BIOCHIMIE PURCǍREA CORNELIA INDRUMǍTOR DE LABORATOR. pentru studenţii de la specializările: CONTROLUL SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE

Transcript

1 PURCǍREA CORNELIA INDRUMǍTOR DE LABORATOR BIOCHIMIE pentru studenţii de la specializările: CONTROLUL SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE TEHNOLOGIA PRELUCRARII PRODUSELOR AGRICOLE EDITURA UNIVERSITǍŢII ORADEA 2015

2 Referenti stiintifici: Conf. univ. Dr. Vicaş Simona Conf. univ. Dr. Alina Caraban Tehnoredactare: Cornelia Purcărea EDITURA UNIVERSITATII ORADEA ISBN: CD

3 CUPRINS LABORATOR 1. Măsuri de protecţia muncii în laboratoarele de biochimie... 4 Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse alimentare... 6 Soluţii de reactivi... 7 LABORATOR 2. METODE DE ANALIZǍ FOLOSITE ÎN BIOCHIMIE LABORATOR 3-4.GLUCIDE Extragerea glucidelor din produsele alimentare Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul Determinări cantitative ale glucidelor Determinarea glucidelor reducătoare cu ajutorul reacţiei Fehling Determinarea glucidelor prin metoda Schrool Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianură de potasiu LABORATOR 5-6. LIPIDE Determinarea principalilor indici la grăsimi Determinarea punctului de topire Determinarea indicelui de iod Determinarea indicelui de saponificare Determinarea indicelui de aciditate Indice de peroxid Reacţia Kreis Determinarea grăsimii metoda Soxhlet principiul metodei Determinarea grăsimii din produsele lactate metoda Gerber principiul metodei LABORATOR DETERMINAREA PROTEINELOR DIN PRODUSELE ALIMENTARE Obţinerea extractelor proteice Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen Determinarea conţinutului de cazeinӑ din lapte Determinarea proteinelor - metoda biuretului Determinarea proteinelor metoda Kjeldhal principiul metodei LABORATOR 10. ENZIME Evidenţierea unor enzime Evidenţierea peroxidazei din hrean

4 Evidenţierea activităţii peroxidazei din lapte Influenţa factorilor fizico-chimici asupra activităţii enzimelor Influenţa temperaturii asupra activităţii enzimelor Influenţa ph-ului asupra activităţii enzimatice LABORATOR VITAMINE Metode de identificare ale vitaminelor Determinarea vitaminei C din vegetale Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans LABORATOR 13.PIGMENŢI Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subţire Determinarea spectrofotometricӑ a conţinutului de clorofilӑ LABORATOR 14. EVALUARE LABORATOR BIBLIOGRAFIE

5 Prefaţӑ Alimentele sunt produse naturale, cu o compoziţie complexă, de origine vegetală sau animală. Ele constituie suportul material al vieţii, al sănătăţii omului, asigurând energia şi substanţele de bază necesare desfăşurării proceselor metabolice. Substanţele componente ale alimentelor se numesc nutrienţi. Nutrienţii sunt compuşi organici sau anorganici, care pot avea rol structural, energetic şi funcţional ca de exemplu : glucide, lipide, protide, enzime, vitamine, elemente minerale şi produşi secundari de metabolism. Prezenta lucrare este astfel realizată, încât să poată fi utilizată cu succes de studenţii de la secţiile Tehnologia Prelucrării Produselor Alimentare, Controlul şi Expertiza Produselor Alimentare dar şi de cei de la Facultăţile de Agricultură, Zootehnie şi Biotehnologii, care studiază biochimia. Indrumӑtorul începe cu protecţia muncii, continuӑ cu o prezentare generală a laboratorului de biochimie, a soluţiilor de reactivi folosiţi şi a metodelor de analiză utilizate în mod curent în biochimia analitică calitativă şi cantitativă. Următoarele lucrӑri cuprind numeroase experienţe privind identificarea şi dozarea constituenţilor principali ai materiei vii (glucide, lipide, protide), a substanţelor cu rol funcţional (enzime, vitamine), a produselor de origine secundară (pigmenţi). La sfârşitul fiecărui capitol, am întocmit câte un test de verificare, care vine în sprijinul studenţilor, pentru a adânci cunoştinţele dobândite la orele de laborator şi pe cele predate la orele de curs. 3

6 LABORATOR 1. Măsuri de protecţia muncii în laboratoarele de biochimie Laboratoarele de biochimie alimenterӑ sunt destinate activităţilor didactice, ştiinţifice respectiv aplicative (agricole, alimentare. etc). In astfel de laboratoare se poate executa o mare diversitate de lucrări necesitând substanţe, sticlărie, ustensile, aparatură şi instalaţii adaptate scopurilor propuse. Accidentele de orice natură pot fi evitate dacă se respectă cu stricteţe condiţiile de lucru prescrise la executarea diferitelor lucrări. In acest scop exista prescripţii generale, cu caracter normativ, referitoare la protecţia şi securitatea muncii (P.S.M.) care trebuie să fie bine cunoscute de către pesoanele care desfăşoară activităţi în laboratoare de profil. Intregul personal şi studenţii care lucrează în laborator trebuie să cunoască şi să respecte regulile de protecţia muncii şi asigurarea securităţii pentru prevenirea accidentelor de muncă. Intregul personal şi studenţii care lucrează în laborator trebuie să cunoască şi să respecte regulile de protecţia muncii şi asigurarea securităţii pentru prevenirea accidentelor de muncă. 1. Personalul din laborator este obligat să poarte halat. 2. Pentru a evita inhalarea diferitelor substanţe din praful care se ridicӑ odatӑ cu mӑturarea poelelor, acestea nu se mătură, ci se spală cu apă sodată, detergenţi sau soluţii antiseptice. 3. Aparatele electrice trebuie să aibe prizele împământate şi izolarea electrică să fie perfectă. 4. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu extinctor. 5. Incăperea unde se prepară acizii minerali, apa de brom, unde se lucrează cu solvenţi organici trebuie să fie prevazută cu nişă, exhaustor şi ventilaţie electrică. 6. Solvenţii şi acizii se depozitează în subsolul clădirii, unde trebuie să existe căi de acces cât mai largi. 7. In chiuvete nu se vor arunca precipitate sau reactivi tari care atacă conducta, dacă totuşi se întâmplă, se lasă să curgă o cantitate mare de apă pentru a evita deteriorarea chiuvetei. 8. La destuparea sticlelor trebuie să se acorde o atenţie deosebită manipulării dopurilor. Acestea se aşază cu partea plată pe masă şi partea cilindrică în sus. 4

7 9. Pentru a evita impurificarea reactivilor surplusul de reactivi ce rămâne în vase nu se toarnă din nou în sticlă. 10. Evaporarea solvenţilor inflamabili se va face numai pe băi de nisip sau băi de apă electrice, sub nişe cu tiraj convenabil. 11. Sticlele cu reactivi se etichetează clar şi durabil, iar turnarea reactivilor din sticle nu se face în dreptul etichetelor, pentru a evita distrugerea lor. 12. După terminarea lucrărilor se verifică dacă aparatura electrică a fost scoasă din prize şi dacă robinetele au fost închise. 13. In laborator se păstrează curăţenie perfectă. Pe masa de lucru se vor afla numai vasele şi reactivii cu care se lucrează. 14. Este interzisă gustarea soluţiilor şi substanţelor de laborator. 15. Mirosirea substanţelor gazoase se face cu prudenţă printr-o mişcare de vânturare deasupra vasului spre nas. 16. Eprubetele în care se fac experienţele nu trebuie îndreptate nici spre cel care face experimentul, nici spre vecin. 17. Substanţele volatile, foarte inflamabile se vor feri de căldura mare şi de lumina solară. Cu ele se lucrează numai în camere bine aerisite şi la o depărtare de 5 metri de orice sursă de flacără. 18. Subsţantele sensibile la lumină sunt păstrate în sticle colorate. 19. Măsurarea soluţiilor toxice nu se face prin pipetare, ci numai cu ajutorul biuretelor sau pipetelor automate. 20. Substanţele periculoase ca: fosforul, metalele alcaline, benzina, sulfura de carbon, carbidul, acetona, iodul, etc. nu se aruncă în chiuvetă, ci se adună în borcane sau se transformă în substanţe inofensive. Fosforul alb se păstrează sub apă, iar metalele alcaline sub petrol. 21. La diluarea acizilor se va turna acidul în apă şi nu invers, lăsând să se prelingă foarte încet acidul pe pereţii vasului. 22. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon şi azot lichid se depozitează în afara laboratoarelor. 23. Cromatografia şi electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul laboratorului şi prevăzute cu ventilaţie. 24. Substanţele toxice se ţin sub cheie. 25. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu trusă de prim ajutor. 5

8 Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse alimentare Analiza biochimică trebuie efectuată imediat ce mostrele recoltate sunt aduse la laborator pentru că acestea se depreciază foarte repede fie datorită activităţii microorganismelor ce se găsesc în sau pe produse, fie activităţii enzimelor tisulare, ambii factori fiind favorizaţi de temperatura camerei, de prezenţa oxigenului din aer şi de lumină. Laboratorul trebuie astfel dimensionat încât să se poată efectua cu promptitudine analizele solicitate pentru a putea stabili operativ starea produsului. Orice laborator de control biochimic al alimentelor trebuie să se compună din următoarele încăperi: 1. Sala de primire a probelor; 2. Sala de pregatire a materialului. 3. Laboratorul de lucru propriu-zis prevăzut cu mese faianţate sau acoperite cu materiale termorezistente şi rezistente la acizi şi baze, chiuvete, etajere metalice pentru reactivi uzuali, becuri de gaz şi prize; 4. Camera frigiderelor pentru pӑstrarea probelor si contraprobelor 5. Camera de balanţe si aparatura performanta- amplasatӑ în acea parte a clădirii în care trepidaţiile sunt minime.balanţa trebuie sӑ fie instalatӑ pe o consolӑ fixatӑ în perete sau mese fixe; 6. Depozit de reactivi, cu minimul de reactivi pe timp de un an. Aici e interzisă instalarea de prize, surse de apă si gaz. Reactivii toxici vor fi amplasaţi într-un dulap metalic cu cheie, iar cheile vor fi pӑsrate de cӑtre şeful de laborator; 7.Sala pentru spӑlarea sticlӑriei. 6

9 Soluţii de reactivi Concentraţia este o caracteristică esenţială a unei soluţii şi reprezintă raportul dintre cantitatea de substanţă dizolvată şi cantitatea dizolvantului utilizat. Există mai multe moduri de exprimare a concentraţiei unei soluţii. a. Concentraţia procentuală: reprezintă cantitatea de substanţă dizolvată în 100g soluţie,în acest caz exprimarea fiind "g/g". Dacă soluţia se prepară prin cântărirea solvatului şi aducerea acestuia la volum constant cu solventul, este exprimare "g/v". Dacă soluţia se prepară volumetric, ambele componente ale soluţiei fiind lichide, avem exprimare "V/V". b. Concentraţia molală se referă la numărul de moli de substanţă dizolvată în 1000ml solvent. c. Concentraţia molară reprezintă numărul de moli de substanţă dizolvată în 1000ml soluţie. d. Concentraţia normală se referă la numărul de echivalenţi (vali) în 1000ml soluţie. Normalitatea unei soluţii se notează fie cu "n", fie cu "N". Soluţia care conţine un val substanţă în 1000ml soluţie, se numeste soluţie 1N. Echivalentul gram (val) reprezintă cantitatea dintr-o substanţă în grame, egală cu echivalentul său chimic. Echivalentul se calculează diferit pentru acizi, baze şi săruri, conform următoarelor relaţii: Pentru acizi Se calculează împărţind masa moleculară a acidului la numărul atomilor de hidrogen ai acidului. Exemplu: Pentru baze Se calculează împărţind masa moleculară a bazei la numărul de grupări hidroxilice 7

10 Exemplu Pentru sare Se calculează împărţind masa moleculară a sării la numărul atomilor de metal înlocuiţi de hidrogen : Exemplu E MgCO3 =84,3/2=42,15g Utilizarea soluţiilor normale în volumetrie prezintă avantajul că soluţiile de aceeaşi normalitate reacţionează între ele în volume egale, deoarece conţin dizolvate substanţe în cantităţi echivalente. Titrul (T) unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame, care se găseşte dizolvată într-un ml de soluţie. Soluţia al cărei titru se cunoaşte se numeşte soluţie titrată. De exemplu, dacă în 1000ml soluţie se găsesc 40,0005g NaOH, într-un ml de soluţie se află T g NaOH, adică : T=40,0005/1000=0,040005g NaOH Pentru obţinerea unei soluţii cu un anumit titru se procedează după următoarele metode: a). fie prin cântărirea unei anumite cantităţi de substanţă etalon sau titrimetrică. Substanţele etalon sunt acele substanţe din care prin simplă cântărire şi dizolvare în balon cotat, la volum cunoscut, se pot obţine soluţii cu concentraţia cunoscută. b). fie prin titrare cu ajutorul unei substanţe etalon. Se cântăreşte o anumită cantitate din substanţa etalon (0,15-0,20g), se dizolvă în apă şi se titrează cu soluţia al cărei titru dorim să îl determinăm. Pentru stabilirea titrului sunt necesare cel puţin două titrări în scopul verificării concordanţei dintre rezultate. Factorul soluţiei (F) este un factor de corecţie al concentraţiei unei soluţii, este numărul care arată corespondenţa dintre un ml soluţie aproximativ normală şi o soluţie exact normală. 8

