PROTEINI POVEZANI S PRENOSOM SIGNALOV Funkcije proteinov Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen...) Kontraktilni proteini Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko bioloških membran Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze...) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)
Biosignaliziranje/prenos signala ( signal transduction ) informacija (molekula iz okolja...) celica z receptorjem celični odziv (kemični proces)
Biosignaliziranje Biološki signali so zelo raznoliki (nekaj primerov: antigeni, oligosaharidi, signali razvoja, komponente EM, rastni faktorji, hormoni, svetloba, mehanski dotik, nevrotransmiterji, hranila, dišeče molekule, feromoni...) Celični odgovori so različni Celice imajo le nekaj mehanizmov prenosa in spreminjanja signalov (signal transduction) Mehanizmi signaliziranja so evolucijsko ohranjeni Primeri signaliziranja - prenos živčnih signalov - odziv na hormone in rastne faktorje - zaznava slike (vid), vonja (voh), okusa - uravnavanje celičnega cikla
Značilnosti prenosa signala Specifičnost: molekulska komplementarnost med molekulo-signalom in receptorsko molekulo Ojačenje signala Izguba občutljivosti ( desensitization ) - prilagoditev na signal ( adaptation ) Integriranje signalov
Specifičnost interakcije signalne molekule z receptorjem Specifičnost vezave: signalna molekula in vezavno mesto na receptorju sta komplementarna selektivna vezava visoka afiniteta K d <10-9 M Rec + S 1 Rec S 1 K d1 Rec + S 2 Rec S 2 K d2 K d1 < < K d2 S 1 molekula, komplementarna z vezavnim mestom receptorja S 2 molekula, ki ni komplementarna z vezavnim mestom
Ojačenje signala: encimska kaskada Ojačenje signala za nekaj redov velikosti lahko poteče v msek
Izguba občutljivosti/prilagoditev ( desenzitisation/adaptation ) Aktivacija receptorja sproži povratni odgovor, ki zapre receptor ali ga odstrani s celične površine (endocitoza)
Seštevanje (integration) signalov Če imata dva dražljaja neodvisen (npr. nasprotni) učinek na metabolične karakteristike, npr. koncentracija sekundarnega obveščevalca [X] ali membranski potencial V m, je končni učinek (odziv) vsota obeh dražljajev na receptor 1 in receptor 2. odgovor
6 splošnih vrst mehanizma prenosa signala: (nadaljevanje) 1. ionski kanalčki z zaporo (npr. nikotinski receptor, acetilholinski receptor) 2. membranski receptorski encimi (npr. receptor za inzulin) 3. membranski receptorji, povezani z G proteini (npr receptor za adrenalin) 4. jedrni receptorji (vežejo steroidne hormone, tiroidne hormone in vitamin D) delujejo kot transkripcijski faktorji 5. membranski receptorji, ki vežejo in aktivirajo topne proteine (npr. proteinske kinaze) iz citoplazme 6. adhezijski receptorji, ki posredujejo informacijo med ekstracelularnim matriksom in citoskeletom
Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala S = signalna molekula 1 2 4 5 6 3 Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Primeri mehanizma prenosa signala: 1. ionski kanalčki z zaporo Ionski kanalčki so osnova za električno signaliziranje vzdražnih celic - ionski kanalčki, odvisni od napetosti primer: Na + kanalček v živčnih in v živčno-mišičnih sinapsah - ionski kanalčki, odvisni od liganda primer: acetilholinski receptor
Transmembranski električni potencial (a) K + Na + ATPaza ustvarja transmembranski potencial -60 mv depolarizacija hiperpolarizacija depolarizacija ob odprtju kanalčka depolarizacija Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 (b) Ioni težijo h gibanju v smeri elektrokemijskega gradienta skozi polarizirano membranospremembe transmembranskega potenciala
Primer: ionski kanalček, odvisen od napetosti: Na + kanalček v živčnih in v živčno-mišičnih sinapsah Na + kanalčki so selektivni (K + in Ca 2+ 100 x slabše prehajata) Hitrost pretoka > 10 7 ionov/sek Kanalčki se odprejo kot odziv na zmanjšanje membranskega potenciala ( voltage-gated ) Hitro se inaktivirajo Kanalček sestavlja membranski protein (1 840 AK ostankov)
