Metode optice de analiza instrumentala. Cursul 11

Transcript

1 Metode optice de analiza instrumentala Cursul 11 1

2 OBIECTIVE Prezentarea tipurilor de metode optice Principiile fundamentale ale metodelor optice Spectroscopia moleculara UV VIS Principii generale Variante de lucru Determinari calitative Determinari cantitative Spectrometrie atomica notiuni fundamentale 2

3 METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC In functie de natura interactiunii dintre radiatii si substante: 1. Metode optice de absorbție de energie Spectrofotometrie moleculară - UV, VIS, IR Spectroscopie atomică 2. Metode optice de emisie de energie Spectroscopie atomică de emisie domenii diverse de lungimi de unda Spectrofotometrie moleculară - fluorescenta, fosforescenta, chemiluminiscenta, difuzia luminii 3

4 3. Metode de fluorescenta, fosforescenta, chemiluminiscenta Metode de difractie Metode refractometrice Metode polarimetrice Metode de difuzie a luminii Metode combinate 4

5 METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC in functie de tipul de analit cercetat Metode optice moleculare absorbție de energie: Spectrofotometrie (UV, VIS, IR) emisie de energie - fluorescenta, fosforescenta, chemiluminiscenta, difuzia sau difractie luminii, polarimetrie, refractometrie Metode optice atomice absorbție de energie Spectroscopie atomică de absorbtie AAS emisie de energie Spectroscopie atomică de emisie OES 5

6 Principii fundamentale ale spectroscopiei optice Se bazeaza pe absorbția sau emisia radiațiilor electromagnetice de către molecule sau atomi radiația electromagnetică are: proprietăți de undă şi de particulă se caracterizeaza prin : 1. lungimea de undăλ cm (micrometriµm, nanometri nm, milimicroni mµ, angstromi Ǻ 2. frecvențaν(nr cicli/sec) - herzi Hz 3. amplitudine A - cm 4. Energie - ev, kev, mev, calorii (cal, kcal),, ergi. 6

7 Caracterizarea undelor electromagnetice Lungimea de undă (λ) = wave length Amplitudine = amplitude Unde cu frecvență înaltă = High frequency waves Unde cu frecvență joasă = Low frequency waves 7

8 Rezultatul determinarii spectroscopice spectru spectrul prezinta grafic energia (emisă sau absorbită) in functie de lungimea de unda Spectrele de absorbție A = f(λ). 8

9 Rezultatul determinarii spectroscopice spectru Fiecare substanță are un spectru de absorbție caracteristic: ca formă generală, ca domeniu spectral, ca număr de maxime (picuri) ca raporturi între intensitățile diverselor picuri 9

10 10

11 Absorbția radiației electromagnetice Notiuni fundamentale Considerăm o radiație incidentă monocromatică, Io, care cade pe o celulă conținând proba (substanta de analizat), celula are lungimea l cm iar concentrația substanței ce absoarbe lumina este C. Transmitanta T T = I 1 /I 0 Absorbanta A A = -ln(t) 11

12 LEGILE ABSORBTIEI - Legea Lambert-Beer I = I 0 e -kl k - coeficientul de absorbție l lungimea cuvei ln(i 0 /I) = kl A = kl k = const. C k - coeficient molar de extincție (absorbanță) notatε, pentru C exprimata in [mol/l] Forma generala a legii Lambert-Beer este: A = εlc 12

13 SPECTROMETRIE UV VIS (moleculara) Caracterizare generala Spectrofotometrie in domeniul de lungimi de unda ultraviolet ( nm) si vizibil ( nm) Aparatele utilizate se numesc spectrofotometre UV-VIS Se determina molecule, deci substante 13