11 De exemplu, pentru o soluţie exact 0,1N de NaOH titrul teoretic este de Pentru o soluţie aproximativ 0,1 N să presupunem că titrul real este Factorul acestei soluţii va fi: F= == 0,004328/ 0,004 =1,0820 Aceasta înseamnă că la 1ml din soluţia noastră corespund 1.082ml din soluţia exact 0.1N. In general, dacă se titrează o soluţie a substanţei A cu greutate moleculară M A, cu reactivul B având normalitatea n şi factorul F, folosind V ml din reactivul B, cantitatea de substanţă A din proba analizată va fi: TEST 1. Laboratoarele de chimie trebuie să fie dotate obligatoriu cu: a.nisă b.ventilatie c.extinctor d.aer conditionat e. Trusă de prim ajutor 2. Solventii organici se evaporă pe: a. flacără b. plită electric c. baie de apă d. baie de nisip 3. Cu solventii organici se lucrează la o distantă de minim. de orice sursă de flacără a. 1m b. 3m c. 5m d. 10m 9

12 4. Balanta analitică se instalează in: a. camera de primire probe b. camera frigorifică c. laboratorul propriu-zis d. cameră specială in care trepidatiile sunt minime 5. Solutiile de reactivi se prepară in: a. cilindru gradat b. pahar Berzelius cotat c. balon cotat 6. Concentratia normală reprezintă: a. număr de moli de substantă in 1000 ml solutie b. cantitatea de substantă dizolvată in 100 g de solutie c. număr de echivalenti dizolvati in 1000 ml de solutie 7. Cât hidroxid de sodiu trebuie cântărit pentru a obtine 250 ml solutie 10% NaOH? a.5 g b. 30g c. 25g d. 60g 8. Pentru a prepara 500 ml solutie NaOH 0,3N avem nevoie de: a. 120 gnaoh b. 6 g NaOH c. 40g NaOH d. 12 g NaOH 9. Pentru a prepara 300 ml NaCl 2M trebuie să cântărim: a. 58,5g NaCl b. 117 g NaCl c. 11,7 g NaCl d. 35,1 g NaCl 10. Câti ml de HCl sunt necesari pentru a prepara 250 ml HCl de concentratie 1M, folosind HCl 36% cu densitatea 1,183g/cm 3? a. 18,56 ml b. 21,43 ml c. 56,71 ml d. 33,11 ml 10

13 11

14 LABORATOR 2. Metode de analizǎ folosite în biochimie După caracteristicile lor, metodele de analiză pot fi: calitative, atunci când se execută numai identificări de substanţă sau se evidenţiază însuşiri fizico-chimice ale acestora şi cantitative, atunci când se execută determinări evaluate prin măsurare şi exprimate în unităţi de masură. Metodele cantitative se împart în trei mari grupe: metode gravimetrice, volumetrice si fizico-chimice Metodele gravimetrice al căror principiu se bazează pe cântăriri analitice Metodele volumetrice se bazează pe măsurări de volume, de exemplu reacţiile de titrare Metodele fizico-chimice la care determinările se bazează pe evidenţierea unor însusiri fizico-chimice specifice substanţei care se analizează, care permit evaluarea cantitativă. Aceste metode se împart în: Metode optice: - Colorimetrice - Fotometrice - Spectrofotometrice - Flamfotometrice - Refractometrice - Polarografice Metode de separare metode cromtografice Metode electrochimice - Electroforetice 12

15 - Potenţiometrice - Conductometrice Metode optice a. Metodele colorimetrice reprezintă metodele de analiză care se bazează pe compararea vizuală a intensităţii coloraţiei soluţiilor de concentraţii diferite cu cea a unei soluţii standard. Aceste analize prezintă avantajul că necesită cantităţi mici de substanţă şi un timp relativ redus în comparaţie cu analizele chimice. b. Metoda fotocolorimetrică se bazează pe fenomenul efectului fotoelectric (fotoefect), adică fenomenul de desprindere a electronilor din atomii substanţei sub influenţa fluxului luminos. Celulele fotoelectrice transformă energia luminoasă în energie electrică. Fotocurentul care ia naştere este proporţional cu intensitatea I a radiaţiei şi se măsoară cu un galvanometru de sensibilitate mare. Inlocuirea ochiului observatorului cu celule fotoelectrice elimină erorile subiective. c.metoda spectrofotometrică se bazează pe determinarea coeficientului de extinţie a soluţiei la diferite lungimi de undă. Fig. Spectrofotometru Pe baza raportului dintre lungimea de undă şi capacitatea de percepere a ochiului omenesc radiaţiile luminoase se împart în trei categorii: radiaţii vizibile, a căror lungime de undă se situează în domeniul nm; radiaţii ultraviolete, cu lungimea de undă mai mică de 400nm; radiaţii infraroşii, cu lungimea de undă mai mare de 760nm. Lungimile de undă corespunzătoare spectrului vizibil sunt redate în următorul tabel. 13

16 Culoarea Violet Albastru Verde Galben Portocaliu Roşu Domeniul lungimilor de undă nm nm nm nm nm nm d.metoda flamfotometrică (fotometria cu flacără) este una din metodele de analiză cantitativă de interes deosebit pentru laboratoarele de biochimie. Este o metodă de analiză rapidă, precisă şi necesită o aparatură relativ simplă. Are o aplicabilitate practică limitată îndeosebi la metalele alcaline şi alcalino-pământoase. Fig. Flamfotometru principiu de functionare si aparat Fotometria cu flacără se bazează pe înregistrarea spectrelor de emisie ale diferitelor elementelor excitate în flacără cu ajutorul unei celule fotoelectrice. Fiecare element are o radiaţie specifică numită bandă spectrală de emisie. Majoritatea atomilor posedă o bandă de emisie principală şi mai multe benzi secundare. Benzile individuale ale diferitelor elemente se pot suprapune cum este cazul sodiului şi calciului, la aproximativ 590nm. 14

17 e.refractometria se bazează pe fenomenele de refracţie sau de reflecţie totală a unui fascicol de radiaţii luminoase la limita de separaţie dintre două medii cu indici de refracţie diferiţi. f.polarimetria constituie o metodă analitică cu ajutorul căreia se masoară deviaţia luminii polarizate produse de substanţele optic active şi pe această bază se determină concentraţia lor. Lumina polarizată se obţine trecând lumina naturală prin prisme speciale, numite nicoli, care au proprietăţi birefringente. Caracteristica substanţelor optic active o constituie disimetria moleculară datorată carbonului asimetric. Rotaţia luminii polarizate se poate face spre dreapta, caz în care unghiul de rotaţie se notează cu (+), sau spre stânga (-). Polarimetre Pentru o anumită lungime de undă, unghiul de rotaţie specifică a unei substanţe aflate sub formă de soluţie, este proporţional cu grosimea stratului traversat şi cu concentraţia ei. Constanta de proporţionalitate specifică fiecărei substanţe se numeşte unghi de rotaţie specifică şi se notează cu (α)d 20, unde 20 reprezintă temperatura la care se face citirea, iar D, linia sodiului (ca sursă de lumină, aparatele sunt echipate cu lămpi de sodiu). In practica, polarimetria se foloseşte pentru determinarea concentraţiei unor glucide cu ajutorul aparatelor numite polarimetre. Fiecare substanţă optic activă are un unghi specific de rotaţie, în condiţii determinate de lucru. In tabelul următor sunt trecute valorile unghiului de rotaţie specifică a unor glucide de importanţă biologică. Substanţa (α)d 20 Substanţa (α)d 20 Glucoză Lactoză Fructoză Manoză Galactoză Arabinoză Maltoză Xiloză Zaharoză Celobioză

18 Metode de separare - Metode cromatografice Permit separarea substanţelor dintr-un amestec pe baza capacităţii de distribuţie între o fază staţionară şi una mobilă având ca urmare deplasarea cu viteză diferită a componentelor purtate de faza mobilă de-a lungul fazei staţionare. Metodele cromatografice se pot clasifica după starea de agregare a fazei staţionare şi mobile şi după fenomenul de absorbţie sau de repartiţie între două faze nemiscibile în: cromatografie pe hârtie cromatografie în strat subţire cromatografie pe coloană de sephadex cromatografie în fază gazoasă lichid cromatografia a.cromatografia pe hârtie are loc o repartiţie a substanţelor ce se separă între stratul de lichid polar (apă) aderent de hârtie şi faza mobilă (organică), nemiscibilă cu apa. Deci, este o cromatografie de repartiţie de tip lichid-lichid. Ca suport se utilizează hârtia cromatografică Whatman, Schleicher-Schűll, etc. -Pentru aplicare se pot folosi siringi, micropipete, pipete Pasteur. -Developarea se face în aparate speciale de sticlă, care să asigure o atmosferă închisă. -Soluţiile developante sunt specifice substanţelor ce se cercetează. După developare şi uscare la aer a cromatogramelor, acestea se pulverizează uniform cu o soluţie revelatoare cu compoziţie specifică substanţelor ce se cercetează. Se usucă din nou la aer, apoi se expun la etuvă, la temperatura de ºC pentru evidenţierea spoturilor. Fig. Cromatografia pe hartie Pentru identificare se pot folosi două procedee: prin comparare cu standardele de referinţă preparate din substanţe cunoscute cu ajutorul factorului de retenţie numit Rf 16

19 Rf-ul se defineşte ca fiind raportul dintre distanţa parcursă de substanţa separată prin cromatografie şi distanţa parcursă de solvent. Deci, pentru calcularea Rf-ului se măsoară pe de o parte distanţa de la punctul de start până la linia de migrare a solventului (L), iar pe de de altă parte distanţa de la punctul de start până la centrul geometric al spotului substanţei respective (l). R f =l / L Valoarea Rf-ului este totdeauna subunitară şi în aceleaşi condiţii de lucru fiecare substanţă are un Rf cu valoare absolut specifică. Pentru evaluarea cantitativă, fiecare spot identificat se decupează, eluează şi se supune determinării fotometrice faţă de un standard de referinţă cu concentraţie cunoscută. In biochimie, cromatografia pe hârtie are multiple domenii de aplicare, dar se foloseşte în special pentru separarea, identificarea şi determinarea aminoacizilor şi a substanţelor glucidice. b. Cromatografia în strat subţire este asemănătoare cromatografiei pe hârtie cu deosebirea că în locul hârtiei se folosesc plăci de sticlă acoperite cu un strat adsorbant, uniform distribuit, de grosime prestabilită, din silicagel sau alt material asemănător. Prezintă avantajul unei mai bune separări a compuşilor din amestec şi a unei foarte bune reproductibilităţi. Metoda poate fi utilizată şi în cazul unor substanţe developante care ar ataca hârtia cromatografică. Fig. Cromatografia in strat subtire 17

20 c. Cromatografia pe coloană de sephadex. Principiul este asemănător cu al cromatografiei pe hârtie sau în strat subţire cu deosebirea că suportul şi faza staţionară sunt introduse într-o coloană cilindrică de sticlă. Substanţele din amestec sunt purtate de faza mobilă de-a lungul fazei staţionare, distribuindu-se în mod specific, în funcţie de capacitatea lor de migrare, în acest fel realizându-se separarea lor. Cromatografia pe coloane Sephadex-ul este o substanţă hidrofilă de tipul dextran-ului, care are proprietatea de a se îmbiba foarte repede cu apă, formând geluri poroase. Aceste geluri sunt formate din macromolecule filiforme, legate între ele încrucişat, formând o reţea tridimensională care se comportă ca o adevărată sită moleculară. Efectul acestei site este acela că modelează viteza de parcurgere a ei de către substanţe în funcţie de masa lor moleculară. Metoda se foloseşte pentru separarea diferitelor fracţiuni proteice, inclusiv pentru separarea şi purificarea enzimelor, acizilor nucleici, polipeptidelor, aminoacizilor, precum şi a unor polizaharide. c.cromatografia în fază gazoasă reprezintă una din cele mai perfecţionate tehnici cromatografice cunoscute până în prezent, cu ajutorul căreia se determină substanţele dintr-un amestec, în domeniu nanogramelor. Faza mobilă este alcătuită dintr-un gaz purtător, iar faza staţionară este formată din substanţe specifice care sunt lichide la temperatură înaltă şi care sunt fixate de un suport inert pulverulent. Complexul de substanţe care alcătuiesc faza staţionară sunt introduse într-o coloană lungă şi îngustă, din sticlă, alcătuind aşa-numita umplutură de coloană. Extractul din proba de cercetat purificat printr-o tehnică specială se injectează în partea superioară a coloanei de unde este preluat de gazul purtător şi vehiculat de-a lungul fazei staţionare. In funcţie de structura lor chimică componentele amestecului 18

