In vitro ανοσοδιάγνωση ασθενειών Εργαστήριο Ανοσοπεπτιδικής Χηµείας ΕΚΕΦΕ «ηµόκριτος» ρ. Κουτραφούρη Βασιλική, ρ. Λιβανίου Ευαγγελία
ιάγνωση ασθενειών 1. Κλινική Εξέταση 2. Γενικές και Ειδικές Εξετάσεις Σκοπός: έγκαιρη και αξιόπιστη διάγνωση για την καλύτερη αντιµετώπιση του ασθενούς
Ανοσοαναλύσεις 1. Απλές και γρήγορες διαδικασίες µε υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση, για την ταυτόχρονη ανάλυση µεγάλου αριθµού δειγµάτων 2. Έχουν βρει εφαρµογή: α. Κλινική έρευνα (κατανόηση του φυσιολογικού και του παθολογικού ρόλου βιολογικά δραστικών ουσιών, κατανόηση ασθενειών, ανάπτυξη νέων διαγνωστικών εργαλείων) β. Φαρµακευτική Βιοµηχανία (ανακάλυψη και ανάπτυξη φαρµάκων, µελέτες µεταβολισµού και τοξικολογικές µελέτες αυτών) γ. ιάγνωση ασθενειών
Ανοσοαναλύσεις Αρχή λειτουργίας: Βασίζονται στην χρήση αντισωµάτων, τα οποία: α. Είναι γλυκοπρωτεΐνες β. Παράγονται από τα Β-λεµφοκύτταρα γ. Αποτελούνται από δύο ελαφριές και από δύο βαριές πολυπεπτιδικές αλυσίδες δ. Επιδεικνύουν σηµαντική ποικιλοµορφία στις περιοχές πρόσδεσης του αντιγόνου ε. Εµφανίζουν υψηλή ειδικότητα προς το µόριο σύνδεσης και συνδέονται µε αυτό µε υψηλή συγγένεια
Ανοσοαναλύσεις a. Ετερογενείς ανοσοαναλύσεις β. Οµογενείς ανοσοαναλύσεις Ανάλογα µε τηναρχήτηςµεθόδου α. Μη Ανταγωνιστικές β. Ανταγωνιστικές Ανάλογα µε τηναρχήτηςµεθόδου α. Ραδιοανοσοαναλύσεις β. Ενζυµοανοσοαναλύσεις γ. Ανοσοαναλύσεις χηµειοφωταύγειας Ανάλογα µε τον ιχνηθέτη
Ανοσοαναλύσεις a. Ετερογενείς ανοσοαναλύσεις: β. Οµογενείς ανοσοαναλύσεις α. Μη Ανταγωνιστικές β. Ανταγωνιστικές Πραγµατοποιείται διαχωρισµός των ανοσοσυµπλεγµάτων από τις ελεύθερες µορφές του αντιγόνου ή του αντισώµατος α. Ραδιοανοσοαναλύσεις β. Ενζυµοανοσοαναλύσεις γ. Ανοσοαναλύσεις χηµειοφωταύγειας
Ανοσοαναλύσεις a. Ετερογενείς ανοσοαναλύσεις β. Οµογενείς ανοσοαναλύσεις: εν πραγµατοποιείται διαχωρισµός των ανοσοσυµπλεγµάτων από τις ελεύθερες µορφές του α. Μη Ανταγωνιστικές αντιγόνου ή του β. Ανταγωνιστικές αντισώµατος α. Ραδιοανοσοαναλύσεις β. Ενζυµοανοσοαναλύσεις γ. Ανοσοαναλύσεις χηµειοφωταύγειας
Ανοσοαναλύσεις a. Ετερογενείς ανοσοαναλύσεις β. Οµογενείς ανοσοαναλύσεις α. Μη Ανταγωνιστικές: β. Ανταγωνιστικές Ανταγωνισµός µη ιχνηθετηµένου αντιγόνου για την κατάληψη ορισµένου αριθµού µορίων του ειδικού αντισώµατος α. Ραδιοανοσοαναλύσεις β. Ενζυµοανοσοαναλύσεις γ. Ανοσοαναλύσεις χηµειοφωταύγειας
Ανοσοαναλύσεις a. Ετερογενείς ανοσοαναλύσεις β. Οµογενείς ανοσοαναλύσεις α. Μη Ανταγωνιστικές β. Ανταγωνιστικές Ανταγωνισµός ιχνηθετηµένου αντιγόνου για την κατάληψη ορισµένου αριθµού µορίων του ειδικού αντισώµατος α. Ραδιοανοσοαναλύσεις β. Ενζυµοανοσοαναλύσεις γ. Ανοσοαναλύσεις χηµειοφωταύγειας
