RASTLINSKI RASTNI HORMONI

Transcript

1 RASTLINSKI RASTNI HORMONI Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za agronomijo

2 rastlinski rastni regulatorji (= rastlinski hormoni) so najpomembnejši notranji dejavniki, ki uravnavajo rast in razvoj rastline

3 Definicija rastlinskih hormonov hormoni so organske molekule, ki so udeleţene pri regulaciji rasti in razvoja v rastlini jih zasledimo v majhnih koncentracijah sintetizirajo se v določenih delih rastline, njihov fiziološki učinek pa se, potem, ko se transportirajo, izraţa v drugih tkivih učinek je lahko stimulacija ali zaviranje določenih procesov (+ ali -) ne sluţijo kot hranila odgovor tarčnega tkiva na prisotnost hormona, je odvisen od njegove občutljivosti, t.j. razpoloţljivosti receptorskih molekul na membranah celic v tarčnem tkivu

4 Rastlinski rastni hormoni so zunajcelični signali, ki jih lahko celica prepozna s pomočjo posebnih receptorjev, ki so nameščeni na celični membrani (plazmalemi) ali, potem ko se hormon prenese v celico, s pomočjo znotrajcelilčnih receptorjev, ki so nameščeni v citoplazmi ali v jedru. Tarčna celica zaznava hormone s pomočjo receptorjev hormon hormon plazmalema receptor na plazmalemi znotrajcelični receptor celična stena

5

6 Skupine rastlinskih rastnih hormonov avksini citokinini giberelini abscizinska kislina etilen jasmonati brasinolidi salicilna kislina sistemin hormonom podobne spojine

7 GIBERELIN (GA 1 ) ETILEN ABSCIZINSKA KISLINA AVKSIN (indolocetna kislina) CITOKININ (zeatin) jasmonska kislina brasinosteroid salicilna kislina poliamin

8 AVKSINI

9 Odkritje avksinov proučevanje fototropizma - koleoptila trav se ukrivi proti viru svetlobe C.Darwin, F. Darwin (1880): svetlobo zaznava vršiček koleoptile, rastna cona koleoptile je nekaj mm pod vršičkom obstajati mora, siganal, ki se pod vplivom svetlobe tvori v vršičku in prenese do rastne cone, kjer povzroči hitrjšo rast na neosvetljenem delu koleoptile Boysen-Jensen (1913): poskusi z omejevanjem transporta iz vršička Paál (1919): poskusi z dekapitirano koleoptilo F. Went (1926): poskusi z agarnimi bloki

10 = prvi list = koleoptila

11 4 dni stara sejanka ovsa svetloba koleoptila seme pri intaktni sejanki pride do krivljenja če odstranimo vršiček koleoptile, krivljenja ni če je vršiček koleoptile zastrt, krivljenja ni korenine Rastni stimulus se sintetizira v vršičku koleoptile in vpliva na rastno cono.

12 Rastni stimulus je kemijska snov. Rastni stimulus je difuzibilen. košček sljude na neosvetljeni strani, krivljenja ni košček sljude naosvetljeni strani, krivljenje je Ţelatina ne omejuje transporta rastnega stimulusa iz vršička koleoptile, krivljenje je moţno. Če odtrsnimo vršiček koleptile in ga poloţimo nazaj na odrezano koleptilo tako, da je nameščen samo na eno stran, pride do krivljenja koleoptile ne da bi jo izpostavili usmerjeni svetlobi.

