ΑΣΚΗΣΗ 10 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ D ΣΕ ΦΥΤΑ Ο προσδιορισμός αυτός μπορεί να εφαρμοστεί σε ποικιλία φυτών ή φυτικών ιστών, όπως στο φυτό Arabidopsis thaliana ή σε λαχανάκια Βρυξελλών (Brasica oleracea), αντίστοιχα. Έχει εφαρμοστεί με επιτυχία και σε ολόκληρα φυτά ή φύλλα του Gossypium hirsutum (καλλιεργούμενο βαμβάκι). Εισαγωγή Η φωσφολιπάση D (PLD, EC 3.1.4.4) υδρολύει τα μεμβρανικά φωσφολιπίδια προς φωσφατιδικό οξύ το οποίο, στη συνέχεια, συμμετέχει σε πορείες μεταγωγής σήματος στο εσωτερικό των κυττάρων 1. Παρουσία πρωτοταγούς αλκοόλης, η PLD καταλύει τη μεταφωσφατιδυλίωση του σχήματος. Καθώς η φωσφατιδυλο-αλκοόλη δεν απαντάται υπό κανονικές συνθήκες στα κύτταρα, η αντίδραση χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση της ενεργότητας PLD. Σχήμα 10.1 Αντιδράσεις υδρόλυσης και μεταφωσφατιδυλίωσης που καταλύει η PLD. 284
Η PLD είναι διαδεδομένη σε θηλαστικά και βακτήρια, κυρίως όμως στα φυτά: υπάρχουν δώδεκα γονίδια PLD στο φυτό A. thaliana, ενώ μόνο δυο στα θηλαστικά και ένα σε κύτταρα ζύμης. Στα φυτά, που διαθέτουν έξι ισομορφές της PLD (α-ζ), συμμετέχει στην απόκριση σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις. Οι ισομορφές των φυτικών PLD διαφέρουν στους τομείς που περιέχουν (όλες πάντως διαθέτουν εις διπλούν το καταλυτικό μοτίβο HKD), στο ph και τα επίπεδα ασβεστίου που απαιτούν για τη βέλτιστη δράση τους. Στις αποκρίσεις των φυτών συμμετέχουν κυρίως οι ισομορφές α και δ. Με την προτεινόμενη μέθοδο προσδιορίζεται η ενεργότητα της ισομορφής α της PLD, που αποτελεί την κύρια συστατική μορφή του ενζύμου στα φυτά. Ο προσδιορισμός της ισομορφής δ διαφέρει λόγω της απαίτησής της για ελαϊκό οξύ και ΡΙΡ 2, που πρέπει να προστίθενται στο μίγμα αντίδρασης κατά τον in vitro προσδιορισμό του ενζύμου. Όπως και για τον προσδιορισμό της ενεργότητας PLC (βλ. Άσκηση 9), έτσι και για τον προσδιορισμό της ενεργότητας PLD, είναι προτιμότερο να χρησιμοποιείται ραδιοσημασμένο υπόστρωμα ([ 3 Η] ή [ 14 C]φωσφατιδυλοχολίνη), που αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου (η φωσφατιδυλοχολίνη αποτελεί το κύριο, in vivo και in vitro, υπόστρωμα του ενζύμου). Ωστόσο, ο ίδιος προσδιορισμός μπορεί να παραγματοποιηθεί και με ψυχρό υπόστρωμα, μόνο που στην περίπτωση αυτή διαφέρει η ανάλυση των προϊόντων της δράσης του ενζύμου. Επεξεργασία του φυτικού ιστού Όταν ο προσδιορισμός γίνεται σε φυτά, αυτά αναπτύσσονται σε σταθερές συνθήκες. Ενδεικτικά αναφέρονται: θάλαμος σταθερής θερμοκρασίας (25 C) και υγρασίας (50-60%) με φωτοπερίοδο 16:8h (φως:σκοτάδι). Το τμήμα του φυτού που επιλέγεται να μελετηθεί, αποσπάται και ομογενοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 50mM, ph 7.5, 10mM KCl, 1mM EDTA, 0.5mM PMSF, 2mM DTT. O υποδοχέας του ομογενοποιητή πρέπει να είναι βυθισμένος σε πάγο. Εναλλακτικά, ο φυτικός ιστός ψύχεται απότομα σε υγρό άζωτο και κονιορτοποιείται σε πορσελάνινο γουδί, που επίσης περιέχει υγρό άζωτο. Η σκόνη που προκύπτει προστίθεται στο ρυθμιστικό διάλυμα. Σε κάθε περίπτωση, ο λόγος του βάρους του ιστού (g) προς τον όγκο του ρυθμιστικού διαλύματος (ml) για την ομογενοποίηση πρέπει να είναι 4-8.5:15. Ακολουθεί διήθηση από διπλή γάζα και φυγοκέντρηση του διηθήματος στα 1,500xg για 15min. Παραλαμβάνεται το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης, θερμαίνεται στους 55 C για 5min και αμέσως μετά ψύχεται απότομα σε πάγο και φυγοκεντρείται στα 10,000xg για 15min. Το υπερκείμενο αυτής της φυγοκέντρησης επαναφυγοκεντρείται στα 100,000xg για 45min. Ελέγχονται για ενεργότητα PLD τα δυο τελευταία κλάσματα: κλάσμα μικροσωμάτων στο οποίο, στην περίπτωση του G. hirsutum, εντοπίζεται κυρίως η ενεργότητα PLD και υπερκείμενο των μικροσωμάτων, στο οποίο 285