Ανοσοαναλύσεις a. Ετερογενείς ανοσοαναλύσεις β. Οµογενείς ανοσοαναλύσεις α. Μη Ανταγωνιστικές β. Ανταγωνιστικές α. Ραδιοανοσοαναλύσεις: β. Ενζυµοανοσοαναλύσεις: γ. Ανοσοαναλύσεις χηµειοφωταύγειας: Ραδιοϊσότοπο Ένζυµο Χηµειοφωταυγή ένωση
Ετερογενής Μη Ανταγωνιστική Ανοσοανάλυση α. Επισηµασµένο 1ο αντίσωµα β. Επισηµασµένο 2ο αντίσωµα Χρήση δύο ειδικών πρώτων αντισωµάτων για την ανάλυση του αντιγόνου και σχηµατισµός sandwich
Ετερογενής Μη Ανταγωνιστική Ανοσοανάλυση Πρότυπη καµπύλη Πρότυπη καµπύλη µη ανταγωνιστικής ανοσοανάλυσης 0,7 Οπτική Απορρόφηση 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 ποσότητα αντιγόνου Η οπτική απορρόφηση που παίρνουµε είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου στο προς ανάλυση δείγµα
Ετερογενής Ανταγωνιστική Ανοσοανάλυση 1. + Αντίσωµα ακινητοποιηµένο σε στερεά φάση
Ετερογενής Ανταγωνιστική Ανοσοανάλυση 2α. + 2β. +
Ετερογενής Ανταγωνιστική Ανοσοανάλυση 2α. + Αντιγόνο ακινητοποιηµένο σε στερεά φάση µε επισηµασµένο 1ο αντίσωµα 2β. +
Ετερογενής Ανταγωνιστική Ανοσοανάλυση 2α. + Αντιγόνο ακινητοποιηµένο σε στερεά φάση µε επισηµασµένο 1ο αντίσωµα 2β. + + Αντιγόνο ακινητοποιηµένο σε στερεά φάση µε επισηµασµένο 2ο αντίσωµα
Ετερογενής Ανταγωνιστική Ανοσοανάλυση Πρότυπη καµπύλη Πρότυπη καµπύλη ανταγωνιστικής ανοσοανάλυσης 0,7 Οπτική Απορρόφηση 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 ποσότητα αντιγόνου Η οπτική απορρόφηση που παίρνουµε είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου στο προς ανάλυση δείγµα
Ανοσοαναλύσεις 1. Υψηλή εκλεκτικότητα στην αλληλεπίδραση αντισώµατος - αναλύτη 2. Μεγάλη ποικιλία αντισωµάτων που µπορούν να παραχθούν µε µεθόδους βιοτεχνολογίας 3. Μεγάλος αριθµός εύκολα ανιχνεύσιµων ιχνηθετών 1. Προσδιορίζεται µεγάλος αριθµός αναλυτών 2. Χαµηλά όρια ανίχνευσης 3. Σχετικά χαµηλό κόστος
Παθήσεις και είκτες στη ιάγvωση και στον Προσδιορισµό των Οποίων Βρίσκουν Εφαρµογή οι Ανοσοαναλύσεις
1. Θυρεοειδής Κλινικές ιαταραχές: Υποθυρεοειδισµός Υπερθυρεοειδισµός Μη τοξική βρογχοκήλη Σύνδροµο «νοσούντος» ευθυρεοειδισµού Θεραπεία υποκατάστασης της L-θυροξίνης Ενδογενή αντισώµατα για τις Τ3 και Τ4 Οικογενής δισαλβουµιναιµική υπερθυροξιναιµία Αναλύτες: Θυρεοειδοτρόπος ορµόνη Θυροξίνη Πρόσληψη της Τ3 και της Τ και υπλογισµός του δείκτης της ελεύθερης θυροξίνης Ελεύθερη Τ4 Τριιωδοθυρονίνη Ελεύθερη Τ3 Σφαιρίνη δέσµευσης της θυροξίνης Αντισώµατα του υποδοχέα της θυρεοειδοτρόπου ορµόνης Αντισώµατος της υπεροξειδάσης του θυρεοειδούς Αντισώµατα θυρεοσφαιρίνης Θυρεοσφαιρίνη
