ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Κ. ΖΟΥΜΠΟΣ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΑ ΜΥΕΛΟΔΥΣΠΛΑΣΤΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ ΜΕ ΜΑΚΡΑΣ ΔΙΑΡΚΕΙΑΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ. ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ Χ. ΚΟΥΡΑΚΛΗ ΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΙΑΤΡΟΣ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΟΣ ΕΠΙΜΕΛΗΤΡΙΑ Α ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2007

2 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Αντί προλόγου 7 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Φυσιολογική αιμοποίηση Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα Ιεραρχική οργάνωση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων Αιμοποιητικοί αυξητικοί παράγοντες-κυτταροκίνες Stem-cell Factor Ιντερλευκίνη Ιντερλευκίνη Αυξητικός παράγων κοκκιοκυττάρων μακροφάγων (GM-CSF) Αυξητικός παράγων κοκκιοκυττάρων (G-CSF) Ερυθροποιητίνη Άλλοι αιμοποιητικοί παράγοντες FLT3-Ligand Ιντερλευκίνη Θρομβοποιητίνη (c-mpl ligand) Αυξητικός παράγων μακροφάγων (M-CSF) Αυξητικός παράγων ηωσινοφίλων (Eo-CSF ή IL-5) Ιντερλευκίνη Τύπου ινσουλίνης αυξητικός παράγων-1 (IGF-1) Βιολογικοί τροποποιητές Ιντερφερόνη-α Αρασυτίνη (Κυτοσίνη-Αραβινοσίδη) Bιταμίνη D Μέθοδοι μελέτης της αιμοποίησης Μέθοδοι in vitro Αιμοποιητικές καλλιέργειες Γενικά Καλλιέργειες προγονικών κυττάρων βραχείας διάρκειας Ημίρρευστες καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων σύντομης διάρκειας Καλλιέργειες προγονικών κυττάρων μακράς διάρκειας Κλινικές εφαρμογές μακράς διάρκειας καλλιεργειών Κυτταρικές σειρές Μελέτες κλωνικότητας Κυτταρογενετική Τεχνικές μοριακής βιολογίας Κυτταρομετρία ροής Μελέτη της απόπτωσης Προσδιορισμός αιμοποιητικών κυτταροκινών και υποδοχέων τους Μέθοδοι in vivo Συστήματα ξενομοσχευμάτων Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα Εισαγωγή Διαγνωστικά κριτήρια Ταξινομήσεις κατά FAB και κατά WHO Επιδημιολογία Αιτιοπαθογένεια Γενετικοί παράγοντες Περιβαλλοντικοί παράγοντες Κατά στάδια ογκογένεση Χρωμοσωμικές και μοριακές ανωμαλίες (μοριακά βιολογικά χαρακτηριστικά) Απόπτωση στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα Κλινικές και αιματολογικές εκδηλώσεις Προγνωστικοί παράγοντες - προγνωστικά συστήματα Προγνωστική σημασία της in vitro ανάπτυξης των προγονικών κυττάρων Θεραπευτική στρατηγική Υποστηρικτική αγωγή Μεταγγίσεις-Αποσιδήρωση 47 3

4 5.8.2 Αιμοποιητικοί αυξητικοί παράγοντες Βιταμίνες και συνένζυμα Ανδρογόνα και αναβολικά στεροειδή Διαφοροποιητικοί παράγοντες Αντιαγγειογενετικοί παράγοντες Παράγοντες που τροποποιούν επιγενετικές μεταβολές Ανοσοκατασταλτική αγωγή Άλλα φάρμακα Χημειοθεραπεία Μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων 53 ΙΙ. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ: Αιμοποιητικές καλλιέργειες επί ασθενών με ΜΔΣ Εισαγωγή: Προϋπάρχουσα εμπειρία Δεδομένα από βραχείας διάρκειας καλλιέργειες ασθενών με ΜΔΣ Δεδομένα από μακράς διάρκειας καλλιέργειες μελέτη του στρώματος Σκοπός της διατριβής Ασθενείς που μελετήθηκαν και μέθοδοι Βραχείας διάρκειας καλλιέργειες Απομόνωση μονοπυρήνων κυττάρων περιφερικού αίματος Αποχωρισμός μονοπυρήνων κυττάρων μυελού Συνθήκες και αξιολόγηση της καλλιέργειας βραχείας διάρκειας Ασθενείς που μελετήθηκαν με καλλιέργειες βραχείας διάρκειας Ασθενείς με RARS που μελετήθηκαν με καλλιέργειες βραχείας διάρκειας Μακράς διάρκειας καλλιέργειες Μέθοδος μακράς διάρκειας καλλιεργειών Ασθενείς που μελετήθηκαν με μακράς διάρκειας καλλιέργειες Επίδραση παραγόντων και κυτταροκινών στις καλλιέργειες μακράς διάρκειας Μέθοδος μελέτης του στρώματος του μυελού Ασθενείς με ΜΔΣ στους οποίους μελετήθηκε το στρώμα του μυελού Αποτελέσματα Μακράς διάρκειας καλλιέργεια χωρίς προσθήκη τροποποιητού (control) Διάρκεια ζωής της μακράς διάρκειας καλλιέργειας Ποιότητα στρώματος με την πρόοδο της καλλιέργειας σε ασθενείς και μάρτυρες Παράγοντες που επηρέαζαν την ανάπτυξη του στρώματος σε ασθενείς και μάρτυρες Κυτταρική απόδοση των υπερκειμένων των καλλιεργειών Εβδομαδιαία κυτταρική απόδοση των καλλιεργειών Διακυμάνσεις της κυτταρικής απόδοσης στην πορεία της καλλιέργειας Συνολική κυτταρική απόδοση καλλιεργειών μακράς διάρκειας Παράγοντες που επηρέαζαν την κυτταρική απόδοση των καλλιεργειών Μορφολογία των παραγόμενων κυττάρων στις καλλιέργειες μακράς διάρκειας Ανάλυση αποτελεσμάτων ασθενών με ΜΔΣ αναλόγως της FAB ταξινόμησης Διάρκεια ζωής της καλλιέργειας αναλόγως της FAB ταξινόμησης Αξιολόγηση της ανάπτυξης του στρώματος αναλόγως της FAB ταξινόμησης Κυτταρική απόδοση υπερκειμένων αναλόγως της FAB ταξινόμησης Σύγκριση της κυτταρικής απόδοσης των υπερκειμένων στις 5 ομάδες κατά FAB Ανάλυση των αποτελεσμάτων αναλόγως της ηλικίας Ανάλυση των αποτελεσμάτων αναλόγως του ποσοστού βλαστών μυελού Ανάλυση των αποτελεσμάτων αναλόγως της κυτταροβρίθειας του μυελού Ανάλυση των αποτελεσμάτων αναλόγως των καρυοτυπικών ανωμαλιών Ανάλυση αποτελεσμάτων αναλόγως της διάρκειας της δυσπλαστικής φάσης Ανάλυση των αποτελεσμάτων αναλόγως της εξέλιξης προς οξεία λευχαιμία Ανάλυση των αποτελεσμάτων αναλόγως της συνολικής επιβίωσης Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη χαμηλής συγκέντρωσης IFN-α Συνολική αποτίμηση αποτελεσμάτων Ανάλυση της επίδρασης χαμηλής συγκέντρωσης IFNα στις καλλιέργειες μακράς διάρκειας, αναλόγως της FAB ταξινόμησης 110 4

5 8.2.3 Ο ρόλος της ηλικίας στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη χαμηλής συγκέντρωσης IFN-α Η σημασία του ποσοστού των βλαστών μυελού στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη χαμηλής συγκέντρωσης IFNα Η σημασία της κυτταροβρίθειας του μυελού και των καρυοτυπικών ανωμαλιών στην συμπεριφορά των καλλιεργειών με την προσθήκη χαμηλής συγκέντρωσης IFNα Η σημασία της διάρκειας της δυσπλαστικής φάσης στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη χαμηλής συγκέντρωσης IFN-α Ανάλυση της επίδρασης χαμηλής συγκέντρωσης IFN-α στις καλλιέργειες αναλόγως της εξέλιξης προς λευχαιμία και της συνολικής επιβίωσης των ασθενών Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη υψηλής συγκέντρωσης IFN-α Συνολική αποτίμηση αποτελεσμάτων των καλλιεργειών Επίδραση IFNα 500 IU/ml στις καλλιέργειες, αναλόγως της FAB ταξινόμησης Ανάλυση της επίδρασης της υψηλής συγκέντρωσης IFN-α στις καλλιέργειες μακράς διάρκειας, αναλόγως άλλων χαρακτηριστικών των ασθενών Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη αρασυτίνης Συνολική αποτίμηση αποτελεσμάτων των καλλιεργειών Ανάλυση της επίδρασης αρασυτίνης στις καλλιέργειες αναλόγως της FAB ταξινόμησης Ανάλυση της επίδρασης της αρασυτίνης στις καλλιέργειες μακράς διάρκειας αναλόγως άλλων χαρακτηριστικών των ασθενών Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη συνδυασμού IFN-α και αρασυτίνης Συνολική αποτίμηση αποτελεσμάτων των καλλιεργειών Ανάλυση της επίδρασης του συνδυασμού αρασυτίνης-ιfn-α στις καλλιέργειες μακράς διάρκειας, αναλόγως της FAB ταξινόμησης Ανάλυση της επίδρασης του συνδυασμού ΙFNα και αρασυτίνης στις καλλιέργειες, αναλόγως άλλων χαρακτηριστικών των ασθενών Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη βιταμίνης D Συνολική αποτίμηση των αποτελεσμάτων Ανάλυση της επίδρασης της βιταμίνης D 3 αναλόγως της FAB ταξινόμησης Ανάλυση της επίδρασης της βιταμίνης D 3 αναλόγως άλλων χαρακτηριστικών Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη Ιντερλευκίνης-3 (IL-3) Συνολική αποτίμηση των αποτελεσμάτων Ανάλυση της επίδρασης της IL-3 αναλόγως της FAB ταξινόμησης Ο ρόλος της ηλικίας στην συμπεριφορά των καλλιεργειών με την προσθήκη IL Η σημασία του ποσοστού βλαστών του μυελού στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη IL Η σημασία της κυτταροβρίθειας του μυελού στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη IL Η σημασία του καρυοτύπου στην συμπεριφορά των καλλιεργειών με την προσθήκη IL Η σημασία της διάρκειας της δυσπλαστικής φάσης στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη IL Ανάλυση της επίδρασης IL-3 στις καλλιέργειες αναλόγως της εξέλιξης προς λευχαιμία Επίδραση της IL-3 στις καλλιέργειες αναλόγως της συνολικής επιβίωσης των ασθενών Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη ιντερλευκίνης-6 (IL-6) Συνολική αποτίμηση αποτελεσμάτων Ανάλυση της επίδρασης της IL-6 αναλόγως της FAB ταξινόμησης Ο ρόλος της ηλικίας στην συμπεριφορά των καλλιεργειών με την προσθήκη IL Η σημασία του ποσοστού βλαστών του μυελού στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη IL Η σημασία της κυτταροβρίθειας του μυελού στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη IL Η σημασία του καρυοτύπου στην συμπεριφορά των καλλιεργειών με προσθήκη IL Η σημασία της διάρκειας της δυσπλαστικής φάσης στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη IL Ανάλυση της επίδρασης IL-6 στις καλλιέργειες αναλόγως της εξέλιξης 5

