3. Πρωτεΐνες των κοκκίων των ηωσινόφιλων

3. Πρωτεΐνες των κοκκίων των ηωσινόφιλων Γ.Χρ. Μελέτης 1, Σ. Μασουρίδη 1, Α. Σαραντόπουλος 1, Α. Σπηλιοπούλου 1, Ι.Β. Ασημακόπουλος 1, B. Μηλιώνης 1, Μ. Ασπραδάκη 1, Ε. Βαριάμη 1, Ε. Τέρπος 2 ΚΥΡΙΑ ΣΗΜΕΙΑ Ηωσινόφιλα κοκκία Πρωτεΐνες ηωσινόφιλων κοκκίων Αποκοκκίωση ηωσινόφιλων 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα άφθονα κοκκία των ηωσινόφιλων περιέχουν πληθώρα ουσιών που λαμβάνουν μέρος στη φλεγμονώδη αντίδραση όπως οι πρωτεΐνες των κοκκίων [MBP (major basic protein), ECP (eosinophil cationic protein), EDN (eosinophil derived neurotoxin), EPO (eosinophil peroxidase)], ουσίες που παράγοντα μετά την ενεργοποίηση των ηωσινόφιλων, όπως χημειοκίνες, αρκετές πρωτεάσες και υπεροξείδια, ένζυμα (λυσοφωσφολιπάση, φωσφολιπάση D, αρυλσουλφατάση, ισταμινάση, κατάλαση, όξινη φωσφατάση, μη ειδικές εστεράσες, γλυκαζοαμινογλυκάνες, αξοζαμινιδάση, ζελατινάσες), κυτταροκίνες (IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, Il-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-16,GM-CSF, TGF-α, TGF-β, TNG-α), χημειοκίνες (MCP-1, MIP- 1α, PDGF, VEGF, RANTES, εοταξίνη) και μεμβρανικούς μεσολαβητές (LTC 4, PAF, 15-HETE, PGE 1, PGE 2, TXB 2 ). Όλες αυτές οι ουσίες παίζουν σημαντικό ρόλο στη συμμετοχή των ηωσινόφιλων στην ανοσολογική απάντηση στις παρασιτικές λοιμώξεις αλλά και στην αντοχή σε μερικούς τύπους νεοπλασμάτων. Λόγω της δράσης αυτών των ουσιών ιδιαίτερα σε περιπτώσεις αθρόας παραγωγής και διασποράς φαίνεται ότι συμμετέχουν σε τοπικές ιδιαίτερα βλάβες στην πορεία διάφορων νοσημάτων ιδιαίτερα στην καρδιά, πνεύμονες, δέρμα, νευρικά κύτταρα, πεπτικό σωλήνα κλπ. Πιο σημαντικές είναι οι δράσεις στους διάφορους ιστούς από την μείζονα βασική πρωτεΐνη (major basic protein, MBP), την κατιονι- 1 A Παθολογική Κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών, Νοσοκομείο Γενικό Λαϊκό, Αθήνα, 2 Αιματολογική Κλινική και Τμήμα Βιοϊατρικής Έρευνας 251 Γενικό Νοσοκομείο Αεροπορίας, Αθήνα 42

κή πρωτεΐνη των ηωσινόφιλων (eosinophilic cationic protein, ECP), την υπεροξειδάση (eosinophil peroxidase, EPO), και τη νευροτοξίνη (eosinophil-derived neurotoxin, EDN ή EPX). 2. ΗΩΣΙΝΟΦΙΛΑ ΚΟΚΚΙΑ Είναι σαφές ότι ο κύριος διεγέρτης της ωρίμανσης και απελευθέρωσης των ηωσινόφιλων από τον μυελό των οστών είναι η IL-5, η οποία συμμετέχει στη σύνθεση των πρωτεϊνών των ηωσινόφιλων κοκκίων στα άωρα κύτταρα της ηωσινοφιλικής σειράς. Ο κρυσταλοειδής πυρήνας (core) των κοκκίων περιέχει MBP και περιβάλλεται από την matrix που περιέχει κυρίως ECP, ΕPO και EDN. Η MBP είναι ένα πολυπεπτίδιο με 117 αμινοξέα που συμμετέχει ενεργά στη βλάβη και διάσπαση της μεμβράνης διάφορων κυττάρων. Επιπλέον ακόμα και μικρές συγκεντρώσεις της φαίνεται να μεσολαβεί στην παραγωγή ουσιών από διάφορα κύτταρα που συμμετέχουν στη φλεγμονώδη αντίδραση όπως IL-8 από τα πολυμορφοπύρηνα (χημειοτακτικός παράγων). Οι MBP, ECP και EPO έχουν κυτταροτοξική δράση εμπλεκόμενες στην ανοσολογική αντίδραση σε παρασιτικές λοιμώξεις (ελμινθιάσεις), αλλά μπορεί να προκαλέσουν βλάβες ή και καταστροφή κυττάρων (π.