MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII, TINERETULUI ŞI SPORTULUI UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA MEDICINĂ ŞI FARMACIE ONACA ADRIANA GABRIELA TEZĂ DE DOCTORAT STRESUL OXIDATIV ŞI COMPLICAŢIILE MICROVASCULARE ALE DIABETULUI ZAHARAT Conducător ştiinţific: Prof. Univ. Dr. MARIUS MOTOCU Oradea 2011
CUPRINS Introducere 8 Lista de abrevieri.. 11 PARTEA I STADIUL CUNOAŞTERII Cap.I. Stresul oxidativ. Cadrul etiopatogenetic... 13 1.1. Definitia stresului oxidativ... 13 1.2. Acţiunea stresului oxidativ asupra organismului... 13 1.3. Metode de determinare a radicalilor liberi. 22 1.4. Sisteme antioxidante... 22 1.5. Acţiunea substanţelor oxidante asupra compuşilor organici:... 24 1.6. Concluzii. 27 Cap.II. Actualităţi privind diabetul zaharat 30 2.1. Definiţia diabetului zaharat 30 2.2 Clasificarea şi terminologia actuală a diabetului zaharat 30 2.3. Notiuni de fiziopataologie.. 32 2.4. Complicaţiile cronice ale diabetului zaharat.. 32 2.4.1. Clasificarea complicaţiilor cronice 32 2.4.1.1. Boala microvasculară diabetică... 33 2.4.1.2. Boala macrovasculară... 37 2.4.1.3. Neuropatia diabetică... 37 2.4.2. Fiziopatologia complicaţiilor cronice ale diabetului zaharat.. 40 Cap.III. Implicarea stresului oxidativ în apariţia complicaţiilor microvasculare ale diabetului zaharat... 44 3.1. Definiţia stresului oxidativ.. 44 3.2. Mecanismele prin care SO generează complicaţiile microvasculare ale DZ.. 44 3.2.1. Hiperproducţia de radicali liberi de oxigen 49 3.2.2. Reducerea activităţii sistemelor antioxidante 54 3.3. Efectele stresului oxidativ în diabetul zaharat.. 55 3.3.1. Efectul citotoxic general şi modificări tisulare în diabetul zaharat... 55 3.3.2. Efectul citotoxic asupra celulelor β pancreatice... 56 3.3.3. Stresul oxidativ şi retinopatia diabetică... 57 3.3.4. Stresul oxidativ şi boala renală diabetică... 59 1
3.4. Concluzii... 62 PARTEA a II-a CONTRIBUŢII PROPRII Cap.IV. Ipoteza de lucru. Obiectivele studiului 65 4.1 Ipoteza de lucru... 65 4.2. Obiectivele studiului... 66 Cap.V. Material şi metodă.. 68 5.1 Material... 68 5.2. Metode de explorare utilizate în studiu.. 70 5.2.1. Investigarea stresului oxidativ... 70 5.2.1.1. Determinarea produsilor oxidati... 70 5.2.1.2. Determinarea capacităţii antioxidante... 71 5.2.2. Investigarea echilibrului metabolic la pacienţii cu diabet zaharat... 72 5.2.3. Metode de investigare a prezenţei complicaţiilor DZ... 77 5.3. Metode de prelucrare statistică 82 Cap.VI. Rezultate şi discuţii 84 6.1. Echilibrul metabolic şi stresul oxidativ la pacienţii diabetici versus pacienţi nediabetici... 84 6.1.1. Structura loturilor... 84 6.1.2. Caracteristicile lotului de diabetici... 88 6.1.3. Complicaţiile diabetului. 93 6.1.3.1. Complicaţiile microvasculare... 93 Tipul complicaţiilor microvasculare... 93 Durata diabetului şi de tipul complicaţiilor microvasculare... 94 Tipul retinopatiei 95 Durata diabetului şi tipul retinopatiei... 96 Stadiul nefropatiei.. 99 Durata diabetului şi tipul nefropatiei... 100 6.1.3.2. Polineuropatia diabetică.... 101 6.1.3.3. Complicaţiile macrovasculare ale diabetului şi APP pentru nediabetici... 102 6.1.3.4. Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare ale diabetului... 105 Durata diabetului în funcţie de asocierea complicaţiilor 106 2
6.1.3.5. Numărul complicaţiilor. 109 6.1.4. Echilibrul metabolic.. 111 6.1.4.1. Echilibrul metabolic comparativ diabetici nediabetici.. 111 6.1.4.2. Echilibrul metabolic şi tratamentul antidiabetic... 112 6.1.4.3. Echilibrul metabolic şi controlul metabolic... 114 6.1.4.4. Echilibrul metabolic şi complicaţiile microvasculare 115 Tipul complicaţiei microvasculare. 115 Tipul retinopatiei 117 Stadiul nefropatiei.. 119 6.1.4.5. Ehilibrul metabolic şi polineuropatia diabetică... 120 6.1.4.6. Echilibrul metabolic şi complicaţiile macrovasculare 122 6.1.4.7. Echilibrul metabolic şi asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare... 123 Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare la pacienţii fără PNP... 123 Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare la pacienţii cu PNP... 125 6.1.4.8. Echilibrul metabolic şi numărul complicaţiilor 126 6.1.5. Profilul lipidic... 128 6. 1.6. Evaluarea funcţiei renale.. 131 6.1.6.1. Microalbuminuria şi proteinuria 132 6.1.7. Evaluarea stresului oxidativ 133 6.1.7.1. Stresul oxidativ comparativ diabetici nediabetici.. 133 6.1.7.2. Stresul oxidativ şi tratamentul antidiabetic 136 6.1.7.3. Stresul oxidativ şi controlul metabolic.. 138 6.1.7.4. Stresul oxidativ şi complicaţiile microvasculare 140 Tipul complicaţiei.. 140 Tipul retinopatiei... 142 Stadiul nefropatiei... 145 6.1.7.5. Stresul oxidativ şi PNP diabetică... 148 6.1.7.6. Stresul oxidativ şi complicaţiile macrovasculare.. 150 6.1.7.7. Stresul oxidativ şi asocierea complicaţiilor micro şi macrovasculare... 152 Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare la pacienţii fără PNP. 152 3
Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare la pacienţii cu PNP. 154 6.1.7.8. Stresul oxidativ şi numărul complicaţiilor 156 6.2. Studiul stresului oxidativ şi a complicaţiilor microvasculare pacienţii cu DZ tip 1 versus pacienţi cu DZ tip 2... 159 6.2.1. Structura loturilor 159 Distribuţia cazurilor în funcţie de sex... 159 Distribuţia cazurilor în funcţie de mediu 160 Distribuţia cazurilor în funcţie de vârstă 161 6.2.2. Caracteristicile generale ale lotului... 162 Durata diabetului 162 Controlul metabolic 162 6.2.3. Complicaţiile diabetului... 163 6.2.3.1. Complicaţiile microvasculare 163 Tipul complicaţiilor microvasculare.. 163 Durata diabetului şi tipul complicaţiilor microvasculare... 165 Tipul retinopatiei 166 Stadiul nefropatiei.. 167 6.2.3.2. Polineuropatia diabetică... 168 6.2.3.3. Complicaţiile macrovasculare ale diabetului... 168 6.2.3.4. Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare ale diabetului... 169 6.2.3.5. Numărul complicaţiilor 171 6.2.4. Echilibrului metabolic 172 6.2.5. Profilul lipidic 174 6.2.6. Evaluarea funcţiei renale 177 6.2.6.1. Microalbuminuria şi proteinuria 178 6.2.7. Stresului oxidativ 179 6.2.7.1. Stresul oxidativ comparativ diabetici tip 1 diabetici tip 2. 179 6.2.7.2. Stresul oxidativ şi controlul metabolic. 181 6.2.7.3. Stresul oxidativ şi complicaţiile microvasculare. 183 6.2.7.4. Stresul oxidativ şi complicaţiile macrovasculare. 186 6.2.7.5. Stresul oxidativ şi PNP. 188 6.2.7.6. Stresul oxidativ şi asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare... 190 4
Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare la pacienţii fără PNP... 190 Asocierea complicaţiilor micro- şi macrovasculare la pacienţii cu PNP... 192 6.2.7.7. Stresul oxidativ şi numărul complicaţiilor... 195 6.3. Corelaţii ale stresului oxidativ cu parametrii studiaţi... 197 6.3.1. Corelaţii ale MDA cu parametrii studiaţi... 197 Corelaţii ale MDA cu parametrii echilibrului metabolic... 197 Corelaţii ale MDA cu parametrii profilului lipidic... 198 Corelaţii ale MDA cu alţi parametrii funcţiei renale... 200 Corelaţii ale MDA cu microalbuminuria şi proteinuria... 201 Corelaţii ale MDA cu alţi parametrii ai stresului oxidativ... 202 6.3.2. Corelaţii ale proteinelor carbonilate cu parametrii studiaţi... 204 Corelaţii ale proteinelor carbonilate cu parametrii echilibrului metabolic... 204 Corelaţii ale proteinelor carbonilate cu parametrii profilului lipidic... 205 Corelaţii ale proteinelor carbonilate cu parametrii funcţiei renale... 207 Corelaţii ale proteinelor carbonilate cu microalbuminuria şi proteinuria... 209 6.3.3. Corelaţii ale ceruloplasminei cu parametrii studiaţi... 210 Corelaţii ale ceruloplasminei cu parametrii echilibrului metabolic 210 Corelaţii ale ceruloplasminei cu parametrii profilului lipidic... 211 Corelaţii ale ceruloplasminei cu parametrii funcţiei renale... 213 Corelaţii ale ceruloplasminei cu microalbuminuria şi proteinuria... 214 Corelaţia ceruloplasminei cu proteinele carbonilate... 215 6.3.4. Concluzii... 215 Cap.VII. Concluzii generale... 217 Bibliografie... 222 5
Capitolul I STRESUL OXIDATIV. CADRU ETIOPATOGENIC 1.1. Definiţia stresului oxidativ Stresul oxidativ reprezintă perturbarea homeostaziei redox sau totalitatea deteriorărilor oxidative produse de catre o supraproducţie de specii reactive (SR) ori o diminuare a capacităţii sistemelor antioxidante (AO) la nivelul celulei sau a întregului organism (38, 39). În esenţă se produce o dereglare a balanţei prooxidante /antioxidante în favoarea prooxidanţilor şi în defavoarea antioxidanţilor (Sies 1993). 1.2. Acţiunea stresului oxidativ asupra organismului Radicalii oxizi exercită asupra organismului două categorii de efecte: benefice şi nocive (26,,67, 72, 117): 1. Efecte benefice: bactericid în cadrul fagocitozei, stimularea activităţii limfocitelor, controlul tonusului vascular, stimularea creşterii şi proliferării celulelor, stimularea secreţiei de eritropoetină. 2. Efecte nocive:distrucţia/ deteriorarea structurilor celulare, transformarea malignă celulară, îmbătrânirea celulară. Sub acţiunea stresului oxidativ pot fi proteine, glucide. 1.3. Metode de determinare a radicalilor liberi afectate mai multe structuri: ADN, lipide, Determinarea radicalilor liberi este foarte dificilă datorită faptului că ei se găsesc în concentraţii scazute şi au o durata scurtă de viaţă. (6, 13, 21) Pentru determinare sunt folosite: - metode indirectede dozare: urmăresc efectele radicalilor liberi asupra diferitelor structuri, dozând produşii rezultaţi din degradarea acestor substante: - malondialdehida (MDA) - proteinele carbonilate Capitolul II ACTUALITATI PRIVIND DIABETUL ZAHARAT 2.1. Definiţia diabetului zaharat Diabetul zaharat este un sindrom complex, heterogen, de tulburări care pot avea o etiologie diferită, dar care au în comun hiperglicemia asociată cu modificări lipidice şi proteice majore. Diabetul zaharat nu este o boală în sensul tradiţional al termenului, ci se apropie mai mult de definiţia unui sindrom, ale cărui componente au ca element comun hiperglicemia (73, 115, 117). 6