6 προς λευχαιμία και της συνολικής επιβίωσης των ασθενών Μακράς διάρκειας καλλιέργεια με προσθήκη συνδυασμού IL-3 και IL Συνολική αποτίμηση αποτελεσμάτων Ανάλυση της επίδρασης του συνδυασμού IL-3 + IL-6 αναλόγως της FAB ταξινόμησης Ο ρόλος της ηλικίας στην συμπεριφορά των καλλιεργειών με την προσθήκη IL-3+ IL Η σημασία του ποσοστού βλαστών του μυελού στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη συνδυασμού IL-3+IL Η σημασία της κυτταροβρίθειας του μυελού στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη του συνδυασμού IL-3+IL Η σημασία του καρυοτύπου στην συμπεριφορά των καλλιεργειών με την προσθήκη του συνδυασμού IL-3+IL Η σημασία της διάρκειας της δυσπλαστικής φάσης στην συμπεριφορά των καλλιεργειών μακράς διάρκειας με την προσθήκη του συνδυασμού IL-3+IL Ανάλυση της επίδρασης του συνδυασμού IL-3+IL-6 στις καλλιέργειες, αναλόγως της εξέλιξης προς λευχαιμία και της συνολικής επιβίωσης των ασθενών Αποτελέσματα βραχείας διάρκειας καλλιεργειών Συνολική αποτίμηση των αποτελεσμάτων Αποτελέσματα βραχείας διάρκειας καλλιεργειών ασθενών με RARS In vitro απάντηση των κλωνογόνων προγονικών κυττάρων του μυελού Απόπτωση και in vitro ανάπτυξη αποικιών In vivo ανταπόκριση στη θεραπεία Κλινική πορεία και εξέλιξη των ασθενών με RARS Γονιδιακή έκφραση κυτταροκινών στα κύτταρα του στρώματος ασθενών με ΜΔΣ Συζήτηση Εισαγωγή στην συζήτηση Βραχείας διάρκειας καλλιέργειες Μακράς διάρκειας καλλιέργειες Στρώμα του μυελού Αξιολόγηση των παραμέτρων των καλλιεργειών Επίδραση παραγόντων και κυτταροκινών στις καλλιέργειες Ιντερφερόνη-α Αρασυτίνη Βιταμίνη D Ιντερλευκίνη Ιντερλευκίνη-6 και συνδυασμός IL-3 και IL Συμπεράσματα Περίληψη Summary Βιβλιογραφία Παρουσίαση των αποτελεσμάτων της διατριβής 219 6

7 ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ... Θα ήθελα να εκφράσω όλες μου τις ευχαριστίες στον καθηγητή μου κ. Νικόλαο Ζούμπο για την ανάθεση αυτής της διδακτορικής διατριβής, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και την καθοδήγησή του κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων και την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. Επίσης τον ευχαριστώ θερμά για την υπομονή και κατανόηση που έδειξε για τις προσωπικές μου δυσκολίες, που εμπόδισαν τη συνέπειά μου στο χρόνο της συγγραφής της. Θα θυμάμαι πάντα με ιδιαίτερη συγκίνηση τη χαρά μου όταν μυήθηκα στις κυτταροκαλλιέργειες και είχα τα πρώτα επιτυχή αποτελέσματα. Σε μια εποχή που στην Ελλάδα δεν είχε αναπτυχθεί σε άλλο εργαστήριο η μέθοδος των μακράς διάρκειας καλλιεργειών, με περιέβαλε με την εμπιστοσύνη του και μου μετέδωσε το πάθος του για το σωστό, το ακριβές και την μαγεία της έρευνας. Φυσικά είχε προηγηθεί η επίδρασή του πάνω μου όσον αφορά την πραγματική έννοια της Ιπποκράτειας Ιατρικής, της ειλικρινούς αγάπης για τον Άρρωστο και της ανάγκης ύπαρξης σωστής επιστημονικής ενημέρωσης και σκέψης, πάντα επ ωφελεία του αρρώστου. Όλα όσα μου μεταλαμπάδευσε είναι για μένα πολύτιμη παρακαταθήκη ζωής. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον καθηγητή μου κ. Νικόλαο Μπεράτη, μέλος της τριμελούς επιτροπής, για την εκτίμηση που μου έδειξε, τόσο κατά τη διάρκεια της μαθήτευσής μου κοντά του κατά τα χρόνια της ειδικότητας της Παιδιατρικής, όσο και μετά, κατά το διάστημα της ενασχόλησής μου με την Αιματολογία. Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στον καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Τσαταλά, που όλα αυτά τα χρόνια της διεξαγωγής των πειραμάτων αρχικά και της συγγραφής στη συνέχεια, με ενθάρρυνε και με παρότρυνε να συνεχίσω, με τον ιδιαίτερο τρόπο που διαθέτει να εκφράζει το ειλικρινές ενδιαφέρον του. Οι επί της ουσίας της διατριβής παρατηρήσεις του ήταν πάντοτε πολύτιμες. Θερμά ευχαριστώ τα μέλη της επταμελούς επιτροπής: Την καθηγήτριά μου κ. Παναγιώτα Ματσουκά, που δεν κουράστηκε να με βοηθά ψυχολογικά να ξεπερνάω τις δυσκολίες της εξεύρεσης χρόνου κατά τη συγγραφή, να με παροτρύνει να συνεχίσω και με το δικό της μοναδικό τρόπο να με κάνει να νιώθω ικανή, όταν οι αντικειμενικές δυσκολίες με έκαναν να λυγίζω. Την επίκουρη καθηγήτρια κ. Μαρίνα Καρακάντζα ευχαριστώ όχι μόνο για την ουσιαστική κριτική των αποτελεσμάτων, αλλά και για την ειλικρινή φιλία που μας συνδέει, που της υπαγόρευε να με ενθαρρύνει για την ολοκλήρωση της διαδικασίας. Τον καθηγητή κ. Ανδρέα Αντωνόπουλο, την καθηγήτρια κ. Αγλαΐα Αθανασιάδου και την επίκουρη καθηγήτρια κ.αδαμαντία Παπαχατζοπούλου θερμά ευχαριστώ για την πρόθυμη συμμετοχή τους στην επταμελή επιτροπή και την καλοπροαίρετη κριτική τους. Η διατριβή αυτή δεν θα είχε τις προοπτικές να αρχίσει αν δεν υπήρχε η υποστήριξη στο εργαστήριο κυτταροκαλλιεργειών του τμήματός μας από την βιολόγο κ. Νανά Λάφη, που μαζί μου, στα πρώτα μου βήματα στο εργαστήριο, έθεσε τις βάσεις της μεθόδου. Το μέρος της μελέτης του στρώματος ολοκληρώθηκε με τον έλεγχο της έκφρασης κυτταροκινών με PCR με τη βοήθεια του βιολόγου κ. Βασίλη Ορφανού. Θερμές ευχαριστίες και στους δυό τους. Θεωρώ ότι τα οφέλη που αποκομίζει κανείς από την εκπόνηση μιας διδακτορικής διατριβής σαφώς εξατομικεύονται. Για μένα, το μεγαλύτερο κέρδος που βίωσα για το μακρό χρονικό διάστημα που απαιτήθηκε για τη διεξαγωγή του πειραματικού μέρους και η ανάμνησή του πάντα μου φέρνει μια γλυκιά αίσθηση, ήταν η ικανοποίηση της εδραίωσης της μεθοδολογίας στο εργαστήριό μας και το καταπληκτικό κλίμα που έζησα με τη συνεισφορά των βιολόγων μας Ελένης Θανοπούλου, Φένιας Τσόπλου και Ζωζώς Χαλβατζή. Η Ελένη και η Φένια με βοήθησαν ουσιαστικά και στο πειραματικό μέρος αναλαμβάνοντας κάποιες φορές την επανατροφοδότηση των καλλιεργειών, όταν οι κλινικές μου υποχρεώσεις έθεταν σε κίνδυνο τη ζωή τους, ενώ αξιολόγησαν και αρκετά αποτελέσματα καλλιεργειών βραχείας διάρκειας. Η Φένια επίσης ανέλαβε πλήρως την μελέτη της απόπτωσης. Τα ήθος και των τριών, η αγάπη τους για το εργαστήριο, οι γνώσεις τους και η θετική τους στάση αποτελούν για μένα πρότυπα. Την βιολόγο μας Αναστασία Γαλάνη ευχαριστώ πολύ για την συμμετοχή της στις καλλιέργειες βραχείας διάρκειας. 7

8 Ευχαριστώ όλους τους συναδέλφους στο Αιματολογικό Τμήμα για την πολύτιμη ενασχόλησή τους με τους ασθενείς, την Μαρία Τηνιακού, τον Παναγιώτη Κατέβα, τον Παναγιώτη Ζήκο, την Ανθή Ακτύπη, τον Σωτήρη Παγώνη, τον Κώστα Λεμπεσόπουλο, την Μπέττυ Γρουζή, την Ουρανία Σεϊμένη, την Εύη Τριανταφύλλου, την Ελένη Φραγκοπανάγου, τον Νίκο Γιαννακούλα, την Ευαγγελία Τζουβάρα, τον Αλέξανδρο Σπυριδωνίδη, την Ματίνα Κούγελου και όλους τους ειδικευόμενους, που όχι μόνο με τη φροντίδα των ασθενών αλλά και με την τήρηση στοιχείων στους φακέλους τους με βοήθησαν στην κλινική συσχέτιση των ευρημάτων μου. Όλους τους θυμάμαι με ιδιαίτερη εκτίμηση και αγάπη. Στην αγαπημένη γραμματέα μας και προσωπική μου φίλη Έλλη Σκλίβα όλες μου τις ευχαριστίες για την πολύτιμη παρουσία της στο τμήμα μας και για όση βοήθεια μου προσέφερε, με το γνωστό χαμόγελο και τη μοναδική προθυμία και αποτελεσματικότητά της. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στο σύζυγό μου Αργύρη Συμεωνίδη, όχι μόνο για τη γόνιμη συμβολή του κατά το πειραματικό στάδιο διεξαγωγής της διατριβής, αλλά και για την ανεκτίμητη βοήθεια που μου προσέφερε στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και στην κριτική ανασκόπηση του όλου κειμένου. Υπήρξε πάντα ο πιό αυστηρός και συνάμα ο πιό τρυφερός κριτής μου... Είναι βέβαιο ότι χωρίς την αγάπη, την κατανόηση και τη βοήθειά του δεν θα είχα φτάσει ποτέ στο τελικό αποτέλεσμα. 8