2. Φλοιός Επινεφριδίων Κλινικές ιαταραχές: Υπερκορτιζολαιµία Υποκορτιζολαιµία Αναλύτες: Κορτιζόνη Αδρενοκορτικοτρόπος ορµόνη 3. In Vitro γονιµοποίηση και µεταφορά εµβρύου Κλινικές ιαταραχές: 4 στάδια της In Vitro γονιµοποίησης Αναλύτες: Οιστραδιόλη
4. Μεταβολισµός οστών Κλινικές ιαταραχές: Υπερασβεστιαιµία ιαταραχές του παραθυρεοειδούς αδένα Υποασβεστιαιµία ιαταραχές της Βιταµίνης D Μυελώδες καρκίνωµα του θυρεοειδούς Νόσος του Paget Οστεοπόρωση Αναλύτες: Μεταβολίτες της βιταµίνης D(25-υδροξυβιταµίνη D, 1,25- διυδροξυβιταµίνη D) Παραθυρεοειδική ορµόνη Πρωτεΐνη που σχετίζεται µε την παραθυρεοειδική ορµόνη Καλσιτονίνη
5. Στειρότητα Κλινικές ιαταραχές: Πρωτοπαθής υπογοναδισµός στη γυναίκα ευτεροπαθής υπογοναδισµός στη γυναίκα Στειρότητα και φυσιολογική έµµηνος λειτουργία Πρωτοπαθής υπογοναδισµός στον άντρα ευτεροπαθής υπογοναδισµός στον άντρα Εξασθενισµένη µεταφορά και βιωσιµότητα του σπέρµατος Αναλύτες: Ωχρινοποιητική ορµόνη (LH) Θυλακιοτρόπος ορµόνη (FSH) Προλακτίνη Οστραδιόλη Ανασταλτίνη Προγεστερόνη Τεστοστερόνη ιυδροτεστοστερόνη
6. ασυτριχισµός και ανδρογενετισµός στις γυναίκες Κλινικές ιαταραχές: Σύνδροµο πολυκυστικής ωοθήκης Ιδιοπαθής δασυτριχισµός Όγκοι της ωοθήκης που εκκρίνουν ανδρογόνα Συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων Σύνδροµο Cushing Αναλύτες: Ωχρινοποιητική ορµόνη (LH) και Θυλακιοτρόπος ορµόνη (FSH Τεστοστερόνη Σφαιρίνη που δεσµεύει την φυλετική ορµόνη Ελεύθερη τεστοστερόνη Ανδροστενεδιόνη Θειική δευδροεπιανδροστερόνη 17α-υδροξυπρογεστερόνη ιυδροτεστοστερόνη Ανδροστανεδιόλες και τα γλυκουρονίδιά τους
7. Εγκυµοσύνη Κλινικές ιαταραχές: Ανίχνευση πρώιµης εγκυµοσύνης Κίνδυνος αποβολής Έκτοπη εγκυµοσύνη Χρωµοσωµικές ανωµαλίες στο έµβρυο Ατέλειες στο νευρικό σωλήνα στο έµβρυο Πρόωρος τοκετός Ανεπάρκεια πλακούντα Προ-εκλαµψία ιάφορες διαταραχές Έλεγχος για σύνδροµο Down Αναλύτες: α-εµβρυική πρωτεΐνη Ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη Πρωτεΐνη Α του πλάσµατος που σχετίζεται µε τηνεγκυµοσύνη Οιστραδιόλη Άλλοι αναλύτες
8. Ανεπάρκεια ανάπτυξης και αυξητικής ορµόνης Κλινικές ιαταραχές: Έλλειψη ή ανεπάρκεια της αυξητικής ορµόνης Ανθεκτικότητα στην αυξητική ορµόνη Περίσσεια έκκρισης αυξητικής ορµόνης Αναλύτες: Αυξητική ορµόνη Πρωτεΐνη δέσµευσηςτηςαυξητικήςορµόνης Παράγοντες οµοιάζοντες της ινσουλίνης (IGF-I & IGF-II) Πρωτεΐνες δέσµευσης των IGF-I & IGF-II 9. Σακχαρώδης ιαβήτης Αναλύτες: Ινσουλίνη, προϊνσουλίνη και C-πεπτίδιο Γλυκοαιµοσφαιρίνη (GHb) Άλλες γλυκοζυλιωµένες πρωτεΐνες Μικροαλβουµίνη