2.4.1.1. Boala microvasculară diabetică Retinopatia diabetică Definiţie şi incidenţa retinopatiei dibetice: Retinopatia diabetică reprezintă una din cele mai importante complicaţii pe termen lung ale diabetului zaharat. Microangiopatia retiniană constituie una din principalele semne de afectare vasculară şi reprezintă principala cauză de orbire a pacienţilor cu diabet zaharat. Boala renală diabetică Definiţie: Putem defini boala diabetică renală ca fiind o afectare glomerulară progresivă, inflamatorie care evoluează pe fondul unui teren diabetic. In prezent termenul de nefropatie diabetică a fost înlocuit cu cel de boală renală diabetică termen care reflectă mai bine complexitatea modificărilor care apar la nivel renal în cursul bolii. 2.4.2. Fiziopatologia complicaţiilor cronice ale diabetului zaharat Patogenia complicaţiilor cronice ale diabetului zaharat este complexă şi multifactorială. Principala cauză în apariţia lor este considerată hiperglicemia cronică. Aceasta declanşează şi amplifică o serie de mecanisme patogene care vor genera apariţia complicaţiilor cronice ale diabetului zaharat. Mecanismele declanşate de starea de hiperglicemie cronică vor avea răsunet în special la nivel vascular (115). Tulburările metabolice generate de hiperglicemie sunt (16, 20, 28, 34): a. glicozilarea proteinelor b. producţie excesivă de radicali liberi ai oxigenului c. activarea căii poliol Capitolul III IMPLICAREA STRESULUI OXIDATIV IN APARITIA COMPLICATIILOR MICROVASCULARE ALE DZ 3.1. Definiţia stresului oxidativ Noţiunea de stres oxidativ defineşte existenţa unui dezechilibru între producţia de antioxidanţi şi radicalii liberi ai oxigenului, dezechilibru produs fie prin scăderea antioxidanţilor fie prin creşterea radicalilor liberi. (8, 13, 14 ) 3.2. Mecanismele prin care stresul oxidativ generează complicaţiile microvasculare ale diabetului zaharat Există 4 ipoteze prin care hiperglicemia ar putea induce apariţia complicaţiilor diabetului:: creşterea fluxului căii poliol, formarea crescută a produşilor de glicozilare avansată, activarea proteinkinazei, creşterea fluxului căii hexozaminei. 7
3.3. Efectele stresului oxidativ în diabetul zaharat La pacienţii diabetici s-a constatat creşterea peroxidării lipidelor şi scăderea activităţii enzimelor antioxidante eritrocitare. Principalele ţinte ale oxidării sunt proteinele, creşterea conţinutului în carbonil al acestora, prin formarea aldehidelor şi cetonelor este un indicator al stresului oxidativ. Nivelul plasmatic al proteinelor glicozilate neenzimatic este semnificativ crescut la pacienţii diabetici comparativ cu persoanele nondiabetice. Acest fenomen se observă încă din stadiile precoce ale bolii ceea ce înseamnă că modificările structurale ale proteinelor plasmatice datorate radicalilor liberi apar devreme şi vor duce în timp la apariţia complicaţiilor în stadiile tardive ale bolii. Capitolul IV IPOTEZA DE LUCRU. OBIECTIVE 4.1. Ipoteza de lucru Interesul crescând faţă de stresul oxidativ şi de implicarea lui în patologie se justifică prin rolul esenţial pe care îl joacă acesta în aparitia unor leziuni specifice celulare, tisulare sau de organ denumite generic leziuni oxidative. In prezent este cunoscut faptul că la pacienţii diabetici, ca urmare a starilor de hiperglicemie se produce o intensificare a agresiunii oxidative prin autooxidarea glucozei, formarea produşilor avansaţi de glicozilare. Speciile reactive ale oxigenului apărute ca urmare a acestor procese vor determina apariţia disfuncţiilor la nivelul endoteliului şi vor induce o intensificare a proliferării celulelor musculare netede. Totuşi fenomenul este încă incomplet studiat în prezent. Acest neajuns porneşte de la faptul că speciile reactive au o durată scurtă de viaţă şi de aici derivă dificultăţile de dozare a acestori produsi şi dificultatea de a stabilii relaţia dintre acţiunea acestor produşi şi apariţia unor fenomene patologice 4.2. Obiectivele studiului 1. Studiul comparativ între diabetici şi nondiabetici vizând elementele stresului oxidativ în funcţie de structura lotului studiat (repartiţia pe sexe, pe mediu de provenienţă, grupe de vârstă, durata de evoluţie a bolii la pacienţii diabetici, tipul terapiei antidiabetice urmate şi gradul controlului metabolic obţinut în urma tratamentului). 2. Studiul comparativ DZ tip 1- DZ tip 2 vizând elementele stresului oxidativ în funcţie de structura lotului studiat (repartiţia pe sexe, pe mediu de provenienţă, grupe de 8