9 I. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Φυσιολογική αιμοποίηση Η οργάνωση και λειτουργία του αιμοποιητικού συστήματος αποτελεί θελκτικό πεδίο έρευνας, κατά τις τελευταίες δεκαετίες. Το θέμα αυτό είχε και παλιότερα κεντρίσει το ενδιαφέρον των ερευνητών και διάφορες θεωρίες είχαν διατυπωθεί για να ερμηνεύσουν πώς εξασφαλίζεται η συνεχής παραγωγή ωρίμων αιμοποιητικών κυττάρων, καθ όλη την διάρκεια ζωής ενός ατόμου. Άλμα όμως για την κατανόηση των μηχανισμών αυτών, προσέφεραν οι κυτταροκαλλιέργειες σε διάφορα υλικά, οι οποίες παρέχουν ένα in vitro μοντέλο αιμοποίησης (Bradley TL et al 1966, Pike B et al 1970, Dexter TM et al 1977). Η μελέτη του μοντέλου αυτού βοήθησε στην διατύπωση πιό εμπεριστατωμένων θεωριών για την αιμοποίηση. Από τα διάφορα θεωρητικά μοντέλα που προτάθηκαν, oρισμένα δεν επιβεβαιώθηκαν και ατόνησαν ενώ άλλα ενισχύθηκαν από τα πειραματικά δεδομένα και επικράτησαν. Τα δύο επικρατέστερα θεωρητικά μοντέλα σήμερα είναι: 1. Το στοχαστικό μοντέλο, το οποίο στηρίζεται στην υπόθεση ότι η δέσμευση (commitment) και η διαφοροποίηση των αρχέγονων πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων (stem cells) είναι τυχαία, υπάρχει δηλαδή μία σταθερή πιθανότητα για κάθε κύτταρο, σε κάθε διαίρεσή του, να δεσμευθεί προς συγκεκριμένη διαφοροποιητική διαδικασία, (Till JE et al 1964) και, 2. Το μοντέλο του μικροπεριβάλλοντος, που βασίζεται στην υπόθεση ότι η δέσμευση των stem cells προς συγκεκριμένο απόγονο επάγεται από το μικροπεριβάλλον, μέσα στο οποίο αυτό αναπτύσσεται. Αυτή η δεύτερη θεωρία, που κερδίζει συνεχώς έδαφος, υποστηρίχθηκε βασικά από πειραματικά δεδομένα καλλιεργειών μακράς διάρκειας, όπως αυτές διαμορφώθηκαν από τους Dexter και συν. (Dexter TM et al 1987) με την βελτίωση της αρχικής μεθόδου των Gartner και Kaplan (Gartner S, Kaplan H 1980). Στις καλλιέργειες αυτές, το στρώμα που αναπτύσσεται in vitro, από προσκολλημένα στον πυθμένα του δοχείου κύτταρα, υποστηρίζει την αιμοποίηση για μεγάλα χρονικά διαστήματα, παίζοντας τον ρόλο του ειδικού επαγωγικού μικροπεριβάλλοντος. Σήμερα γίνεται γενικά παραδεκτό ότι πολύ σημαντικοί και απαραίτητοι για την ρύθμιση της αιμοποίησης παράγοντες, προέρχονται από τα μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των ο- στών. Η λειτουργία της αιμοποίησης εξασφαλίζεται με την αλληλεπίδραση των στελεχιαίων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού με τα κύτταρα του στρώματος, μέσω πολύπλοκων διαδικασιών, που δεν έχουν ακόμα πλήρως διευκρινισθεί in vivo (Dexter TM 1982). Ένα άλλο σημείο, που έχει τύχει γενικής παραδοχής, είναι το σχηματικό διάγραμμα της οργάνωσης του αιμοποιητικού συστήματος, που ξεκινά από το ολοδύναμο στελεχιαίο προγονικό αιμοποιητικό κύτταρο και διακλαδίζεται στο πολυδύναμο μυελικό στελεχιαίο και το πολυδύναμο λεμφικό στελεχιαίο. Αυτά ακολούθως δίνουν γένεση σε ωριμότερες βαθμίδες δεσμευμένων προς μία σειρά (committed stem-cells) κυττάρων (Humphries RK et al 1981). Από τα τελευταία αυτά δεσμευμένα αιμοποιητικά κύτταρα θα προέλθουν, με περαιτέρω ωρίμανση, οι άωρες βαθμίδες κυττάρων της κάθε σειράς, που θα δημιουργήσουν τους τελικά διαφοροποιημένους απογόνους τους, δηλαδή τα ώριμα κύτταρα που κυκλοφορούν στο περιφερικό αίμα. Άγνωστος παραμένει ο αριθμός των κυτταρικών διαιρέσεων που απαιτείται για την μετάβαση από το ένα «διαμέρισμα» διαφοροποίησης στο επόμενο. Αυτό που γνωρίζουμε με βεβαιότητα είναι ότι η ωρίμανση βαίνει εις βάρος της αυτοαναπαραγωγικής ικανότητος κάθε κυττάρου, με πλήρη απώλεια της τελευταίας κατά το τελικό στάδιο διαφοροποίησης. Είναι ενδιαφέρον, ότι πολλά από τα αρχικά ερωτήματα του Osgood το 1964, όταν μελετούσε την κινητική και λειτουργία των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων, παραμένουν ακόμα αναπάντητα, ωστόσο πολλά επίσης έχουν απαντηθεί και έχουν εδραιώσει την κατανόηση των διαδικασιών της φυσιολογικής και της παθολογικής αιμοποίησης, των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων, της διακυτταρικής επικοινωνίας και των διαβιβαστών της και των σχέσεων μεταξύ των κυρίως αιμοποιητικών κυττάρων και των επικουρικών για την αιμοποίηση κυττάρων που αποτελούν το στρώμα του μυελού (Bodine DM et al, 1991). 9

10 1.1 Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα Η ορολογία των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων δημιουργεί προβλήματα κατά την μετάφραση από την αγγλική στην ελληνική γλώσσα. Ο όρος stem cell έχει αποδοθεί ποικιλοτρόπως, ως στελεχιαίο, μητρικό, αρχέγονο κύτταρο κλπ. Εδώ θα χρησιμοποιηθεί ο όρος αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο για τα κύτταρα που πληρούν τις εξής βασικές προϋποθέσεις: 1) έχουν ικανότητα αυτοαναπαραγωγής, ώστε ο αριθμός τους να παραμένει σταθερός εφ όρου ζωής, 2) έχουν εκτεταμένη δυνατότητα παραγωγής ωριμότερων απογόνων, που με τη σειρά τους θα διαφοροποιηθούν προς τα κυκλοφορούντα στο περιφερικό αίμα έμμορφα στοιχεία και 3) χαρακτηρίζονται από την ιδιότητα της πολυδυναμίας, δηλαδή την ικανότητα παραγωγής απογόνων όλων των κυτταρικών σειρών. Με άλλα λόγια, είναι τα κύτταρα που μπορούν να συντηρήσουν την αιμοποίηση εφ όρου ζωής. Τα αναφερόμενα ως progenitor cells, που στα ελληνικά αποδίδονται ως προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, είναι απόγονοι των αρχέγονων, και μολονότι εμφανίζουν σημαντική ικανότητα διαφοροποίησης προς περισσότερες από μια κυτταρικές σειρές (πολυδύναμα προγονικά κύτταρα pluripotent progenitor cells), στερούνται της ικανότητος αυτοαναπαραγωγής, δηλαδή δεν μπορούν να συντηρήσουν την αιμοποίηση ενός οργανισμού εφ όρου ζωής. Απόγονοι των παραπάνω είναι τα committed progenitor cells ή μονοδύναμα κύτταρα, τα οποία δεν έχουν την δυνατότητα διαφοροποίησης προς περισσότερες από μια κυτταρικές σειρές (Humphries RK et al 1981, Coulombel L et al 1983). 1.2 Ιεραρχική οργάνωση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων Η εικόνα 1 δείχνει σχηματικά την ιεραρχική οργάνωση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων, όπως προκύπτει από τις διαθέσιμες σήμερα μεθόδους ανίχνευσής τους. Τo πιο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο μπορεί να δώσει απογόνους που να ανήκουν τόσο στη μυελική, όσο και στη λεμφική σειρά και είναι σε θέση να συντηρεί για μακρό χρονικό διάστημα την παραγωγή κυττάρων όλων των αιμοποιητικών σειρών. Πειραματικά δεδομένα από ποντίκια, ιδιαίτερα με την χρήση τεχνικών γενετικής σήμανσης σε συνδυασμό με μεθόδους μεταμόσχευσης μυελού, έ- χουν αποδείξει την ύπαρξη πολύ αρχέγονων και εξαιρετικά πολυδύναμων (totipotent) λεμφομυελοποιητικών κυττάρων. Η παρουσία παρόμοιων κυττάρων στον άνθρωπο έχει υποστηριχθεί κατά κύριο λόγο από την συμμετοχή πολλαπλών αιμοποιητικών σειρών στον κακοήθη κλώνο διαφόρων αιμοποιητικών νεοπλασιών, με χαρακτηριστικό παράδειγμα τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία. Σύμφωνα με πιό πρόσφατα πειραματικά δεδομένα απομονώθηκε ένα μόνο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο από αίμα ομφαλίου λώρου και αποδείχθηκε ότι αυτό μπορεί να δώσει απογόνους προς όλες τις κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένης και της λεμφικής (Sutherland et al 1989). Φαίνεται ότι ακόμη και μεταξύ των πιo αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, με εξαιρετικά αυξημένη ικανότητα αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης, ικανή να διατηρήσει στην ζωή πειραματόζωα μετά από θανατηφόρο ακτινοβολία, υπάρχει κάποιου είδους ιεραρχική οργάνωση. Τα δεδομένα που αποδεικνύουν την ύπαρξη αυτής της ιεραρχίας προέρχονται πάλι από ποντίκια, στα οποία διαπιστώθηκαν διαφορετικές ικανότητες των προγονικών κυττάρων στην ταχύτητα παραγωγής ώριμων απογόνων και στην διάρκεια διατήρησης αυτής της ικανότητος. Ο αριθμός των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων διατηρείται σταθερός, μέσω της α- σύμμετρης διαίρεσης, δηλαδή μιας διαίρεσης κατά την οποία παράγεται ένα κύτταρο με πανομοιότυπες ιδιότητες με το προγονικό του και ένα δεύτερο που είναι κατά τι ωριμότερο. Η απώλεια της πολυδυναμίας είναι μια βαθμιαία διεργασία, δηλαδή δεν γίνεται μέσα σε ένα μόνο βήμα διαφοροποίησης, ούτε είναι απόλυτα γνωστό σε ποιό ακριβώς στάδιο γίνεται. Η δεξαμενή των stem cells είναι μικρή, συνολικά 1-2 x 10 6 κύτταρα, το 95% των οποίων βρίσκονται σε ηρεμία, δηλαδή σε φάση G 0 του κυτταρικού κύκλου. Από τα υπόλοιπα 5% που ευρίσκονται σε κύκλο, παράγονται σε καθημερινή βάση περισσότερα από κύτταρα αίματος. 10