αναμένεται πιθανή διαλυτή ενεργότητα. Έλεγχος μπορεί να γίνει και στα προηγούμενα ιζήματα. Ο έλεγχος των ιζημάτων γίνεται μετά από αναδιασπορά τους στο ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης ως εξής: ίζημα των 1,500g σε 200μL/g ιστού, ίζημα 10,000xg σε 150μL/g ιστού, ίζημα 100,000xg σε 60-90μL/g ιστού. Τα προς μελέτη δείγματα μπορούν να παραμείνουν για μικρό χρονικό διάστημα στους -20 C, αφού κατανεμηθούν σε μικρότερες ποσότητες σε σωλήνες eppendorf. Προετοιμασία του υποστρώματος Όπως και στην περίπτωση της PLC της Άσκησης 9, η PLD θα υδρολύσει αποτελεσματικά το υπόστρωμα της μόνο αν αυτό έχει μικυλλιακή μορφή. Στην περίπτωση της φωσφατιδυλοχολίνης, η παρασκευή μικυλλίων είναι εύκολη, κάτι που δεν ισχύει π.χ. για λιπίδια που σχηματίζουν μετά τη διασπορά τους στο νερό εξαγωνικές ΙΙ δομές. Για την προετοιμασία του υποστρώματος της PLD, κατάλληλη ποσότητα φωσφατιδυλοχολίνης (0.4μmol/δείγμα αντίδρασης) εξατμίζεται μέχρι ξηρού σε ρεύμα αζώτου. Στον ίδιο σωλήνα προστίθεται ραδιοσημασμένη φωσφατιδυλοχολίνη ([2-παλμιτυλο-9,10-3 Η]φωσφατιδυλοχολίνη) σε ποσότητα τέτοια, ώστε η ειδική ραδιενέργεια του υποστρώματος να είναι 45-50cpm/nmol. Η επισήμανση του υποστρώματος είναι σε τέτοια θέση ώστε, μετά την υδρόλυσή του, να είναι επισημασμένο και το προϊόν της αντίδρασης (φωσφατιδικό οξύ). Μετά την εξάτμιση και της ραδιοσημασμένης φωσφατιδυλοχολίνης, στο σωλήνα προστίθεται μικρή ποσότητα χλωροφορμίου που επίσης εξατμίζεται εξαντλητικά μέχρι ξηρού. Στο υπόλειμμα προστίθεται ποσότητα νερού, ώστε η τελική συγκέντρωση της φωσφατιδυλοχολίνης να είναι 20mM και γίνεται υπερήχηση σε λουτρό υπερήχων και σε θερμοκρασία δωματίου (25 C) μέχρι να παραληφθεί από το νερό ολόκληρη η ποσότητα του λιπιδίου (περίπου 10min). Για τον έλεγχο του ποσοστού διασποράς του υποστρώματος, γίνεται μέτρηση ραδιενέργειας του μικυλλιακού παρασκευάσματος (αρκούν 1-2μL γι αυτό) και η τιμή συγκρίνεται με τη ραδιενέργεια του υποστρώματος που αρχικά προστέθηκε στο σωλήνα. Η διαδικασία είναι παρόμοια και στην περίπτωση χρησιμοποίησης ψυχρού υποστρώματος. Για την παρασκευή του διαλύματος ομογενοποίησης και του μικυλλιακού υποστρώματος χρησιμοποιείται νερό millipore. In vitro αντίδραση Ο προσδιορισμός αποτελεί τροποποίηση της μεθόδου των Ryu et al 2. Στο σωλήνα της αντίδρασης προστίθενται με τη σειρά 20μL διαλύματος CaCl 2 500mM, 20μL δια- 286
λύματος SDS 5mM, 20μL υποστρώματος (επισημασμένου ή μη) και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τα 200μL με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES 100mM (ph 6.5). Αν ελέγχεται η δυνατότητα του ενζυμικού παρασκευάσματος να καταλύσει αντίδραση μεταφωσφατιδυλίωσης, στο μίγμα προστίθενται 2μL απόλυτης αιθανόλης πριν από την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος (198μL, στην περίπτωση αυτή). Η αντίδραση ξεκινά με την προσθήκη 20μL ενζυμικού παρασκευάσματος που θα πρέπει να περιέχει 3-30 μg πρωτεΐνης (ο προσδιορισμός της πρωτεΐνης γίνεται με τη μέθοδο Lowry et al. 3 ). H αντίδραση γίνεται σε υδρόλουτρο 30 C για 30min και διακόπτεται με την προσθήκη 750μL χλωροφορμίου-μεθανόλης (1:2) και έντονη ανάδευση. Ανάλυση των προϊόντων