13 Kot ukrivljenja ( ) Kot ukrivljenja ( ) Vršički koleoptile poloţeni na ţelatino Po določenem času vršičke odstranimo, ţelatino nareţemo na bloke Bloke poloţimo stransko na odrezane koleoptile, te se krivijo v temi, merimo kot ukrivljenja Število vršičkov, ki so bili inkubirani na posameznem ţelatinoznem bloku. Indol-ocetna kislina (IAA; avskin v ţelatinoznem bloku (mg L -1 )

14 Indolocetna kislina - IAA Kemijska narava avksinov je bila odkrita v sredini tridesetih let 20. stoletja Indolocetna kislina (IAA) je najbolj razširjen in fiziološko najpomembnejši avksin v rastlinskem svetu. - odkritje drugih avksinov - sinteza avskinskih analogov

15 Avksini indolmaslena kislina (IBA) 4-kloroindolocetna kislina fenilocetna kislina 2,4-diklorfenoksiocetna kislina (2,4-D) naftalenocetna kislina

16 Analiza avksinov v rastlinskem tkivu biotest: ukrivljenje koleoptile ovsa (Avena sativa) - večja koncentracija avksina, močnejša ukrivljenost ( mg L -1 ) radiološki imuno test (RIA) (10-9 g) protitelesa, ki prepoznajo IAA, radioaktivna IAA ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) - avksin je konjugiran na encim kromatografske metode, tankoplastna, HPLC in plinska (GC) kromatografija + masna spektrometrija (10-12 g)

17 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay Pri ELISI vzorec (rdeče kroţci) veţemo na posebno ploščico. Dodamo specifična protitelesa (oranţna), ki se veţejo z molekulami, katerih koncentracije ţelimo izmeriti. Ta protitelesa so primarna. Na njih veţemo sekundarna protitelesa (modra), ki so povezana s proteinom,encimom, ki katalizira reakcijo s substratom, ob kateri nastaja obarvan produkt. Pred dodatkom substrata izperemo vsa nevezana protitelesa. Intenziteta barve je sorazmerna s količino proučevanih molekul

18 Sinteza avksinov poteka v hitro rastočih tkivih nadzemnega dela rastline vršni meristemi mladi listi razvijajoči plodovi tudi v starejših listih in koreninskih vršičkiv, vendar manj glavni prekurzor je aminokislina triptofan - ki se lahko na več moţnih načinov pretvori v IAA pot indolpiruvične kisline (IPA) pot triptamina pot indolacetonitrila pot indol-3-acetamida od triptofana neodvisna pot sinteze (prekurzor je indol-3-glicerol fosfat)

19 triptofan indol-3-acetamid indol-3-acetaldoksim indol-3-piruvična kislina triptamin indol-3-acetonitril indol-3-acetaldehid indol-3-etanol indol-3-ocetna kislina (IAA)

20 Polarni transport avksina avksin se v koleoptili ovsa transportira od vršička do baze = POLARNI TRANSPORT ker predstavlja vršiček poganjka glavni vir avksina nastane s polarnim transportom v rastlini gradient avksina longitudinalni gradient avksina vpliva na mnogo razvojnih procesov npr. podaljševanje stebla, apikalno prevlado, celjenje poškodb, staranje listo, itd.

21 Polarni transport avksina agarni blok, ki vsebuje avksin A (donor) apikalni del (A) B (prejemnik) bazalni del (B) B (donor) A (prejemnik)

22 H+-kotransport avksina apeks plazmalema celična stena citosol 1. IAA vstopa v celico pasivno (IAAH) ali z aktivnim transportom (IAA - ) 2. protonske črpalke vzdrţujejo kisel ph celične stene vakuola 3. v citosolu, ki ima nevtralen ph, prevladuje disocirana oblika avksina (IAA - ) baza 4. anioni IAA - zapuščajo celico s pomočjo posebnih prenašalnih proteinov, ki so skoncentrirani na bazalnem delu celice

23 Privzem avksina omogoča membranski potencial in gradient ph ( E+ ph) pasivni transport nedisociiranega avksina IAAH aktivni transport disociiranega avksina IAA - ; simport z H + Efluks avksina je pogojen samo z membranskim potencialom ( E)

