ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Α ΠΡΟΠΑΙ ΕΥΤΙΚΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Α.Π.Θ. ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΜΠΑΣ ΑΝΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2010-2011 Αριθ. 2419 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΘΥΜΙ ΙΛΙΚΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ ΚΑΙ ΘΥΜΙ ΙΛΙΚΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΕΞΑΙΡΕΣΙΜΟ ΟΡΘΟΚΟΛΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΙΩΑΝΝΑ ΗΜΗΤΡΙΟΥ ΤΖΕΒΕΛΕΚΗ ΙΑΤΡΟΣ, ΕΙ ΙΚΕΥΟΜΕΝΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Α ΠΡΟΠΑΙ ΕΥΤΙΚΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Α.Π.Θ. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΠΑΣ ΑΝΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΛΑΥΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΠΑΣ ΑΝΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΛΑΥΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΚΡΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΤΣΑΜΟΥΡΗΣ ΑΣΤΕΡΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΣΑΛΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΖΗΜΑΓΙΩΡΓΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΕΠΙΚ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα» (Νόµος 5343/32, αρθρ.20 2 και ν.1268/82, αρθρ. 50 8)

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ

µ µ µ µ µ. 3

1. 1.1 1.2 µ - µ 1.3 2. 2.1 µ 2.2 Amsterdam 2.3 Bethesda 2.4 µ µ 2.5 µ µ 2.6 2.7 µ 2.8 µ 2.9 µ 2.10 µ 2.11 µ 2.12 3. 3.1 µ - 3.2 4. 5. 7

5.1 5.2 6. 6.1 6.2 µ Dukes (1932) 6.3 µ Astler Coller (1954) 6.4 µ (AJCC 7 ) 7. 7.1 7.2 8. 8.1 8.2 µ 8.3 9. 9.1 9.2 µ µ 9.3 µ 9.4 µ 10. 8

11. 11.1 11.2 µ µ ( ) 11.3 µ 11.4 11.5 RNA 11.6 PCR µ 12. 13. A 13.1 A 13.2 mrna TYMS TYMP 13.3 13.4 mrna TYMS µ 14. 15. 16. 17. SUMMARY 6 9

µ µ µ µ µ, µ. µ µ µ µ µ µ, µ µ. µ, µ µ. µ µ µ,, µ µ µ. µ µ µ, µ µ µ µ µ µ µ. µ µ µ µ ( hymidylate Synthase, TS) µ ( hymidylate Phosphorylase, TP) µ, µ µ µ µ. µ µ, µ µµ, µ µ µ µ µ µµ.., µ, µ µ µ µ, µ µ.., µ, µ µ, µ. 7 11

µ µ µ µ µ µ µ,. µ µ. µ. µ,, µ, µ µ µ µ, µ µ µ µ.., µ... µ. µ - µ, µ µ. µ µ µ µ µ µ µ. µ µ, µ µ µ, µ µ µ. µ µ. µ µ µ µ, µ µ µ µ µ µ, µ µ µ µ. 12

1. 1.1., µ µ, µ µ. 2008 µ µ 663.000 320.000 571.000 288.000 608.000, 8% µ. 1,2 1.2 µ - µ µ µ µ 60 70, µ µ 71 69.,, µ (µ ) -. µ µ. µ ( ).,,, µ, ( ), µ., µ µ,, µ, µ µ. 2 µ µ µ. µ µ, µ µ µ µ µ. 11 15

, µ µ µ µ µ. µ., µ µ,, µ. µ µ µ µ µ, µ µ 30% 1980-1984 2000-2007,, µ µ. 1, µ µ µ, µ 50 50. µ,, µ 18,6%, 4,7%, µ 7%, µ 57,9%. µ, 1,1:1 µ. µ, µ µ. 4,5 µ µ µ, µ µ. µ, µ FAP (Familial Adenomatous Polyposis) µ NPCC (Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer). µ µ µ µ 50., µ µ µ 65. 1,6 80%,, -. µ, µ µ µ 12 16

, µ µ 20%. µ µ µ µ µ -, µ µ µ µ, µ. 1,5 1.3 : - µ > 60 - µ - µ - - - µ (, Crohn) - (, ) - - - µ - µ µ µ µ, µ µ. µ,, µ, µ µ 1,5. 2. 2.1 µ O µ µ, µ µ ( µ 13 17

, aberrant crypt foci), µ ( µ ) µ ( ). µ µ µ. µ µ µ, µ µ,. :, µ. (oncogenes) µ µ µ, µ -., µ µ, -. µ µ µ, G1 µ µ µ. K- ras, BRAF. (tumor suppressor genes) µ S, µ DNA µ µ. : APC,p53, DCC, SMAD4. µ µ DNA µ µ, G2, DNA µ. 7,8 µ, (gatekeepers) (caretakers). µ µ µ, µ. µ µ µ. µ. µ DNA, µ µ ( PCC). 14 18

µ µ µ µ µ µ µ. µ µ. µ µ µ µ. 7,8 µ, TP53. µ, APC, µ µ 5q21 µ 310KDa. APC µ, µ, µ µ µ. µ µ, 80% µ µ µ PC. µ µ ( µ Lynch), µ 5 µ, DNA. hmsh2, hmsh6, hmlh1, hpms1 hpms2, µ µ hmlh1 hmsh2. µ, µ µ, µ µ µ µ µ µ µ µ µ, µ µ µ. µ Amsterdam Bethesda µ µ µ µ (HNPCC). µ MLH1 MSH2 Amsterdam Bethesda. 9,10 2.2 Amsterdam O : ) µ µ HNPCC, ) µ, ) 15 19

) µ 50 2.3 Bethesda O : ) µ µ 2 µ µ HNPCC, µ, µ µ µ HNPCC, ) µ µ µ µ µ / µ µ HNPCC (, µ,, ) / µ 45 µ 40 ) µ µ µ, µ 45, ) µ µ µ µ, µ 45, ) µ µ (signet ring cell), µ 45, ) µ µ µ, µ 45 µ µ µ µ µ µ µ µ µ. µ. 11 2.4 µ µ µ, µ µ : µ µ µ (Loss of heterozygoticity) µ µ µ µ DNA (Mismatch Repair Deficiency Pathway). O µ µ µ µ µ APC. O µ µ µ µ DNA (Mismatch Repair Deficiency Pathway) µ µ, µ (mismatches) µ DNA. 6 (hmlh1, hmsh2, hmsh3, hmsh6, hpms1, hpms2) µ µ µ DNA, µ 16 20

µ µ µ, µ µ (microsatellites). µ µ µ µ (microsatellite instability, MSI) µ µ µ µ. MSI, µ hmlh1 µ µ mrna hmlh1 µ, µ. µ µ, µ µ R µ. µ MSI-H µ, µ µ µ µ. µ µ, 80-90%, µ µ 10-20%. µ µ MSI. MSI (MSI-H) 30-40% µ µ, µ MSI (MSI-L) µ 30-40%., MSI ( icrosatellite stable, MSS) µ. 12,13 µ µ µ µ µ µ µ, µ µ µ. µ, µ, µ. COX-2. µ µ µ µ µ µ, µ, µ,, µ,.., µ, µ µ µ µ.,, µ µ. MSI-H µ µ 17 21

µ µ µ, µ µ. 14,15 µ, µ µ. µ DNA µ µ µ, µ µ µ µ APC, µ µ. µ µ 5 µ µ. µ µ K-ras µ µ µ µ 18q µ µ. µ DCC p53 17q µ, µ µ µ µ. 9,16,17,18 µ µ µ µ DNA, µ R (mismatch mutation repair genes), µ µ µ µ µ DNA. µ µ µ µ µ µ µ µ. 19,20,21,22 H µ µ Volgestein Fearon µ 1 µ 1. 18 22

2.5 µ µ 1) µ 50. 10 µ 50 µ µ 70-75. µ µ µ µ µ, µ 40. 23 2) µ µ µ µ. 3) µ µ. µ, 4,5-5,5 % (µ )., µ µ, µ 8-10%. 4) µ µ µ ( Crohn). µ 5-10 µ µ. 10 µ µ µ µ 20., 20-25,. µ µ 40, µ µ. µ µ µ µ, µ µ µ µ. µ µ µ µ µ. Crohn, µ. 5) µ µ µ. : ) µ µ µ µ, µ µ µ µ. µ 20-25 µ 40. µ µ : 23

- µ (familial adenomatous polyposis FAP) - µ Gardner - µ Turcot - µ Peutz-Jehers 6) µ µ µ µ µ (Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer, HNPCC). µ µ (Lynch I, Lynch II) 4-5% 3,23,24 µ 2. 2.6, 70-80%, µ µ. µ, µ, µ, µ. : 1. µ 2. µ, µ µ µ, - µ 20 24

3. µ µ.,,,... µ, µ ( µ ), µ ( ), µ. µ µ µ µ µ µ. : ), µ µ µ, ) µ, ), µ µ ) µ, µ µ ), µ µ. 1,25 µ., µ, µ µ. µ µ 10 12 /ml, µ, Gram ( ),. µ µ µ µ. µ, µ µ, µ µ µ, µ µ µ. µ, µ µ µ µ (mutagens). -,, -, 7-. µ µ µ µ. µ 21 25

µ, µ µ µ µ. 25,26 µ µ », µ µ µ µ.. µ µ µ, µ µ µ µ. µ µ µ, µ µ µ µ., µ µ µ µ µ µ. H µ µ,., ( ) µ, µ,. µ µ µ µ (, ) µ. µ µ C 6 H 6, - -. 1,26 µ µ µ,, µ µ. µ µ ph.,, µ,. µ,. 40-50%, µ 8,5%. µ µ., µ µ, 22 26

µ. µ., µ µ, µ µ µ.. µ, µ µ.. 1,26,27 µ 60-70%. µ, µ. µ µ µ. µ,,,.,, µ. 26,27,28, µ µ µ, µ,, - -µ, µ, µ µ.. µ µ µ µ,., µ µ µ. µ µ µ µ, µ µ µµ.,, µ µ., µ µ µ µ., µ 23 27

, µ µ. µ µ. µ, µ. 1,27 2.7 µ µ µ µ, µ, µ µ. µ µ 40% µ µ. µ µ µ, µ µ. µ µ > 29 Kg/m 2 µ. 1,2 2.8 µ µ. µ American Cancer Society (ACS) 12% µ. µ. µ, µ µ µ µ µ µ µ µ. µ µ µ µ 20-30 µ 1,2,28 2.9 µ µ µ,, µ. 24 28