14 ACTIVITATE INDEPENDENTA Care din urmatoarele determinari optice aplicate la controlul alimentelor se desfasoara in domeniul UV si care in domeniul VIS: 1. Determinarea polifenolilor λ = 760 nm 2. Determinarea flavonoidelor λ = 510 nm 3. Determinarea HMF din miere λ = 284 si 336 nm 4. Determinarea proteinelor (Bradford) λ = 595 nm 5. Determinarea prolinei λ = 510 nm 6. Determinarea catalazei (Beers) λ = 240 nm 7. Determinarea catalazei (Guaiacol) λ = 570 nm 8. Determinarea peroxidazei λ = 470 nm 9. Determinarea nitritilor λ = 520 nm 14

15 Aparatura utilizată Schema bloc pentru un spectrometru de absorbție toate componentele optice trebuie să fie transparente pentru domeniul de lungimi de unda ales!!!! 15

16 Spectrofotometru in UV VIS Spectrometru FT-IR 16

17 Caracterizarea părților componente ale aparaturii in spectrometria UV VIS 1. Sursa Emite semnalul (radiatia) semnalul emis trebuie să fie o radiație continuă în domeniul ales; semnalul trebuie să fie constant 2. Monocromatorul scop: separarea radiației policromatice într-una monocromatică dispozitiv de tip optic (prisme) 17

18 3. Cuvele pentru probă materiale transparente în domeniul lungimii de undă utilizate; grosimea trebuie să fie reproductibilă, constantă, cunoscută, măsurabilă. ultraviolet - cuve din cuarț (λ 200 nm 400 nm) vizibil cuve din sticlă moale sau Pyrex (λ 300 nm 2,5µm) 18

19 4. Detectorii fotomultiplicatoare, emulsii fotografice, termocuple, celule fotoconductive, celule pneumaticeşi celule fotoelectrice în funcție de domeniul spectrului. în domeniul UV vizibil - fotocelule, celule fotomultiplicatoare, filme fotografice 19

20 Părți componente ale spectrofotometrului de absorbție UV VIS Diferentieri functionale UV/VIS 20

21 Principiu general Spectrometria de absorbție în UV-VIS - principii Unele substanțe (nemetale, metale, compuşi ai acestora, substanțe organice) au proprietatea de a forma cu reactivi specifici, în anumite condiții, compuşi solubili colorați. Intensitatea de culoare a compusului format, numit compus colorimetrabil, este direct proporțională cu concentrația sa în anumite limite ale acesteia. Metoda spectrofotometrică molecularǎ se bazează pe determinarea (masurarea, citirea) la un aparat numit spectrofotometru a absorbanței unei soluții colorate de o concentrație anume, la o lungime de undă specifică, în domeniul ultraviolet (UV) sau vizibil (VIS). 21

22 Orice determinare spectrofotometrică se caracterizează prin următoarele aspecte: reactivul de culoare utilizat, adică reactivul care determină formarea unui compus colorimetrabil prin reacție cu specia pe care dorim să o determinăm; lungimea de undăλla care se face determinarea, specifică pentru fiecare compusşi nominalizată în metodă; dimensiunea cuvei aparatului care se utilizează (drumul optic; de cele mai multe ori este 1 cm). 22

23 Variante de lucru: 1. Colorimetria (VIS) Spectrometria de absorbție în UV-VIS 2. Fotometria (VIS: lumina incidentă este filtrată prin filtre optice, cu spectru larg) 3. Spectrofotometria (UV, VIS: lumina incidentă este filtrată prin monocromatoare, domeniul îngust) 23

24 Colorimetria intensitatea culorii probei se compară vizual, în lumină albă, cu un set de soluții etalon de concentratie cunoscuta - prelucrate în condiții absolut identice cu proba. În această tehnică se pot realiza măsurători, prin comparație vizuală, în eprubetă, la lumina zilei, rezultând analize chimice cu exactități < decât 1%. 24

25 este o metodă subiectivăşi mai puțin selectivă rezultatele depind mult de persoana care execută analiza deoarece sensibilitatea maximă a ochiului omenesc atinge maximul pentru domeniul nm (domeniul culorii verzi), lucru important când compararea probei cu etalonul se face vizual Cu cât există mai multe soluții etalon, pentru comparație, cu atât metoda este mai exactă. 25