21 străbat coloana cu viteze diferite, deci, se separă unele de altele. La extremitatea opusă a coloanei există un sistem de detecţie care semnalizează ieşirea din coloană a fiecărui element. Intensitatea semnalelor emise este proporţională cu concentraţia fiecărei substanţe, ceea ce permite evaluarea cantitativă. Semnalele transmise de detector sunt amplificate, apoi se înregistrează grafic sub forma de picuri a căror înalţime sau arie e proporţională cu concentraţia. Identificarea şi evaluarea cantitativă se fac cu ajutorul standardelor de referinţă cu concentraţie cunoscută. d. Cromatografie de lichide de înaltă performanţă - Metoda se bazează pe acelaşi principiu ca şi celelalte metode cromatografice şi anume repartizarea diferită a componentelor unui amestec de substanţe între o fază staţionară şi o fază mobilă. Deosebirea majoră între această metodă şi cromatografia de gaz este aceea că faza mobilă este lichidă şi nu gazoasă. În plus, faza mobilă nu are un simplu rol de cărăuş ci participă activ la procesul de separare datorită unor interacţiuni complexe Metode electrochimice a.electroforeza este tehnica analitică ce are la bază capacitatea particolelor încărcate electric dintr-o soluţie coloidală de a migra spre polul (+) sau (-) atunci când prin mediul respectiv trece un curent electric. Mai exact, dacă într-un mediu se găsesc particole încărcate electric, pozitiv sau negativ, şi dacă în mediul respectiv se creează un câmp electric între doi electrozi sub tensiune, atunci particolele migrează către electrodul de semn contrar. Viteza de migrare e condiţionată de mai mulţi factori, dar în primul rând de mărimea încărcăturii electrice a fiecărei particole. In aceleaşi condiţii de lucru (ph, temperatură, intensitatea câmpului electric, natura suportului) viteza de migrare a substanţelor dintr-un amestec e diferită în funcţie de natura fiecărei substanţe. In practica de laborator, electroforeza se utilizează în special pentru separarea fracţiunilor proteice din lichidele biologice sau din extractele de ţesuturi, ulterior fiind posibilă identificarea şi evaluarea lor cantitativă. b.metodele potenţiometrice se bazează pe determinarea concentraţiei ionilor din soluţie măsurând valoarea sau variaţia potenţialului unui electrod indicator. Aceste metode pot fi: directe (ph-metria) indirecte (titrări potenţiometrice) 19

22 ph-ul se defineşte ca fiind logaritmul cu semn schimbat al concentraţiei ionilor de hidrogen dintr-o soluţie. Se exprimă prin valori cuprinse între Valoarea 7 corespunde mediului neutru Valorile mai mici decât 7 corespund mediului acid Valorile mai mari decât 7 corespund mediului bazic (alcalin) ph-ul are o importanta deosebita in desfasurarea reactiilor biochimice din organism. In mediul biologic, valoarea constantă a ph este Determinarea ph-ului se poate face prin metoda cu hârtie indicator, metoda cu soluţie indicatoare, dar pentru determinarea exactă a ph-ului se foloseşte metoda potenţiometrică ph-metria. hârtie de ph ph-metru Principiul metodei constă în măsurarea diferenţei de potenţial electric între un electrod de referinţă şi un electrod de măsurare introduşi în soluţia de cercetat şi exprimarea acesteia sub formă de unităţi de ph. Aparatele folosite se numesc ph-metre. Pentru etalonarea lor se folosesc soluţii tampon. Acetea sunt formate din soluţii în care solvatul este alcătuit din două sau mai multe substanţe chimice, care prin particularitătile lor se opun la schimbarea ph-ului atunci când variază concentraţia ionilor de hidrogen. Exemple de sisteme tampon: Sistemul tampon constituit dintr-un acid slab şi sarea lui cu o bază tare acid acetic, acetat de sodiu Sistem tampon constituit dintr-o bază slabă şi sarea ei cu un acid tare hidroxid de amoniu, clorură de amoniu Sistemele tampon îndeplinesc un rol biochimic esenţial în organism pentru că ele asigură menţinerea ph-ului în limite fiziologice specifice vieţii. 20

23 c. Conductometria cuprinde metode de analiză bazate pe determinarea conductibilităţii soluţiilor. Conductibilitatea soluţiilor de electroliţi se datorează deplasării sarcinilor electrice (ionilor) sub influenţa unui gradient de potenţial realizat cu ajutorul a doi electrozi. Există o dependenţă lineară între concentraţia unui ion din soluţie şi contribuţia acestui ion la conductibilitatea totală a soluţiei. TEST 1. Ce este cromatografia? Daţi exemple de diferite tipuri de cromatografie. 2. Precizaţi care este metoda cea mai des utilzată în biochimia analitică cantitativă 3. Care sunt cele 3 categorii în care se împart radiaţiile luminoase, pe baza raportului între lungimea de undă şi capacitatea de percepere a ochiului omenesc? 4. Ce este ph-ul? Indicaţi două metode de determinare a ph-ului. 5. Ce determinări se realizează cu ajutorul metodelor refractometrice? 6. Ce sunt soluţiile tampon? 21

24 Laborator 3-4.Glucide Glucidele sunt substanţe naturale universal răspândite în organismele vegetale şi animale. Au rol structural şi energetic, reprezentând combustibilul principal al tuturor organismelor. De exemplu, pentru un adult furnizează 60% din energia necesară. Glucidele sunt substanţe cu funcţiuni mixte, care conţin în molecula lor grupări carbonilice şi hidroxilice, ele fiind polihidroxialdehide sau polihidroxicetone. In funcţie de complexitatea structurală glucidele se clasifică în două categorii: Oze denumite şi monozaharide sunt compuşi la care hidroliza acidă sau enzimatică nu conduce la compuşi mai simpli care să păstreze totuşi proprietăţile grupului. Ozide sunt glucide care prin hidroliza acidă sau enzimatică pun în libertate una sau mai multe molecule de monozaharide. In funcţie de moleculele care rezultă în urma hidrolizei, ozidele se împart în: - Holozide - care conţin în structura lor monozaharide - Heterozide care sunt constituite din monozaharide şi o componentă neglucidică numită aglicon. Reacţiile chimice folosite pentru identificarea şi dozarea glucidelor, sunt reacţii de culoare, condensare, deshidratare, oxido-reducere, hidroliză, etc. 22

25 Extragerea glucidelor din produsele alimentare Extragerea monoglucidelor şi a oligoglucidelor din produsele alimentare se poate realiza prin presare sau prin extracţia produsului respectiv cu anumiţi solvenţi. Extracţia prin presare Se aplică produselor alimentare cu conţinul mare de apă şi glucide solubile. In urma presării se obţine un suc care conţine glucide solubile. Acest suc se utilizează la dozarea glucidelor prin metode refractometrice şi densitometrice. Rezultatele acestor măsuratori sunt orientative deoarece în sucul obţinut pot exista şi alte substanţe solubile în apă. Extracţia cu solvenţi specifici Această metodă este folosită frecvent în scopuri analitice şi industriale. Solvenţii utilizaţi sunt: apa la 75-80ºC sau etanolul la temperatura de fierbere. a). Extracţia apoasă la cald cu defecare Extractul primar obţinut prin această metodă are un grad de puritate mai mare decât prin presare, deoarece prin procesul de defecare se îndepărtează substanţele neglucidice cu ajutorul unor reactivi numiţi defecanţi. (In latină, termenul de defecare înseamnă desfacere, purificare). b). Extracţia alcoolică Metoda se foloseşte pentru produsele cu conţinut ridicat de amidon sau în scopuri microanalitice. Amidonul este insolubil în etanol şi în felul acesta se înlătură posibilitatea antrenării sale în extract. In cazul microanalizei glucidelor se aplică extracţia alcoolică, deoarece etanolul are un rol dublu: de extractant şi de defecant. Extractul alcoolic poate fi tratat cu schimbător de ioni pentru a scoate eventualii anioni şi cationi existenţi în extract sau poate fi tratat cu cărbune activ pentru înlăturarea pigmentilor solubili în etanol. 23

26 3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul Refractometrie este metoda pentru determinarea indicelui de refractie "n", sau a refractiei molare Rm.Analiza refractometrica este utilizata pentru a determina concentratiei unuei substante dintr-o solutie in functie de indicele de refractie. Metoda refractometrica se aplica pentru determinarea concentratiilor solutiilor în industria zaharului, conserve vegetale, produse zaharoase, glucoza, etc.; determina substanta uscata solubila si concentratia de zahar daca în extractul solubil al unui produs alimentar predomina zaharurile iar nezaharul este constant. Refractometria se utilizeaza si pentru determinarea indicelui de refractie al grasimilor, respectiv pentru determinarea continutului de grasime al unui produs alimentar. Se numeşte indice de refracţie raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase faţă de verticala (α) şi sinusul unghiului de refracţie (β). Indicele de refracţie=sin α/sin β Indicele de refracţie Indicele de refracţie este o constantă specifică fiecărei substanţe. Valoarea lui depinde de cantitatea, mărimea şi structura fizică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se poate determina concentraţia unei soluţii şi astfel se poate stabili procentul de substanţă uscată sau de apă. Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind refractometrul Abbé. Indicele de refracţie este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca determinările să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometrele sunt cuplate de obicei cu baie ultratermostatată. 24

27 Tipuri de refractometre: Se numeşte indice de refracţie raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase faţă de verticala (α) şi sinusul unghiului de refracţie (β). Indicele de refracţie=sin α/sin β Indicele de refracţie Indicele de refracţie este o constantă specifică fiecărei substanţe. Valoarea lui depinde de cantitatea, mărimea şi structura fizică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se poate determina concentraţia unei soluţii şi astfel se poate stabili procentul de substanţă uscată sau de apă. Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind refractometrul Abbé. Indicele de refracţie este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca determinările să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometrele sunt cuplate de obicei cu baie ultratermostatată. Modul de lucru pentru refractometrul Abbe-Zeiss 1. Se depărtează prismele una de alta, se spală suprafaţa cu alcool şi se lasă să se usuce. 25

28 2. Cu o pipetă se pun câteva picături din lichidul de studiat pe suprafaţa prismelor, după care se închide blocul prismelor. 3. Cu ajutorul oglinzii se îndreaptă fasciculul luminos către prisme. 4. Privind prin luneta din dreapta se pune la punct imaginea firelor reticulare prin învârtirea ocularului. Apoi se caută domeniul de separaţie dintre câmpul luminos şi întunecat învârtind butonul din stânga. Dacă în câmpul lunetei se observă o figură neregulată, înseamnă că lichidul nu a acoperit întreaga suprafaţă a prismei. În acest caz se mai pun câteva picături de lichid, până când domeniul luminos şi cel întunecat sunt separate printr-o linie dreaptă. 5. Cu butonul din stânga se aduce încrucişarea firelor reticulare în suparapunere cunlinia de separaţie. Cu lupa din stânga se citeşte pe scala gradată direct indicele de refracţie IR al lichidului 6. Se repetă măsurătorile de cel puţin 3 ori. Date experimentale: Nr Repetitii/medie IR Conc SU probei. solubila in apa 1 R1 R2 R3 M 2 R1 R2 R3 M 3 R1 R2 R3 M 26

29 3.2.Determinări cantitative ale glucidelor Determinarea glucidelor reducătoare cu ajutorul reacţiei Fehling Reacţia Fehling poate servi şi pentru determinarea cantitativă a glucidelor reducătoare. Pentru aceasta trebuie să determinăm titrul soluţiei Fehling, adică corespondenţa în glucoză sau alt glucid reducător al reactivului Fehling, cu care se lucrează. Prin titrul soluţiei Fehling se înţelege cantitatea de glucoză exprimată în miligrame, care reduce amestecul format din 10ml soluţie Fehling I+ 10ml soluţie Fehling II. Determinarea titrului soluţiei Fehling. Se cântareşte 1g glucoză pură, uscată în prealabil la 100ºC şi se dizolvă într-un balon cotat de 100ml, completându-se la semn cu apă distilată. Intr-un flacon Erlenmeyer se pun exact 10ml reactiv Fehling I şi 10ml reactiv Fehling II şi se adaugă 10-20ml apă distilată.flaconul se încălzeşte până la fierbere pe o sită de azbest şi se adaugă din biuretă soluţie de glucoză picătură cu picătură, până când soluţia va deveni incoloră şi se observă depunerea unui precipitat roşu-cărămiziu, care se depune pe fundul vasului. Dacă se depăşeşte punctul de viraj soluţia va deveni galbenă din cauza caramelizării glucozei şi reacţia trebuie repetată. Este bine ca reactivul Fehling să fiarbă tot timpul, glucoza să se adauge numai în picături şi titrarea să se facă cât mai repede. Titrul soluţiei Fehling =N 10 mg N= nr.ml de glucoză utilizaţi In cazul determinării glucidelor din soluţii necunoscute se procedează la fel ca şi în cazul stabilirii titrului, cu deosebire că în biuretă se pune soluţia de cercetat. unde: Glucoză mg =Titrul solutiei Fehling 1000/ N 1 N 1 = numarul de ml utilizaţi din soluţia de glucidă necunoscută Calcule si observatii 27

