Μοριακοί δείκτες στη διάγνωση και πρόγνωση των μυελοϋπερπλαστικών νοσημάτων Νόρα Βύνιου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αιματολογίας Αιματολογικό Τμήμα Α Παθολογικής Κλινικής ΕΚΠΑ
BCR-ABL- αρνητικά μυελοϋπερπλαστικά νοσήματα (MPNs) (WHO 2008) Αληθής πολυκυτταραιμία Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση Πρωτοπαθής μυελοΐνωση Χρόνια ουδετεροφιλική λευχαιμία Χρόνια ηωσινοφιλική λευχαιμία, μη άλλως καθοριζόμενη Μαστοκύττωση Αταξινόμητο μυελοϋπερπλαστικό νεόπλασμα
Αληθής πολυκυτταραιμία (PV): Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (1) Diagnostic criteria for PV (WHO 2008) 2 major+1 minor criteria, or the 1 st major+2 minor criteria required Major Criteria Hemoglobin of more than 18.5 g/dl in men, 16.5 g/dl in women, or elevated red cell mass greater than 25% above mean normal predicted value. Presence of JAK2 617V greater than F or other functionally similar mutations, such as the exon 12 mutation of JAK2. Minor Criteria Bone marrow biopsy showing hypercellularity with prominent erythroid, granulocytic, and megakaryocytic proliferation. Serum erythropoietin level below normal range. Endogenous erythroid colony formation in vitro. Mεταλλάξεις της JAK2 κινάσης: JAK2 V617F σε > 95% των ασθενών με PV (Kralovics et al, NEJM 2005, Baxter et al, Lancet 2005) (συνήθως PV με tri-lineage involvement) JAK2 exon 12 mutations σε ~ 3% ασθενών με PV (Scott et al, NEJM 2007) (άνω των 37 διαφορετικών μεταλλάξεων έχουν εντοπιστεί, συνήθως PV με υπερπλασία κυρίως ερυθράς σειράς)
Αληθής πολυκυτταραιμία (PV) : Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (2) (EPO, TPO ) (EPO, TPO ) Όλες οι γνωστές μεταλλάξεις φαίνεται πως επηρεάζουν τον τομέα της ψευδοκινάσης του JAK2 μορίου, που φυσιολογικά αλληλεπιδρά με τον τομέα της κινάσης, εμποδίζοντας τη δράση του Έλεγχος για τις μεταλλάξεις σε PB ή ΒΜ, συνήθως με allele-specific PCR για τη V617F και με PCR-Direct sequencing/pyrosequencing για exon12 mutants (συχνά χαμηλή ευαισθησία με τις δύο τελευταίες μεθόδους!) (Gong et al, J Mol Diagnostics 2013)
Αληθής πολυκυτταραιμία (PV) : Μοριακοί δείκτες στην πρόγνωση Σχέση μεταξύ αλληλικού φορτίου JAK2 V617F και προόδου σε μυελοσκλήρυνση (post-pv MF) (Passamonti et al, Leukemia 2010, μελέτη σε 338 ασθενείς με PV) Risk of transformation to myelofibrosis according to the assessment of the JAK2V617F allele burden by monitoring the evolutionary pattern (A) or using the first single-point measurement (B). (Alvarez-Larran et al, American J of Hematol 2014, μελέτη σε 163 ασθενείς με PV και 184 ασθενείς με ΕΤ)
Αληθής πολυκυτταραιμία (PV) : Μοριακοί δείκτες στην πρόγνωση Σχέση μεταξύ αλληλικού φορτίου JAK2 V617F και θρομβωτικά / αιμορραγικά επεισόδια? (Passamonti et al, Leukemia 2010, μελέτη σε 338 ασθενείς με PV) (Alvarez-Larran et al, American J of Hematol 2014, μελέτη σε 163 ασθενείς με PV και 184 ασθενείς με ΕΤ)
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (1) Κριτήρια διάγνωσης ΕΤ κατά WHO 2008 (πρέπει και τα 4 να πληρούνται)