11 Εικόνα 1. Διάγραμμα ιεραρχικής οργάνωσης της φυσιολογικής αιμοποίησης Ένα μεγάλο ερώτημα που τίθεται είναι, πώς λαμβάνεται η απόφαση για την κατεύθυνση που θα πάρει ένα πολυδύναμο αιμοποιητικό κύτταρο, δηλαδή προς ποιά κυτταρική σειρά θα εξελιχθεί, ή με άλλα λόγια πώς αποφασίζεται το λεγόμενο commitment ή δέσμευση. Είναι ένα τυχαίο ή προκαθορισμένο γεγονός; Θα μπορούσε να υποστηριχθεί ότι είναι ένα τυχαίο γεγονός, α- φού θυγατρικά κύτταρα ενός προγονικού κυττάρου μπορούν να δώσουν απογόνους που ανήκουν σε οποιαδήποτε αιμοποιητική σειρά. Η ανακάλυψη όμως των αυξητικών αιμοποιητικών παραγόντων και τα in vitro δεδομένα που συσσωρεύτηκαν, κλόνισαν αυτήν την άποψη, ώστε η επικρατούσα σήμερα θεωρία είναι ότι πρόκειται για συνδυασμό τυχαίων και προκαθορισμένων γεγονότων. Οι αιμοποιητικοί παράγοντες δρουν ως τροφικοί παράγοντες για τα αρχέγονα κύτταρα, η παρουσία τους δηλαδή είναι απαραίτητη για την επιβίωση αυτών των κυττάρων (Metcalf D 1984). Τα αρχέγονα κύτταρα, διαφοροποιούμενα βάσει του ενδογενούς γενετικού τους προγράμματος, αναπτύσσουν επιφανειακούς υποδοχείς για τους διάφορους αυξητικούς παράγοντες. Ανάλογα με το είδος των αιμοποιητικών παραγόντων, που υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του μυελού καθορίζεται προς ποιά κυτταρική σειρά θα διαφοροποιηθούν τα αρχέγονα κύτταρα (π.χ. έκφραση υποδοχέα ερυθροποιητίνης + ερυθροποιητίνη στο μικροπεριβάλλον => διαφοροποίηση προς ερυθροκύτταρο). Εάν ο αντίστοιχος αυξητικός παράγων δεν ευρίσκεται στο περιβάλλον κατά την στιγμή της έκφρασης του υποδοχέα, το κύτταρο θα πεθάνει με τον μηχανισμό της απόπτωσης. Πρόκειται επομένως για ένα γεγονός, το οποίο ενέχει μεν το στοιχείο του τυχαίου σε ότι αφορά ποιό κύτταρο (με ποιό υποδοχέα) θα βρεθεί κάποια στιγμή στο αιμοποιητικό περιβάλλον, από την άλλη πλευρά όμως κατά κύριο λόγο προκαθορίζεται, επειδή η παρουσία των αυξητικών παραγόντων αντανακλά τις συγκεκριμένες κατά την φάση εκείνη ανάγκες του οργανισμού σε έμμορφα στοιχεία του αίματος (Moore M 1991). Οι αυξητικοί παράγοντες προέρχονται κυρίως από τα κύτταρα του στρώματος του μυελού, που συντελούν έτσι τόσο στην επιβίωση, όσο και στην διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων (Shadduck R et al 1983). Οι κυριότεροι παράγοντες, των οποίων έχει αναγνωριστεί ο ρόλος ευοδωτικός ή ανασταλτικός στην αιμοποίηση, αναφέρο- 11

12 Πίνακας 1. Αυξητικοί παράγοντες που δρουν στα αιμοποιητικά κύτταρα Αυξητικοί παράγοντες που δρουν στα αρχέγονα κύτταρα Stem cell factor (SCF)/c-kit ligand Flt-3 ligand Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Ιντερλευκίνη-9 (IL-9) Ανασταλτικός παράγων της λευχαιμίας (LIF) Ιντερλευκίνη-11 (IL-11) Αυξητικοί παράγοντες που δρουν στα πολυδύναμα κύτταρα Ιντερλευκίνη-3 (IL-3) Αυξητικός παράγων κοκκιοκυττάρων μακροφάγων (GM-CSF) Αυξητικοί παράγοντες που δρουν στα μονοδύναμα κύτταρα Ερυθροποιητίνη (Epo) Θρομβοποιητίνη (Tpo) Αυξητικός παράγων κοκκιοκυττάρων (G-CSF) Αυξητικός παράγων μαστοκυττάρων (M-CSF) Ιντερλευκίνη-5 (IL-5) Ανασταλτικοί της αιμοποίησης παράγοντες Τροποποιητικός αυξητικός παράγων-β (TGF-β) Μονοκυτταρική ανασταλτική πρωτεϊνη -1 (MIP-1) Ιντερφερόνη-γ (IFNγ) Παράγων Νέκρωσης του Όγκου-α (TNFα) νται στον Πίνακα 1. Σε επόμενη ενότητα θα περιγραφούν συνοπτικά οι σημαντικότερες κυτταροκίνες / αυξητικοί αιμοποιητικοί παράγοντες, που εμπλέκονται στην φυσιολογική αιμοποίηση, και χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αυτής της διατριβής (Ogawa M et al, 1985 και 1989). 2. ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΙ ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ- ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ 2.1 Αυξητικός παράγοντας των πολυδύναμων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων (Stem cell factor, Mast cell growth factor, c-kit ligand) Ο Stem cell factor (SCF) ανακαλύφθηκε αρχικά στα ποντίκια, ενώ στον άνθρωπο προσδιορίσθηκε και κλωνοποιήθηκε το Το γονίδιό του εδράζεται στο χρωμόσωμα 12q22-24 και κωδικοποιεί 2 πρωτεΐνες με ισοδύναμη δράση, που συμμετέχουν σε αναλογία 3:1, με το μεγαλύτερο μόριο να υπερέχει και σχηματίζουν τελικά γλυκοπρωτεΐνη ΜΒ kda. Ο υποδοχέας του SCF (CD117, c-kit) με ΜΒ 145 kda, ανήκει στην υπεροικογένεια τυροσινικής κινάσης τύπου-1 και το γονίδιό του εδράζεται στο χρωμόσωμα 4q Με την πρόσδεση του SCF το σύμπλεγμα ομοδιμερίζεται, αυτοφωσφορυλιώνεται και αναπτύσσει δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης στο κυτταροπλασματικό τμήμα. Σε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και ποντικού και σε φυσιολογικά προγονικά κύτταρα, η σύνδεση του SCF με τον υποδοχέα του, μεταδίδουν μήνυμα κυρίως μέσω των οδών Jak2 και SΤΑΤ1-SH2. Άλλα ενδοκυττάρια μονοπάτια που ενεργοποιούνται, εμπλέκουν την κινάση Tec του πρωτοογκογονιδίου src και την φωσφορυλίωση της Lyn κινάσης, η δράση 12

13 της οποίας είναι πολύ σημαντική για τον πολλαπλασιασμό των αιμοποιητικών κυττάρων. Eπίσης ενεργοποιείται η κινάση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3 (PI3-K), η οποία φωσφορυλιώνει σερίνες και θρεονίνες και είναι απαραίτητη για την διαίρεση και επιβίωση του κυττάρου. Η επαγωγή κυτταρικού πολλαπλασιασμού γίνεται και μέσω συνέργειας με άλλους υποδοχείς κυτταροκινών, όπως με τον υποδοχέα της ερυθροποιητίνης (Ashman LK 1999). Βιολογική δράση στον αιμοποιητικό ιστό Έκφραση του υποδοχέα c-kit έχει βρεθεί σε κύτταρα στρώματος μυελού, ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες και διάφορες λευχαιμικές σειρές. Δεν έχει βρεθεί κυτταροκίνη που να επάγει την έκφρασή του, ενώ ο TGFβ και η IL-4 την αναστέλλουν. Ο SCF λειτουργεί ως παράγων κυτταρικής επιβίωσης, αναστέλλοντας την p53-εξαρτώμενη απόπτωση, όχι όμως και την p53- προκαλούμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1/S. Στα πολυδύναμα προγονικά κύτταρα ο SCF ευοδώνει τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση και μιμείται την δράση του M-CSF. Στις καλλιέργειες εμφανίζει συνέργεια με τον GM-CSF, την IL-3 και τον υποδοχέα Flt3 στην προαγωγή της ανάπτυξης των πολυδύναμων και των δεσμευμένων προγονικών κυττάρων. Οι συνδυασμοί SCF+IL-3+G-CSF, SCF+IL6+IL-3 και SCF+IL-11 έχουν χρησιμοποιηθεί για ex vivo επέκταση (expansion) των αιμοποιητικών κυττάρων. Επίσης σε κλινικές μελέτες φάσης I/II ο συνδυασμός SCF+G-CSF ήταν 2-3 φορές πιό αποτελεσματικός για κινητοποίηση CD34 + κυττάρων, σε σύγκριση με τον G-CSF μόνο. Σε καλλιέργειες κυττάρων στρώματος μυελού έχει διαπιστωθεί ποικίλη έκφραση του SCF και του Flt3-ligand και σημαντικές βιολογικά ποσότητες εκκρίνονται από αυτά. Εν τούτοις, σε μακράς διάρκειας καλλιέργειες, παρ όλο που παράγεται διαλυτός SCF, δεν διαπιστώνεται σημαντική δραστηριότητα στο υπερκείμενο, μάλλον λόγω αποθήκευσής του στην εξωκυττάρια ουσία και μεταφοράς του στα στελεχιαία κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά επιβιώνουν και πολλαπλασιάζονται για ημέρες ή και εβδομάδες χωρίς να διαφοροποιούνται κάτω από αυτές τις συνθήκες, ενώ τα κύτταρα που δεν έχουν επαφή με την εξωκυττάρια ουσία, αποβιώνουν εντός λίγων ημερών. Η προσθήκη SCF σε καλλιέργειες μυελού ασθενών με συγγενή ή επίκτητα σύνδρομα ανεπάρκειας μυελού οδηγεί σε αύξηση των αποικιών (Deberry C et al 1997). Στα κλωνογονικά κύτταρα δρα συνεργικά με άλλες κυτταροκίνες, όπως η IL-3, ο GM-CSF, η Epo και η θρομβοποιητίνη και υποστηρίζει την ανάπτυξη BFU-E, CFU-GEMM και CFU-Mk. Η αυτοανανέωση των προγονικών κυττάρων της ερυθράς σειράς επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης του c-kit υποδοχέα και των υποδοχέων των στεροειδών ορμονών. Τα προγονικά κύτταρα που εκφράζουν μόνο c-kit αντιδρούν με μικρό αριθμό διαιρέσεων μετά επίδραση του SCF (Ashman LK 1999). Στα μαστοκύτταρα ο SCF δρα σαν χημειοτακτικός παράγων και ευοδώνει την αποκοκκίωσή τους, επιπλέον δε έχει διεγερτική και αντιαποπτωτική δράση συνεργικά με την IL-3, IL-4 και IL-10 (Timokhina I et al, 1998). Εξ άλλου, ο SCF ενισχύει την ανάπτυξη των δενδριτικών κυττάρων. Δρα όμως και σε άλλους ιστούς, όπως είναι ο νευρικός, όπου παράγεται και εκφράζεται ο υποδοχέας του κυρίως από τους νευρώνες. Στο αναπαραγωγικό σύστημα διεγείρει την σπερματογένεση, ενώ το σύστημα μεταγωγής μηνύματος SCF/c-kit εμπλέκεται στην δημιουργία των εξωηπατικών χοληφόρων (Kozlowski M et al 1998). 2.2 Ιντερλευκίνη-3 (IL-3) Η IL-3 είναι πολυδύναμος αυξητικός παράγων, από τους πρώτους που αναγνωρίσθηκαν. Το γονίδιο της εδράζεται στο μακρό σκέλος του χρωμοσώματος 5 (5q23-31) σε απόσταση 9 ΚΒ από το γονίδιο του GM-CSF και κοντά στα γονίδια και άλλων κυτταροκινών (M-CSF, IL-4, IL-5, IL-9) και στο γονίδιο του υποδοχέα του M-CSF. Παλαιότερες ονομασίες της είναι αυξητικός παράγων μαστοκυττάρων, συνεργιστικός παράγων, αιμοποιητίνη-2, BPA (Burst Promoting Activity) και Multi-CSF. Πρόκειται για γλυκοπρωτεΐνη Μ.Β kd, αποτελούμενη από πολυπε- 13

