςη τησ τϊςησ (διαφορϊσ κλύςησ e - ) εκατϋρωθεν τησ μιτοχονδριακόσ μεμβρϊνησ πϋραν ενϐσ κρύςιμου κατώτερου ςημεύου και η επαγωγό τησ οξεύδωςησ του υπεροξειδύου.

41 Παρακολοϑθηςη (follow-up) αςθενών με Δ υμπεραςματικϊ, η ςυςτηματικό παρακολοϑθηςη (Follow-up) των αςθενών θεωρεύται αναπϐςπαςτο κομμϊτι τησ ςωςτόσ ρϑθμιςησ του Δ. Αυτό ςυνύςταται κατ αρχϊσ ςε ϋλεγχο τησ γλυκοζυλιωμϋνησ αιμοςφαιρύνησ (HbA1c) κϊθε 3-4 μόνεσ. Η HbA1c εύναι το μη αναςτρϋψιμο γλυκοζυλιωμϋνο κλϊςμα τησ αιμοςφαιρύνησ Α1 (HbA1) των ερυθρών αιμοςφαιρύων και αποτελεύ αντικειμενικϐ δεύκτη διακϑμανςησ των επιπϋδων γλυκϐζησ αύματοσ ςε διϊςτημα παρελθϐντων 3-4 μηνών (διϊςτημα ύςο με το χρϐνο ζωόσ των απϑρηνων ερυθρών κυττϊρων = 120 ημϋρεσ). [110] Αποτελεύ ενδιϊμεςο προώϐν (ςωμϊτιο Amandori) τησ διεργαςύασ τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ ενώ, τα επύπεδα τησ ϋχουν ςυςχετιςθεύ ιςχυρϊ με τον κύνδυνο ανϊπτυξησ μικροαγγειοπαθητικών αλλοιώςεων ςτα ϊτομα με Δ. [111] Παρϐτι χρηςιμοποιεύται ωσ μϋτρο εκτύμηςησ του γλυκαιμικοϑ ελϋγχου, δεν ϋχει εδραιωθεύ ακϐμα η χρόςη τησ ωσ διαγνωςτικϐ κριτόριο του Δ. [112,113] Υυςιολογικϋσ τιμϋσ τησ HbA1c θεωροϑνται: 4,5-5,9% ενώ, για τουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ ο ςτϐχοσ τησ θεραπευτικόσ αντιμετώπιςησ εύναι η διατόρηςη επιπϋδων HbA1c <7% λϐγω του μειωμϋνου ό μηδαμινοϑ κινδϑνου εμφϊνιςησ αγγειακών επιπλοκών ςε αυτϊ τα επύπεδα τησ γλυκοζυλιωμϋνησ αιμοςφαιρύνησ (DCCT μελϋτη). [93] Ο ςυςτηματικϐσ ϋλεγχοσ των διαβητικών αςθενών περιλαμβϊνει επύςησ: πρϐληψη και ϋγκυρη διϊγνωςη των επιπλοκών του Δ (1 φορϊ/ϋτοσ: ϋλεγχοσ τησ αλβουμύνησ οϑρων 24ώρου και βυθοςκϐπηςη, 2 φορϋσ/ϋτοσ: ϋλεγχοσ βιοχημικοϑ και λιπιδαιμικοϑ προφύλ) ενώ ςτα ϊτομα με Δ1 εύναι ζωτικόσ ςημαςύασ ο ϋλεγχοσ τησ διακϑμανςησ των επιπϋδων γλυκϐζησ πλϊςματοσ ςε ςχϋςη με τη χορηγοϑμενη ινςουλύνη και τα γεϑματα. κοπϐσ εύναι να τροποποιεύται το δοςολογικϐ ςχόμα με τρϐπο ώςτε να αποφεϑγονται οι ακραύεσ διακυμϊνςεισ των επιπϋδων γλυκϐζησ ςτη διϊρκεια του 24ώρου (sliding scale). [114]

42 Ειδικϐ Μϋροσ Μη ενζυματικό γλυκοζυλύωςη Γενικϊ Όπωσ αναφϋρθηκε όδη, ϋνα εκ των μονοπατιών που υπερλειτουργοϑν ςτο Δ και ευθϑνονται για την εγκατϊςταςη των επιπλοκών του, εύναι αυτϐ τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ. υνοπτικϊ, η καρβοξυλικό ομϊδα τησ γλυκϐζησ ςυνδϋεται μη ενζυματικϊ με τισ αμινομϊδεσ των πρωτεώνών, των λιπιδύων και των νουκλεινικών οξϋων προκαλώντασ μεταβολϋσ ςτη δομό και τη λειτουργύα τουσ. Η διεργαςύα αυτό, εξελιςςϐμενη, δύνει γϋνεςη ςε ϐλο και πιο ςταθερϊ-μη αναςτρϋψιμα προώϐντα, καταλόγοντασ ςτα τελικϊ προώϐντα μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ (AGEs) (Εικϐνα 17, α). Παρϊλληλα με τη διαδικαςύα δημιουργύασ των AGEs επϊγεται το μονοπϊτι του καρβονυλικοϑ stress (carbonyl stress). υγκεκριμϋνα, η αυτο-οξεύδωςη των βϊςεων Schiff και των ςωματύων Amandori προκαλεύ τη δημιουργύα ενδιϊμεςων ενεργών δικαρβονυλικών ενώςεων, οι οπούεσ ονομϊζονται α-δικαρβονϑλια ό οξοαλδεΰδεσ και παρϊγωγα αυτών εύναι οι 3-δεοξυ-γλυκοςϐνη, γλυοξϊλη και μεθυλ-γλυοξϊλη. Σα ενδιϊμεςα αυτϊ προώϐντα διατηροϑν την ικανϐτητα να αλληλεπιδροϑν με τισ ελεϑθερεσ αμινομϊδεσ των πρωτεώνών, τροποποιώντασ αφενϐσ τη λειτουργικϐτητϊ τουσ και ςυνειςφϋροντασ αφετϋρου ςτο ςχηματιςμϐ των AGEs (Εικϐνα 17, β). [106, ] α β Εικϐνα 17: Πιθανού μηχανιςμού ςχηματιςμοϑ των AGEs. Σελικϊ προώϐντα προχωρημϋνησ γλυκοζυλύωςησ (AGEs); N-ε-καρβοξυ-μεθυλ-λυςύνη (CML), N-ε-καρβοξυ-αιθυλ-λυςύνη (CEL), διμερϋσ γλυοξαλ-λυςύνησ (GOLD); διμερϋσ μεθυλ-γλυοξαλ-λυςύνησ (MOLD) (G. Basta, (2004) Ακϐμα, τα AGEs δημιουργοϑνται και μϋςω διεργαςιών οι οπούεσ δεν εξαρτώνται απϐ τη γλυκϐζη. Αυτού οι μηχανιςμού ενεργοποιοϑνται ςτα ουδετερϐφιλα, τα μονοκϑτταρα και τα μακροφϊγα κϑτταρα μϋςω τησ δρϊςησ του ενζϑμου τησ μυελουπεροξειδϊςησ. υγκεκριμϋνα, η ενεργοπούηςη των κυττϊρων αυτών ςε

43 42 καταςτϊςεισ/εςτύεσ φλεγμονόσ προκαλεύ την επαγωγό τησ δρϊςησ του ενζϑμου, το οπούο ςυμμετϋχει ςτην παραγωγό υποχλωρικοϑ οξϋοσ (ΗΟCl) απϐ H2Ο2 και χλώριο. Σο προώϐν τησ αντύδραςη αυτόσ ςχετύζεται με την παραγωγό ενεργών αλδευδών απϐ ελεϑθερα αμινοξϋα (οξεύδωςη αμινοξϋων) καθώσ και AGEs απϐ πρωτεινικϊ μϐρια, επύ παρουςύασ ελεϑθερων αμινοξϋων. [118] Η ςϑνθεςη των AGEs απϐ τα ενεργοποιημϋνα φλεγμονώδη κϑτταρα ενιςχϑει την ϊποψη για ςτενό ςχϋςη μεταξϑ των διαδικαςιών τησ φλεγμονόσ, των AGEs και πιθανϐν των επιπλοκών του Δ. Η ενδογενόσ ςϑνθεςη των AGEs αυξϊνεται ςε φυςιολογικϋσ καταςτϊςεισ ϐπωσ η γόρανςη αλλϊ και ςε διϊφορεσ παθολογικϋσ καταςτϊςεισ ϐπωσ η υπεργλυκαιμύα (ακχαρώδησ Διαβότησ), η νϐςοσ Alzheimer ό η νεφρικό δυςλειτουργύα. [106] Ψςτϐςο, τα AGEs μπορεύ να ληφθοϑν και εξωγενώσ, δεδομϋνου ϐτι εμπεριϋχονται ςτον καπνϐ του τςιγϊρου [119,120] αλλϊ και ςε πλόθοσ τροφών (γλυκοτοξύνεσ) (Πύνακασ 4). Πύνακασ 4: ϑςταςη οριςμϋνων τροφύμων ςτα AGEs: methylyglyoxal (MG) & carboxymetyllysine (CML). (Uribarri J, 2010)

44 43 ε ϋλεγχο 250 κοινών χρηςιμοποιοϑμενων τροφύμων για την περιεκτικϐτητϊ τουσ ςε AGEs βρϋθηκε πωσ η ομϊδα που υπερτερεύ εύναι αυτό των τροφύμων πλοϑςιων ςε λιπαρϊ. Επύςησ, υψηλό περιεκτικϐτητα ςε AGEs βρϋθηκε ςτην ομϊδα των κρεϊτων και των υποκατϊςτατων αυτών. Ση χαμηλϐτερη ςυγκϋντρωςη των AGEs εμπεριεύχε η ομϊδα των υδατανθρϊκων. ημαντικϐ ρϐλο ςτην περιεκτικϐτητα των τροφύμων ςε AGΕs θεωρεύται πωσ παύζει ο τρϐποσ μαγειρϋματοσ τουσ (θερμοκραςύα και διϊρκεια μαγειρϋματοσ, ϑπαρξη υγραςύασ). υγκεκριμϋνα, παρατηρόθηκε πωσ το ψόςιμο ςτη ςχϊρα (225 o C) και το τηγϊνιςμα (177 o C) ςυνδϋονται με ςυςςώρευςη μεγϊλων ποςών AGEs ςτισ τροφϋσ. Ακολουθεύ το ψόςιμο ςτο φοϑρνο (177 o C) ενώ, η μικρϐτερη περιεκτικϐτητα ςε AGEs εντοπύςθηκε ςε τρϐφιμα που εύχαν βραςθεύ (110 o C). [121] Σα AGEs που λαμβϊνονται μϋςω τροφόσ διαθϋτουν τισ ύδιεσ προ-οξειδωτικϋσ και προ-φλεγμονώδεισ ιδιϐτητεσ με τα ενδογενώσ ςυντιθϋμενα AGEs, [122] για το λϐγο αυτϐ θεωρεύται πωσ ςυςχετύζονται με την ανϊπτυξη χρϐνιων φλεγμονωδών καταςτϊςεων ςε κατϊ τα ϊλλα υγιό ϊτομα. [123] Επύςησ, ϋχει βρεθεύ πωσ η υπϋρμετρη ειςαγωγό ςτη διατροφό θερμικϊ επεξεργαςμϋνων τροφύμων μπορεύ να επιφϋρει ςτον οργανιςμϐ διαβητογϐνα και νεφροτοξικϊ αποτελϋςματα, όπια φλεγμονώδη αντύδραςη και επαγωγό τησ αθηροςκλόρωςησ. [124] Πλϋον, δύνονται κατευθυντόριεσ οδηγύεσ ώςτε να μειώνεται η περιεκτικϐτητα τησ διατροφόσ ςε AGEs και να προλαμβϊνονται οι μακροχρϐνιεσ βλαπτικϋσ τουσ επιδρϊςεισ. [125] Σο πλόθοσ των διαφορετικών μηχανιςμών μϋςω των οπούων παρϊγονται τα AGEs δικαιολογεύ το γεγονϐσ πωσ τα AGEs αποτελοϑν ϋνα ετερογενϋσ πλόθοσ ενώςεων, με διαφορετικϋσ φυςικϋσ και χημικϋσ ιδιϐτητεσ. Οι ιδιϐτητεσ που μοιρϊζονται εύναι ο φθοριςμϐσ, η διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη (cross-linking) με ϊλλα μϐρια και η παραγωγό καφϋ χρώματοσ κατϊ την αντύδραςη Maillard. Σα AGEs χωρύζονται λοιπϐν ςε 3 κατηγορύεσ [126] (Εικϐνα 18) : 1. Υθορύζοντα, με διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη AGEs (Fluorescent cross-linking AGEs) [πεντοςιδύνη, κροςλύνη]. 2. Μη φθορύζοντα, με διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη AGEs (Non-fluorescent Cross-linking AGEs)[imidazolium dilysine cross-links, alkyl formyl glycosyl pyrrole (AFGP) cross-links και arginine lysine imidazole (ALI) cross-links]. 3. Φωρύσ διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη AGEs (Non-cross linking AGEs) [πυρραλύνη, N-καρβοξυμεθυλολυςύνη (CML)].

45 44 Εικϐνα 18: Φημικό δομό των 3 κατηγοριών των AGEs: 1) φθορύζοντα, με διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη AGEs, 2) μη φθορύζοντα, με διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη AGEs, 3) χωρύσ διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη AGEs. (Nessar Ahmed, 2005) Σο CML (N-καρβοξυ-μεθυλο-λυςύνη) αποτελεύ ϋνα απϐ τα καλϑτερα μελετημϋνα AGEs ενώ, θεωρεύται ωσ κυρύαρχη μορφό των AGEs που ςυςςωρεϑεται in vivo. [127,128] Οι τροποποιόςεισ των πρωτεώνών που ςχετύζονται με αυτϐ και η ιςχυρό ενεργοπούηςη του υποδοχϋα των AGEs (RAGE) απϐ το CML ςχετύζονται ϋντονα με τη διαδικαςύα τησ γόρανςησ αλλϊ και με ϊλλεσ, παθολογικϋσ καταςτϊςεισ ϐπωσ ο Δ ό η νϐςοσ Alzheimer. [ ]

46 Δρϊςεισ των AGEs Σο μονοπϊτι τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ και η δρϊςη των AGEs θεωρεύται πωσ παύζουν ςημαντικϐ ρϐλο ςτην ανϊπτυξη των χρϐνιων αγγειοπαθητικών επιπλοκών του Δ. [106,126, ] Η ςημαντικϐτητα του μονοπατιοϑ των AGEs διαφαύνεται επύςησ απϐ το γεγονϐσ ϐτι ϋνασ απϐ τουσ κυριϐτερουσ παρϊγοντεσ εκτύμηςησ του γλυκαιμικοϑ ελϋγχου ενϐσ διαβητικοϑ αςθενό και του κινδϑνου που φϋρει για την ανϊπτυξη επιπλοκών, εύναι η HbA1c. Η HbA1c ό γλυκοζυλιωμϋνη αιμοςφαιρύνη, ϐπωσ ϋχει όδη αναφερθεύ, αποτελεύ ςωμϊτιο Amandori, δηλαδό ενδιϊμεςο προώϐν τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ τησ αιμοςφαιρύνησ Α1 των ερυθρών αιμοςφαιρύων. [144] Οι μηχανιςμού μϋςω των οπούων τα AGEs ςυνειςφϋρουν ςτην ανϊπτυξη των αγγειακών διαβητικών επιπλοκών εύναι: (1) δημιουργύα διαςταυρούμενων ςυνδέςεων (cross-links) μεταξϑ ςημαντικών μορύων ςτη βαςικό μεμβρϊνη τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ (ΕΚΟ), μεταβϊλλοντασ μη αντιςτρεπτϊ την κυτταρικό δομό και (2) αλληλεπίδραςη με τον μεμβρανικό υποδοχέα τουσ (RAGE) και μεταβολό τησ κυτταρικόσ λειτουργύασ. Επιπλϋον, τα AGEs αλληλεπιδροϑν και με μϐρια κυκλοφοροϑντα ςτο αύμα οπϐτε και τροποποιοϑν τη δομό και τη λειτουργικϐτητϊ τουσ. A) Εξωκυττϊριεσ δρϊςεισ των AGEs Σα AGEs επιδροϑν ςε ϋνα πλόθοσ διαφορετικών μορύων τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ (ΕΚΟ) ϐπωσ τα λιπύδια, το κολλαγϐνο, η λαμινύνη, η ελαςτύνη και η βιτρονεκτύνη. [ ] Η αλληλεπύδραςη των μορύων αυτών με τα AGEs προκαλεύ δομικϋσ και λειτουργικϋσ τροποποιόςεισ αυτών και κατ επϋκταςη τησ ΕΚΟ. Επιπρϐςθετη δρϊςη των AGEs ςτην ΕΚΟ εύναι η ενεργοπούηςη του υποδοχϋα του (TGF)-β (transforming growth factor β) και η επαγωγό του κυτταρικοϑ πολλαπλαςιαςμοϑ. Αποτϋλεςμα εύναι, η υπερτροφύα τησ ΕΚΟ και η περαιτϋρω παρεμπϐδιςη τησ φυςιολογικόσ διαςυνομιλύασ των κυττϊρων τα οπούα περιβϊλλει. Η δομικό διαταραχό τησ ΕΚΟ, ο πολλαπλαςιαςμϐσ τησ και η ςυνοδό αντύςταςό τησ ςτη δρϊςη των πρωτεολυτικών ενζϑμων [παρεμπϐδιςη των φυςιολογικών διεργαςιών τησ ιςτικόσ αποκατϊςταςησ (tissue remodeling)] οδηγεύ ςε ακαμψύα αυτόσ και ςυνεπακϐλουθη κυτταρικό δυςλειτουργύα. [148] Επύςησ, επηρεϊζεται η δομό και η λειτουργύα τησ βαςικόσ μεμβρϊνησ των αγγεύων, γεγονϐσ που οδηγεύ ςτη διαταραγμϋνη διαπερατϐτητϊσ τουσ, αλλούωςη που παρατηρεύται και ςτο Δ. Όπωσ ϐμωσ αναφϋρθηκε, τα AGEs, εκτϐσ απϐ τα δομικϊ ςυςτατικϊ τησ ΕΚΟ αλληλεπιδροϑν και με τα λιπύδια. Η LDL χοληςτερϐλη αποτελεύ υπϐςτρωμα για τη μη ενζυματικό ςϑνδεςη τησ γλυκϐζησ και το ςχηματιςμϐ των AGEs. Ψςτϐςο, αποτελεύ και πρϐςφορο ϋδαφοσ για τη δρϊςη όδη ςχηματιςμϋνων AGEs ςε αυτό. [149,150] Η αυξημϋνη οξειδωτικό τροποπούηςη τησ LDL (oxldl) απϐ τη δρϊςη των AGEs αποτελεύ επιβαρυντικϐ παρϊγοντα για την ανϊπτυξη των μακροαγγειοπαθητικών επιπλοκών που ςυνοδεϑουν το Δ. Επύςησ, η γλυκοζυλιωμϋνη LDL μειώνει τη ςϑνθεςη του οξειδύου του αζώτου (NO) επηρεϊζοντασ τουσ

