BIOHEMIJA I LABORATORIJSKE VJEŽBE

Transcript

1 BIOHEMIJA I LABORATORIJSKE VJEŽBE Student:

2 Vježba broj 1 KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UGLJIKOHIDRATA 1. TEORETSKI DIO Ugljikohidrati (šećeri, saharidi) su spojevi izgrađeni od lanca ugljikovodika na kojem je vezano više hidroksilnih grupa i po jedna aldehidna ili keto grupa. Nazivaju se i polihidroksilni aldehidi i polihidroksilni ketoni. Dijele se na proste i složene. Prosti šećeri ili monosaharidi se dijele na aldoze i ketoze. Lanac od nc atoma ima n-1 hidroksilnih grupa i ovisno o vrsti šećera, jednu aldehidnu ili jednu keto skupinu. Prema broju C atoma dijele se na trioze, tetroze, pentoze, heksoze i heptoze. Složeni šećeri se dijele na holozide i heterozide. Holozidi su izgrađeni od više međusobno povezanih monosaharidnih jedinica koje se povezuju glikozidnom vezom. Prema složenosti dijele se na oligosaharide (2-10 jedinica) i polisaharide više od 10 monosaharidnih jedinica. Heterozidi (glikozidi) su spojevi monosaharida ili oligosaharida s nekom nešećernom frakcijom koja se naziva aglikon. Šećeri su vrlo rasprostranjeni u prirodi i imaju višestruke biološke uloge: strukturni elementi: npr. celuloza u biljnom svijetu, a u životinjskom svijetu polisaharidi izgrađuju zaštitne opne i oklope energetska rezerva: glikogen kod životinja i škrob u biljnom svijetu osnovni intermedijeri metabolizma: npr. šećer riboza koja ulazi u izgradnju RNA, DNA i raznih koenzima uloga receptora raznih signala: na površini stanice glikoproteini i glikolipidi svojim šećernim dijelom molekule imaju ulogu receptora raznih hemijskih i električnih signala. Prisustvo karbonilne grupe u molekulama šećera uslovljava izvanrednu hemijsku reaktivnost. Danas je prihvaćena poluacetalna struktura prostih šećera koja se predstavlja putem Haworth-ove projekcione strukture (slika 7). Slika 7: Strukturna formula glukoze 1

3 Poluacetalna hidroksilna grupa se po svojim osobinama razlikuje od ostalih OH grupa u molekuli šećera. Ona interakcijom sa alkoholnom grupom istog ili različitog monosaharida, uz izdvajanje molekule vode omogućava formiranje kisikovih mostova, koji su bitni za polimerizaciju monosaharida (nastanak glikozidnih veza). Po osobinama, monosaharidi se razlikuju od drugih organskih supstanci: Oksidacija i redukcija -procesom oksidacije monosaharidi prelaze u onske, uronske i dikarbonske oksikiseline. Onske nastaju oksidacijom aldehidne grupe u karboksilnu, uronske oksidacijom primarne OH-grupe u karboksilnu, a dikarbonske kiseline nastaju oksidacijom aldehidne i primarne alkoholne grupe. Na bazi oksidacije monosaharida uvedene su reakcije dokazivanja šećera u rastvoru, kao što su: Tromerova, Benediktova, Bottger-ova, Nylander-ova, Felingova i dr. Monosaharidi uz prisustvo nekog redukujućeg sredstva mogu preći u odgovarajuće alkohole, pri čemu se redukuje aldehidna grupa od aldoze, a keto grupa od ketoze. Redukcija se vrši u baznoj sredini i pri povišenoj temperaturi. Šećeri sastavljeni iz dva ili više monosaharida (npr. oligosaharidi imaju 2-10 monosaharida) mogu zadržati reducirajuća svojstva ako im jedna reducirajuća grupa (aldehidna ili keto) nije stupila u glikozidnu vezu. Optička aktivnost - Većina šećera ima svojstvo zakretanja ravni polarizirane svjetlosti kao posljedicu posjedovanja asimetrično-og/ih C-atoma, što se koristi za kvalitativno (provjerom specifičnog ugla zakretanja) i kvantitativno (m jerenjem ugla zakretanja) određivanje. Mjerenjem optičke aktivnosti može se pratiti i kinetika brojnih reakcija. Kao primjer može se navesti i hidrolize saharoze, koja se još zove inverzija saharoze, jer je saharoza kao spoj desnogira (zakreće ravan polari zovane svijetlosti udesno), a produkt koji nastaje hidrolizom je lijevogiri. Hidrolizom nastaje ekvimolarna smjesa glukoze i fruktoze. Obzirom da je fruktoza lijevogira, a glukoza desnogira, u otopini dva šećera dominira onaj smjer obrtanja polarizovane svijetlosti čiji je specifični ugao zakretanja veći. U ovom slučaju to je specifični ugao fruktoze i otopina je lijevogira. Zato se ekvimolarna smjesa glukoze i fruktoze naziva invertni šećer. Konfiguracija monosaharida - označava se velikim slovima D i L, pa šećeri koji nose oznaku D imaju desnu, a šećeri koji imaju oznaku L imaju lijevu konfiguraciju. Svi monosaharidi koji imaju raspored H i OH-grupe na posljednjem asimetričnom, odnosno pretposljednjem C-atomu, kao i D-glukoza imaju desnu konfiguraciju bez obzira kako obrću ravan polarizovane svjetlosti. Pouzdano kvalitativno i kvantitativno određivanje ugljikohidrata vrši se brojnim hromatografskim metodama uz primjenu čistih šećera kao standarda. Reakcije koje se koriste za kvalitativno dokazivanje prisustva ugljikohidrata temelje se najčešće na reducirajućim svojstvima mono- i disaharida, oksidaciji mono- i disaharida uz vezivanje nastalih produkata pogodnim reagensima u specifično obojene komplekse. Vrlo jednostavan eksperiment za kvalitativno dokazivanje šećera je karameliziranje koje se dešava na povišenoj temperaturi kada nastaju produkti (boja može varirati od žute preko smeđe do crne ovisno o visini temperature i vremenu zagrijavanja) uz izdvajanje karakterističnog i ugodnog mirisa. Temperatura topljenja (preciznije temperatura raspadanja) kao fizička konstanta također služi pri identifikaciji šećera. Fermentacija - pri djelovanju kvasca na otopine većine monosaharida, nekih disaharida i oligosaharida, dolazi do selektivne fermentacije. Ovisno o prisustvu odgovarajućih enzima u 2