Primer: ionski kanalček, odvisen od napetosti: Na + kanalček nevrona, uravnavan s transmembransko napetostjo α-podenota kanalčka domene I, II, III, IV Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Na + kanalček nevrona, uravnavan s transmembransko napetostjo veliko Arg V m =-60mV V m =+30mV Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Primer: ionski kanalček, odvisen od liganda: acetilholinski receptor (nikotinski tip) Receptor je bistvena komponenta signala, ki se prenese od motoričnega nevrona do mišičnega vlakna (v živčno-mišični sinapsi) Naravni ligand acetiholin (ACh) (ligand je tudi nikotin) Vezava ACh na receptor povzroči konformacijsko spremembo receptorja odpre se ionski kanalček Kationi prehajajo v notranjost celice depolarizacija membrane Ionski kanalček je prepusten za Na +, Ca 2+ in K + Na + prehaja v smeri nižje konc. (2 x 10 7 ionov/s)
Primer, ionski kanalček, odvisen od liganda: acetilholinski receptor Podenote: 2α, β, γ, δ; na α podenotah vezavno mesto za ACh Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Konformacijska sprememba ionskega kanalčka po vezavi acetilholina (AcH) Polarni ak ostanki Leu Leu zaprt ionski kanalček hidrofobni levcin preprečuje pretok ionov odprt ionski kanalček konformacijska sprememba hidrofobni levcin se je umaknil, v notranjost kanalčka se izpostavijo polarne AK Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Tri stanja ACh receptorja Neaktivno (mirovanje) Aktivno (aktivacija) Neobčutljivo (desenzitizacija) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Prenos živčnega impulza depolarizacija hiperpolarizacija - Električni impulz (akcijski potencial) potuje od živčne celice po aksonu preko sinaps do naslednje celice - Tri vrste ionskih kanalčkov, odvisnih od napetosti: Na +, K + in Ca 2+ kanalčki - Na + in K + kanalčki se zaporedno odpirajo - enosmerna depolarizacija membrane - Ca 2+ kanalčki se odprejo, Ca 2+ sproži eksocitozo ACh - ACh se sprosti v sinaptično režo, aktivira Na + / Ca 2+ kanalčke na postsinapričnem nevronu... dve vrsti kanalčkov: -odvisni od napetosti -odvisni od liganda - acetilholin-esteraza (AChE) katalizira hidrolizo AChE utišanje signala
Utišanje signala: razgradnja liganda acetilholina (ACh) z encimom acetilholin-esterazo + H 2 O CH 3 COOH + HOCH 2 CH 2 N + (CH 3 ) 3 acetilholin ocetna kislina holin
Naravni strupi, ki delujejo na ionske kanalčke interferirajo s prenosom živčnega impulza Tetrodotoksin (riba fugu) in saksitoksin (dinoflagelati- školjke) se vežeta na Na + kanalčke in prepreči prenos impulza Dendrotoksin (črna mamba) inhibira K + kanalčke Kalcikludin (zelena mamba) inhibira Ca 2+ kanalčke Dendrotoksin Tubokurarin, (aktivni del strupa kurare, s katerim so ob Amazonki zastrupljevali puščice, K d 10-7 M), kobratoksin in bungarotoksin (kobra, kreit; K d 10-15 M) se vežejo na ACh receptor Chondrodendron tomentosum
Strukture nekaterih naravnih strupov, ki inhibirajo ionske kanalčke Tetrodotoksin
Bolezni, ki izvirajo iz okvar ionskih kanalčkov * * * Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Nevroni vsebujejo ionske kanalčke, ki se odzivajo na različne nevrotransmiterje primeri: nevrotransmiter ionski kanalček ACh Na +, Ca 2+ glicin Cl - serotonin Na +, K +, Ca 2+ glutamat Na +, K +, Ca 2+
Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 1 2 4 5 6 3
Primeri mehanizma prenosa signala: 2. membranski receptorski encimi receptor za inzulin inzulinski receptor tetramer 2α, 2β zunajcelični del α 2 vezavni mesti za 2 inzulina znotrajcelični del β kinazna encimska aktivnost PI-3K Tyr Po vezavi inzulina se izvrši avtofosforilacija inzulinskega receptorja na Tyr β podenote znotraj celice, sledi fosforilacija subatrata IRS in nadaljnje interakcije med proteini. premik transporterja za glukoza aktivacija encimov aktivacija genov (sinteza proteinov) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Aktiviranje inzulinskega receptorja tirozinske kinaze z avto-fosforilacijo sprememba konformacije Neaktivna domena tirozinske kinaze Aktivna domena 3 tyr ostanki fosforilirani Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Osnovni učinki inzulina Hitri (sekunde): pospešen transport glukoze, AK in K + v celice, občutljive na inzulin Srednje hitri (minute): - stimulacija sinteze, inhibicija razgradnje glikogena - stimulacija sinteze, inhibicija razgradnje proteinov - stimulacija razgradnje, inhibicija sinteze glukoze Kasnejši (ure): povišana koncentracija encimov, ki sintetizirajo lipide inzulin