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (2) Mετάλλαξη της JAK2 κινάσης: JAK2 V617F σε περίπου 40% των ασθενών με ET (Kralovics et al, NEJM 2005, Baxter et al, Lancet 2005, Levine et al, Cancer Cell 2005) Μετάλλαξη του υποδοχέα της θρομβοποιητίνης (ΜPL): MPL W515L/K στο 1-3% ασθενών με ET, μετάλλαξη αμοιβαία αποκλειόμενη με την JAK2 V617F (Pardanani et al, Blood 2006) Μετάλλαξη της καλρετικουλίνης (CALR): Insertions/deletions στο εξόνιο 9 της CALR παρούσες στο 70% περίπου των JAK2V617F-, ΜPLW515L/K - ασθενών (Κlampfl et al, NEJM 2013, Νangalia et al, NEJM 2013) Aναζήτηση μεταλλάξεων με allele-specific PCR για JAK2 V617F και MPL W515L/K και με PCR- direct sequencing για την hotspot περιοχή μεταλλάξεων της CALR
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (3) Saur et al, Blood 2010
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (4) CALR: πρωτεΐνη που τροποποιεί την αγωγή σήματος σε οδούς που χρησιμοποιούν ως δεύτερο μήνυμα το Ca, δεσμεύοντας ιόντα ασβεστίου Οι μεταλλάξεις της CALR στα μυελο-υπερπλαστικά νοσήματα είναι συνήθως insertions ή deletions (frameshift mutations) που καταργούν την αλληλουχία KDEL (πρόσδεση στο ER)
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες στην πρόγνωση (1) Φαίνεται πως η παρουσία CALR μετάλλαξης συνδυάζεται με καλύτερης πρόγνωσης νόσο σε σύγκριση με την JAK2V617F : μικρότερος κίνδυνος θρομβώσεων και σε μία μελέτη επίσης μικρότερη επίπτωση post-et MF και λευχαιμικής μετατροπής Rumi et al, Blood 2014 (Αναδρομική μελέτη σε 466 ασθενείς με ET και 468 ασθενείς με PV)
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες στην πρόγνωση (1) Chen et al, Annals of Hematol 2014 (μελέτη σε 147 ασθενείς με ΕΤ) Rotunno et al, Blood 2014 (μελέτη σε 576 ασθενείς με ΕΤ)
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες στην πρόγνωση (2) Το αλληλικό φορτίο JAK2 φαίνεται πως παίζει ρόλο και στην ΕΤ ως προς την πρόγνωση επιπλοκών από τη νόσο Antonioli et al, Haematologica 2008 (μελέτη σε 260 ασθενείς με ΕΤ)
Ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση (ET): Μοριακοί δείκτες στην πρόγνωση (2) (Alvarez-Larran et al, American J of Hematol 2014, μελέτη σε 163 ασθενείς με PV και 184 ασθενείς με ΕΤ) Risk of transformation to myelofibrosis according to the assessment of the JAK2V617F allele burden by monitoring the evolutionary pattern (A) or using the first single-point measurement (B). (Alvarez-Larran et al, American J of Hematol 2014, μελέτη σε 163 ασθενείς με PV και 184 ασθενείς με ΕΤ)
Πρωτοπαθής μυελοϊνωση (PMF): Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (1) Diagnostic criteria (WHO 2008): must meet all 3 major criteria plus at least two minor criteria Major criteria: 1: megakaryocyte proliferation and atypia (small to large megakaryocytes with dense clustering, an aberrant N/C ratio and hyperchromatic and irregularly folded nuclei, often described as cloud-like or balloon-shaped ) accompanied by either reticulum or collagen fibrosis OR in the absence of reticulin fibrosis, the megakaryocyte changes must be accompanied by increased marrow cellularity, granulocytic proliferation and often decreased erythropoiesis (i.e. pre-fibrotic PMF) 2: not meeting WHO criteria for CML, PV, MDS or other myeloid neoplasm 3: demonstration of JAK2 V617F or other clonal marker (MPL W515K/L) or no evidence of reactive marrow fibrosis Minor criteria: 1: leukoerythroblastosis 2: increased serum LDH 3: anemia 4: palpable splenomegaly
