Rast mikroorganizmov na površini: biofilmi

Transcript

1 Rast mikroorganizmov na površini: biofilmi David Stopar Novi sad 2007 Izr. prof. dr. David Stopar Univerza v Ljubljani, BF Oddelek za živilstvo Katedra za mikrobiologijo Večna pot david.stopar@bf.uni-lj.si Web: 1

2 Mikrostrukture na površini 2

3 Površina kot jo vidi AFM 3

4 Električni dvojni sloj elektronevtralna raztopina površinski naboj Nernstov potencial Sternov sloj Zeta potencial Sternov sloj: ioni in kontra ioni direktno na površini Zeta potencial: električni potencial na imaginarni površini, ki ločuje trdno vezano tekočino (elastično obnašanje) od ostale tekočine (viskozno obnašanje). Od zeta potenciala je odvisna elektroforetska mobilnost, elektroosmoza in sedimentacija. Ko je zeta potencial večji od 50 mv so disperzije zelo stabilne (elektro odboj), če je manjši pride do koagulacije. 4

5 Vpliv okolja (površine) na organizacijo lipidov oksidirano zlato SiO 2 alkani lipidni vezikli površinski lipidni dvosloj površinski lipidni monosloj 5

6 Vpliv okolja (površine) na obliko biofilma Bacillus subtilis kolonija na trdnem gojišču z različno koncentracijo agarja 6

7 Biofilmi večina mikroorganimov (do 99 %) v naravnih sistemih je pritrjena in raste na površini mikroorganizmi, tvorijo kooperativni konzorcij, kjer so posamezni mikroorganizmi integralni del celote biofilmi se laho razvijejo iz ene same vrste ali pa iz združbe večih različnih populacij 7

8 Načini opazovanja biofilmov rast na trdni površini mikrotitrske plošče biofilmi na interfazi zrak-voda pelikule pretočne celice 8

9 Nastanek biofilma 9

10 Nastanek biofilma 10

11 Regulacija nomadskega in sesilnega cikla sinteza polisaharida sinteza bička 11

12 Biofilm kot kolektiv regulacija genov Pseudomonas aeuruginosa Rdeče točke geni aktivirani v biofilmu (upregulacija) Zelene točke reprimirani geni v biofilmu (downregulacija) 12

13 Adsorpcija na površino za večino celic velja, da potrebujejo flagele, pile in fimbrije za nastanek biofilma po ireverzibilni vezavi na substrat pride do produkcije ekstracelularnega materiala masa ekstracelularnega materiala lahko za 100 krat presega maso bakterije 13

14 Ekstracelularni biopolimeri (EPS) ekstracelularni biopolimeri so predvsem izgrajeni iz polisaharidov in vode (~ 90 %) osnovna enota je običajno izgrajena iz dveh ali treh sladkorjev oligomeri so lahko - nerazvejani (1,2), (1,3), (1,4), (1-6) - razvejani (1,2,3), (1,2,4), (1,3,4), (1,3,6), (3,4,6) 14

15 Vezava bakterij na površino D. geothermalis biofilmi, na površini poliranega nerjavečega jekla. 15

16 Vpliv okolja na obliko biofilma D. geothermalis bakterije spirane z vodo 1h pri 45 o C bakterije sprane z 0.1% (w/v) natrijevim hidroksidom 16

17 Vpliv okolja na obliko biofilma UV: 360 nm, 1 W/m2 za 20 h s stresanjem pri 45 oc A in B: netretirane celice C in D: z UV tretirane celice 17

18 3D arhitektura biofilma Vibrio cholerae A Bakterije imajo konstitutivno izražen GFP. Slike kažejo bifilm inkubiran 6 ur. A. pogled z vrha v ravnini xy nizka povečava (merilo je 50 µm) B. pogled z vrha v ravnini xy velika povečava (merilo je 10 µm) B C. pogled s strani v ravnini xz (merilo je 10 µm) C Fitnat Yildiz and Gary Schoolnik 18

19 Vpliv hidrodinamske sile na obliko biofilma tok tekočine ločitev toka sila upora vzgon recirkulacija površina 19

20 Makrokozmos poskus z biofilmi v White Clay Creeku 0.3 m naklon = m/m 0.3 m hitrost = m/s Re= m 0.3 m 0.3 m naklon = m/m hitrost = 0.23 m/s 30 m Re=7559 V koritu so bili delci velikost 21 mm Vzorčenje vsake 3 dni v času 30 dni. 20