vârstă, durata de evoluţie a bolii şi tipul terapiei antidiabetice urmate şi controlului metabolic obţinut în urma tratamentului.) gradul 3. Studiul parametrilor stresului oxidativ: ceruloplasmina, malondialdehida şi proteinele carbonilate, a parametrilor glucidici (glicemia bazală, Hb A1c), a parametrilor lipidici (colesterol, trigliceride, HDL-Col, LDL-Col). 4. Studiul corelaţiilor existente între parametrii stresului oxidativ şi parametrii glucidici, lipidici; precum şi între acesta şi prezenţa şi numărul complicaţiilor microvascular Capitolul V MATERIAL ŞI METODĂ 5.1. Material Am inclus în studiu un număr de 200 de pacienţi cu diabet zaharat şi un lot martor format din 90 de pacienţi fără diabet, fără modificări ale toleranţei la glucoză. Persoanelor din lotul martor li s-au efectuat aceleaşi investigaţii ca şi celor din lotul de diabetici. Protocolul de studiu a cuprins pentru lotul pacienţilor cu diabet zaharat următoarele date: vârsta pacienţilor, sex, mediul de provenientă, durata de evoluţie a bolii, tipul terapiei administrate, gradul controlului metabolic, complicatiile diabetului şi asocierile morbide, precum şi parametrii metabolismului glucidic şi lipidic. Parametrii studiaţi: atât la pacienţii diabetici cât şi la lotul martor s-au determinat parametrii stresului oxidativ evalut prin determinarea rezultatului activitatii prooxidative asupra structurilor proteice: proteinele carbonilate, structurilor lipidice: malondialdehida şi a activitatii antioxidante: ceruloplasmina. 5.2. Metode de explorare utilizate în studiu A. Determinarea produşilor oxidaţi Determinarea malondialdehidei Determinarea proteinelor carbonilate B. Determinarea capacităţii antioxidante Dozarea ceruloplasminei Capitolul VI REZULTATE SI DISCUTII 6.1.7. Stresului oxidativ Stresul oxidativ comparativ diabetici nediabetici Studiul pe care l-am efectuat a urmărit să cuantifice intensitatea stresului oxidativ la pacienţii diabetici. Am evaluat activitatea prooxidantă folosindu-mă de dozarea unor produşi rezultaţi din oxidarea lipidelor- malondialdehida, respectiv a proteinelor- proteinele carbonilate. Activitatea antioxidantă am evaluat-o prin dozarea ceruloplasminei un 9
antioxidant neenzimatic. Datele pe care le-am obţinut prin compararea activităţii prooxidante şi respectiv antioxidante a pacienţilor diabetici versus nondiabetici sunt în concordanţă cu datele din literatura de specialitate. Tabel XXXII. Valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ Parametru Diabetici Nediabetici MpDS MpDS MDA (nmol/ml) 3,55±0,39 1,90±0,21 Proteine carbonilate (nmol/mg) 2,13±0,22 1,17±0,15 Ceruloplasmina (mg%) 28,95±3,21 34,70±3,85 Între diabetici şi nediabetici există diferenţe semnificative în ceea ce priveşte valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ (MDA, ceruloplasmina şi proteinele carbonilate). Astfel, valorile MDA şi a proteinelor carbonilate sunt semnificativ mai mari la diabetici faţă de nediabetici (p<0,001), iar ale ceruloplasminei sunt semnificativ mai mici (p=0,024). 5,00 4,00 MDA (nmol/ml) 3,00 2,00 3,55 p<0,001 1,90 1,00 0,00 Diabetici Nediabetici Grafic nr.51. Valorile medii ale MDA 3,00 2,50 Proteine carbonilate (nmol/mg) 2,00 1,50 1,00 2,13 p<0,001 1,17 0,50 0,00 Diabetici Nediabetici Grafic nr.52. Valorile medii ale proteinelor carbonilate 10
50,00 40,00 Ceruloplasmina (mg%) 30,00 20,00 28,95 p=0,024 34,70 10,00 0,00 Diabetici Nediabetici Grafic nr.53. Valorile medii ale ceruloplasminei Datele obţinute relevă o intensificare a activităţii speciilor reactive cu generarea în cantităţi crescute a produşilor rezultaţi din agresiunea asupra structurilor proteice şi a structurilor lipidice şi o activitate redusă a activităţii antioxidante. Cercetările recente au acordat o atenţie deosebită problemelor legate de stresul oxidativ şi de implicarea lui în apariţia şi evoluţia diabetului zaharat. Stresul oxidativ, prin producerea de specii reactive ale oxigenului (SRO) este considerat un factor care stă la baza dezvoltării rezistenţei la insulină şi disfuncţiei celulelor β. Prin aceste mecanisme stresul oxidativ este implicat în apariţia alterărilor toleranţei la glucoză şi în apariţia diabetului zaharat. Speciile reactive ale complicaţiilor diabetului. Stresul oxidativ şi controlul metabolic oxigenului sunt de asemenea implicate în progresia