24 Polarni transport avksina polarni transport je aktiven mesto polarnega transporta: ţilni parenhim (dvokaličnice) hitrost polarnega transporta: 1 cm h -1 za iztok avksina je odgovoren PIN-prenašalni protein inhibitorji polarnega transporta avksina (antiavksini): blokirajo iztok avksinov NPA (naftiltalamična kislina) TIBA (trijodobezojeva kislina) Nepolarni transport avksina floem

25 Dejavniki, ki vplivajo na ravnoteţje IAA v celici od triptofana odvisna biosinteza od triptofana neodvisna biosinteza IAA konjugacija transport kopartmentizacija v kloroplastu oksidacija dekarboksilacija

26 UDP-glukoza Konjugacija avksinov aspartat indol-3-ocetna kislina Indolacetilaspartat mio-inozitol Indolacetil-β-D-glukoza večina avksina v rastlini se nahaja v konjugirani obliki (t.j. avksin je kovalentno vezan na druge molekule, npr. glukozo, mioinozitol, amidi ) konjugirane oblike so neaktivne

27 Razgradnja avksina Razdradnja je oksidativna razgradnja z dekarboksilacijo nekarboksilacijska razgradnja Nahajanje avksina v celici citosol kloroplast

28 Dejavniki, ki vplivajo na ravnoteţje IAA v celici od triptofana odvisna biosinteza od triptofana neodvisna biosinteza IAA konjugacija transport kopartmentizacija v kloroplastu oksidacija dekarboksilacija

29 Fiziološki učinki avksina rast koleoptile in stebla, rast korenin mehanizem celične rasti: avksin zakisanje celične stene razteznosti celične stene

30 18 urna inkubacija v vodi 18 urna inkubacija v avksinu

31 Avksin poveča razteznost celične stene in omogoča celično rast (glej poglavje rast celic!) r p ksiloglukan, ki kriţno povezuje mikrofibrile celuloze smer delovanja raztezne sile ob večanju volumna encimi, ki rahljajo steno mikrofibrile celuloze... razteznost celične stene... minimalni pritisk (turgor), potreben za celično rast razteznost celične stene (stress relaxation) elastične in plastične lastnosti stene ph hitrejša rast (vpliv avksina) ekspanzini proteini, ki rahljajo vodikove vezi med polisaharidi celične stene ksiloglukanendotransglikozilaza

32 Avksin in vpliv v zmanjšanje ph v celični steni, ki omogoča večjo razteznost stene in s tem celično rast. Avskin naj bodisi stimuliral delovanje protonskih črpalk (1) ali pa stimuliral sintezo le-the (2-6)

33 Fiziološki učinki avksina rast koleoptile in stebla, rast korenin mehanizem celične rasti: avksin zakisanje celične stene razteznosti celične stene fototropizem gravitropizem...

34 A B Pri odgovoru rastline na svetlobo (A) ali silo zemeljske teţnosti (B) se v hipokotilu avksin različno razporeja. V prvem primeru se avksin kopiči na senčeni strane hipokotila, v drugem pa na spodnji strani. Rastline navadnega repnjakovca (Arabidopsis thaliana) so bile transformirane z DR5::GUS reporterskim genom

35 Mehanizem fototropizma A) tema B) usmerjena svetloba vršiček koleoptile koruze blok agarja C) D) popolnoma ločeni polovici vršička koleoptile, ni prerazporejanja avksina delno ločeni polovici vršička koleoptile, prerazporejanje avksina

36 Akcijski spekter za fototropizem

37 Razlaga fototropizma Cholodny-Went-ov model v vršičku koleoptile se sintetizira IAA v vršičku koleoptile se zaznava usmerjena svetloba posledica usmerjene svetlobe je lateralno prerazporejanje avksina, ki se vpliva na rast koleoptile receptor za fototropizem je fototropin, protein vezan na plazmalemo, ob absorpciji modre svetlobe se fosforilira