µ µ ( ), µ µ. µ 2-3 µ, µ µ µ µ. µ µ µ µ 10. 29, µ, µ, µ µ, µ µ µ µ. 1,27 µ µ µ 100-550 µ µ. µ, µ µ.,, µ. µ µ µ µ, µ µ. 1,4 2.10 µ µ µ µ (NSAIDS). µ µ µ µ. µ µ µ µ, µ µ µ µ. µ µ µ, 30-50%, µ µ µ µ. µ µ NSAIDS µ -2 (COX-2), µµ µ µ. 25 29

COX-2 µ,, -3- µ µ,. O COX-2 celecoxib, µ 400 mg µ µ µ 28%. µ µ µ µ celecoxib. 6,28,30 2.11 µ µ µ µ µµ µ, µ µ µµ µ µ, µ µ µ µ. 1,6,7,28 2.12 µ µ µ, µ µ µ µ µ µ. 31 National Academy of Sciences, American Cancer Society (ACS) µ µ : 1. µ. 2. µ 3., µ. 4. µ µ µ, C, -,,. 5. µ 30

6. µ 30 3. 3.1 µ - µ µ µ µ. µ µ µ µ 20 µ. µ 6, µ 6-8., µ µ, µ µ. µ µ, µ µ µ. µ µ, µ. µ µ µ µ µ 5 18 µ. µ µ ) µ µ µ µ, ) µ µ µ µ, )µ ) µ, µ. µ µ µ µ µ µ : µ,,, µ µ µ µ µ, µ,, µ µ. µ µ µ µ. µ 10, 4-6 3-5, µ 2-2,5, µ 5-7. µ µ µ µ µ -, µ µ µ., µ µ µ. µ µ, µ,. µ µ µ µ µ 27 31

µ µ µ µ. µ µ µ µ., µ µ µ, µ µ µ µ. µ µ µ µ, µ., µ µ µ µ µ µ µ, µ. µ µ µ µ µ. 32,33 µ µ µ, µ. µ µ µ, µ µ, µ µ. µ, µ µ, µ.,, µ µ µ,. 34 µ µ µ µ µ µ. µ µ µ µ 5., µ µ µ µ,, µ, µ Cushing, µ. 3.2 O : 1) E, µ µ, µ µ µ,. 2) A µ, µ µ µ µ 28 32

µ µ, µ µ. 3),, µ, µ ( ). 4) µ, µ µ µ µ µ,. 5) µ, µ,. 6) µ µ µ µ. 4,6 4., µ µ µ. µ µ µ, µ, Crohn. H µ (fecal occult blood testing) µ 90%, µ µ, µ µ µ µ µ. µ µ. µ µ µ µ µ, µ µ. µ µ. µ µ (<1 )., µ,, µ µ µ,., µ µ µ. µ µ µ, 29 33

µ, µ µ, µ µ µ µ. 4,33 µ µ, µ µ 1 µ 90%., µ µ. µ µ µ, µ µ, µ,, µ µ. µ µ CEA µ µ µ µ µ µ., CEA CA 50, CA 19-9, TPA AFP. µ µ, µ, µ µ µ µ µ µ µ µ µ. 81-95% µ µ µ µ µ. µ 35% µ. µ µ µ µ µ, µ APC µ µ DNA (sequencing). 1,4 5. 5.1 µ µ µ µ : µ,, µ, µ µ µ. 30 34

Ως ελκωτικός τύπος, ο οποίος εµφανίζει εξέλκωση, ανώµαλα χείλη και ρυπαρό πυθµένα, διηθεί συνήθως το τοίχωµα προκαλώντας στένωση του αυλού του εντέρου και η εντόπιση του είναι συνήθως στο αριστερό κόλον. Ως δακτυλιοειδής ή στενωτικός τύπος, ο οποίος έχει τάση περιµετρικής αύξησης προκαλώντας απόφραξη και συνηθέστερα εντοπίζεται στο ορθοσιγµοειδές και το κατιόν κόλον. Ως διηθητικός τύπος, µε εκτεταµένη επέκταση που παροµοιάζεται µε την πλαστική λινίτιδα στο στόµαχο. Ως κολλοειδής τύπος, που εµφανίζεται ως ευµεγέθης ζελατινώδης µάζα. 4,32 5.2 Ιστολογικά χαρακτηριστικά Οι ιστολογικοί τύποι του ορθοκολικού καρκίνου είναι οι εξής: 1. Αδενοκαρκίνωµα. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου κατά 95% είναι αδενοκαρκίνωµα, το οποίο εµφανίζει χαµηλή, µέτρια ή υψηλή διαφοροποίηση. Τα αδενοκαρκινώµατα θεωρούνται µικρά όταν η διάµετρός τους είναι 2 εκ. Πρώιµο αδενοκαρκίνωµα ορίζεται εκείνο το νεόπλασµα που δεν επεκτείνεται στο µυϊκό χιτώνα. Τα αδενοκαρκινώµατα θεωρούνται µεγάλα όταν η διάµετρός τους είναι > 2εκ και εµφανίζονται µε ποικίλες µορφές, όπως ελκωτικοί, εξωφυτικοί, θηλώδεις, οζώδεις στενωτικοί ή επίπεδοι όγκοι. Σπανιότερα στο παχύ έντερο εµφανίζεται ο κολλοειδής και ο αµετάπλαστος καρκίνος, ο οποίος είναι υψηλού βαθµού κακοήθειας. Το αδενοκαρκίνωµα του παχέος εντέρου, όταν έχει αδενοειδή σχηµατισµό χαρακτηρίζεται ως χαµηλής διαφοροποίησης (Grade I), όταν το 25% είναι συµπαγές χαρακτηρίζεται µέτριας διαφοροποίησης (Grade II) και όταν το λιγότερο από 25% έχει αδενοειδή διάταξη χαρακτηρίζεται ως υψηλής διαφοροποίησης (Grade III). Το στρώµα είναι µυοϊνοβλαστικό µε ή χωρίς φλεγµονώδη διήθηση και διαφορετικού τύπου αγγειοβρίθεια. Αξιολογείται το βάθος της διήθησης στις στιβάδες, η επέκταση του όγκου στον ορογόνο χιτώνα καθώς και στα παρακείµενα όργανα. Το βλεννώδες αδενοκαρκίνωµα χαρακτηρίζεται από παραγωγή βλέννης σε αναλογία > 50% του όγκου. Ο κολλοειδής τύπος χαρακτηρίζεται από την παραγωγή εξωκυττάριου βλέννης, ενώ στον τύπο «σφραγιστήρος δακτυλίου» υπάρχει παραγωγή ενδοκυττάριας βλέννης. Τα βλεννώδη αδενοκαρκινώµατα έχουν χαµηλό ποσοστό 5ετούς επιβίωσης (<18%), αφορούν συνηθέστερα νέα άτοµα και συχνά αναπτύσσονται σε έδαφος ελκώδους κολίτιδας ή σε εξαλλαγέν λαχνωτό αδένωµα. Ο µέσος 35

µ µ µ 130 µ. 5 ( 10 15 ), µ. 4,33,35 2... Lieberkuhn. µ., µ. 3. µ, µ µ, µ µ µ ( µ, ). µ µ µ µ PV. 4. µ µ. µ. 5. µ. µ. µ µ µ. 6. 6.1 µ µ µ : ), ) µ, ) µ ) µ µ µ.,,, µ µ µ. 1932, C. E. Dukes, St Mark s Hospital. µ Dukes, µ, µ µ stler Coller, 1954, American Joint Committee on Cancer (AJCC) International Union Against Cancer (UICC) µ µ, µ µ µ, ( ), µ ( ) µ µ µ ( ). 33,36 32 36

6.2 µ Dukes (1932) µ µ µ µ. µ µ µ µ µ C µ µ µ µ D µ µ µ µ µ 6.3 µ Astler Coller (1954) 1 µ (Dukes A) 2 µ µ µ, µ µ (Dukes B) C1 µ µ µ, µ µ µ µ C2, µ µ µ µ D* µ µ µ * µ µ stler-coller µ, Pierre Denoix µ 1943 1952, µ µ µ µ µ. µ 1978 7, 2010 AJCC,. C ( 4b,N0), V IVA IVB. 36 6.4 µ (AJCC 7 ) ( ) 0 x µ µ Tis µ in situ, µ T1 33 37

2 3 4a 4b µ µ µ µ µ / µ µ ( ) x µ µ µ 0 µ µ 1 µ 1 3 µ 1a µ N2a 2-3 µ 1c, µ,, µ µ 2 4 µ 2a 4 6 µ 2b 7 µ µ µ µ ( ) 0 µ µ µ 1 µ µ µ 1a,, µ,, µ µ 1b 34 38

µ 3 µ A Dukes MAC 0 Tis N0 M0 - - I T1 N0 M0 A A T2 N0 M0 A B1 IIA T3 N0 M0 B B2 IIB T4a N0 M0 B B2 IIC T4b N0 M0 B B3 IIIA T1 T2 N1 / N1c M0 C C1 T1 N2a M0 C C1 T3 T4a N1 / N1c M0 C C2 T2 T3 N2a M0 C C1/C2 T1 T2 N2b M0 C C1 T4a N2a M0 C C2 T3 T4a N2b M0 C C2 T4b N1 N2 M0 C C3 IIIB IIIC IVA 1a - - IV O T 1b - - µ µ American Joint Committee on Cancer (7 ) 35 39

7 µ, C ( 4b,N0), V IVA IVB., µ µ µ µ µ, µ µ 1a, N1b N2a N2b. 4bN1, µ IIIC µ C., µ µ µ µ µ µ µ µ. 36 µ 5 5 (%) T1-2, N0,M0 70-95 T3-4, N0, M0 55-65, 1-3, 0 39-60 V,, 1 0-16 Greene et al, AJCC 6 th Edition, 2002 T 5 µ 5 (%) (%) 1-2, 0 <5 90 3, 0 8 74 4, 0 15 65 1-2, 1 6 81 1-2, 2 8 69 3, 1 11 61 3, 2 C 15 48 4, 1-2 C 19-22 36 Gunderson et al, nt J Radiat Oncol Biol Phys, 2002 36 40

µ, µ µ,., µ µ µ (R). 4 RX µ µ µ R0 µ R1 µ R2 µ µ (CRM) µ µ. µ µ <1 mm ( ), >2-10 mm. 37 µ µ,, µ µ µ µ µ µ µ, µ µ µ µ µ. 7. µ, 1/3 µ, µ µ 5-10%. 1/3 µ µ, µ µ µ µ µ 1/3, µ, ( ). µ,, µ µ µ.,, µ 37 41

µ., µ, µ µ µ. µ µ µ µ µ µ µµ. µ. 38 7.1 1. µµ µ µ µ µ µ µ µ. µ µ. µ µ µ µ µ µ µ 0,5. µ, µ µ., µ,. 4,39 2. µ µµ µ µ µ. µ µ,, µ. 4,40 3. µ 1932 µ µ µ Dukes µ µ µ. µ µ., 90% µ Dukes A, Dukes µ 70-75%. C µ 38 42