Tabel XXXIV. Valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ în funcţie de controlul metabolic Parametru Control metabolic Control metabolic Control metabolic bun mediu slab MDA(nmol/ml) 3,11±0,37 3,66±0,44 4,39±0,53 Prot.carbonilate nmol/mg) 1,82±0,22 2,15±0,24 2,72±0,28 Ceruloplasmina (mg%) 30,38±3,62 28,89±3,44 25,34±3,06 Valorile medii ale MDA sunt mai mari cu cât controlul metabolic este mai slab. Astfel, dacă la pacienţii cu un control metabolic bun valoarea medie a MDA este 3,11 nmol/mg, la cei cu control mediu este 3,66 nmol/ml (p=0,021), iar la cei cu control slab este semnificativ mai mare (4,39 nmol/ml) (p<0,001). Ca şi în cazul MDA, valorile medii ale proteinelor carbonilate sunt cu atât mai mari cu cât controlul metabolic este mai slab. Astfel, dacă la pacienţii cu un control metabolic bun 11
valoarea medie a proteinelor carbonilate este 1,82 nmol/mg, la cei cu control mediu este de 2,15 nmol/mg (p=0,042), iar la cei cu control slab este semnificativ mai mare (2,72 nmol/mg) (p<0,001). 5,50 MDA (nmol/ml) 4,50 3,50 3,11 3,66 4,39 2,50 1,50 Bun Mediu Slab Grafic nr.57. Valorile medii ale MDA în funcţie de controlul metabolic 3,50 3,00 Proteine carbonilate (nmol/mg) 2,50 2,00 1,50 1,82 2,15 2,72 1,00 0,50 Bun Mediu Slab Grafic nr.58. Valorile medii ale proteinelor carbonilate în funcţie de controlul metabolic 40,00 35,00 Ceruloplasmina (mg%) 30,00 25,00 30,38 28,89 25,34 20,00 15,00 Bun Mediu Slab Grafic nr.59. Valorile medii ale ceruloplasminei în funcţie de controlul metabolic 12
Valorile medii ale ceruloplasminei sunt cu atât mai mici cu cât controlul metabolic este mai slab. La pacienţii cu control metabolic slab ceruloplasmina este semnificativ mai mică decât la cei cu control metabolic mediu (p=0,02) sau bun (p<0,001). Cercetările au dovedit că există o creştere a radicalilor liberi în condiţii de hiperglicemie, nivelul acestora ajungând la valori foarte mari în situaţia unor dezechilibre glicemice marcate. Au existat totuşi şi studii care nu au putut evidenţia această corelaţie. Astfel că, noi cercetări sunt încă necesare pentru a demonstra fără dubii dacă stresul oxidativ la pacienţii diabetici este condiţionat de prezenţa complicaţiilor şi dacă constituie un mecanism patogenic de sine stătător sau doar o verigă de legătură între hiperglicemie şi diverse consecinţe patogenice ale acesteia (22, 79). Stresul oxidativ şi complicaţiile microvasculare Tabel LXIII. Valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ în funcţie de complicaţiile microvasculare Parametru Retinopatie Nefropatie Retinopatie + nefropatie DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 MDA (nmol/ml) 3,340,42 3,050,38 4,270,47 3,640,40 4,980,55 3,910,42 Prot.carbonilate 2,290,25 1,950,21 2,450,25 2,060,22 2,810,27 2,370,22 (nmol/mg) Ceruloplasmina (mg%) 25,273,01 28,472,94 24,332,68 27,633,14 23,282,97 27,043,09 La pacienţii cu retinopatie MDA este semnificativ mai mare la diabeticii tip 1 faţă de tip 2 (3,34 faţă de 3,05 nmol/mg) (p=0,014), la cei cu nefropatie de 4,27 faţă de 3,64 nmol/ml (p<0,001), iar la ce cu la care retinopatia este asociată cu nefropatie valorile 4,98 faţă de 3,91 nmol/mg (p<0,001). Atât la diabeticii tip 1 cât şi la cei tip 2 cele mai mici valori ale MDA se înregistrează în cazul pacienţilor cu retinopatie, iar cele mai mari la cei retinopatie asociată cu nefropatie. 7,00 6,00 Retinopatie Nefropatie Retinopatie + Nefropatie MDA (nmol/ml) 5,00 4,00 3,00 3,34 p=0,014 3,05 4,27 p<0,001 3,64 4,98 p<0,001 3,91 2,00 1,00 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 Grafic nr.113. Valorile medii ale MDA în funcţie de tipul complicaţiei microvasculare 13
În ceea ce priveşte proteinele carbonilate, indiferent de tipul complicaţiilor microvasculare, valorile sunt semnificativ mai mari la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2 (p<0,001). Cele mai ridicate valori se întâlnesc la pacienţii cu retinopatie asociată cu nefropatie, indiferent de tipul diabetului. Proteine carbonilate (nmol/mg) 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 2,29 Retinopatie Nefropatie Retinopatie + Nefropatie p<0,001 1,95 2,45 p<0,001 2,06 2,81 p<0,001 2,37 1,00 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 Grafic nr.114. Valorile medii ale proteinelor carbonilate în funcţie de tipul complicaţiei microvasculare Cele mai mari valori ale ceruloplasminei se înregistrează la diabeticii cu retinopatie, indiferent de tipul diabetului, iar cele mai mici la la cei cu retinopatie asociată cu nefropatie. Indiferent de tipul complicaţiei microvasculare valorile ceruloplasminei sunt semnificativ mai mici la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2 (25,27 versus 28,47 mg% la retinopatie, 24,33 versus 27,63 mg% la nefropatie şi 23,28 versus 27,04 mg% la retinopatie asociată cu nefropatie) (p=0,011, p<0,001, respectiv p<0,001). 35,00 Retinopatie Nefropatie Retinopatie + Nefropatie Ceruloplasmina (mg%) 30,00 25,00 25,27 p=0,011 28,47 p<0,001 24,33 27,63 23,28 p<0,001 27,04 20,00 15,00 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 Grafic nr.115. Valorile medii ale ceruloplasminei în funcţie de tipul complicaţiei microvascular 14