38 A B Pri odgovoru rastline na svetlobo (A) ali silo zemeljske teţnosti (B) se v hipokotilu avksin različno razporeja. V prvem primeru se avksin kopiči na senčeni strane hipokotila, v drugem pa na spodnji strani. Rastline navadnega repnjakovca (Arabidopsis thaliana) so bile transformirane z DR5::GUS reporterskim genom

39 Rast v dolţino (mm) Fototropizem - rast koleoptile neosvetljena stran kontrola brez osvetlitve osvetljena stran Čas (min)

40 Gravitropizem negativni gravitropni odgovor nadzemnega dela

41 Gravitropizem - pozitivni gravitropni odgovor korenin intaktna korenina - kontrola korenina brez koreninske čepica, vertikalno korenina z delno odstranjeno koreninsko čepico, vertikalno korenina koreninska čepica horizontalno orientirana korenina s kor. čepico normalno krivljenje horizontalno orientirana korenina brez kor. krivljenja ni Za gravitropizem korenin je pomembna koreninska čepica!

42 Koreninski vršiček Statocita Amiloplast (statolit) Navpični poloţaj Vodoravni poloţaj Amiloplast Koreninski vršiček Enakomeren pritisk amiloplastov na endoplazmatski retikulum Neenakomeren pritisk amiloplastov na endopl. retikulum

43 Gravitropizem - navpično orientirana korenina korteks ţila cona podaljševanja koreninska čepica statocita (povečano) statoliti enakomerna lateralna razporeditev avksina

44 Gravitropizem - horizontalno orientirana korenina majhna koncentracija IAA stimulira rast celic zgornje strani korenine cona inhibicije velika koncentracija IAA inhibira rast celic spodnje strani korenine neenakomeren poloţaj statolitov, povečano iztekanje IAA na spodnjo stran

45 Vpliv različnih koncentracij avksina na rast različnih delov rastline brst nadzemni del korenine koncentracija g L -1

46 Fiziološki učinki avksina rast koleoptile in stebla, rast korenin mehanizem celične rasti: avksin zakisanje celične stene razteznosti celične stene fototropizem gravitropizem apikalna prevlada razvoj lateralnih in adventivnih korenin premostitev začetka abscizije (odpadanja listov in plodov) regulacija razvoja cvetnih brstov zorenje plodov indukcija diferenciacije ţilnega tkiva...

47 Apikalna prevlada (dominanca) vršiček inhibiran razvoj stranskih poganjkov odstranjen vršiček stranski poganjki niso inhibirani razvijajoči se stranski poganjki

48 Apikalna prevlada (dominanca) odstranjen vršnji brst avksin stranski brsti odstranjen vršnji brst stranski brsti stranski poganjki Regulira jo več hormonov, za njo pa je ključen nastanek avksina v rastnem vršičku glavnega poganjka in njegov polarni transport. Avksin ne vstopa v aksilarne brste in ne inhibira direktno njihovega razvoja. Njegovo delovanje naj bi bilo omejeno na ksilem in sklerenhimatsko tkivo ţil v steblu. Novejše raziskave nakazujejo, da so v regulacijo apikalne prevlade vpleteni strigolaktoni, terpenoidni laktoni, ki jih lahko proizvajajo tako nadzemni, kot tudi korenine, vendar njihova vloga še ni povsem pojasnjena. Nasprotno pa je dobro poznan učinek citokininov, katerih velike koncentracije spodbudijo intenziven razvoj pazdušnih poganjkov.