4 pekarskom ili pivskom kvascu fermentacija može biti alkoholna i mliječno-kiselinska. Kod prve nastaje etanol, a kod druge kojoj podliježe mliječni šećer laktoza nastaje mliječna kiselina. 2. EKSPERIMENTALNI DIO Reducirajuća svojstva monosaharida i disaharida 1. Trommerova reakcija Na ispitivanu probu (1-2 ml otopine šećera) dodaje se isti volumen 2 M NaOH i uz miješanje toliko 0,25 M otopine CuSO 4 dok se ne stvori talog Cu(OH) 2 koji se više ne otapa. Zagrijavanjem, reducirajući šećeri izdvajaju crveni talog Cu 2 O: 2. Fehlingova reakcija U epruvetu sipati 1 ml reagensa Fehling I i Fehling II i zagrijavati na ključalom vodenom kupatilu nekoliko minuta. Zatim dodati ispitivanu otopinu šećera i ukoliko se odmah ne pojavi crveni talog Cu 2 O nastaviti grijati. -Fehling I: vodena otopina bakar(ii)-sulfata (6,25 g CuSO 4 x5h 2 O u 100 ml H 2 O) -Fehling II: alkalna otopina kalijum-natrijum tartarata (15 g NaOH i 5 g soli u 100 ml H 2 O) Pri spajanju Fehlinga I i Fehlinga II nastaje plavo obojeni kompleks bakarkalijnatrij tartarata. 3. Benedictova reakcija U epruvetu se stavi 1,5 ml Benedictovog reagensa i nekoliko kapi ispitivane probe i zagrijava 2 minute na ključalom vodenom kupatilu. Crveni talog Cu 2 O dokaz je prisustva reducirajućih šećera. 3

5 Benedictov reagens: 1. Otopi se 173 g bezvodnog Na-citrata i 90 g bezvodnog Na-karbonata u 600 ml destilovane vode uz grijanje. Po potrebi se filtrira. Nadopuniti sa destilovanom vodom do 850 ml. 2. Otopi se 17,3 CuSO 4 x5h 2 O u 150 ml H 2 O. Nakon toga otopina 1, postepeno, uz mješanje, dodaje se u otopinu Nylanderova reakcija Na 2 ml ispitivane otopine dodaje se 0,5 ml Nylanderova reagensa i zagrijava do pojave smeđeg do crnog taloga od izdvojenog bizmuta: Nylanderov reagens: otopi se 4 g K-Na tartarata u 100 ml 10 %-og NaOH. Tome se dodaje 2 g bizmutnitrata i zagrijava. Nakon toga, filtrirati i ohlađeni filtrat koristiti kao reagens. 5. Reakcija srebrnog ogledala U epruvetu sipati 2 ml 10 %-og AgNO 3 i dodavati NH 4 OH do alkalne reakcije. Zatim dodati 2 ml 1 %-ne otopine glukoze i grijati na vodenom kupatilu. Nakon izvjesnog vremena na zidovima epruvete stvara se ogledalo od izdvojenog srebra. Ostale bojene reakcije za dokazivanje ugljikohidrata 1. Molischeva reakcija Molischeva reakcija je opća reakcija na prisustvo šećera. Negativna proba isključuje njihovo prisustvo u ispitivanom uzorku. Temelji se na dehidratacionom djelovanju koncentriranih kiselina pri čemu nastaje furfural ili njegovi derivati koji sa α-naftolom daju obojene spojeve. Postupak: na 2 ml ispitivane otopine dodati nekoliko kapi Molischeva reagensa, promješa i vrlo pažljivo, niz zidove epruvete dodati 3 ml konc. H 2 SO 4. Na dodirnom sloju dvije tečnosti javlja se crveno-ljubičasto obojenje, koje ukazuje na prisustvo šećera. 4

6 2. Seliwanov test-razlikovanje aldoza i ketoza Specifična reakcija na ketoze izvodi se Seliwanovim reagensom (otopina rezorcinola u HCl). Ketoze se dehidratiziraju sa rezorcinolom do furfurala (derivata furfurala) mnogo brže od aldoza, a furfural se kondenzira sa rezorcinolom i gradi kompleks crvene boje. Postupak: na 2 ml Seliwanov-og reagensa dodati nekoliko kapi ketoze (fruktoze) i zagrijavati do ključanja u toku 60 sekundi. Nastaje crvenkasto obojenje, a zatim crveni talog. Razlikovanje pentoza i heksoza 1. Tauberova reakcija Ova reakcija je selektivno pozitivna na pentoze. Reagens sadrži benzidin u koncentrovanoj acetatnoj kiselini. Postupak: na 0,5 ml pentoze (arabinoza, riboza, ksiloza) dodati 2 ml Tauberovog reagensa, zagrijati do ključanja do smanjenja volumena na polovicu. Epruvetu zatim uroniti u hladnu vodu i dopuniti vodom na polazni volumen. U toku nekoliko sekundi javlja se vrlo stabilna svijetlo-crvena boja. 2. Bialova reakcija Ova reakcija je pozitivna na pentoze, a reagens sadrži orcinol i željezo(iii)-hlorid u HCl. Postupak: Na 1,5 ml pentoze dodati 2,5 ml reagensa i grijati na ključalom vodenom kupatilu. Pentoze zagrijavanjem sa HCl daju furfural koji se u prisustvu feri jona kondenzira sa orcinolom (1,3-dihidroksi-5-metilbenzen) pri čemu se javlja zeleno obojeni kompleks. Ponoviti reakciju sa glukozom i ustanoviti negativan test. Fermentacija Na suspenziju kvasca u vodi dodati otopinu koja se ispituje (2 % -nu fruktozu). Zatvoriti epruvetu (tzv. patkicu), okrenuti je i držati u termostatu pri 37 C. Nakon 30 minuta zapažaju se mjehurići izdvojenog CO 2, koji idu prema vrhu epruvete i potiskuju tečnost. 5