της αντίδρασης Μετά τη διακοπή της αντίδρασης, προστίθενται διαδοχικά 200μL KCl 2M και 200μL χλωροφορμίου υπό ισχυρή ανάδευση. Οι φάσεις του διφασικού συστήματος που σχηματίζεται διαχωρίζονται με φυγοκέντρηση στα 500xg για 5min και παραλαμβάνεται η χλωροφορμική (κάτω) φάση. Τα λιπίδια της χλωροφορμικής φάσης (φωσφατιδικό οξύ και μη υδρολυθέν υπόστρωμα) διαχωρίζονται με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε πλάκες silica gel 60H και σύστημα ανάπτυξης χλωροφορμίου-μεθανόλης-υδροξειδίου του αμμωνίου (65:35:5). Για να γίνει αυτό, το χλωροφορμικό εκχύλισμα εξατμίζεται και τα λιπίδια αναδιαλύονται σε μικρή ποσότητα χλωροφορμίου-μεθανόλης (2:1) και τοποθετούνται, με μορφή ζώνης, ποσοτικά στην πλάκα. Στην πλάκα τοποθετούνται επίσης, με τη μορφή κηλίδας και πρότυπα φωσωατιδυλοχολίνης και φωσφατιδικού οξέος. Κατά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, το φωσφατιδικό οξύ μετακινείται 2-3cm από το σημείο ένθεσης του δείγματος, κάτι που επιτρέπει το διαχωρισμό του από το λυσο-φωσφατιδικό οξύ που πιθανόν παράγεται στη διάρκεια της in vitro αντίδρασης. Για την παρασκευή των χρωματογραφικών πλακών αναμιγνύονται 36.5g silica gel H με 100mL διαλύματος οξαλικού καλίου 2.1%. Το μίγμα αυτό ανακινείται ισχυρά για 2min και 40sec ακριβώς πριν επιστρωθεί στη γυάλινη πλάκα. Οι πλάκες στη συνέχεια ενεργοποιούνται στους 130 C για μια ώρα. Οι χρωματογραφικές αυτές πλάκες είναι κατάλληλες για το διαχωρισμό όξινων φωσφολιπιδίων. Μετά το διαχωρισμό των λιπιδίων, παραλαμβάνεται με τη βοήθεια λεπίδας η περιοχή που περιέχει το φωσφατιδικό οξύ και, μετά την προσθήκη 0.5mL μεθανόλης και του κατάλληλου για λιπιδικά δείγματα σπινθηριστή i, μετράται η ραδιενέργεια σε μετρητή σπινθηρισμού υγρών. Στην περίπτωση χρησιμοποίησης ψυχρού υποστρώματος, η παραλαβή των λιπιδίων από το μίγi Διάλυμα σπινθηρισμού για λιπιδικά δείγματα: 5g PPO, 0.3g POPOP σε 1L τολουολίου, διάλυμα σπινθηρισμού για υδατικά δείγματα: 7g PPO, 0.3g POPOP, 100g ναφθαλινίου σε 1L διοξάνης. Μετά την πλήρη διάλυση, προστίθενται στο διάλυμα 200mL νερού (ΡΡΟ: 2,5-διφαινυλοξαζόλιο, ΡΟΡΟΡ: 1,4-δι[2-(φαινυλοξαζολο)]βενζόλιο). 287
μα της αντίδρασης και ο χρωματογραφικός διαχωρισμός του φωσφατιδικού οξέος είναι παρόμοιος. Ο προσδιορισμός όμως των επιπέδων του φωσφατιδικού οξέος γίνεται μετά από παραλαβή με τη βοήθεια λεπίδας της περιοχή που περιέχει το φωσφατιδικό οξύ, εκχύλιση του silica gel και προσδιορισμό φωσφόρου στο λιπιδικό εκχύλισμα. Για την εκχύλιση χρησιμοποιείται σύστημα διαλυτών κατά Bligh-Dyer (βλ. Άσκηση 12), με τη διαφορά ότι εδώ η υδατική φάση αντικαθίσταται με διάλυμα HCL τελικής συγκέντρωσης 1.1Ν. Ο ποσοτικός προσδιορισμός για την ποσοτικοποίηση του προϊόντος της ενεργότητας PLD (του απομονωμένου με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας φωσφατιδικού οξέος) περιγράφεται αναλυτικά επίσης στην Άσκηση 12. Σε όλες τις περιπτώσεις, ο εντοπισμός του φωσφατιδικού οξέος (γενικότερα, των λιπιδίων μετά το χρωματογραφικό διαχωρισμό τους) γίνεται με έκθεση της χρωματογραφικής πλάκας σε ατμούς ιωδίου. Βιβλιογραφία 1 Liu Y, Su Y, Wang X (2013) Phosphatidic αcid-mediated signaling. Adv Exp Med Biol, 991:159-1762. 2 Ryu SB, Karlsson BH, Ozgen M, Palta JP (1997) Inhibition of phospholipase D by lysophosphatidylethanolamine, a lipid-derived senescence retardant. Proc Natl Acad Sci USA, 94:12717-12721. 3 Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem, 193:265-275. 288