30 28

31 3.2.2.Determinarea glucidelor prin metoda Schrool Determinarea zahărului reducător dupa această metodă este mult mai rapidă, nu necesită aparatura specială (filtru G 4 ) însă este mai puţin exactă decât metoda Bertrand. Prin această metodă, cantitatea de oxid cupros formată se determină indirect, prin dozarea iodometrică a sulfatului de cupru existent în soluţia Fehling, înainte şi după reducere. Diferenţa obţinută reprezintă cantitatea de cupru redusă de către zahăr. Reacţiile chimice care au loc sunt următoarele: 2 CuSO KI = 2 CuI + 2 K 2 SO 4 + I 2 I 2 + Na 2 S 2 O 3 = 2 NaI + Na 2 S 4 O 6 Reactivi necesari: - soluţie Fehling I - soluţie Fehling II - tiosulfat de sodiu 0,1N - iodură de potasiu 10% - acid sulfuric, d=1,11 - amidon solubil 1% Mod de lucru: Intr-un balon Erlenmeyer de 300ml se introduc 10ml soluţie Fehling I, 10ml soluţie Fehling II şi 20ml din soluţia de analizat. Balonul se încălzeşte pe sită de azbest, reglându-se astfel flacăra becului încât soluţia să fiarbă după trei minute. Se fierbe două minute, se răceşte apoi soluţia în curent de apă după care se adaugă 20ml soluţie de iodură de potasiu şi 15ml acid sulfuric. Se titrează iodul pus în libertate, prin reducerea cuprului în iodură cuproasă, cu Na 2 S 2 O 3 0,1N în prezenţa amidonului ca indicator. Titrarea se continuă până la dispariţia culorii albastre. Se face o probă martor pentru stabilirea titrului cantităţii de cupru din cei 10ml soluţie Fehling. Proba martor se lucrează în aceleaşi condiţii ca şi proba de analizat, cu diferenţa că în locul soluţiei de zahăr se adaugă 20ml apă distilată. Cantitatea de cupru redusă de către zahăr se află în funcţie de cantitatea de tiosulfat de sodiu 0,1N folosită la titrare, pe baza relaţiei : V =V1 V2 în care V = ml Na 2 S 2 O 3 0,1N corespunzător zahărului care se găseşte în proba de analizat, in ml V1 = ml tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei martor, în ml V2 = ml de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei de analizat în ml 29

32 Soluţia de Na 2 S 2 O 3 0,1N ml Determinarea zahărului invertit şi glucozei după Schoorl Cupru mg Glucoză mg Zahăr Invertit mg 6,4 3,2 3,2 12,7 6,3 6,4 19,1 9,4 9,7 25,4 12,6 13,0 31,8 15,9 16,4 38,2 19,2 19,8 44,5 22,4 23,2 50,9 25,6 26,5 57,3 28,9 29,9 63,6 32,3 33,4 70,0 35,7 36,8 76,3 39,0 40,3 82,7 42,4 43,8 89,1 45,8 47,3 95,4 49,3 50,8 101,8 52,8 54,3 108,1 56,3 58,0 114,4 59,8 61,8 120,8 63,3 65,5 127,2 66,9 69,4 133,5 70,7 73,3 139,8 74,5 77,2 146,2 78,5 81,2 152,6 82,6 85,2 159,0 86,6 89,2 Cantitatea de zahăr analizată, corespunzătoare volumului V de tiosulfat de sodiu se află cu ajutorul unui tabel, exprimarea fiind în zahăr invertit sau glucoză. Calcul şi observaţii 30

33 31

34 4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianură de potasiu Lactoza din lapte este unul din componentele extractului uscat total reprezentând aproximativ 35%. Lactoza este un compus instabil suferind fermentaţii sub infuenţa microorganismelor prezente în lapte. Pentru determinarea lactozei din lapte se folosesc mai multe metode chimice (metoda Bertrand, varianta Elser, metoda cu fericianurӑ de potasiu), sau se folosesc metode instrumentale (metoda polarimetricӑ). Lactoza, reduce în mediu alcalin şi la cald, fericianura de potasiu K 3 [Fe(CN)6] în ferocianură de potasiu, K 4 [Fe(CN)6], ceea ce va duce la decolorarea soluţiei galbene de fericianură. Reactivi necesari : - sulfat de cupru, soluţie saturată - soluţie alcalină de fericianură de potasiu: se dizolvă 23g fericianură de potasiu în cca.400ml apă, iar în alt pahar 23g hidroxid de potasiu tot în cca. 400ml apă. Cele două soluţii se trec în balon cotat de 1000ml, se completează cu apă la semn şi se omogenizează. - soluţie standard de lactoză: 5g lactoză se aduc cu apă în balon cotat de 1000ml, se completează la semn şi se omogenizează.1ml din această soluţie conţine 5mg lactoză. Mod de lucru Stabilirea titrului soluţiei de fericianură de potasiu : Intr-un vas Erlenmeyer se introduc 10ml soluţie alcalină de fericianură de potasiu, peste care se adaugă 30ml apă distilată şi se aşează pe sita de azbest, iar deasupra lui se potriveşte biureta cu soluţie standard de lactoză. Se porneşte flacăra şi când începe fierberea se picură soluţie de lactoză din biuretă agitând flaconul după fiecare picătură, până în momentul în care culoarea galbenă dispare brusc. Ritmul de picurare trebuie să fie rar,iar soluţia din vas în continuă fierbere moderată. Titrul soluţiei de fericianură de potasiu exprimat în numărul de mg lactoză necesar pentru a reduce 1ml soluţie de fericianură, se stabileşte cu ajutorul formulei : T = V x5 / 10 în care : V = volumul soluţiei de lactoză folosit, în ml 5 = conţinutul de lactoză, în mg, corespunzător la 1ml soluţie 10 = volumul soluţiei de fericianură folosit,în ml 32

35 Determinarea: Intr-un balon cotat de 100ml se introduc 10ml lapte peste care se adaugă cca. 40ml apă şi se omogenizează. Adӑugӑm 1 ml soluţie saturatӑ de CuSO 4, (0,5 ml solutie saturata de fericianura de potasiu). Amestecul se agitӑ de 3-4 ori şi se completeazӑ cu apa pâna la semn, dupa care se lasӑ 5 minute în repaus. După un repaos de 5 minute se filtrează prin filtru cutat şi se obţine un lichid clar de culoare slab albăstruie. Pentru a îndepărta excesul de sulfat de cupru adăugăm 0,5-1,0g pulbere de zinc, se omogenizează şi se filtrează din nou. Astfel se obţine un lichid incolor şi perfect limpede. Filtratul se introduce în biuretă şi se procedează în continuare ca la stabilirea titrului soluţiei de fericianură. Calculul rezultatelor a. Calcul Titru b. Calcul continut lactoza Conţinutul de lactoză din lapte, exprimat în g la 100ml, se calculează astfel : Lactoză, g la 100ml = (Tx10x10 /V x1000)x 100 în care : T = titrul soluţiei de fericianură de potasiu 10 = volumul soluţiei de fericianură de potasiu luat în lucru,în ml 10 = raportul între volumul balonului cotat (50 ml) şi laptele luat în lucru (5 ml) V = volumul de filtrat folosit, în ml 1000 = factor de transformare mg în g 100 = factor de exprimare pentru 100ml lapte 33

36 Interpretarea rezultatului Continutul în lactoza al laptelui de vaca este în medie 4,55%. Cantitatea de lactoza din lapte scade în cazul falsificӑrii laptelui cu apa precum si în cazul modificarilor inflamatorii ale glandei mamare. Laptele cu aciditate de peste 21ºT nu se preteazӑ pentru determinarea lactozei. În acest caz se vor obtine valori mai mici decât cele pentru laptele proaspӑt deoarece procesele fermentative se desfӑşoarӑ în primul rând pe seama lactozei. Test 1. Care este rolul glucidelor în organism? 2. Cum se pot extrage glucidele din produsele alimentare? 3. Daţi exemplu de reacţie de reducere, care permite identificarea şi determinarea cantitativă a glucidelor reducătoare. 4. Ce monoglucide rezultă în urma hidrolizei lactozei? 5. Care este substanţa de baza din reactivul Fehling? 34

37 Laborator 5-6. Lipide 5.1.Determinarea principalilor indici la grăsimi Determinarea punctului de topire Valoarea punctului de topire al grăsimilor este în strânsă corelaţie cu natura şi proporţia acizilor graşi din structura lor chimică. Astfel, grăsimile care conţin şi acizi graşi saturaţi inferiori de tipul acizilor butiric, caproic, caprilic, care la temperatura camerei sunt lichizi sau semilichizi, vor avea consistenta mai moale decât alte grăsimi, cum este cazul grăsimii laptelui. Invers, grăsimile în structura cărora predomină acizii graşi saturaţi superiori de tipul acidului stearic vor avea consistenţa mult mai fermă, cum este cazul seului de rumegătoare. Toţi acizii graşi nesaturaţi sunt lichizi la temperatura de 20 C. Exemplul cel mai evident îl constituie uleiurile vegetale, la care proporţia de acizi graşi nesaturaţi este de 60%. Pentru că grăsimea fiecărei specii are o structură chimică specifică şi valoarea punctului de topire va fi relativ specifică. Punctul de topire poate fi socotit ca indicator util pentru stabilirea speciei de la care provine grăsimea supusă analizei. Valoarea punctului de topire este dată de temperatura corespunzătoare momentului în care grăsimea introdusă într-un tub capilar şi încălzită lent, se clarifică brusc. Materiale necesare: - tuburi capilare din sticlă, uniform calibrate, bine degresate şi uscate, cu diametrul interior de 1mm şi lungimea de 15 mm. - termometru cu mercur de C, gradat din 0,1 în 0,1 C - pahar Berzelius de 100ml - stativ cu clemă pentru suspendarea termometrului 35

38 - glicerină - plită electrică sau bec de gaz Mod de lucru : Intr-un creuzet mic de porţelan se introduc câteva grame de grăsime şi se încălzeşte uşor până la topire completă. In acest moment, cu ajutorul unei pense, se introduc în creuzet două tuburi capilare care se vor umple complet cu grăsime topită.se lasă apoi creuzetul în repaos pentru răcire şi închegarea grăsimii. Se scot cele două tuburi capilare şi se curăţă de grăsimea aderentă la suprafaţa lor externă. Coloana de grăsime din interiorul capilarelor trebuie să fie compactă şi să ocupe tot lumenul acestora. Cu ajutorul unui inel subţire de cauciuc se fixează cele două capilare de o parte şi alta a rezervorului cu mercur al termometrului şi termometrul astfel pregătit se introduce la congelatorul frigiderului unde se ţine 24 de ore Paharul Berzelius umplut cu glicerină se trece pe plita electrică sau pe sita de azbest şi în el se suspendă termometrul cu cele două tuburi capilare. Termometrul se fixează cu ajutorul unei cleme în poziţie perfect verticală, în aşa fel încât să se ocupe centrul geometric al masei de glicerină din pahar, iar tuburile capilare la rândul lor să fie în poziţie perfect verticală. Fig. Instalaţie pentru determinarea punctului de topire a grăsimii Se acţionează căldura şi se urmăreşte temperatura pe scala gradată a termometrului şi aspectul grăsimii din cele două tuburi capilare. Incălzirea trebuie să fie lentă, încât viteza de creştere a temperaturii să înregistreze un ritm de 2-3 C/ minut. In preajma punctului de topire coloana de grăsime din capilare începe să se clarifice de la exterior spre interior. In momentul în care s-a realizat clarificarea completă se citeşte valoarea temperaturii. In acest moment o bulă de grăsime se va profila brusc la capătul superior al tubului capilar, ca urmare a alunecării coloanei de grăsime topită împinsă de 36

39 presiunea de jos în sus a glicerinei din pahar. Aproape instantaneu picătura de grăsime se desprinde de capătul tubului capilar şi se ridică la suprafaţa stratului de glicerină Determinarea indicelui de iod Dublele legături ale acizilor graşi nesaturaţi din compoziţia grăsimilor conferă acestora caracter de instabilitate chimică, ce se traduce şi prin capacitatea lor de a adiţiona uşor halogeni la nivelul acestor duble legături. Indicele de iod este cantitatea de iod, în grame, adiţionată de 100g grăsime.valorea acestui indice este condiţionată de natura şi proprţia acizilor gra6si nesaturaţi (adică de numărul dublelor legături) din compoziţia grăsimilor. Grăsimile care au un conţinut mic de acizi graşi neasturaţi vor avea indicele de iod cu valoare mai mică (grăsimile animale în general), iar cele care au un conţinut mare de acizi graşi nesaturaţi, vor avea un indice de iod cu valoare mare (uleiurile) De exemplu, untul de vacă are un indice de iod cuprins între ; untura de porc între ; uleiul de floarea soarelui intre Indicele de iod constituie un criteriu pentru aprecierea purităţii grăsimii. In condiţii specifice de lucru, se tratează o cantitate dată de grăsime cu o soluţie de iod de concentraţie cunoscută, apoi se titrează excesul de iod cu o soluţie echivalentă de tiosulfat de sodiu. Cantitatea de iod adiţionată se calculează din diferenţă. Reactivi necesari : - cloroform sau tetraclorură de carbon - reactiv Hanus (monobromură de iod) - iodură de potasiu, soluţie 15% proaspăt preparatӑ - tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1N - amidon, soluţie 1%, proaspăt preparată Mod de lucru: Cantitatea de grăsime care se ia în lucru, se va corela cu indicele de iod probabil al acesteia după cum urmează: - 1,0g, pentru indicele de iod cuprins între ,6g, pentru indicele de iod cuprins între ,25g, pentru indicele de iod cuprins între ,15g, pentru indicele de iod mai mare de 120 Intr-un flacon Erlenmeyer de 300ml cu dop rodat, se cântăreşte la balanţa analitică grăsimea în prealabil topită. Se adaugă apoi 10ml cloroform, 25ml reactiv Hanus şi se lasă la întuneric minute, funcţie de valoarea indicelui de iod. Se adaugă apoi 20ml iodură de 37