µ µ 70%, µ. µ µ µ µµ µ. 6 µ 20%. 4 4. µ µ µ,. µ µ, 5, µ µ µ. 5. µ, 0-2%. µ µ Brown Warren. 7.2 1. µ µ µ µ. µ µ, µ. 2. µ µ µ. 3. µ µ µ µ µ µ,. µ, µ,, µ µ, µ. 39 43

4. µ µ 40 µ 5%,, µ µ. 5. µ µ µ µ ( ) µ µ µ 5. 6. µ µ µ - µ. 7. µ µ µ µ µ µ µ µ µ, µ,, µ µ, µ µ. 8. µ µ µ µ,, µ µ. µ µ µ µ, µ µ µ. 8. 8.1 µ. µ, µ µ µ 40 44

µ µ µ µ. µ µ µ µ, µ µ µ. µ,, µ, µ. µ, µ, µ µ. 33,, µ µ µ µ µ µ µ. µ. µ µ µ µ - - µ µ, µ µ µ. µ µ - µ. µ : ) µ µ - µ µ µ, 6-8, ) µ µ µ µ, µ µ µ µ ) Hartmann,, µ µ, µ µ µ µ µ µ. 4,32,33 µ µ, en block µ µ µ µ. µ, : 1) µ µ µ µ µ, µ µ µ, µ 5. 2) µ µ. µ µ µ µ 41 45

µ µ,, µ µ µ µ. 3) µ (5-18%) µ µ, µ µ. 4) µ 5) n block µ µ µ µ, µ. 6) (4-5%) 4, 35 µ. 8.2 µ µ µ µ. µ µ (adjuvant) µ µ, µ µ µ µ µ. µ µ µ µ µ, µ µ, µ. µ µ 5-FU µ µ (LV), µ µ (FOLFOX) (FOLFIRI) µ µ µ µ. µ µ 5-FU µ TS, 5-FU µ µ 41,42 µ, µ 5-FU µ 26% 5, 5 64% 71% µ. µ, MOSAIC Trial 2004, µ 5-FU/LV 6 23% 10%, µ. µ µ (ASCO) 2005, 3. µ 5-FU/LV µ. 43 42 46

µ µ µ µ. A µ µ (QUASAR, 2004) 3238, 71% µ ( ) 91% Dukes, µ 5-FU, 1-5%. µ µ ASCO, µ µ., µ 4,,, µ, µ µ µ µ (<13) µ. 43,44 µ µ MSI. MSI (MSI-H) 30-40% µ µ, µ MSI (MSI-L) µ 30-40%., MSI ( icrosatellite stable, MSS), µ. µ µ µ µ µ µ µ, µ µ µ., µ, µ µ µ µ. MSI µ µ µ µ, MSI µ µ µ. 12,13,45, «Oncotype Dx», µ. 12 µ 3. µ. µ «µ» (recurrence score) 0 100 µ µ µ. µ µ µ 1-30 µ µ, µ 30-40 40 µ 43 47

. µ µ µ µ µ. 44,46 µ µ µ µ µ µ cetuximab bevacizumab,. 15, µ (irinotecan, oxaliplatin) ( bevacizumab: µ µ µ VEGF, cetuximab, panitumumab: µ µ µ µ EGFR µ ) µ µ µ. µ µ µ µ µ µ (FOLFOX, µ ) µ / 30-35%. 47 µ µ µ. µ µ -, µ µ µ -VEGF -EGFR µ 20 µ, µ. µ µ µ µ µ µ µ µ., µ µ µ µ µ. µ, µ KRAS -EGFR µ µ. 48,51 8.3 µ µ, µ µ, µ, µ µ µ. µ µ µ, µ µ µ. 44 48

µ µ µ,, µ. µ µ µ µ. µ 5-FU µ µ. 33,51,52,53 9. 9.1, µ µ µ, µ µ µ, µ µ µ., µ µ µ µ. 54 µ, µ µ µ. µ µ, µ µ, µ µ, µ µ µ. µ µ. 55 µ µ µ (CEA), CA19-9, o CA50, TPA FP., µ µ, µ µ µ µ µ µ µ, µ µ µ µ. 56,57, µ, µ, µ. 45 49

µ µ, µ µ µ µ. µ, µ µ µ µ µ. 55,58,60 H µ, µ, µ µ µ µ µ. 61, : ) µ ( Ki-67, Mib-1, µ ), ) / (p53, K-ras, DCC, cl-2, c-erb2), ) DNA (microsatellite instability). LOH 18q, ) (, VEGF), / µ µ ( µ, matrix µ ) ) µ ( µ, µ ). 55,62 9.2 µ µ p53. p53 µ µ 17, µ G1 S µ DNA. µ µ, µ µ µ 50% µ. p53 µ p53 µ µ (20 ) µ µ µ., µ µ p53,, µ. 39-60% p53,, 30-76%. µ µ p53 µ µ -. 55,63 cl-2. Bcl-2 -, 18q21, µ µ µ 46 50

µ. Bcl-2 Bcl-x µ, Bcl-xL Bcl-xs, µ µ. µ p53 Bcl-2-., µ cl-2+ µ, 30%, µ. µ µ. 55,64 K-Ras., µ 21KDa GTP, µ µ µ. 20-40% µ, µ µ µ µ µ µ, µ µ µ GFR, EGFR µ K-Ras µ. µ K-ras µ µ p53 µ. 55,65 c-myc. µ 70%. c-myc µ µ µ µ. µ c-myc Bcl-2 µ. 55 VEGF., µ µ. µ µ µ µ µ, µ, µ µ µ. 55 EGFR. µ µ µ µ, µ µ FISH µ µ µ PCR µ. µ EGFR µ 47 51

πρόγνωση. εν έχει, όµως προς το παρόν αποδειχτεί συσχέτιση κλινικής ανταπόκρισης σε θεραπείες (cetumimab, panitumumab, gefitinib) και υπερέκφρασης του EGFR. Πιθανόν αυτό να οφείλεται σε τεχνικούς λόγους ανίχνευσης που ξεκινούν από την αρχική µονιµοποίηση των ιστών έως το είδος, την ποιότητα, την εξειδίκευση και ευαισθησία του αντισώµατος. Αντίθετα, υπάρχουν µελέτες όπου παρατηρείται συσχέτιση ανταπόκρισης στις παραπάνω θεραπείες και ενίσχυσης ή µη του γονιδιακού σήµατος µε τη µέθοδο FISH. 55,66 Χρωµοσωµική απώλεια 18q (18qLOH). Στο χρωµόσωµα 18q εδράζονται γονίδια που σχετίζονται µε την καρκινογένεση του παχέος εντέρου, όπως το DCC (deleted in colon cancer) και τα SMAD2 και SMAD4. To DCC κωδικοποιεί µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη µε ιδιότητες µοριακής προσκόλλησης (adhesion molecule), παίζει ρόλο σε διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις και στα καρκινικά κύτταρα, επάγει την απόπτωση, σταµατάει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G2M και σχετίζεται µε µεταστάσεις. Η απώλεια της ετεροζυγωτίας 18q αναφέρεται ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης στον ορθοκολικό καρκίνο, συχνότερα σχετίζεται µε τον µεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο ενώ η πρόγνωση των ασθενών και η συνολική επιβίωση είναι δυσµενέστερη. 55,67,68 Στην παρούσα µελέτη διερευνάται η σηµασία δύο προγνωστικών µοριακών δεικτών, οι οποίοι µπορεί να είναι χρήσιµοι στην εκλογή χηµειοθεραπευτικού σχήµατος ώστε να επωφεληθούν ασθενείς µε ορθοκολικό καρκίνο, που έχουν υποβληθεί σε θεραπευτική εκτοµή µε συµπληρωµατική χηµειοθεραπεία. Οι δείκτες αυτοί είναι η θυµιδιλική συνθάση (Τhymidylate Synthase, TS) και η θυµιδιλική φωσφορυλάση (Τhymidylate Phosphorylase, TP). 9.3 Θυµιδιλική Συνθάση H θυµιδιλική συνθάση (TS, thymidylate synthase) είναι ένα ένζυµο, το οποίο καταλύει τη µεθυλίωση της µονοφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dump) σε µονοφωσφορική δεοξυθυµιδίνη (dtmp). Το γονίδιο που κωδικοποιεί για τη σύνθεση της TS, το TYMS, βρίσκεται στην περιοχή 18p11.32 του χρωµοσώµατος 18. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η µέγιστη ενζυµική δραστηριότητα της ΤS παρατηρείται µεταξύ G1 και S φάσης του κυτταρικού κύκλου. Όταν αρχίζει ο πολλαπλασιασµός των κυττάρων, τόσο τα επίπεδα ΤS mrna όσο και τα επίπεδα της TS αυξάνουν κατά 10-20 φορές (G1 S φάση). Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν στο συµπέρασµα ότι υπάρχει µηχανισµός ρύθµισης της έκφρασης της TS σε µεταγραφικό επίπεδο. Στο ανθρώπινο γονιδίωµα, η απαραίτητη περιοχή προαγωγέα (ΕPR, essential promoter region) βρίσκεται µεταξύ -161 και -141 θέσης σε σχέση µε το κωδικόνιο έναρξης AUG, µε πολλές οµοιότητες µε το γονιδίωµα ποντικιών, στο 48 52