47 46 φυςιολογικοϑσ μηχανιςμοϑσ τησ αγγειοδιαςτολόσ / αγγειοςϑςπαςησ και επιβαρϑνοντασ περαιτϋρω την αγγειακό δυςλειτουργύα. [152] Σϋλοσ, παρατηρεύται καταςτολό ςτην πρϐςληψη και εκκαθϊριςη τησ γλυκοζυλιωμϋνησ LDL (ςϑμπλοκο AGE-LDL) απϐ τον υποδοχϋα τησ ςτα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα και παρϊταςη τησ βλαπτικόσ τησ δρϊςη ςτισ αθηρωματικϋσ βλϊβεσ των αγγεύων. [152] τον Πύνακασ 5, παρατύθενται ςυνοπτικϊ οι εξωκυττϊριεσ-μη μεςολαβοϑμενεσ απϐ τον υποδοχϋα - δρϊςεισ των AGEs. Μη μεςολαβοϑμενεσ απϐ τον υποδοχϋα δρϊςεισ των AGEs Εξωκυττάρια ουςία Διαςταυροϑμενη ςϑνδεςη με το κολλαγϐνο και αντοχό ςτη δρϊςη τησ κολλαγενϊςησ Επαγωγό ςϑνθεςησ ςυςτατικών τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ Μειωμϋνοσ αυτϐ-πολυμεριςμϐσ τησ λαμινύνησ και ϋκπτωςη ςτη ςϑνδεςό τησ με το κολλαγϐνο τϑπου-iv και τισ πρωτεογλυκϊνεσ θειικόσ ηπαρϊνησ Καταςτολό του οξειδύου του αζώτου (ΝΟ) απϐ τα ςυνδεδεμϋνα με το κολλαγϐνο AGEs Παγύδευςη των LDL και IgG ςτον υπενδοθηλιακϐ χώρο Λιποπρωτεανεσ Μειωμϋνη αναγνώριςη του ςυμπλϐκου ΑGE LDL απϐ τον κυτταρικϐ LDL υποδοχϋα Αϑξηςη επιρρϋπειασ τησ LDL ςε οξειδωτικϋσ τροποποιόςεισ AGEs: τελικϊ προώϐντα προχωρημϋνησ γλυκοζυλύωςησ; LDL: χαμηλόσ πυκνϐτητασ λιποπρωτεϗνη; IgG: ανοςοςφαιρύνεσ G. Πύνακασ 5: Δρϊςεισ των AGEs, μη μεςολαβοϑμενεσ απϐ το μεμβρανικϐ τουσ υποδοχϋα. (G. Basta et al. 2004) B) Eνδοκυττϊριεσ δρϊςεισ των AGEs Οι ενδοκυττϊριεσ δρϊςεισ των AGEs αναπτϑςςονται εύτε λϐγω τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ ενδοκυττϊριων μορύων (ενδοκυττϊρια ςϑνθεςη AGEs), ό ϋπειτα απϐ τη ςϑνδεςη κυκλοφοροϑντων AGEs με ειδικϐ μεμβρανικϐ υποδοχϋα και την ενεργοπούηςη αυτοϑ. Όςον αφορϊ ςτον ενδοκυττϊριο ςχηματιςμϐ των AGEs, ϋχει ςυςχετιςθεύ με τη διαταραχό ςε ποικιλύα κυτταρικών λειτουργιών οι οπούεσ εύναι ςημαντικϋσ για την αγγειακό ομοιϐςταςη. [153,154] Ο ρυθμϐσ ςχηματιςμοϑ των AGEs εύναι ταχϑτεροσ επύ παρουςύασ φυςικών ενδοκυττϊριων ςακχϊρων ϐπωσ φρουκτϐζη, 3- φωςφορικό- γλυκεραλδεΰδη και 6-φωςφορικό-γλυκϐζη. [155] Παρϊδειγμα αυτόσ τησ λειτουργύασ των AGEs εύναι η γλυκοζυλύωςη του βαςικοϑ αυξητικοϑ παρϊγοντα των ινοβλαςτών (basic fibroblast growth factor) η οπούα οδηγεύ ςε ςημαντικό (70%) μεύωςη τησ μιτογϐνου δϑναμησ του κυτταροπλϊςματοσ των ενδοθηλιακών κυττϊρων και την ανϊπτυξη αγγειακόσ δυςλειτουργύασ. [156] Όςον αφορϊ ςτισ υπϐλοιπεσ ενδοκυττϊριεσ δρϊςεισ των AGEs, απαιτεύται η διαμεςολϊβηςη ειδικοϑ μεμβρανικοϑ υποδοχϋα. Ψςτϐςο, για τα AGEs

48 47 υπϊρχουν περιςςϐτεροι του ενϐσ υποδοχεύσ. Οι λειτουργύεσ που εκλϑονται μετϊ την ενεργοπούηςη του εκϊςτοτε υποδοχϋα διαφϋρουν, δεδομϋνου ϐτι οριςμϋνοι υποδοχεύσ ςυμβϊλλουν ςτη βλαπτικό δρϊςη των AGEs (φλεγμονώδησ απϊντηςη, κυτταρικό δυςλειτουργύα) ενώ κϊποιοι ϊλλοι ςυνειςφϋρουν ςτην απομϊκρυνςη τουσ απϐ την κυκλοφορύα και την μεύωςη τησ προ-οξειδωτικόσ τουσ δρϊςησ. Οι υποδοχεύσ των AGEs εύναι οι: [106,140,145] SR-A (Macrophage scavenger receptors types I and II) OST-48 [Oligosaccharyl transferase- 48 (AGE-R1)] 80 K-H phosphoprotein (AGE-R2) galectin-3 (AGE-R3) LOX-1(Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1) CD-36 (Cluster of Differentiation 36) FEEL-1(fasciclin EGF-like, laminin-type EGF-like, and link domaincontaining scavenger receptor-1) & η παρϊλογη πρωτεϗνη του, FEEL-2 Λακτοφερρύνη, Λυςοζϑμη Τποδοχϋασ για τα AGEs (RAGE). Πιο αναλυτικϊ: Οι SR-A (Macrophage scavenger receptors types I and II) αποτελοϑν μϋλη μιασ οικογενεύασ μεμβρανικών υποδοχϋων που ςυνολικϊ καλοϑνται υποδοχεύσ εκκαθαριςτϋσ (scavenger receptors, SRs). [157,158] ε αυτοϑσ τουσ υποδοχεύσ ςυνδϋεται πλόθοσ μορύων, μεταξϑ των οπούων εύναι: τροποποιημϋνεσ λιποπρωτεύνεσ, λιποπολυςακχαρύτεσ (LPS), gram θετικϊ και αρνητικϊ βακτόρια, αποπτωτικϊ κϑτταρα [159] καθώσ και τα AGEs. [160] Θεωρεύται πωσ ο ςυγκεκριμϋνοσ υποδοχϋασ ςχετύζεται με την εγκατϊςταςη των διαβητικών επιπλοκών ϐπωσ η νεφροπϊθεια και η αθηρωμϊτωςη. [161,162] Όςον αφορϊ ςτη διαβητικό νεφροπϊθεια, θεωρεύται πωσ επϊγει τη μετανϊςτευςη των μακροφϊγων ςτουσ νεφροϑσ προκαλώντασ διόθηςη και διαταραχό τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ. [163] Ο AGE-R1 [OST-48 (Oligosaccharyl transferase-48)] θεωρεύται αρνητικϐσ ρυθμιςτόσ του οξειδωτικοϑ stress που επϊγουν τα AGEs καθώσ και των φλεγμονωδών διεργαςιών που εκλϑονται απϐ αυτϊ. Η υπερϋκφραςη του υποδοχϋα ςε μεςαγγειακϊ νεφρικϊ κϑτταρα φϊνηκε να ενιςχϑει τη ςϑνδεςη και αποδϐμηςό των AGEs ενώ, ςυνοδεϑτηκε με αναςτολό ςτην ενεργοπούηςη του RAGE και επιβρϊδυνςη ςτην ανϊπτυξη διαβητικόσ νεφροπϊθειασ. [ ] Σο γεγονϐσ επύςησ ϐτι, ςε διαβητικοϑσ αςθενεύσ με εγκατεςτημϋνεσ επιπλοκϋσ ϋχει παρατηρηθεύ μειωμϋνη ϋκφραςη του AGE-R1 ςτα μονοπϑρηνα κϑτταρα του περιφερικοϑ τουσ αύματοσ και αυξημϋνα επύπεδα AGEs ςτον ορϐ, ενιςχϑει την ϊποψη για τον προςτατευτικϐ ρϐλο που διαδραματύζει ο AGE-R1 ϋναντι των βλαπτικών ιδιοτότων των AGEs. [165] Ο AGE-R2 (80 K-H phosphoprotein) αποτελεύ πρωτεϗνη υπϐςτρωμα τησ πρωτεινικόσ κινϊςησ C (PKC) [167] και ςυνδϋει το μεταγωγικϐ μονοπϊτι του FGFR3 (fibroblast growth factor receptor-3) με αυτϐ των MAP κιναςών (Ras/MAPK μονοπϊτι). Πιςτεϑεται πωσ ςχετύζεται με τη μεταγωγό ςόματοσ μϋςω του υποδοχϋα RAGE, ςυνεπώσ και με τισ φλεγμονώδεισ δρϊςεισ των AGEs. Ο AGE-R3 (galectin-3) αποτελεύ υποδοχϋα με πολλαπλϋσ λειτουργύεσ ϐπωσ ρϑθμιςη τησ προςκϐλληςησ των κυττϊρων, του κυτταρικοϑ κϑκλου καθώσ και τησ λειτουργύασ του ματύςματοσ του mrna. τα μακροφϊγα, τα αςτροκϑτταρα και τα

49 48 ενδοθηλιακϊ κϑτταρα ςυνδϋεται με υψηλό ςυγγϋνεια με τα AGEs ενώ δεν εκφρϊζεται ιδιαύτερα ςτουσ ιςτοϑσ-ςτϐχουσ των διαβητικών επιπλοκών ϐπωσ το μεςϊγγειο και το ενδοθόλιο. Η ϋκφραςη του υποδοχϋα ϐμωσ αυξϊνεται ςε αυτοϑσ τουσ ιςτοϑσ κατϊ τη γόρανςη κα ςε διαβητικϐ περιβϊλλον. [168] Αρχικϊ, αυτό η υπερϋκφραςη του AGE-R3 ςτο νεφρικϐ ιςτϐ θεωρόθηκε πωσ ενιςχϑει την ιςτικό αναδιαμϐρφωςη που ευθϑνεται για την ανϊπτυξη τησ διαβητικόσ νεφροπϊθειασ. Ψςτϐςο, παρατηρώντασ την εμφϊνιςη εντονϐτερων ιςτικών αλλοιώςεων ςε διαβητικϐ περιβϊλλον ςε AGE-R3 (-) ποντύκια ςε ςχϋςη με τα φυςιολογικϊ εδραιώθηκε η ϊποψη τησ προςτατευτικόσ δρϊςησ του υποδοχϋα ϋναντι τησ AGEεπαγώμενησ ιςτικόσ βλϊβησ. [169,170] Ο LOX-1(Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1) αποτελεύ μια λεκτύνη C τϑπου που ςυνδεϐμενη με την οξειδωμϋνη LDL (oxldl) προκαλεύ την ενδοκυττϊρωςη και τη λυςοςωμικό αποδϐμηςό τησ. Η λειτουργύα αυτό πιςτεϑεται πωσ δύνει ϋναυςμα ςτη δημιουργύα των αφρωδών κυττϊρων και τησ αθηρωματικόσ πλϊκασ. Ο LOX-1 ϐμωσ αποτελεύ και ενδοθηλιακϐ υποδοχϋα των AGEs τα οπούα μϊλιςτα ανταγωνύζονται ςτη ςϑνδεςη την oxldl. [171,172] Ο CD-36 (Cluster of Differentiation 36) υποδοχϋασ αποτελεύ μϋλοσ τησ ομϊδασ Β των υποδοχϋων εκκαθαριςτών (class B scavenger receptor family, SR-B). Θεωρεύται πωσ διαμεςολαβεύ την ενδοκυττϊρωςη και τη μετϋπειτα αποδϐμηςη των AGEs πρωτεινών οπϐτε και λειτουργεύ προςτατευτικϊ ϋναντι των βλαπτικών δρϊςεων των AGEs. [173] Ο FEEL-1 (fasciclin EGF-like, laminin-type EGF-like, and link domain-containing scavenger receptor-1) ανόκει ςτην ομϊδα των υποδοχϋων εκκαθαριςτών. Ο FEEL- 2 εύναι ϋνα παρϊλογο γονύδιο του FEEL-1 και εμφανύζει 40% ομολογύα με την αμινοξικό του αλληλουχύα. Θεωρεύται πωσ, η ςϑνδεςη των 2 υποδοχϋων με τα AGEs προκαλεύ ενδοκυττϊρωςη αυτών και ενεργοπούηςη μεταγωγικών μονοπατιών που πιθανϐν ςχετύζονται με την ανϊπτυξη των αλλοιώςεων τησ γόρανςησ και του διαβότη. [174] Η λακτοφερρίνη και η λυςοζγμη αποτελοϑν 2 μεγϊλεσ αντιβακτηριακϋσ πρωτεϗνεσ και αποτελοϑν εκκαθαριςτικοϑσ υποδοχεύσ για τα AGEs. Η αϑξηςη τησ ςυγκϋντρωςησ των AGEs εμποδύζει την ενζυμικό και αντιβακτηριακό δρϊςη τησ λυςοζϑμησ ενώ αναςτϋλλει τισ βακτηριο-προςκολλητικϋσ και βακτηριοκτϐνεσ ιδιϐτητεσ τησ λακτοφερρύνησ. Η δρϊςη αυτό των AGEs πιθανϐν ερμηνεϑει την αυξημϋνη επύπτωςη των λοιμώξεων ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ. [139,175] Ο RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts) εύναι ο καλϑτερα μελετημϋνοσ υποδοχϋασ των AGEs. χετύζεται με την ανϊπτυξη των προοξειδωτικων και προ-φλεγμονωδών δρϊςεων των AGEs. [176] Αναλϑεται περαιτϋρω ςτη ςυνϋχεια.

50 Τποδοχϋασ των AGEs (RAGE) Γενικϊ Ο RAGE αποτελεύ ϋναν πολυπροςδετικϐ μεμβρανικϐ υποδοχϋα, τησ υπεροικογϋνειασ των ανοςοςοςφαιρινών. Σο γονύδιο που τον κωδικοποιεύ εύναι γνωςτϐ και ωσ AGER, και εδρϊζεται ςτο χρωμϐςωμα 6 (6p 21-3), ςτην περιοχό του μεύζονοσ ςυςτόματοσ ιςτοςυμβατϐτητασ (ΜΗC). [177] Υυςιολογικϊ, εκφρϊζεται ςε χαμηλϊ επύπεδα ςτα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, τα μεςαγγειακϊ κϑτταρα, τισ λεύεσ μυώκϋσ ύνεσ, τα μονοκϑτταρα, τισ ινοβλϊςτεσ και τα νευρικϊ κϑτταρα ενώ, παρατηρεύται φυςιολογικϊ αυξημϋνη ϋκφραςό του ςτα τϑπου Ι πνευμονοκϑτταρα και τα εμβρυικϊ κϑτταρα. [178,179] Η ϋκφραςη του υποδοχϋα αυξϊνεται ςε καταςτϊςεισ που ςχετύζονται με τισ διαδικαςύεσ τησ φλεγμονόσ ϐπωσ οι αγγειακϋσ νϐςοι, ο καρκύνοσ, η ανϊπτυξη του νευρικοϑ ςυςτόματοσ και ο ςακχαρώδησ διαβότησ. [ ] Εξαύρεςη αποτελεύ η μεύωςη τησ ϋκφραςη του υποδοχϋα ςε φυςιολογικϊ επύπεδα, ςτον καρκύνο του πνεϑμονα και την ιδιοπαθό πνευμονικό ύνωςη. [184,185] Τπϊρχουν 3 μορφϋσ του υποδοχϋα RAGE: 1) Πλόρουσ μόκουσ υποδοχϋασ RAGE (full-length RAGE) 2) RAGE χωρύσ κυτταροπλαςματικό ουρϊ (dominant-negative RAGE) 3) Διαλυτϋσ μορφϋσ RAGE (srage) Πλόρουσ μόκουσ RAGE (full-length RAGE) Tο ςυνολικϐ μόκοσ του πλόρουσ υποδοχϋα RAGE εύναι 394 αμινοξϋα. Ο RAGE ςυνύςταται απϐ μια εξωκυττϊρια υπομονϊδα (334αα), μια υδρϐφοβη διαμεμβρανικό α-ϋλικα (19αα) και μια μικρό ενδοκυττϊρια ουρϊ (43αα). Σο εξωκυττϊριο τμόμα του υποδοχϋα αποτελεύται απϐ 3 δομϋσ που ομοιϊζουν με ανοςοςφαιρύνεσ: 2 ςταθερϋσ C-δομϋσ (C1, C2) και μια μεταβλητό V-δομό ςτο αμινοτελικϐ ϊκρο [186] (Εικϐνα 19). H V και C1 δομϋσ δεν εύναι ανεξϊρτητεσ μεταξϑ τουσ και μϊλιςτα αποτελοϑν μια ενιαύα δομικό μονϊδα. Αντύθετα, η C2 εύναι πλόρωσ ανεξϊρτητη δομό και ςυνδϋεται με τη V-C1 μϋςω ενϐσ εϑκαμπτου ςυνδϋτη. Η κυρύωσ υπεϑθυνη δομό για τη ςϑνδεςη των προςδετών ςτον RAGE εύναι η V- δομό, ωςτϐςο ςυνεργιςτικϐ αλλϊ δευτερεϑοντα ρϐλο διαδραματύζει και η C1-δομό. [187]