χ. επιθηλιακά κύτταρα του αναπνευστικού). Η ΕPO των ηωσινόφιλων είναι διμερική πρωτεΐνη που περιέχει αίμη και μοιάζει κατά πολύ με την υπεροξειδάση των πολυμορφοπυρήνων και η τοξική της δράση είναι σημαντική όταν συμμετέχει στο υπόστρωμα το υπεροξείδιο του υδρογόνου, το βρομίδιο ή ΝΟ (μια πιθανή οδός με την οποία η ΕPO των ηωσινόφιλων μπορεί να συμμετέχει στη φλεγμονώδη αντίδραση στο άσθμα). Η ECP είναι μια ριβονουκλεάση που εκκρίνεται υπό διάφορες μορφές κατασκευαστικά και αντιγονικά από τη μορφή που είναι αποθηκευμένη στα κοκκία. Με μονοκλωνικό αντίσωμα υπάρχουν αντικρουόμενα δεδομένα αν μπορεί να γίνει διάκριση των μη διεγερμένων ηωσινόφιλων (EG1) από τα ενεργοποιημένα ηωσινόφιλα (EG2). Η EDN έχει δράση ριβονουκλεάσης όπως και η ECP αλλά φαίνεται να μην είναι τοξική για τα παράσιτα ή τα κύτταρα των θηλαστικών. Τόσο η ΕCP όσο και η EDN μπορεί να βρεθούν και στα πολυμορφοπύρηνα. H ΕCP υπάρχει στην matrix των ηωσινόφιλων κοκκίων μαζί με την EDP και την ΕPO, ενώ η MBP βρίσκεται στο κρυσταλοειδές τμήμα των κοκκίων. Η ΕCP έχει δράση ριβονουλεάσης πολλαπλάσια (100x) της ΕDP και μαζί με την MBP έχουν κυτταροτοξική δράση για διάφορα κύτταρα (μικρόβια, παράσιτα και κύτταρα θη- 43

λαστικών) και προκαλεί αναστολή πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων, ενώ έχει δράση και στη διαπερατότητα των αγγείων. Η μέσω της ECP ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων είναι μικρότερη σε σχέση με τη δράση της MBP και EPO. H μέτρηση της ECP στις διάφορες εκκρίσεις μπορεί να δώσει σημεία ενεργοποίησης των ηωσινόφιλων σαν ένδειξη της φλεγμονώδους αντίδρασης που εξαρτάται από την IgE. Πιθανότατα στο μέλλον η μετρήσεις όλων πρωτεϊνών των κοκκίων των ηωσινόφιλων θα βοηθήσουν σημαντικά στις μη ειδικές διαταραχές με ηωσινοφιλία και στις περιπτώσεις που υπάρχει πραγματικά ιστική διαταραχή λόγω αποκοκκίωσης των ηωσινόφιλων (π.χ. σύνδρομο Churg-Stauss από το αλλεργικό άσθμα ή ηωσινοφιλική οισοφαγίτδα από οισοφαγίτιδα από παλινδρόμηση κ.λπ.). 3. ΑΠΟΚΟΚΚΙΩΣΗ ΤΩΝ ΗΩΣΙΝΟΦΙΛΩΝ Τα ηωσινόφιλα βρίσκονται σε σημαντική αναλογία στους ιστούς όπου και ασκούν τις λειτουργίες τους. Η αποκκοκίωση των ηωσινόφιλων συμμετέχει σε σημαντικό βαθμό στην παθογένεια αρκετών νοσημάτων όπως αλλεργική ρινίτιδα, βρογχικό άσθμα, ηωσινοφιλική πνευμονία κλπ. Σε αρκετές περιπτώσεις ενώ το κύτταρο είναι ακέραιο, εντούτοις τα κοκκία χρωματίζονται έντονα και τα ηωσινόφιλα είναι αποκοκκιωμένα με διάσπαρτα ελεύθερα κοκκία στους γύρω ιστούς. Πιθανότατα τα κοκκία εξέρχονται του κυττάρου με εξωκύττωση ή τμηματική αποκκοκίωση ή καταστροφή του ηωσινόφιλου. Πιθανότατα προηγείται ένα στάδιο προσκόλλησης των κυττάρων στον ευαισθητοποιημένο στόχο (π.