οποίο έγιναν και οι περισσότερες µελέτες σε παρόµοια στοιχεία προαγωγέα sp1 και ETs. Εκτός από αυτούς, βρέθηκε µία επιπλέον περιοχή δέσµευσης του παράγοντα πρόσδεσης Sp1, η οποία δρά ως αρνητική ρυθµιστική αλληλουχία (NRS, negative regulatory sequence). Μετάλλαξη σε αυτή την αλληλουχία οδηγεί σε αύξηση της ενεργότητας του προαγωγέα του TYMS έως και 70%. Ο µεταγραφικός παράγοντας LSF, ο οποίος σχετίζεται µε την κυτταρική αυξηση και παίζει ρόλο στην S φάση του κυτταρικού κύκλου µπορεί επίσης να εµφανίσει µεταλλάξεις. Οι µεταλλάξεις αυτές είναι δυνατό να οδηγήσουν σε αναστολή της G1/S φάσης για την έκφραση του ΤΥΜS γονιδίου και προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο 69,70 Η προσθήκη µεθυλικής οµάδας στην 5 θέση του πυριµιδινικού δακτυλίου παίζει ρόλο στη de novo σύνθεση της θυµιδίνης. Ο ρόλος που παίζει το ένζυµο αυτό στην οδό σύνθεσης των νουκλεοτιδίων, το οποίο δεν µεταβολίζει το παράγωγο της 5-FU στο υπόστρωµα αλλά αντίθετα, αναστέλλεται από αυτό, την καθιστά σηµαντικό χηµειοθεραπευτικό στόχο. ηλαδή, η ΤS αποτελεί διακυτταρικό µόριο-στόχο της 5FU µετατρέποντας τη µονοφωσφατάση της δεοξυουριδίνης (dump) σε µονοφωσφατάση της δεοξυθυµιδίνης (dtmp). 71 Η θυµιδίνη είναι το µόνο νουκλεοτίδιο, που είναι ειδικό για την DNA σύνθεση και κατά συνέπεια η ΤS αποτελεί στόχο κυττοτοξικών χηµειοθεραπευτικών παραγόντων. Η ενζυµική δραστηριότητα του ενζύµου περιλαµβάνει διαδικασία δύο σταδίων. Αρχικά, η µονοφωσφορική δεοξουριδίνη (dump) συνδέεται µε τον υποδοχέα της και αυτό προκαλεί µετασχηµατισµό στη δοµή που επιτρέπει το άνοιγµα ενός γειτονικού υποδοχέα για το Ν-5,10-µεθυλενο- τετραϋδροφολικό (CH 2 FH 4 ). Η µία καρβονική οµάδα του φολικού οξέος µεταφέρεται στη συνέχεια στο δακτύλιο της ουριδίνης και έτσι προκύπτει µονοφοσφωρική δεοξυθυµιδίνη (dtmp) και διϋδροφολικό οξύ. Το dmtp φωσφορυλιώνεται από µία κινάση σε dtdp και dttp, σε βάση δηλαδή για τη σύνθεση του DNA. Στη διαδικασία σύνθεσης του DNA, σηµαντικό βήµα αποτελεί η µετατροπή του dump σε dtmp. Αυτό επιτυγχάνεται µε την TS, η έκφραση της οποίας σχετίζεται µε την απάντηση στη θεραπεία µε βάση το 5-FU. Ειδικότερα, η υπερέκφραση της TS συνδυάζεται µε αντίσταση στη θεραπεία και µε δυσµενή πρόγνωση. Θεωρείται σηµαντικός προγνωστικός παράγοντας για ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση ανεξάρτητα από το ΤΝΜ στάδιο και άλλους ιστολογικούς παράγοντες. 72,73,74 Για περισσότερο από 40 χρόνια, ο κύριος χηµειοθεραπευτικός παράγοντας που χρησιµοποιείται στη θεραπεία ασθενών µε ορθοκολικό καρκίνο ήταν και εξακολουθεί να είναι η 5-φθοριοουρακίλη (5-FU). Ωστόσο, τα ποσοστά απάντησης στη θεραπεία κυµαίνονται από 10 έως 20%, όταν αυτή αποτελεί µονοθεραπεία. Τα ποσοστά αυτά 49 53

µ, 25%. S µ - µ 5-FU µ 5-FU µ µ. S dtmp µ, µ. 75,76 H µ µ S Belfort µ.coli µ µ S in vitro, in vivo µ µ, µ µ, µ µ µ mrna. µ µ µ µ µ 5-FU 77,78. S µ µ µ, µ E.coli, S TSmRNA µ. O Maley, TS, µ D µ, µ µ, µ µ µ -µ µ TS. 77,79 TS µ µ µ µ µ 28. µ 28 bp (R ) (TSER, TS promoter enhancer region) TSER, 2R/2R, 2R/3R 3R/3R. µ µ 3R/3R µ S mrna ( µ µ µ 5-FU µ ), µ µ 2R/2R. S µ µ, 5-FU, µ, µ. µ µ 5-FU µ µ µ µ, µ,. 69,80,81,82,83 50 54

µ 4. µ 5-FU. Fareed 2009 H S µ µ S (TS promoter enhancer region, TSER). O Hoie (1995), germ-line µ µ µ TS, µ (2R) (3R) µ 28-bp. O Pullarkat µ µ µ TS mrna µ µ µ. 82,83,84, µ µ µ, SNP (G>C) 12 3R, (2R, 3RC, 3G), µ µ µ USF-1 (upstream stimulating factor) µ µ µ µ µ. O µ µ mrna µ µ. 84 µ µ µ S µ -µ, 6-bp 3 -UTR 51 55

( TS1494, del 6) RNA MS RNA TS. 83,84 µ µ µ µ µ µ µ µ, µ µ. µ, µ. µ µ µ, µ µ µ µ µ µ µ. 85,86,87 To S µ, µ (LOH). µ µ µ 2R/3R µ µ 2R 3R TSER. µ µ TS µ µ 5-FU. O Pullarkat, µ 3R/3R, µ µ µ µ 5-FU µ µ 2R/3R 2R/2R 84. µ TS mrna µ 3R/3R, 5FU, µ µ TS. µ µ µ µ µ., µ TS mrna µ 2R/2R 2R/3R 5-FU µ., µ µ 2R/3R µ µ 5-FU. 83,88 µ Kristensen (2010), µ µ TS mrna µ 2R/2R 2R/3R. µ 3R/3R µ TS µ TS µ 2R/3R (p=0,01) µ 2R/2R (p=0,02). 52 56

συχνότητα εµφάνισης των διάφορων γονοτύπων, 2R/2R. 3R/3R και 2R/3R ήταν 24%, 15% και 61%, αντίστοιχα, ποσοστά που συµφωνούν µε άλλες µελέτες. 87,89,90,91,92 Η µονοφωσφορική φλουοροδεοξυουριδίνη (FdUMP), που είναι µεταβολίτης της 5- FU, προκαλεί αναστολή της ΤS και αυτό αποτελεί έναν κύριο µηχανισµό δράσης της 5-FU. Συνδέεται στον ίδιο υποδοχέα και µε την ίδια συγγένεια όπως η dump, όµως σε αντίθεση µε το υδρογόνο, το άτοµο φθορίου στην 5 θέση δε µπορεί να αφαιρεθεί. Κατά συνέπεια η FdUMP και το φολικό οξύ που συνδέονται µε οµοιοπολικό δεσµό µε την TS οδηγούν στην δηµιουργία τριπλού συµπλόκου, στο οποίο η µία θειϊκή κυστεΐνη της ΤS ενώνεται µε την µία καρβονική οµάδα του 6 άκρου της FdUMP. Η έκφραση της ΤS ως παράγοντας ευαισθησίας στις φλουοροπυριµιδίνες έχει καταδειχθεί in vitro και in vivo και µπορεί να παίξει σηµαντικό ρόλο στον καθορισµό της ευαισθησίας ασθενών µε καρκίνο στη θεραπεία µε φλουοροπυριµιδίνες. Σε αρκετές µελέτες διερευνάται η συσχέτιση µεταξύ της έκφρασης της TS και της συνολικής επιβίωσης ασθενών µε ορθοκολικό καρκίνο. Πολλές µελέτες έδειξαν ότι τα χαµηλά επίπεδα έκφρασης της TS συσχετίζονται µε καλύτερο ποσοστό απάντησης στη χηµειοθεραπεία µε 5FU και καλύτερο ποσοστό 5ετούς επιβίωσης. Αν και στις περισσότερες µελέτες περιγράφεται µικρότερο διάστηµα ελεύθερο νόσου και πτωχότερη επιβίωση σε ασθενείς που εκφράζουν υψηλά επίπεδα TS, η αποτίµηση της προγνωστικής σηµασίας του ενζύµου ποικίλλει. 93,94 H έκφραση της θυµιδιλικής συνθάσης µπορεί να αξιολογηθεί και ανοσοϊστοχηµικά από τοµές παρασκευασµάτων παχέος εντέρου σε ασθενείς µε ορθοκολικό καρκίνο. Φαίνεται από κάποιες µελέτες ότι αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για τη συνολική επιβίωση και το διάστηµα ελεύθερο νόσου. Όγκοι ασθενών που εµφανίζουν υψηλή έκφραση της TS, φαίνεται να απαντούν χειρότερα στη συµπληρωµατική χηµειοθεραπεία µε 5-FU, σε αντίθεση µε εκείνους τους όγκους που εκφράζουν χαµηλά επίπεδα TS. Ειδικά σε ασθενείς µε ορθοκολικό καρκίνο σταδίου ΙΙ, φαίνεται ότι η υπερέκφραση της TS σχετίζεται µε αυξηµένα ποσοστά υποτροπής της νόσου ανεξαρτήτως θεραπείας. 95,96,97 Aντίθετα, σε ασθενείς µε ορθοκολικό καρκίνο στους οποίους ανευρίσκονται αυξηµένα επίπεδα έκφρασης της TS από τα νεοπλασµατικά κύτταρα, η χηµειοθεραπεία µε το σχήµα FOLFIRI είναι περισσότερο αποτελεσµατική. 96 O ποσοτικός προσδιορισµός της TS µπορεί να γίνει είτε µε υπολογισµό της ενζυµικής δραστηριότητας µε την 3 Η -FdUMP ενζυµική δοκιµασία, είτε µε RT-PCR ή Western Blotting. Η µέτρηση του mrna της TS γίνεται µε τη µέθοδο της Real-Time PCR και ο ανοσοϊστοχηµικός προσδιορισµός της TS γίνεται µε τη χρήση ειδικών µονοκλωνικών αντισωµάτων (TS 106). 98 53 57

9.4 µ µ (TP, thymidylate phosphorylase) µ, µµ µ, in vitro in vivo µ. MP, TP, q13.33 µ µ 22, µ 1,8 kb 10 µ 4,3 kb ( agiwara et al, 1991). 99,100 µ, µ µ µ (Desgranges et al, 1981) µ µ 110 KD 90 D E.Coli. µ µ µ µ - - ( / domain), µ µ µ - µ µ µ. H µ - /. H µ 1989 Ishikawa µ µ µ TP.Coli. P box CCAAT box, G-C µ SP-1,, µ. 1987, TP µ PDEGF (Platelet-Derived Endothelial Growth Factor), µ (Miyazono et al, 1987 Ishikawa et al, 1989),, µ P µ µ,, µ µ. 102,103,104 µ P : ) µ µ µ 2 - - D ) µ 2 - - D ), µ - µ µ µ µ µ, µ µ. B µ, µ, µ,,,,,,, µ. P µ., µ P µ. H TP 54 58