7 Hidroliza i inverzija saharoze 1. Sa 1-2 ml otopine saharoze izvesti neku od reducirajućih proba (npr. Trommerovu ili Benedictovu) i zabilježiti ishod. Nakon toga, na 5 ml otopine saharoze dodati 0,5 ml konc. HCl i zagrijavati minuta na ključalom vodenom kupatilu. Ohladiti i hidrolizat neutralizirati zasićenom otopinom Na-karbonata. 2. Na neutraliziranoj otopini izvesti Benedictovu probu i konstatirati prisustvo reducirajućih grupa, nastalih hidrolitičkim cijepanjem glikozidne veze. Određivanje glukoze po Willstätter-u Jod se u alkalnoj sredini prevodi u hipojodit koji oksidira aldoze do odgovarajućih aldonskih kiselina, a sam se redukuje u jodid. Višak joda koji nije reagovao sa aldozom odredi se sa Na 2 S 2 O 3. Iz količine joda koji je reagovao sa aldozom izračunava se preko utroška odgovarajućeg rastvora Na 2 S 2 O 3 sadržaj aldoze. Rastvor joda i baze moraju se brzo promješati sa rastvorom šećera da bi se izvršila reakcija oksidacije šećera. Ukoliko se sporo radi dolazi do oksidacije hipojodita u jodate, koji ne reaguju sa šećerom u alkalnoj sredini. J 2 + 4OH - 2JO - + 2H 2 O JO - + CH 2 CH(CHOH) 4 CHO + OH - CH 2 OH(CHOH) 4 COONa + J - + H 2 O Ketoze i disaharidi trehaloznog tipa ne reaguju sa alkalnim rastvorom joda. Treba se imati u vidu da sve aldoze i disaharidi maltoznog tipa (laktoza, maltoza) reaguju sa alkalnim rastvorom joda na isti način kao i glukoza, te se u njihovom prisustvu ne može odrediti glukoza na ovaj način. Međutim, praktično, u namirnicama u kojima se određuje glukoza kao što su proizvodi od šećera, voćne prerađevine, med i drugo, osim glukoze nema ni jedne druge aldoze u količini koja bi bitno uticala na rezultat. Potrebni reagensi: - 0,1 M rastvor joda - 0,2 M NaHCO 3-0,2 M Na 2 CO 3-25 % H 2 SO 4-0, 1 M Na 2 S 2 O 3-1 % škrob PROCEDURA ZA RAD U erlenmajer se uzme 25 ml osnovnog filtrata (nastalog rastvaranjem 2 g meda u 250 ml vode), pomješa se sa 25 ml 0,2 N Na 2 CO 3, ostavi se da stoji 1-2 sata na tamnom mjestu. Nakon stajanja zakiseli se sa 12 ml 25 % H 2 SO 4, a slobodni jod titrira sa 0,1 M Na 2 S 2 O 3, uz škrob kao indikator. Istovremeno se radi i slijepa proba. Na osnovu dobijenih vrijednosti odredi se sadržaj glukoze u ispitivanom uzorku. 6

8 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Kakve osobine pokazuju monosaharidi: a) reducirajuće b) oksidirajuće c) hidroksilirajuće 2. Napišite strukturne formule α-d-glukopiranoze i β-d-glukopiranoze? 3. Napišite strukturne formule: α-d-ribofuranoze i α-d-dezoksiribofuranoze? 4. Koji disaharidi u svom sastavu sadrže α-d-glukozu: a) maltoza b) saharoza c) laktoza d) celobioza 5. Koji disaharidi u svom sastavu imaju β-d-glukozu? e) celobioza f) laktoza g) saharoza 6. Koji od navedenih ugljikohidrata će dati pozitivnu (+) ili negativnu (-) reakciju sa navedenim reagensima? Glukoza Fruktoza Galaktoza Saharoza Laktoza Maltoza Benediktova reakcija Selivanov test Fermentacija Reakcija sa jodom 7

9 7. Napisati konačnu reakciju alkoholne i mliječno-kiselinske fermentacije? 8. Napišite strukturne formule disaharida a) trehaloze b) maltoze 4. REZULTATI Uzorak Reakcija Opažanja i rezultat 8