Inzulin uravnava prenos prenašalca glukoze v miocitu (hitri učinek inzulina) Nelson DL, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Uravnavanje ekspresije gena z inzulinom (počasni učinek) IRS-1 insulin receptor substrat adaptorski protein kinaze inzulinski receptor Raf MEK ERK Ras G protein transkripcijski faktor trankripcija genov, ki kodirajo encime, vključene v metabolizem glukoze Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 1 2 4 5 6 3
Primeri mehanizma prenosa signala: 3. membranski receptorji, sklopljeni z G proteini Sestavine signaliziranja preko receptorjev, sklopljenih z G proteini Receptor s 7 transmembranskimi α-vijačnicami zazna signalno molekulo S Protein, ki veže gvanozinski nukleotid - heterotrimerni G protein (podenote Gα, Gβ, Gγ) Encim v membrani, ki katalizira reakcijo nastanka sekundarnega obveščevalca, npr. adenilatna ciklaza (AC) camp, fosfolipaza C (PLC) IP 3 S encim substrat produkt - sekundarni obveščevalec
3. membranski receptorji, sklopljeni z G proteini - ojačenje signala (kaskadna reakcija) receptor G protein AC, PLC... camp, cgmp... fosforilacija aktivni encimi Vezava signala na receptor aktivira več molekul G proteinov Vsaka Gα podenota aktivira več encimov (efektorjev) Vsak encim katalizira nastanek več molekul sek. obveščevalcev Vsak sek. obveščevalec aktivira več encimov kinaz Vsaka kinaza fosforilira (aktivira) več encimov, vključenih v določeno metabolično pot
3. membranski receptorji, povezani z G proteini Sekundarni obveščevalci, ki se sintetizirajo po aktivaciji G-proteinov - nekaj primerov camp, cgmp - delovanje nekaterih hormonov, npr. adrenalin - delovanje svetlobe (molekulske osnove vida) - delovanje dišečih molekul (molekulske osnove vonja) - delovanje okusnih molekul (molekulske osnove okusa) diacilglicerol (DAG), inozitol-3-fosfat (IP 3 ) in Ca 2+
Primer signaliziranja preko G proteinov: signal adrenalin β-adrenergični receptor veže adrenalin camp aktivirana proteinske kinaze aktivirana metabolična pot (razgradnja glikogena) kot celični odgovor Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Nastanek sekundarnega obveščevelca camp ATP camp + PP i ATP camp
Utišanje signala, ki ga je sprožil adrenalin in ki deluje preko camp 1. Hidroliza camp s fosfodiesterazo 2. Hidroliza GTP z endogeno GTPazno aktivnostjo Gα podenote 3. Desenzitizacija receptorja z arestinom 1. hidroliza camp s fosfodiesterazo camp adenozin 5 -monofosfat (AMP)
2. Hidroliza GTP z endogeno GTPazno aktivnostjo Gα podenote Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
3. Desenzitizacija signaliziranja β-adrenergičnega receptorja z arestinom β-adrenergična arestinska kinaza (β-ark) arestin endocitoza Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Signali, ki uporabljajo camp kot sekundarni obveščevalec k Kortikotropin o Adrenalin r Glukagon t Histamin i Lutenizirajoči hormon k Dišeče molekule o Prostaglandini t Somatostatin r Molekule okusa o Hormon, ki stimulira p ščitnico i n Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Primer signaliziranja preko G proteinov Inozitol-3-fosfata (IP 3 ) kot sekundarni obveščevalec Encim: fosfolipaza C Aktiviranje fosfolipaze C (PLC) s hormonom in delovanje IP 3 na ionske kanalčke za Ca 2+ v membrani endoplazmatskega retikuluma Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Dražljaji, ki se prenašajo preko fosfolipaze C in IP 3 Peptid, ki sprošča gastrin Glutamat (signaliziranje v možganih) Gonadotropin-sproščujoči hormon (hipofiza) Histamin Oksitocin Vazopresin Serotonin Tirotropin-sproščujoči hormon
Primer signaliziranja preko G proteinov: Sprejem svetlobe v očesu vretenčarjev Struktura očesa
Struktura paličnic diski
Protein rodopsin v membrani diska citosol notranjost retinal
Indukcija hiperpolarizacije celic paličnic s svetlobo razgradnja cgmp zaprtje ionskih kanalčkov stanje mirovanja aktiviranje s svetlobo Paličnica, za svetlobo občutljiva čutna celica v mrežnici, ki sestoji iz paličke, perikariona in nevrita Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Interakcija med rodopsinom (receptor za svetlobo) in transducinom (G protein) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Vitamin A in njegovi produkti izomerizacija 11-cis-retinala v trans retinal pod vplivom svetlobe - prvi v zaporedju dogodkov v vidnem ciklu konformacijska sprememba rodopsina...