, µ, µ,, µ µ ( GIE). µ TP, µ,, µ,, µ µ, µ µ. 99,105,106 H µ µ 5 - -5- (5 -DFUR, doxifluridine), µ µ µ, 5- (5-FU). 5-FU µ µ FdUMP FUTP µ µ 5-FU µ µ. 5 -DFUR, µ µ µ, µ µ 5-FU, µ 5 -DFUR µ P. P µ 5 -DFUR, µ µ P DPD., P,, µ µ µ µ. 105,106 µ µ µ µµ µ :, µ µ. µ µ 5 -dfcyd µ,, 5 dfurd µ cytidine deaminase µ P 5-FU. µ 5 -cfcyd µ µ,. µ 5 -dfcyd 5 -dfurd µ, µ 5-FU, µ 5-FU. 55 59

µ 2- -D µ (2DDR-1P) µ µ µ µ ( ) ( 2 - ) µ 5. µµ P µ µ µ Bronckaers, edicinal Research Reviews, 2009 µ 6 µ 56 60

µ TP µ 5-FU µ µ. µ, µ,,, µ,, µ, TP µ µ µ. µ µ. 99,107,108 5-FU P FdUMP FdUrd µ µ 5-FU. 5-FU., µ, P, µ µ µ µ µ µ P µ 10 µ. 107,108,109 µ P µ µ µ,, µ µ µ. µ P µ µ RT- PCR µ TP µ µ µ µ µ µ µ. µ µ, µ (DPD), µ 5-FU 85% µ µ DPD, µ µ 1 µ 3 % µ. µ µ 5-FU, µ µ µ 5-FU. µ µ DPD µ 5-FU. µ TS µ - 5-FU DPD µµ µ 5-FU, 5-FU TS DPD. K TS DPD µ µ µ µ µ 5-FU. 111,112 H µ µ µ µ µ µ µ µ. 57 61

µ µ S TP, µ µ 5-FU, µ µ µ µ µ µ. 114 µ µ, TS µ µ 5-FU. Y P µ µ µ µ. µ µ µ µ µ µ µ µ. 114,115,116 Bronckaers, edicinal Research Reviews, 2009 µ 7. µ µ 5-FU, µ 5-FU, 5 - (5-DFUR) µ. µ µ 5 -DFCR 5 -DFUR µ µ µ,. 5 -DFUR, µ P µ 5-FU µ µ µ., µ P µ FdUrd µ TS FdUMP, µ µ µ µ µ TS, TS DNA. (RR), 58 62

µ FDUP FdUDP µ FdUMP. FdUrd µ µ FdUTP., 5-FU DNA µ µ FUTP. 5-FU µ µ (DPD), µ µ. µ µ, 5-FU. 5 - -2,4 µ (CDHP), µ DPD, µ 5-FU. ( ) orotate ( PRT), 5-FU µ. (LV) o 5,10-µ CH 2 THF, FdUMP S. 105,107,110 59 63

10. µ µ µ µ µ µ, µ (thymidylate synthase, TS) µ (thymidylate phosphorylase, ) µ, µ µ µ µ. µ µ µ µ µ µ, µ µ µ µ, µ. µ, µ S TP µ µ, µ. 64

11. 120 µ µ µ, 98 22 µ µ µ. µ µ S TP µ block µ, µ µ µ µ µ.... µ ( )... µ, µ µ µ.,...... 11.1 E µ µ / ( / ), µ µ µ (, -tissue microarrays). / µ µ µ µ µ µ. µ,,., µ µ µ µ. 11.2 µ µ ( ) µ µ µ µ 583. µ 121 115. µ µ µ µ (TMA Model I, Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, U.S.A.)..., µ µ. 5, µ 61 65

0,6 χιλ. και εγκλείσθηκαν σε 2 νέους κύβους παραφίνης µεγάλου µεγέθους. Η απόσταση µεταξύ των ιστικών κυλίνδρων ήταν 1,0 χιλ. Στους ΤΜΑ κύβους εγκλείσθηκαν επίσης και ιστικοί κύλινδροι από ιστούς ως δείκτες αξιοπιστίας (µάρτυρες) της ανοσοϊστοχηµικής (ΑΙΧ) τεχνικής. Ειδικότερα, στην αρχή και το τέλος του ΤΜΑ τοποθετήθηκαν 14 συνολικά ιστικοί κύλινδροι από θυρεοειδή, δέρµα και αµυγδαλή. Οι θέσεις των ιστικών κυλίνδρων στους 2 ΤΜΑ κύβους καταγράφησαν σε αρχείο Excel (2 worksheets). Το παραπάνω αρχείο χρησιµοποιήθηκε ως βάση για την χαρτογράφηση και ταξινόµηση των περιπτώσεων καθώς και για την καταγραφή των αποτελεσµάτων των ανοσοχρώσεων. Σε περιπτώσεις απώλειας ή αδυναµίας αξιολόγησης των περιστατικών από τα ΤΜΑ, η ανοσοϊστοχηµεία έγινε σε ξεχωριστές για κάθε περίπτωση τοµές παραφίνης. Μετά τη δηµιουργία των ΤΜΑ, οι κύβοι, τοποθετήθηκαν σε κλίβανο στους 60 0 C για 15 + 5 προκειµένου να οµογενοποιηθεί η παραφίνη και να αποκατασταθεί η συνοχή και οι µικρο-ρωγµές της παραφίνης. Όπως έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία µε τη χρησιµοποίηση τουλάχιστον 3 ιστικών κυλίνδρων διαµέτρου 0,6 χιλ. είναι δυνατή η αντιπροσώπευση του >95% της ολόκληρης ιστικής τοµής, ενώ στην περίπτωση της τοποθέτησης 5 ιστικών κυλίνδρων το ποσοστό ξεπερνά το 99%. 117,118,119,120 11.3 Ανοσοϊστοχηµεία Στην ανοσοϊστοχηµική µελέτη χρησιµοποιήθηκαν µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι των αντιγόνων TYMS (κλώνος TS 106, Neomarkers, Fremont, CA, USA, σε αραίωση 1:300) και TYMP (κλώνος PGF-44C, Zymed, CA, USA, σε αραίωση 1:100). Τοµές πάχους 2.5 µm από τους ΤΜΑ κύβους παραφίνης κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε φορτισµένα πλακίδια (Dako, Glostrup, Denmark). Ακολούθησε η διαδικασία της αποπαραφίνωσης µε τοποθέτηση των τοµών σε κλίβανο στους 37 ο C για ολονύκτια επώαση και η εµβάπτιση σε δύο διαδοχικά διαλύµατα ξυλόλης (xylene, 2-αλλαγές), για 20 συνολικά λεπτά. Η αφυδάτωση των ιστών έγινε σε τρία διαδοχικά διαλύµατα αλκοόλης (ethanol) πυκνότητας 100%, 96%, 70% (3 αλλαγές) για συνολικό χρόνο 30 λεπτών. Η αποκάλυψη των αντιγόνων πραγµατοποιήθηκε θερµαίνοντας τα πλακίδια σε διάλυµα κιτρικού νατρίου (sodium citrate solution, ph 6.0) µέσα σε φούρνο µικροκυµάτων για 20 λεπτά. Μετά από διαδοχικές πλύσεις (5) των 3 λεπτών µε TBS, τα πλακίδια επωάσθηκαν µε ειδικό διάλυµα (Power Block TM, BioGenex, USA) για την εξουδετέρωση της µη ειδικής σύνδεσης του αντισώµατος µε αντιγόνα των ιστών, ώστε να µειωθούν οι µη ειδικές χρωστικές αντιδράσεις. Η επώαση µε το παραπάνω διάλυµα ήταν µία ώρα για την TYMS (TS) και 10 λεπτά για την TYMP (TP). Η σήµανση του συµπλέγµατος αντιγόνου-αντισώµατος έγινε µε τη χρήση ειδικών 66

µ µ., µ HRP (super sensitive non-biotin detection system. BioGenex, Fremont, CA, USA) µ TYMS Envision (Dako) TYMP. µ µ 3, 3 - µ (DAB) µ Mayer. 98 11.4 µ µ µ µ µ, µ µ. 121,122 µ µ ( - ) ( ), µ µ ( µ ) = +., µ µ µ 0-3 (0 0 5%, 1 6 25%, 2 26% 50%, 3 51% 100%), 0-3 (0=, 1 =, 2 = µ, 3 = )., µ, µ ( = 0-6). µ TYMS, µ µ 4, µ µ, µ <4. µ >5% TYMP µ. 1. /, µ µ µ µ µ. 63 67

2. TS µ (µ x 100) 3. µ TS (µ x100) 4. A S µ (µ x100) 64 68

5. TP µ, µ. (µ x 200) 6. TP µ 7. µ P µ. 69

11.5 RNA RNA 93 µ, µ 10µm µ µ µ. µ µ µ, µ µ 56 C µ. µ, µ RNA µ µ TRIZOL-LS. µ µ, 2 µg RNA µ µ cdna ( µ µ DNA) µ µ, Superscript III Rnase H µ µ - µ µ RNA ( Invitrogen / Life Technologies)., µ cdna µ 20-40 ng RNA equivalents /µl ( 1:20 µ ). µ µ -20 o C µ. TYMS (TS, thymidylate synthase, µ µ 18p11.32) TYMP (TP, thymidylate phosphorylase, µ µ 22q13.33) µ µ real time PCR (QRT-PCR). µ µ µ µ (Taqman), µ µ FAM 5 - µ - 3 (minor-groove-binders, MGB). µ µ PCR µ µ µ µ. µ : ( ) mrna TS, µ Hs00426591_m1 87 bp µ 6 7 ( NM_001071.2), ( ) mrna TP, µ Hs00157317_m1, 95 bp µ 4 5, µ µ NM_001953.3. µ µ µ mrna TP, NM_001113755.1 NM_001113756.1. PCR ( µ ) µ µ mrna (housekeeping) - (GUSB), µ µ. µ µ µ #4333767T ( µ QRT-PCR Applied Biosystems). µ, 66 70

