Spektroskopija elektronska paramagnetna resonanca (EPR) - spinsko označevanje in spinsko lovljenje pri študiju supramolekularnih sistemov

Transcript

1 Spektroskopija elektronska paramagnetna resonanca (EPR) - spinsko označevanje in spinsko lovljenje pri študiju supramolekularnih sistemov Janez Štrancar Laboratory of Biophysics, IJS / C AMASTE

2 Zakaj EPR? Radikali ter različni elektronski defekti v trdni snovi so strukture z nesparjenimi elektroni, torej imajo spin. Spinska stanja so občutljiva na lokalna električna polja in druge spine, zato se spreminjajo, če se spreminjajo pogoji v okolici. Interakcije med spini so odvisne od razdalj, zato so odvisne od translacijske difuzije. Interakcije med spini in polji so večinoma anizotropne, zato so odvisne od orientacije, torej tudi od rotacijske difuzije. Vse te pojave lahko raziskujemo z metodo, ki komunicira z elektronskimi spini, to pa je eletronska paramagnetna/spinska resonanca (EPR/ESR)

3 Spektroskopija elektroska paramagnetna resonanca (EPR)

4 Princip EPR Potreba po nesparjenem elektronu s spinom in zato magnetnim momentom Potreba po magnetnem polju, s katerim detektiramo magneni moment (spin) Potreba po mikrovalovnem sevanju, ki vzbudi prehode med spinskimi stanji Prosti radikali nitroksidi R 1 R 2 R 2 itroxide synthesis avoiding radical site (Lebedev & Kazarnovsky 1959, Rozantsev & eiman 1962) Energija E B = 0 Absorbcijski spekter Interakcije z drugimi magnetnimi momenti! dvod absorbcijskega spektra M I =+1 M I = 0 M I =-1 M I =-1 M I = 0 M I =+1 magnetno polje B Mikrovalovna motnja!!! E = hν = µ B Bg + AM I

5 bčutek za razpone polj, frekvenc in energij Magnetno polje med T zemeljsko magnetno polje: mt, X-band EPR: 0.3 T, novorojena hitrovrteča se nevtronska zvezda: 100 MT Frekvenca/valovna dolžina/energija med GHz / cm / µev VHF (RF) svetloba: 100 MHz 3 m 0.3 µev ( x manj od kt) X-band EPR: 10 GHz 30 mm 0.03 mev (1000x manj od kt) IR svetloba: 10 THz 30 µm 30 mev (skoraj kt) Vidna svetloba: 600 THz 500 nm 2 ev (energija kemijskih vezi) UV svetloba: 10 PHz 30 nm 30 ev (ionizirajoče!)

6 EPR spektrometer Izbira polja / frekvence je odvisna od: vdorne globine valovanja, ki se s frekvenco zmanjšuje občutljivosti, ki s frekvenco močno narašča; Dielektričnih izgub(v vodnih vzorcih), ki preprečujejo sklopitev resonatorja na valovanje v valovodu in ki tudi močno naraščajo s frekvenco; željene ločljivostmagnetnih sklopitev, ki narašča z magnetnim poljem; uporabljena tehnologija izvorov in transporta valovanja ter izdelave resonatorjev(rf, MW, IR). uporabljena tehnologija magnetov (elektromagneti, superprevodni magneti) ALI GU DIDA amen modulacijein fazne detekcije je omogočiti ozkopasovno filtriranje signala Posledica modulacije je detekcija odvoda abosrbcijske krivulje;

7 EPR okna Časovno okno anizotropije magnetnih sklopitev zaradi rotacij molekul (10-30 G) ustrezajo Larmorjevim frekvencam MHz, kar generira časovno okno 10 ns Krajevno okno interakcije z nesparjenimi elektroni so modulirane preko kontaktnih ali dipolnih interakcij z dosegom pod 10 nm, zaradi česar je EPR občutljiva na lokalno strukturiranost, difuzijo in reologijo na molekularni skali bčutljivost absolutna občutljivost EPR spektrometra je spinov(20 fmol) v 10 µl vzorcu, kar ustreza koncentraciji 2 nm