χ. προνύμφες παρασίτων με επικάλυψη από ανοσοσφαιρίνες ή και συμπλήρωμα που ευοδώνει την αποτελεσματική κυτταροτοξικότητα του ηωσινόφιλου προς το παράσιτο. Τα ηωσινόφιλα του αίματος αυξάνουν την απελευθέρωση των πρωτεϊνών των κοκκίων με τη δράση PAF, εοσινοταξίνη ή IL-5, ή με σύνδεση της εκκριτικής IgA των βλεννογόνων με τους υποδοχείς Fcα ή Fcγ ενός κυττάρου στόχου. Με τον τρόπο αυτό μπορεί το ηωσινόφιλο να συμμετέχει σημαντικά στην καταστροφή παρασίτων που μολύνουν το πεπτικό σωλήνα. Παρά τη σχέση IgE και αλλεργικών νοσημάτων, φαίνεται ότι η σύνδεση με τον υψηλής συγγένειας υποδοχέα της IgE των ηωσινόφιλων δεν προκαλεί σημαντική τους αποκκοκίωση. Η αλληλεπίδραση των ηωσινόφιλων μέσω ιντεγκρινών με τις πρωτεΐνες της επιφάνειας των κυττάρων ή αντισώματα μπορεί ανάλογα με τη διέγερση να τροποποιήσει ή να αυξήσει της απελευθέρωση ουσιών από τα κοκκία (ο GM-CSF αυξάνει την απελευθέρωση EDN μέσω της VCAM-1 και ICAM-1). Η διέγερση των ηωσινόφιλων και από διαλυτούς παράγοντες όπως εοταξίνη έχει σαν αποτέλεσμα απελευθέρωση ΕCP μέσω ενεργοποίησης πρωτεϊνικής κινάσης. Δεν είναι γνωστοί όλοι οι μηχανισμοί ελέγχου της απελευθέρωσης των κοκκίων των ηωσινόφιλων αλλά είναι μάλλον βέβαιη η πολύπλοκη σχέση των διαφόρων 44

μεσολαβητών φλεγμονής, αυξητικών παραγόντων, κυτταροκινών, μορίων προσκόλλησης στην τροποποίηση των λειτουργιών των ηωσινόφιλων. 4. ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΚΟΚΚΙΩΝ ΤΩΝ ΗΩΣΙΝΟΦΙΛΩΝ Τα ηωσινόφιλα είναι πηγή αυξητικών παραγόντων και ρυθμιστικών ή προφλεγμονωδών κυτταροκινών/χημειοκινών. Έχει γίνει αποδεκτό ότι τα ηωσινόφιλα τις συνθέτουν και τις αποθηκεύουν στα κοκκία τους. RANTES (regulated uponactivation, normal T cell expressed and secreted) αποθηκεύεται τόσο στην matrix των κοκκίων μαζί με την MBP και EPO, όσο και εκτός των κοκκίων (ταχύτερη απελευθέρωση μετά διέγερση με IFN-γ). H IL-6 επίσης συνδυάζεται με τις πρωτεΐνες των κοκκίων όπως EPO, MBP, αρυλσουλφατάση και β-εξοζαμινιδάση κ.α. Όλες αυτές οι κυτταροκίνες/χημειοκίνες φαίνεται ότι έχουν σημαντική συμμετοχή στις τοπικές θέσεις της αλλεργικής φλεγμονώδους αντίδρασης με αυτοκρινή ή παρακρινή απελευθέρωση. Αρκετά νοσήματα με ηωσινοφιλία αίματος ή ιστική όπως το βρογχικό άσθμα χαρακτηρίζονται από διήθηση π.χ. του βρογχικού βλεννογόνου από προφλεγμονώδη κύτταρα με επικράτηση των ηωσινόφιλων. Προηγείται σημαντική αύξηση της παραγωγής ηωσινόφιλων από το μυελό, αυξημένη απελευθέρωση στο περιφερικό αίμα και εκλεκτική συνάθροισή τους τις αεροφόρους οδούς μέσω μορίων προσκόλλησης και χημειοτακτικών ουσιών. Φαίνεται η βαρύτητα της προσβολής σχετίζεται με τα επίπεδα των ηωσινόφιλων και των προϊόντων τους στο αίμα, πτύελα, βρογχικό έκπλυμα ή βιοψία. Σημαντική σχέση και ρόλος μεταξύ επιπέδων MBP, ΕCP υπεραντίδρασης από τους βρόγχους και βρογχικής απόφραξης. Η διέγερση των ηωσινόφιλων με TNF-α μπορεί να προκαλέσει απελευθέρωση μεταμοπρωτεϊνασών που μερικές φαίνεται να έχουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων και διαταραχές στην ακεραιότητα της κυτταρική μεμβράνης των επιθηλιακών κυττάρων. Σε μερικές περιπτώσεις π.