14 πτιδική άλυσο 133 αμινοξέων. Συντίθεται και εκκρίνεται από ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα, μετά από διέγερση με μιτογόνα, εστέρες φορβόλης και διάφορα αντιγόνα. Αν και τα γονίδια του GM-CSF και της IL-3 γειτνιάζουν, η παραγωγή τους ρυθμίζεται με διαφορετικό τρόπο (Garland J et al 1983). Ο GM-CSF παράγεται από κύτταρα στρώματος, ενώ η IL-3 όχι (Otsuka T et al 1988). Παρ ότι τα Τ-λεμφοκύτταρα μπορούν να ρυθμιστούν ώστε να παράγουν και IL-3 και GM-CSF, υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι οι δύο παράγοντες ρυθμίζονται ανεξάρτητα (Niemeyer CM et al 1989). Δρα μέσω σύνδεσης με ειδικό μεμβρανικό υποδοχέα. Ο υψηλής συγγένειας υποδοχέας της IL-3 είναι ετεροδιμερές που αποτελείται από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες, την α, που είναι ειδική (CDw123, ανθρώπινο χρωμόσωμα Χp22, Yp13.3) και την β, που είναι κοινή και για τους υποδοχείς της IL-5 και του GM-CSF (CDw131, ανθρώπινο χρωμόσωμα 22q12.2-q13.1). Η β άλυσος σχηματίζει υποδοχέα χαμηλής συγγένειας για την IL-3, όταν συνδυασθεί με την α άλυσο του υποδοχέα του GM-CSF ή της IL-5, ενώ μόνη της αδυνατεί να δράσει. Υποδοχείς IL-3 εκφράζονται στα προγονικά κύτταρα του μυελού, τα ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα, μεγακαρυοκύτταρα, μαστοκύτταρα και BFU-E. Η σύνδεση της IL-3 με τον υψηλής συγγένειας υποδοχέα της ακολουθείται από ταχεία φωσφορυλίωση των μορίων CrkL που συνδέεται με τους SΗc, SHP-2 και Cbl. Ο τελευταίος φωσφορυλιώνεται και έτσι επάγεται η σύνδεσή του με τον Grb-2, την PI3-κινάση και τον fyn. Η προαποπτωτική πρωτεΐνη BAD απενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης στα κύτταρα που διεγείρονται από IL-3. Η οδός JAK-STAT μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί, μετά από σύνδεση της IL-3 με τον υποδοχέα της (Chaturvedi P et al 1998). Η IL-3 είναι πολυδύναμος αιμοποιητικός παράγων, με σύνθετη δράση στον αιμοποιητικό ιστό. Δρα άμεσα στα πολυδύναμα προγονικά κύτταρα, μετά την έξοδό τους από την φάση G 0 και την είσοδο σε ενεργό φάση του κυτταρικού κύκλου, πριν την διαφοροποίησή τους προς καθορισμένη κατεύθυνση. Προάγει επίσης την διαφοροποίηση των CFU-GEMM προς CFU-GM και BFU-E, και των μεγακαρυοκυττάρων (CFU-Mk), βασεοφίλων (CFU-Bas), μαστοκυττάρων και ηωσινοφίλων (CFU-Eo). Στις δράσεις της αυτές συνεργάζεται με τον GM-CSF, τον SCF και την IL-4. Σε συνεργασία με την IL-2 προάγει τον πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων, ενώ επάγει την διαφοροποίηση των Β-λεμφοκυττάρων, που έχουν διεγερθεί με τον πολυκλωνικό ενεργοποιητή SAC, σε πλασματοκύτταρα. Τέλος in vitro, προάγει τον πολλαπλασιασμό λευχαιμικών κυττάρων μυελικής σειράς. Η δράση της επεκτείνεται ακόμη περισσότερο έμμεσα, μέσω επαγωγής της σύνθεσης άλλων κυτταροκινών, που ευοδώνουν τον πολλαπλασιασμό και την λειτουργικότητα ωριμότερων κυττάρων. Παράλληλα ενισχύει και την διαφοροποίηση των πολυδύναμων κυττάρων, παρεμποδίζοντας την ανάπτυξη CFCs από τα στελεχιαία προγονικά κύτταρα και αδυνατεί να διατηρήσει την ζωτικότητα των τελευταίων. Από πειράματα σε ποντίκια, μόνο τα κύτταρα στρώματος, που είναι γενετικά τροποποιημένα ώστε να παράγουν συνεχώς IL-3, μπορούν να υποστηρίξουν σταθερά την ανθρώπινη αιμοποίηση, σε αντίθεση με κύτταρα γενετικά τροποποιημένα για να παράγουν SCF ή IL-7 (Saeland S et al 1988, Kurata H et al 1995). Από τα παραπάνω προκύπτει ότι ο ρόλος της IL-3 στην αιμοποίηση είναι πλειότροπος, με άμεσες και έμμεσες δράσεις. Σε καλλιέργειες προγονικών κυττάρων μυελού επάγει τον σχηματισμό πολυδύναμων αποικιών, όμως η δράση της μεγιστοποιείται όταν συνδυαστεί και με άλλους αυξητικούς παράγοντες. Έτσι, έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι οι διάφορες δράσεις της IL-3 επί των ωριμότερων αιμοποιητικών κυττάρων, πιθανώς αντανακλούν την ικανότητά της να επάγει την έκφραση άλλων κυτταροκινών, που στην πραγματικότητα είναι αυτές που τελικά δρουν. Η ευόδωση της ανάπτυξης βασεοφίλων και μαστοκυττάρων in vitro εμφανίζεται σταθερά σε μακράς διάρκειας καλλιέργειες μυελού τρωκτικών, όχι όμως και ανθρώπων. Η χορήγηση IL-3 σε ποντίκια προκαλεί εκσεσημασμένη μαστοκυττάρωση εντέρου και σπληνός, εξ ού και η ονομασία mast-cell growth factor-1. Η παρουσία βοηθητικών κυττάρων, όπως των μακροφάγων που ανταποκρίνονται στην IL-3, εξηγεί αρκετές από τις έμμεσες δράσεις της. Ωστόσο σε knock-out ποντίκια για το γονίδιο της IL-3 δεν έχει διαπιστωθεί σοβαρή αιμοποιητική διαταραχή. Κλινικές εφαρμογές της κυτταροκίνης αυτής δεν έχουν καθοριστεί, γιατί δεν φαίνεται να παρέχει επιπρόσθετο όφελος σε σχέση με τους άλλους παράγοντες που ήδη χρησιμοποιούνται. Η 14