10. Αιµατολογία Κλινικές ιαταραχές: Αναιµία Περίσσεια σιδήρου και αιµοχρωµάτωση Λευχαιµία και λέµφωµα ιαταραχές αιµόστασης Αναλύτες: Βιταµίνη Β12 και φολλικό οξύ Αντίσωµα ενδογενούς παράγοντα Φερριτίνη Τρανσφερρίνη Υποδοχείς τρανσφερρίνης Ερυθροποιητίνη Έλεγχοι για την πήξη των αιµοπεταλίων: β-θροµβοσφαιρίνη Παράγοντες πήξης Ινοδογόνο Πρωτεΐνες C και S Θροµβοξάνη Β4 Πλασµινογόνο Κλπ.
11. Καρδιακοί δείκτες Κλινικές ιαταραχές: Στεφανιαία νόσος Καρδιακή ανεπάρκεια Υπέρταση Αναλύτες: Κινάση κρεατινίνης & το ΜΒ ισοένζυµο Μυοσφαιρίνη Καρδιακή τροπονίνη (Τ & Ι) Πρωτεΐνη δέσµευσης λιπαρού οξέος και ισοένζυµο καρβονικής ανυδράσης ΙΙΙ Απολιποπρωτεΐνες ΑΙ, ΑΙΙ & Β Λιποπρωτεΐνη Α Οµοκυστεΐνη Νατριοδιουρητικό πεπτίδιο Ρενίνη πλάσµατος Ενεργοποιητές και αναστολείς του πλασµινογόνου
12. Καρκινικοί δείκτες Αναλύτες: Καρκινο-εµβρυονικό αντιγόνο α-εµβρυική πρωτεΐνη Αντιγόνον υδατάνθρακα 19-9 Καρκινικό αντιγόνο 125 Καρκινικό αντιγόνο 15-3 Υποδοχέας οιστρογόνου και υποδοχέας προγεστερόνης Λανθάνουσα αιµορραγία στα κόπρανα Ειδικό προστατικό αντιγόνο Φωσφατάση προστατικού οξέος β2-µικροσφαιρίνη Ειδική των νευρώνων ενολάση Αντιγόνο υδατάνθρακα 50 Αντιγόνο καρκινώµατος πλακώδους κυττάρου Αντιγόνο ιστικού πολυπεπτιδίου, ειδικό αντιγόνο ιστικού πολυπεπτιδίου Αλκαλική φωσφατάση του πλακούντα Ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη Καθεψίνη D Υποδοχέας της Ιντερλευκίνης-2 C-erb B-2 (Her-2/neu) ογκοπρωτεΐνη Ρ53 Αντιγόνο όγκου ουροδόχου κύστης Ανοσοχρωµατογραφικές µέθοδοι για καρκινικούς δείκτες Νέοι πειραµατικοί και άλλοι δείκτες: Καρκινικό αντιγόνο 195 TAG 72,4 Αντιγόνο S-100 SLX-I MCA CA-549 BRCA1 &BRCA2 P21 ή RAS DR-70 90K/MAC-2 BP Bcl-2 NMP-22 NMP αναλύσεις TAG-12 CA1-18 Αγγειογενετικοί παράγοντες Χρωµογρανίνη Α Τελοµεράση Έλεγχος αναδιάταξης Β/Τ γονιδίου Οστική αλκαλική φωσφατάση
13. Αλλεργία Αλλεργική νόσος: ιάγνωση και θεραπεία Αλλεργιογόνα Αναλύτες: Συνολική IgE ορού Αντίσωµα έναντι ειδικής επί του αλλεργιογόνου IgE Μέθοδοι ανάλυσης IgG αντισώµατος είκτες ενεργοποίησης κυττάρου Αξιολόγηση: Ποσοτικός προσδιορισµός των ΙgE ειδικών αντισωµάτων Τιµές αναφοράς Ποιοτικός έλεγχος Κλινικές εφαρµογές: ιάγνωση της ατοπικής νόσου και ταυτοποίηση του αλλεργιογόνου Πρόληψη και παρακολούθηση της ανάπτυξης της αλλεργικής νόσου