καθώς και επαναληπτική σειρά αντιδράσεων, παράλληλα µε θετικούς (RNA αναφοράς [reference RNA, από Applied Biosystems]) και αρνητικούς µάρτυρες (τυφλά δείγµατα). Οι αντιδράσεις πραγµατοποιήθηκαν σε όγκο 20 µl για τον κάθε στόχο, σε σύστηµα real time PCR ABI7500 (Applied Biosystems), σε προκαθορισµένες συνθήκες (45 κύκλοι), και τα αποτελέσµατα αναλύθηκαν µε το λογισµικό SDS v1.4. Τα κριτήρια για την αποδοχή των δειγµάτων για περαιτέρω ανάλυση ήταν: κατώφλι αύξησης καµπύλης (cycle threshold, CT) για τον εσωτερικό µάρτυρα <36, και απόλυτη τιµή CT (CT στόχου CT GUSB ) µεταξύ των επαναληπτικών δειγµάτων <0.5. Η σχετική έκφραση των γονιδίων TS και TP υπολογίστηκε γραµµικά, ως η διαφορά (40 CT), όπου η CT υπολογίσθηκε από τις µέσες τιµές CT όλων των αποτελεσµάτων για κάθε δείγµα (διπλά και επαναληπτικά). Συνολικά, 85/93 (91.4%) δείγµατα κρίθηκαν κατάλληλα για περαιτέρω ανάλυση της σχετικής έκφρασης TS και ΤΡ. 11.6 PCR Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης είναι µία µέθοδος ενίσχυσης in vitro µίας γνωστής και προκαθορισµένης αλληλουχίας DNA. Στηρίζεται στην ενζυµατική επιµήκυνση εκκινητών, των λεγόµενων primers (συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια), οι οποίοι υβριδίζουν σε αντίστοιχα σηµεία του υπό ανίχνευση DNA και επιµηκύνονται µε τη βοήθεια DNA εξαρτώµενης DNA πολυµεράσης, χρησιµοποιώντας ως πρότυπο την υπό µελέτη αλληλουχία. Στο πρώτο στάδιο της αντίδρασης γίνεται µετουσίωση του DNA στόχου και το δίκλωνο DNA µετατρέπεται σε µονόκλωνο. Στη συνέχεια, στο 2 ο στάδιο συνδέονται (υβριδίζονται) τα δύο συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία λειτουργούν ως εκκινητικά µόρια (primers) στις δύο πλευρές του DNA στόχου, στους αντίστοιχους κλώνους του DNA. Στο 3 ο στάδιο, µε τη δράση ενός ενζύµου DNA πολυµεράση, προστίθενται συµπληρωµατικές βάσεις δεσοξυριβονουκλεοτιδίων στο 3 άκρο κάθε primer και η αλυσίδα επεκτείνεται. Με αυτόν τον τρόπο σχηµατίζονται δύο καινούργιες αλυσίδες DNA ή κλώνοι DNA, που είναι συµπληρωµατικές ως προς αυτές των 2 κλώνων του προτύπου DNA και έτσι το DNA στόχος έχει διπλασιαστεί. Η παραπάνω σειρά της µετουσίωσης, υβριδισµού και επέκτασης των primers µε σύνθεση νέου κλώνου DNA σποτελεί ένα κύκλο αντίδρασης PCR. Στο τέλος του 1 ου κύκλου της αντίδρασης οι κλώνοι του DNA στόχου είναι τέσσερεις και αποτελούν τα πρότυπα για τη σύνθεση νέων κλώνων DNA, που θα γίνει στον 2 ο κύκλο. Στο τέλος του 2 ου κύκλου οι κλώνοι θα είναι οκτώ και ο αριθµός ανατύπων του DNA στόχου αυξάνει εκθετικά µε την αύξηση του αριθµού των κύκλων, επιτυγχάνεται δηλαδή µεγέθυνση του DNA στόχου. Κάθε κύκλος PCR περιλαµβάνει τρεις διαφορετικές θερµοκρασίες για τα 67 71

, µ µ 92-95 o C 30, µ 50-60 o C 1-2 70-78 o C 1-2. µ µ (polymerase chain reaction, PCR) µ (Real time, RT-PCR) µ RNA DNA. µ DNA µ µ PCR µ µ, (Realtime PCR). µ, µ µ µ µ µ µ µ µ µ,, µ µ. µ µ µ µ PCR,, µ µ, µ µ. Real-time PCR : ) µ DNA, µ DNA ) µ µ µ (probes) µ µ µ. µ µ µ µ, µ µ, µ µ, µ TaqMan PCR. µ TaqMan, µ µ Real-time PCR, µ µ 100.000 «-» (targetspecific), TaqMan µ µ µ µ µ. 123,124,125 12. µ µ µ (Univariate Cox Regression) µ µ o 68 72

mrna µ S TP µ. µ µ µ -. (OS) µ µ µ µ, µ (DFS) µ µ µ µ µ. µ, µ µ. O (Hazard Ratios, HR) µ µ µ p (wald test). S P mrna µ µ 2 test. µ mrna S TYMP µ Spearman. µ mrna, µ µ, µ µ Mann-Whitney µ. µ µ µ µ NCI BRB Array Tools µ P TYMS µ µ Cox proportional hazard model. H (Gene set analysis. GSA, Effron) µ µ µ µ µ µ µ., µ µ =0,05 µ µ µ SPSS v15 Windows (SPSS Inc, Chicago, IL). 13. A 13.1 A 98, µ µ 95. 1. µ µ µ, µ µ 32 90. µ µ µ 58:40 (39,8%), 30 (30,6%) µ µ µ American Joint Committee on cancer. µ µ µ µ 69 73

stler-coller, 39% 2 34,7% C2, µ µ (51,7%) µ (grade II) µ µ. 95 µ, 59 (60,2%) µ µ µ. µ µ 2. µ,. µ µ µ 6, µ µ 1 12., 25 (25,5%) µ 5- FU/Leukovorin. 18 (18,4%) FOLFOX (5-FU/Lekovorin/Oxaliplatin) 13 (13,3%) µ FOLFIRI (5-FU/Leukovorin/Irinotecan). FOLFOXIRI (5-FU/ / Oxaliplatin/Irinotecan) µ µ. 1. N % N=98 ( ) <65 25 25.5 65 70 71.4 3 3.1 51 52.0 47 48.0 15 15.3 58 59.2 40 40.8 70 74

µ 0 56 57.1 1-3 27 27.6 4 15 15.3 µ ( ) T1 4 4.1 T2 14 14.3 T3 74 75.5 T4b 6 6.1 µ ( ) N0 57 58.2 N1a 11 11.2 N1b 12 12.2 N1c 5 5.1 N2a 6 6.1 N2b 6 6.1 Nx 1 1.0 (AJCC) I 16 16.3 IIA 39 39.8 IIC 3 3.1 IIIA 2 2.0 IIIB 30 30.6 IIIC 8 8.2 µ µ Astler - Coller A 4 4.1 B1 12 12.2 B2 39 39.8 B3 3 3.1 C1 2 2.0 C2 34 34.7 C3 4 4.1 µ 9 9.2 89 90.8 71 75

93 94.9 5 5.1 91 92.9 7 7.1 µ (Grade) I 29 29.6 II 56 57.1 III 13 13.3 2. µ µ µ N % µ µ µ 59 60.2 Fluorouracil / Leucovorin 25 25.5 FOLFOX 18 18.4 FOLFOXIRI 1 1.0 FOLFIRI 13 13.3 Capecitabine (µ ) 1 1.0 µ ( µ ) 6 (1-12) 13.2 mrna TYMS TYMP µ µ TYMS 74,7%. 75,6% µ TYMP. µ 3. µ µ,,, µ µ µ µ µ TYMS µ TYMP. (p>0,05,. ( 4,5,6,7) 72 76

3. A µ N (%) TP (n=86) / µ (- -/+) 65 (75.6) (+) 21 (24.4) TS (n=87) / µ (- -/+) 22 (25.3) (+) 65 (74.7) Όπου - μειωμένη έκφραση, + υψηλή έκφραση και +/- μειωμένη έκφραση 4. µ µ P TS - -/+ + p (- -/+) + p ( ) <65 19 (26.8) 4 (16.7) 0.414 4 (18.2) 15 (23.8) 0.769 65 52 (73.2) 20 (83.3) 18 (81.8) 48 (76.2) 43 (56.6) 10 (38.5) 0.119 14 (63.6) 32 (49.2) 0.324 33 (43.4) 16 (61.5) 8 (36.4) 33 (50.8) 5. µ µ P TS - -/+ + p - -/+ + p 38 (52.1) 18 (72.0) 0.103 14 (63.6) 36 (55.4) 0.620 35 (47.9) 7 (28.0) 8 (36.4) 29 (44.6) µ 73 77

0 38 (51.4) 17 (68.0) 0.331 13 (59.1) 37 (56.9) 0.982 1-3 25 (33.8) 5 (20.0) 6 (27.3) 19 (29.2) 4 11 (14.9) 3 (12.0) 3 (13.6) 9 (13.8) I 20 (27.0) 7 (28.0) 0.332 4 (18.2) 23 (35.4) 0.291 II 42 (56.8) 17 (68.0) 15 (68.2) 33 (50.8) III 11 (1.4) 1 (4.0) 3 (13.6) 9 (13.8) 6. mrna µ TYMP TYMS - -/+ + p - -/+ + p ( ) <65 10 (23.8) 12 (28.6) 0.804 10 (24.4) 12 (27.9) 0.806 65 32 (76.2) 30 (71.4) 31 (75.6) 31 (72.1) 22 (50.0) 25 (58.1) 0.521 29 (65.9) 18 (41.9) 0.032 22 (50.0) 18 (41.9) 15 (34.1) 25 (58.1) 78

7. mrna µ TYMP TYMS µ p µ p 24 (54.5) 24 (55.8) 0.999 23 25 0.668 (52.3) (58.1) 20 (45.5) 19 (44.2) 21 (47.7) 18 (41.9) µ 0 25 (56.8) 25 (58.1) 0.313 22 28 0.153 (50.0) (65.1) 1-3 15 (34.1) 10 (23.3) 13 (29.5) 12 (27.9) 4 4 (9.1) 8 (18.6) 9 920.5) 3 (7.0) µ I 14 (31.8) 14 (32.6) 0.565 15 13 0.526 (34.1) (30.2) II 26 (59.1) 22 (51.2) 22 (50.0) 26 (60.5) III 4 (9.1) 7 (16.3) 7 (15.9) 4 (9.3) 79

µµ 1,2. µ µ mrna P TYMS (40- dct) 25 20 Frequency 15 10 5 0 35,0 36,0 37,0 38,0 39,0 TYMP (40-dCT) 40,0 41,0 15 Frequency 10 5 0 35,0 36,0 37,0 38,0 TYMS (40-dCT) 39,0 40,0 80

8. µ mrna markers (40- CT) TYMP TYMS N 85 85 13 13 µ 37.8 37.1 µ 37.7 36.9 0.8 0.9 35.2 35.0 40.0 39.7 9. Spearman µ mrna markers TYMP TYMS Spearman s (Rho) 0.341 p-value 0.001 10. µ (Univariate Cox Regression) µ HR 95% CI Wald-p HR 95% CI Wald-p µ TP - -/+ + 1 + 1.250 0.445-3.507 0.672 1.004 0.401-2.515 0.993 TS - -/+ + 1 + 0.575 0.212-1.554 0.275 0.528 0.231-1.208 0.131 81