21 Razvoj biofilma v rečnem koritu po 3 dneh po 15 dneh po 24 dneh 21

22 Odvisnost klorofila in števila bakterij od hitrosti toka klorofil a število bakterij 22

23 Odvisnost debeline, oblike in gostote biofilma od hitrosti toka 23

24 Vpliv toka na površino biofilma slow fast 24

25 Modeliranje penetracije snovi v biofilm a = 2D S k 0 o a = razdalja do katere penetrira snov S 0 = koncentracija topljenca na interfazi biofilm-raztopina k 0 = volumetrična hitrost reakcije D = difuzijska konstanta µ = specifična hitrost rasti mikroorganizma k 0 = µ X Y X = celična gostota Y = donos biomase 25

26 Difuzija snovi v biofilmu glede na difuzijo v vodi 26

27 Primer penetracije kisika v biofilm Biofilm ima gostoto celic 12 mg cm -3, hitrost rasti je 0.8 h -1, donos biomase je 0.5 mg biomase na mg kisika. Volumetrična hitrost reakcije je 1 3 µ X 0. 8h 12 mg cm = = = 5 3mg L s 1 k. Y 0. 5mg mg Če je v vodi 6 mg L -1 kisika in je difuzijsko razmerje D B /D aq = 0.57, potem je difuzijski koeficient za kisik v biofilmu 1.53 x 10-5 cm 2 s -1 in prepotovana razdalja D So cm s 6 mg L a = = = 58µ m 1 1 k 5. 3mg L s 0 27

28 Profil kisika v biofilmu globina (mm) 28

29 Difuzija kisika v biofilmu Substrat je na globini 0 mm. Puščice označujejo smer lokalnega difuzijskega fluksa kisika. 29

30 Primer penetracije protimikrobnega sredstva v biofilm Biofilm ima gostoto celic 5 mg cm -3. Mikroorganizem ima specifično katalazno aktivnost 0.01 mm mg -1 s -1, Volumetrična hitrost reakcije je k = kx = 0 01mM mg s 5mg ml = mm L s Če je v vodi koncentracija peroksida 10 mm in je difuzijski koeficient za peroksid v biofilmu 7 x 10-6 cm 2 s D So cm s 10 mm L a = = = µ m 1 1 k 50mM L s 0 Penetracija reaktivnih snovi v biofilm je majhna! Podobno velja tudi za protimikrobna sredstva 30

31 Aktivnost alkalne fosfataze V mediju je veliko fosfata, celice nimajo aktivne alkalne fosfataze V mediju je malo fosfata, vrhnje celice biofilma imajo aktivno alkalno fosfatazo 31

32 Biogeokemijski gradienti Glavne transformacije NH 4 + NO 3 - O 2 DUŠIK NO 2 - NO 3- asimilacija nitrifikacija denitrifikacija NH 4+ asimilacija SO 4 2- O 2 SO 4 2- asimilacija ŽVEPLO S o H 2 S SO 2-4 redukcija S 2- oksidacija S 2- asimilacija CO 2 O 2 OGLJIK aerobna respiracija CH 4 oksidacija CH 4 anaerobna respiracija metanogeneza /fermentacija 32

33 Odziv nitrifikatorjev na kemijske gradiente Oksidatorji NH 4+ - zeleno Oksidatorji NO 2- -rdeče 33

34 Odziv sintrofov na kemijske gradiente Syntrophus propionat oksidirajoča bakterija (rdeča puščica) Methanomicrobiales metanogena bakterija (zelena puščica) 20 µm Harmsen et al. 34

35 Meritve aktivnosti v biofilmu iz cianobakterij Primer prostorsko razporejenih meritev aktivnosti v biofilmu ~1 cm ~ 1.5 cm O 2 -profil ph-profil H 2 S-profil 35

36 Meritve O 2, ph in H 2 S v biofilmu cianobakterij 1500 Oxygen 1500 ph 1500 Sulphide Depth (µm) O 2 in % of airsaturation ph H 2 S (total) (µm) 36

37 Skupni O 2, H 2 S in ph v biofilmu cianobakterij na svetlobi in v temi ph ph A B -500 Mat surface Depth (µm) Oxygen ph Sulphide * P (g) Darkness Light (415 µe) O 2 and S tot (µm) * Gross photosynthesis (µmol O 2 cm -3 s -1 ) 37