14. Αυτοάνοσα νοσήµατα Αναλύτες: Αντι-πυρηνικά αντισώµατα Αντι-δίκλωνο (DS) DNA Αντι-SM Αντι-RNP Αντι-SSA/RO Αντι-SSB/LA Αντι-ιστόνη Αντι-DNP Αντι-κεντρόµερος Αντι-SCL-70 Ρευµατοειδής παράγοντας Αντι-ουδετερόφιλα κυτταροπλασµατικά αντισώµατα (C-ANCA, P-ANCA) Αντι-σπειραµατική βασική µεµβράνη (GBM) Anti-Jo-1 Αnti-microsomal (υπεροξειδάση θυρεοειδούς-τρο) Αυτοαντισώµατα νησιδιοκυττάρου (ICA) Αντισώµατα έναντι του φλοιού των επινεφριδίων Αντισώµατα έναντι βρεγµατικού κυττάρου (PCA) Αντι-µιτοχονδριακά αντισώµατα (ΑΜΑ, ήμ2) Αντισώµατα έναντι των λείων µυών (SMA) Αντισώµατα έναντι του ηπατικού-νεφρικού µικροσώµατος (LKM) IgA αντι-ενδοµύιου ιστού τρανσγλουταµινάση IgG και IgA αντι-γλοιαδίνη Αντίσωµα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (ACHR) Ραβδωτά αντισώµατα Αντισώµατα καναλιού ασβεστίου Αντισώµατα έναντι της καρδιολιπίνης
15. Σεξουαλικώς µεταδιδόµενα νοσήµατα Neisseria Gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Trichomonas vaginalis Candida albicans vaginitis Gardnerella vaginalis Herpes simplex virus type 2 Syphilis (Treponema pallidum) 16. Συγγενή νοσήµατα µικροβιολογικής προέλευσης Cytomegalovirus Rubella virus Tojiplasma gondiisma gondii Parovirus B19 Group B Streptococci
17. Ηπατίτιδα Ιός ηπατίτιδας Α, anti-hav IgM, ANTI-HAV IgG Ιός ηπατίτιδας B, HBsAg, HBcAg, HBeAg, anti-hbs, anti-hbc, anti- HBc IgM, anti-hbe Ιός ηπατίτιδας C Ιός ηπατίτιδας D Ιός ηπατίτιδας E GB ιοί 18. Ανθρώπινοι Ρετροϊοί Αιτιολογικοί παράγοντες HTLV-1/-II HIV-1/-2 19. ιάφορες Ασθένειες Μικροβιολογικής Προέλευσης Herpes simplex virus type 1 Epstein-Barr virus Chagas disease Candida albicans invasive candidiasis Borrelia burgorferi Helicobacter pylori Group A streptococcus Human herprsvirus 6 Human herpesvirus 8 (Kaposi s sarcoma herpesvirus)
Ανάπτυξη Μη Ανταγωνιστικής Ετερογενούς Ενζυµοανοσοανάλυσης ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH σε Νεογνά και την Έγκαιρη ιάγνωση της Νόσου του Συγγενούς Υποθυρεοειδισµού
Θυρεοειδοτρόπος Ορµόνη ή Θυρεοτροπίνη (TSH: Thyroid-Stimulating Hormone) Παράγεται στην υπόφυση ιεγείρει την έκκριση της θυροξίνης (Τ3) και της τριιωδοθυρονίνης (Τ4) από τον θυρεοειδή αδένα Τα επίπεδά της στο αίµα είναι ελαττωµένα στον υπερθυρεοειδισµό (υπερλειτουργία του θυρεοειδούς αδένα) και αυξηµένα στον υποθυρεοειδισµό (υπολειτουργία του θυρεοειδούς αδένα) Έχουν αναπτυχθεί µέθοδοι προσδιορισµού των επιπέδων της στο αίµα γιατί: 1. ιαπιστώνεται η σωστή ή µη λειτουργία του θυρεοειδούς αδένα 2. Προσδιορισµόςτηςαιτίαςτηςβλάβης 3. Παρακολούθηση ασθενών µε υποθυρεοειδισµό που λαµβάνουν φάρµακα 4. Παρακολούθηση της λειτουργίας του θυρεοειδούς σε ασθενείς µε υπερθυρεοειδισµό 5. ιάγνωση συγγενούς υποθυρεοειδισµού στα νεογνά