49 Avskin in indukcija korenin + avksin + avksin kontrola Dodatek indol-maslene kisline (IBA) v tkivni kulturi stimulira razvoj adventivnih korenin iz kalusa

50 Avksin in razvoj plodov endosperm kot vir avksina za začetne faze rasti ploda PARTENOKARPIJA = razvoj ploda brez prisotnosti semen, razvoj neoplojenih cvetov lahko doseţemo z avksinom Avksin, ki ga proizvajajo razvijajoči embriji stimulira razvoj ploda Če odstranimo plodiče, se plod ne razvije Če odstranimo del plodičev, se plod razvije neenakomerno

51 Avksin je pomemben za diferenciacijo prevodnih tkiv avksini citokinini ranitev kopičenje hidrolitičnih encimov, sinteza cel. stene Ca 2+ / CaM cisteinske proteaze brasinosteroidi RNaze DNaze proteaze razgradnja tonoplasta sekundarna cel. stena RNaze DNaze proteaze razgradnja cel. org. nastanek trahej (traheid) = ksilogeneza izolirane mezofilne celice diferencirane traheje

52 vršni brst vršiček je odrezan, listi in brsti nad rano so odstranjeni, zato da je zmanjšana vsebnost endogenega avkisna takoj po ranitvi je na steblo nanešen avskin (IAA) v obliki avksinske paste nodij mlad list odrasel list IAA v lanolinu rana rana ţile kotiledon intaktna rastlina kumare okoli rane se pod vplivom avksina, ki difundira z mesta nanosa, diferencirajo elementi ksilema

53 Tvorba adventivnih korenin na stiku med cepičem in podlago pri zelenem cepljenju paradiţnika je posledica polarnega transporta avksina in njegovega kopičenja na bazi cepiča. Poskus: Nina Kacjan-Maršič Foto: Franci Celar

54 Mehanizem delovanja avksina pri zaznavanju avskina sodelujejo receptorski proteini ABP (auxin binding protein) direktni učinek (primer direktne aktivacije protonskih črpalk z IAA in s pomočjo ABP57) membranski receptor ABP1 na membrani endoplazmatskega retikuluma (ER), na plazmalemi hitri učinki avksina hiperpolarizacija membrane v 1-2 minutah (preprečeno z inhibitorji H + -ATPaz in blokatorji ABP1) prenos signala v celici lahko poteka preko sprememb [Ca] kot sekundarnega sporočevalca ali spremembe znotrajceličnega ph vpliv na ekspresijo genov - hitri odgovori - kasnejši odgovori

55 Komercialna uporaba sintetičnih avksinov dolga tradicija (50 let) koreninjenje potaknjencev kontrola cvetenja kontrola abscizije avksinski herbicidi: 2,4-D, dicamba (zatiranje širokolistnih plevelov)

56 GIBERELINI

57 Giberelini odkriti v tridesetih in petdesetih letih 20. stol bolezen riţa bakanae, visoka stebla, brez tvorbe semen odkrili so, da bolezen povzroča kemična snov iz glive Giberella fujikorii izolacija iz filtratov te glive giberelini, giberelinska kislina (GA 3 ) ali so giberelini prisotni tudi v rastlinah? več kot 110 kemično zelo sorodnih spojin, ki pa niso vse aktivne (intermediati v metabolizmu giberelinov) osnova je ent-kauren

58 GA3 - giberelinska kislina

59

60 učinek giberelina GA 3 na rast pritlikave mutante graha (progress No.9) levo = kontrola, desno = tretirane rastline, 7 dni po dodatku 5 µg GA 3

61 Pri zelju lahko z giberelinom doseţemo intenzivno rast v dolţino in cvetenje

62

63 Biosinteza giberelinov terpenoidna pot, giberelini so diterpeni mesto sinteze: mladi, aktivno rastoči poganjki, listi, zgornji internodiji 1. reakcije ciklizacije nastanek ent-kaurenskega skeleta 2. reakcije oksidacije do GA 12 -aldehida 3. tvorba vseh ostalih giberelinov iz GA 12 -aldehida GA 12 -aldehid GA 12 GA 53 GA 44 GA 19 GA 20 GA 1 GA 29 GA 8

64 Biosinteza giberelinov

65 Fiziološki učinki giberelinov stimulacija rasti stebla rozetastih in pritlikavih rastlin prehod iz juvenilne v odraslo fazo iniciacija cvetenja in določanje spola cvetov nastanek plodov kalitev - prekinitev dormance