51 50 Εικϐνα 19: Δομό του υποδοχϋα των AGEs (RAGE). Ο υποδοχϋσ αποτελεύται απϐ: 1 εξωκυττϊριο τμόμα το οπούο ςυνύςταται ςε 1 V και 2 C δομϋσ, 1 διαμεμβρανικϐ τμόμα και 1 ενδοκυττϊρια ουρϊ. (T. Ostendorp et al, 2007) Ο RAGE ϋχει τη δυνατϐτητα να αλληλεπιδρϊ με τϊξεισ μορύων και ϐχι μεμονωμϋνουσ προςδϋτεσ εξαιτύασ τησ ιδιομορφύασ τησ V-C1 δομόσ του. υγκεκριμϋνα, η V-C1 δομό λϐγω τησ ευκαμψύασ τησ ςε ςχϋςη με τη C2-δομό, ϋχει τη δυνατϐτητα να αλληλεπδρϊ με διαφορετικϊ μϐρια ςτα οπούα αναγνωρύζει μϐνο την τριτοταγό και ϐχι την πρωτοταγό δομό. υνεπώσ, υπϊρχει πλόθοσ προςδετών που ςυνδϋονται ςτον RAGE και η αλληλεπύδραςό τουσ με αυτϐν ςχετύζεται με ποικύλεσ κλινικϋσ οντϐτητεσ. [187] τον Πύνακα 6 αναφϋρονται οι προςδϋτεσ του RAGE καθώσ και η κλινικό τουσ ςπουδαιϐτητα. Προςδϋτεσ του RAGE Κλινικό ςπουδαιϐτητα AGEs Διαβητικϋσ και ουραιμικϋσ επιπλοκϋσ, αθηροθρϐμβωςη, γόρανςη. S100/calgranulins Υλεγμονώδησ απϊντηςη: ρευματοειδόσ αρθρύτιδα, πολλαπλό ςκλόρυνςη, φλεγμονώδεισ νϐςοι του εντϋρου. HMGB-1(Amphoterin) Οντογϋνεςη του κεντρικοϑ νευρικοϑ ςυςτόματοσ. Διόθηςη καρκύνου, αγγειογϋνεςη, μετϊςταςη. β-ινύδια αμυλοειδοϑσ Εναπϐθεςη διαταραγμϋνα αναδιπλωμϋνων πρωτεώνών: νϐςοσ Alzheimer, αμυλοεύδωςη. β2- ιντεγκρύνη Mac-1 Προςκϐλληςη λευκοκυττϊρων: φλεγμονώδησ απϊντηςη Πύνακασ 6: Προςδϋτεσ του υποδοχϋα RAGE και οι κλινικϋσ οντϐτητεσ ςτισ οπούεσ εμπλϋκεται η μεταξϑ τουσ αλληλεπύδραςη. (N. Vazzana et al. 2009) Η ςϑνδεςη των προςδετών ςτο RAGE δεν οδηγεύ ςε κϊθαρςη ό αποδϐμηςό τουσ αλλϊ ςε ενεργοπούηςη ενϐσ πλόθουσ ενδοκυττϊριων διεργαςιών οι οπούεσ πυροδοτοϑνται μϋςω τησ ενδοκυττϊριασ ουρϊσ του υποδοχϋα και καταλόγουν ςτην παραγωγό προ-οξειδωτικών και προ-φλεγμονωδών παραγϐντων. Πιο αναλυτικϊ, η ενεργοπούηςη του υποδοχϋα προκαλεύ την ενεργοπούηςη μορύων που ανόκουν ςε διαφορετικϊ μεταγωγικϊ μονοπϊτια μεταξϑ των οπούων εύναι το μονοπϊτι των ΜΑΡ κιναςών [mitogen activated protein kinases (MAPK)] και τα μϐρια (ERK)-1/2 (extracellular regulated kinase), p38 και c-jun N-terminal kinase (JNK), Jak/STATs, phosphoinositol 3-kinase (PI3K) καθώσ και το μονοπϊτι τησ Rho

52 51 GTPase και τα μϐρια Cdc42 και Rac-1 [106,134,181-2, ] (Εικϐνα 20). Επιπλϋον ϐμωσ, η ενεργοπούηςη του RAGE επϊγει το ςχηματιςμϐ ενεργών ριζών οξυγϐνου (ROS) μϋςω τησ ενεργοπούηςησ τησ NAD(P)H οξειδϊςησ και ϊλλων ενδοκυττϊριων πηγών ROS, ϐπωσ η μιτοχονδριακό αλυςύδα μεταφορϊσ ηλεκτρονύων. [194] Σελικϐ αποτϋλεςμα τησ κινητοπούηςησ αυτών των μεταγωγικών μορύων /μονοπατιών εύναι η ενεργοπούηςη πυρηνικών μεταγραφικών παραγϐντων, ϐπωσ ο NF-κB (nuclear growth factor-κb), και η μεταβολό ςτην ϋκφραςη πλόθουσ γονιδύων. [131, 190,195] Ο NF-κB εμπλϋκεται ςτην ϋκφραςη των γονιδύων για την ενδοθηλύνη-1, τον ιςτικϐ παρϊγοντα (Tissue Factor;TF), τη θρομβομοδουλύνη, των προφλεγμονωδών κυτταροκινών ϐπωσ η ιντερλευκύνη-1α (IL-1α), η ιντερλευκύνη-6 (IL-6) και ο παρϊγοντασ νϋκρωςησ του ϐγκου-α (Tumor Necrosis Factor-α;TNF-α) καθώσ και των μορύων προςκϐλληςησ ϐπωσ το ενδοθηλιακϐ προςκολλητικϐ μϐριο-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1; VCAM-1) και το διακυτταρικϐ προςκολλητικϐ μϐριο-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1; ICAM-1). [106,126,183,196-7] Η ενεργοπούηςη του υποδοχϋα RAGE επϊγει την περαιτϋρω ϋκφραςη του γονιδύου που τον κωδικοποιεύ καθώσ και οριςμϋνων απϐ τουσ υπϐλοιπουσ υποδοχεύσ των AGEs (SR-a, CD36). Εικϐνα 20: Μεταγωγικϊ μονοπϊτια του υποδοχϋα RAGE. [PI3K: 3-φωςφατιδυλο-ινοςιτϐλη κινϊςη, MAPK: ενεργοποιημϋνη απϐ μιτογϐνα πρωτεώνικό κινϊςη, NF-κΒ: πυρηνικϐσ παρϊγοντασ-κβ, ICAM- 1: διακυτταρικϐ προςκολλητικϐ μϐριο-1, VCAM-1: ενδοθηλιακϐ προςκολλητικϐ μϐριο-1, VEGF: αγγειακϐσ αυξητικϐσ παρϊγοντασ, TNF-α: παρϊγοντασ νϋκρωςησ του ϐγκου-α, MCP-1: χημειοτακτικό πρωτεϗνη των μονοκυττϊρων-1, SR: εκκαθαριςτικϐσ υποδοχϋασ, IL: ιντερλευκύνη] (N. Vazzana et al. 2009) υνοψύζοντασ, η ενεργοπούηςη του RAGE μετϊ τη ςϑνδεςη των προςδετών του προκαλεύ αϑξηςη ςτην ϋκφραςη προ-φλεγμονωδών και προςκολλητικών μορύων και την παραγωγό βλαπτικών οξειδωτικών παραγώγων ςτα κϑτταρα που τον

53 52 εκφρϊζουν, ϐπωσ τα ενδοθηλιακϊ και τα μονοπϑρηνα κϑτταρα. Αυτϋσ οι αλλαγϋσ, ςε ςυνδυαςμϐ με τη μειωμϋνη διαθεςιμϐτητα του ΝΟ (βλϋπε δρϊςεισ των AGEs) προκαλοϑν διαταραχό ςτη διαπερατϐτητα των αγγεύων και όπια χρϐνια φλεγμονώδη διόθηςό τουσ απϐ ενεργοποιημϋνα μονοκϑτταρα. Επύςησ, η αυξημϋνη ϋκφραςη των εκκαθαριςτικών υποδοχϋων των AGEs (SR-Α & CD36) ςτα μονοκϑτταρα-μακροφϊγα ςυνεπϊγεται αυξημϋνη ενδοκυττϊρωςη τησ oxldl και δημιουργύα των αφρωδών κυττϊρων, κυττϊρων που ςχετύζονται ςτενϊ με την ανϊπτυξη τησ αθηρωματικόσ πλϊκασ. Μϋςω αυτών των ςυςχετύςεων ενιςχϑεται η ςτενό ςχϋςη μεταξϑ των AGEs, τησ μεταγωγόσ ςόματοσ μϋςω του RAGE, των μονοκυττϊρων και τησ οξειδωτικόσ ενδοθηλιακόσ βλϊβησ με την ανϊπτυξη των χρϐνιων αγγειακών επιπλοκών του διαβότη. [126,134,198-9] τον Πύνακα 7 παρατύθενται ςυνοπτικϊ οι δρϊςεισ των AGEs που μεςολαβοϑνται απϐ τον υποδοχϋα τουσ και ςχετύζονται με την ανϊπτυξη τησ αγγειακόσ βλϊβησ, ενώ ςτην Εικϐνα 21 φαύνεται το ςϑνολο των ενδο- και εξωκυττϊριων δρϊςεων των AGEs. Μεςολαβοϑμενεσ απϐ τον υποδοχϋα δρϊςεισ των AGEs Μονοπγρηνα φαγοκγτταρα Επαγωγό των PDGF, IGF-1, IL-1 h και TNF-α Φημειοταξύα απϐ τα διαλυτϊ AGEs Αποπταξύα απϐ τα ακινητοποιημϋνα AGEs Αυξημϋνη πρϐςληψη του AGE LDL ςυμπλϐκου Λεία μυΰκά κγτταρα Αυξημϋνη πολλαπλαςιαςτικό ενεργϐτητα Αυξημϋνη παραγωγό φιμπρονεκτύνησ Ενδοθηλιακά κγτταρα Αυξημϋνη διαπερατϐτητα Αυξημϋνο ενδοκυττϊριο οξειδωτικϐ stress Επαγωγό τησ ενδοθηλύνησ-1 και αϑξηςη αγγειοςυςτολόσ Μεύωςη τησ ϋκφραςησ τησ θρομβομοδουλύνησ και επαγωγό τησ ϋκφραςησ του ιςτικοϑ παρϊγοντα (Σissue Factor, TF) Αυξημϋνη ϋκφραςη μορύων προςκϐλληςησ AGEs: τελικϊ προώϐντα προχωρημϋνησ γλυκοζυλύωςησ; PDGF: αυξητικϐσ παρϊγοντασ προερχϐμενοσ απϐ τα αιμοπετϊλια; IGF-1: αυξητικϐσ παρϊγων ομοιϊζων ςτην ινςουλύνη; TNFα: παρϊγοντασ νϋκρωςησ του ϐγκου-α; IL-1h: ιντερλευκύνη-1h; LDL: χαμηλόσ πυκνϐτητασ λιποπρωτεϗνη. Αποπταξύα: μετανϊςτευςη των μονοπϑρηνων φαγοκυττϊρων. Πύνακασ 7: Δρϊςεισ των AGEs, ςχετιζϐμενεσ με την ανϊπτυξη αγγειακών βλαβών, μεςολαβοϑμενεσ απϐ το μεμβρανικϐ τουσ υποδοχϋα. (G. Basta et al. 2004)

54 53 Εικϐνα 21: Δρϊςεισ των AGEs ςτην εξωκυττϊρια ουςύα (μη μεςολαβοϑμενεσ απϐ υποδοχϋα) και ενδοκυττϊρια (μεςολαβοϑμενεσ απϐ υποδοχϋα). την εξωκυττϊρια ουςύα (ΕΚΟ) τα AGEs τροποποιοϑν ϋνα πλόθοσ μορύων ϐπωσ τα λιπύδια, το κολλαγϐνο, η ελαςτύνη, η λαμινύνη και η βιτρονεκτύνη, μεταβϊλλοντασ τισ ιδιϐτητεσ και την ευκαμψύα τησ. Επύςησ, μϋςω τησ ενεργοπούηςη του TGF-β υποδοχϋα επϊγεται και η ποςοτικό αλλαγό τησ ΕΚΟ. Σα AGEs ςυνδεϐνται ςε πολλοϑσ υποδοχεύσ (AGE-R1, R2, R3, SR I & II, RAGE). Η ςϑδεςό τουσ ςτον τελευταύο, ςυνεπϊγεται αυξημϋνη παραγωγό ROS μϋςω τησ NAD(P)H οξειδϊςησ και ενεργοπούηςη των p21ras & MAPKs. Επύςησ, επϊγεται το ςόμα μϋςω του p38, MAPK, Rac/Cdc μονοπατιοϑ. Κοινό κατϊληξη εύναι η μεταφορϊ του μεταφραφικοϑ παρϊγοντα NF-κΒ ςτον πυρόνα και η μεταγραφό γονιδύων ϐπωσ: ενδοθηλύνησ 1, ICAM-1, ιςτικοϑ παρϊγοντα (Tissue Factor), Ε-ςελεκτύνησ κ.ϊ. τα οπούα ςχετύζονται με τισ διαδικαςύεσ τησ φλεγμονόσ. Σα AGEs μειώνουν και τη διαθεςιμϐτητα του ΝΟ ενώ, αυξϊνοντασ την ενδοκυττϊρωςη τησ oxldl ςυμβϊλλουν ςτη μετατροπό των μακροφϊγων ςε αφρώδη κϑτταρα. DN= υποδοχϋασ RAGE χωρύσ ενδοκυττϊρια ουρϊ. (A. Goldin, 2006) Ο RAGE ανόκει ςε μια τϊξη υποδοχϋων οι οπούοι περύεχουν μια διαμεμβρανικό ϋλικα και η ενδοκυττϊρια ςηματοδϐτηςό τουσ μεςολαβεύται απϐ κινϊςεσ. Μϋλη αυτόσ τησ ομϊδασ αποτελεύ ο υποδοχϋασ τησ ερυθροποιητύνησ (EPOR) και τησ αυξητικόσ ορμϐνησ (GHR). Οι περιςςϐτεροι αντύςτοιχοι υποδοχεύσ, προκειμϋνου να εύναι λειτουργικού και να ενεργοποιόςουν τα ενδοκυττϊρια μεταγωγικϊ τουσ μονοπϊτια, πολυμερύζονται. Η ϊποψη περύ διμεριςμοϑ και του RAGE ενιςχϑεται απϐ το γεγονϐσ ϐτι ο υποδοχϋασ προκειμϋνου να ςυνδεθεύ και να ενεργοποιηθεύ απϐ τον προςδϋτη S-100, διμερύζεται. [187,200] Μελετώντασ το μηχανιςμϐ

55 54 αλληλεπύδραςησ του RAGE με τα AGEs παρατηρόθηκε η ϑπαρξη ολιγομερών του υποδοχϋα ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη και θεωρεύται πωσ αυτϊ εύναι υπεϑθυνα για την αναγνώριςη και των AGEs απϐ τον υποδοχϋα. [201] Αντύςτοιχα αποτελϋςματα υπϊρχουν ςχετικϊ με την αλληλεπύδραςη και του α-αμυλοειδοϑσ με τον υποδοχϋα RAGE. [202] υνεπώσ, εύναι πιθανϐν ο RAGE να δρα και να επϊγει τισ ενδοκυττϊριεσ λειτουργύεσ του μετϊ απϐ διμεριςμϐ του RAGE χωρύσ κυτταροπλαςματικό ουρϊ (dominant-negative RAGE) Σο ενδοκυττϊριο τμόμα του RAGE βρύςκεται ςτο καρβοξυτελικϐ ϊκρο του υποδοχϋα, το μόκοσ του εύναι μικρϐτερο απϐ 50αα και ευθϑνεται για την ενδοκυττϊρια μεταγωγό του ςόματοσ. Τποδοχεύσ που ςτεροϑνται αυτϐ το κομμϊτι εύναι μη λειτουργικού. [190] Η παραγωγό του dominant-negative RAGE προϋρχεται απϐ εναλλακτικϐ μϊτιςμα του γονιδύου του υποδοχϋα, ωςτϐςο δεν εύναι γνωςτό η λειτουργικϐτητα του ςυγκεκριμϋνου προώϐντοσ Διαλυτϋσ μορφϋσ RAGE (srage) Εκτϐσ απϐ το μεμβρανικϐ υποδοχϋα, υπϊρχουν και οι διαλυτϋσ, κυκλοφοροϑςεσ μορφϋσ του RAGE. Οι διαλυτϋσ μορφϋσ του RAGE μποροϑν να προκϑψουν εύτε απϐ εναλλακτικϐ μϊτιςμα του γονιδύου RAGE (esrage) ό απϐ ενζυμικϐ κϐψιμο του εξωκυττϊριου τμόματοσ του υποδοχϋα (srage). Ο ϐροσ srage (soluble RAGE) χρηςιμοποιεύται και για τον προςδιοριςμϐ ϐλων των υδατοδιαλυτών μορφών του RAGE (προερχϐμενων απϐ εναλλακτικϐ μϊτιςμα & απϐ ενζυμικϐ κϐψιμο πλόρουσ υποδοχϋα). Όπωσ προαναφϋρθηκε, το esrage (endogenous secretory RAGE) γνωςτϐ και ωσ RAGEv1, εύναι προώϐν εναλλακτικοϑ ματύςματοσ του γονιδύου του RAGE και εκκρύνεται εξωκυτταρύωσ. Αποτελεύται απϐ το εξωκυττϊριο τμόμα του υποδοχϋα, ςτερεύται του διαμεμβρανικοϑ και ενδοκυττϊριου τμόματοσ του RAGE ενώ, χαρακτηρύζεται απϐ μια ειδικό καρβοξυτελικό αλληλουχύα 16 αμινοξϋων (16αα) [203,204] (Εικϐνα 22). Σο esrage εκφρϊζεται κυρύωσ ςτα αγγειακϊ ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, τα νευρικϊ κϑτταρα, τα β-παγκρεατικϊ κϑτταρα, τα αδρενεργικϊ κϑτταρα και τα ηπατικϊ κϑτταρα. [205] Παρϊγεται ανεξϊρτητα απϐ το srage αλλϊ επιτελεύ παρϐμοιεσ λειτουργύεσ με αυτϐ. [206] Σο srage εύναι προώϐν δρϊςησ των ενζϑμων ADAM10 (A Disintegrin And Metalloprotease-10) και MMP9 (Metalloproteinase 9) ςτο εξωκυττϊριο τμόμα του RAGE. [207,208] Ενιςχυτικϐ ρϐλο ςε αυτό τη διαδικαςύα παύζουν αςβϋςτιοεξαρτώμενα ιςοϋνζυμα τησ πρωτεώνικόσ κινϊςησ C (PKCα και PKCβΙ). [206] Αναλυτικϐτερα, ο RAGE κϐβεται ενζυματικϊ μεταξϑ τησ C2 δομόσ και του διαμεμβρανικοϑ τμόματοσ, με αποτϋλεςμα την παραγωγό του srage και ενϐσ τμόματοσ που περιλαμβϊνει τη διαμεμβρανικό και ενδοκυττϊρια περιοχό του RAGE (RAGE-CTF) (Εικϐνα 22). Σο srage αποτελεύται απϐ τη V-C1-C2 δομό του RAGE και διαθϋτει τισ ύδιεσ προςδετικϋσ ικανϐτητεσ με αυτϐν. Σο ςυνολικϐ του μόκοσ εύναι μικρϐτερο απϐ το αντύςτοιχο του esrage (λεύπει η αμινοξικό αλληλουχύα των 16αα) αλλϊ τα επύπεδα του srage εύναι 2-5 φορϋσ πιο υψηλϊ απϐ αυτϊ του esrage (το srage εύναι η πιο ςυχνό μορφό παραγωγόσ διαλυτοϑ RAGE). Σο διαμεμβρανικϐ και ενδοπλαςματικϐ υπϐλειμα του RAGE (RAGE-CTF) εύναι μη