15 χρήση της δοκιμάστηκε επί μυελοδυσπλασίας, οξείας μυελογενούς λευχαιμίας, αναιμίας Blackfan-Diamond και απλαστικής αναιμίας, κυτταροπενιών της HIV-λοίμωξης και αιμοποιητικής αποκατάστασης μετά από μεταμόσχευση, μόνης ή σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες. Έχει ήδη βρεθεί βελτίωση στην αιματολογική αποκατάσταση όλων των σειρών, όταν χορηγηθεί σε συνδυασμό με G-CSF, σε σύγκριση με G-CSF μόνον, μετά από αυτόλογη μεταμόσχευση για λέμφωμα. Σε γενικές γραμμές, η IL-3 δεν φαίνεται ικανή να διορθώνει σημαντικά την λευκοπενία και την θρομβοπενία στις δόσεις που γίνονται ανεκτές, και έτσι δεν υπερτερεί του G- ή του GM-CSF. Προκλινικά δεδομένα υποδεικνύουν συνέργειά της με αυτούς τους παράγοντες, ο συνδυασμός μάλιστα με τον GM-CSF φάνηκε να επάγει και την μεγακαρυοποίηση. Ο συνδυασμός αυτός χρησιμοποιήθηκε σε ασθενείς μετά από χημειοθεραπεία, χωρίς να φανεί διαφορά από την χορήγηση μόνου του GM-CSF, παρά μόνο στην αποκατάσταση της θρομβοπενίας. Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρθηκαν σε συγχορήγηση με G-CSF (Woodcock JM et al, 1999). 2.3 Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Η IL-6 είναι πρωτεΐνη kda, που κωδικοποιείται από γονίδιο που εδράζεται στο βραχύ σκέλος του χωμοσώματος 7. Ανακαλύφθηκε και χαρακτηρίστηκε συγχρόνως από διάφορους ερευνητές με αποτέλεσμα αρχικά να έχει ονομασθεί με ποικιλία ονομάτων, όπως διεγερτικός των Β-λεμφοκυττάρων παράγων-2, ιντερφερόνη-β 2, επαγωγικός παράγων των ηπατοκυττάρων, αυξητικός παράγων υβριδωμάτων, παράγων αντικατάστασης των Τ-λεμφοκυττάρων και επαγωγικός παράγων-2 των μονοκυττάρων-κοκκιοκυττάρων. Ο όρος IL-6 αντικατέστησε όλους τους παραπάνω. Η IL-6 εκφράζεται σε ποικιλία κυτταρικών πληθυσμών, όπως ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, μονοκύτταρα-μακροφάγα και Τ-λεμφοκύτταρα και επάγεται από άλλες κυτταροκίνες όπως ο TNF-α και η IL-1, καθώς και από μιτογόνα και ενδοτοξίνες. Ο υποδοχέας της είναι ένα ετεροδιμερές, που αποτελείται από 2 υπομονάδες: μία α-υπομονάδα 80 kda, το γονίδιο της οποίας εδράζεται στο χρωμόσωμα 1q21 και χαρακτηρίζεται από το CD126 αντιγόνο και μία β-υπομονάδα, που μεταφέρει το μήνυμα, της οποίας το γονίδιο εδράζεται στο χρωμόσωμα 5q11 και χαρακτηρίζεται από το CD130 αντιγόνο. Η IL-6 έχει εξαιρετικά ευρεία βιολογική δράση, την οποία επιδεικνύει ισχυρότερα σε συνέργεια με άλλους παράγοντες. Έτσι, δρα μόνη της, αλλά περισσότερο σε συνέργεια με την IL-3, ή τον GM-CSF για την ανάπτυξη αποικιών CFU-GEMM και BFU-E, ενώ επάγει τον σχηματισμό και την ανάπτυξη αποικιών κοκκιώδους και μονοκυτταρικής σειράς, σε συνδυασμό με IL-4 και G-CSF. Σε συνδυασμό με IL-2, IL-4 και IL-14 επάγει επίσης τον πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων. Τα κύτταρα των αποικιών κοκκιώδους-μονοκυτταρικής (GM) και μονοκυτταρικής (Μ) σειράς αυξάνουν την δυνατότητα αυτοαναπαραγωγής τους παρουσία IL-6, ιδιαίτερα αν προστεθεί και IL-2. Με την IL-2 συνεργάζεται και στην παραγωγή ανοσοσφαιρινών. Επάγει την διαφοροποίηση των Β-λεμφοκυττάρων και την τελική διαφοροποίηση λευχαιμικών κυτταρικών σειρών μυελικής προέλευσης. Ο διαφοροποιητικός της ρόλος αναδεικνύεται και με την δράση της σε κυτταρικές σειρές φαιοχρωμοκυττώματος, όπου προκαλεί νευρωνική διαφοροποίηση. Επιπλέον επάγει αντιδράσεις οξείας φάσης και διεγείρει τα ηπατοκύτταρα για έκκριση πρωτεϊνών οξείας φάσης, όπως η CRP, το ινωδογόνο και η απτοσφαιρίνη. Έτσι η έκφραση και παραγωγή της αυξάνονται σε διάφορες καταστάσεις, όπως η χρονία φλεγμονή, τα αυτοάνοσα νοσήματα και η σήψη. Είναι ισχυρό πυρετογόνο in vivo, δράση που μπορεί να ανασταλεί αν προηγηθεί χορήγηση διαλυτού ανασυνδυασμένου υποδοχέα της. Πρόσφατη μελέτη σε ποντίκια με έλλειψη της IL-6 προτείνει ότι η IL-6 δρα σαν βασική αντιφλεγμονώδης κυτταροκίνη, που όπως η ιντερλευκίνη-10, ρυθμίζει την ένταση της φλεγμονώδους απόκρισης (Kishimoto T 1989). Μία από τις πρωτοαναγνωρισθείσες ιδιότητές της ήταν η επαγωγή της μεγακαρυοποίησης in vitro και in vivo. Σε πειραματόζωα δρά συνεργικά με την IL-3 και τον GM-CSF στην υποστήριξη ανάπτυξης CFU-Meg αποικιών, ευοδώνει την ωρίμανση μεγακαρυοκυττάρων, αυξάνει τον αριθμό των προγονικών μεγακαρυοκυττάρων και τα επίπεδα των κυκλοφορούντων στο αίμα αι- 15

16 μοπεταλίων. Θεωρείται ο ορμονικός διαμεσολαβητής της αντιδραστικής θρομβοκυττάρωσης που συνοδεύει χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις. Σε μελέτη των Mei και συν. αποδείχθηκε ότι η βιοδιαθεσιμότητα της IL-6 σε μακράς διάρκειας καλλιέργειες μυελού συσχετιζόταν άμεσα με το μέγεθος και την πλοειδία του πυρήνα των μεγακαρυοκυττάρων. Δεν βρέθηκε όμως συσχέτιση της βιοδιαθεσιμότητας της IL-6 με τον αριθμό των μεγακαρυοκυττάρων και διατυπώθηκε η υπόθεση ότι η IL-6 ευοδώνει, όχι τον πολλαπλασιασμό, αλλά μάλλον την ωρίμανση αυτών. Η κυτταροκίνη αυτή δεν μπορεί εύκολα να καταταγεί σε μιά συγκεκριμένη κατηγορία αυξητικών παραγόντων, γιατί έχει την ικανότητα να δρά έμμεσα και να επηρρεάζει ποικίλες αιμοποιητικές σειρές αλλά και μη αιμοποιητικά κύτταρα. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-6 (rhil-6) δρα κυρίως σαν συνεργικός παράγων και δεν έχει σαφώς αναδειχθεί άμεση δράση της επί κανενός είδους ανθρώπινων αιμοποιητικών κυττάρων, παρ όλο που διεγείρει τον σχηματισμό αποικιών κοκκιοκυττάρων / μακροφάγων στα ποντίκια. Αντιθέτως έχει αναμφίβολα αυτοκρινή / παρακρινή δράση ως αυξητικός παράγων σε κυτταρικές σειρές μυελικής και λεμφικής προέλευσης. Από in vivo μελέτες σε ποντίκια, αποδείχθηκε ότι η rhil-6 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των CFU-S, κάτι που αντανακλά την ικανότητά της να δρα σε συνέργεια με πολλούς σταθερά παραγόμενους αυξητικούς παράγοντες (Gardner JD et al 1990). Πλην της εξειδικευμένης δράσης της στα μεγακαρυοκύτταρα, η IL-6 συνεργάζεται και με παράγοντες που δρουν στα πρώϊμα στάδια της αιμοποίησης, όπως ο FLT3 και ο SCF. Eπομένως είναι δυνατόν και αυτή να δρα σε πρώϊμο στάδιο της διαφοροποίησης και να ενεργοποιεί τα προγονικά κύτταρα. Η ανεπάρκεια IL-6 επηρρεάζει αντίστροφα την επιβίωση των προγονικών και των προδρόμων αιμοποιητικών κυττάρων πολλών σειρών. Μετά από χημειο- ή ακτινοθεραπεία η IL-6 βοηθάει την αιματολογική αποκατάσταση μειώνοντας την περίοδο μυελοκαταστολής. Κλινικές εφαρμογές Λόγω της μεγακαρυοποιητικής in vitro δράσης της, η IL-6 θεωρήθηκε ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως θρομβοποιητικός παράγων in vivo, τα αποτελέσματα όμως της χορήγησής της ήταν απογοητευτικά. Το μόριο δεν αναπτύχθηκε τελικά για κλινική χρήση, κυρίως λόγω ελλείψεως ασφάλειας κατά την χορήγηση, το οποίο έγινε φανερό κατά τις μελέτες φάσης Ι. Σε δόσεις >5 μg/kg/d, απαραίτητες για να αναδειχθεί η θρομβοποιητική της δράση, εμφανίζονται σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες, κυρίως υψηλός πυρετός και σύνδρομο αγγειακής διαφυγής, οι οποίες καθιστούν μη ανεκτή την αγωγή. Η IL-6 όμως έχει πιθανώς και αντινεοπλασματική δράση. Δρα συνεργικά με την IL-2 για την παραγωγή κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων, πιθανώς μέσω της ικανότητάς της να προκαλεί αύξηση της έκφρασης των υποδοχέων της IL-2 στα θυμοκύτταρα. Παρ όλο που δεν διαπιστώθηκε κλινική ανταπόκριση σε αρχική μελέτη, ο ανοσοφαινότυπος του περιφερικού αίματος έδειξε αύξηση της έκφρασης των υποδοχέων της IL-2 στα CD3+ κύτταρα, υποδηλώνοντας έτσι ενεργοποίηση αυτών των λεμφοκυττάρων. Καμμιά αντικαρκινική δράση της κυτταροκίνης δεν αναδείχθηκε σε κλινική μελέτη φάσης ΙΙ, επί μεταστατικού καρκίνου του νεφρού, όπως σχεδίασε η ομάδα μελέτης των κυτταροκινών. Προς το παρόν έχει εγκαταλειφθεί κάθε κλινική δοκιμή in vivo χορήγησης της IL-6, για οποιαδήποτε ένδειξη. 2.4 Αυξητικός παράγων κοκκιοκυττάρων μακροφάγων (GM-CSF) Ο GM-CSF είναι γλυκοπρωτεΐνη αποτελούμενη από 127 αμινοξέα, με Μ.Β kda, και το γονίδιό του εδράζεται στο μακρό σκέλος του χρωμοσώματος 5, κοντά στα γονίδια των IL- 3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 και του υποδοχέα του M-CSF. Σε φυσιολογική αιμοποίηση παράγεται από Τ-λεμφοκύτταρα, μαστοκύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες και θυμοκύτταρα, και η παραγωγή του επάγεται από ποικίλα σήματα, μεταξύ των οποίων και από πρωτεΐνες οξείας φάσεως. Ασκεί τη δράση του μέσω σύνδεσης με τον υποδοχέα του στην κυτταρική επιφάνεια. Ο 16