8 Ko radikali ne živijo dovolj dolgo... Če je življenski čas vzbujenih stanj nesparjenega elektrona (radikala) skrajši od EPR časovnega okna, takih stanj ne moremo videti direktno Spinsko lovljenje in EPR Kratkožive radikale ulovimo in spremenimo v dolgožive radikalske adukte, ki jih lahko detektiramo z EPR + - oxoamonium kot spinski lovilec R R. itroksidni radikalski adukt

9 Spinsko lovljenje za merjenje učinkovitosti fotovzbujanja Fotovzbujanje titanoksidnih nanocevk v vodi z 2 povzroči generacijo radikalov Radikale lovimo in njihove adukte detektiramo z EPR Z vzbujanjem z različno svetlobo lahko določimo spektralno odvisnost fotovzbujanja λ

10 Spinsko lovljenje ni vedno povsem učinkovito zadje: difuzija radikalov in pasti razpad pasti in radikalskih aduktov radikalske reakcije H 2 0 nanomaterial H, H, H R 5 β β H R bβ R 5 R (or - -R ) H R 5 H R5 H H R (or-r) R 5 R (or -R) R 5 H H R 5 R 5 R5 R 5 R5 H H R (or-r) R 5 H H R 5

11 Vzporedna detekcija različno dolgoživih radikalov Kafeična kislina + lakaza : 1 mt Dolgoživi radikal na kafeični kislini Kafeična kislina + lakaza + DMP (spinski lovilec): Kratkoživi radikali se pretvarjajo v hidroksilni radikal, ki ga lovi DMP (hidroksilni je najbolj stabilen med kratkoživimi radikali)

12 Tipični EPR spektri različnih kisikov radikalov Lovljenje z DMP in DEPMP, kjer se lepo vidi pretvorba H. v H.

13 Spinsko označevanje in študij lokalne mobilnosti Ker sta sklopitvi elektronskega spina in zunanjega magnetnega polja ter elektronskega in jedrskega (dušikovega) spina pri nitroksidnem radikalu zelo anizotropni, bo spekter nitroksida zelo odvisen od orientacije proti zunanjem magnetnem polju R 1 R 2 R 2 R 1 R 2 R 2

14 EPR in anizotropija rotacijskega gibanja In bioloških sistemih so orientacije neenakomerno usmerjene glede na magnetno polje, zato je EPR spekter superpozicija spektrov pri različnih orientacijah Korelacijski čas rotacijskega gibanja Anizotropija rotacijskega gibanja Zaradins časovnega oknaso oblike EPR spektrov hitro opletajočih se spinkih označevalcev odvisne tako od anizotropije kot tudi od hitrosti rotacijskega gibanja 5 ns Časovno okno

15 Študij premreževanja polimerov PRIMER: zamreževanje želatinskih (biopolimernih) gelov z EDC zamreževalcem PRBLEM: stopnja zamreževanja in neznana lokalna mobilnost polimernih verig PRISTP: uporaba spinskega označevalca, ki se veže na isto skupno, kot EDC, in poroča o mobilnosti

16 Spinsko označevanje in študij translacijske difuzije Močna spinska izmenjava + Šibka spinska izmenjava = Rezultirajoči spekter kot utežena vsota

17 Korelacija oblike EPR spektrov in spinske izmenjave

18 anoreologija in translacijska difuzija v morskem gelu Počasna difuzija koncentrirane raztopine označevalca v gel generira različna koncentracijska stanja, iz njih pa lahko zaradi omejitev difuzije izluščimo velikost kletk

19 Razglednica za spomin Energija Magnetno polje astanek EPR spektra Detekcija radikalov s spinskim lovljenjem EDC/H2-1/1_fosfatni_puf nedial dial_1x dial_2x + izotropno gibanje anizotropno gibanje Gibljivost polimerov preko anizotropije rotacijskega gibanja anoreologija preko spinske izmenjave =

20 ur team Laboratory of F5.IJS, FFA.UI-LJ, C AMASTE Zoran Arsov Marjeta Šentjurc Jure Zdovc Jana Mlakar Slavko Pečar Tilen Koklič Ivan Kvasić Darija Jurašin Stane Pajk Alma Mehle Janez Mravljak Ajasja Ljubetič Iztok Urbančič Maja Garvas Daniele Biglino Janez Štrancar