56 55 λειτουργικϐ και αλληλεπιδρώντασ ενδοκυττϊρια με τη γ-ςεκρετϊςη οδηγεύται προσ αποδϐμηςη. [182,206] Εικϐνα 22: Παραγωγό των διαλυτών μορφών του RAGE (srage) και η λειτουργύα τουσ. Σο srage προκϑπτει απϐ τη MMP9- και ADAM10- μεςολαβοϑμενη ενζυμικό διατομό του RAGE ό απϐ το εναλλακτικϐ μϊτιςμα του RAGE γονιδύου (esrage). Σο srage διαθϋτει το εξωκυττϊριο τμόμα του RAGE με αποτϋλεςμα να ςυνδϋεται με τουσ ύδιουσ προδϋτεσ και να λειτουργεύ ωσ φραγμϐσ ςτην ενδοκυττϊρια ςηματοδϐτηςη του RAGE και των υπολούπων υποδοχϋων των AGEs. (N. Vazzana, 2009) Σο srage, ςτο ςϑνολϐ του (esrage + srage), μετϊ την ϋκκριςό του εξωκυτταρύωσ, ςυνδϋεται με τουσ προςδϋτεσ του RAGE και τουσ απομακρϑνει απϐ την κυκλοφορύα μϋςω απϐ αποδϐμηςόσ τουσ ςτο ςπλόνα και το όπαρ. Η ύδια λειτουργύα επιτελεύται και ϐςον αφορϊ τα κυκλοφοροϑντα AGEs. υγκεκριμϋνα, το srage οδηγώντασ τα AGEs προσ αποδϐμηςη, εμποδύζει την ενεργοπούηςη και την επαγωγό τησ ενδοκυττϊριασ ςηματοδϐτηςησ τϐςο του RAGE ϐςο και των λοιπών μεμβρανικών υποδοχϋων των AGEs, αποτρϋποντασ την ανϊπτυξη κυτταρικόσ δυςλειτουργύασ. [182] Ϊχει βρεθεύ πωσ τα επύπεδα του srage ςχετύζονται με τα επύπεδα των κυκλοφοροϑντων AGEs [209] και πωσ αποτελοϑν ϋμμεςο δεύκτη (αντιςτρϐφωσ ανϊλογο) τησ ενεργϐτητασ και τησ παθογϋνειασ του RAGE. [210] Επύςησ, μειωμϋνα επύπεδα του srage ϋχουν ςυςχετιςθεύ με πρωώμϐτερη και εντονϐτερη εμφϊνιςη των επιπλοκών του διαβότη ενώ, χορόγηςη srage ςε πειραματικϊ μοντϋλα ϋχει δεύξει επιβρϊδυνςη ϋωσ και αναςτολό τησ εμφϊνιςησ των διαβητικών επιπλοκών. [ ] Βϊςει των ανωτϋρων δεδομϋνων, οι διαλυτϋσ μορφϋσ του RAGE, λειτουργώντασ ανταγωνιςτικϊ ωσ προσ τη βλαπτικό δρϊςη του υποδοχϋα, αποτελοϑν πιθανϐ μελλοντικϐ θεραπευτικϐ ϐπλο ϋναντι των διαβητικών επιπλοκών. [214,215] Πϋραν του srage, υπϊρχουν και ϊλλοι μηχανιςμού που κινητοποιοϑνται απϐ τον οργανιςμϐ προκειμϋνου να μετριαςτοϑν τα επύπεδα και οι δρϊςεισ των AGEs. [139] Όπωσ ϋχει όδη αναφερθεύ, οι υποδοχεύσ AGE-R1, AGE-R3 και CD36 αλληλεπιδρώντασ με τα AGEs λειτουργοϑν προςτατευτικϊ ϋναντι τησ δρϊςησ αυτών, ϐπωσ επύςησ και η λυςοζϑμη. Ϊχει βρεθεύ πωσ και η ινςουλύνη, μϋςω επαγωγόσ του IRS/PI3Κινϊςη μονοπατιοϑ, ενιςχϑει την ενδοκυττϊρια πρϐςληψη των AGEs απϐ τουσ εκκαθαριςτικοϑσ υποδοχεύσ. [216]

57 Υλεγμονό και ακχαρώδησ Διαβότησ Η φλεγμονό αποτελεύ φυςιολογικό διαδικαςύα ϊμυνασ του οργανιςμοϑ ϋναντι των μικροοργανιςμών και των λοιπών παθογϐνων. Ψςτϐςο, η ςυςτηματικό φλεγμονό θεωρεύται πωσ ςυςχετύζεται με τη φυςιολογικό γόρανςη και την εμφϊνιςη νϐςων ϐπωσ ο ακχαρώδησ Διαβότησ, η νϐςοσ Alzheimer και η αθηρωμϊτωςη. [ ] Ο ακχαρώδησ διαβότησ ςυςχετύζεται ςτενϊ με τισ διαδικαςύεσ τησ φλεγμονόσ, τϐςο ϐςον αφορϊ την αιτιοπαθογϋνειϊ του [32] ϐςο και την εμφϊνιςη των επιπλοκών του. υγκεκριμϋνα, οι μακρο-αγγειοπαθητικϋσ επιπλοκϋσ που μπορεύ να αναπτυχθοϑν ςυνόθωσ κατϊ τη διϊρκεια του ακχαρώδη Διαβότη τϑπου ΙΙ αλλϊ και τϑπου Ι, αφοροϑν αθηρωματικϋσ βλϊβεσ ςτα μεςαύου και μεγϊλου μεγϋθουσ αγγεύα. Κατϊ τη δημιουργύα τησ αθηρωματικόσ πλϊκασ, τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα εκκρύνουν χημειοτακτικοϑσ παρϊγοντεσ (MCP-1) οι οπούοι προςελκϑουν τα μονοκϑτταρα του αύματοσ προσ το αγγειακϐ τούχωμα. Εκεύ, τα μονοκϑτταρα μετατρϋπονται ςε μακροφϊγα και φαγοκυτταρώνοντασ την πλεονϊζουςα LDL χοληςτερϐλη μεταςχηματύζονται ςε αφρώδη κϑτταρα. Σα ώριμα μακροφϊγα και τα αφρώδη κϑτταρα διαδραματύζουν ςημαντικϐ ρϐλο ςτην εξϋλιξη και τη ρόξη τησ αθηρωματικόσ πλϊκασ, γεγονϐσ που επιβεβαιώνει το ςημαντικϐ ρϐλο τησ φλεγμονόσ ςτη διαδικαςύα τησ αθηρωμϊτωςησ [217,220-1] (Εικϐνα 23). Εικϐνα 23: Υλεγμονώδεισ διεργαςύεσ που εμπλϋκονται ςτην παθογϋνεια τησ αθηρωμϊτωςησ. Σα μονοκϑτταρα και τα μακροφϊγα κϑτταρα αποτελοϑν ςημαντικοϑσ μεςολαβητϋσ τησ διεργαςύασ. (Licastro et al., Immunity & Ageing 2005) Οι μικρο-αγγειοπαθητικϋσ επιπλοκϋσ του ακχαρώδη Διαβότη χαρακτηρύζονται απϐ ενδοθηλιακό δυςλειτουργύα και διαταραχό ςτη διαπερϊτοτητα των μικρών και τριχοειδικών αγγεύων. Αναλυτικϐτερα, εμφανύζεται αλλαγό των ιδιοτότων τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ και διαταραχό ςτη ρϑθμιςη τησ διαςτολόσ/ςϑςπαςησ των αγγεύων με αποτϋλεςμα την αυξημϋνη αγγειακό διαπερατϐτητα καθώσ επύςησ και ενδοθηλιακό δυςλειτουργύα η οπούα ςυνεπϊγεται την ϋκλυςη προ-φλεγμονωδών και προ-θρομβωτικών παραγϐντων. [218,219] Θεωρεύται πωσ και αυτϋσ οι βλϊβεσ ςτα

58 57 ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, τη βαςικό μεμβρϊνη και τη γϑρω εξωκυττϊρια ουςύα μεςολαβοϑνται απϐ κϑτταρα και μϐρια τησ φλεγμονόσ. υγκεκριμϋνα, ϋχει βρεθεύ πωσ ςτα ϊτομα με Δ1 ϋχει παρατηρηθεύ αυξημϋνη ενεργοπούηςη των μονοκυττϊρων του περιφερικοϑ αύματοσ, υποδηλώνοντασ την ϑπαρξη μιασ όπιασ χρϐνιασ φλεγμονώδουσ κατϊςταςησ ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ. [222-4] Η υπεργλυκαιμύα θεωρεύται πωσ ενιςχϑει ό εκλϑει τισ φλεγμονώδεισ διεργαςύεσ και την κινητοπούηςη των κυττϊρων φλεγμονόσ ςτο Δ, μϋςω των πολλαπλών μεταγωγικών μονοπατιών που επϊγει. [222] Ιδιϊζουςασ ςημαςύασ εύναι το μονοπϊτι τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ και τα προώϐντα αυτοϑ, τα AGEs. Η βλαπτικό δρϊςη των τελευταύων εξαςκεύται εύτε απευθεύασ ςτα δομικϊ ςτοιχεύα τησ εξωκυττϊριασ ουςύασ ό μϋςω ςϑνδεςησ ςτουσ κυτταρικοϑσ τουσ υποδοχεύσ. Ο RAGE αποτελεύ τον καλϑτερα μελετημϋνο υποδοχϋα των AGEs και ϋχει ςυςχετιςθεύ ιςχυρϊ με την ενεργοπούηςη των διεργαςιών φλεγμονόσ. [180-1,183,225-6] Μερικϊ απϐ τα μϐρια που εμπλϋκονται ςτισ διαδικαςύεσ τησ φλεγμονόσ (χημειοταξύα και ενεργοπούηςη μονοκυττϊρων, κυτταροκύνεσ) και τησ προ-θρομβωτικόσ κατϊςταςησ που επϊγει ο RAGE εύναι: η χημειοτακτικό πρωτεϗνη των μονοκυττϊρων-1 (MCP-1), το ςϑμπλεγμα διαφοροπούηςησ-68 (CD68), η πρωτεώνικό κινϊςη-β (AKT2/PKB), ο παρϊγοντασ νϋκρωςησ ϐγκου-α (TNFα), η ιντερλευκύνη-6 (IL-6) και ο ιςτικϐσ παρϊγων (TF) MCP-1 (Φημειοτακτικό πρωτεϗνη των μονοκυττϊρων-1, Monocyte chemotactic protein-1) Σο MCP-1 [γνωςτϐ και ωσ CCL2 (Chemokine (C-C motif) ligand 2)] εύναι μια χημειοκύνη 76 αμινοξϋων (13kDa) και θεωρεύται ωσ ο μεύζων χημεοτακτικϐσ παρϊγων των μονοκυττϊρων και των Σ-λεμφοκυττϊρων. [ ] To γονύδιο του MCP-1 εδρϊζεται ςτο χρωμϐςωμα 17 (17q11.2-q12) [229] ενώ, η πρωτεϗνη του εκκρύνεται απϐ κϑτταρα ϐπωσ τα μονοκϑτταρα και τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα και δρα ςυνδεϐμενο ςτουσ υποδοχεύσ CCR2 και CCR4. Σο MCP-1 και η χημειοτακτικό του δρϊςη, ϋχουν ενεχοποιηθεύ για την ανϊπτυξη των αγγειακών αθηροςκληρυντικών αλλοιώςεων οι οπούεσ ςυναντϐνται και ςτο διαβότη. [221,230] υγκεκριμϋνα, η CRP (C-αντιδρώςα πρωτεϗνη), που εύναι δεύκτησ ενδοθηλιακόσ βλϊβησ, επϊγει την ϋκκριςη του MCP-1 απϐ τα ενδοθηλιακϊ και λεύα μυώκϊ κϑτταρα του αγγειακοϑ τοιχώματοσ. [231-2] υνϋπεια αυτοϑ εύναι η προςϋλκυςη των μονοκυττϊρων ςτον υπενδοθηλιακϐ χώρο, ϐπου μετατρεπϐμενα ςε αφρώδη κϑτταρα προκαλοϑν την ανϊπτυξη των αθηρωματικών πλακών. Επιπλϋον, το MCP-1 βοηθϊ ςτη μετανϊςτευςη και την ενεργοπούηςη των μονοκυττϊρων και μϋςω επαγωγόσ ςτην ϋκφραςη προςκολλητικών μορύων (ϐπωσ οι ιντεγκρύνεσ), και προφλεγμονωδών κυτταροκινών (ϐπωσ οι ιντερλευκύνεσ). [234-5] Επιπρϐςθετα, το MCP-1 ςυμμετϋχει ςτην ανϊπτυξη και προθρομβωτικών καταςτϊςεων μϋςω επαγωγόσ ςτην ϋκφραςη του ιςτικοϑ παρϊγοντα (TF). [236-7] Όςον αφορϊ το Δ1, ϋχει βρεθεύ ςημαντικό ςυςχϋτιςό του με τα επύπεδα του MCP-1. [238-9] υγκεκριμϋνα, θεωρεύται πωσ το MCP-1 ςχετύζεται με την προςϋλκυςη των μονοκυττϊρων ςτον ενδοθηλιακϐ και υπενδοθηλιακϐ χώρο και κατ επϋκταςη ςτην ανϊπτυξη των μικρο-και μακρο-αγγειοπαθητικών βλαβών. Η ϊποψη αυτό ενιςχϑεται απϐ το γεγονϐσ ϐτι τα επύπεδα του MCP1 βρύςκονται αυξημϋνα ςτουσ ενόλικεσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ και ειδικϊ ςε αυτοϑσ με ανεπαρκό γλυκαιμικϐ ϋλεγχο. [240] Η ϋκφραςη του MCP-1 ϋχει παρατηρηθεύ πωσ επϊγεται απϐ τη