17 υποδοχέας του είναι τύπου I υποδοχέας και αποτελείται από 2 διαμεμβρανικές υποομάδες: μια α- υποομάδα χαμηλής συγγένειας, και μια β-υποομάδα που μεταδίδει το μήνυμα, κοινή και για τους υποδοχείς των IL-3 και IL-5. Η α-υποομάδα κυκλοφορεί επίσης σε διαλυτή μορφή, που ανταγωνίζεται την δράση του GM-CSF in vitro, εξουδετερώνοντας τον συνδέτη. Ο υποδοχέας εκφράζεται στα μονοκύτταρα, φαγοκύτταρα, ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα, πλασματοκύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες, καθώς και σε κύτταρα χρονίας μυελογενούς λευχαιμίας και λευχαιμικών σειρών. Η α-υποομάδα ανιχνεύεται επίσης σε κακοήθεις πλασματοκυτταρικές σειρές, στις οποίες έχει διαπιστωθεί ότι ο GM-CSF προκαλεί ενεργοποίηση της μεταγωγικής οδού p21- ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK), αυξάνει την σύνθεση DNA, και αναστέλλει την απόπτωση. Η μετάδοση του μηνύματος γίνεται μέσω 2 οδών, που καταλήγουν στην ενεργοποίηση της οδού JAK2 - MAP κινάσης, που είναι απαραίτητη για όλες τις βιολογικές δράσεις του GM-CSF. Επιπλέον, ο GM-CSF ενεργοποιεί οδούς μέσω της β-υποομάδας του υποδοχέα, που μεταδίδουν σήματα επιβίωσης στα κύτταρα στόχους (Watanabe S et al, 1996). Βιολογική δράση στον αιμοποιητικό ιστό Ο GM-CSF είναι ευρέος φάσματος αυξητικός παράγων, που επάγει την ανάπτυξη αποικιών CFU-Blast, CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-Eo, BFU-E και CFU-Mk. Η χορήγησή του in vivo σε ποντίκια προκαλεί δοσοεξαρτώμενη αύξηση των δικτυοερυθροκυττάρων και των λευκών αιμοσφαιρίων του περιφερικού αίματος και διόγκωση του σπληνός. Όταν ο υποδοχέας εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων, ο GM-CSF επάγει την αύξηση όλων των αιμοποιητικών κυτταρικών σειρών, εύρημα που υποστηρίζει το στοχαστικό μοντέλο αιμοποίησης, δηλαδή την ε- ξάρτηση της εξέλιξης κάθε κυττάρου από το εσωτερικό του πρόγραμμα μάλλον, παρά από την ύπαρξη εξωγενούς αυξητικού παράγοντα. Επιπλέον ενισχύει την λειτουργία ώριμων κυττάρων, όπως ουδετερόφιλων, ηωσινοφίλων, βασεόφιλων, μαστοκυττάρων, μονοκυττάρων, φαγοκυττάρων και ιστικών μακροφάγων. Στις βιολογικές του ιδιότητες περιλαμβάνονται η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου της IL-1 στα ουδετερόφιλα και τα μονοκύτταρα του αίματος, η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου του TNFα στα μονοκύτταρα, η συνδιέγερση του Τ-κυτταρικού πολλαπλασιασμού με την IL-2, η διέγερση ή συνδιέγερση της αύξησης διαφόρων λευχαιμικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών και η επαγωγή της μετανάστευσης και του πολλαπλασιασμού αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro. Προκαλεί μετανάστευση, αλλά όχι χημειοταξία στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, επιμηκύνει την επιβίωσή τους σε καλλιέργεια in vitro και τα προφυλάσσει από την απόπτωση. Στα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα ο GM-CSF διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση, ανεξάρτητα από τον M-CSF, αν και το επιτυγχάνει μέσω της ίδιας οδού μεταγωγής του μηνύματος, που είναι εξαρτώμενη από την πρωτεΐνη ras. Περιφερικά μονοκύτταρα, που διεγείρονται συγχρόνως από GM-CSF και IFN-α διαφοροποιούνται σε δυνητικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Στα ώριμα μακροφάγα ο GM-CSF διεγείρει την δράση ελαστάσης, μέσω αύξησης της μετάφρασης και ενίσχυσης της σταθερότητος. Η ρύθμιση της δράσης της μεταλλοελαστάσης από IFNγ, M-CSF και GM-CSF αναδεικνύει τον ρόλο αυτών των μορίων στον έλεγχο της αποδόμησης των ελαστικών ινών στους πνεύμονες και στα αιμοφόρα αγγεία. Ο GM-CSF είναι αυτοκρινής αυξητικός παράγων για τους οστεοβλάστες και δεσμεύεται στις γλυκοζαμινογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειάς τους και της εξωκυττάριας ουσίας, καθώς και στην θειική ηπαράνη, σε ενεργό μορφή. Στα ηωσινόφιλα ο μεταφέρει αντιαποπτωτικά μηνύματα μέσω ενεργοποίησης της οδού των JAK2 κινασών και συμμετέχει στην ιστική ηωσινοφιλία στις περιοχές αλλεργικής αντίδρασης. Επίσης αυξάνει την έκφραση των ICAM-1 και VCAM-1, που είναι σημαντικά μόρια για την συγκέντρωση και εφεξής την λειτουργία των ηωσινόφιλων. Τέλος, στα λευχαιμικά κύτταρα ο GΜ-CSF μεταφέρει αντιαποπτωτικά μηνύματα. Ασθενείς με νεανική χρόνια μυελομονοκυτταρική λευχαιμία παρουσιάζουν ευαισθησία στην ανάπτυξη αποικιών με την προσθήκη του παράγοντα, ενώ στην CMML των ενηλίκων έχουν παρατητηθεί τουλάχιστον 2 μοντέλα ανάπτυξης: ένα παρόμοιο της νεανικής και ένα πιό ετερογενές, με τυχαία ανάπτυξη CFU-GM και CFU-M αποικιών και έλλειψη ευαισθησίας στον GΜ-CSF. Υποστηρίζει 17

18 επίσης τον πολλαπλασιασμό των μυελωματικών κυττάρων σε συνεργασία με τον κύριο αυξητικό τους παράγοντα, την IL-6. Ο υποδοχέας του εκφράζεται στα κύτταρα αυτά καθώς και στα κύτταρα της τριχωτής λευχαιμίας, τα οποία όμως δεν προστατεύει από την απόπτωση ούτε επάγει τον πολλαπλασιασμό τους (Woodcock-JM et al 1999). Βιολογική δράση σε άλλους ιστούς Ο GM-CSF αποτελεί μεσολαβητή για την διακυτταρική επικοινωνία στο θηλυκό αναπαραγωγικό σύστημα. Η σύνθεση και έκκρισή του κατά την κύηση διεγείρεται από τα οιστρογόνα και αναστέλλεται εν μέρει από την προγεστερόνη. Είναι παράγων απαραίτητος για την ανάπτυξη του εμβρύου σε πειραματόζωα. Εκφράζεται επίσης στο τοίχωμα των αρτηριών και επί αθηροσκλήρυνσης υπάρχει αυξημένη έκφραση του mrna του και του κολλαγόνου τύπου VIII, ιδίως στα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα. Ο GM-CSF ενισχύει την ανάπτυξη των πνευμόνων και προκαλεί επιθηλιακή υπερπλασία των κυψελίδων. Ανιχνεύεται ακόμη μαζί με τον υποδοχέα του σε συνδυασμό και με άλλες κυτταροκίνες (IL-1α, IL-6 και IL-8), σε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και ποντικού, σε ιστούς και τον ορρό ασθενών με καρκίνωμα εκ πλακώδους επιθηλίου, ενώ παράγεται και από κύτταρα μελανώματος ποντικού. Επίσης συμμετέχει στην φλεγμονώδη αντίδραση των νεύρων σε τραυματισμό, με διέγερση των μακροφάγων και προϊούσα εκφύλιση. 2.5 Αυξητικός παράγων κοκκιοκυττάρων (G-CSF) O G-CSF είναι γλυκοπρωτεΐνη 18 kda και οφείλει την ονομασία του στην κυριότερη ιδιότητά του να προκαλεί τελική διαφοροποίηση των προγονικών μυελικών κυττάρων σε ώριμα ουδετερόφιλα. Ανακαλύφθηκε το 1985 από καρκινική σειρά ουροδόχου κύστης και κλωνοποιήθηκε σύντομα. Το γονίδιό του εδράζεται στο μακρό σκέλος του χρωμοσώματος 17(17q11) και κωδικοποιεί πολυπεπτίδιο 174 αμινοξέων, η γλυκοζυλίωση του οποίου σταθεροποιεί το μόριο στην κυκλοφορία. Ο μηχανισμός δράσης του εμπλέκει το γονίδιο GIG-1, η έκφραση του οποίου αυξάνεται και στα φυσιολογικά μονοκύτταρα και στα κύτταρα της ΟΜΛ μετά από επίδραση G-CSF. Ο υποδοχέας του G-CSF είναι μεγάλου μεγέθους (759 αμινοξέα) πρωτεΐνη ΜΒ 115 kda, που ανήκει στην οικογένεια υποδοχέων κυτταροκινών τύπου Ι. Το εξωκυττάριο τμήμα είναι παρόμοιο με αυτό του υποδοχέα της IL-3. Στην κυτταρική επιφάνεια ο υποδοχέας σχηματίζει ομοδιμερές σύμπλεγμα. Η σύνδεση του G-CSF οδηγεί στον σχηματισμό τετραμερούς, και υπάρχουν 2 θέσεις σύνδεσης με τον υποδοχέα. Μετά την σύνδεση μετάγονται μηνύματα για ενεργοποίηση των Jak1, Tyk2 και Jak2 και ακολουθεί φωσφορυλίωση των STAT1, STAT3 και STAT5, το μήνυμα μεταγραφής φτάνει στον πυρήνα και αρχίζει η λειτουργία γονιδίων που προκαλούν διαφοροποίηση. Επιπλέον, ο G-CSF προκαλεί ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA), της ε- ξωκυττάριας κινάσης (ERK), της c-jun-n-terminal κινάσης (JNK) και της p38 MAP κινάσης (Deshpande RV et al, 1997, Chakraborty A et al, 1998). Συγγενείς δομικές ανωμαλίες του ενδοκυτταροπλασματικού τμήματος του υποδοχέα μπορεί να επηρεάζουν ή όχι την σύνδεση με τον G-CSF, αλλά σίγουρα μεταδίδουν εσφαλμένο μήνυμα και εμπλέκονται στην παθογένεια της σοβαρής συγγενούς ουδετεροπενίας (σύνδρομο Kostman) και στην αυξημένη προδιάθεση για οξεία λευχαιμία των ασθενών με το σύνδρομο αυτό. Επιπρόσθετες επίκτητες μεταλλάξεις προκύπτουν σε ομάδα αυτών των ασθενών που αναπτύσσουν ΟΜΛ. Αυτές οι μεταλλάξεις έχουν ως αποτέλεσμα περαιτέρω διέγερση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σαν απάντηση στην επίδραση G-CSF (Visani G et al 1995). Βιολογική δράση Υπό φυσιολογικές συνθήκες ο G-CSF παράγεται από τα κύτταρα του στρώματος του μυελού, μονοκύτταρα και μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες. Εν τούτοις, κάτω από 18