Θυρεοειδοτρόπος Ορµόνη ή Θυρεοτροπίνη (TSH: Thyroid-Stimulating Hormone) Παράγεται στην υπόφυση ιεγείρει την έκκριση της θυροξίνης (Τ3) και της τριιωδοθυρονίνης (Τ4) από τον θυρεοειδή αδένα Τα επίπεδά της στο αίµα είναι ελαττωµένα στον υπερθυρεοειδισµό (υπερλειτουργία του θυρεοειδούς αδένα) και αυξηµένα στον υποθυρεοειδισµό (υπολειτουργία του θυρεοειδούς αδένα) Έχουν αναπτυχθεί µέθοδοι προσδιορισµού των επιπέδων της στο αίµα γιατί: 1. ιαπιστώνεται η σωστή ή µη λειτουργία του θυρεοειδούς αδένα 2. Προσδιορισµόςτηςαιτίαςτηςβλάβης 3. Παρακολούθηση ασθενών µε υποθυρεοειδισµό που λαµβάνουν φάρµακα 4. Παρακολούθηση της λειτουργίας του θυρεοειδούς σε ασθενείς µε υπερθυρεοειδισµό 5. ιάγνωση συγγενούς υποθυρεοειδισµού στα νεογνά
Υποθυρεοειδισµός 1. Πρωτοπαθής υποθυρεοειδισµός Βλάβη του ίδιου του θυρεοειδούς: α. Αγενεσία θυρεοειδούς β. Εκ γενετής διαταραχές στη σύνθεση των ορµονών γ. Ελλιπής πρόσληψη ιωδίου δ. Καταστροφή ή αφαίρεση του αδένα ε. Φλεγµονές στ. Λήψη φαρµάκων 2. ευτεροπαθής υποθυρεοειδισµός Βλάβη της υπόφυσης που παράγει την θυρεοειδοτρόπο ορµόνη (TSH: thyroid stimulating hormone )
Υποθυρεοειδισµός Συγγενής υποθυρεοειδισµός 1. Πρωτοπαθής υποθυρεοειδισµός Βλάβη του ίδιου του θυρεοειδούς: α. Αγενεσία θυρεοειδούς β. Εκ γενετής διαταραχές στη σύνθεση των ορµονών γ. Ελλιπής πρόσληψη ιωδίου δ. Καταστροφή ή αφαίρεση του αδένα ε. Φλεγµονές στ. Λήψη φαρµάκων 2. ευτεροπαθής υποθυρεοειδισµός Βλάβη της υπόφυσης που παράγει την θυρεοειδοτρόπο ορµόνη (TSH: thyroid stimulating hormone )
Συγγενής Υποθυρεοειδισµός στα Νεογνά Το ποσοστό εµφάνισης της νόσου εκτιµάται πως είναι 1 στα 3500 νεογνά ηλαδή υπολογίζεται ότι στην Ελλάδα γενιούνται κάθε χρόνο περίπου 30 µωρά µε συγγενή υποθυρεοειδισµό
Συγγενής Υποθυρεοειδισµός στα Νεογνά Το ποσοστό εµφάνισης της νόσου εκτιµάται πως είναι 1 στα 3500 νεογνά ύσκολη η διάγνωση, καθώς µετά τον τοκετό τα νεογνά δεν παρουσιάζουν εµφανή κλινικά συµπτώµατα, αφού λαµβάνουν θυρεοειδικές ορµόνες από την µητέρα κατά τη διάρκεια της κύησης Η µη έγκαιρη διάγνωση και αντιµετώπιση µπορεί να οδηγήσει σε καθυστέρηση της σωµατικής ανάπτυξης και σε µη αναστρέψιµη διανοητική καθυστέρηση του παιδιού
Εθνικό Πρόγραµµα Προληπτικού Ελέγχου Νεογνών Γίνεται προσπάθεια έγκαιρης διάγνωσης παθήσεων των νεογνών, που δεν είναι προφανείς κατά τη γέννηση, και οι οποίες εάν διαγνωστούν και αντιµετωπιστούν έγκαιρα, τότε το νεογνό θα µπορέσει να ζήσει χωρίς προβλήµατα. 1. Συγγενής Υποθυρεοειδισµός Η διάγνωση γίνεται τις πρώτες ηµέρες µετά τον τοκετό µε προσδιορισµό των επιπέδων της TSH στο αίµα τουβρέφους
Εθνικό Πρόγραµµα Προληπτικού Ελέγχου Νεογνών Γίνεται προσπάθεια έγκαιρης διάγνωσης παθήσεων των νεογνών, που δεν είναι προφανείς κατά τη γέννηση, και οι οποίες εάν διαγνωστούν και αντιµετωπιστούν έγκαιρα, τότε το νεογνό θα µπορέσει να ζήσει χωρίς προβλήµατα. 1. Συγγενής Υποθυρεοειδισµός 2. Έλλειψη του ενζύµου G-6-PD 3. Φαινυλκαιτονουρία
