- 26 - ΕΝΟΤΗΤΑ Γ ΣΤΕΡΟΕΙΔΗ Τα στεροειδή είναι μια σημαντική κατηγορία φυσικών προϊόντων των οποίων οι δομές έχουν ως βάση το σκελετό του υδρογονωμένου τετρακυκλικού περυδροκυκλοπεντανοφαινανθρενίου. 2 3 11 1 10 9 Α Β 12 17 13 Γ Δ 8 14 15 7 16 5 4 6 Περυδρο-κυκλοπεντανο-Φαινανθρένιο Τα στεροειδή είναι πολύ διαδεδομένα στη φύση και απαντώνται τόσο σε φυτικούς όσο και σε ζωικούς οργανισμούς. Είναι δυνατόν να προέλθουν βιοσυνθετικά από τα τριτερπένια λανοστερόλη (στα ζώα) και κυκλοαρτενόλη (στα φυτά). Τα στεροειδή σχηματίζονται από τα συγκεκριμένα τριτερπένια με απώλεια τριών μεθυλουποκαταστατών από τον ανθρακικό σκελετό και ενός μικρότερου τμήματος της πλευρικής αλυσίδας.
- 27-3 C 3 C O 3 C O 3 C Λανοστερόλη Κυκλοαρτενόλη Ειδικά τα στεροειδή των ζωικών οργανισμών συμμετέχουν σε πολλές σημαντικές βιολογικές λειτουργίες. Οι ορμόνες του φύλου των θηλαστικών, οι στερόλες, τα χολικά οξέα, η βιταμίνη D, οι ορμόνες των επινεφριδίων (κορτικοστεροειδή), οι καρδιακοί γλυκοζίτες ανήκουν στην κατηγορία των στεροειδών. Τα στεροειδή τα οποία απαντούν στη φύση, συνήθως είναι ενωμένα με οξυγόνο στον C 3. Επίσης τα περισσότερα στεροειδή είναι υποκατεστημένα με μεθυλομάδες στις θέσεις C 10 και C 13, ενώ στον C 17 υπάρχει κάποιος υποκαταστάτης που είναι αλκύλιο ή άλλη ομάδα. Τα φυτικά στεροειδή αποτελούν την κυριότερη πηγή στεροειδών φαρμάκων. Ένα μικρό ποσοστό παρασκευάζεται από ζωικά στεροειδή και η ολική σύνθεση είναι συμφέρουσα μόνο στην περίπτωση ορισμένων αρωματικών στεροειδών και των 19-νορ-στεροειδών, όπως η νορεθιστερόνη. ΑΣΚΗΣΗ 1 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ ΑΠΟ ΠΕΤΡΕΣ ΧΟΛΗΣ Ένα από τα πιο διαδεδομένα στεροειδή είναι η χοληστερόλη η οποία απαντάται σε όλους τους ιστούς των θηλαστικών ως συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών. χοληστερόλη αποτελεί την πρώτη ύλη για τη σύνθεση των χολικών οξέων, των ορμονών του φύλου και των επινεφριδίων. Η χοληστερόλη ήταν το πρώτο στεροειδές το οποίο απομονώθηκε και μελετήθηκε. Βέβαια εξαιτίας της πολύπλοκης δομής της πέρασαν περίπου 160 χρόνια από την
- 28 - ανακάλυψή της (1770) για να προσδιοριστεί η δομή αυτή (1932). Επιπλέον, επειδή η χοληστερόλη περιέχει οκτώ ασύμμετρα κέντρα και επομένως υπάρχουν 2 8 =256 δυνατά στερεοϊσομερή της, απαιτήθηκαν άλλα 23 χρόνια (1955) για να προσδιοριστεί η τρισδιάστατη δομή της. Η δομή της περιλαμβάνει στον C 3 μία υδροξυλομάδα (βδιάταξης) και ένα διπλό δεσμό μεταξύ των θέσεων C 5 και C 6. Η χοληστερόλη και τα χολικά οξέα καλύπτουν ως πρώτες ύλες το 10% περίπου της παγκοσμίου παραγωγής στεροειδών. Τα επίπεδα της χοληστερόλης στο αίμα εξαρτώνται τόσο από τις διατροφικές συνήθειες του ατόμου όσο και από διάφορους φυσιολογικούς παράγοντες. Πιστεύεται ότι τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης σχετίζονται με την εμφάνιση της αθηροσκλήρωσης (πάθηση των μεγάλων αρτηριών, η οποία χαρακτηρίζεται από την εναπόθεση λιποειδών και το σχηματισμό αθηρωματικών πλακών κάτω από τον έσω χιτώνα τους). 3 C O 3 4 5 6 8 7 Χοληστερόλη Η χοληστερόλη είναι δυνατόν να απομονωθεί από πέτρες χολής (πολτοποιημένες) χρησιμοποιώντας θερμό αιθέρα. Μαζί με τη χοληστερόλη εκχυλίζονται και άλλα τρία στεροειδή τα οποία συνυπάρχουν σε μικρές ποσότητες (0.1-3%). Τα στεροειδή αυτά παρουσιάζουν παρόμοια διαλυτότητα με τη χοληστερόλη και έτσι δεν είναι δυνατόν να διαχωριστούν με κρυστάλλωση. Ένα από τα στεροειδή αυτά είναι η χοληστανόλη. Τα άλλα δύο είναι η 7-δεϋδρο-χοληστερόλη, η οποία περιέχει δύο διπλούς δεσμούς μεταξύ των ατόμων άνθρακα 5 & 6 και 7 & 8, και η Δ 7 -χοληστεν-3β-όλη η οποία περιέχει έναν διπλό δεσμό μεταξύ των ατόμων άνθρακα 7 και 8.