13.3 µ µ 62,6 µ µ µ 60,8 64,5 µ 15 (15,3%) 20 (20,4%). µ (Cox-Regression Analysis) µ µ (OS) µ (DFS) µ S TYMP (Wald p>0,05 ), ( 10). 84,3%, µ µ S TP. 3 (DFS) 78,1% ( 9, 11). (overall survival, OS) (disease free survival, DFS) 11. µ TYMS TYMP µ µ µ 0 µ. 11. ( verall Survival, OS) 20 (20.4%) (95% CI) E 3 (95% CI) 84.3% (77-92) µ 2.2-45.5 µ (Disease free survival,dfs) 15 (15.3%) (95% CI) E 3 (95% CI) 78.1% (70-86) µ 0.1-54.4 ( µ ) 62.6 (60.8-64.5) E: µ 78 82

13.4 mrna TYMS µ µ (Cox-Regression Analysis) µ (OS) µ (DFS) µ mrna S TYMP (Wald p>0,05, 12. µ mrna TYMS TYMP µ µ. 12. Cox mrna HR 95% CI Wald-p HR 95% CI Wald-p mrna TYMP Low (<median) 1 1 High ( median) 1.059 0.430-2.607 0.900 1.312 0.583-2.954 0.512 TYMS Low (<median) 1 1 High ( median) 0.450 0.171-1.184 0.106 0.716 0.318-1.613 0.421 µµ 3,4. mrna µ. ( ann- Whitney test) TYMP (40- CT) 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 p=0.636 Negative/Low Positive/High TP (IHC) TYMS (40- CT) 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 p=0.017 negative positive TS (IHC) 83

14. µ µ µ µ., µ µ µ µ, µ, µ µ µ µ.. µ,, µ µ, µ µ µ µ µ µ µ µ µ. 85 µ µ µ µ µ, µ (thymidylate synthase, TS) µ (thymidylate phosphorylase, ). µ µ µ µ µ, µ µ µ µ µ. µ S TP µ µ µ, µ. µ 5-FU, µ µ, µ 5-FU ( µ ) µ (FOLFOX) µ (FOLFIRI) µ µ. 130,131 µ µ µ µ - µ, 38 µ µ,, DNA µ µ S. 84

µ µ TS µ µ 5-143, 87,144,145 FU. TS µ µ TS µ µ µ µ µ 5-FU, µ. 111,126,127,128,129 O Soong (2008) µ 945 µ µ µ µ µ, µ S µ µ, µ DPD µ., µ P µ. µ, 81 µ µ µ, µ TS, DPD P µ, µ, µ µ. 147,, µ µ TS µ. µ µ meta- 2610 µ, µ TS µ µ µ µ,., µ S. µ, S µ µ, µ µ µ. 96,121,134 µ TS µ. (HR) 0,70 µ µ TS 1,2 µ S. Edler µ 862, µ µ µ 5-FU, µ µ µ,, µ µ TS, µ, S, 85

µ µ., µ µ,,, µ µ µ µ µ TS, µ µ. 148 µ µ 243 µ µ µ µ TS µ µ µ., µ S,, µ S µ µ. µ, p53. µ µ TS µ µ TS (p<0,001). µ µ p53 µ µ TS, µ Lenz µ. 149,150,151 O Donada (2011), µ 55 µ, TS (p<0,01), (p=0,68). 162 Edler (2002) 862 µ, µ µ 5-FU/LV, µ µ TS. µ µ µ µ TS 106 TS µ DFS OS, lsaleh, µ µ 221 µ, µ µ µ µ S S µ µ. µ µ, µ µ TS µ 5-FU. 83 µ, µ µ 2R 3R TYMS, µ µ µ 5-FU µ., µ µ TYMS 29% 3R/3R, 16% 2R/2R 55%. 84,155,54 86

µ TYMS µ µ µ 28 bp 5 µ,, in vitro µ., TYMS µ µ, µ 2 (2R/2R, TSER*2), tandem repeats (3R/3R, TSER*3) 2R/3R ( SER*2/TSER*3). µ, µ TS mrna µ µ, µ µ 5-FU. µ TSmRNA µ µ (TSER*3) µ TSER*2 µ µ TYMS µ µ µ µ µ 5-FU. µ µ µ, µ (2R/2R) µ µ µ 3R/3R 2R/3R. 84 µ ( V), TS µ µ 5-FU µ ( schele (2000), Paradiso (2000), Johnston (2003)., µ, µ TS µ µ µ µ. 160 Leichman µ S µ RT-PCR µ µ µ µ 5-FU, mrna µ µ µ. 127 µ µ S µ, µ µ µ 138,139,140,141 µ µ TS, µ µ µ µ µ 5-FU, µ µ TS.,, µ µ 35-50%, 83 87

µ µ µ. 136,137,75 µ µ TS, µ -, µ TS, µ µ µ. 152,153,154, µ µ TS, µ µ. TS µ TS mrna G1, µ µ S µ µ TS µ DNA. µ µ, µ TS µ µ TS µ µ 5-FU, µ µ,. 78,126 µ µ Berger (1998), HCT116, µ µ µ MS µ FdUrd, Calascibetta (2010) DNA TYMS µ 68 µ. µ µ µ µ µ µ DNA, µ PCR sequencing, µ TS-DNA TS-DNA. µ, µ TS-DNA, µ µ µ µ TS. 161,74,162 µ µ TS, µ µ µ TS, µ S µ 5-FU. 95,132,133 A µ, mrna TS, TP DPD µ µ µ µ µ µ µ 5-FU µ 5-FU 111, µ 84 88

µ µ µ µ. 134 H µ TP µ µ µ µ FOLFIRI. 156 A µ µ µ, µ National Cancer Institute's Anticancer Drug Screen 60, µ µ TS 5-FU FUdR). 135 µ mrna DPD TP µ 5-FU µ. 142,111 Lassmann (2007), µ µ mrna TS, TP DPD µ µ µ µ 5-FU µ µ µ µ P/DPD. 147 µ µ µ TS, µ µ 5-FU µ µ,, µ µ µ µ TS. (Johnston (1994), Edler (2002), Kornmann ( 2003)) 157,158,159 (Alegra (2003), Sakamoto (2003)) µ, µ µ S.,, TS µ (Nanni ( 200)2, Allegra (2002)). µ 391 µ, µ µ µ 5-FU, µ µ S, DPD µ (p=0,17), (p=0,19). TS DPD, µ µ µ µ TS. µ,, TS µ µ µ S. 134 85 89

µ µ µ ( (2009), 498 µ, µ µ TS µ, µ µ DFS OS µ µ TS (212, 43%). S µ µ µ FOLFOX,, (wald-p=0,068) DFS (wald-p=0,036). 166,167,168 µ,, TS µ µ µ 5-FU. Lenz, Aschele, Cascinu 166,167,168. µ MS TP µ µ µ µ., µ µ mrna TYMS TYMP µ µ., µ TS 74,7%, 75,6% µ TP, µ µ (OS) µ (DFS) µ S TP (Wald p>0,05). 90

15. µ µ mrna TYMS TYMP µ µ., µ TS 74,7%, 75,6% µ TP, µ µ (OS) µ (DFS) µ (Wald p>0,05). 91

16. µ µ µ ( S) µ ( ) µ µ, µ µ µ µ. µ µ 98 µ, µ µ µ 59, µ µ 5-FU/LV 25,5%), FOLFOX (18,4%), FOLFIRI (13,3%) FOLFOXIRI µ µ µ µ., µ µ TYMS TYMP µ µ µ µ µ µ µ real-time PCR (QRT-PCR). 98, (39,8%) (30,6%) AJCC 59 µ µ µ (60,2%). 62,6 µ, 15 (15,3%) 20 (20,4%),, µ TS TP, µ µ (DFS) ( S) (wald p>0,05 ). 74,7% µ S 75,6% µ P, µ µ DFS, OS (p>0,05 ), µ,, µ µ µ. 3 84,3% µ 3 DFS 78,1%. µ, µ µ µ µ µ µ, TS TP µ µ, µ µ TS µ µ µ. µ µ µ µ. µ µ mrna S, TP µ µ. 88 92

µ µ µ, µ µ - µ. µ TS TP, µ µ µ µ µ µ µ µ 5-FU µ. 93

17. SUMMARY In our study we assessed the prognostic significance and predictive value of the expression patterns of, TYMS and TYMP, at mrna and protein level in a cohort of 98 colorectal cancer patients received 5-FU-based adjuvant chemotherapy. Any association of those expression findings with age, gender, primary site, positive regional lymph nodes and tumor cell differentiation grade has also been investigated. Fifty-nine patients received adjuvant chemotherapy. In total, 5-FU/Leucovorin chemotherapy was given to 25 patients (25.5%), 18 (18.4%) patients were treated with FOLFOX and 13 patients (13.3%) received FOLFIRI. One patient was given FOLFOXIRI and another one received capecitabine monotherapy. Archival formalin-fixed, paraffin-embedded tumor specimens were retrieved from 98 patients.protein expression patterns of TYMS and TYMP were assessed by immunohistochemistry and patterns of relative mrna expression were evaluated by quantitatve reverse transcriptase real-time PCR for TYMS and TYMP. Gene expression profiling was performed on tumor samples by using cdna microarrays. The majority (39.8%) was on stage IIA while 30 tumors (30.6%) was on stage IIIB according to AJCC. With a median follow-up of 62.6 months (range 60.8-64.5), 15 relapses (15.3%) and 20 deaths (20.4%) were recorded. Immunohistochemical analysis revealed high protein expression levels for TYMS and of the tumors respectively, while low expression levels was found in 75.6% of the tumors for TYMP. The 3-year overall survival (OS) rate was 84.3%, while the 3-year disease-free survival (DFS) rate was 78.1%, Our results show that immunohistochemically assessed TYMS and TYMP protein expression levels as well as mrna expression levels have no independent prognostic significance for OS and DFS in the colorectal cancer patients cohort studied. No statistically significant association was also found for age, gender, primary site, lymph nodes status and tumor grade correlated with TYMS and TYMP mrna and protein expression levels (p>0.05 for all markers). he goal of identifying potential prognostic and predictive biomarkers in colorectal cancer patients, is the application and incorporation of these markers in the clinical practice by offering the opportunity to individualize cancer treatment. Although there are reports from 90 94

several studies on the prognostic and predictive role of TS and TP, it still remains controversial and additional clinical studies are required to finally establish their relationship with clinical response and potential benefit to adjuvant 5-FU based chemotherapy. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ APC: Adenomatous polyposis coli/ Αδενωµατώδης πολυποδίαση παχέος εντέρου ACF: Abberant crypt foci/πρόδροµες εστιακές εστίες δυσπλασίας BFGF: Basic fibroblast growth factor/βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας CEA: Carcinoembryonic antigen/καρκινοεµβρυικό αντιγόνο COX: Cyclooxygenase/Κυκλοοξυγενάση CTL: Cytotoxic T lympohocyte/κυτταροτοξικό Τ λεµφοκύτταρο DFS: Disease Free Survival/Ελεύθερο νόσου διάστηµα DPD: Dihydropyrimidine dehydrogenase/ διϋδροπυριµιδινική δεϋδρογενάση EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor/Υποδοχέας επιδερµικού αυξητικού παράγοντα ESMO: European Society of Medical Oncology FAP: Familiar adenomatous polyposis/οικογενής πολυποδίαση FISH: Fluorescence In Situ Hybridization /Φθορίζων εντοπισµένος/επιτόπιος υβριδισµός FGF: Fibroblast Growth Factor/ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας HPV: Human papilloma virus/ιός ανθρωπίνου θηλώµατος IHC: Immunohistochemistry/ανοσοϊστοχηµεία LOH: Loss of heterozygosity/απώλεια ετεροζυγωτίας MIN: Multiple intestinal neiplasia/πολλαπλές εντερικές νεοπλασίες mrna: Messanger ribonucleic acid/αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊνικό οξύ 95