10 Uzorak Reakcija Opažanja i rezultati 9

11 Određivanje koncentracije glukoze u uzorku OVJERA VJEŽBE: 10

12 Vježba broj 2 1. TEORETSKI DIO POLISAHARIDI Polisaharidi su sastavljeni od većeg broja monosaharida (više od 10) međusobno povezanih glikozidnom vezom i nemaju reducirajuća svojstva. Najčešće imaju koloidni karakter (škrob, glikogen itd.) ili su netopivi u vodi (celuloza). Koloidno stanje se može potvrditi taloženjem. Razlikuju se homo- i heteropolisaharidi. Homopolisaharidi su izgrađeni od iste vrste monosaharidnih jedinica, a heteropolisaharidi od različitih vrsta. Kod biljaka je velika raznolikost polisaharida koji uglavnom ispunjavaju dvije funkcije: izgrađuju stanične stijenke i stanične potporne elemente, ili su rezervne tvari u obliku škroba i inulina. Hidrolizom polisaharida nastaju postepeno slijedeći proizvodi razgradnje: dekstrini, disaharidi i najzad monosaharidi. Tokom hidrolize gube se karakteristične reakcije polisaharida, a postepeno se javljaju redukujuće osobine nastalih di- i monosaharida. Škrob je biljna rezervna tvar, koja se osobito mnogo nakuplja u zrnima (žito) i gomoljima u obliku škrobnih zrnaca. Ekstrakcijom i frakcioniranjem škrob se može razgraditi na dva različita spoja amilozu i amilopektin. Čisti škrob je bijeli prah, nerastvorljiv u hladnoj vodi, a u toploj daje koloidni rastvor. Škrob je izgrađen od 15-30% amiloze i 70-85% amilopektina. Amiloza je linearni polimer koji nastaje povezivanjem D-glukoza ( 1-4) glikozidnim vezama. Broj glukoza u amilozi je Amiloza ima spiralnu konformaciju u kojoj je 6-7 glukoznih jedinica u jednoj spirali. Amilopektin je izgrađen od glukoznih lanaca u kojima je zastupljena ( 1-4) glikozidna veza, koji su međusobno razgranati ( 1-6) glikozidnim vezama. U amilopektinu ima jedno grananje na prosječno 25 jedinica glukoze. Pod djelovanjem enzima (α i β amilaze) komponente škroba se postepeno razlažu na dekstrine (smjesa polisaharida niže molekularne težine), (+) -maltozu i konačno D(+)-glukozu. Smjesa svih tih spojeva se nalazi npr. u kukuruznom sirupu. Slika 8: Struktura amiloze i amilopektina Celuloza je raširena u biljnom svijetu. Obično je povezana sa ostalim tvarima za izgradnju (lignin). Gotovo čista celu loza nalazi se u staničnim stijenkama dlačica pamuka. Tehnička se dobiva najčešće od drveta, te različitim metodama čisti od lignina i drugih popratnih tvari. Prirodna celuloza sadrži oko jedinica glukoze povezane glikozidnim vezama između C1 i C4. Celuloza se ne rastvara u vodi, ni u razblaženim kiselinama i bazama. Rastvara se u Schweitzerovom reagensu [Cu(NH 3 ) 4 ][OH] 2. Hidrolizom sa 11

13 koncentrovanom hloridnom kiselinom se razlaže do glukoze. Tretiranjem celuloze sa dušičnom kiselinom dobiva se nitroceluloza, koja je eksplozivan spoj. Glikogen je rezervni ugljikohidrat unutar životinjskih stanica. Sadržaj glikogena u jetri ovisi o prehrani, jer se već nakon kratkog gladovanja spušta na minimalnu vrijednost. Glikogen je veoma razgranat polisaharid, velike relativne molekulske mase (od 10 5 do 10 7 ). Heteropolisaharidi se nalaze i u biljnom i u životinjskom svijetu gdje uglavnom imaju ulogu izgradnje potpornih i zaštitnih tkiva. Dijele se na: Glikozaminoglikani, koji su izgrađeni od ponavljajućih disaharidnih jedinica koje sadrže derivat jednog od amino šećera ( glukozamina ili galaktozamina). Jedan od šećera u disaharidu sadrži negativno nabijenu karboksilnu ili sulfatnu skupinu. Glikokonjugati, koji su izgrađeni od oligosaharidne šećerne jedinice s jedne strane i proteina ili lipida s druge strane. Glikoproteini, koji nastaju spajanjem male oligosaharidne šećerne jedinice na veliku proteinsku molekulu. Postoje dva načina povezivanja proteinske molekule i šećerne jedinice: O i N glikozidne veze. Glikolipidi su spojevi koji imaju jedan hidrofobni lipidni i jedan hidrofilni šećerni dio. Hidrofilna šećerna jedinica je glukoza ili galaktoza na koju se dalje nadovezuju razgranati oligosaharidi, dok hidrofobni dio molekule čine neki diacilglicerol ili aminoalkohol sfingozin i na njega vezana neka višemasna kiselina. Razlikovanje polisaharida se zasniva na: rastvorljivosti u vodi (koloidne otopine) specifičnim reakcijama 2. EKSPERIMENTALNI DIO Koloidne osobine 1. Taloženje alkoholom Škrob se taloži 95 %-tnim etanolom tako što se na određeni volumen suspenzije škroba u vodi dodaje isti volumen etanola. Otopina se promućka i ostavi da se izvrši taloženje, a zatim talog odvoji filtriranjem. Na filtrat i na talog izvesti reakciju sa jodom. 2. Taloženje amonijum-sulfatom Na određeni volumen škroba dodaje se isti volumen zasićenog rastvora (NH 4 ) 2 SO 4, dobro promućka i ostavi da stoji neko vrijeme. Škrob se taloži, a filtrat daje negativnu reakciju sa jodom. Reakcije sa jodom 1. Reakcije na škrob Na 5 ml suspenzije škroba u vodi dodati Lugolov reagens (J 2 u vodenom rastvoru KJ). Javlja se izrazito plava boja koja je pri jačoj koncentraciji tamno-modra. 12