Ανάπτυξη Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 1. Αιµοληψία 2. Προσρόφηση σε κατάλληλο χαρτί 3. Μέτρηση της TSH
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 3. Εκπλύσεις 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 4. Εκπλύσεις 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 5. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερµοκρασία δωµατίου 4. Εκπλύσεις και τοποθέτηση των κηλίδων αίµατος και κατάλληλου διαλύµατος εκχύλισης 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 6. Αποµάκρυνση των κηλίδων και εκπλύσεις 5. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερµοκρασία δωµατίου 4. Εκπλύσεις και τοποθέτηση των κηλίδων αίµατος και κατάλληλου διαλύµατος εκχύλισης 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 7. Προσθήκη αντισώµατος έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε κουνέλι 6. Αποµάκρυνση των κηλίδων και εκπλύσεις 5. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερµοκρασία δωµατίου 4. Εκπλύσεις και τοποθέτηση των κηλίδων αίµατος και κατάλληλου διαλύµατος εκχύλισης 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 8. Εκπλύσεις 7. Προσθήκη αντισώµατος έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε κουνέλι 6. Αποµάκρυνση των κηλίδων και εκπλύσεις 5. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερµοκρασία δωµατίου 4. Εκπλύσεις και τοποθέτηση των κηλίδων αίµατος και κατάλληλου διαλύµατος εκχύλισης 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 8. Εκπλύσεις και προσθήκη του 2ου επισηµασµένου µε ένζυµο αντισώµατος 7. Προσθήκη αντισώµατος έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε κουνέλι 6. Αποµάκρυνση των κηλίδων και εκπλύσεις 5. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερµοκρασία δωµατίου 4. Εκπλύσεις και τοποθέτηση των κηλίδων αίµατος και κατάλληλου διαλύµατος εκχύλισης 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 9. Εκπλύσεις 8. Εκπλύσεις και προσθήκη του 2ου επισηµασµένου µε ένζυµο αντισώµατος 7. Προσθήκη αντισώµατος έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε κουνέλι 6. Αποµάκρυνση των κηλίδων και εκπλύσεις 5. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερµοκρασία δωµατίου 4. Εκπλύσεις και τοποθέτηση των κηλίδων αίµατος και κατάλληλου διαλύµατος εκχύλισης 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά 10. Μέτρηση της οπτικής απορρόφησης 9. Εκπλύσεις και προσθήκη του κατάλληλου ενζυµικού υποστρώµατος 8. Εκπλύσεις και προσθήκη του 2ου επισηµασµένου µε ένζυµο αντισώµατος 7. Προσθήκη αντισώµατος έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε κουνέλι 6. Αποµάκρυνση των κηλίδων και εκπλύσεις 5. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερµοκρασία δωµατίου TMB 4. Εκπλύσεις και τοποθέτηση των κηλίδων αίµατος και κατάλληλου διαλύµατος εκχύλισης 3. Εκπλύσεις και προσθήκη διαλύµατος κορεσµού 2. Επώαση στους 4 ο C καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας 1. Επικάλυψη των µικροφρεατιδίων µε αντίσωµα έναντι της TSH που έχει αναπτυχθεί σε γίδα
Κατά την Ανάπτυξη της Μεθόδου Μελετήθηκαν: 1. Ανάπτυξη αντισωµάτων 2. Συγκέντρωση του διαλύµατος του αντισώµατος επίστρωσης του πλακιδίου Χρόνος επώασης Συνθήκες επώασης Πρότυπα διαλύµατα αντιγόνου Χρόνος επώασης Συνθήκες επώασης Αραίωση 1ου αντισώµατος Χρόνος επώασης Συνθήκες επώασης Συγκέντρωση 2ου επισηµασµένου αντισώµατος Χρόνος επώασης Συνθήκες επώασης Ιχνηθέτης Χρωµογόνο Όρια ανίχνευσης TMB
Πρωτόκολλο Ανοσοαναλυτικής Μεθόδου ELISA για τον Προσδιορισµό της TSH στα Νεογνά Τελικός προσδιορισµός της TSH: 1. Κατασκευή της πρότυπης καµπύλης 2. Η οπτική απορρόφηση που λαµβάνουµε είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της TSH στο κάθε δείγµα 3. Προσδιορισµός των συγκεντρώσεων της TSH στα προς µέτρηση δείγµατα Αξιολόγηση των αποτελεσµάτων: 1. Φυσιολογικά επίπεδα 2. Αυξηµένα επίπεδα ( επανέλεγχος) Στα πλαίσια αξιολόγησης της συγκεκριµένης µεθόδου έγινε ανάλυση σε 30.000 δείγµατα τα οποία µας παραχωρήθηκαν από το ΙΥΠ.
Τί είναι οι ανοσοαναλύσεις 1. Απλές 2. Γρήγορες και οικονοµικές 3. Ευρύ φάσµαεφαρµογής 4. Αξιόπιστες µεχαµηλάόριαανίχνευσης
Τί είναι οι ανοσοαναλύσεις
Τί είναι οι ανοσοαναλύσεις Πού βρίσκουν εφαρµογή Τί ισχύει σήµερα στην έρευνα
Τί ισχύει σήµερα στην έρευνα Τρεις είναι οι βασικοί στόχοι: Ι. Αύξηση της ευαισθησίας των ανοσοαναλύσεων Νέες µέθοδοι επισήµανσης, βελτίωση της τεχνολογίας που εφαρµόζεται (καλύτερα συστήµατα ανίχνευσης)
Τί ισχύει σήµερα στην έρευνα Τρεις είναι οι βασικοί στόχοι: Ι. Αύξηση της ευαισθησίας των ανοσοαναλύσεων ΙΙ. Ανάπτυξη εξειδικευµένων αντισωµάτων Βελτιστοποίηση των παραγόµενων αντισωµάτων
Τί ισχύει σήµερα στην έρευνα Τρεις είναι οι βασικοί στόχοι: Ι. Αύξηση της ευαισθησίας των ανοσοαναλύσεων ΙΙ. Ανάπτυξη εξειδικευµένων αντισωµάτων ΙΙΙ. Ανακάλυψη νέων µοριακών δεικτών Θυµοσίνη β15 (καρκίνος µαστού & προστάτη, Nature Medicine 1996) Ουµανίνη (νευροεκφυλιστικές ασθένειες, PNAS 2001)
Τί ισχύει σήµερα στην έρευνα Τρεις είναι οι βασικοί στόχοι: Ι. Αύξηση της ευαισθησίας των ανοσοαναλύσεων ΙΙ. Ανάπτυξη εξειδικευµένων αντισωµάτων ΙΙΙ. Ανακάλυψη νέων µοριακών δεικτών