38 Profil kisika, ph in H 2 S v različnih časovnih intervalih po končanem osvetljevanju biofilma iz cianobakterij -500 Mat surface Depth (µm) Light * 17 min 94 min 173 min H 2 S (µm) Oxygen (µm) ,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 ph * Solid reds in fig. B is gross photosynthesis rates (pg) 38

39 Biofilm kot kolektiv - QS Quorum sensing ima v biofilmu več funkcij: omogoča vezavo na površino sodeluje pri sintezi ekstracelularnega materiala omogoča regulirano celično smrt v biofilmu omogoča disperzijo biofilma omogoča zaščito pred predatorji 39

40 Kemijska narava signalnih molekul - feromonov O O G - homoserin laktoni O O H N H 3-oxo-C6-HSL iz Vibrio fischeri G + peptidi H-Tyr-Ile-Asn- NH S O NH Asp Phe Leu Me Me O ciklični tiolakton iz S. aureus Druge signalne molekule: γ-butirolaktoni, quinoloni, furanoni 40

41 biofilm bioluminescenca sporulacija simbioze ekstracelularni encimi procesi kjer je kooperacija pomembna plodno telesce virulenca antibiotiki bacteriocini transfer genetskega materiala 41

42 QS v planktonski obliki in v biofilmu 42

43 QS in zaščita pred predatorji bakterije brez protozoja s protozojem Prisotnost protozoja stimulira produkcijo citotoksinov, ki so QS regulirani. 43

44 QS in zaščita pred fagocitozo polimorfni leukociti ne morejo pojesti celic v biofilmu, če odstranimo gene za QS pa lahko QS lahko uporabimo pri kontroli formiranja in virulence biofilmov 44

45 Ekološko pomembni biofilmi biofilmi pri tretiranju odpadnih vod biofilmi v medicini biofilmi pri biorudarjenju cianobakterijske prevleke in odstranjevanje ksenobiotikov biofilmi na ledenih ploščah Antarktike biofilmi na suspediranih delcih v morju (npr. morski sneg, kjer lahko poteka metanogeneza, fiksacija dušika, produkcija sulfida) 45

46 Struktura flokule različne mikrobne združbe in populacije heksoze pentoze metan H 2 alkoholi, organske k. proteini polisaharidi 46

47 A.acetinomycetemcomitans C.sputigens staterin C.ochracoe S.oralis S.sanguis mucin P.intermedia P.acneas prolinsko bogat protein Fusobacterium nucleatum C.gingivalis H.parainfluenca S.gordonii aglutinin Eubacterium spp. A.israelii fragmenti bahkt. stene P.losscheii mucin aglutinin kondicioniran film organskih spojin Površina zoba T.denticola V.atypica S.oralis S.sanguis E.corrodens P.gingivalls alfa amilaza S.flueggel A.naeslundii S.gordonii P.denticola prolinsko bogat protein pozni kolonizatorji zgodnji kolonizatorji Koagregacijski proces pri nastanku zobnega plaka Prikazane bakterijske vrste: Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinomyces israelii, Actinomyces naeslundii, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Eikenella corrodens, Eubacterium spp., Fusobacterium nucleatum, Haemophilus parainfluenzae, Porphyromonas gingivalis, Prevotella denticola, Prevotella intermedia, Prevotella loescheii, Propionibacterium acnes, Selenomonas flueggei, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Treponema spp., Veillonella atypica. Preko 500 bakterijskih vrst

48 Strategije za odstranjevanje biofilmov preprečitev komunikacije med bakterijami (npr. uporaba bromiranih furnaonov, analogov signalnih molekul, uporaba sintetičnih peptidov) uporaba naravnih ali sisntetičnih kelatorjev za železo (npr. laktoferin) razgradnja polisaharidnega matriksa uničenje mikrobnih celic z radikali 48

49 Protimikrobne TiO 2 površine O 2 - H 2 O 2 OH OH - e - H + TiO 2 hν Vse celične komponente so lahko razgrajene z ROS 49

50 Protimikrobne TiO 2 površine: inaktivacija E. coli Bacterial survival (CFU/ml) 1.E+08 1.E+07 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E+00 light TiO 2 light Time (min) 50