40 potasiu, şi 100ml apă distilată, apoi se titrează repede cu tiosulfat de sodiu. Spre sfârşitul titrării, când culoarea soluţiei se deschide la galben, se adaugă 3-5 picături soluţie de amidon; soluţia se colorează în albastru. Se continuă titrarea agitând mereu, foarte energic, până la dispariţia culorii albastre. In aceleaşi condiţii se face si o probă martor, dar fără grăsime. Calculul rezultatelor : Indicele de iod = 0,01269 (V V 1 ) 100 / m în care: 0,01269 = cantitatea de iod, în g, corespunzătoare la 1ml tiosulfat de sodiu soluţie 0,1N V = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea martor V 1 = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei ce se analizează. m = cantitatea de grăsime, în g, luată în lucru Determinarea indicelui de saponificare Indicele de saponificare exprimă numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru a saponifica total un gram de grăsime. Cu cât este mai mare masa moleculară a gliceridei, respectiv a acizilor graşi, cu atât cantitatea de hidroxid de potasiu necesară saponificării este mai mică.valoarea indicelui de saponificare dă indicaţii asupra constituţiei chimice a grăsimii cercetate. Reactivi necesari: - soluţie alcoolică de hidroxid de potasiu aproximativ 0,5N- se preparӑ dizolvând 32g hidroxid de potasiu în puţină apă şi completând la 1000ml cu alcool de 95ºC - fenolftaleină 1% în alcool 95ºC - acid clorhidric 0,5N Mod de lucru: Intr-un balon de ml se cântăresc 1-2g grăsime la care se adaugă apoi 25ml hidroxid de potasiu alcoolic. Balonul se astupă cu un dop, prin care trece un refrigerent ascendent răcit cu apă, apoi se încălzeşte pe o baie de apă fierbinte minute. După acest timp soluţia din flacon se titrează cu HCl 0,5N. Dacă soluţia este puternic colorată, se diluează cu alcool pentru ca să se poată observa cât mai bine culoarea roşie a fenolftaleinei. Intr-un balon se face o titrare martor cu 25ml de hidroxid de potasiu alcoolic. Diferenţa dintre numărul de ml folosiţi la titrarea soluţiei martor N 1 şi a celor folosiţi la titrarea soluţiei cu grăsime N 2, dă numărul de ml de hidroxid de potasiu întrebuinţaţi la saponificarea grăsimii luată în lucru. 38

41 Din aceştia se calculează apoi numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru saponificarea unui gram de grăsime şi care reprezintă indicele de saponificare. Indicele de saponificare = (N 1 N 2 ) F HCl 28 / G în care: N 1 = volumul de acid clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei martor N 2 = volumul de acid clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei de grăsime 28 = cantitatea de hidroxid de potasiu, în mg, corespunzătoare la 1ml hidroxid de potasiu, G = masa de grăsime Determinarea indicelui de aciditate Indicele de aciditate reprezintă numărul de miligrame de hidroxid de sodiu necesar pentru neutralizarea acizilor graşi liberi dintr-un gram de grăsime. Reactivi necesari : - hidroxid de sodiu 0,1N - fenolftaleină, soluţie alcoolică 2% - amestec alcool-eter 1:1 (un volum alcool etilic 95 C se amestecă cu un volum eter etilic) înainte de folosire se neutralizează cu NaOH 0,1N în prezenţă de fenolftaleină. Mod de lucru : Intr-un pahar Berzelius se cântăresc 5g de grăsime şi se încălzeşte până la topire. Se adaugă 20ml amestec alcool-eter neutralizat faţă de fenolftaleină şi se titrează cu NaOH 0,1N sub agitare continuă, până la apariţia culorii roz care trebuie să persiste 30 de secunde. Calcul : Aciditate, în acid oleic % = 0,0282 V 100 / m în care : 0,0282 = cantitatea de acid oleic, în g, corespunzătoare la 1ml hidroxid de sodiu 0,1N V = volumul soluţiei de hidroxid de sodiu 0,1N, în ml, folosit la titrare m = masa probei luată pentru determinare Indice de peroxid Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de peroxid şi alte substanţe oxidante dintr-o cantitate dată de grăsime, care oxidează iodura de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o soluţie de tiosulfat de sodiu iar exprimarea rezultatelor se face în miliechivalenţi de peroxid la 1 kg produs. Reactivi necesari : - cloroform + acid acetic glacial - iodură de potasiu, soluţie apoasă saturată, proaspăt preparată 39

42 - tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1N şi 0,01N - amidon, soluţie 1%, proaspăt preparată Mod de lucru: Probele de grăsime pentru această determinare se recoltează în borcane brune de sticlă cu dop rodat. Recipientul se umple complet cu grăsime fără a se forma goluri de aer, se închide etanş şi se păstrează la rece şi întuneric pe tot parcursul, până în momentul analizei. Proba se încălzeşte moderat pe baia de apă cu 5-10 C peste punctul de topire al grăsimii, apoi se omogenizează uşor fără a se îngloba aer. Dacă grăsimea topită are un conţinut mare de apă (este pronunţa tulbure) se adaugă cca. 20% sulfat de sodiu anhidru, se omogenizează şi se lasă în repaus pentru decantare. Din stratul clar de la suprafaţă se cântăreşte foarte exact într-un flacon cu dop rodat o cantitate corelată cu indicele probabil de peroxid şi anume. Indicele de peroxid probabil (miliechivalenţi/kg) Până la 19 între între între Cantitatea de grăsime (g) 5 ± 0,05 2,0-1,2 1,5-0,8 0,8-0,5 In flaconul cu grăsime se introduc 10ml cloroform si se omogenizează până la dizolvare. Se adaugă 15ml acid acetic, 1ml soluţie de iodură de potasiu, se închide cu dopul, se agită 1 minut si se lasă în repaus la întuneric exact 5 minute. Se adaugă 75ml apă distilată şi se titreză repede cu soluţie de tiosulfat de sodiu, 0,01N dacă indicele de peroxid este până la 19, sau 0,1N dacă indicele de peroxid este mai mare. Către sfârşitul titrării se foloseşte soluţia de amidon (până la dispariţia culorii albastre). In paralel se efectuează o determinare martor în aceleaşi condiţii dar fără grăsime. Calculul rezultatelor: Indice de peroxid, miliechivalenţi/kg = (V V 1 ) n 1000 / m în care : V = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei V 1 = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea martorului n = normalitatea soluţiei de tiosulfat de sodiu folosită la titrare m= masa probei de grăsime, în g, luată în lucru 40

43 Reacţia Kreis Aldehida epihidrinică se formează în mod constant în procesul de oxidare avansată a grăsimilor. Ea reacţionează cu fluoroglucina în mediu acid, formând un compus colorat. Intensitatea culorii este proporţională cu cantitatea de aldehidă epihidrinică, deci şi cu procesul de oxidare. Reactivi necesari: - fluoroglucină, soluţie eterică 0,1%. Se păstrează max 1 sӑpt. în sticle brune - acid clorhidric concentrat(d=1,19) Mod de lucru: Intr-o eprubetă curată se introduce o anume cantitate din proba de grăsime, după topirea prealabilă la temperatură moderată (cca.50 C). Se adaugă acelaşi volum de acid clorhidric concentrat şi se omogenizează bine. Se adaugă în continuare acelaşi volum de soluţie de fluoroglucină şi se omogenizează din nou. Dacă untura este proaspătă soluţia din eprubetă rămâne incoloră sau capătă o tentă gălbuie. Dacă sunt instalate procese de oxidare, apare o culoare roşie de diferite intensităţi, funcţie de gradul râncezirii. Culoarea se dezvoltă imediat şi este stabilă o oră. Calcule si observatii 41

44 6.1. Determinarea grăsimii metoda Soxhlet principiul metodei În produsele naturale, substanţele grase sunt înglobate de obicei în celule grăsoase, a căror membrană este de natură proteică. Extragerea cantitativă din proba care se analizează, presupune eliberarea grăsimii din corsetul proteic. Distrugerea membranei sau peliculei proteice se poate realiza pe două căi: pe cale fizică (cu ajutorul căldurii), sau pe cale chimică (prin hidroliza acidă sau alcalină). Separarea grăsimii de celelalte componente organice şi minerale se poate realiza prin extracţie selectivă cu ajutorul solvenţilor organici, sau prin centrifugare. Determinarea grăsimii din produsele alimentare de origine animală se poate realiza prin mai multe metode: prin extracţie cu solvenţi organici, cum ar fi metoda Soxhlet, Goldfish, Mojonnier sau folosind hidroliza acidă sau alcalină - metoda Gerber, Babcock. Metoda de referinţă utilizată în laboratoarele de stat este metoda Soxhlet. Principiul metodei Grăsimea din proba de cercetat este extrasă până la epuizare cu solvenţi organici şi după îndepărtarea solventului de extracţie se cântăreşte şi se exprimă procentual. Pentru asigurarea extracţiei complete, proba este supusă în prealabil unui tratament termic la temperatură moderată prin care se realizează deshidratarea şi distrugerea membranei sau peliculei proteice a microstructurii în care este înglobată. Extractoare Soxhlet 42

45 6.2. Determinarea grăsimii din produsele lactate metoda Gerber principiul metodei Componentele majore din ţesurile şi umorile animale au greutate specifică 1,00 (apa) sau mai mare de 1,00 (protidele, glucidele şi substanţele minerale). Lipidele au greutate specifică mai mică decât unu. Există deci posibilitatea separării şi determinării lipidelor prin centrifugare. Pentru aceasta este necesar ca toate componentele să se găsească sub formă de soluţie, emulsie sau suspensie coloidală, situaţie ce se poate realiza în condiţii optime prin hidroliză acidă. Metoda se foloseşte în special pentru determinarea grăsimii din lapte şi din produsele lactate. Prin adaptări corespunzătoare însă, se poate utiliza pentru determinarea grăsimii din orice produs de origine animală. Produsul de cercetat este introdus într-un recipient de sticlă special numit butirometru unde este supus unei hidrolize rapide cu ajutorul acidului sulfuric. Grăsimea eliberată din structura în care este încorporată, se separă prin centrifugare. Pentru uşurarea separării se foloseşte alcoolul amilic. Cantitatea de grăsime, exprimată procentual, se citeşte direct pe tija gradată a butirometrului. Butirometre Centrifugă Gerber 43

46 Test 1. Care este rolul lipidelor în organism? 2. Ce fel de acizi graşi conţin uleiurile? Precizaţi care este reacţia folosită pentru determinarea gradului de nesaturare a grăsimilor. 3. Enumeraţi constantele caracteristice lipidelor. 4. Care este metoda folosită pentru a pune în evidenţă degradarea oxidativă avansată a grăsimilor? 5. Care este principiul metodei de determinare a grăsimilor din lapte şi alte produse lactate? 6. Indicaţi solventul folosit pentru extragerea grăsimilor prin metoda Soxhlet. 44

47 Laborator Determinarea proteinelor din produsele alimentare Protidele sunt substanţe chimice esenţiale ale materie vii. Ele sunt formate în special din aminoacizi. Sunt substanţe complexe care conţin C, H, O, N şi uneori sulf, fosfor, fier sau cupru. Rolul fundamental este cel plastic şi funcţional şi mai puţin energetic. Ele sunt considerate cele mai importante substanţe prezente în regnul animal şi vegetal. Aminoacizii sunt acizi carboxilici în care un atom de hidrogen a fost înlocuit cu o grupare amino, -NH 2 ; ei rezultă prin hidroliza acidă, bazică sau enzimatică a proteinelor. Din punct de vedre al comportării faţă de diferiţi solvenţi protidele se clasifică în proteine simple şi proteine conjugate. Prin hidroliză proteinele simple eliberează numai aminoacizi, iar proteinele conjugate eliberează pe lângă aminoacizi şi o componentă neproteică numită grupare prostetică. In constituţia corpului omenesc se găsesc câteva mii de proteine diferite, cu structuri speciale care corespund anumitor funcţii specifice. Analiza calitativă şi cantitativă a aminoacizilor se bazează pe reacţiile specifice date de gruparea amino, carboxil, de radicalul moleculei fiecărui aminoacid, de legăturile peptidice, pe valoarea punctului izoelectric şi pe masa moleculară. Reacţiile chimice prin care pot fi identificate protidele se împart în: - Reacţii de culoare specifice sau generale - Reacţii de precipitare 45