59 58 γλυκοζυλιωμϋνη LDL χοληςτερϐλη, η οπούα αποτελεύ προώϐν του ενεργοποιημϋνου μονοπατιοϑ τησ μη ενζυματικόσ γλυκοζυλύωςησ (AGE-LDL) ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ. [241] Σϋλοσ, πιςτεϑεται πωσ η παρατεταμϋνη υπεργλυκαιμύα ςχετύζεται με την πρώιμη εμφϊνιςη νεφρικών βλαβών ςτο Δ1 λϐγω τησ αϑξηςησ ςτη βιοςϑνθεςη του MCP-1, μϋςω του επαγώμενου οξειδωτικοϑ stress. [242] CD68 (ϑμπλεγμα διαφοροπούηςησ-68, Cluster of Differentiation 68) Σο CD68 εύναι μια διαμεμβρανικό γλυκοπρωτεϗνη 110kDa, η οπούα εκφρϊζεται ϋντονα ςτα μονοκϑτταρα και τα ιςτικϊ μακροφϊγα. Σο CD68 αποτελεύ δεύκτη για τα μακροφϊγα ωςτϐςο, δεν εύναι ειδικϐ μϐνο για τα κϑτταρα αυτϊ αφοϑ εκφρϊζεται και ςτα λιποκϑτταρα και τα κϑτταρα του ςτρώματοσ του λιπώδουσ ιςτοϑ. [243] Σο γονύδιο που κωδικοποιεύ το CD68 εδρϊζεται ςτο χρωμϐςωμα 17 (17p13) ενώ, εναλλακτικϐ μϊτιςμϊ του δύνει γϋνεςη ςε διαφορετικϋσ ιςομορφϋσ του CD68. [244] Σο CD68 ανόκει ςτην οικογϋνεια των λυςοςωμικών/ενδοςωμικών ςχετιζϐμενων μεμβρανικών γλυκοπρωτεώνών (LAMP οικογϋνεια). υγκεκριμϋνα, το μϐριο αρχικϊ εντοπύζεται ςτα λυςοςώματα και τα ενδοςώματα, και μϐνο ϋνα μικρϐ μϋροσ του εύναι τοποθετημϋνο ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη. H βαρϋωσ γλυκοζυλιωμϋνη εξωκυττϊρια δομό του, ςυνδϋεται ςε ιςτο- και οργανο- ειδικϋσ λεκτύνεσ και ςελεκτύνεσ οπϐτε, η μεταφορϊ του CD68 απϐ τα ενδοςώματα/ λυςοςώματα ςτην πλαςματικό μεμβρϊνη δύνει τη δυνατϐτητα ςτα μονοκϑτταρα να ενεργοποιηθοϑν, να μεταναςτεϑςουν και να μετατραποϑν ςε ιςτικϊ μακροφϊγα. [244] Όπωσ προαναφϋρθηκε, το CD68 αποτελεύ δεύκτη των μακροφϊγων. Η αυξημϋνη ϋκφραςό του ςχετύζεται με την ενεργοπούηςη των μονοκυττϊρων του αύματοσ και τη μετατροπό τουσ ςε μακροφϊγα, υποδηλώνοντασ το ρϐλο του μορύου ςτισ διεργαςύεσ αφενϐσ τησ φλεγμονόσ και αφετϋρου τησ αθηρωμϊτωςησ. [245-6] Επιπρϐςθετα, το CD68 αποτελεύ μϋλοσ των μεβρανικών υποδοχϋων εκκαθαριςτών και ςυγκεκριμϋνα ϋχει δειχθεύ πωσ αποτελεύ υποδοχϋα τησ οξειδωμϋνησ LDL χοληςτερϐλησ (oxldl). [247] Εξαιτύασ αυτόσ τησ λειτουργύασ του, το CD68 ςυςχετύζεται περαιτϋρω με τη διαδικαςύα τησ αθηροςκλόρυνςησ και ςυγκεκριμϋνα με τη μετατροπό πλϋον των μακροφϊγων κυττϊρων προσ αφρώδη κϑτταρα ςτην περιοχό των αθηρωματικών πλακών. Σϋλοσ, η ϋκφραςη του CD68 ϋχει παρατηρηθεύ αυξημϋνη ςε ϊτομα με Δ1 υποδεικνϑοντασ την πιθανό εμπλοκό του ςτισ φλεγμονώδεισ διεργαςύεσ που ενεργοποιοϑνται ςτα πλαύςια τησ νϐςου. Η ϋκφραςη αυτό του CD68 βρϋθηκε να αυξϊνεται περαιτϋρω μετϊ απϐ διϋγερςη του MCP-1, υποδεικνϑοντασ την ϑπαρξη αλληλεπύδραςησ μεταξϑ των δϑο μορύων. [240,245] Akt/PKB (Πρωτεώνικό κινϊςη Β, Protein kinase B) H Akt2 αποτελεύ ϋνα εκ των τριών μελών τησ οικογενεύασ των PKB /Akt ςερύνη/θρεονύνη κιναςών. Κωδικοποιεύται απϐ γονύδιο που βρύςκεται ςτο χρωμϐςωμα 19 (19q ), εκφρϊζεται απϐ τα περιςςϐτερα κϑτταρα του οργανιςμοϑ αλλϊ κυρύωσ απϐ τα μυώκϊ κϑτταρα και τα το εμβρυώκϐ φαιϐ λύποσ. [248-9] H Akt2 επιτελεύ πολλαπλϋσ λειτουργύεσ που ςχετύζονται με την ανϊπτυξη, τον πολλαπλαςιαςμϐ, την επιβύωςη-απϐπτωςη και το μεταβολιςμϐ των κυττϊρων

60 59 καθώσ και με την κυτταρικό ςηματοδϐτηςη τησ ινςουλύνησ. [250-1] Λϐγω τησ ςτενόσ ςχϋςησ τησ Akt2 με τη ρϑθμιςη του κυτταρικοϑ κϑκλου και τησ αντιαποπτωτικόσ τησ δρϊςησ, θεωρεύται ωσ δυνητικϐ ογκογονύδιο. Επύςησ, η Akt2 λαμβϊνει μϋροσ και ςτην ινςουλινο-μεςολαβοϑμενη ομοιϐςταςη τησ γλυκϐζησ και το μεταβολιςμϐ των λιπιδύων που ςχετύζονται με αυτό. Σϋλοσ, η Akt2, ενεργοποιοϑμενη απϐ χημειοτακτικοϑσ παρϊγοντεσ [252] επϊγει τη μεταβολό του κυτταροςκελετοϑ, που εύναι αναγκαύα για τη μετανϊςτευςη των κυττϊρων ςτα πλαύςια τησ φλεγμονόσ ό τησ καρκινικόσ μετϊςταςησ. [253] ε μη ενεργοποιημϋνα κϑτταρα, η Akt2 παραμϋνει ςτο κυτταρϐπλαςμα ςε μη φωςφορυλιωμϋνη κατϊςταςη. Η ενεργοπούηςη των ιςοενζϑμων Akt/PKB πραγματοποιεύται μετϊ απϐ φωςφορυλύωςη αυτών και μεταφορϊ τουσ ςτην πλαςματικό μεμβρϊνη, διαδικαςύα η οπούα ρυθμύζεται απϐ την PI3 κινϊςη/pdk1 και το mtor. Εν ςυνεχεύα, η Akt2 φωςφορυλιώνει πλόθοσ υποςτρωμϊτων, ρυθμύζοντασ κατϊ αυτϐ τον τρϐπο το ςϑνολο των λειτουργιών που αναφϋρονται παραπϊνω [250,252,254-5] (Εικϐνα 24). Εικϐνα 24: Μηχανιςμϐσ ενεργοπούηςησ τησ Akt και των μεταγωγικών μονοπατιών που ςχετύζονται με αυτό. Η μη ενεργοποιημϋνη Akt παραμϋνει ςτο κυτταρϐπλαςμα ενώ η ενεργοποιημϋνηφωςφορυλιωμϋνη Akt μεταφϋρεται ςτην πλαςματικό μεμβρϊνη ϐπου φωςφορυλιώνει πλόθοσ υποςτρωμϊτων. (Ichiro Shiojima, 2002) Η Akt επύςησ αποτελεύ μϋλοσ των ρυθμιςτικών παραγϐντων τησ αγειοδιαςτολόσ /αγγειοςϑςπαςησ. υγκεκριμϋνα, η παραγωγό του αγγειοδιαςταλτικοϑ ΝΟ ρυθμύζεται κατϊ Akt-εξαρτώμενο τρϐπο. [256] Ο ρϐλοσ τησ Akt2 ςτην ομοιοςταςύα τησ αγγειακόσ λειτουργύασ υποδηλώνεται και απϐ το ςυςχετιςμϐ τησ με την μετανϊςτευςη των ενδοθηλιακών κυττϊρων και την αγγειογϋνεςη. υγκεκριμϋνα, οι διαδικαςύεσ αυτϋσ επϊγωνται απϐ τον VEGF (αυξητικϐσ παρϊγων των αγγεύων) ο οπούοσ ρυθμύζεται απϐ το PI3K-Akt μεταγωγικϐ μονοπϊτι. [257] Η οξειδωμϋνη LDL χοληςτερϐλη (oxldl) ϋχει βρεθεύ πωσ αναςτϋλλει την παραπϊνω διαδικαςύα μϋςω επαγωγόσ τησ αποφωςφορυλύωςησ τησ Akt. [259] Επιπλϋον, το μονοπϊτι PI3K-Akt

61 60 δρα αναςταλτικϊ και ςτουσ μηχανιςμοϑσ τησ πόξησ του αύματοσ μϋςω αναςτολόσ ςτην ϋκφραςη του ιςτικοϑ παρϊγοντα (TF), ο οπούοσ αποτελεύ πρώιμο κυτταρικϐ ενεργοποιητό τησ πόξησ. [260] Επιπρϐςθετα, η Akt2 ςχετύζεται με τη χημειοταξύα των μακροφϊγων κυττϊρων, γεγονϐσ που την ςτα μϐρια που ρυθμύζουν τισ διαδικαςύεσ τησ φλεγμονόσ. Αναλυτικϐτερα, η Akt2 ενεργοποιοϑμενη απϐ χημειοτακτικοϑσ παρϊγοντεσ (πχ. MCP-1) [252] επϊγει τον πολυμεριςμϐ των πρωτεώνών του κυτταροςκελετοϑ (ακτύνη) που εύναι απαραύτητεσ για τη μετανϊςτευςη των μακροφϊγων κυττϊρων ενώ, η απαλοιφό του γονιδύου τησ Akt2 καταςτϋλλει την MCP-1 επαγώμενη χημειοταξύα. [253] Σϋλοσ, η Akt2 λϐγω τησ ςχϋςησ τησ με την κυτταρικό ςηματοδϐτηςη που επϊγει η ινςουλύνη ϋχει ςυςχετιςθεύ με το Δ2 και την ινςουλινο-αντύςταςη των ιςτών που τον ςυνοδεϑει. [261] TNF-α (Παρϊγων νϋκρωςησ του ϐγκου-α, Tumor Νecrosis factor-α) Ο TNF-α αποτελεύ μια κυτταροκύνη οξεύασ φϊςησ τησ φλεγμονόσ, η οπούα εκκρύνεται κυρύωσ απϐ τα κϑτταρα του ανοςοποιητικοϑ ςυςτόματοσ (μακροφϊγα) και ταυτοποιόθηκε απϐ την ικανϐτητϊ τησ να περιορύζει την ανϊπτυξη των ϐγκων. Ωλλα κϑτταρα που εκκρύνουν τον TNF-α εύναι τα μαςτοκϑτταρα, τα λεμφοκϑτταρα, τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, τα λιποκϑτταρα, οι ινοβλϊςτεσ και τα νευρικϊ κϑτταρα. [262] Ο TNF-α κωδικοποιεύται απϐ γονύδιο που βρύςκεται ςτο χρωμϐςωμα 6 (6p21.3) και αρχικϊ παρϊγεται ωσ τϑπου ΙΙ διαμεμβρανικό πρωτεϗνη μεγϋθουσ 212 αμινοξϋων, που τακτοποιεύται με τη μορφό ςταθερών ομοτριμερών. Μετϊ απϐ πρωτεολυτικό δρϊςη τησ μεταλλοπρωτεώνϊςησ ADAM17 (ό TACE) ςτο τριμερϋσ, παρϊγεται διαλυτϐ τμόμα του TNF-α το οπούο κυκλοφορεύ ςε μικρϋσ ποςϐτητεσ (nmol) ενώ, το υπϐλοιπο κομμϊτι παραμϋνει ςυνδεδεμϋνο ςτη μεμβρϊνη. [263] Τπϊρχουν δϑο υποδοχεύσ του TNF-α: TNF-R1 (ό CD120a, p55/60), ο οπούοσ εκφρϊζεται ςχεδϐν ςτουσ περιςςϐτερουσ ιςτοϑσ και ενεργοποιεύται τϐςο απϐ το διαλυτϐ ϐςο και απϐ μεμβρανικϐ κομμϊτι του TNF-α, και TNF-R2 (ό CD120b, p75/80), ο οπούοσ εκφρϊζεται μϐνο ςτα κϑτταρα του ανοςοποιητικοϑ και ενεργοποιεύται μϐνο απϐ το τριμερϋσ που εύναι ςυνδεδεμϋνο ςτη μεμβρϊνη. Επύ ενεργοπούηςόσ του, ο υποδοχϋασ του TNF-α επύςησ δημιουργεύ τριμερό ενώ ενεργοποιεύ τα μεταγωγικϊ μονοπϊτια του NF-κB (κυτταρικό ανϊπτυξη και πολλαπλαςιαςμϐσ, φλεγμονό, αντι-αποπτωτικό δρϊςη), των ΜΑΡ κιναςών (κυτταρικό διαφοροπούηςη και πολλαπλαςιαςμϐσ, προ-αποπτωτικό δρϊςη) και το μονοπϊτι του θανϊτου (όπια αποπτωτικό δρϊςη μϋςω καςπαςών) [264-5] (Εικϐνα 25).

62 61 Εικϐνα 25: Μεταγωγικϊ μονοπϊτια που ςχετύζονται με την ενεργοπούηςη του υποδοχϋα του TNFα.Ο υποδοχϋασ, μετϊ τη ςϑνδεςη του τριμεροϑσ TNF-α, επύςησ τριμερύζεται ενώ ενεργοποιεύ τα μονοπϊτια του NF-κΒ, των ΜΑΡκιναςών και των καςπαςών. (Wiley SR, 2003). Απϐ τισ πιο ςημαντικϋσ και αρκετϊ μελετημϋνεσ δρϊςεισ του TNF-α εύναι αυτϋσ που ςχετύζονται κυρύωσ με τισ διεργαςύεσ τησ φλεγμονόσ και επιτελοϑνται κατϊ βϊςη ςυνεργιςτικϊ με την ιντερλευκύνη 1 (IL-1) και 6 (IL-6). Οι δρϊςεισ αυτϋσ περιλαμβϊνουν την ηπατικό ςϑνθεςη των μορύων οξεύασ φϊςησ τησ φλεγμονόσ, τον πυρετϐ, τη χημειοταξύα και την ενεργοπούηςη των μακροφϊγων. Πιο αναλυτικϊ, ο TNF-α ϋχει ςυςχετιςθεύ ιςχυρϊ με τη διαδικαςύα τησ χημειοταξύασ των μακροφϊγων κυττϊρων. [266-7] Η λειτουργύα αυτό αποτελεύ μϋροσ τησ φυςιολογικόσ φλεγμονώδουσ απϊντηςησ του οργανιςμοϑ ϋναντι των παθογϐνων παραγϐντων αλλϊ και των διεργαςιών που κινητοποιοϑνται κατϊ την ανϊπτυξη τησ αθηρωμϊτωςησ, οπϐτε ο TNF-α αποτελεύ μϐριο που εμπλϋκεται και με τισ δϑο διαδικαςύεσ. [268-9] Η ςυμμετοχό του TNF-α ςτη χημειοταξύα των μακρφοφϊγων φαύνεται και απϐ το γεγονϐσ ϐτι ο TNF-α επϊγει την ϋκφραςη του MCP-1 απϐ τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα μϋςω του Akt/PKB μεταγωγικοϑ μονοπατιοϑ. [270] υγκεκριμϋνα, η ςϑνδεςη του TNF-α ςτον υποδοχϋα του προκαλεύ την ενεργοπούηςη τησ Akt/PKB [271] μϋςω τησ φωςφορυλύωςόσ τησ απϐ την PI3κινϊςη. Η κινητοπούηςη του μονοπατιοϑ τησ Akt/PKB προκαλεύ την ενεργοπούηςη του NF-κΒ και κατ επϋκταςη την ϋκφραςη των μορύων που ςχετύζονται με αυτϐν. Μεταξϑ αυτών των μορύων εύναι και το MCP-1, ο οπούοσ ϐπωσ ϋχει όδη αναφερθεύ αποτελεύ μεύζονα χημειοτακτικϐ παρϊγων για τα μονοκϑτταρα. [272] Ακϐμα, λϐγω τησ ςτενόσ του ςχϋςησ με τισ διαδικαςύεσ τησ φλεγμονόσ, ο TNF-α ϋχει βρεθεύ πωσ ςυμμετϋχει ςτη φλεγμονώδη καταςτροφό των νηςιδύων του παγκρϋατοσ κατϊ την ανϊπτυξη του Δ1. [273] Όμωσ, εκτϐσ απϐ την ςυμμετοχό του ςτην ανϊπτυξη του Δ1, ο TNF-α φαύνεται να ςυςχετύζεται ϋντονα με τη δυςλειτουργύα του ενδοθηλύου και την ανϊπτυξη τησ αγγειακόσ νϐςου που ςυχνϊ ςυνυπϊρχει. υγκεκριμϋνα, επϊγει την ϋκκριςη πλόθουσ κυτταροκινών (IL-6, IL-8) και προθρομβωτικών παραγϐντων (TF) μϋςω του NF-κB και αναςτϋλλει τη ςϑνθεςη και δρϊςη του αγγειοδιαςταλτικοϑ ΝΟ: α) λϐγω τησ αναςτολόσ των ςυνθετικών ενζϑμων του ΝΟ (enos) [274-5] και β) λϐγω αυξημϋνησ απομϊκρυνςησ