26 Colorimetria.tropical.com.pl/images/upload/fck/image/test.jpg 26

27 Culoarea unui compus nu este culoarea absorbita ci este culoarea care ramane dupa ce se scade frecventa absorbita din sursa de radiatii 27

28 ACTIVITATE INDEPENDENTA Pentru compusii care se determina la activitatea independenta anterioara scrieti culoarea compusului colorimetrabil care se formeaza si caruia i se determina absorbanta 28

29 Fotometria şi spectrofotometria măsoară instrumental lumina transmisă de o soluție colorată (vizibil) sau incolora (ultraviolet) lucrând cu o sursă de lumină monocromatică. Când lumina incidentă este filtrată, prin filtre optice, având un spectru mai larg, avem de a face cu o fotometrie când domeniul filtrat este mai îngust (utilizând monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie. La spectrofotometrie, este posibilă fixarea mai precisă a lungimii de undă la care se lucrează. 29

30 Cu ambele variante se poate chiar trasa un spectru de absorbție, adică o curbă, obținută prin măsurarea semnalului în funcție de lungimea de undă a radiației incidente. În literatura de specialitate uneori se foloseşte pentru ambele metodeşi denumirea de metodă colorimetrică (sau chiar spectrocolorimetrică), ceea ce uneori poate crea confuzii. În domeniul UV, ochiul omenesc nepercepând lumina, se utilizează doar spectrofotometria. 30

31 Determinari calitative in spectroscopia UV VIS Se bazeaza pe compararea spectrelor de absorbție (λ maximelor) ale substanțelor în domeniul UV-VIS, ( nm) cu spectre cunoscute λ max maxim de absorbție X - selectivitatea maximului de absorbție 31

32 32

33 33

34 Determinǎri cantitative ȋn spectroscopie Înălțimea curbei şi suprafața încadrată de curbă reprezintă caracteristici cantitative care servesc la determinarea concentrației substanțelor din probe Se bazeaza pe legea Lambert-Beer A = εlc Se realizeaza o curba de etalonare pe baza determinarii absorbantei etalonului la diferite concentratii cunoscute, la lungimea de unda corespunzatoare maximului de absorbtie 34

35 În dreapta - curba de absorbție la diferite concentrații În stânga - curba de etalonare având un maxim de absorbție la lungimea de undă, λmax = 610 nm 35

36 UV-vis spectra of different concentrations of Rose Bengal. The molecular structure of Rose Bengal (4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'- tetraiodofluorescein). Calibration curve of Rose Bengal. Equation of line: y = x (R2 = 0.996) 36

37 Spectrul de absorbție al Rodaminei B la diferite concentrații 37

38 Absorbanta Curba de etalonare, nitriti in ape, Griess y = x R 2 = Concentratia, mg/l 38

39 Curba etalonare nitriti ape y = x R 2 = Abs Conc 1.4 Curba etalonare nitriti ape y = x R 2 = abs conc 39

40 Determinarea concentratiei pentru proba necunoscutǎ NUMAI PENTRU DOMENIUL DE CONCENTRATIE IN CARE ESTE VALABILA LEGEA LAMBERT-BEER 1. Prin comparație cu un etalon de concentrație cunoscută 2. Pe baza factorului de panta mediu, Fm 3. Pe baza ecuatiei de regresie aferenta curbei de etalonare, y=ax + b 40

41 1 - Prin comparație cu un etalon de concentrație cunoscută (interpolare) εmol - coeficientul de extincție molară pentru soluția de concentrație cunoscută, respectiv de concentrație necunoscută, b-grosimea probei din cuvă, c-concentrația cunoscută a probei de referință, cx- concentrația necunoscută a probei analizată. Prin împărțirea celor două ecuații se obține: Calculul concentrației pentru proba necunoscută: 41

