Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) - lokalizacija molekularnih spektroskopskih informacij s fluorescenčnim mikroskopom

Transcript

1 Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) - lokalizacija molekularnih spektroskopskih informacij s fluorescenčnim mikroskopom Janez Štrancar Laboratorij za biofiziko, IJS / CO NAMASTE Zakaj je ta slika netipčna za navadno mikroskopijo, zakaj za fluorescenčno mikroskopijo?

2 Od mikroskopije do fluorescenčne mikroskopije Kontrast! microscopy fluorescence microscopy

3 Pojav fluorescence Absorbcijski in emisijski spekter Eksitacija in relaksacija elektronskih stanj 3

4 Konfokalna fluorescenčna mikroskopija Optično rezinjenje! Eksitiramo eno optično ravnino in Zajemamo svetlobe iz ene optične ravnine! fluorescence microscopy fluorescent confocal microscopy

5 Fluorescenčna mikrospektroskopija lokalizacija pri fiziol. pogojih 3D microscopy confocal microscopy fluorescence microscopy microspectroscopy kontrolirano ozadje spektralno občutljiva detekcija

6 Fluorescence microspectroscopy (FMS)

7 Shema FMS konfokalna mikroskopija fluorescenca spektroskopija Liquid crystal tunable filter EM Iztok Urbančič FMS 7

8 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E primeren za opazovanje bioloških vzorcev v tekočini objektivi 10x, 40x, 100x (oljni in vodni imerzijski) motorizirana mizica (ravnina XY) motoriziran revolver objektivov (Z) Iztok Urbančič FMS 8

9 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS nazivna moč 300 W 4,5 W izsevane svetlobe, 500 mw v vidnem delu zvezen spekter od UV do NIR nadomešča nabor več laserjev Iztok Urbančič FMS 9

10 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II nabor širokoprepustnih vzbujevalnih in izsevnih filtrov in dvobarvnih zrcal Iztok Urbančič FMS 10

11 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II V primerjavi z laserskim skeniranjem: manj bledenja fluorescence neodvisnost pri izbiri fluorescenčnih barvil Iztok Urbančič FMS 11

12 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II TK nastavljivi filter VariSpec spektralno območje nm spektralna širina prepustnosti 10 nm korak 1 nm odzivni čas 50 ms Iztok Urbančič FMS 12

13 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II TK nastavljivi filter VariSpec EMCCD kamera QImaging Rolera Mgi+ ločljivost 512x512, velikost elementov 16 µm kvantni izkoristek > 90% hitrost snemanja30 s 1 temni tok < 0.2 e (pix s) 25 C elektronsko pomnoževanje signala (do 1000x) Iztok Urbančič FMS 13

14 Elementi FMS fluorescenčne nanokroglice (50 nm) Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II 10 µm TK nastavljivi filter VariSpec EMCCD kamera QImaging Rolera Mgi+ Optična pinceta Aresis Tweez 200si IR vlakenski laser 1064 nm izhodna moč 5 W več kot 1000 sočasnih pasti preklapljanje med pastmi 100 khz natančnost lege pasti < 1 nm Iztok Urbančič FMS 14

15 Zajem in kodiranje krajevno lociranih spektralnih lastnosti

16 Kam so šli vsi fotoni? element prepustnost [1] jakost [W] fotonski tok [s 1 ] 300 W Xe obločnica 4, , svetlobni vodnik 0,1 4, , vzbujevalni filtri 0,2 9, , konfokalni disk 0,08 7, , objektiv(vstopna odprtina) 0,08 5, , fluorofori(absorpcija, emisija) ( ) 2, , / 3D slikovni element ( voxel ) , , [(pix s) 1 ] objektiv(na, n) 0,3 5, , : : izsevni filtri 0,7 3, , TK filter 0,02 8, , kamera (γ ADCe) (0,02) 4, [ADCe (pix s) 1 ] Iztok Urbančič FMS

17 Ciljano porazdeljevanje označevalcev Od lastnosti označevalcev je odvisno, kje se le ti porazdeljujejo! A 10 µm B C D E F

18 Preverjamo stabilnost vezave označevalcev Akumulirane titan oksidne nanocevke v MCF7 celicah (rak dojke) po 1 dnevu, sprane s PBS Vezan in prost Alexa označevalec imata vrha emisijskega spektra razmaknjena za 8 nm emmision-maximum-coding FMS image emmision spectra of the two states of the same probe

19 Identificiramo delce manjše od resolucije mikroskopije Akumulirani polistirenski nanodelci v MCF7 celicah (rak dojke) po 1 dnevu Kolokalizacija z doma-sintetiziranim membranskim označevalcem, ki ima vrh emisijskega spektra zamaknjen za 40 nm glede na vrh spektra označevalca na nanodelcih Intenziteta fluorescence (a.u.) Nanodelci Membranska proba slika, ki kodira intenziteto slika, ki kodira vrh emisijskega spektra Valovna dolžina (nm) Emisijski spekter obeh označevalcev membranski označevalec

20 Opazujemo časovno odvisne pojave, kot je zlivanje membran Zaradi zlivanja membrane liposomov s plazemsko membrano, s okoli fluorescenčnih označevalcev spreminja koncentracija holesterola, ki vpliva na strukturiranost membrane, ta pa se odraža na vrhu emisijskega spektra 5 µm 5 min 10 min 15 min

21 Razglednica za spomin Koncept FMS Barvno kodiranje spektralnih lastnosti Detekcija nanodelcev preko spektralnega kontrasta Detekcija lokalnega molekularnega okolja

22 Projektna skupina Laboratorij za F5.IJS, FFA.UNI-LJ, CO NAMASTE Zoran Arsov Marjeta Šentjurc Jure Zdovc Jana Mlakar Slavko Pečar Tilen Koklič Ivan Kvasić Darija Jurašin Stane Pajk Alma Mehle Janez Mravljak Ajasja Ljubetič Iztok Urbančič Maja Garvas Daniele Biglino Janez Štrancar