63 62 του ΝΟ. [276] Σελικϐ αποτϋλεςμα εύναι η εμφϊνιςη αγγειακόσ φλεγμονόσ και αναδιαμϐρφωςησ, κινητοπούηςη μηχανιςμών πόξησ, επαγωγό τησ ενδοθηλιακόσ απϐπτωςησ, επύταςη του αγγειακοϑ οξειδωτικοϑ stress και διαταραχό ςτη ρϑθμιςη τησ αγγειοδιαςτολόσ/αγγειοςϑςπαςησ [277] (Εικϐνα 26). Εικϐνα 26: υμμετοχό του TNF-α ςτη αγγειακό δυςλειτουργύα. Ο TNF-α επϊγει την ϋκφραςη προφλεγμονωδών και προ-θρομβωτικών παραγϐντων καθώσ ενώ, ςυμβϊλλει ςτη μεύωςη τησ βιοδιαθεςιμϐτητασ του NO. υνολικϊ προακλεύται ενδοθηλιακό φλεγμονό, δυςλειτουργύα και απϐπτωςη, αγγειακό αναδιαμϐρφωςη, θρϐμβωςη και αγγειοςϑςπαςη. (H. ZHANG, 2009) Όπωσ προαναφϋρθηκε, ϋνα απϐ τα ενδοκυττϊρια αποτελϋςματα τησ ςϑνδεςησ του TNF-α με τον υποδοχϋα του εύναι η ενεργοπούηςη του NF-κΒ. Σο γεγονϐσ ϐτι οι αγγειακϋσ βλϊβεσ του διαβότη ςυνδϋονται ιςχυρϊ με τη βλαπτικό δρϊςη των AGEs -RAGE και επύςησ ϐτι οι δρϊςεισ του RAGE μεςολαβοϑνται απϐ τον ενεργοποιημϋνο NF-κΒ [183], πιθανϐν υποδηλώνει τη ςυνεργαςύα των AGEs-RAGΕ με τον TNF-α κατϊ την ανϊπτυξη τησ αγγειακόσ δυςλειτουργύασ. Πιςτεϑεται ϐτι ο NF-κΒ αποτελεύ το ςυνδετικϐ μϐριο μεταξϑ των δϑο μονοπατιών. υγκεκριμϋνα, ϋνασ απϐ τουσ μηχανιςμοϑσ που ο RAGE αςκεύ τισ βλαπτικϋσ του δρϊςεισ ςτο αγγειακϐ τούχωμα εύναι μϋςω επαγωγόσ ςτην ϋκφραςη πλόθουσ προ-φλεγμονωδών μορύων μϋςω του NF-κΒ. Ο TNF-α, ο οπούοσ αποτελεύ προφλεγμονώδεσ μϐριο, επύςησ μϋςω του NF-κB επϊγει περαιτϋρω την ϋκφραςη του RAGE. Σα παραπϊνω δεδομϋνα, ςε ςυνδυαςμϐ με την ομοιϐτητα των λειτουργιών που διαταρϊςουν τα AGEs-RAGE και ο TNF-α, ενιςχϑουν τη ϊποψη περύ ςυνεργιςτικόσ δρϊςησ των ςυγκεκριμϋνων μορύων ϐςον αφορϊ την αγγειακό δυςλειτουργύα που αναπτϑςςεται ςτο διαβότη. [278-9] υνοψύζοντασ, ο TNF-α εμπλϋκεται ποικιλοτρϐπωσ ςτην εμφϊνιςη τησ αγγειακόσ νϐςου (χημειοταξύα μακροφϊγων και αθηρωμϊτωςη, ενδοθηλιακό δυςλειτουργύα, θρϐμβωςη, αγγειακό αναδιαμϐρφωςη και ενδοθηλιακϐ οξειδωτικϐ stress). το Δ1, ϐλεσ οι παραπϊνω δυςλειτουργύεσ αναπτϑςςονται ςε μεγϊλο βαθμϐ, για αυτϐ και ϋχει μελετηθεύ η πιθανό ςυμμετοχό του TNF-α ςτην ανϊπτυξη των αγγειακών βλαβών τησ νϐςου. Αναλυτικϐτερα, τα επύπεδα πλϊςματοσ του TNF-α ϋχουν βρεθεύ αυξημϋνα ςε ενόλικα ϊτομα με Δ1 ενώ ϋχουν ςυςχετιςθεύ με τισ παραμϋτρουσ μεταβολικοϑ ελϋγχου (HbA1c, λιπιδαιμικϐ προφύλ). [280] Ψςτϐςο,

64 63 ϋχει παρατηρηθεύ μειωμϋνη τοπικό ϋκκριςη του TNF-α απϐ μονοκϑτταρα περιφερικοϑ αύματοσ ςε νεαροϑσ ενόλικεσ αςθενεύσ με Δ1. Αυτϐ ύςωσ υποδηλώνει την πιθανό καταςτολό τησ ανοςολογικόσ απϐκριςησ που ςυνοδεϑει το Δ και επιςημαύνει την πολυδιϊςτατη φϑςη τησ νϐςου. [281] IL-6 (Ιντερλευκύνη-6, Interleukin-6) Η IL-6 αποτελεύ μια κυτταροκύνη η οπούα διαθϋτει προ- αλλϊ και αντιφλεφμονώδεισ ιδιϐτητεσ, και εκκρύνεται απϐ τα Σ-λεμφοκϑτταρα, τα μακροφϊγα, τισ οςτεοβλϊςτεσ, τα μυώκϊ κϑτταρα και τα κϑτταρα του λιπώδουσ ιςτοϑ. [282] Η IL- 6 αποτελεύ μεςολαβητό ςε διαδικαςύεσ που ςχετύζονται με την οξεύα φϊςη τησ φλεγμονόσ και του πυρετοϑ, του μεταβολιςμοϑ των μυώκών κυττϊρων και τησ παχυςαρκύασ καθώσ επύςησ και τησ νευρωνικόσ ανϊπτυξησ. Οι δρϊςεισ αυτϋσ αςκοϑνται μετϊ απϐ ςϑνδεςη τησ IL-6 ςτον μεμβρανικϐ τησ υποδοχϋα. Ο υποδοχϋασ τησ IL-6 εύναι ϋνασ τϑπου ΙΙ υποδοχϋασ κυτταροκινών και αποτελεύται απϐ την αλυςύδα πρϐςδεςησ (IL-6Ra ό CD126), η οπούα εκφρϊζεται ςτα παρϊπανω κϑτταρα και το τμόμα μεταγωγόσ του ςόματοσ (CD130 ό gp130), το οπούο εύναι κοινϐ για πολλοϑσ ϊλλουσ υποδοχεύσ. Η πρϐςδεςη τησ IL-6 ςτο IL-6Ra τμόμα, προκαλεύ τη δημιουργύα ςυμπλϐκου με το gp130 και την ενδοκυττϊρια μεταγωγό ςόματοσ το οπούο ενεργοποιεύ υποςτρώματα ϐπωσ οι JAKs (Janus kinases) και τα STATs (Signal Transducers and Activators of Transcription) [283] (Εικϐνα 27). Εικϐνα 27: Μεταγωγικϐ μονοπϊτι τησ IL-6. Η ςϑνδεςη τησ IL-6 ςτον υποδοχϋα τησ (IL-6Ra) προκαλεύ το ςχηματιςμϐ ςυμπλϐκου με το gp130 και την ενδοκυττϊρια μεταγωγό ςόματοσ μϋςω των JAK/STATs. (Cell Signaling Technology, 2002) Ϊχει παρατηρηθεύ πωσ τα επύπεδα τησ IL-6 μεταβϊλλονται φυςιολογικϊ με την εξϋλιξη τησ εφηβεύασ και ςυγκεκριμϋνα μειώνονται μετϊ την εγκατϊςταςη αυτόσ.

65 64 Σϐςο η τεςτοςτερϐνη ϐςο και η οιςτραδιϐλη φαύνεται πωσ αναςτϋλλουν την παραγωγό τησ IL-6. [284-5] Ψςτϐςο, η IL-6 αποτελεύ μϐριο το οπούο ϋχει ςυςχετιςθεύ και με πολλϋσ παθολογικϋσ καταςτϊςεισ οι οπούεσ ςυνοδεϑονται απϐ ποικύλου βαθμοϑ ενεργοπούηςη των διαδικαςιών τησ φλεγμονόσ. Σϋτοιεσ καταςτϊςεισ εύναι η παχυςαρκύα, [286] ο καρκύνοσ, [287] η ρευματοειδόσ αρθρύτιδα, [288] η αθηρωμϊτωςη, [289] αλλϊ και ο ακχαρώδησ Διαβότησ. [290] Η IL-6, ϐπωσ όδη αναφϋρθηκε, ϋχει ςυςχετιςθεύ ςτενϊ με την ανϊπτυξη αθηρωματικών αλλοιώςεων μϋςω επαγωγικόσ δρϊςησ τϐςο ςτη μετανϊςτευςη των μονοκυττϊρων του αύματοσ ϐςο και την παραγωγό προφλεγμονωδών/ προθρομβωτικών παραγϐντων. [291] Σο γεγονϐσ αυτϐ, αναδεικνϑει την χρηςιμϐτητα τησ IL-6 ωσ ςημαντικϐ προγνωςτικϐ παρϊγοντα για την ανϊπτυξη καρδιαγγειακών ςυμβαμϊτων, αντύςτοιχο τησ CRP. [221,292-3] Επιπλϋον, η IL-6 ςχετύζεται με το Δ αν και ο ρϐλοσ τησ δεν εύναι πλόρωσ αποςαφηνιςμϋνοσ. υγκεκριμϋνα, ςυμβϊλλοντασ ςτην ενεργοπούηςη και τη μετανϊςτευςη των μονοκυττϊρων καθώσ και ςτην ανϊπτυξη τησ αθηρωμϊτωςησ, η IL-6 βοηθϊ ςτην εμφϊνιςη των μικρο- και μακρο-αγγειοπαθητικών επιπλοκών τησ νϐςου. Επύςησ, ϋχει βρεθεύ πωσ το ενεργοποιημϋνο μονοπϊτι των AGEs αυξϊνει την ηπατικό παραγωγό τησ CRP διαμϋςου αϑξηςησ ςτην ϋκφραςη τησ IL-6 (και IL- 1) ςτα μονοκϑτταρα του περιφερικοϑ αύματοσ, υποδηλώνοντασ τη ςυνεργαςύα αυτών των μορύων κατϊ την ανϊπτυξη ενδοθηλιακόσ βλϊβησ. [294-5] Σα επύπεδα τησ IL-6 ϋχουν βρεθεύ αυξημϋνα ςτο πλϊςμα νεαρών ενηλύκων διαβητικών αςθενών (Δ1) με επαρκό γλυκαιμικϐ και λιπιδαιμικϐ ϋλεγχο και ϋλλειψη κλινικών ενδεύξεων αγγειοπαθητικών επιπλοκών. Σα ςτοιχεύα αυτϊ θεωρεύται πωσ υποδηλώνουν την ϑπαρξη υποκλινικόσ όπιασ χρϐνιασ φλεγμονώδουσ απϊντηςησ ςτα ϊτομα με Δ1, ακϐμη και επύ απουςύασ κλινικών ευρημϊτων, η οπούα πιθανϐν μακροπρϐθεςμα ςυςχετύζεται με την ανϊπτυξη των επιπλοκών του διαβότη. [296] Ψςτϐςο, ϐπωσ αναφϋρθηκε παραπϊνω, η τοπικό ϋκκριςη τησ IL-6 και ϊλλων φλεγμονωδών παραγϐντων (TNF-α) απϐ μονοκϑτταρα αςθενών με Δ1 ϋχει βρεθεύ μειωμϋνη, υποδηλώνοντασ την πιθανό καταςτολό του ανοςοποιητικοϑ ςυςτόματοσ ςε αυτοϑσ τουσ αςθενεύσ. [281] TF (Ιςτικϐσ παρϊγοντασ, Tissue Factor ό Παρϊγοντασ πόξη ΙΙΙ) Ο TF αποτελεύ μια διαμεμβρανικό γλυκοπρωτεϗνη, 47 kda, η οπούα αποτελεύ εναρκτόριο μϐριο του μονοπατιοϑ τησ πόξησ. υγκεκριμϋνα, ο TF ςε ςυνδυαςμϐ με τουσ παρϊγοντεσ πόξησ VII και VIIa ενεργοποιεύ τουσ παρϊγοντεσ IX και Φ, δύνοντασ ϋναυςμα ςτον κατταρϊκτη αντιδρϊςεων τησ πόξησ και καταληγοντασ ςτο ςχηματιςμϐ ινώδουσ [297-9] (Εικϐνα 28).

66 65 Εικϐνα 28: Μονοπϊτι τησ πόξησ. Ο ιςτικϐσ παρϊγοντασ (TF) επϊγει τη διαδικαςύα τησ πόξησ μϋςω ενεργοπούηςησ του παρϊγοντα VII και οδηγεύ τελικϊ ςτο ςχηματιςμϐ ινώδουσ. (Y. NEMERSON, 1988) Ο TF φυςιολογικϊ βρύςκεται ςτον υπενδοθηλιακϐ χώρο, τα αιμοπετϊλια και τα λευκοκϑτταρα και το γονύδιο που τον κωδικοποιεύ εδρϊζεται ςτο χρωμϐςωμα 1. Υυςιολογικϊ, ο TF δεν εκφρϊζεται ςτα μονοκϑτταρα του αύματοσ ό τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα ωςτϐςο, ερεθύςματα ϐπωσ οι βακτηριακού λιποπολυςακχαρύτεσ ό οι κυτταροκύνεσ που ενεργοποιοϑν τισ διεργαςύεσ τησ φλεγμονόσ επϊγουν την ϋκφραςό του ςτα κϑτταρα αυτϊ. [299] Όπωσ προαναφϋρθηκε, ςε φυςιολογικεσ καταςτϊςεισ η ϋκφραςη του TF απϐ τα μονοκϑτταρα/μακροφϊγα εύναι περιοριςμϋνη ωςτϐςο αυτό επϊγεται μετϊ απϐ ενεργοπούηςη των ςυγκεκριμϋνων κυττϊρων. Σο γεγονϐσ αυτϐ υποδηλώνει την ϑπαρξη ςϑνδεςησ μεταξϑ των διαδικαςιών τησ φλεγμονόσ και τησ πόξησ. Πιςτεϑεται ϐτι αυτϐσ ο ςυνδϋτησ εύναι το MCP-1, διϐτι ϋχει παρατηρηθεύ η δοςοεξαρτώμενη ϊυξηςη ςτην ϋκφραςη του TF ςε μονοκϑτταρα περιφερικου αύματοσ μετϊ απϐ επαγωγό τουσ με τον ςυγκεκριμϋνο χημειοτακτικϐ παρϊγοντα. [237] Δεδομϋνησ τησ φλεγμονώδουσ αγγειακόσ βλϊβησ που υπϊρχει ςυχνϊ ςτο διαβότη και τησ ςϑνδεςησ των διαδικαςιών φλεγμονόσ με αυτϋσ τησ πόξησ, όταν αναμενϐμενη η εϑρεςη ςυςχϋτιςησ του TF με το διαβότη και τισ καρδιαγγειακϋσ επιπλοκϋσ του. Ψςτϐςο, τα δεδομϋνα απϐ την υπϊρχουςα βιβλιογραφύα εύναι αντιφατικϊ. υγκεκριμϋνα, ϋχει βρεθεύ πωσ η ενεργοπούηςη των μονοκυττϊρων ςτα πλαύςια τησ αγγειοπϊθειασ του διαβότη ςχετύζεται με δομικϋσ και λειτουργικϋσ ποικιλομορφύεσ των διαλυτών μορφών του TF. [300-1] Ϊχει παρατηρηθεύ αϑξηςη των επιπϋδων του TF ςτο πλϊςμα αςθενών με Δ1 και μικροαγγειακϋσ βλϊβεσ. [302] Αντύθετα, η ϋκφραςη του TF δεν ϋχει δεύξει μεταβολϋσ ςτουσ ενόλικουσ αςθενεύσ με Δ1 ςε ςχϋςη με τουσ μϊρτυρεσ, υποδηλώνοντασ ύςωσ τη μεγαλϑτερη ςημαςύα τησ διαλυτό μορφόσ του μορύου ςτην ανϊπτυξη των αγγειακών βλαβών. [303] Σϋλοσ, θεωρεύται πωσ η υπεργλυκαιμύα που ςυνυπϊρχει ςτο Δ αποτελεύ εκλυτικϐ

67 66 παρϊγοντα για την αυξημϋνη ϋκφραςη του TF [304] και πιθανϐν αυτό η διαδικαςύα ςυνδϋεται με την ενεργοπούηςη του RAGE απϐ τα κυκλοφοροϑντα AGEs. υγκεκριμϋνα, ο ενεργοποιημϋνοσ RAGE επϊγει την ανϊπτυξη ενδοκυττϊριασ οξειδωτικόσ απϐκριςησ η οπούα οδηγεύ ςε αϑξηςη τησ ϋκφραςησ προφλεγμονωδών και προ-θρομβωτικών παραγϐντων (TF), ςυμβϊλοντασ ϋτςι ςτη φλεγμονώδη ενδοθηλιακό δυςλειτουργύα και την ανϊπτυξη θρομβωτικών καταςτϊςεων. [305]

68 κοπϐσ τησ εργαςύασ Απϐ ϐλα τα ανωτϋρω καταδεικνϑεται αφενϐσ η ςοβαρϐτητα των επιπτώςεων του Δ ςτη διϊρκεια και την ποιϐτητα τησ ζωόσ των προςβεβλημϋνων ατϐμων και αφετϋρου, η πολυπλοκϐτητα των μηχανιςμών που διϋπουν τη διαδικαςύα ανϊπτυξησ και εξϋλιξησ των επιπλοκών αυτών. Η αυξανϐμενη επύπτωςη τησ νϐςου ςτον παιδιατρικϐ πληθυςμϐ ορύζει επιτακτικό την ανϊγκη τησ αποςαφόνιςησ των διεργαςιών που οδηγοϑν ςτην ανϊπτυξη των διαβητικών επιπλοκών προκειμϋνου να προλαμβϊνεται ό να αναχαιτύζεται η εξϋλιξό τουσ. Εύναι γνωςτϐ πωσ κεντρικϐ ρϐλο ςτην ανϊπτυξη των διαβητικών επιπλοκών διαδραματύζουν τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα και η δυςλειτουργύα αυτών, δυςλειτουργύα η οπούα θεωρεύται πωσ διαμεςολαβεύται απϐ χρϐνια όπια φλεγμονώδη απϊντηςη. κοπϐσ τησ παροϑςασ εργαςύασ εύναι η διερεϑνηςη του ρϐλου που πιθανϐν διαδραματύζουν τα μονοπϑρηνα κϑτταρα του περιφερικοϑ αύματοσ καθώσ και οι διαδικαςύεσ και τα μϐρια τησ φλεγμονόσ ςτην εγκατϊςταςη και εξϋλιξη των αγγειακών επιπλοκών ςε παιδιϊ και νεαροϑσ ενόλικεσ με ακχαρώδη Διαβότη τϑπου 1 (Δ1).