19 κατάλληλες συνθήκες ή μετά κακοήθη εξαλλαγή, ποικίλα κύτταρα καθίστανται ικανά να παράγουν και να εκκρίνουν G-CSF. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται NK κύτταρα, στρωματικά κύτταρα του πλακούντα, λεία μυϊκά κύτταρα, αρθρικά χονδροκύτταρα και διάφορες λευχαιμικές και καρκινικές σειρές. Η IL-1, ο TNF-α και η ενδοτοξίνη προκαλούν έκκριση G-CSF. Η προσβολή των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων από κυτταρομεγαλοϊό καταστέλλει την παραγωγή G- CSF και GM-CSF στα προχωρημένα στάδια της λοίμωξης και είναι υπεύθυνη για την μυελοκαταστολή που παρατηρείται συχνά στις περιπτώσεις αυτές. Είναι γνωστό ότι ο G-CSF, όχι μόνο διεγείρει την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των δεσμευμένων προγονικών κυττάρων της κοκκιώδους σειράς και την ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων, αλλά συμμετέχει και στην ανάπτυξη πιο πρώιμων αιμοποιητικών κυττάρων, δρώντας παρόμοια με την IL-3 και ενισχύοντας την δράση της. Δρώντας συνεργικά και με άλλες κυτταροκίνες (GM-CSF, SCF, IL-3, IL-6, IL-11), ο G-CSF κινητοποιεί αποτελεσματικά τα ηρεμούντα προγονικά κύτταρα του μυελού, προωθώντας τα από την G 0 στις G 1 S φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Ακόμη έχει άμεση επίδραση στον πολλαπλασιασμό και ωρίμανση της μεγακαρυοκυτταρικής σειράς, ασθενέστερη φυσικά από την αντίστοιχη της θρομβοποιητίνης. Ο G-CSF είναι βασικός διαφοροποιητικός και ενεργοποιητικός παράγων των ουδετεροφίλων. Προκαλεί έκκριση μυελοϋπεροξειδάσης και αλκαλικής φωσφατάσης στο κυτταρόπλασμα, μειωμένη παραμόρφωση μέσω πολυμερισμού της F-ακτίνης και αυξημένη έκφραση των CD11b, CD11c και CD18, όχι όμως και του CD11a στην κυτταρική επιφάνεια. Όπως και η IFN-γ, ενισχύει την δράση των ουδετεροφίλων έναντι βακτηριδίων και μυκήτων, αυξάνει την παραγωγή Η 2 Ο 2, ευοδώνει την χημειοταξία ουδετεροφίλων και μονοκυττάρων, χωρίς να τροποποιεί την έκφραση μορίων προσκόλλησης στην επιφάνειά τους. Έχουν περιγραφεί επίσης ανοσορρυθμιστικές δράσεις του παράγοντα αυτού. Τα προγονικά κύτταρα που κινητοποιούνται στο περιφερικό αίμα μετά επίδραση G-CSF, έχουν μειωμένη έκφραση α 4 -ιντεγκρίνης και προσκολλώνται πολύ δύσκολα και σε μικρό βαθμό στο στρώμα του μυελού. Σε φαρμακολογικές συγκεντρώσεις ο G- CSF ελαττώνει την έκφραση ICAM-1, που προκαλεί η IL-1, ενώ εμφανίζει συνέργεια με την τελευταία στην επαγωγή της έκφρασης VCAM-1. Ο ρόλος του G-CSF στην βιολογία της ΟΜΛ έχει απασχολήσει ιδιαιτέρως τους ερευνητές, που απέδειξαν αυξημένο πολλαπλασιασμό βλαστών σε καλλιέργειες παρουσία του παράγοντα. Άλλες κυτταροκίνες εμφανίζουν συνέργεια προς αυτήν την κατεύθυνση (GM-CSF, IL3, IL4, SCF) ενώ άλλες ανασταλτική δράση (TNF και TGFβ1). Εξ άλλου σε κάποια είδη λευχαιμικών βλαστών, τα ρετινοειδή προκαλούν επαγωγή της έκφρασης του υποδοχέα, και ερμηνεύοντας την συνέργεια των δύο ουσιών στην πρόκληση διαφοροποίησης επί προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας. Ανασυνδυασμένος G-CSF χρησιμοποιείται ευρέως στην κλινική πράξη τα τελευταία 12 χρόνια και έχει συσσωρευτεί σημαντική εμπειρία όσον αφορά τις ενδείξεις, τις παρενέργειες και την φαρμακοκινητική του (Dale DC et al, 1998). 2.6 Ερυθροποιητίνη (Epo) Η Ερυθροποιητίνη είναι ο πρώτος αυξητικός παράγων που αναγνωρίσθηκε και απομονώθηκε πριν 100 χρόνια (1906 Garnot - De Flandre) από τα ούρα ασθενών πασχόντων από απλαστική αναιμία. Είναι πρωτεΐνη 28 kda, αποτελείται από 166 αμινοξέα και στην γλυκοζυλιωμένη μορφή της αποκτά ΜΒ kda. Η γλυκοζυλίωση προφυλάσσει την ταχεία κάθαρση του μορίου από τα ηπατοκύτταρα. Το γονίδιό της εδράζεται στο χρωμόσωμα 7q21. Η Epo στην ενήλικο ζωή παράγεται κυρίως από τον νεφρό, και μάλιστα από τα κύτταρα της παρασπειραματικής συσκευής, ενώ ποσοστό <10% παράγεται από τα κύτταρα Kuppfer στο ήπαρ. Το κύριο ερέθισμα για την παραγωγή της είναι η υποξία του νεφρικού ιστού, που ενεργοποιεί ειδικό αισθητήρα, ο οποίος δρα ως μεταγραφικός παράγων για την έκφραση του γονιδίου της. Ο υποδοχέας της Epo είναι τύπου I κυτταροκινών, με δομή παρόμοια με τους υποδοχείς του SCF και της IL-3. Το γονίδιό του εδράζεται στο χρωμόσωμα 19p13 και κλωνοποιήθηκε το 1989 σε κύτταρα ερυθρολευχαιμίας ποντικού. Μετά την σύνδεσή του με την Epo ενεργοποιείται 19

20 και μεταδίδει μήνυμα μέσω της οδού JAK2/STAT5. Έχει 2 ενδοκυτταροπλασματικές υπομονάδες. Η πρώτη μεταφέρει μήνυμα πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης στην ερυθρά σειρά, ενώ η δεύτερη μεταφέρει αντίθετα μηνύματα ή μηνύματα που εξασθενούν τα αρχικά. Η ενεργοποίηση της οδού JAK2/STAT5 οδηγεί στον σχηματισμό του ισχυρού μεταγραφικού συμπλέγματος fos/jun, που επάγει την έκφραση γονιδίων διαφοροποίησης. Μια διαφορετική οδός ενεργοποίησης είναι αυτή της PI3-κινάσης και της MAP κινάσης, που καταλήγουν σε ενεργοποίηση άλλων γονιδίων όπως των cis, osm και pim-1, σε συνέργεια με τον SCF. Η ρύθμιση των οδών μεταγωγής του μηνύματος επιτυγχάνεται μέσω αποφωσφορυλίωσης του υποδοχέα από τις τυροσινικές φωσφατάσες SHPTP1 και SHPTP2. Μετάλλαξη του υποδοχέα στο τμήμα πρόσδεσης των φωσφατασών, οδηγεί σε συνεχή ενεργοποίησή του και υπερευαισθησία σε ελάχιστες ποσότητες Epo, και ο μηχανισμός αυτός οδηγεί στην οικογενή ερυθροκυττάρωση. Υπό διερεύνηση ευρίσκεται ο ρόλος μεταλλάξεων του γονιδίου του υποδοχέα στην παθογένεια της αναιμίας των μυελοδυσπλαστικών και μυελοϋπερπλαστικών συνδρόμων (Broudy VC et al 1989). Βιολογική δράση της ερυθροποιητίνης Η ερυθροποιητίνη επάγει όλες τις βιοχημικές οδούς που είναι απαραίτητες για την ωρίμανση και διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων. Οι κύριοι μηχανισμοί δράσης της είναι 1) παρεμπόδιση της απόπτωσης και 2) μείωση του χρόνου μεταξύ των διαιρέσεων, δηλαδή επαγωγή της διαφοροποίησης. Επιπλέον έχει διαπιστωθεί ότι συμμετέχει στον σχηματισμό των πρωτεϊνών της μεμβράνης, της αίμης και της σφαιρίνης. Είναι ισχυρός παράγων επιβίωσης για τα CFU-E, που επί απουσίας της αποπίπτουν μετά ένα κύκλο σύνθεσης DNA. Η πλειοψηφία των CFU-E (80%) εκφράζουν υποδοχείς Epo, ενώ μικρή έκφραση υπάρχει στα BFU-E και σταδιακή μείωση παρατηρείται κατά την ωρίμανση της ερυθράς σειράς, ώστε στο στάδιο της ορθοχρωματικής ευθροβλάστης να παραμένουν ελάχιστοι. Στις αωρότερες μορφές αυξάνεται η δράση της Epo παρουσία SCF, ενώ τα CFU-E και οι προερυθροβλάστες αναπτύσσονται καλύτερα σε συμπαρουσία IGF-1. Κατά την διάρκεια αναιμίας ή υποξίας αυξάνεται η παραγωγή Epo, ενώ σε συνθήκες υπεροξυγόνωσης, σε φλεγμονώδεις νόσους του συνδετικού ιστού και σε νεφρολογικά νοσήματα, μειώνεται κάτω από τα φυσιολογικά όρια. Σε καλλιέργειες Epo εξαρτώμενης κυτταρικής σειράς, η αποστέρηση Epo από το θρεπτικό υλικό έχει ως αποτέλεσμα την σοβαρή μείωση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-x L και Bcl-2, και τα κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση. Η εξωγενής προσθήκη Bcl-x L, μπορεί να αναστρέψει το φαινόμενο, αναδεικνύοντας τον σημαντικό ρόλο του για την επιβίωση της ερυθράς σειράς. Υποδοχείς Epo έχουν βρεθεί και σε άλλα είδη κυττάρων. Τα μεγακαρυοκύτταρα τους εκφράζουν αυτόματα, ενώ τα Β-λεμφοκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν την δυνατότητα έκφρασης υποδοχέων Epo μετά διέγερση. Τα νευρικά κύτταρα και τα κύτταρα του πλακούντα εκφράζουν επίσης υποδοχείς Epo σε διάφορα στάδια ωρίμανσης ( Krantz SB, 1991). 2.7 Άλλοι αιμοποιητικοί παράγοντες FLT3-Ligand (FL) Αποτελεί τον προσδέτη του υποδοχέα flt3/flk2, που ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων τυροσινικής κινάσης τύπου ΙΙΙ. Ο υποδοχέας αυτός εκφράζεται ευρέως στον λεμφικό και τον αιμοποιητικό ιστό, κατά αποκλειστικότητα στα προγονικά κύτταρα και καθόλου στα ώριμα. Εκφράζεται επίσης σε κακοήθη κύτταρα οξείας μυελογενούς και λεμφογενούς λευχαιμίας, ενώ πρόσφατα διεπιστώθησαν μεταλλάξεις του σε μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα. Η πρωτεΐνη δρα κυρίως στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία διεγείρει για να εισέλθουν από την φάση G 0 στην φάση κυτταρικής ανάπτυξης, ενώ παράλληλα αναστέλλει την απόπτωση. Στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα έχει μικρότερη δράση, την οποία εκφράζει κυρίως σε συνέργεια με άλλους αιμοποιητικούς παράγοντες. Ιδιαίτερη βιολογική του ιδιότητα αποτελεί η επίδρασή στον πολλα- 20