χ. λοίμωξη από τον RSV (respiratory syncytial virus) απελευθερώνονται άλλοτε άλλα ποσά ECP, EDN, MBP από τα συγκεντρωθέντα ηωσινόφιλα λόγω παραγωγής ηωσινοχημειοκινών από τα επιθήλια όπως RANTES, MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1), MIP-1α (macrophage inflammatory protein) που έχουν σκοπό να εξουδετερώσουν τον ιό. Είναι γνωστή σχέση των ηωσινόφιλων και των μαστοκυττάρων σε αρκετά νοσήματα που συνδέονται με ηωσινοφιλία. Τα μαστοκύτταρα διεγείρονται να παράγουν ισταμίνη μετά επαφή τους με την MBP, ECP, EPO και ΕDΝ. Επίσης τα ηωσινόφιλα συνθέτουν, αποθηκεύουν και απελευθερώνουν SCF (stem cell factor) που συμμετέχει στη διαφοροποίηση, επιβίωση, πολλαπλασιασμό, ωρίμαση και λειτουργίες 45

των μαστοκυττάρων όπως και o NGF (nerve growth factor) που συμμετέχει στην επιβίωση και διέγερση των μαστοκυττάρων (παραγωγή ισταμίνης) και στην απελευθέρωση EPO από τα ηωσινόφιλα. Τόσο τα ηωσινόφιλα όσο και τα μαστοκύτταρα έχουν συμμετοχή στην εμφάνιση ίνωσης σε διάφορες καταστάσεις, μέσω δράσης στους ινοβλάστες με μεσολάβηση τόσο των πρωτεϊνών των κοκκίων όσο και διαφόρων κυτταροκινών. Η ECP αναστέλλει τη διάσπαση πρωτεογλυκάνης και αυξάνει την ενδοκυττάρια συγκέντρωση γλυκοσαμινογλυκανών στους ινοβλάστες των πνευμόνων. Η MBP και η EDN δρουν συνεργικά με την IL-1 και τον TGF-β για την παραγωγή IL-6 που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και τη σύνθεση κολλαγόνου. Τα ηωσινόφιλα επίσης μπορεί να τροποποιήσουν τις ιδιότητες των ινοβλαστών μέσω του FGF- 2 (fibroblast growth factor), του NGF και του VEGF (vascular endothelial growth factor) αλλά και των IL-4 και IL-13 και να συμμετέχουν στην αγγειογένεση μέσω και άλλων μεσολαβητών (PDGF, b-fgf, IL-8, IL-6, TGF-β, GM-CSF). Στο μέλλον αναμένονται πολλές πληροφορίες για τον ρόλο των ηωσινόφιλων στα αλλεργικά νοσήματα, την ίνωση, την αγγειογένεση και τα νεοπλάσματα ΒιβλιογραφΙα 1. Meeusen ENT, Balic A. Do eosinophils have arolein the killingof helminth parasites? Parasitol Today 2000, 16:95-101 2. Gleich GJ. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol 2000, 105:651-663 3. Moneret_Vautrin D.A. Le dosase de la protein cationic deseosinophiles est-il un marquer utile pour l internist? Rev Med Int 2006, 27:679-683 4. Venge P. Human eosinophil granule proteins: Structure, function and release. In Immunopharmacologyof eosinophils. London, Academic Press 1993 5. Rankin SM, Conroy DM, Williams TJ. Eotaxin and eosinophil recruitment:implication forhumandisease. Mol Med Today 2000, 6:20-27 6. Walsh GM. Eosinophil granule proteins and their role in disease. Curr Opin Hematol 2001, 8:28-33 7. Wang J, Slungaard A. Role of eosinophilic peroxidase in host defense and disease pathology. Arc Biochem Biophys 2006, 445:256-260 8. Broxmeyer HA. Chemokines in hemopoiesis, Curr Opin Hematol 2008, 15:49-58 46

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Α. Ποιες πρωτεΐνες, λεμφοκίνες και άλλες ουσίες περιέχουν τα κοκκία των ηωσινόφιλων; Β. Ποιες είναι οι κύριες δράσεις των πρωτεϊνών των ηωσινόφιλων κοκκίων; Γ. Ποιες είναι αλληλεπιδράσεις των ηωσινόφιλων με άλλα κύτταρα; Δ. Ποια η συμμετοχή των ηωσινόφιλων στο βρογχικό άσθμα; Ε. Ποια κύτταρα είναι ευαίσθητα στις πρωτεΐνες των ηωσινόφιλων κοκκίων; 47