14 Hidroliza škroba Hidroliza škroba provodi se u kiseloj sredini uz zagrijavanje. Na nekoliko mililitara vodene otopine škroba doda se 2-3 ml HCl (3 mol/dm 3 ) i stavi u ključalo vodeno kupatilo. Poslije svaka dva minuta uzima se po nekoliko kapi hidrolizata i izvodi proba Lugolovim reagensom. Označi se vrijeme koje je potrebno za prvu promjenu boje sa škrobom i nastave probe sve dok reakcija sa jodom ne postane negativna. Dio finalnog hidrolizata neutralizirati sa Na 2 CO 3 i izvesti jednu od reducirajućih reakcija, čiji će pozitivni test ukazati da je škrob razložen na disaharid maltozu, odnosno monosaharid glukozu. Napomena Tokom hidrolize škrob daje sljedeće međuproizvode: amilodekstrine, koji sa jodom daju crvenosmeđe obojenje; eritrodekstrine-sa jodom daje purpurnocrveno obojenje; ahrodekstrine-sa jodom ne daju boju; maltozu i glukozu-sa jodom ne daju boju, ali daju pozitivne redukujuće probe. Proizvodi hidrolitičke razgradnje škroba mogu se utvrditi na primjer u hljebu. Na nekoliko komadića hljeba dodati vodu, homogenizirati, ostaviti da stoji izvjesno vrijeme, filtrirati kroz gazu, a zatim kroz filter-papir. Sa malom količinom filtrata izvesti jodnu probu, čija purpurnocrvena boja ukazuje na nastali eritrodekstrin tokom pečenja hljeba. Maltoza i glukoza nastaju hidrolitičkom transformacijom jednog dijela škroba iz brašna pod uticajem enzima amilaze iz pšenice, koja se aktivira temperaturom u toku procesa kvasanja hljeba. U hljebu dakle, postoje istovremeno, škrob, dekstrini, maltoza i glukoza, jer proces kvasanja i pečenja uslovljava prelaz jednog dijela škroba u njegove razgradne proizvode. Hidroliza celuloze U posudu za hidrolizu staviti usitnjeni filter papir ili mikrokristaličnu celulozu i dodati oko 3 ml hloridne kiseline (3 mol/dm 3 ). Dobija se gusti sirup, koji se pažljivo sipa u vodu (oko 5 ml) i pusti da ključa 30 minuta. Ohladiti, neutralizirati 10%-tnim Na 2 CO 3 (pažljivo uz lakmus papir). Na neutralnom hidrolizatu izvesti neku od redukujućih proba. Napomena: tokom hidrolize iz celuloze nastaju celobioza i glukoza, koje imaju redukujuća svojstva. 3. ZADACI I VJEŽBE 1. U sastav kojeg polisaharida ulaze ostaci fruktoze: a) glikogena b) škroba c) inulina d) celuloze 13

15 2. Koji se monosaharid dobija pri potpunoj hidrolizi glikogena: a) D-fruktoza b) glukoza-1-fosfat c) glukozo-6-fosfat d) D-glukoza 3. Koji ugljikohidrati pripradaju heteropolisaharidima: a) heparin b) arabinoza c) arabin d) glikogen e) hialuronska kiselina 4. Kojim specifičnostima strukture su uslovljene razlike u osobinama celuloze i glikogena? 5. Od navedenih primjera izaberite pravilne: a) sastavna komponenta celuloze je α-glukoza b) pri kiseloj hidrolizi skroba gradi se maltoza c) djelovanjem maltaza na maltozu nastaje α-glukoza d) proizvodi hidrolize mnogih polisaharida su heksoze i njihovi derivati e) pri redukciji aldoza i ketoza grade se alkoholi 6. Napišite strukturne formule slijedećih disaharida: laktoze, saharoze, celobioze! Koji monosaharidi ulaze u njihov sastav? 7. Koji spojevi pripadaju heteropolisaharidima? Navedite njihov sastav? 14

16 4. REZULTATI Uzorak Reakcija Opažanja i rezultati OVJERA VJEŽBE: 15

17 Vježba broj 3 KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE LAKTOZE POLARIMETRIJSKOM METODOM (ODREĐIVANJE SADRŽAJA LAKTOZE (IZRAŽEN U %) U UZORKU MLIJEKA) 1. TEORETSKI UVOD Polarimetrija je optička metoda pomoću koje se prati zakretanje ravni polarizirane svjetlosti. To zakretanje ravni polarizirane svjetlosti naziva se optička rotacija, a spojevi koji zakreću ravan su optički aktivni. Veličina i pravac zakretanja ravni polarizovane svjetlosti koje prolazi kroz rastvor neke asimetrične supstance je reprodukujuća i stalna veličina i može se kvantitativno odrediti. Zakretanje ravni polarizovane svjetlosti može da bude desno (u pravcu kazaljke na satu) i lijevo (suprotno kretanju kazaljke na satu). Spoj koji zakreće udesno ima desnu rotaciju i obilježava se sa (+), a spoj koji zakreće ulijevo ima lijevu rotaciju i obilježava se sa (-). Uslov za optičku aktivnost jednog organskog spoja je prisustvo jednog asimetričnog centra u molekuli, odnosno atoma ugljika kod kojeg su sve četiri valencije zasićene različitim grupama ili radikalima. Instrument pomoću kojeg se određuje vrijednost ugla zakretanja ravni polarizirane svjetlosti zove se polarimetar. Polarizirana svjetlost nastaje kada se svjetlost određene valne dužine iz vidljivog dijela elektromagnetnog spektra propusti kroz sistem Nikolovih prizmi. Znak polarizovane svjetlosti, žute svjetlosti iz svjetlosnog izvora prolazi kroz sabirno sočivo i pada na nepokretnu prizmu, izrađenu od kalcita koja ima osobinu dvostrukog prelamanja svjetlosti. Ona je polarizator svjetlosti. Polarizovani zrak iz polarizatora dolazi na drugu prizmu, koja se okreće oko svoje horizontalne ose (analizator). Iz analizatora zrak kroz sistem sočiva dolazi do oka posmatrača. Svjetlost kod koje su smjerovi oscilacija sređeni na neki način naziva se polarizovana svjetlost. Slika 9: Princip rada polarimetra. Vrijednost ugla rotacije ravni polarizirane svjetlosti za optički aktivnu tvar ovisi o: Strukturi molekule Broju molekula na svjetlosnom putu (koncentraciji) Temperaturi Talasnoj dužini svjetlosti iz izvora Otapalu 16