- 29-3 C 8 O 5 6 7 Χοληστανόλη ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Κωνικές φιάλες Oγκομετρικοί κύλινδροι Διαχωριστική χοάνη Διάταξη διηθήσεως Υάλινο χωνί Ατμόλουτρο Υλικά και αντιδραστήρια Πέτρες χολής Αιθέρας Μεθανόλη Πειραματική πορεία 2 g πολτοποιημένες πέτρες χολής τοποθετούνται σε μια κωνική φιάλη των 25 ml. Στη φιάλη προστίθενται 10 ml αιθέρα και το μίγμα θερμαίνεται σε ατμόλουτρο [Σχήμα Π4α], ενώ συγχρόνως αναδεύεται. Κατόπιν το καφεκίτρινο διάλυμα, ενώ είναι ακόμα ζεστό, διηθείται μέσω πτυχωτού ηθμού, o οποίος έχει διαβραχεί με αιθέρα, εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8]. Η φιάλη και ο ηθμός ξεπλένονται με μικρή ποσότητα αιθέρα. Το διήθημα αραιώνεται με 10 ml μεθανόλης, αποχρωματίζεται και κατόπιν θερμαίνεται σε ατμόλουτρο [Σχήμα Π4α]. Εν συνεχεία το διάλυμα διηθείται, ενώ είναι ακόμα ζεστό, σε θερμό υάλινο χωνί με πτυχωτό ηθμό [Σχήμα Π15]. Το διήθημα ξαναθερμαίνεται και προστίθεται στάγδην νερό μέχρι εμφανίσεως ενός θολώματος. Με ψύξη του διαλύματος αποβάλλεται η χοληστερόλη, η οποία διηθείται, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.2) [Σχήμα Π16β], εκπλένεται με κρύα μεθανόλη και αφήνεται να ξηραθεί, επί αρκετή ώρα, Το στερεό το οποίο διηθείται είναι ένα προϊόν μεταβολισμού της αιμοσφαιρίνης, η χολερυθρίνη. Για τον αποχρωματισμό προστίθεται στο διάλυμα ενεργός άνθρακας και το μίγμα διηθείται, υπό κενό, μέσω ηθμού με πορώδες (Νο.3) ο οποίος περιέχει λεπτό στρώμα γης διατόμων (Celite) [Σχήμα Π16β].
- 30 - επάνω στον ηθμό. Συλλέγονται περίπου 1.5 g ακάθαρτης χοληστερόλης (Σ.Τ 146-148 o C). Καθαρή χοληστερόλη απομονώνεται με βρωμίωση και κατόπιν αποβρωμίωση αυτής. ΑΣΚΗΣΗ 2α ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 5α,6β-ΔΙΒΡΩΜΟΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ Ο καθαρισμός της χοληστερόλης από τα άλλα στεροειδή τα οποία τη συνοδεύον κατά την απομόνωσή της είναι δυνατόν να επιτευχθεί χημικά με βρωμίωση. Η χοληστερόλη μετατρέπεται σε διβρωμο-χοληστερόλη με την προσθήκη Br 2 στο διπλό δεσμό της, ενώ η χοληστανόλη που δεν έχει διπλό δεσμό δεν αντιδρά με το Br 2. Τέλος τα άλλα δύο στεροειδή η 7-δεϋδρο-χοληστερόλη και Δ 7 -χοληστεν-3β-όλη βρωμιώνονται πιο δύσκολα λόγω στερεοχημικής παρεμποδίσεως. O 2 1 3 4 5 6 Br 2 O Br Br Χοληστερόλη 5α, 6β-Διβρωμοχοληστερόλη ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Ατμόλουτρο Κωνικές φιάλες Συσκευή διηθήσεως Υλικά και αντιδραστήρια Χοληστερόλη Άνυδρο οξικό νάτριο Διαιθυλαιθέρας Οξικό οξύ Βρώμιο
- 31 - Πειραματική πορεία 0.20 g (2.5 mmol) σκόνης άνυδρου οξικού νατρίου διαλύονται σε 25 ml οξικού οξέος. Το μίγμα αναδεύεται ζωηρά ώστε να διαλυθεί όλο το οξικό νάτριο. Στη συνέχεια στο διάλυμα του οξικού νατρίου προστίθενται 2.8 g (0.9 ml, 15.5 mmol) βρωμίου και το μίγμα μεταγγίζεται με ανάδευση σε διάλυμα χοληστερόλης σε αιθέρα. Το διάλυμα γρήγορα αποκτά κίτρινο χρώμα και αποβάλλεται το διβρωμίδιο σαν άμορφη μάζα. Το μίγμα ψύχεται σε παγόλουτρο και το προϊόν συλλέγεται με διήθηση, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.2) [Σχήμα Π16β]. Το προϊόν που είναι σαν πάστα, πιέζεται με σπάτουλα πάνω στον ηθμό και πλένεται