Πρωτοπαθής μυελοϊνωση (PMF): Μοριακοί δείκτες για τη διάγνωση (2) Mετάλλαξη της JAK2 κινάσης: JAK2 V617F σε 50-60% των ασθενών με PMF (Kralovics et al, NEJM 2005, Baxter et al, Lancet 2005) Μετάλλαξη του υποδοχέα της θρομβοποιητίνης (ΜPL): MPL W515L/K στο 5-9% ασθενών με PMF, μετάλλαξη αμοιβαία αποκλειόμενη με την JAK2 V617F (Pikman et al, PLos Med 2006, Pardanani et al, Blood 2006) Μετάλλαξη της καλρετικουλίνης (CALR): Insertions/deletions στο εξόνιο 9 της CALR παρούσες στο 80% περίπου των JAK2V617F-, ΜPLW515L/K - ασθενών (Κlampfl et al, NEJM 2013, Νangalia et al, NEJM 2013)
ΠΡΟΓΝΩΣΗ PMF Only two predictors of leukemic transformation in the D- IPSS study: unfavorable karyotype, PLT100.000
(Tefferi et al, Leukemia 2014) Πρωτοπαθής μυελοϊνωση (PMF): Μοριακοί δείκτες για την πρόγνωση (1) Σχέση των driver mutations με πρόγνωση
Cumulative incidence of thrombosis in PMF patients stratified according to their driver mutation. Vertical tick marks indicate right-censored patients. JAK2-mutant patients had a higher incidence of thrombosis than those with CALR mutation (P =.021). This difference remained statistically significant after adjusting for age (SHR, 2.19; 95% CI, 1.15-4.18; P =.017), the estimated risk of thrombosis being about 2-fold in JAK2-mutant compared with CALR-mutant patients. Cumulative incidence of leukemic transformation in PMF patients stratified according to their driver mutation. Vertical tick marks indicate rightcensored patients. Triple-negative patients had higher incidence of leukemic transformation compared with both CALR-mutant and JAK2- mutant patients (maximum P value equal to.043). Rumi et al, Blood 2014
ΠΡΩΤΟΠΑΘΗΣ ΜΥΕΛΟΪΝΩΣΗ (PMF): ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΓΝΩΣΗ (2) Μεταλλάξεις σε άλλα γονίδια έχουν βρεθεί στην PMF σε μεγάλες μελέτες με arraycgh ASXL1, EZH2 SRSF2 IDH1/2 Polycomb group proteins Spliceosome component Isocitrate dehydrogenase Vannucchi et al, Leukemia 2013
ΠΡΩΤΟΠΑΘΗΣ ΜΥΕΛΟΪΝΩΣΗ (PMF): ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΓΝΩΣΗ (2) Vannucchi et al, Leukemia 2013
ΠΡΩΤΟΠΑΘΗΣ ΜΥΕΛΟΪΝΩΣΗ (PMF): ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΓΝΩΣΗ (2) Gulielmegli et al, Leukemia 2014 Ανάλογα αποτελέσματα και για τον κίνδυνο λευχαιμικής μετατροπής
ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΜΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ (SM) Major criterion Minor criteria Multifocal, dense aggregates of mast a. In biopsy section, more than 25% of cells (15 or more) detected in sections of the masts cells in the infiltrate have bone marrow and confirmed by tryptase atypical morphology, or, of all the mast immunohistochemistry or other special cells in the aspirate smear, more than stains 25% are immature or atypical b. Mast cells co-express CD117 with CD2 and/or CD25 c. Detection of KIT point mutation at codon 816 in bone marrow, blood, or other extracutaneous organs d. Serum total tryptase persistently >20 ng/ml (not a valid criteria in cases of systemic mastocytosis with associated clonal hematologic nonmast-cell lineage disease) Table 1. WHO criteria for systemic mastocytosis Diagnosis may be rendered if one major plus one minor or three minor criteria are fulfilled.