6.2.7.7. Stresul oxidativ şi numărul complicaţiilor Tabel LXVIII. Valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ în funcţie de n complicaţiilor Parametru Fără complicaţii 1 complicaţie 2 complicaţii DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 MDA 3,780,39 3,010,36 4,020,41 3,280,36 4,280,44 3,410,40 (nmol/ml) Prot.carbonilate (nmol/mg 2,120,22 1,550,20 2,370,23 1,980,21 2,370,23 2,090,22 Ceruloplasmina (mg%) 26,982,68 32,253,36 25,642,64 30,003,32 25,802,66 28,893,18 Parametru 3 complicaţii > 4 complicaţii DZ tip 1 DZ tip 2 DZ tip 1 DZ tip 2 MDA (nmol/m) 4,550,47 3,530,39 5,130,52 3,690,41 Prot.carbonilate 2,540,24 2,140,22 2,790,25 2,270,22 (nmol/mg Ceruloplasmina (mg%) 25,012,84 28,503,21 24,132,59 27,553,08 Valorile MDA sunt cu atât mai mari cu cât numărul complicaţiilor este mai mare, indiferent de tipul diabetului, semnificativ mai mari la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2. Proteinele carbonilate înregistrează valori semnificativ mai mici la pacienţii fără complicaţii faţă de cei cu complicaţii (p<0,001), indiferent de tipul diabetului, iar la pacienţii cu DZ tip 1 sunt semnificativ mai mari decât la diabeticii tip 2. Valorile ceruloplasminei sunt cu atât mai mici cu cât numărul complicaţiilor este mai mare, indiferent de tipul diabetului, semnificativ mai mici la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2. 6,50 MDA (nmol/ml) 5,50 4,50 3,50 DZ tip 1 3,78 3,01 4,02 3,28 4,28 3,41 4,55 3,53 DZ tip 2 5,13 3,69 2,50 1,50 Fara complic. 1 2 3 >4 Grafic nr.128. Valorile medii ale MDA în funcţie de numărul complicaţiilor 15
3,50 Proteine carbonilate (nmol/mg) 3,00 2,50 2,00 1,50 DZ tip 1 2,12 1,55 2,37 2,37 2,09 1,98 2,54 2,14 DZ tip 2 2,79 2,27 1,00 0,50 Fara complic. 1 2 3 >4 Grafic nr.129.valorile medii ale proteinelor carbonilate în funcţie de numărul complicaţiilor 40,00 Ceruloplasmina (mg%) 35,00 30,00 25,00 32,25 26,98 DZ tip 1 DZ tip 2 30,00 28,89 25,64 25,80 28,50 25,01 27,55 24,13 20,00 15,00 Fara complic. 1 2 3 >4 Grafic nr.130. Valorile medii ale ceruloplasminei în funcţie de numărul complicaţiilor 6.3. Corelaţii ale stresului oxidativ cu parametrii studiaţi Corelaţii ale MDA cu alţi parametrii ai stresului oxidativ La pacienţii diabetici creşterea activităţii prooxidante s-a dovedit a fi asociată cu o reducere a capacităţii antioxidante care ar trebui să protejeze structurile celulare de injuriile exercitate de radicalii liberi. 16
40 Ceruloplasmina (mg%) 35 30 25 20 r=-0,54, p<0,001 y=31,51x-0,13 15 2,1 5,3 MDA (nmol/ml) Grafic nr.141. Corelaţia MDA ceruloplasmină Ceruloplasmina se corelează negativ cu MDA, adică cu cât valorile MDA sunt mai mari, cu atât valorile ceruloplasminei sunt mai mici. Această corelaţie derivă din faptul că MDA reprezintă un produs de oxidare pe când ceruloplasmina este o structură cu rol antioxidant. 3 Proteine carbonilate (nmol/mg) 2,5 2 1,5 1 r=0,46, p=0.01 y=1,70x+0,09 0,5 2,1 5,3 MDA (nmol/ml) Grafic nr.142. Corelaţia MDA proteine carbonilate S-a determinat o corelaţie directe între MDA şi proteinele carbonilate (r=0,46), ambele fiind produşi de degradare oxidativă: a structurilor lipidice şi respectiv proteice. Analizând corelaţiile dintre valorile malondialdehidei şi alţi parametrii studiaţi s-a constatat că cele mai puternice corelaţii s-au determinat între MDA şi controlul metabolic (glicemia à jeun şi HbA1c: r=0,69, respectiv r=0,73), urmate de ceruloplamină (r=-0,54), LDL-colesterol (r=0,49) şi trigliceride (r=0,48). 17
Capitolul VII CONCLUZII GENERALE 1. Stresul oxidativ reprezintă o alterare a balaţei între agenţii oxidanti şi cei antioxidanţi. O înclinare a balanţei înspre agenţii prooxidanţi va declanşa o serie de reacţii care vor genera injurii la nivelul structurilor micro şi macrovasculare. 2. Complicatiile microvasculare cele mai importante sunt: retinopatia diabetică şi boala renală diabetică. Există autori care includ în aceste complicaţii şi neuropatia diabetică datorită faptului că principalul mecanism al apariţiei acestei complicaţii este afectarea vasa nervorum. 