με οξικό οξύ μέχρι που το διήθημα να είναι άχρωμο (3x10ml ΑcO). Το προϊόν (σύμπλοκο 1:1 διβρωμοχοληστερόλης/οξικού οξέος) ξηραίνεται μέχρι σταθερού βάρους σε θερμοκρασία δωματίου. Rf (A) 0,53 (A) Οξικός αιθυλεστέρας : Πετρ. Αιθέρας (1:1) ΑΣΚΗΣΗ 2β ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ ΑΠΟ 5α, 6β- ΔΙΒΡΩΜΟΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ Η διβρωμοχοληστερόλη μετατρέπεται σε χοληστερόλη μετά κατεργασία από κατεργασία με σκόνη Zn σε οξικό οξύ. O 1 2 Br Br O 3 4 5 6 2 Η άσκηση πραγματοποιείται στην εστία προσεκτικά φορώντας γάντια και γυαλιά Το διάλυμα παρασκευάζεται ως εξής: Σε ποτήρι ζέσεως 100 ml φέρονται 2.9 g (7.5 mmol) χοληστερόλης τα οποία διαλύονται σε 30 ml αιθέρα με θέρμανση σε ατμόλουτρο και ταυτόχρονη ανάδευση με υάλινη ράβδο.
- 32 - ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Κωνικές φιάλες Συσκευή διηθήσεως Μαγνητικός αναδευτήρας Υλικά και αντιδραστήρια Χοληστερηλοβρωμίδιο Άνυδρο οξικό νάτριο Διαιθυλαιθέρας Οξικό οξύ Μεθανόλη Βρώμιο Σκόνη Zn Διάλυμα ΗCl 1N Διάλυμα NaO 1N Na 2 SO 4 Πειραματική πορεία 1.5 g χοληστερηλοδιβρωμιδίου τοποθετούνται σε μια σφαιρική φιάλη των 100 ml, καλύπτονται με 25 ml αιθέρα, προστίθεται 1 ml οξικού οξέος και το αιώρημα αναδεύεται ισχυρά με μαγνητικό αναδευτήρα [Σχήμα Π2]. Ακολούθως προστίθενται 0.8 g σκόνης ψευδαργύρου σε μικρές δόσεις εντός 10 λεπτών. Μετά την προσθήκη του ψευδαργύρου το μίγμα αναδεύεται άλλα 20 λεπτά. Εν συνεχεία προστίθεται 1 ml νερού, το στερεό διαλύεται και το διάλυμα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη [Σχήμα Π6]. Προστίθενται 20 ml αιθέρα και η αιθερική στοιβάδα πλένεται διαδοχικά 1 φορά με 20 ml νερού, 1 φορά με 20 ml υδροχλωρικού οξέος 1Ν, 2 φορές με 20 ml νερού, 1 φορά με 20 ml ΝαΟΗ 1Ν και 2 φορές με 20 ml νερού. Εν συνεχεία η οργανική φάση ξηραίνεται με Na 2 SO 4, διηθείται μέσω πτυχωτού ηθμού εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8] και συμπυκνώνεται, υπό κενό, [Σχήμα Π9] μέχρι ξηρού. Στο στερεό υπόλειμμα προστίθενται 20 ml μεθανόλης και το ίζημα (χοληστερόλη) συλλέγεται με διήθηση, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.2) [Σχήμα Π16β] και ξηραίνεται σε ξηραντήρα. Η καθαρότητα του προϊόντος ελέγχεται με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Σ.Τ. 149-150 o C, Rf (A) 0,33 (A) Οξικός αιθυλεστέρας : Πετρ. Αιθέρας (1:1) Εάν κατά την προσθήκη του ψευδαργύρου η φιάλη ζεσταθεί τότε τοποθετείται σε παγόλουτρο. Κατά τη διάρκεια της ανάδευσης το μίγμα μετατρέπεται σε μια πάστα λευκού στερεού, το οποίο είναι το σύμπλοκο της χοληστερόλης με ZnBr 2.
- 33 - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Donald L. Pavia, Gary M. Lampman, George S. Kriz "Introduction to Organic Laboratory Techniques", 2 st Edition, Second Edition Saunders College Publishing, New York 2. Gunnar Samuelsson, "Φαρμακευτικά Προϊόντα Φυσικής Προελεύσεως", (Απόδοση στην Ελληνική, Γενική Επιστημονική Επιμέλεια: Π. Κορδοπάτης, Ε. Μάνεση- Ζούπα, Γ. Πάϊρας), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο (1996). 3. R. Ikan, "Natural Products, A Laboratory Guide", 2 nd Edition, Academic Press Inc., New York (1991).