Molekulski dogodki, ki jih sproži svetloba v diskih Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Absorpcijski spektri rodopsina in rdečih, zelenih in modrih receptorjev celic čepkov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Konzervirane Daltonove oči John Dalton ni razlikoval barv. Po njegovi smrti 1844 so konzervirali njegove oči in leta 1990 analizirali DNA primerjava nukleotidnih zaporedij različnih opsinov (barvnih pigmentov). Ugotovitev: ni bilo gena za pigment za absorpcijo svetlobe zelene barve Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Značilnosti sistemov signaliziranja kot odziv na hormone, svetlobo, vonj in okus Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Inaktiviranje G proteinov z bakterijskimi toksini: ADPribozilacija Gα podenote vpliv na signalno pot Bakterijski toksini encimi, ki katalizirajo ADP-ribozilacijo G proteinov povzročijo oslovski kašelj (Pertussis toxin) in kolero (Cholera toxin)
Nekatere skupne značilnosti signalnih poti, ki vključujejo sekundarni obveščevalec: Vezava signalne molekule na receptor v plazemski membrani sproži interakcije protein-protein znotraj celice (sodelujoči proteini so receptorji, G-protenin, adaptorji, encimi (kinaze) nastanek majhne molekule v celici sekundarnega obveščevalca ( second messenger ) - hidrofilni sekundarni obveščevalci: camp, cgmp, IP 3, Ca 2+ - hidrofobni sekundarni obveščevalci: diacilglicerol, fosfatidil-inozitol fosfati aktivacija določene signalne poti biološki odgovor celice Kaskadne reakcije (ojačanje signala) znotraj celice po vezavi signalne molekule na receptor v membrani
Signaliziranje, ki uravnava mitozo (celični cikel) Vse evkariontske celice ohranjen mehanizem uravnavanja mitoze. Intenzivna delitev celic poteka med med embrionalnim razvojem; v odraslem organizmu počasna delitev celic. Celično delitev uravnavajo zunanji rastni faktorji. Vstop celice v celično delitev (celični cikel) in prehod iz ene v drugo fazo cikla uravnavajo proteinske kinaze/ fosforilacija proteinov. Če so regulatorni mehanizmi, ki uravnavajo delitev celic okvarjeni, sledi nekontrolirana rast rakava rast (tumor). Mitóza je proces pri delitvi jedra somatskih celic, sestavljen iz niza faz, ki zagotavlja ohranitev enakega števila kromosomov in množine DNA v na novo nastalih jedrih, sledi delitev citoplazme (citokineza), Slovenski medicinski slovar 2004
Motnje v biosignaliziranju: izražanje onkogenov Onkogeni so mutirane oblike genov, ki kodirajo okvarjene proteine, ki uravnavajo celični cikel. Onkoproteini so tako spremenjeni signalni proteini, da stalno oddajajo signal za celično delitev in s tem povzročajo tumorje. Onkogeni so genetsko dominantni. Onkogeni lahko kodirajo defektne receptorje, rastne faktorje, G- proteine, proteinske kinaze ali regulatorje transkripcije. Tumor supresorski geni kodirajo proteine, ki zavirajo celično delitev. Mutacije v teh genih so recesivne, a tudi lahko privedejo do nastanka tumorjev
Primer onkogena, ki kodira okrnjen receptor za epidermalni rastni faktor (EGF) motnja v odzivu na zunanji stimulus - stalno aktivirana signalna pot Permanenten signal za delitev povzroči, da se celica nekontrolirano deli! Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005
Vzroki za nastanek onkogenov Prerazporeditev kromosomov Kemične učinkovine UV sevanje Virusna infekcija
Motnje v biosignaliziranju: izražanje onkogenov Pri prenosu onkogenov lahko posredujejo tudi virusi Virusni onkogeni zelo podobni genom v živalih gostiteljicah virusov, protoonkogenenom Protoonkogeni kodirajo proteine, ki uravnavajo celično rast Med virusno infekcijo se lahko protoonkogen vgradi v virusni genom in se spremeni (mutacije, skrajšanje gena) Ob naslednji infekciji virusa se mutirani protoonkogen onkogen - izrazi v celici-gostiteljici, kjer prepreči normalno uravnavanje rasti celice rakava rast
Onkogeni: pretvorba regulatornega gena v virusni onkogen Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005