18 Specifični ugao rotacije nekog enantiomera je veličina ugla rotacije koja potiče od 1,00 g tvari u 1,00 cm 3 otapala u cijevi dužine 1,00 dm na određenoj temperaturi, valnoj dužini svjetlosti i određenom otapalu. Najčešće se koristi svjetlost valne dužine 589,3 nm (natrijumova D linija). Specifični ugao rotacije ( T D ) za neku optički aktivnu tvar izračunava se iz izmjerenog ugla rotacije na polarimetru () pomoću slijedeće formule: T D l c gdje je: l dužina kivete (dm) T termodinamička temperatura D valna dužina volframove lampe koja odgovara žutoj natrijevoj liniji pri 589,3 nm. c koncentracija tvari (g/cm 3 ) Mnogi optički aktivni spojevi daju otopine kod kojih se vrijednost ugla zakretanja ravni polarizirane svjetlosti mijenja tokom vremena. Ova pojava, koja se naziva mutarotacija (lat. mutare = mijenjati) posljedica je aldehid-poluacetalne ravnoteže: O OH HO CH 2 OH O OH OH HO C H OH OH OH CH 2 OH OH HO CH 2 OH O OH OH -D-glukoza D-glukoza -D-glukoza (lančani oblik) Slika 10: Strukturne formule α-d i β-d-glukoze Svježe pripremljena otopina -D-glukoze ima specifični ugao zakretanja +112, a -Dglukoze +18,7. Tokom vremena, bilo koji od ova dva oblika glukoze mutarotacijom dostigne konačnu vrijednost specifičnog ugla zakretanja od +52,7. Prema tome, otopina glukoze koja pokazuje specifični ugao zakretanja od +52,7 predstavlja u stvari ravnotežnu smjesu i oblika. 2. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni reagensi: - mlijeko - laktoza 17

19 - reagens za bistrenje ( 40g kalij -jodida rastvoriti u 200ml vode, dodati 55g živinog jodida i sve dopuniti vodom do 500ml. Izvjesno vrijeme se mućka, a zatim se pusti da se talog slegne. Bistri talog se odlije) - 20 % sumporna kiselina (H 2 SO 4 ) Optička metoda koja će se koristiti je polarimetrija. Detekcija se ostvaruje očitavanjem ugla zakretanja na odgovarajućoj mjernoj skali koja je povezana sa analizatorom. PROCEDURA ZA RAD Pripremiti po 50 ml 1 %, 2 %, 5%, 10 % i 15 %-tne otopine laktoze i držati 30 minuta na temperaturi C, da bi se mutarotacija svela na minimum (U svrhu dobijanja boljih rezultata otopine se pripreme 24 h prije mjerenja i ostave na temperaturu od 2 8 C). Prije rada sa otopinama potrebno je naći korekciju (odstupanje od nule na mjernoj skali) polarimetra pomoću destilirane vode. Nakon toga za svaku otopinu izmjeriti ugao zakretanja na polarimetru i nacrtati grafik na milimetarskom papiru gdje je = f(c), gdje je mjereni ugao, a c koncentracija laktoze u g/100 ml, odnosno u %. Zatim se mjeri ugao zakretanja otopine mlijeka. Uzme se 75 ml mlijeka u odmjerni sud od 100 ml, doda se 7,5 ml 20% H 2 SO 4 i 7,5 ml reagensa za bistrenje, a zatim dopuni vodom do marke. Filtrira se. Bistrom filtratu se mjeri ugao zakretanja. Na osnovu kalibracione krive očitava se koncentracija u uzorku mlijeka. 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Objasnite, zašto u rastvoru α-galaktoze optička rotacija se vremenom smanjuje? Objasnite, zašto rastvori α- i β-oblika u istim koncentracijama po isteku određenog vremena pokazuju jednu te istu optičku aktivnost? 2. Šta je inverzija, a šta je invertni šećer? Napišite formulu invertnog šećera? 18

20 3. Koristeći se podacima navedenim za specifične uglove zakretanja anomernih oblika glukoze (u teorijskom dijelu) izračunati procentualnu zastupljenost tih oblika glukoze u stanju ravnoteže. 4. REZULTATI - Vrijednosti mjerenja ugla zakretanja α (H 2 O) α 1% laktoza α 2% laktoza α 5% laktoza α 10% laktoza α 15% laktoza Uzorak mlijeka 19

21 - Koncentracija nepoznatog uzorka - Uz izvještaj priložiti i grafik kalibracione krive. OVJERA VJEŽBE 20