66 Uravnavanje biosinteze giberelinov fotoperioda (kratek dan, dolg dan) temperatura (stratifikacija, vernalizacija) koncentracija giberelinov

67 Fotoperioda in giberelini AMO = inhibitor biosinteze giberelinov GA 3 = giberelinska kislina Pri špinači pride do podaljševanja stebla in listnih pecljev ob izpostavitvi dolgim dnevom (LD). Inhibitor biosinteze giberelinov učinek dolgega dne izniči (LD+AMO), podaljševanje pa lahko doseţemo, če takšnim rastlinam dodamo eksogeni giberelin (LD+AMO+GA 3 ).

68 porast količine v % vsebnost posameznih giberelinov na začetku izpostavitve dolgemu dnevu (ng/g FW) Petkratno povečanje koncentracije GA 1 je dejavnik, ki pospešuje podaljšanje rast špinače število dolgih dni

69 Vsebnost GA 1 (ng g FW -1 ) Giberelini in svetloba hitro zmanjšanje GA 1 zaradi razgradnje tema iz teme na svetlobo 4h iz teme na svetlobo 24h iz teme na svetlobo 120h kontinuirana svetloba

70 Transport giberelinov floem mesto sinteze: mladi, aktivno rastoči poganjki, listi, zgornji internodiji

71 Biotesti za gibereline, analiza giberelinov podaljševanje hipokotila solate podaljševanje listov pri riţu kontrola 100 pg GA 3 1 ng GA 3 indukcija -amilaze v aleuronski plasti semen ječmena HPLC-MS GC-MS

72 Fiziološki učinki giberelinov stimulacija rasti stebla rozetastih in pritlikavih rastlin prehod iz juvenilne v odraslo fazo iniciacija cvetenja in določanje spola cvetov nastanek plodov kalitev - prekinitev dormance

73 prvi list koleoptila apikalni meristem poganjka testa / perikarp aleuronska plast škrobni endosperm aleuronske celice hidrolitični encimi GAs = giberelini produkti hidrolize skutelum korenina

74 Giberelini in kalitev Model kalitve ječmenovega semena počivajoče seme sprejem vode, embrio sintetizira GIBERELINE, ki se prenesejo v aleuronsko plast semena GIBERELIN inducira sintezo hidrolaz v aleuronski plasti (amilaza, nukleaze, proteaze). Ti encimi prehajajo v endosperm. Sintezo hidrolitičnih encimov inhibira ABA amilaza v endospermu razgrajuje škrob, proteaze sproščajo iz proteinov aminokisline iz triptofana se sintetizirajo AVKSINI, nukleaze sproščajo prekurzorje CITOKININOV avksini in citokinini spodbujajo embrio k celičnim delitvam in rasti v dolţino

75 Mikroskopski posnetek alevronske plasti celic ječmenovega semena Protoplasti alevronskih celic v zgodnji (levo) in pozni fazi tvorbe encima amilaza. PSV = vezikli ki vsebujejo protein (encim) PSV PSV

76 Odgovor na GA (%) α-amilaza RNaza DNaza Čas po tretiranju z GA (min)

77 Mehanizem delovanja giberelinov vezava na receptor prenos signala (transdukcija) izraţanje genov zgodnjega odgovora izraţanje genov poznega odgovora podaljševanje stebel giberelin pospešuje delitve celic v meristemih vpliv na proteine, ki regulirajo celični cikel rast celic povečanje razteznosti celične stene

78 Uporaba giberelinov proizvodnja sadja daljšanje pecljev vinskih jagod podaljševanje plodov proizvodnja slada iz ječmena povečevanje pridelka sladkornega trsa indukcija cvetenja - proizvodnja semen mutante z manj giberelina inhibitorji sinteze giberelinov