MSS: Microsatellite stable/ OS: Overall Survival/ PCR: Polymerase Chain Reaction / µ RT-PCR: Real-Time PCR/ Real-Time µ TS: Thymidylate synthase/ µ TP: Thymidylate phosphorylase/ µ TCR- : -cell receptor / - TGF: Transforming growth factor/ : Tissue Microarrays / µ t TNF: Tumor necrosis factor/ 5-FU: 5- Fluorouacil/5 5-FU/LV: 5-Fluorouacil/Leukovorin/5 / 96

1. µ.,,., µ.,. : µ. 2008;8(1,2):16-26 2. Colorectal Cancer Fact and Figures 2008-2010. Atlanta American Cancer Society, 2008 3. Quirke P, Risio M, Lambert R, von Karsa L, Vieth M. Quality assurance in pathology in colorectal cancer screening and diagnosis European recommendations. Virchows Arch (2011) 458:1 19 4.,,. µ, University Studio Press, 2001 5. Jass JR. Molecular heterogeneity of colorectal career: implications for cancer control. Surg Oncol 2007; 16(1): S7-9. 6. Efthimiadis C, Basdanis G, Zatagias A, Tzeveleki I, Kosmidis C, Karamanlis E, Harlaftis N. Manometric and clinical evaluation of patients after low anterior resection for rectal cancer. Tech Coloproctol. 2004 Nov;8 Suppl 1:s205-7. 7...., µ 2007, µ 8. Michor F, Iwasa Y, Lengauer C, Nowak M. Dynamics of colorectal cancer. Review. Seminars in Cancer Biology 2002;15:484-493 9. Markowitz S, Bertagnoli M. Molecular basis of colorectal cancer. N Engl J Med 2009;361:2449-2460 10. Apessos A, Mihalatos M, Danielidis I et al. hmsh2 is the most commonly mutated MMR gene in a cohort of Greek HNPCC patients. Br J Cancer. 2005 Jan 31;92(2):396-404. 11. Rodriguez-Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, et al. A National Cancer Institute workshop on hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: meeting highlights and Bethesda Guidelines. J Natl Cancer Inst 1997;89:1758 1762. 12..,.,., µ. µ µ, µ. µ p53, µ. µ 2002;16(2):58-73 93 97

13. Kim G, Colangelo L, Wieand H, Paik S, Kirsch I, Wolmark N, Allegra C. Prognostic and Predictive Roles of High-Degree Microsatellite Instability in Colon Cancer: A National Cancer Institute National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Collaborative Study. J Clin Oncol 2007; 25 (7):767-772. 14. µ., M.,., µ., µµ, µ. µ µ µ µ DNA MMR. 2006; 23(5):473-482 15. A A.,. µ µ µ. µ 2003; 2(2):157-163 16. Arends JW. Molecular interactions in the Vogelstein model of colorectal carcinoma. J Pathol 2000; 190:412-416. 17. Grady WM. Genomic instability and colonic cancer. Cancer and Metastasis Reviews 2004; 23:11-27. 18. Fostira F, Thodi G, Sandaltzopoulos R, Fountzilas G, Yannoukakos D. Mutational spectrum of APC and genotype-phenotype correlations in Greek FAP patients. BMC Cancer. 22;10:389;2010 19. Lynch Henry and Chapelle A. Hereditary colorectal cancer. Engl J Med 2003;348:919-932. 20. Mihalatos M, Apessos A, Papadopoulou E, Agnantis NJ, Yannoukakos D, Fountzilas G, Nasioulas G. Genetic alterations of the APC gene in familial adenomatous polyposis patients of the hellenic group for the study of colorectal cancer. Anticancer Res. 2003 May- Jun;23(3A):2191-3. 21. Mihalatos M, Apessos A, Dauwerse H et al. Rare mutations predisposing to familial adenomatous polyposis in Greek FAP patients. BMC Cancer 15;5:40. 2005 22. Mihalatos M, Danielides I, Belogianni J, Harokopos E, Papadopoulou E, Kalimanis G, Tsiava M, Triantafillidis JK, Kosmidis PA, Fountzilas G, Basdanis G, Agnantis NJ, Yannoukakos D, Nasioulas G. Novel mutations of the APC gene in familial adenomatous polyposis in Greek patients. Cancer Genet Cytogenet. 2003 Feb;141(1):65-70. 23. Zisiadis A, Harlaftis N, Zaraboukas T, Basdanis G, Aletras H. The significance of dysplasia in colorectal adenomatous polyps associated with carcinoma. J Med Assoc Ga. 1993 May;82(5):247-9. 24. Annie Yu HJ, Lin KM, Ota DM, Lynch HT. Hereditary nonpolyposis colorectal 94 98

cancer: preventive management. Cancer Treat Rev 2003 Dec;29(6):461-70. 25. Wong JJ, Hawkins NJ, Ward RL. Colorectal cancer: a model for epigenetic tumorigenesis. Gut 2007; 56:140-8. 26. Pearson JR, Gill CI, Rowland IR. Diet, fecal water, and colon cancer--development of a biomarker. Nutr Rev. 2009 Sep;67(9):509-26 27. Cranston D, McWhinnie D, J.Collin. Dietary fibre and gastrointestinal disease. Br J Surg, 75:508-512, 1988 28.,,. µ µ., 2010,27(2):151-164 29. Moorehead R.J. and Mackelvey S.T.D. Cholecystectomy and colorectal cancer, Br J Surg 76;3:250-253, 1989 30. Richter M, Weiss M, Weinberger I, Furstenberger G, Marian B. Growth inhibition and induction of apoptosis in colorectal tumor cells by cyclooxygenase inhibitors. Carcinogenesis 2001; 22:17-25. 31. Colorectal Cancer prevention. Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 2009 32., 26, 517-553 University Studio Press 2001 33. Schwartz s Principles of Surgery, Ninth Edition. Brunicardi C. Mc Graw-Hill, 2010 34. Wolff B, Fleshman J, Beck D, Pemberton J, Wexner S.The ASCRS Textbook of Colon and Rectal Surgery 1 st Edition, Springer 2007 35. Zbar A, Wexner S. Coloproctology 1 st Edition, 2010 Springer Specialist Surgery Series 36. AJCC. Cancer staging manual. 7th and New York. Springer 2010. 37. Wang C, Zhou ZG, Yu YY, et al. Occurrence and prognostic value of circumferential resection margin involvement for patients with rectal cancer. Int J Colorectal Dis. 2009;24:385-90. 38. Stojadinovic A, Nissan A, Protic M, et al. Prospective Rrandomized study comparing sentinel lymph node evaluation with standard pathologic evaluation for the staging of colon carcinoma. Results from the United States Military Cancer Institute Clinical Trials Study GI- 01. Ann Sugery 2007;245:846-57. 39. Burdy G, Panis Y, Alves A, e al. Identifying patients with T3-T4 node-negative colon cancer at high risk of recurrence. Dis Colon Rectum 2001;44:1682-8. 40. Sarli L, Bader G, Iusco D, et al. Number of lymph nodes examined and prognosis of TNM stage II colorectal cancer. Eur J Cancer 2005;41:272-9. 95 99

41. Poon MA, O Conell MJ, Moertel CG, et al. Biochemical modulation of fluorouracil: evidence of a significant improvement of survival and quality of life in patients with advanced colorectal carcinoma. J Clin Oncol 42. Samid D. Capecitabine, A Tumor-Targeting Oral Fluoropyrimidine Molecular Rationale and Clinical Validation. Rustum Y. Fluoropyrimidines in Cancer Therapy. Human Press 2003 43. Soong R, Diasio RB. Advances and challenges in fluoropyrimidine pharmacogenomics and pharmacogenetics. Pharmacogenomics. 2005 Dec;6(8):835-47. Review 44. Chun P, Wainberg Z. Adjuvant Chemotherapy for Stage II Colon Cancer: The Role of Molecular Markers in Choosing Therapy. Gastrointest Cancer Res 2009; 3:191 196. 45. Thodi G, Fostira F, Sandaltzopoulos R et al. Screening of the DNA mismatch repair genes MLH1, MSH2 and MSH6 in a Greek cohort of Lynch syndrome suspected families. BMC Cancer. 2010 Oct 11;10:544. 46. Vicuna B., Benson III Al.B. Adjuvant therapy for stage II colon cancer: prognostic and predictive markers. J Natl Compr Canc Netw 2007;5(9):927-936 47. Papadimitriou CA, Papakostas P, Karina M et al. A randomized phase III trial of adjuvant chemotherapy with irinotecan, leucovorin and fluorouracil versus leucovorin and fluorouracil for stage II and III colon cancer: a Hellenic Cooperative Oncology Group study. BMC Med. 2011 Jan 31;9:10. 48.., -,.. µ. µ anti-egfr µ µ. µ 2008;7(3-4):286-293 49. Fountzilas G, Zisiadis A, Dafni U, Konstantaras C, Hatzitheoharis G, Papavramidis S, Bousoulegas A, Basdanis G, Giannoulis E, Dokmetzioglou J, Katsohis C, Nenopoulou E, Karvounis N, Briassoulis E, Aravantinos G, Kosmidis P, Skarlos D, Pavlidis N. Fluorouracil and leucovorin with or without interferon alfa-2a as adjuvant treatment, in patients with highrisk colon cancer: a randomized phase III study conducted by the Hellenic Cooperative Oncology Group. Oncology. 2000 Apr;58(3):227-36. 50. Timotheadou E, Papakostas P, Tsavdaridis D, Basdanis G, Kalofonos H, Aravantinos G, Bafaloukos D, Fountzilas G. Irinotecan and oxaliplatin combination, as second-line treatment, in fluoropyrimidine-pretreated advanced colorectal cancer. A phase II study by the Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG). Tumori. 2005 Jul-Aug;91(4):309-13. 100