69 68 4. ΤΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ

70 Αςθενεύσ υπϐ μελϋτη Για τη ςυγκεκριμϋνη μελϋτη ϋγινε αιμοληψύα και απομϐνωςη μονοπϑρηνων κυττϊρων απϐ 47 προεφηβικϊ και εφηβικϊ παιδιϊ (ηλικύασ 4-18 ετών) και 10 νεαροϑσ ενόλικεσ (ηλικύασ ετών) με Δ1 και 39 μη διαβητικοϑσ μϊρτυρεσ, αντύςτοιχησ ηλικύασ. Η αιμοληψύα πραγματοποιόθηκε ςε αςθενεύσ που παρακολουθοϑνται ςε τακτικό βϊςη ςτα ιατρεύα τησ Παιδιατρικόσ Ενδοκρινολογύασ του Πανεπιςτημιακοϑ Νοςοκομεύου Πατρών. Προηγόθηκε λεπτομερόσ ενημϋρωςη των αςθενών και των γονϋων για τη φϑςη τησ μελϋτησ και δϐθηκε ενυπϐγραφη ςυγκατϊθεςη για τη ςυμμετοχό τουσ ςε αυτό. ε κϊθε αςθενό ϋγινε λόψη λεπτομεροϑσ ατομικοϑ και οικογενειακοϑ ιςτορικοϑ, ϋλεγχοσ των ςωματομετρικών χαρακτηριςτικών (ϑψοσ, βϊροσ, περύμετροσ κοιλύασ, περύμετροσ ιςχύων, ϊνοιγμα ϊνω ϊκρων, περύμετροσ κεφαλόσ, περύμετροσ τραχόλου) και πλόρησ φυςικό εξϋταςη. Επύςησ, ϋγινε καταγραφό του εργαςτηριακοϑ ελϋγχου ο οπούοσ περιελϊμβανε: γλυκοζυλιωμϋνη αιμοςφαιρύνη (ΗbA1c), ολικό χοληςτερϐλη (Chol), χαμηλόσ πυκνϐτητασ λιποπρωτεϗνη (LDL), υψηλόσ πυκνϐτητασ λιποπρωτεϗνη (HDL), τριγλυκερύδια (Tg), ουρύα, κρεατινύνη και ηπατικϊ ϋνζυμα (SGOT, SGPT). Η πιθανό ϑπαρξη των μικροαγειοπαθητικών αλλοιώςεων ςτουσ διαβητικοϑσ αςθενεύσ ϋγινε με τη βυθοςκϐπηςη και τη μϋτρηςη των επιπϋδων μικροαλβουμύνησ οϑρων 24ώρου.

71 Απομϐνωςη Μονοπϑρηνων Κυττϊρων Περιφερικοϑ αύματοσ (PBMCs) Ϊπειτα απϐ τη λόψη περιφερικοϑ αύματοσ, πραγματοποιόθηκε απομϐνωςη των κυκλοφοροϑντων μονοπϑρηνων κυττϊρων (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs), προσ χρόςη αυτών για περαιτϋρω επεξεργαςύα και μελϋτη. ΤΛΙΚΑ Διϊλυμα PBS (500ml) Ονομαςύα υλικοϑ Histopaque -1077(φικϐλη) [Sigma- Aldrich, Dorset,UK] RPMI 1640 [GIBCO/ Invitrogen] Heparin Sodium PBS NaCl [Sigma- Aldrich] KCl [Sigma- Aldrich] Na 2HPO 4 [Sigma- Aldrich] KH 2PO 4 [Sigma- Aldrich] dh 2O [Sigma- Aldrich] Διϐρθωςη ph = 7,4 40 gr 1 gr 7,2 gr 1,2 gr Ψσ τα 500ml Πύνακασ 8 : Τλικϊ και διαλϑματα για την απομϐνωςη PBMCs απϐ αύμα. Aπομϐνωςη PBMCs απϐ αύμα: ΜΕΘΟΔΟ 20ml ηπαρινιςμϋνου αύματοσ τοποθετόθηκαν ςε 10ml φικϐλησ (θερμοκραςύα δωματύου) με ιδιαύτερη προςοχό ώςτε να μην αναμειχθοϑν οι δϑο ςτιβϊδεσ. τη ςυνϋχεια, ϋγινε φυγοκϋντρηςη με τισ εξόσ ρυθμύςεισ: 3000 ςτροφϋσ/λεπτϐ, 19 ο C, 35 λεπτϊ, επιτϊχυνςη: 2, φρϋνο: 0. (α) Σο αποτϋλεςμα τησ φυγοκϋντρηςησ όταν ο διαχωριςμϐσ του δεύγματοσ ςε 4 ευδιϊκριτεσ ζώνεσ οι οπούεσ απϐ επϊνω προσ τα κϊτω όταν: πλϊςμα, μονοπϑρηνα κϑτταρα, φικϐλη, ερυθρϊ αιμοςφαύρια (Εικϐνα 29). Εικϐνα 29: Απομϐνωςη μονοπϑρηνων κυττϊρων απϐ περιφερικϐ αύμα. τιβϊδεσ μετϊ απϐ την πρώτη φυγοκϋντρηςη με φικϐλη.

72 71 Με προςοχό προσ αποφυγό ανϊμειξησ των ζωνών, ϋγινε ςυλλογό ~3ml πλϊςματοσ απϐ την κορυφό τησ πρώτησ ζώνησ και φϑλαξό του ςτουσ -70 o C (για περαιτϋρω χρόςη). Με χρόςη πλαςτικόσ πιπϋτασ και με όπιεσ κυκλικϋσ κινόςεισ ϋγινε ςυλλογό των μονοπϑρηνων κυττϊρων απϐ τη δεϑτερη ζώνη και μεταφορϊ τουσ ςε νϋο ςωλόνα των 50ml. τη ςυνϋχεια ϋγιναν πλϑςεισ με θρεπτικϐ υλικϐ RPMI Προςτϋθηκε RPMI ωσ τα 45ml και ϋγινε φυγοκϋντρηςη με τισ παρακϊτω ρυθμύςεισ : 1600 ςτροφϋσ/λεπτϐ, 4 ο C, 10 λεπτϊ, επιτϊχυνςη: 9, φρϋνο: 9. (β) Εν ςυνεχεύα, αναρροφόθηκε το υπερκεύμενο υγρϐ, προςτϋθηκαν 5ml RPMI και με μια πιπϋτα αναδεϑτηκε ώςτε να γύνει αναδιϊλυςη του παραχθϋντοσ κυτταρικοϑ ιζόματοσ. Σο εκχϑλιςμα μεταφϋρθηκε ςε νϋο ςωλόνα των 15ml και ςυμπληρώθηκε RPMI ωσ τα 12ml. τη ςυνϋχεια ϋγινε φυγοκϋντρηςη με τισ ςυνθόκεσ φυγοκϋντρηςησ (β). Η διαδικαςύα τησ αναρρϐφηςησ, τησ προςθόκησ RPMI, τησ αναδιϊλυςησ και τησ φυγοκϋντρηςησ επαναλόφθηκε ϐπωσ και προηγουμϋνωσ. Μετϊ την ολοκλόρωςη και τησ τϋταρτησ φυγοκϋντρηςησ αναρροφόθηκε ϐλο το υπερκεύμενο και προςτϋθηκε 1ml PBS ώςτε να γύνει μια τελευταύα πλϑςη ςτα κϑτταρα. Με μια πιπϋτα και PBS αναδιαλϑθηκαν τα κϑτταρα απϐ τα τοιχώματα του ςωλόνα και μεταφϋρθηκαν ςε μικροςωλόνα των 1,5ml. Πραγματοποιόθηκε φυγοκϋντρηςη ( rpm) για 2 λεπτϊ. Αναρροφόθηκε πλόρωσ ϐλο το υπερκεύμενο και απϋμεινε το ύζημα των απομονωμϋνων PBMCs. Σα κϑτταρα αποθηκεϑθηκαν ςε κατϊψυξη -70 ο C.

73 Απομϐνωςη RNA απϐ απομονωμϋνα PBMCs τα απομονωμϋνα PBMCs, πραγματοποιόθηκε απομϐνωςη ολικοϑ RNA με τη χρόςη του RNA extraction kit : GenElute TM Mammalian Total RNA Miniprep Kit, τησ Sigma Aldrich (ςϑμφωνα με τησ κατευθυντόριεσ οδηγύεσ τησ καταςκευϊςτριασ εταιρύασ). ΤΛΙΚΑ Πύνακασ 9: Τλικϊ απομϐνωςησ ολικοϑ RNA απϐ PBMCs. Απομϐνωςη ολικοϑ RNA απϐ PBMCs: GenElute TM Mammalian Total RNA Miniprep Kit ( Sigma Aldrich) Lysis Solution 2-Mercaptoethanol (2-ME) Wash Solution 1 Wash Solution 2 Elution Solution GenElute Filtration Columns in tubes GenElute Binding Columns in tubes Collection tubes, 2.0 ml Λοιπϊ Τλικϊ 70% Ethanol Solution DNase I (RNase free) [Takara] ΜΕΘΟΔΟ Σα PBMCs λϑθηκαν χρηςιμοποιώντασ για κϊθε δεύγμα 250μl Lysis Solution buffer και 2,5μl β-μερκαπτοαιθανϐλη. το ςημεύο αυτϐ απαιτόθηκε καλό ανϊδευςη και φυγοκϋντρηςη για λύγα δευτερϐλεπτα, ώςτε να ςπϊςουν οι μεμβρϊνεσ των κυττϊρων και να ελευθερωθεύ το ολικϐ RNA. Σα δεύγματα μεταφϋρθηκαν ςε κολώνεσ με ειδικϐ φύλτρο, ϐπωσ φαύνεται ςτην Εικϐνα 30 (κολώνα χρώματοσ μπλε) και φυγοκεντρόθηκαν για 2 λεπτϊ, με ςκοπϐ να απομακρυνθοϑν τα κυτταρικϊ θραϑςματα και να αποδεκατιςτεύ το DNA. Σο φύλτρο ςτη ςυνϋχεια απομακρϑνθηκε. τα δεύγματα ϋπειτα προςτϋθηκαν 250μl αιθανϐλησ (70%) και αναδεϑθηκαν καλϊ. Σα δεύγματα μαζύ με την αιθανϐλη μεταφϋρθηκαν ςε νϋεσ κολώνεσ δϋςμευςησ του RNA (Εικϐνα 30) χρώματοσ κϐκκινο και φυγοκεντρόθηκαν για 15 δευτερϐλεπτα. το ςημεύο αυτϐ, το RNA προςδϋνεται ςτο φύλτρο τησ κολώνασ. Ακολουθεύ προςθόκη 250μl Wash Solution Buffer 1 και φυγοκϋντρηςη για 15 δευτερϐλεπτα.

74 73 Σο εκχϑλιςμα ϋπειτα απομακρϑνθηκε και προςτϋθηκε προςεκτικϊ ςτη μεμβρϊνη του φύλτρου τησ κολώνασ 80μl DNAse (10μl DNAse και 70μl DNAse Buffer),για 15 λεπτϊ ώςτε να δρϊςουν οι ενδονουκλεϊςεσ. τη ςυνϋχεια, προςτϋθηκαν 250μl Wash Solution Buffer 1 και ϋγινε φυγοκϋντρηςη για 15 δευτερϐλεπτα. Απομακρϑνοντασ το εκχϑλιςμα, προςτϋθηκαν 500μl Wash Solution Buffer 2. Ακολοϑθηςε φυγοκϋντρηςη για 15 δευτερϐλεπτα. Η πλϑςη με 500μl Wash Solution Buffer 2 επαναλόφθηκε και τα δεύγματα φυγοκεντρόθηκαν για 2 λεπτϊ. Σϋλοσ, απομακρϑνθηκε το νϋο εκχϑλιςμα και προςτϋθηκαν 50μl Elution Solution Buffer. Ακολοϑθηςε φυγοκϋντρηςη για 1 λεπτϐ. Εικϐνα 30: Απομϐνωςη ολικοϑ RNA με τη χρόςη του RNA Extraction Sigma Kit. *Σα 50μl του εκχυλύςματοσ με το ολικϐ RNA αποθηκεϑθηκαν ςε κατϊψυξη -20 ο C. *Όλη η διαδικαςύα πραγματοποιόθηκε ςε πϊγο.

75 RT-PCR & PCR ςε απομονωμϋνα PBMCs ε μονοπϑρηνα κϑτταρα περιφερικοϑ αύματοσ (PBMCs) ςτα οπούα ϋγινε απομϐνωςη ολικοϑ RNA, μελετόθηκε με τη μϋθοδο τησ PCR η γονιδιακό ϋκφραςη των μορύων: χημειοτακτικό πρωτεϗνη των μονοκυττϊρων-1 (MCP-1), ςϑμπλεγμα διαφοροπούηςησ-68 (CD68), πρωτεώνικό κινϊςη-β (AKT2/PKB), παρϊγοντασ νϋκρωςησ ϐγκου-α (TNFα), ιντερλευκύνη-6 (IL-6) και υποδοχϋασ των τελικών προώϐντων προχωρημϋνησ γλυκοζυλύωςησ (RAGE). ΤΛΙΚΑ Master mix I 5x First Buffer 8μl 0,1M DTT 5μl 25nM dntp s 1μl Random Primers 0,25μl RNAse OUT 0,25μl depc H 2O 20,5μl Master mix II 5x First Buffer depc H 2O Superscript 2μl 7μl 1μl Συνολικόσ όγκοσ 35μl Συνολικόσ όγκοσ 10μl Πύνακασ 10: Διαλϑματα παραςκευόσ cdna μϋςω RT- PCR. MCP1 CD68 AKT2 TNF-α IL6 RAGE 10x First Buffer (μl) nM dntp s (μl) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 50 nm MgCl 2 (μl) 2 1,5 1,5 2 2,5 2 Primer forward (μl) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Primer reverse (μl) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 depc H 2O (μl) 31 31,5 36, ,5 31 Taq Polymerase (μl) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 cdna (μl) Tm ( o C) Πύνακασ 11: Διαλϑματα για PCR ςτα μϐρια: MCP1, CD68, AKT2, TNF-α, IL6, RAGE ςε PBMCs. MCP1 CD68 AKT2 TNFα PRIMERS F: TCTCTGCCGCCCTTCTGTGC R: CCGAAGACTTGAACACTCACTCC F: ACAAGCAATAGCACTGCCAC R: GCAGCAACTCGAGCATCATT F: TGAGCTGTCCCGAGCTAGGT R: AGTCGCTCACACAGTCACCG F: AAGCATGATCCGGGACGTGG R: CTCGACTTTGCCGAGTCTGG

76 75 IL6 RAGE ACTIN F: ACGGCATCTCAGCCCTGAGA R: CCTGAGGGCTCTTCGGCAAA F: AACTGCAGGCTCTGTGGGAGGAT R: CCTTGCCAAGCTTTCTTCTACAACC F: AAGGCCAACCGTGAAAAGATGACC R: ACCGCTCGTTGCCAATAGTGATGA Πύνακασ 12: Primers των μορύων MCP1, CD68, AKT2, TNF-α, IL6, RAGE και χρηςιμοποιόθηκαν. (F=forward, R=reverse) ACTIN που ο C για 5 λεπτϊ ο C για 45 δευτερϐλεπτα 3. Σm για 30 δευτερϐλεπτα ο C για 1 λεπτϐ 5. Επανϊληψη βόμ.2-4 για 35 κϑκλουσ * ο C για 5 λεπτϊ 7. 4 ο C επ αϐριςτο Πύνακασ 13: Πειραματικϋσ ςυνθόκεσ PCR που εφαρμϐςθηκαν για την ανύχνευςη των γονιδύων MCP1, CD68, AKT2, TNF-α, IL6, RAGE και ACTIN ςε απομονωμϋνα PBMCs. * ε ϐλα τα μϐρια εφαρμϐζονται 35 κϑκλοι επανϊληψησ των βημϊτων 2-4, εκτϐσ του TNF-α και τησ IL6 για τα οπούα εφαρμϐζονται 40 κϑκλοι. Πόκτωμα αγαρϐζησ 1% Αγαρϐζη 1,4gr ΣΒΕ 0,5x 140ml Εthidium bromide 2,3μl TBE 10x, 1000 ml Tris-Base 108gr Boric Acid 55gr dh 2O Ψσ τα 1000ml Loading Buffer Glycerol 3ml TBE O,5x 7,5ml Bromophenol blue Μϊρτυρασ (ladder) Loading buffer 30μl Stock 1Kb/100bp 10μl dh 2O 60μl Πύνακασ 14: Ρυθμιςτικϊ διαλϑματα και υλικϊ για ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα αγαρϐζησ 1%. ΜΕΘΟΔΟ Μετϊ την απομϐνωςη του ολικοϑ RNA απϐ τα PBMCs ακολοϑθηςε RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), κατϊ την οπούα καταςκευϊςτηκε cdna (ςυμπληρωματικϐ DNA) του ολικοϑ RNA. τη ςυνϋχεια

77 76 ϋγινε παραγωγό πολλαπλών αντιγρϊφων τησ αλληλουχύασ DNA του ενδιαφϋροντϐσ μασ με ενζυματικϐ τρϐπο, PCR (Polymerase Chain Reaction - Αλυςιδωτό Αντύδραςη Πολυμερϊςησ). Καταςκευό cdna απϐ απομονωμϋνο ολικϐ RNA: Αρχικϊ παραςκευϊςτηκε το αρχικϐ διϊλυμα (Master Μix I) του οπούου τα ςυςτατικϊ φαύνονται ςτον Πύνακα 10. Σα 35μl απϐ το παραπϊνω διϊλυμα αναμύχθηκαν με 5μl RNA και τοποθετόθηκαν ςτο μηχϊνημα τησ PCR για 3 λεπτϊ ςτουσ 70 ο C. Ακολοϑθηςε ϊμεςη μεταφορϊ των δειγμϊτων ςτον πϊγο και παραςκευό του δεϑτερου διαλϑματοσ (Master Mix II), του οπούου τα ςυςτατικϊ φαύνονται ςτον Πύνακα 10. το προηγοϑμενο διϊλυμα προςτϋθηκαν 10μl απϐ το Master Mix II και εν ςυνεχεύα τα δεύγματα επανατοποθετόθηκαν ςτο μηχϊνημα για: 60 λεπτϊ ςτουσ 42 ο C και 10 λεπτϊ ςτουσ 70 ο C. Αλυςιδωτό αντύδραςη πολυμερϊςησ ςε απομονωμϋνα PBMCs: Αρχικϊ, παραςκευϊςτηκε διϊλυμα το οπούο περιεύχε το cdna και ϐλα τα υλικϊ που εύναι απαραύτητα για την αντιγραφό του. Σα υλικϊ που χρηςιμοποιόθηκαν για κϊθε γονύδιο ξεχωριςτϊ φαύνονται αναλυτικϊ ςτον Πύνακα 11. Ϊπειτα, το cdna αποδιατϊχθηκε με θϋρμανςη ςτουσ ο C για 5 λεπτϊ. Ακολοϑθηςε ψϑξη ςτουσ ο C (αναλϐγωσ τησ Tm των εκκινητών) για 30 δευτερϐλεπτα, ϋτςι ώςτε να γύνει υβριδοπούηςη των αλυςύδων DNA με τουσ ειδικοϑσ για το γονύδιο εκκινητϋσ (primers). Η Σm εύναι η θερμοκραςύα βϋλτιςτησ τόξησ των εκκινητών (primers). Για τα μϐρια MCP1 & RAGE όταν 55 o C, για τα μϐρια ΣNFα & ΑΚΣ2 εύναι 54 ο C, ενώ για τα μϐρια CD68 και IL6 όταν 52 ο C. Σο μϐριο τησ ACTIN αποτελεύ εςωτερικϐ μϊρτυρα ώςτε να εκτιμηθεύ η ποςϐτητα του mrna ςε κϊθε δεύγμα, και κϊθε φορϊ ελεγχϐταν ςε ςταθερό θερμοκραςύα των 52 ο C. Σϋλοσ, το δεύγμα επωϊςθηκε ςτουσ 72 ο C για 5 λεπτϊ. Σο βόμα αυτϐ απαιτεύται για την επιμόκυνςη τησ αλληλουχύασ των εκκινητών και την αντιγραφό του DNA. Σο παραπϊνω βόμα επιτυγχϊνεται με τη βοόθεια θερμοανθεκτικών ϋνζυμων, ϐπωσ η Taq Polymerase, και των ολιγονουκλεοτιδύων ( dntp s: ATP, TTP, GTP, CTP) που υπϊρχουν ςτο διϊλυμα. Αυτϐσ ο κϑκλοσ βημϊτων πραγματοποιόθηκε για 35-40φορϋσ (αναλϐγωσ του μορύου που ελεγχϐταν). Μετϊ το πϋρασ των κϑκλων η θερμοκραςύα διατηρεύτο ςτουσ 4 ο C επ αϐριςτο. Οι εκκινητϋσ και οι ακριβεύσ ςυνθόκεσ που εφαρμϐςτηκαν για κϊθε γονύδιο ςτο μηχϊνημα τησ PCR, φαύνονται ςτουσ Πύνακεσ 12 και 13 αντύςτοιχα. Σο αμϋςωσ επϐμενο βόμα, μετϊ την RT-PCR, όταν η ηλεκτροφϐρηςη των δειγμϊτων ςε πόκτωμα αγαρϐζησ 1%. Για να επιτευχθεύ αυτϐ, ςτα δεύγματα προςτύθονταν 15μl Loading Buffer. Σα υλικϊ που απαιτοϑνται για την παραςκευό του πηκτώματοσ αγαρϐζησ παρατύθενται ςτον Πύνακα 14.

