Μελέτη του ρόλου ανοσο-τροποποιητικής δράσεως της p38 µιτογονο-ενεργοποιηµένης κινάσης ( p38 MAPK ) Μαυρόπουλος Αθανάσιος, PhD

ΕΙΣΑΓΩΓΗ-Ι H p38 MAPK ενεργοποιείται από τις ιντερλευκίνες IL-12 και IL-18 και αποτελεί βασικό ρυθµιστή εκφράσεως της ιντερφερόνης-γ στα ΝΚ (Natural killer) λεµφοκύτταρα (φυσικούς φονείς) Μavropoulos et al, Blood, 2005 Η ενδοκυττάρια σηµατοδοτική οδός p38 (MAPK) µέσω ρυθµίσεως της IFN-γ και άλλων φλεγµονοδών κυτταροκινών, παίζει σηµαντικό ρόλο στην εγγενή αλλά και στην επίκτητο ανοσία (innate & adaptive immune response)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ -II ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΟΝΑ Α: C. I. M. I. Ρύθµιση εγγενούς ανοσίας απο τα Νatural Κiller (φυσικούς φονείς) λεµφοκύτταρα

Ενεργοποίηση ενδοκυττάριας σηµατοδοτικής οδού p38 (MAPK) µέσω κυτταρικών υποδοχέων T-Cell Receptor (TCR), CD28 και IL-12/18

ΕΙΣΑΓΩΓΗ -III ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΟΝΑ Α: C. I. M. I. Η αναστολή της δραστηριότητας της p38 από ειδικούς φαρµακολογικούς παράγοντες σαν τον SB203580, µειώνει σηµαντικά την παραγωγή ιντερφερόνης-γ

H αναστολή της p38 MAPK µέσω SB203580 µειώνει την έκφραση του mrna και πρωτείνης ιντερφερόνης-γ κατα 60-70% στην συγκέντρωση 1µΜ και ολικά στην συγκέντρωση 10µΜ Μavropoulos et al, Blood, 2005

Σχηµατική απεικόνιση ανίχνευσης φωσφορυλιωµένης p38 MAPK έπειτα απο ενεργοποίηση καλλιεργηθέντων λεµφοκυττάρων 6 ηµερών µέσω ανοσοαποτυπώσεως (Western Blot) Chi et al, EMBO J, 2004

Μειονεκτήµατα συµβατικών τεχνικών ανίχνευσης p38 MAPK Ηµι-ποσοτικός προσδιορισµός ενεργοποίησης της p38 MAPK Αδυναµία πολυ-παραµετρικής αναλύσεως ετερογενών πλυθησµών προερχοµένων απο βιολογικό υλικό όπως κύτταρα περιφερικού αίµατος (PBMCs) Υψηλός αριθµός κυττάρων ο οποίος δεν είναι πάντα εφικτός απο βιολογικό υλικό (PBMCs) ασθενών Ανάγκη µακράς καλλιέργειας κυττάρων µε κυτταροκίνες οι οποίες θα οδηγούσαν σε αλλοίωση των αποτελεσµάτων ex vivo αναλύσεων

Προσδιορισµός ενεργοποίησης p38 MAPK µε κυτταροµετρία ροής Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της p38 µετά από διέγερση µε συνδυασµό phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) και ιονοµυκίνης ή µε το φυσιολογικό συνδυασµό της IL-12 και IL-18 ελέγχθηκαν µε κυτταροµετρία ροής Μavropoulos et al, Methods Mol Biol, 2012 Moνιµοποίηση ιάτρηση Χρώση Ανάλυση

Απεικόνιση φωσφορυλιωµένης p38 MAPK µε ανοσοαποτύπωση Western και κυτταροµετρία ροής

Πλεονεκτήµατα κυτταροµετρίας ροής έναντι της ανοσοαποτύπωσης ιευκολύνει την άµεση ανάλυση πολλαπλών τύπων κυττάρων προερχοµένων απο βιολογικό υλικό όπως περιφερικό αίµα (PBMCs) Πλήρης ποσοτικοποίηση της ενεργοποιηµένης p38 MAPK επι ποσοστού κυττάρων και επίπεδα φθορισµού µέσα σε κάθε ξεχωριστό κύτταρο (mean fluorescence intensity) υνατότητα πολυ-παραµετρικής ανάλυσης σπάνιων πληθυσµών οπως των ΝΚ & ΝΚΤ κυττάρων και πολλαπλών φωσφο-επιτόπων (p38, ERK, STAT) µέσα στα ίδια κύτταρα υνατότητα ανάλυσης και ποσοτικοποίησης παραγοµένων κυτταροκινών σε συνάρτηση µε την ενεργοποίηση της p38 MAPK και άλλων σηµατοδοτικών παραγόντων

Φαινοτυπική ανάλυση υποπλυθησµών ΝΚ, ΝΚΤ και Τ περιφερικού αίµατος µε κυτταροµετρία ροής έπειτα απο διάτρηση µε σαπονίνη και µεθανόλη saponin methanol Lymphocytes Lymphocytes FSC FSC SSC SSC 7.3 2.1 20.1 70.5 7.5 2.1 18.3 72.1 CD56 CD56 CD3 CD3

CD56 + UNSTIMULATED CD56 IgG1 PMA/IONOMYCIN IL-12/IL-18 ARSENITE 30 60 P-P38

UNSTIMULATED CD11 c IgG1 PMA/IONOMYCIN CD11 c P-p38 IL-12/IL-18 CD11 c P-p38 ARSENITE CD11 c P-p38 30 60

UNSTIMULATED IgG1 IgG1 CD11c IFN-γ PMA/IONOMYCIN CD11c IFN-γ IL-12/IL-18 CD11c IFN-γ ARSENITE CD11c IFN-γ 120 240

Συµπεράσµατα ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΟΝΑ Α: C. I. M. I. Επιτυχής ανίχνευση φωσφορυλιωµένης p38 MAPK µεσω κυτταροµετρίας ροής σε πολλαπλούς τύπων κυττάρων περιφερικού αίµατος όπως ΝΚ, ΝΚΤ, Τ, Β και CD11c + Επιτυχής απεικόνιση της εκφράσεως ΙFN γ στα κύτταρα αυτά σε συνάρτηση µε την ενεργοποιήση της p38 MAPK. Προοπτική συνδυασµένης ανίχνευσης άλλων φωσφο-κινασών και µεταγραφικών παραγόντων παράλληλα µε επιφανειακούς επιτόπους και κυτταροκίνες Άµεση δυνατότητα µελέτης µέσω απλής λήψεως περιφερικού αίµατος και ροή αποτελέσµατων εντός λίγων ωρών µε αποτέλεσµα την ελαχιστοποίηση χρόνου και αναγκών σε καλλιέργειες και αριθµούς κυττάρων όπως θα συνέβαινε µε άλλες συµβατικές πειραµατικές µεθόδους.

Εφαρµογές Πρωτοκόλλου Παρακολούθηση της αποτελεσµατικότητας της p38 MAPK νεων φαρµάκων στην αναστολή Χρήση της µεθόδου σε κλινικο-εργαστηριακές µελέτες/ clinical trials. Μελέτη της p38 MAPK σε πειραµατικά µοντέλα φλεγµονοδών παθήσεων Ανάπτυξη παροµοίων πρωτοκόλλων για περισσότερους σηµατοδοτικούς µηχανισµούς (ERK, JNK, STAT) και ανίχνευση πολλαπλών κυτταροκινών ( IL-10, TNF-α)