22 Vježba broj 4 1. TEORETSKI DIO Prekursori lipida-masne kiseline KVALITATIVNO ODREĐIVANJE LIPIDA Masne kiseline su uglavnom monokarboksilne organske kiseline s ukupnim brojem C atoma većim od četiri. Mogu biti zasićene i nezasićene masne kiseline, ali gotovo uvijek s nerazgranatim lancem. Masne kiseline se obilježavaju prema broju C atoma i prema broju i položaju dvostrukih veza: C n:x n - broj C atoma x - broj dvostrukih veza Na primjer: C 14:0 C 18:2 (cis,cis- 9, 12 ) miristinska kiselina ima 14 C atoma i nema dvostrukih veza linoleinska kiselina ima 18 C atoma i dvije cis dvostruke veze iza devetog i dvanaestog C atoma. Slika 2: Formule zasićene i nezasićene masne kiseline Tabela 2: Pregled zasićenih masnih kiselina Broj C atoma Naziv kiseline Formula 12 Laurinska CH 3 (CH 2 ) 10 COOH 14 Miristrinska CH 3 (CH 2 ) 12 COOH 16 Palmitinska CH 3 (CH 2 ) 14 COOH 18 Stearinska CH 3 (CH 2 ) 16 COOH 20 Arahidinska CH 3 (CH 2 ) 18 COOH 22 Beheninska CH 3 (CH 2 ) 20 COOH 24 Lignocerinska CH 3 (CH 2 ) 22 COOH Tabela 3: Pregled nezasićenih masnih kiselina Broj C atoma Naziv kiseline Formula 16 Palmitoleinska CH 3(CH 2) 5CH=CH(CH 2) 7COOH 18 Oleinska CH 3(CH 2) 7CH=CH(CH 2) 7COOH 18 Linolna CH 3(CH 2) 4CH=CHCH 2CH=CH(CH 2) 7COOH 18 Linoleinska CH 3CH 2CH=CHCH 2CH=CHCH 2CH=CH(CH 2) 7COOH 20 Arahidonska CH 3(CH 2) 4CH=CHCH 2CH=CHCH 2CH=CHCH 2CH=CH(CH 2) 3COOH 21

23 Prisustvo dvostrukih veza u nezasićenim masnim kiselinama snižava tačku topljenja u odnosu na odgovarajuću zasićenu masnu kiselinu. S druge strane, tačka ključanja je utoliko viša što je lanac C atoma duži, dok prisustvovanje dvostrukih veza praktično nema utjecaja na tačku ključanja. Masne kiseline pokazuju karakteristične reakcije na karboksilnu grupu, pa tako grade u reakciji sa bazama soli (sapune), u reakciji sa alkoholima daju estere, dok nezasićene masne kiseline učestvuju u reakciji adicije (npr. sa bromom ili jodom) i reakcijama oksidacije. Lipidi Lipidi su spojevi esterskog tipa sa kiselinskom komponentom iz reda viših masnih kiselina, dok je alkoholna komponenta glicerol ili neki visokomolekularni alkohol. Dijele se na: proste i složene lipide. Prosti (jednostavni) lipidi sadrže alkohol i masnu kiselinu, a složeni (kompleksni) sadrže pored alkohola i masne kiseline i neke druge spojeve, pa veza može biti i estarska i amidna. Prosti lipidi se dijele prema vrsti alkohola koji esterifikuju masne kiseline na: gliceride (masti i ulja) -alkohol je glicerin, esterifikuju se tri masne kiseline ceride - alkohol je visokomolekularan alifatičan i esterifikuje jednu masnu kiselinu steride - alkohol je derivat sterola, a esterifikuje jednu masnu kiselinu. Predstavnik je lanolin, ester holesterola i masnih kiselina Slika 3: Heterogeni triglicerid Složeni lipidi se dijele na: fosfolipide-sadrži, pored osnovnih sastojaka, i fosfornu kiselinu, H 3 PO 4, esterificiranu na jednu OH grupu glicerola. U zavisnosti od vrste sadržanog alkohola, mogu se dijeliti na glicerofosfolipide (alkohol je glicerol i veza je esterska) i na sfingolipide (alkohol je sfingozin i veza je amidna) glikolipide-sadrže, pored osnovnih sastojaka, i ugljikohidratsku komponentu. Slika 4: Strukturna formula lecitina 22

24 Masti i ulja pod običnim uslovima mogu postojati u čvrstom ili tečnom obliku, u zavisnosti od prirode masnih kiselina. Dužina i stepen nezasićenosti masnih kiselina u molekuli triglicerida određuju njegove fizičke i hemijske osobine. Većina biljnih ulja sadrži većinski dio nezasićenih masnih kiselina, kao što su oleinska, linolna i linoleinska kiselina, koje imaju nisku tačku topljenja i tečne su. Nasuprot tome, animalne trigliceride odlikuje prisustvo zasićenih masnih kiselina, kao što su palmitinska i stearinska, koje doprinose da na sobnoj temperaturi masti budu polučvrste ili čvrste. Katalitičkom hidrogenizacijom ulja se mogu prevesti u masti (npr. industrijski postupak dobijanja margarina). Prirodne masti ili ulja nisu hemijske jedinke, već sadrže veliki broj raznih glicerida. Prosti lipidi imaju izvanrednu ulogu u ishrani (kravlje maslo, salo, biljna ulja, svinjska mast). To su tipične rezerve energije, visoke kalorične vrijednosti. Opšte karakteristike lipida su rastvorljivost, emulzifikacija i saponifikacija. Zbog svoje nepolarne prirode nerastvaraju se u vodi, ali se rastvaraju u organskim rastvaračima. Energičnim mućkanjem vode i ulja dobija se emulzija, koja nije stabilna i strajanjem se razdvaja na dvije faze. Postoje jedinjenja koja mogu stabilizirati emulzije, a najznačajnija su ona koja se nalaze u probavnim sokovima (npr. Na 2 CO 3, žučne kiseline i njihove soli, itd...). Saponifikacija je alkalna in vitro hidroliza masti i ulja i ima veliki industrijski značaj. Sapuni alkalni metala su topivi u vodi (meki sapuni), a sapuni zemnoalkalnih metala su netopivi u vodi (tvrdi sapuni). 2. EKSPERIMENTALNI DIO Slika 4: Struktura sapuna Rastvorljivost U pet epruveta staviti nekoliko kapi ulja ili malo masti, a zatim dodati 1-2ml: Hloroforma Acetona Hladnog etanola Zagrijanog etanola Vode Sadržaj svake epruvete dobro promućkati i zabilježiti svoja zapažanja o rastvorljivosti lipida. Emulzifikacija U tri epruvete staviti nekoliko kapi ulja i malo vode. U prvu eppruvetu dodati 5 kapi 0,5 %- tnog Na 2 CO 3, u drugu 0,5 %-tnog NaHCO 3, a u treću nekoliko kapi destilovane vode. Epruvete dobro promućkati i ostaviti da stoje neko vrijeme i posmatrati gdje dolazi do stabilizacije emulzije. 23