C-kit: τυροσινική κινάση, υποδοχέας του stem cell factor (SCF)
Σημαντικά σημεία Η ανίχνευση της D816V με απλή PCR και Sanger sequencing έχει συνήθως μικρή ευαισθησία, ενώ ουσιαστικά η μετάλλαξη υπάρχει στα κακοήθη μαστοκύτταρα σχεδόν σε όλες (93-97%) περιπτώσεις αληθούς SM. (Garcia-Montero et al Βlood 2006, Kristensen et al J Mol Diagn 2011) Αυτό συμβαίνει γιατί όχι μόνο το αλληλικό φορτίο δεν είναι πάντα 100%, αλλά και πολλές αιμοποητικές σειρές δε φέρουν τη μετάλλαξη, οπότε μειώνεται η πιθανότητα ανίχνευσης σε ολικό μυελό ή ολικό αίμα. (σε μια μεγάλη σειρά ασθενών, η μετάλλαξη, παρούσα στα MCs, βρέθηκε στα ησωσινόφιλα και στα CD34+ κύτταρα στο 1/3 των ασθενών και σε ακόμη μικρότερη συχνότητα στα PMNs και μονοκύτταρα) Garcia-Montero et al Βlood 2006 Προτιμότερες για την ανίχνευση είναι μέθοδοι όπως allele-specific PCR ή enriched sequencing of mutant alleles μετά από digestion του αμετάλλακτου αλληλίου με κατάλληλο restriction enzyme (ESMA) ή allelespecific competitive blocker PCR (ACB-PCR) (Tan et al, Clin Chem 2006, Kristensen et al J Mol Diagn 2011)
D816V ΚΑΙ ΠΡΟΓΝΩΣΗ SM Η παρουσία D816V, συχνότατη όπως είδαμε στην SM, καθορίζει αντίσταση στο imatinib ως θεραπευτική επιλογή Η in vitro δραστικότητα του dasatinib έναντι D816V+ κυτταρικών σειρών, δεν έχει μεταφραστεί σε ανάλογη αποτελεσματικότητα σε ασθενείς (Pardanani, Am J of Hematol 2012)
ΜΥΕΛΟ-ΥΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ ΜΕ ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΗ PDGFRA Diagnostic criteria of an MPN a with eosinophilia associated with FIP1L1 PDGFRA A myeloproliferative neoplasm with prominent eosinophilia AND Presence of a FIP1L1 PDGFRA fusion gene b a Patients presenting with acute myeloid leukemia or lymphoblastic leukemia/lymphoma with eosinophilia and a FIP1L1 PDGFRA fusion gene are also assigned to this category. b If appropriate molecular analysis is not available, this diagnosis should be suspected if there is a Ph-negative MPN with the hematological features of chronic eosinophilic leukemia associated with splenomegaly, a marked elevation of serum vitamin B12, elevation of serum tryptase and increased bone marrow mast cells.
Fusion of FIP1L1 to PDGFRA is the consequence of a deletion on chromosome 4, del(4)(q12q12), with the centromeric breakpoint in FIP1L1 and the telomeric breakpoint in PDGFRA. The breakpoints in FIP1L1 are diverse (introns 7 to 10), but the breakpoints in PDGFRA are always in exon 12 (encoding the juxtamembrane region). (Cools J, NEJM 2003) Because the chromosomal deletion is only 800 kb in size, it remains undetected with standard cytogenetics (karyotype) FISH / PCR, often nested, indicated
H πολύ καλή πρόγνωση με imatinib μπορεί να επηρεαστεί από μεταλλάξεις στον τομές της κινάσης (Τ674Ι, ανάλογη της Τ315Ι στο BCR- ABL) Monitoring ανταπόκρισης στους TKIs: RT-qPCR (CMR σχεδόν σε όλους εντός έτους από αρχή θεραπείας)
ΜΥΕΛΟ-ΥΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ ΜΕ ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΗ PDGFRB Diagnostic criteria of MPN associated with ETV6 PDGFRB fusion gene or other rearrangement of PDGFRB A myeloproliferative neoplasm, often with prominent eosinophilia and sometimes with neutrophilia or monocytosis AND Presence of t(5;12)(q31 q33;p12) or a variant translocation c or, demonstration of an ETV6 PDGFRB fusion gene or of other PDGFRB rearrangement Because t(5;12)(q31 q33;p12) does not always lead to an ETV6 PDGFRB fusion gene, molecular confirmation is highly desirable. If molecular analysis is not available, this diagnosis should be suspected if there is a Ph-negative MPN associated with eosinophilia and with a translocation with a 5q31 33 break point.
O ορισμός αυτός σημαίνει ότι σε κλινική υποψία του συνδρόμου, παρ ότι συνήθως η αναδιάταξη φαίνεται καρυοτυπικά, θα πρέπει να γίνεται μοριακός έλεγχος (RT-PCR) με primers για όλα τα γνωστά breakpoints (Lierman et al, Hameatologica 2007)
Παρακολούθηση PDGFRB-rearranged μεταγράφων με nested και single-step RT-PCR Η nested PCR συνήθως παραμένει θετική παρά την άριστη αιματολογική ανταπόκριση στους TKIs David et al, Blood 2007