48 7.1. Obţinerea extractelor proteice a.albumina vegetală: 25g făină de grâu se amestecă cu 100ml apă distilată şi se lasă să stea 30 minute, agitând din când în când. Se filtreză pe filtru cutat. Dacă primele porţiuni sunt tulburi se filtrează din nou. b.albumină de origine animală : La 50ml lapte se adaugă un volum egal de apă distilată şi apoi, în picături amestecând, 0,2-0,3ml acid acetic concentrat, până la obţinerea unui precipitat floconos. După 5-10 minute amestecul se filtrează printr-o pânză umezită în prealabil. Primele cantităţi se refiltrează. Soluţia limpede, puţin gălbuie conţine albumină şi o parte din globulina din lapte. Reziduul de pe filtru este constituit din cazeină şi grăsime. c.obţinerea proteinelor din albuşul de ou O soluţie concentrată de proteine se formează dintr-un albuş de ou la care se adugă 5-6g NaCl. Se agită puţin, se pune într-un vas de 500ml. Când trebuie preparată o soluţie diluată, se ia un anumit volum din soluţia concentrată şi se diluează de două sau de trei ori cu apă distilată Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire Proteinele sunt alcătuite dintr-un amestec de aminoacizi în diferite proporţii şi din această cauză este important să cunoaştem aminoacizii constituenţi. Separarea şi identificarea aminoacizilor constituenţi este posibilă prin cromatografie pe hârtie sau în strat subţire. In cromatografia pe hârtie se foloseşte hârtie de filtru îmbibată şi străbătută de diferite amestecuri de solvenţi, de exemplu fenol-apă sau butanol apă. Aceleaşi amestecuri de solvenţi sunt folosiţi şi în cromatografia în strat subţire cu deosebirea că în acest caz faza fixă este dispusă pe o placă de sticlă, şi este constituită dintr-un material poros solid silicagel sau oxid de aluminiu. Aminoacizii se deplasează cu viteze diferite de-a lungul hârtiei sau a plăcii cromatografice. Deoarece aminoacizii sunt incolori, trebuie să se realizeze o reacţie de culoare cu ninhidrină. Aminoacizii se prezintă sub formă de pete de dimensiuni diferite, cu intensităţi diferite de culoare. Pentru a identifica în parte se face o cromatogramă de comparaţie, folosind câte un aminoacid cunoscut, astfel se poate cunoaşte poziţia fiecărui aminoacid în cromatogramă. Aparaturӑ necesara : - amestec de 2-3 aminoacizi (1mg/ml apă, 0,1%) 46

49 - soluţii de control de aminoacizi (1mg/ml) - amestec de developare butanol-acid acetic- apă 4:1:5 - ninhidrină 0,1-0,2% în butanol - Hârtie cromatografică Whatman nr.1 sau plăci cromatografice Mod de lucru: Pe o placă cromatografică se trag linii paralele la distanţe de 1cm. La 2cm de marginea inferioară se aşează cu micropipeta câte o picătură din soluţia de cercetat şi din soluţiile de control. Diametrul fiecărei picături trebuie să fie cca. 2-3mm, iar cantitatea maximă de aminoacizi într-o pată în jur de 0,03mg/. Placa cromatografică se introduce în tancul de cromatografiere care conţine amestecul de developare, astfel încât capătul pe care au fost puşi aminoacizii să ajungă în soluţie. Petele de aminoacizi nu trebuie să intre în amestecul de developare. Se lasă un timp, până când frontul solventului ajunge la 2cm de la marginea superioară a plăcii. Se scoate placa, se usucă în etuvă la 100 C şi se pulverizează cu ninhidrină. Se introduce 10 minute în etuvă la 90 C, apoi se observă poziţia şi intensitatea culorii petelor apărute şi se calculează Rf-ul. Distanţa de la linia de start la pată Rf = Distanţa de la linia de start până la frontul solventului Acidul aminat Rf Culoarea ninhidrină Alanină 0.38 Violetă Arginină 0.20 Violetă Cisteină 0.07 Brună Cistină 0.08 Brună Acid glutamic 0.30 Violetă Glicină 0.26 Violetă Histidină 0.20 Violetă-brun Izoleucină 0.72 Violetă Leucină 0.73 Violetă Lizină 0.14 Violetă Metionină 0.55 Violetă Ornitină 0.15 Violetă Fenilalanină 0.68 Violetă Prolină 0.43 Galbenă Serină 0.27 Violetă Treonină 0.35 Violetă Triptofan 0.50 Violetă-brun Tirozină 0.45 Albastră Valină 0.60 Violetă 47

50 48

51 8.1Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen Laptele de vacӑ contine în medie 3,4% proteine reprezentate de: cazeina (2,7%); lactalbumina (0,4%-0,5%); lactoglobulina (0,1-0,2%). In structura proteinelor aminoacizii sunt legaţi între ei prin legături peptidice între gruparea amino a unui aminoacid şi gruparea carboxilică a altui aminoacid. In lanţurile polipeptidelor există şi grupări amino şi carboxilice libere. Pentru determinarea cantitativă este necesară punerea în libertate a aminoacizilor din macromolecula protidică. In acest scop soluţia este supusă hidrolizei alcaline. Principiul metodei Grupele aminice libere ale proteinelor (-NH 2 ) reactioneaza cu formaldehida formând grupӑri (N=CH 2 ) caracteristice bazelor Schiff. În acest fel aciditatea datorata gruparilor carboxilice (-COOH) se poate mӑsura prin titrare cu soluţie de hidroxid de sodiu si se poate corela cu continutul de proteine prin înmultirea cu un factor empiric. Reactiile chimice sunt urmӑtoarele: Reactivi: - NaOH 0,143N. 1ml din această soluţie corespunde la 1% proteina - aldehidă formică soluţie 40%, neutralizată faţă de fenolftaleina inainte de folosire - oxalat de potasiu soluţie 28%, neutralizată faţă de fenolftaleina inainte de folosire - sulfat de cobalt heptahidrat, soluţie 5% - fenolftaleină soluţie alcoolică 2% 49

52 Mod de lucru: Prepararea probei martor într-un vas Erlenmeyer de 100ml se introduc 25ml lapte, 1ml soluţie de oxalat de potasiu şi 0,5ml soluţie de sulfat de cobalt, după care se omogenizează. Se dezvoltă imediat o culoare roză care este stabilă. Fenolftaleina s-a adăugat la neutralizarea celor două soluţii. Determinarea titrului proteic: Intr-un vas Erlenmeyer asemănător cu al probei martor se introduc 25ml lapte, 1ml soluţie de oxalat de potasiu şi eventual 2-3 picături de fenolftaleină. Se omogenizează bine şi după 1 minut se neutralizează cu hidroxid de sodiu până la o coloraţie identică cu a probei martor. Prin această operaţie s-au neutralizat toţi acizii liberi din probă. Pentru ca determinarea să fie precisă este necesar ca la această neutralizare să nu se întrebuinţeze un volum de hidroxid de sodiu 0,143N, mai mare de 1,75 ml. Laptele cu aciditate proprie mai mare nu este apt pentru determinarea proteinelor prin această metodă. In proba astfel neutralizată se adaugă 5ml aldehidă formică şi se omogenizează. Culoarea roz dispare brusc şi laptele îşi reia culoarea albă specifică. După 1 minut se titrează din nou cu soluţia de hidroxid de sodiu până la culoare identică cu a probei martor, notându-se volumul de hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare. In condiţiile în care s-a respectat întocmai metoda de lucru descrisă, volumul soluţiei de hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare reprezintă conţinutul de proteine, în procente al probei de lapte supusă analizei. Rezultatul se exprimă ca media aritmetică a două determinări efectuate în aceleaşi condiţii. Metoda are caracter orientativ. Titrul proteic =V, unde V este volumul de solutie NaOH 0,143N (în ml) folosit la a doua titrare. Rezultatul se exprima prin media a doua determinari efectuate pe aceeasi proba. Calcul si observatii: 50

53 8.2. Determinarea conţinutului de cazeinӑ din lapte Principiul metodei Metoda are la bazӑ determinarea titrului proteic prin metoda Sorensen.Formaldehida adӑugatӑ în lapte blocheazӑ grupӑrile amino, din proteine si determinӑ creşterea aciditӑţii libere. Mӑsurarea nivelului aciditӑţii libere dupӑ blocarea grupӑrilor aminice stӑ la baza determinӑrii proteinelor din lapte. Mod de lucru Intr-un balon Erlenmeyer de 100 ml se adaugӑ 10 ml lapte; 0,5 ml soluţie alcoolicӑ de fenolftaleinӑ şi se titreazӑ cu NaOH 0,1 M pânӑ la culoarea roz. Adӑugӑm 2 ml formaldehidӑ 20% şi se titreazӑ din nou cu NaOH 0,1M pânӑ la apariţia coloraţiei roz care persist 30 secunde. Conţinutul de casein se calculeazӑ cu ajutorul formulei urmӑtoare Caseinӑ g% = V x 1,47 Unde, V = volumul NaOH folosit la a doua titrare 1,47 factor de conversie pentru cseiӑ Conţinut mediu de cazeinӑ în diferite tipuri de lapte: vacӑ - 2,60%, caprӑ - 2,90%, oaie - 4,50%, 51

54 Principiul metodei 9.1.Determinarea proteinelor - metoda biuretului Sulfatul de cupru în mediu bazic reacţioneazӑ cu substanţele care conţin 2 sau mai multe legӑturi peptidice formând un complex colorat în albastru- violet. Intensitatea culorii este direct proporţionalӑ cu numӑrul legӑturilor peptidice din proteinӑ. Numele metodei provine de la compusul biuret H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 care dӑ reacţie pozitivӑ tipicӑ. Metoda este folositӑ pentru determinarea unor cantitӑţi relativ mari de proteinӑ (1-20 mg). Reactivi - Soluţie standard de albuminӑ sericӑ bovinӑ 5mg/ml preparatӑ extemporaneu - Reactiv biuret (3g CuSO 4 x 5 H 2 ) si 9 g tartrat de sodiu si potasiu in 500 ml solutie NaOH 0,2M, se adaugӑ 5g KI şi se aduce la 1 l cu NaOH 0,2 M. - extract proteic total obţinut prin centrifugarea unui omogenat (1g tesut hepatic /10 ml apӑ distilatӑ) Mod de lucru In 6 eprubete se pipeteazӑ: Nr. crt ml solutie standard ml apa distilatӑ Proteinӑ mg/2ml 1 0 2, ,1 1,9,5 3 0,5 1,5 2,5 4 1,0 1, ,5 0,5 7,5 6 2, Absorbanta DO In fiecare eprubeta adӑugӑm 3 ml de reactiv biuret. Probele se agitӑ energic, se incubeazӑ timp de 10 minute la 37 C si dupӑ rӑcire se colorimetreazӑ la 540 nm faţӑ de apӑ. Se construieşte o curbӑ de etalonare trasând pe abscisӑ mg/2ml proteinӑ- iar pe ordonatӑ DO la 540nm. Se determinӑ concentraţia proteicӑ în extractul proteic total, incubând 2ml preparat cu 3ml reactiv biuret la 37 C timp de 10 minute. Dupӑ rӑcire, proba se colorimetreazӑ la 540 nm faţӑ de apӑ iar DO mӑsuratӑ este transformatӑ in concentratie proteicӑ mg/2ml cu ajutorul curbei de etalonare. Dacӑ intensitatea culorii este prea puternicӑ se dilueazӑ preparatul proteic pânӑ când DO se încadreazӑ în curba de etalonare. Valorile obţinute trebuie multiplicate prin factorul de diluţie. 52

55 Calcule şi observaţii 53

56 9.2.Determinarea proteinelor metoda Kjeldhal principiul metodei Componenta de bază, cu valoare nutritivă, din majoritatea produselor alimentare de origine animalădar si vegetalӑ este proteina. Calitatea acestor produse se apreciază, în primul rând, după conţinutul lor în proteine. Proteinele dintr-un anumit tipde aliment au un conţinut de azot cu valoare relativ constantă, la 100g proteine. Cunoscând conţinutul de azot se poate calcula cantitatea de proteine cu ajutorul unui factor de convertire Exemplu pentru carne -Continutul de azot este 16 g la 100 g protein. Factorul de convertire este 6,25 (rezultat din raportul 100/16). Principiul metodei Proba de analizat se mineralizează prin încălzire cu acid sulfuric concentrat în prezenţa unui catalizator. în urma degradării proteinelor şi a celorlalţi compuşi cu azot, se pun în libertate ionii de amoniu care se combină cu acidul sulfuric formând bisulfatul de amoniu. Amoniacul pus în libertate prin alcalinizare puternică este distilat şi titrat. TEST 1. Care sunt metodele de obţinere a extractelor proteice? 2. Care este rolul proteinelor în organism? 3. De câte feluri pot fi reacţiile de precipitare? 4. Ce este punctul izoelectric? 5. Care sunt cele trei etape ale metodei Kjeldahl? 54