78 77 25μl απϐ το κϊθε δεύγμα τοποθετεύτο ςτα κελιϊ του πηκτώματοσ αγαρϐζησ (1%) και ηλεκτροφοροϑταν, αρχικϊ ςε τϊςη ρεϑματοσ 80V και εν ςυνεχεύα 120V. το πρώτο κελύ τοποθετοϑςαμε τον μϊρτυρα DNA ladder 100b ό 1kb (ςυγκεκριμϋνων μοριακών βαρών) (Εικϐνα 31). Εικϐνα 31: Μϊρτυρεσ (ladder) για ηλεκτροφϐρηςη PCR, 100 bp και 1kb αντύςτοιχα. Με το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ γινϐταν λόψη εικϐνασ του πηκτώματοσ με τη βοόθεια υπεριώδουσ φωτϐσ (UV). Σο βρωμιοϑχο αιθύδιο που υπϊρχει ςτο πόκτωμα δεςμεϑεται ςτο DNA ενώ εκπϋμπει φωσ ςτα μόκη κϑματοσ τησ υπεριώδουσ ακτινιβολύασ. Μϋςω αυτοϑ γύνεται ορατϐ το DNA ςε αυτϐ το φϊςμα. Η λόψη τησ φωτογραφύασ γινϐταν με πρϐγραμμα KODAK Digital Science 1D TM. Σα αρχεύα των ληφθϋντων εικϐνων των ζωνών του DNA επεξεργϊζονταν με το ηλεκτρονικϐ πρϐγραμμα Scion Image μϋςω του οπούου γινϐταν ποςοτικοπούηςη τησ οπτικόσ πυκνϐτητασ κϊθε ζώνησ DNA, απϐ καθϋνα δεύγμα, για το εκϊςτοτε μϐριο. Εν ςυνεχεύα το ςϑνολο δεδομϋνων μεταφϋρονταν και επεξεργϊζονταν ςε φϑλλο εργαςύασ του προγρϊμματοσ Excel Η γονιδιακό ϋκφραςη κϊθε μορύου ςυγκρινϐταν με τη γονιδιακό ϋκφραςη τησ β-ακτύνησ. Η β-ακτύνη ωσ δομικϐ ςτοιχεύο του κυτταροςκελετοϑ θεωρεύται πωσ ϋχει αμετϊβλητη απϐ τισ ςυνθόκεσ ϋκφραςησ, οπϐτε λειτουργεύ ωσ εςωτερικϐσ μϊρτυρασ τησ γονιδιακόσ ϋκφραςησ. υνεπώσ, η τελικό μϋτρηςη για κϊθε μϐριο προϋκυπτε απϐ τη ςχϋςη: (οπτικό πυκνϐτητα ζώνησ μορύου-γονιδύου / οπτικό πυκνϐτητα ζώνησ ακτύνησ δεύγματοσ) * 100%.

79 Ανοςοαποτϑπωςη κατϊ Western ςε απομονωμϋνα PBMCs ε λυμϋνα για πρωτεϗνεσ PBMCs, πραγματοποιόθηκε με τη μϋθοδο τησ ανοςοαποτϑπωςησ κατϊ Western, μελϋτη τησ πρωτεώνικόσ ϋκφραςησ των μορύων: Πρωτεώνικό κινϊςη-β (AKT2/PKB), Ιςτικϐσ παρϊγων (TF) και Τποδοχϋασ των τελικών προώϐντων προχωρημϋνησ γλυκοζυλύωςησ (RAGE). ΤΛΙΚΑ 2XSDS (Sample Buffer) Απιονιςμϋνο νερϐ 3,5ml 0.5Μ Tris-HCl 2,5ml 100% Glycerol 2,0ml 20% SDS 2,0ml Bromophenol blue Πύνακασ 15: Διϊλυμα SDS Sample Buffer. Πόκτωμα πακεταρύςματοσ 4% - δϐςη για πϊχοσ 1,5mm Απιονιςμϋνο νερϐ 3,075ml 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 1,25ml 20% (w/v) SDS 0,025ml Acrylamide/Bis-Acrylamide (30% / 0,8% w/v) 0,67ml 10% (w/v) ammonium persulfate-aps 0,025ml TEMED 0,010ml Πόκτωμα διαχωριςμοϑ - δϐςη για πϊχοσ 1,5mm 7% 10% 12% 15% Απιονιςμϋνο νερϐ 5,1ml 4,1ml 3,4ml 2,4ml 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 2,5ml 2,5ml 2,5 ml 2,5ml 20% (w/v) SDS 0,05ml 0,05ml 0,05 ml 0,05ml Acrylamide/Bis-Acrylamide 2,3ml 3,3ml 4,0 ml 5,0ml (30% / 0,8% w/v) 10% (w/v) ammonium O,05ml O,05ml O,05 ml O,05ml persulfate-aps TEMED 0,010ml 0,010ml 0,010ml 0,010ml *Οι καταλϑτεσ APS και TEMED λϐγω των ιδιοτότων τουσ τοποθετοϑνταν τελευταύοι ςτο πόκτωμα. *Σο ΑPS παραςκευαζϐταν κϊθε φορϊ που γινϐταν ηλεκτροφϐρηςη. Πύνακασ 16: Τλικϊ για παραςκευό πηκτώματοσ πακεταρύςματοσ (Stacking gel) 4% και πηκτώματοσ διαχωριςμοϑ (Seperating gel) των πρωτεώνών κατϊ την ανοςοαποτϑπωςη κατϊ Western.

80 79 Running buffer 10x, 1000ml Tris-Base 30gr Glycine 144gr SDS 5gr dh 2O Μϋχρι τα 1000ml Trasfer buffer 10x, 1000ml Tris-Base 30gr Glycine 144gr dh 2O Μϋχρι τα 1000ml TBS 10x, ph 7.5,1000ml Tris-Base 60,55gr NaCl 87,66gr dh 2O Μϋχρι τα 1000ml TBS Tween 1x, 1000ml TBS 10x 100ml Tween 20 1ml dh 2O 900ml Ponceau 10x Ponceau 2gr Trichloroacetic acid 30gr Sulfosalicylic acid 30gr Πύνακασ 17: Ρυθμιςτικϊ διαλϑματα για την ανοςοαποτϑπωςη κατϊ Western. Διϊλυμα Blocking 10%, 50ml Ωπαχο γϊλα 5ml TBS - Tween 45ml *Sodium Azide 20% 50μl Πρώτα Αντιςώματα 10ml RAGE (1:150) 50μl anti-rage ςε 10ml blocking AKT2 (1:1000) 50μl anti-akt2 ςε 10ml blocking TF (1:250) 50μl anti-tf ςε 10ml blocking β-tubulin (1:500) 50μl anti-β tubulin ςε 10ml blocking Δεϑτερα Αντιςώματα 10 ml ςυγκϋντρωςησ 1:1000 Anti-mouse Anti-rabbit 10μl anti-mouse ςε 10ml blocking χωρύσ Sodium Azide 10μl anti-rabbit ςε 10ml blocking χωρύσ Sodium Azide Δεϑτερα Αντιςώματα 10 ml ςυγκϋντρωςησ 1:2000 Anti-mouse 5μl anti-mouse ςε 10ml blocking χωρύσ Sodium Azide *Η προςθόκη Sodium Azide 20% γινϐταν μϐνο κατϊ την παραςκευό πρωτογενοϑσ αντιςώματοσ. Πύνακασ 18: Διϊλυμα Blocking 10% και διαλϑματα πρώτων και δεϑτερων αντιςωμϊτων για την επώαςη τησ μεμβρϊνησ νιτροκυτταρύνησ ςτη μϋθοδο τησ ανοςοαποτϑπωςησ κατϊ Western ςε PBMCs.

81 80 Western Immunoblotting ςε PBMCs: ΜΕΘΟΔΟ Σα απομονωθϋντα PBMCs λϑθηκαν με ςκοπϐ να απομονωθοϑν οι πρωτεϗνεσ. Για κϊθε δεύγμα χρηςιμοποιόθηκαν 50μl SDS Sample Buffer (Πύνακασ 15) και 2,5μl β- μερκαπτοαιθανϐλησ. Σο διϊλυμα που χρηςιμοποιόθηκε περιϋχει ανιοντικϐ απορρυπαντικϐ SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), το οπούο δεςμεϑεται ςτισ πρωτεϗνεσ και αποτελεύ ιςχυρϐ αποδιατακτικϐ παρϊγοντα. Η β-μερκαπτεθανϐλη διαςπϊ τουσ διςουλφιδικοϑσ δεςμοϑσ (S-S) των πρωτεώνών. Σα θραϑςματα των κυττϊρων ςτη ςυνϋχεια βρϊςθηκαν για 5 λεπτϊ ϋτςι ώςτε να επιτευχθεύ πλόρησ αποδιϊταξη των μορύων. Σα δεύγματα με τισ πρωτεϗνεσ μετϊ τη φυγοκϋντρηςη τοποθετόθηκαν ςε πόκτωμα πολυακριλαμιδύου και ηλεκτροφορόθηκαν. Η τεχνικό αυτό ονομϊζεται SDS-PAGE και ςτηρύζεται ςτο γεγονϐσ ϐτι τα κϑτταρα ϋχουν όδη λυθεύ με τη χρόςη απορρυπαντικοϑ SDS, οπϐτε οι πρωτεϗνεσ κατϊ τη διϊρκεια τησ ηλεκτροφϐρηςησ διαχωρύζονται βϊςει του μοριακοϑ τουσ μεγϋθουσ, καθώσ ϐλα τα μϐρια ϋχουν κοινϐ ανιοντικϐ φορτύο. το ςυγκεκριμϋνο εύδοσ ηλεκτροφϐρηςησ χρηςιμοποιεύται ωσ μϋςο διαχωριςμοϑ το ακρυλαμύδιο το οπούο δημιουργεύ τριςδιϊςτατα πολυμερό δύκτυα ςε μια ευρεύα κλύμακα. Σο πόκτωμα (gel) ςχηματύζεται με πολυμεριςμϐ των μονομερών ακρυλαμιδύου, που οδηγεύ ςτη δημιουργύα αλυςύδων πολυακρυλαμιδύου. τισ αλυςύδεσ αυτϋσ ενςωματώνονται κατϊ διαςτόματα μϐρια ΝΝ-μεθυλεν-bis-ακρυλαμιδύου, τα οπούα λϐγω τησ δομόσ τουσ μποροϑν να ενςωματωθοϑν ςε δϑο διαφορετικϋσ αλυςύδεσ και ϋτςι να δημιουργηθεύ πλϋγμα. Ο πολυμεριςμϐσ του ακρυλαμιδύου εύναι ϋνα παρϊδειγμα καταλυτικόσ δρϊςησ των ελευθϋρων ριζών. Η κατϊλυςη γύνεται μϋςω μύασ βϊςησ, τησ ΝΝΝ Ν -τετραμεθυλαιθυλενοδιαμύνη (TEMED), με τη βοόθεια ελευθϋρων ριζών που δημιουργοϑνται χημικϊ με υπερθειώκϊ ιϐντα (S2O3 2- ), χϊρη ςτην παρουςύα ενϐσ δεϑτερου καταλϑτη, του υπερθειικοϑ ϊλατοσ του αμμωνύου [Ammonium Persulphate (APS)]. Σο πόκτωμα ακρυλαμιδύου/bis-ακρυλαμιδύου διακρύνεται ςε δϑο επιμϋρουσ μϋρη: ςτο πρώτο τμόμα ό πόκτωμα πακεταρύςματοσ (stacking gel) το οπούο ϋχει ςταθερϐ ποςοςτϐ ακρυλαμιδύου (4%) και εύναι ανεξϊρτητο απϐ το μϋγεθοσ των προσ ανϊλυςη πρωτεώνών, και ςτο δεϑτερο τμόμα ό πόκτωμα διαχωριςμοϑ (separating gel) του οπούου το ποςοςτϐ ακρυλαμύδησ εξαρτϊται απϐ το μοριακϐ μϋγεθοσ των προσ διαχωριςμϐ πρωτεώνών. Η ςϑςταςη των πηκτωμϊτων πολυακριλαμιδύου τύθενται ςτον Πύνακα 16. τον Πύνακα 19 παρουςιϊζονται οι βϋλτιςτοι ςυςχετιςμού μεταξϑ τησ ςυγκϋντρωςησ ακρυλαμιδύου των πηκτών διαχωριςμοϑ και των αντιςτούχων μοριακών βαρών (ςε KDa) των προσ διαχωριςμϐ πρωτεώνών. τα πειρϊματϊ μασ η επιθυμητό ςυγκϋντρωςη πολυακριλαμιδύου όταν 10%. υγκϋντρωςη Εϑροσ ΜΒ ςε KDa πηκτόσ 7% % % Πύνακασ 19: Βϋλτιςτοι ςυςχετιςμού ςυγκϋντρωςησ ακρυλαμιδύου των πηκτών διαχωριςμοϑ και αντιςτούχων μοριακών βαρών (ςε KDa) των προσ διαχωριςμϐ πρωτεώνών.

82 81 Σα δεύγματα φορτώθηκαν με την επιθυμητό ποςϐτητα ςτα κελιϊ τησ πηκτόσ. Μαζύ με τα δεύγματα φορτώθηκαν και 10μl ladder (μϊρτυρασ με γνωςτϊ μοριακϊ μεγϋθη). τη ςυνϋχεια εφαρμϐςτηκε τϊςη ρεϑματοσ 80V για ϐςη ώρα οι πρωτεϗνεσ βρύςκονταν ςτο πόκτωμα πακεταρύςματοσ και 120V αφϐτου περϊςαν ςτο πόκτωμα διαχωριςμοϑ. την ηλεκτροφϐρηςη χρηςιμοποιόθηκε Running Βuffer 1x (Πύνακασ 17) ωσ ρυθμιςτικϐ διϊλυμα. Μετϊ την ολοκλόρωςη τησ ηλεκτροφϐρηςησ, οι πρωτεϗνεσ μεταφϋρθηκαν και καθηλώθηκαν απϐ το πόκτωμα ςε μεμβρϊνη νιτροκυτταρύνησ μϋςω μεταφορϊσ (transfer), διϊρκειασ 1ώρασ και 20 λεπτών, υπϐ ςταθερόσ ϋνταςησ ρεϑμα 300mΑ. Σο ρυθμιςτικϐ διϊλυμα μεταφορϊσ που χρηςιμοποιόθηκε εύναι το Transfer Βuffer 1x (Πύνακασ 17). Εικϐνα 32: χηματικό απεικϐνιςη διαδικαςύασ SDS-PAGE ηλεκτροφϐρηςησ (πϊνω) και μεταφορϊσ πρωτεώνών ςε μεμβρϊνη νιτροκυτταρύνησ (κϊτω) κατϊ τη διϊρκεια τησ ανοςοαποτϑπωςησ κατϊ Western. Πριν την επώαςη με το αντύςωμα, η μεμβρϊνη επωϊςτηκε με διϊλυμα μπλοκαρύςματοσ των μη ειδικών θϋςεων πρϐςδεςησ των αντιςωμϊτων (διϊλυμα blocking ) για 1 ώρα, το οπούο περιεύχε ϊπαχο γϊλα ςε μορφό ςκϐνησ διαλυμϋνο ςε ΣΒS Tween 1x (Πύνακασ 18). Οι μεμβρϊνεσ ϋπειτα υβριδοποιόθηκαν με ειδικϊ πρωτογενό αντιςώματα. τη ςυγκεκριμϋνη εργαςύα χρηςιμοποιόθηκαν τα εξόσ πρωτογενό αντιςώματα: Anti-RAGE ςυγκϋντρωςησ 1:150 (Rabbit polyclonal antibody, Santa Cruz) Anti-AKT2 1:1000 (Mouse polyclonal antibody, Upstate) Anti-Tissue Factor (TF) 1:250 (Rabbit polyclonal antibody,santa Cruz) & Anti-β-Σubulin 1:500 (Mouse monoclonal antibody, Upstate).