Svetlobni mikroskop. Princip delovanja Pomembna kakovost leč

Transcript

1 Mikroskopija Steklena krogla napolnjena z vodo - prva povečevalna naprava - Plinij prvo stoletje Antonij van Leeuwenhoek ( ) izdelal leče v velikosti bucikine glave (eritrocite, bakterije) Zaharias Jansen - izumitelj mikroskopa izdelal mikroskop z bikonveksno in bikonkavno lečo Robert Hook prvič opisal mikroskop v svoji knjigi Micrographia (1665 leta) uporabil plan-konveksni leči za objektiv in okular

2 Svetlobni mikroskop Princip delovanja Pomembna kakovost leč Ločljivost mikroskopa (D)(ločevanje dveh točk) je odvisna od valovna dolžina svetlobe (λ ) in numerične aperture (NA) D=0,61 λ / NA NA=produkt lomnega količnika medija med objektom in objektivom ter sinusa polovice kotne odprtine (α) NA= n x sin α -lomni količnik vzorca in zraka (n) apertura objektiva (α) Zaradi tehničnih omejitev je ločljivost 0,2 µm

3 Izboljšava ločljivosti Kotna odprtina, konkavno zrcalo, imerzijsko olje

4 Sestavni deli svetlobnega mikroskopa Mehanski deli: stativ, nosilec zrcala, nosilec kondenzorja, mizica, revolver, nosilec tubusa, vijaki Vir svetlobe: - močna žarnica, - kompaktna žarilna nitka Objektivi: - ahromatični, apohromatični - različne povečave (10x,20x,40x,100x) Povečave okularjev (10x,15x) Kondenzorji: - enakomerna in intenzivna osvetlitev - aperturna zaslonka

5 Priprava vzorca

6 Barvanja mikrobioloških preparatov Barvanje po Gramu ločevanje osnovnih dveh skupin bakterij Negativno barvanje (različna barvila: indijsko črno, kristal violetno, metilensko modro) Barvanje različnih struktur celice: endospor, kapsule, bičkov, vključkov, nukleotida specifična barvila Barvanje različnih skupin bakterij: npr. spirohet, rikecij, legionel, mikoplazm Acidorezistentno barvanje

7

8 Temno vidno polje Poseben postopek osvetljevanja. Svetlobi, ki gre skozi objektiv, preprečimo direkten dostop do okularja s kondenzorjem. Predmete opazujemo v odklonjeni svetlobi na temnem polju. Ker direkten žarek iz kondenzorja ne pride v objektiv je vidno polje temno, na objektu pa se žarki razpršijo, odbijejo in je svetleč. Posebni kondenzorji za osvetljevanje objektov s strani (velik kot vpada svetlobe) in močen vir svetlobe. Primerno za opazovanje prozornih predmetov, svetleči delci so mnogo bolj vidni in zato lahko opazujemo zelo majhne objekte.

9 Fazno kontrastno mikroskopija Fazna ploščica za objektivom zavre ali pospeši žarke - ustvari fazno razliko direktnih in uklonskih žarkov. Po interference direktnih in uklonskih žarkov se amplitudi seštejeta v ravnini realne slike. Direktni žarek, se na objektu pospeši, po interferenci je amplituda manjša in objekt je na sliki temnejši. Zaradi različne optične gostote preparata je lahko objekt temen, ozadje svetlejše in dobimo jasno kontrastno sliko. objektiv

10 Primerjava slike presevna svetloba fazni kontrast temno polje

11 Fluorescenčna mikroskopija Fluorescenca Avtofluorescenca (pigmenti avtotrofov,npr.klorofil, ) Fluorokromi (različni, odvisno kaj sledimo) Objekt osvetljujemo s kratkovalovno UV svetlobo ali modro svetlobo,.. Zelo uporabna metoda (ekologija, medicina )

12 Priprava preparata filtracija barvanje štetje

13 Filtracija Koncentracija vzorca na filtru Vrste filtrov: različnih materialov (stekleni, celulozni, polikarbonatni, ) Različne velikosti por odvisno od vrste materiala (od 10 µm do 0,02 µm) Različne dimenzije odvisno od uporabe(volumna tekočine)

14 Barvila: DAPI AO SYBR Primulin

15 Fluorescentna in situ hibridizacija Fiksacija celic Povečanje permeabilnosti celične stene Dodatek specifičnih sond Spiranje & barvanje Pregled pod mikroskopom

16 Transmisijska elektronska mikroskopija TEM Osnovni principi so enaki kot pri svetlobni mikroskopiji, le da s snopom elektronov raziskujemo objekt. Uporabljamo snop elektronov in elektromagnetne leče (kondenzor, objektiv in projektiv namesto okularja). Elektronska puška (katoda z napetostjo pospeši elektrone proti anodi). S projektivom projiciramo sliko objekta na zaslon, ki zažari na mestih, ki jih bombardirajo elektroni. Ločljivost je 0,1 nm, pov. do 10 6 x Delamo v vakuumu Potrebna je posebna priprava vzorca.

17 Priprava vzorca za TEM Ultramikroton: Fiksacija vzorca (glutaraldehid, Osmijev tetraoksid) Sušenje (etanol, aceton) Utrjevanje vzorca (polimerizacija plastike) Rezanje (ultratanke rezine) Nalaganje na mrežice Freez-fracture: Hitro zamrzovanje vzorca (tekoči dušik) Rezanje, lomljenje z nožem Naparevanje s težkimi kovinami Primeren za opazovanje celičnih struktur, virusov

18 Vrstična elektronska mikroskopija SEM Priprava preparata podobna kot pri TEM. S pomočjo ozkega snopa elektronov osvetljujemo površine objektov, ki je prevlečena s kovino. Primarni elektroni povzroče emisijo sekundarnih elektronov, ki jih zbere kolektor. Na kolektorju je fotopomnoževalka, ta ojača dobljeni tok, ki napaja katodno cev (televizijska katodna cev). Dobimo sliko površine preparata. Slika je 2D, vendar zaradi senc kot 3D (elektroni se odbijajo pod različnim kotom). Velika globinska ostrina globinska predstava o površini objekta. Povečave od 15 x do 10 6 x Delamo v vakuumu

19 Konfokalna laserska mikroskopija SCLM Opazujemo žive materiale v kombinaciji laserske svetlobe in fluorescentne ali svetlobne mikroskopije preko računalnika. Žarek usmerimo na različno globino, preparat režemo v plasteh z laserjem; posnetke z različnih globin spravimo in naknadno obdelujemo kot tridimenzionalno sliko. Večja resolucija Uporabna metoda v mikrobni ekologiji Opazujemo filogenetsko različne populacije v habitatu (površine biofilmov,mucusnih agregatov, globino določenega proteina,

20 Druge oblike mikroskopiranja AMF - Mikroskopija na atomsko silo Z laserskim tipalom pregledujemo površino v treh dimenzijah

21 opazujemo žive preparate, ni potrebna priprava preparata zelo velika ločljivost ( 0,1 do 0,01 Å) 3D opazovanje celičnih struktur, opazovanje na nivoju molekul (npr. LPS struktura c. membrane)

22 Merjenje dimenzij z mikroskopom Milimetersko merilce Velikost vidnega polja

23 Določanje števila mikroorganizmov z mikroskopom Število objektov preštejemo v vidnem polju (najmanj 30 polj izračunamo pov. število/vzorec, st.dev.) (n) določimo velikost površine na katero nanesemo vzorec (P) določimo velikost vidnega polja (P1), volumen vzorca (V) Število/ml = P x n/ P1 x V