57 Laborator 10. Enzime Enzimele sunt substanţe de naturӑ proteicӑ, fiind constituite fie numai din resturi de aminoacizi, legaţi prin legături peptidice, fie din catene polipeptidice şi alte componente organice sau anorganice. Acestea prezintă structuri spaţiale complicate. Enzimele, numite şi biocatalizatori, accelerează viteza reacţiilor biochimice de ori prezentând o capacitate catalitică superioară catalizatorilor chimici.reacţiile care în laboratoarele de chimie decurg în condiţii speciale de temperatură, presiune, ph, în prezenţa enzimelor decurg în condiţii moderate. Activitatea catalizatorilor, indiferent de natura lor chimică, se caracterizează prin faptul că poate fi decelată când aceştia se găsesc în cantităţi foarte mici. La sfârşitul reacţiei atât catalizatorul chimic cât şi enzima se regăsesc, într-o stare neschimbată, putând participa la un nou atac catalitic. Enzimele au un grad deosebit de complexitate, motiv pentru care sunt uşor denaturabile prin modificarea temperaturii, ph-ului, prin acţiunea razelor UV, a ultrasunetelor, prin congelări şi decongelări repetate etc. Deosebirea esenţială dintre enzime şi catalizatorii chimici constă în înalta specificitate de acţiune a enzimelor, având capacitatea de a cataliza un singur tip de reacţie biochimică, uneori a unei singure substanţe chimice (specificitate absolută de substrat). Determinarea activităţii enzimatice Prezenţa unei enzime într-un amestec de reacţie poate fi pusă în evidenţă şi urmărită fie prin dispariţia substratului, fie prin apariţia unui produs de reacţie. Enzima este incubată cu substratul, în condiţii de concentraţii, ph şi temperatură strict controlate şi din amestecul de reacţie se scot la anumite intervale de timp probe, care sunt analizate. Fiecare probă este însoţită de un martor, în scopul depistării reacţiilor chimice nespecifice şi spontane care au loc independent de enzimă. Dacă urmărim variaţia în timp a vitezei enzimatice vom constata că la început acest parametru creşte linear, după care scade. Abaterea de la linearitate a vitezei de reacţie în funcţie de timp poate fi datorată fie inversării sensului reacţiei (echilibrul este atins şi reacţia inversă devine mai importantă), fie scăderii în timp a concentraţiei substratului când enzima nu mai este saturată în acesta, fie inhibiţiei printr-un produs al reacţiei. Pentru a minimaliza aceste efecte, în cercetările enzimologice se determină viteza iniţială de reacţie v o cand v creşte linear în timp. 55

58 Activitatea enzimatică este frecvent exprimată în unităţi (U), astfel că o unitate reprezintă cantitatea de enzimă ce catalizeză transformarea a 1 micromol de substrat într-un minut, în condiţii definite. Unitatea internaţională sistematică a activităţii enzimatice este katal-ul (kat) care reprezintă transformarea unui mol de substrat pe secundă. Puritatea unei enzime se exprimă prin activitatea specifică, care este numărul de unităţi enzimatice (U) pe mg proteină sau numărul de catali pe kg proteină Evidenţierea unor enzime Evidenţierea peroxidazei din hrean Peroxidaza catalizează oxidările cu oxigen peroxidic, deci activează şi următoarea reacţie în care donorul de electroni este pirogalolul. Trecerea culorii în portocaliu-brun indică apariţia configuraţiei chinonice în purpurogalină. Reactivi necesari : - peroxidază (extract apos de hrean) - pirogalol 2% - apă oxigenată 0,5% Mod de lucru : Intr-o eprubetă se iau 1ml extract apos de hrean, la care se adaugă 0,5ml pirogalol şi două picături de apă oxigenată. Imediat apare o culoare portocalie brună Evidenţierea activităţii peroxidazei din lapte Peroxidaza existentă în laptele care nu a fost supus unui tratament termic descompune apa oxigenată cu eliberare de oxigen. Evidenţierea acestui fenomen se poate face prin reacţii de culoare specifice ale oxigenului cu unele substanţe uşor oxidabile, cum ar fi ; parafenilen diamina, tinctura de guaiac sau benzidina. Evidenţierea activităţii peroxidazei este utilă pentru identificarea laptelui nepasteurizat. Reactivi necesari : - apă oxigenată 3% - parafenilendiamină Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 5ml lapte, 5 picături apă oxigenată şi cca. 1g amestec de parafenilendiamină cu nisip, după care se omogenizează, se lasă în repaos 2 minute, apoi se citeşte reacţia. In cazul prezenţei peroxidazei (lapte nepasteurizat) lichidul din eprubetă capătă culoare albastră cenuşie In cazul absenţei peroxidazei (lapte corect pasteurizat) lichidul nu-şi modifică culoarea sau capătă o tentă cenuşie slab perceptibilă. 56

59 10.2. Influenţa factorilor fizico-chimici asupra activităţii enzimelor Influenţa temperaturii asupra activităţii enzimelor Acţiunea temperaturii asupra reacţiilor enzimatice este dublă: - modifică viteza reacţiei enzimatice - denaturează enzima, respectiv apoenzima care este de natură proteică Majoritatea enzimelor au o temperatură optimă, între C. La temperaturi sub 0 C, activitatea enzimelor scade foarte mult, fără să fie distruse. Sub formă uscată, enzimele îşi păstrează activitatea şi unele pot rezista scurt timp la o temperatură de 100 C. Se preferă ca temperatură de lucru +37 C, deoarece distrugerea enzimei este practic nulă, iar viteza reacţiei este suficient de mare. Reactivi necesari : - salivă diluată - soluţie de amidon 1% în clorură de sodiu 0,3% - reactiv Fehling Mod de lucru: In două eprubete se măsoară câte 4ml soluţie amidon 1% în clorură de sodiu 0,3%. Intr-o eprubetă se adaugă 1ml salivă proaspătă, nefiartă, iar în a doua 1ml salivă fiartă. Se agită şi se introduc în termostat la + 37 C timp de 15 minute. Se adaugă în fiecare eprubetă 1ml reactiv Fehling şi se fierbe pe baie de apă 5 minute. In eprubeta cu salivă nefiartă, reactivul Fehling este redus la suboxid de cupru de culoare roşie cărămizie. In eprubeta cu salivă fiartă, unde amilaza este distrusă prin fierbere, amidonul; nefiind hidrolizat, reactivul Fehling nu este redus, deci culoarea nu se schimbă. 57

60 Influenţa ph-ului asupra activităţii enzimatice. Fiecare enzimă dezvoltă o activitate maximă la o anumită valoare a ph-ului= ph optim. Extractul enzimatic s-a obţinut din cartofi 10 g cartofi se mojarează cu 5 g carbonat de calciu. Amestecul se trece cantitativ in cilindru de 100 ml si după o oră se filtrează prin vată. Modul de lucru Reactiv Balon 1 Balon 2 Balon 3 Balon 4 Extract enzimatic 5 ml 5 ml 5 ml - HCl 1 N (ph=2) 2 ml NaOH 1 N (ph=14) ml - Apă distilată (ph=7) - 2 ml - 5 ml Se agită H 2 O 2 1% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Se lasă în repaos 15 minute H 2 SO 4 15% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml KI 10% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Molibdat de amoniu 1% 2-3 picături. Agitare energică 2-3 minute Probele se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N în prezenţa amidonului ca indicator până la decolorare. Calcul Datele experimentale exprimate în ml tiosulfat de sodiu se scad din ml tiosulfat folosit la titrarea probei martor. V M V P Folosind aceste date si ph-ul la care a acţionat enzima se trasează curba care indică influenţa ph-ului asupra activităţii enzimei. Calcule şi observaţii laborator

61 TEST 1. Ce sunt enzimele şi ce rol au în organism? 2. Care este diferenţa între cataliza enzimatică şi cea chimică? 3. Care sunt factorii care influenţează activitatea enzimatică? 4. Care este enzima care catalizează hidroliza amidonului? 5. Ce importanţă prezintă determinarea activităţii peroxidazei în industria alimentară 6. Care este enzima determinată din mierea de albine, ce constituie un criteriu de autenticitate al mierii de albine? Descrieţi principiul metodei de lucru folosite. 59

62 Laborator Vitamine Celulele conţin pe lângă componentele lor de bază, anumite substanţe organice, active la concentraţii foarte mici, numite vitamine, care sunt vitale pentru organism. Unele organisme nu pot sintetiza vitamine şi trebuie să le obţină din surse exogene. Lipsa vitaminelor din organism (avitaminoză), insuficienţa (hipovitaminoză) sau concentraţia crescută (hipervitaminoză) dau naştere la tulburări metabolice mai mult sau mai puţin grave. Vitaminele au structură chimică heterogenă şi din această cauză clasificarea lor este foarte dificilă.cel mai des folosit criteriu este în funcţie de solubilitate şi după acest criteriu există vitamine liposolubile (A, D, E, K) şi vitamine hidrosolubile (vitaminele B, C, PP). Fiecare vitamină prezintă reacţii caracteristice majoritatea lor fiind reacţii de culoare Metode de identificare ale vitaminelor Identificarea vitaminei A a. Vitamina A dă cu acidul tricloracetic o coloraţie galbenă care virează în albastru. Reactivi necesari: - soluţie uleioasă de vitamina A 0,1mg% - soluţie cloroformică de acid tricloracetic 30% Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 0,5ml soluţie uleioasă de vitamina A şi 1ml soluţie acid tricloracetic 30%. Apare o coloraţie galbenă care virează în albastru. b. Vitamina A tratată cu fenol în prezenţa guaiacolului dau o coloraţie roşie purpurie. Reactivi necesari : - soluţie uleioasă de vitamină A 0,1mg% - guaiacol cristale - fenol p.a. - acid clorhidric concentrat - cloroform Mod de lucru : Intr-o eprubetă se măsoară 0,5ml soluţie vitamină A la care se adaugă un cristal de guaiacol, 2 picături fenol, 1ml acid clorhidric concentrat şi 5ml cloroform. După agitare apare o coloratie roşie-purpurie. c. Reacţia dintre vitamina A şi clorura de stibiu în soluţie cloroformică, cu formarea unei coloraţii albastre, poartă denumirea de reacţia Carr-Price. Reacţia poate fi folosită şi pentru dozarea vitaminei A. 60

63 Reactivi necesari : - concentrate de vitamina A - cloroform purificat - soluţie cloroformică de clorură de stibiu Mod de lucru : la 4-5 picături de soluţie de vitamina A se adaugă 1ml cloroform şi 1-2 ml soluţie cloroformică de clorură de stibiu. Se agită conţinutul eprubetei. Apare o coloraţie albastră proporţională cu conţinutul de vitamina A. In cazul determinărilor cantitative se compară culoarea obţinută cu o scară etalon sau colorimetric. Identificarea vitaminei D a. Reacţia cu aldehide: Vitaminele D reacţionează cu aldehidele aromatice (vanilină, furfural), în prezenţa acidului percloric, cu formarea de produşi coloraţi. Reactivi necesari : - soluţie benzenică de vitamina D - soluţie 0,1% de aldehidă aromatică în benzen - acid acetic glacial - amestec de acid percloric ; 2ml aldehidă acetică se tratează 2,5ml acid acetic glacial şi se încălzeşte la C, timp de 30 minute. Mod de lucru : Intr-o eprubetă se iau 1ml soluţie benzenică de vitamina D şi 1ml de aldehidă aromatică în benzen şi se încălzesc la fierbere. Se adaugă apoi două picături de reactiv percloric şi se fierb încă un minut, apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Soluţia devine tulbure, colorată în verde. Se adaugă 1,5ml acid acetic şi se urmăreşte culoarea formată. a. Reacţia cu clorura de stibiu : soluţia benzenică de vitamina D se tratează cu cloroform în raport de 1:10 şi apoi cu o soluţie cloroformică de clorură de stibiu.şi se obţine o coloraţie galben-portocalie. b. Reactia cu anilină Reactivi necesari: - untură de peşte - amestec anilină : HCl, în raport 15:1 Mod de lucru: Intr-o eprubetă se introduc 3ml untură de peşte sau soluţie uleioasă de vitamina D, şi 1ml amestec de anilină :HCl. Se agită uşor si se încălzeşte la fierbere. Emulsia galbenă devine la început verde şters apoi trece în roşu. După 2-3 minute emulsia se separă în două straturi dintre care cel inferior are o culoare roşie intensă. 61

64 Identificarea vitaminei E a. Reacţia cu acidul azotic α- tocoferolul se oxidează în prezenţa clorurii ferice sau a acidului azotic la α- tocoferilchinonă, de culoare roşie Reactivi necesari : - soluţie uleioasă de vitamina E - etanol - acid azotic concentrat Mod de lucru : Se iau într-o eprubetă câteva picături dintr-o soluţie uleioasă de vitamina E, se tratează cu câteva picături de acid azotic concentrat. Conţinutul se încălzeşte de la sine şi apare o coloraţie brună roşie (se lucrează cu atenţie şi la nevoie se răceşte). c.reacţia cu clorura ferică Datorită grupării hidroxil tocoferolii dau reacţie pozitivă cu clorura ferică. Reacţia este specifică fenolilor, care sunt oxidaţi la compuşi chinonici. Reactivi necesari : - soluţie alcoolică de vitamină E 0,1mg % - soluţie clorură ferică 10% Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 0,5ml solutie alcoolică de vitamină E şi 2-3 picături soluţie clorură ferică 10%. După agitare apare o coloratie galben-roşiatică Identificarea vitaminelor B a.vitamina B 1 : In mediu alcalin este oxidată de fericianura de potasiu la tiocrom de culoare roşie, care prezintă o fluorescenţă albastră în UV. Reactivi necesari : - soluţie vitamina B 1 1g - solutie de fericianură de potasiu 2% - metanol - NaOH 30% - izobutanol - etanol 96 Mod de lucru: Intr-o pâlnie de separare se pipetează 1ml din soluţia de vitamină, 4 picături metanol şi 1-2 picături de fericianură de potasiu 2%. Se agită şi se adaugă 1ml sol. NaOH 30%. Se lasă în repaus 2 minute şi se introduc 10ml izobutanol, după care se agită energic. Se lasă în repaus câteva minute, după care timp se separă cele două straturi. Stratul inferior apos se îndepărtează şi se reţine stratul cu izobutanol care conţine tiocromul. Se spală cu 3ml apă distilată. Se separă apa, iar stratul de izobutanol se tranvazează într-o eprubetă şi se adaugă 62