42 2 - Pe baza factorului de panta mediu, Fm factorul de transformare (de pantă) F este raportul dintre concentrațiile şi absorbanțele corespunzătoare pentru fiecare soluție care formează scara etalon. Ci F i = A i se calculează media aritmetică a valorilor obținute F i, notată cu Fm: n F i i=1 F m = n unde i are valori de la 1 la maxim n, în funcție de numărul de soluții etalon utilizate pentru obținerea punctelor prin care se obține curba de etalonare (minim 5 maxim 10, în general). Concentrația probei necunoscute se determină prin calcul, înmulțind absorbanța citită Ax cu Fm. C x = A x F m 42

43 Exemplu 43

44 ACTIVITATE INDEPENDENTA Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2, 3) prin metoda factorului de panta mediu Fm 44

45 3 - Pe baza ecuatiei de regresie Pe baza ecuației care descrie curba de etalonare Y absorbanta X - concentratia y = ax +b, de unde x = (y- b)/a se determinǎ concentrația necunoscutǎ c x c x = (absorbanța x b)/a 45

46 Exemplu NOTA - R 2 este o masura a liniaritatii curbei, deci a respectarii legii Lambert-Beer, cu atat mai buna cu cat valoarea este mai aproape de 1 46

47 ACTIVITATE INDEPENDENTA Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2, 3) prin utilizand ecuatia de regresie a curbei de etalonare 47

48 Spectrometria atomica Spectroscopia atomică constă în urmatoarele tehnici de uz analitic: emisia atomică; absorbția atomică 48

49 introdusă în analiza chimică din anul 1952 de către australianul A. Walsh se bazează pe fenomenul descoperit de germanul G. R. Kirchhoff (1859) -şi anume inversia liniilor spectrale legea lui Kirchhoff: Principiul spectrometriei atomice Fiecare element chimic absoarbe acele radiații pe care le poate emite în aceleaşi condiții, bine determinate, de temperatură şi presiune. 49

50 Atom invelis electronic stare fundamentala Dacă o radiație de o anumită lungime de undă acționează asupra unui atom aflat în stare fundamentală, atomul poate să absoarbă radiația şi să treacă într-o stare excitată, un astfel de proces fiind cunoscut sub denumirea de absorbție atomică 50

51 Întrucât această stare (excitata) este instabilă, atomul va reveni imediat şi spontan către starea fundamentală. Electronul se va întoarce în poziția lui inițială, poziția stabilă orbital şi va fi emisă o cantitate de energie radiantă echivalentă cu cea absorbită în procesul de excitare. Lungimea de undă a energiei radiante emise este direct legată de tranziția electronică care a avut loc si este egala cu cea a energiei absorbite Deoarece fiecare element are o structură electronică unică, lungimea de undă a luminii emise este o proprietate unică a fiecărui element în parte. 51

52 Ce se determina prin spectroscopie atomica? ATOMI ELEMENTE CHIMICE, METALE 52

53 Aparatura ȋn absorbția atomicǎ 53

54 Sursa de radiații emite un flux luminos de intensitate constantă, prestabilita Soluția conținând proba de analizat (sau etalonul, este transformată într-un aerosol fin, în interiorul unei incinte numite sistem de pulverizare sau pulverizator (nebulizor). Aerosolul, amestecat intim cu amestecul de gaze (oxidant plus carburant) este condus în flacără unde atomii unui anumit element absorb doar lumina cu lungimea de undă specifică elementului respectiv. Monocromatorul selecteaza radiatia specifica elementului cercetat Detectorul (un foto-multiplicator), măsoară intensitatea luminii monocromatice Inregistrare date computer - 54

55 Determinari in AAS Determinare calitativă Atomii unui anumit element absorb doar lumina cu lungimea de undă specifică elementului respectiv (emisă de sursăşi trecută prin flacără) Atomii celorlalte elemente însoțitoare nu absorb lumina la aceeaşi lungime de undă ci fiecare la alte valori ale acesteia deci prin selectarea lungimii de undă se pot identifica elementele chimice 55