3. Pacienţii diabetici prezintă hiperglicemie cronică, ceea ce va genera o agresiune oxidativă. Prin autooxidarea glucozei se vor forma produşi de glicozilare avansată. In urma acestor agresiuni oxidative se produc radicali liberi care vor iniţia mecanisme fiziopatologice ce vor genera disfuncţii endoteliale, modificări importante care sunt implicate în apariţia complicaţiilor microvasculare ale diabetului zaharat. 4. Mecanismele prin care stresul oxidativ intervine în apariţia leziunilor vasculare la pacienţii diabetici sunt: intensificare oxidării LDL, disfuncţia endotelială, inflamaţia vasculară, activarea proceselor de tromboză. 5. Reducerea activităţii sistemelor antioxidante este consecinta mai multor mecanisme:scăderea concentraţiei de glutation, scăderea activităţii superoxiddismutazei (SOD), deficitul de detoxifiere a componentelor stresului carbonil, modificarea producerii de NO şi a acţiunii sale 6. Metodele indirecte de determinare a actiunii radicalilor liberi asupra diferitelor structuri sunt reprezentate de dozarea: malondialdehidei (MDA), a produşilor de peroxidare lipidica, a proteinelor carbonilate. 7. Capacitatea antioxidanta a organismului poate fi apreciata prin dozarea substantelor antioxidante de tipul: ceruloplasminei. 8. Actiunea agentilor oxidanti la nivel tisular şi celular va determina declansarea unor procese fiziopatologice care stau la baza aparitiei leziunilor microvasculare. 9. Loturile studiate au inclus un număr de 200 pacienţi diabetici (179 cu DZ tip 2 şi 21 cu DZ tip 1) şi 90 pacienţi fără DZ şi fără modificarea toleranţei la glucoză. Pentru toţi pacienţii s-au urmărit parametrii stresului oxidativ (MDA, proteinele carbonilate şi ceruloplasmina). Pentru pacienţii diabetici a fost studiată prezenţa complicaţiilor cronice ale DZ şi corelaţia cu elementele stresului oxidativ. 18
10. Între diabetici şi nediabetici există diferenţe semnificative în ceea ce priveşte valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ (MDA, ceruloplasmina şi proteinele carbonilate). Astfel, valorile MDA şi a proteinelor carbonilate sunt semnificativ mai mari la diabetici faţă de nediabetici (p<0,001), iar a ceruloplasminei sunt semnificativ mai mici (p=0,024). 11. Intre tipul de terapie antidiabetică şi intensitatea stresului oxidativ se constată existenţa unei corelaţii chiar dacă aceasta nu este semnificativă statistic. Astfel pacienţii care urmau terapie doar cu dietă sau antidiabetice orale au prezentat valori mai mari ale MDA şi proteinelor carbonilate şi valori scăzute ale ceruloplasminei comparativ cu cei insulinotrataţi. 12. Pacienţii diabetici care au avut un control metabolic bun au prezentat o activitate prooxidantă mai redusă şi o activitante antioxidantă mai accentuată comparativ cu cei care erau dezechilibraţi metabolic. Analiza statistică a susţinut faptul că există o corelaţie puternică între controlul metabolismului glucidic şi intensitatea stresului oxidativ. 13. Pacienţii diabetici care prezentau complicaţii microvasculare de tip: retinopatie şi nefropatie diabetică au prezentat o activitata prooxidantă intensă comparativ cu pacienţii diabetici care nu prezentau aceste complicaţii. 14. Stresul oxidativ va creşte progresiv pe măsură ce boala renală avansează, accentuându-se când apare insuficienţa renală cronică datorită dezechilibrării balanţei dintre rata de generare a oxidanţilor şi capacitatea de neutralizare a acestora 15. Pacienţii diabetici cu polineuropatie diabetică au avut valori mai mari ale MDA şi ale proteinelor carbonilate şi valori scăzute ale ceruloplasminei comparativ cu pacienţii fără polineuropatie diabetică. 16. Aceeaşi corelaţie statistică pozitivă ca şi cazul complicaţiilor microvasculare se constată şi între intensitatea stresului oxidativ şi prezenţa complicaţiilor macrovasculare la pacienţii diabetici. 17. Între diabeticii tip 1 şi cei de tip 2 există diferenţe semnificative în ceea ce priveşte valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ (MDA, ceruloplasmina şi proteinele carbonilate) (p=0,026, p=0,032, respectiv p<0,001). 18. Valorile medii ale MDA sunt mai mari cu cât controlul metabolic este mai slab, indiferent de tipul diabetului zaharat. Indiferent de controlul metabolic valorile MDA sunt semnificatic mai mari la diabeticii tip 1 faţă de cei tip 2. 19