65 2ml etanol. Eprubeta se aşează în faţa unei surse de lumină UV, când se observă apariţia unei fluorescente albastre. b. Vitamina B 2 : prezintă fluorescenţă galben-verzuie şi sub acţiunea reducătorilor trece în leucoderivat, care nu mai prezintă fluorescenţă. Reacţia este reversibilă şi îşi recapătă fluorescenta în prezenţa oxigenului. Reactivi necesari : - soluţie vitamina B 2 50mg % - zinc metalic granule - soluţie acid clorhidric 10% Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 1ml soluţie vitamină B 2, care prezintă o fluorescenţă galben-verzuie. Se adaugă mg zinc metalic şi 2ml acid clorhidric 10%. Se agită de câteva ori şi se observă dispariţia fluorescenţei. Se astupă eprubeta cu degetul şi se agită. Se observă apariţia fluorescenţei, datorită oxidării vitaminei sub acţiunea oxigenului atmosferic. Identificarea Vitaminei C a. Vitamina C datorită proprietăţii de a se oxida uşor, reduce sărurile de argint la argint metalic. Reactivi necesari : - soluţie vitamină C 3g% - soluţie azotat de argint 5g% - soluţie hidroxid de amoniu 20% Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 1ml azotat de argint şi se adaugă hidroxid de amoniu picătură cu picătură până la dizolvarea precipitatului format iniţial. Se adaugă 2ml soluţie de vitamină C şi se încălzeşte pe baie de apă 5-10 minute. Va apărea argintul metalic depus pe pereţii eprubetei. b. Vitamina C se extrage din ţesuturi cu soluţii slab acide pentru a fi evitată alterarea ei, apoi se identifică cu ajutorul fericianurii de potasiu. In prezenţa clorurii ferice, vitamina C, reduce fericianura de potasiu, formând albastrul de Berlin. Reactivi necesari : - soluţie de HCl 2% - fericianură de potasiu 1% - clorură ferică soluţie 1% Mod de lucru: Se cântăresc 4-5g din materialul vegetal şi se introduc într-un mojar unde se mojarează cu nisip şi HCl 2%. Se aduce apoi volumul la 100ml cu acid clorhidric şi se filtrează. Din acest lichid se introduc 5ml într-o eprubetă şi se tratează cu o picătură de sol. fericianură de potasiu şi o picătură de sol. de clorură ferică. Rezultă o coloraţie albastră. 63

66 11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale Se bazează pe proprietatea reducătoare a acidului ascorbic. Acidul ascorbic prin oxidare se transformă în acid dehidroascorbic. Dozările se fac prin volumetrie iar solutia de titrare este - iodat de potasiu, Extracţia din produse vegetale 15 g produs vegetal se mojarează timp de 10 minute cu 2,5 g de nisip si 10 ml de acid metafosforic. Se complectează la 50 ml cu acid metafosforic, se filtrează sau se centrifughează. Din filtrat se iau 10 ml si se dozează vitamina C la fel ca din suc. Dozarea vitamine C Reactivi: - soluţie standard vitamina C 1 mg/ml - amidon 1% - HCl 1M - Iodat de K 0,004N (1,2g KI + 0,478g I 2, se aduce la 1000 ml cu apă distilată). - acid metafosforic 5% 10 ml de soluţie standard de vitamina C se amestecă cu 20 ml apă distilată, 2 picături de HCl 1 M şi 15 picături de amidon 1%, se titrează cu iodat de K până la culoarea albastră care persistă 15 secunde. Se notează cu V volumul de iodat folosit la titrare. Se repetă aceleaşi operaţii pentru suc sau pentru supernatant, în loc de 10 ml soluţie standard se vor folosi 10 ml suc sau filtrat. Se notează cu V 1 volumul de iodat folosit la titrare. Calcul Pentru suc 10 x V 1 vitamina C mg /10 ml suc = V Pentru vegetale 10 x V 1 x 5 vitamina C mg /100 g produs = x 100 V x m V = vol. de iodat folosit la titrarea soluţiei standard V 1 = vol. de iodat folosit la titrarea probei 5 = dilutia 10 = ml solutie standard luata in lucru m = masa probei (15g) 100 = raportarea la 100 g produs 64

67 Calcul si observatii 65

68 11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans In mediu acid vitamina C este oxidată la acid dehidroascorbic de către reactivul Tillmans (2,6-diclorfenolindofenol) de culoare roşie, care se reduce consecutiv transformându-se în leucoderivatul corespunzător incolor. Reactivi necesari : - soluţie Tillmans-10mg 2,6-diclorfenolindofenol în 100ml apă distilată se păstrează câteva zile la frigider. - soluţie de acid metafosforic 5%în apă distilată - acid acetic glacial - carbonat de calciu pulbere - soluţie de acetat de plumb 5% - material de analizat Mod de lucru : Stabilirea titrului în acid ascorbic al soluţiei de reactiv Tillmans Se pipetează într-un balon Erlenmeyer 10 ml soluţie de vitamina C şi se titrează din biureta cu soluţie Tillmans cu picătura, până în momentul în care culoarea virează în roz şi persistă 30 secunde. T= 0, / V în care: 0,088 = cantitatea de acid ascorbic, în mg existentă în 1ml 10 = volumul soluţie de acid ascorbic luat în lucru V= volumul soluţiei de indicator folosit la titrare Intr-un flacon Erlenmeyer se pun 20ml lapte, peste care se adaugă sub agitare, 8ml soluţie de acid metafosforic. Se omogenizează şi apoi se filtrează. Inr-un alt flacon Erlenmeyer se pipetează 14ml filtrat (echivalentul a 10ml de lapte) şi se titrează cu reactiv Tillmans, până la apariţia culorii roz persistente 30 de secunde. 66

69 Calcul : Conţinutul în vitamină C, exprimat în mg la 100ml lapte, se calculează cu ajutorul formulei: Vitamină C, mg la 100ml = V T 100 / V 1 în care: V = volumul soluţiei de indicator, în ml, folosit la titrare T = titrul soluţiei de indicator V 1 = volumul de lapte corespunzător celor 14ml filtrat luat în lucru (10ml) Conţinutul vitaminei C din lapte este cuprins între 10 şi 80 mg/l cu variaţii în funcţie de specie, tipul de alimentaţie şi sezon, fiind mai ridicat vara când animalele se hrănesc cu iarbă şi cu diferite nutreţuri verzi. Calcule şi observaţii laborator 12 67

70 TEST 1. Ce este acidul ascorbic, ce rol are în organism? Dati exemple de surse naturale de acid ascorbic. 2. Mentionaţi pentru fiecare vitamină din grupul B, numele şi rolul în organism 3. Ce rol are vitamina A în organism, şi care sunt produsele alimentare bogate în vitamina A? Ce sunt provitaminele A? 4. Indicaţi o metodă de identificare a vitaminei A care poate fi utilizată si pentru determinarea cantitativă a vitaminei A. 5. Care sunt factorii care influenţează stabilitatea vitaminelor? Daţi exemplu pentru vitamina A, B 1 şi C. 68

71 Laborator 13.Pigmenţi Culoarea diferitelor organe ale plantelor se datoreazӑ unor substanţe colorate, numite pigmenţi. Pigmenţii naturali au rol biochimic şi fiziologic foarte important. Iau parte la numeroase procese metabolice, formează sisteme de oxidoreducere, dau gustul, aroma şi coloritul unor produse alimentare. Pigmenţii clorofilieni au rol esenţial în procesul de fotosinteză Sub aspect chimic, pigmenţii naturali sunt substanţe foarte heterogene. Ei se găsesc în celule şi ţesuturi în stare liberă sau sub formă de cromoproteide, glicozide etc.in general se găsesc în cantităţi mici şi se determină prin metode cromatografice, colorimetrice şi spectrofotometrice Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subţire Amestecul de pigmenţi este extras cu un solvent potrivit si se separӑ prin cromatografie in strat subtire pe placi acoperitecu silicagel-material adsorbant, fiecare pigment situându-se într-o anumită zonă, de-a lungul plӑcii. Reactivi necesari : - acetonă - hexan - sulfat de sodiu anhidru - mojar cu pistil - nisip sau sticlӑ pisatӑ - tuburi capilare - hârtie de filtru Obţinerea extractului: pentru prepararea extractului de pigmenţi se mojarează 2g frunze de spanac cu puţin nisip şi 3 ml acetonă.se decanteazӑ soluţia si se trece pe o pâlnie cu vatӑ, se stoarce vata pentru a recupera extractul. Porţiunile de extract se reunesc într-un tub cu capac. Reziduul din mojar se reia cu 3 ml de acetonӑ, se repetӑ operaţia anterioarӑ. La final se adaugӑ 3ml de acetonӑ şi 5ml de hexan în mojar şi se mojareazӑ pânӑ reziduul se decoloreazӑ. Soluţia obţinutӑ se trece intr-o eprubeta cu dop. Se adaugӑ 3 ml de saramurӑ se agita si se lasӑ sӑ se separe. Startul de sus va fi verde inchis iar cel de jos verde deschis. Extractul spălat se usucă adăugând sulfat de sodiu anhidru până la limpezirea soluţiei. 69

72 Cromatografie -Mod de lucru: Soluţia cu amestecul se aplică în picături la baza plăcii, cu ajutorul unei micropipete. Se usucă picăturile prin suflare şi se introduce placa în amestecul de eluare cu capătul cu picături în jos astfel ca picăturile să nu ajungă în eluent. Linia de start trebuie sӑ fie la 1,5-2 cm. Developarea durează aproximativ 30 de minute.identificarea componentelor se face prin compararea poziţiei lor cu cea a componentelor din soluţii etalon sau prin stabilirea valorilor Rf. La terminarea separării, pe placă ordinea pigmenţilor de sus în jos va fi : - β caroten - diceto-carotenoide - cetohidroxi-carotenoide - hidroxi-carotenoide Spoturile obţinute se pot determina şi cantitativ folosind metode colorimetrice. Calcule şi observaţii laborator

73 13.2. Determinarea spectrofotometricӑ a conţinutului de clorofilӑ Mod de lucru - Se cântӑresc 100 mg frunzӑ /probӑ. - Se mojareazӑ cu 10 ml acetonӑ 80% cu ajutorul nisipului sau a sticlei pisate - Se filtreazӑ si filtratul se colecteazӑ intr- eprubetӑ. Determinarea concentratiei de clorofilӑ. Blanckul folosit este acetona. Se umple cuva spectrofotometrului cu extractul obtinut si se citesc absorbantele la urmӑtoarele lungimi de undӑ: 663 nm; 645 nm; 470 nm. Calcule: Folosind ecuaţia Arnon se calculeazӑ continutul de clorofila Chl a (mg/g) = [(12.7 A663) - (2.6 A645)] ml acetona / mg frunze Chl b (mg/g) = [(22.9 A645) - (4.68 A663)] ml acetona / mg frunze Total Chl = Chl a + Chl b. C x+c = 1000 A Chla Chlb/214, (x = xantofila si caroten) 71

74 TEST 1. Care este rolul pigmenţilor naturali? 2. Care este rolul clorofilei în organismele vegetale? 3. Indicaţi metodele cel mai des utilizate pentru identificarea si dozarea pigmenţilor. 72

75 Laborator 14. Evaluare laborator. Determinarea unor parametrii, efectuarea unor calcule 73

76 BIBLIOGRAFIE 1. Dumitru IF., - Biochimie - Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti Dumitru IF., D.Iordăchescu Introducere în enzimologie- Ed. Medicală, Bucureşti, Iordăchescu D., I.F.Dumitru-Biochimie practică Tipografia Universităţi, Bucureşti, Neamţu G.,- Biochimie alimentară- Ed.Ceres, Bucureşti, Neamţu G.,- Lucrări Practice de biochimie alimentară- Tipo Agronomia, Cluj-Napoca, Popescu N., Meica S., - Noţiuni şi elemente practice de chimie analitică sanitar veterinară, Ed.Diacon Coresi, Bucureşti, Purcărea C.,- Biochimie alimentară practică, Ed.Univ.Oradea, Purcărea C., Biochimie agroalimentară. Edit.Univ. Oradea, Socaciu C.,- Chimie alimentelor- Ed.Academic.Press, Cluj-Napoca, Socaciu C., O.Bobiş - Caiet de lucrări practice, Chimia alimentelor, Ed. Academic Press, Cluj-Napoca,

77 75