56 56

57 Activitate independenta Care este elementul necunoscut (unknown) din exemplul de pe slide-ul anterior? 57

58 Determinare cantitativă Se bazeaza pe Legea Lambert-Beer Diminuarea intensitatii radiatiei, exprimată în unitați de absorbanță, este proporțională cu numărul de atomi ai elementului de analizat, prezenți în flacăra, deci cu concentratia acestora. 58

59 Aplicatiile metodelor optice la controlul alimentelor 59

60 CONCLUZII Metodele optice permit determinari de atomi si/sau molecule in functie de tehnica folosita si domeniul spectral (lungimea de unda) Spectrofotometria moleculara in UV si VIS este cea mai utilizata tehnica in controlul curent al alimentelor Determinarile optice calitative se bazeaza peλa maximelor si numarul acestor maxime Determinarile optice cantitative se bazeaza pe relatia dintre absorbanta si concentratie, potrivit legii Lambert-Beer 60

61 Aparatele utilizate Spectrofotometre in care semnalul optic se converteste in semnal electric și care are componentele optice transparente la λ de lucru Tehnicile de lucru in spectrofotometria moleculara sunt: colorimetria, fotometria si spectrofotometria Determinarile cantitative se bazeaza pe operatiunea de etalonare curba de calibrare prin tehnici de calcul diferite Spectroscopia atomica emisie si absorbtie atomica Aplicatiile metodelor optice in control alimente se refera la compozitie, substante adaugate si contaminanti chimici 61

62 Test de verificare 1. Care sunt tipurile de metode optice utilizateȋn controlul alimentelor? 2. Pe ce principiu fizic general se bazează spectroscopia optică? 3. Care sunt mărimile care caracterizează o radiație electromagnetică? 4. Cum se numește rezultatul unei determinări spectroscopice? 5. Care este domeniul de lungimi de undăȋn care se execută determinările spectroscopiceȋn UV/VIS? 6. Definiți transmitanța/absorbanța la o determinare spectrofotometrică. 7. Care este legea fundamentală aplicată la determinările spectrofotometrice? 8. Definiți legea Lambert Beer forma generală. 9. Ce se determină (dpdv analitic) atunci cănd se utilizează metode spectrofotometriceȋn domeniul UV și VIS? 10. Care sunt părțile componente ale unui spectrofotometru? 62

63 11. Care diferențe suntȋntre spectrofotometru care face determinăriȋn domeniul UV față de cel care face determinăriȋn domeniulȋn VIS? 12. Care este principiul general al determinărilorȋn spectroscopia de absorbție UV-VIS? 13. Prin ce se caracterizează orice determinare spectrofotometrică? 14. Care sunt variantele de lucru ȋn spectrometria de absorbție în UV-VIS 15. Caracterizați pe scurt colorimetria/fotometria / spectrofotometria. 16. Pe ce se bazează o determinare calitativă in spectroscopia UV VIS? 17. Pe ce se bazează o determinare cantitativă in spectroscopia UV VIS? 18. Cum se realizează curba de etalonare ȋn spectroscopia UV VIS? 19. Care sunt metodele utilizateȋn spectroscopia UV VIS pentru a se determina concentrația probei necunoscute? 63

64 20. Cum se calculează concentrația probei necunoscute prin metoda comparației cu un etalon de concentrație cunoscută (interpolare)/ metoda factorului de panta/ utilizand ecuatia curbei de etalonare? 21. Care sunt tehnicile de lucru ale spectroscopiei atomice? 22. Pe ce fenomen fizic se bazează spectroscopia atomică? 23. Care este principiul de funcționare al spectroscopiei atomice? 24. Ce se determină (dpdv analitic) prin spectroscopie atomică? 25. Pe ce se bazează determinările calitativeȋn spectroscopia atomică? 26. Pe ce se bazează determinările cantitativeȋn spectroscopia atomică? 27. Dati cel putin trei ex de aplicatii ale metodelor optice in domeniul alimentar 64