19. Ca şi în cazul MDA, valorile medii ale proteinelor carbonilate sunt mai mari cu cât controlul metabolic este mai slab, indiferent de tipul diabetului şi semnificativ mai mari la diabeticii tip1 faţă de cei tip 2. 20. Valorile medii ale ceruloplasminei sunt cu atât mai mici cu cât controlul metabolic este mai slab, indiferent de tipul diabetului şi indiferent de controlul metabolic valorile ceruloplasminei sunt semnificativ mai mici la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2. 21. La pacienţii cu retinopatie MDA este semnificativ mai mare la diabeticii tip 1 faţă de tip 2 (3,34 faţă de 3,05 nmol/mg) (p=0,014), la cei cu nefropatie de 4,27 faţă de 3,64 nmol/mg (p<0,001), iar la cei la care retinopatia este asociată cu nefropatie valorile sunt de 4,98 faţă de 3,91 nmol/mg (p<0,001). 22. Atât la diabeticii tip 1 cât şi la cei tip 2 cele mai mici valori ale MDA se înregistrează în cazul pacienţilor cu retinopatie, iar cele mai mari la cei retinopatie asociată cu nefropatie. 23. În ceea ce priveşte proteinele carbonilate, indiferent de tipul complicaţiilor microvasculare, valorile sunt semnificativ mai mari la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2 (p<0,001). Cele mai ridicate valori se întâlnesc la pacienţii cu retinopatie asociată cu nefropatie, indiferent de tipul diabetului. 24. Indiferent de tipul complicaţiei microvasculare valorile ceruloplasminei sunt semnificativ mai mici la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2 (25,27 versus 28,47 mg% la retinopatie, 24,33 versus 27,63 mg% la nefropatie şi 23,28 versus 27,04 mg% la retinopatie asociată cu nefropatie) (p=0,011, p<0,001, respectiv p<0,001). 25. Între diabeticii tip 1 şi tip 2 cu PNP există diferenţe semnificative în ceea ce priveşte valorile medii ale parametrilor stresului oxidativ (MDA, ceruloplasmina şi proteinele carbonilate). Astfel, valorile MDA şi a proteinelor carbonilate sunt semnificativ mai mari la diabeticii tip 1 faţă de diabeticii tip 2 (p<0,001, respectiv p=0,026), iar a ceruloplasminei sunt semnificativ mai mici (p=0,040). 26. Valorile MDA şi ale proteinelor carbonilate sunt cu atât mai mari cu cât numărul complicaţiilor diabetice este mai mare. Valorile ceruloplasminei sunt cu atât mai mici cu cât numărul complicaţiilor diabetice este mai mare. Aceste observaţii au fost valabile atât pentru DZ tip 1 cât şi pentru DZ tip 2. 27. Cercetările efectuate au evidenţiat şi existenţa unor corelaţii intre parametrii metabolismului lipidic şi intensitatea stresului oxidativ. S-a constatat o corelaţie liniară între valorile MDA şi proteinelor carbonilate şi valorile colesterolului, trigliceridelor, LDL Col şi o corelaţie inversă cu HDL Col. 20
28. S- a evidenţiat o corelaţie negativă între ceruplasmină şi trigliceride (r=-0,37), cu cât intensitatea proceselor antioxidante este mai mică cu atât valorile trigliceridelor serice au fost mai crescute. 29. Implicarea stresului oxidativ în apariţia complicaţiilor microvasculare ale DZ sugerează că intervenţia terapeutică asupra acestor mecanisme fiziopatologice fie în sensul reducerii speciilor reactive fie a creşterii sistemelor antioxidante va avea ca efect o intârziere a aparitiei şi o limitare a evoluţiei acestor complicatii. Bibliografie 1. The American Association of Clinical Endocrinologists: Medical guidelines for the management of diabetes mellitus: the AACE system of intensive diabetes selfmanagement 2002 update. Endocrine Practice. 2002;8(Suppl. 1):S40 S82. 2. Burtă L., Burtă O., Micle L, Micle O., Muresan M., Muresan I, Dorofteiu M.: Stresul oxidativ în bolile medico- chirurgicale, 2003 Ed Univ Oradea, pg 5-33. 3. Ceriello A, Motz E: Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance, diabetes, and cardiovascular disease? Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 2004;24: pg 816 823. 4. Cheta D: Preventing diabetes mellitus. Ed Wiley, Chichester, 1999, pg 25-58. 5. Halliwell B, Gutteridge JMC: Free redicals in biology and medicine. 3 rd, Ed Oxford University Press 2000, pg 22-38. 6. Harrison D, Griendling KK, Landmesser U, Hornig B, Drexler H. :Role of oxidative stress in atherosclerosis. American Journal af Cardiology, 2003,91; 7A-11A. 7. N Hancu, I A Veresiu: Diabetul zaharat nutritia si bolile metabolice. Ed National 1999 pg 211-304. 8. Ionescu Targoviste Constantin- Tratat de diabet Paulescu, Ed Academiei Române, Bucuresti 2004, pg 243-244, 755-777, 895-1067. 9. Mogensen CE, Keane WF, Bennet PH, Jerums G, Parving HH Passa P.: Prevención de la nefropatía diabética con especial referencia a la microalbuminuria. Lancet (ed. Esp.) 1996, pg 201-206. 10. Moncada S. : The vascular endotelium. Ed Springer 2006, pg 222-228 11. Mota Maria : Microangiopatia diabetica-ed Didactica şi Pedagogica, Bucuresti 2003, pg33-79, 91-96, 149-174. 12. Motocu M. : Endoteliul vascular în diabetul zaharat. Microangiopatia diabetică- Practica Med Interna, 1992, nr 3, pg 25-28. 13. Nadler JL- : Oxidative stress, inflammation and diabetic complications Diabetes mellitus. Diabetes 2001 ; 38,pg 1008-1016. 14. Serafinceanu C.: Boala renala diabetica, Editura Morosan 2002 pg 35-39, 64-73. 15. Soares R, Costa C: Oxidative stress, Inflammations and angigenesis in the methabolic syndrome. Ed Springer 2007, pg 125-136. 21
22