25 Saponifikacija U epruvetu uzeti 0,5 ml ulja, dodati 10 ml 10%-tne otopine NaOH u etanolu i držati u ključalom kupatilu 5-10 minuta. Nastaje mliječna emulzija sapuna, na koju se dodaje topla, destilovana voda do otapanja. Podijeliti dobijenu otopinu sapuna na tri epruvete i izvesti slijedeće probe. 1. Isoljavanje sapuna U prvu epruvetu dodati malo čvrstog NaCl. Promućkati, a zatim dodavati i dalje, sve dok se so rastvara. Stvara se tzv. isoljeni sapun (jer je dodan višak elektrolita). 2. Nastajanje sapuna netopivih u vodi U drugu epruvetu dodati 2 ml otopine CaCl 2 (0,5 mol/dm 3 ). Nastaje netopljivi Ca-sapun (tzv. tvrdi sapun) 3. Precipitacija sapuna U treću epruvetu dodavati kap po kap konc. HCl ili konc. CH 3 COOH i dobro promućkati. Stvara se bijeli talog, jer se zakiseljavanjem, topivi sapun prevodi u netopive masne kiseline. Dokazivanje sastojaka jednostavnih lipida 1.Dokazivanje alkoholne komponente a) Dokazivanje glicerola U suhu epruvetu staviti nekoliko kapi ulja, dodati malo anhidrovanog CaCl 2 i grijati na plamenu. Vježbu obavezno raditi u digestoru. Nastali akrolein napada disajne organe. b) Dokazivanje holesterola 1. Salkovskijev (Salkowsky) test na holesterol U epruvetu staviti 2ml hloroformne otopine holesterola. Pažljivo dodati 2ml koncentrovane H 2 SO 4 i blago promućkati. Ostaviti kratko vrijeme i utvrditi da gornji hloroformni dio postaje crven, a donji žut sa zelenom fluorescencijom. 2. Libermanova (Liebermann) reakcija U epruvetu nasuti oko 2ml hloroformne otopine holesterola, dodati 10 kapi anhidrida acetatne kiseline i 2 kapi konc. H 2 SO 4. Kao pozitivan test javlja se prvo ružičasto, zatim plavo obojenje, koje prelazi u zelenkasto. Holesterol se djelovanjem H 2 SO 4 dehidratizira i oksidira. Iz dvije molekule holesterola kondenzacijom nastaju ugljikovodici sa dvostrukim vezama koji daju različite proizvode H 2 SO 4 i acetanhidridom, što je uzrok prelaza boje jedne u drugu boju. 24

26 2. Dokazivanje kiselinske komponente a) Dokazivanje nezasićenih masnih kiselina Na 2 ml hroloformne otopine uzoraka lipida (izvestu probu na puter i jestivo ulje) dodavati u kapima otopinu joda u hloroformu uz mućkanje i blago zagrijavanje na vodenom kupatilu. Ukoliko je u uzorku prisutna neka od nezasićenih masnih kiselina, otopina joda će se obezbojiti. Dokazivanje prisustva složenih lipida i njihovih sastojaka 1. Dokazivanje prisustva lecitina Na otopinu žumanca jajeta dodati zasićenu alkoholnu otopinu kadmij-klorida. Ukoliko u uzorku ima lecitina izdvaja se bijeli talog kompleksnog spoja glicerolfosfolipida sa kadmijem. Također, izvesti reakciju na alkoholnu otopinu uzorka lecitina poznate čistoće. 2. Hidroliza lecitina Staviti u epruvetu 6 ml otopine lecitina, dodati 2-3 ml otopine NaOH i pažljivo kuhati 5 minuta. Hidrolizat je potrebno razdijeliti u četiri epruvete. a) Dokazivanje holina (trimetiletanolamin) Pri ključanju, tokom hidrolize, može se osjetiti karakterističan miris rasola, svojstven trimetilaminu, koji nastaje iz holina. Postavljeni crveni lakmus papir (na otvor epruvete u kojoj se vrši hidroliza) poplavi zbog isparavanja baznog trimetilamina. b) Dokazivanje fosfata Na 2 ml hidrolizata lecitina dodavati 10 %-tnu HNO 3 do neutralizacije. Na neutraliziranu otopinu dodati 2 ml amonijum-molibdata, pri čemu nastaje karakteristična žuta boja amonijumfosfomolibdata. c) Dokazivanje kisele komponente a) Dokazivanje masnih kiselina Ovaj eksperiment zasniva se na istom principu kao i dokazivanje prisustva masnih kiselina (saponifikacija i precipitacija). U ovom slučaju izvešćemo samo precipitaciju. Na 2-3 ml hidrolizata lecitina dodavati u kapima 10 %-tnu HCl do kisele reakcije. U kiseloj sredini se iz natrijevih soli masnih kiselina (nastalih baznom hidrolizom) stvaraju slobodne masne kiseline koje isplivavaju na površinu otopine i grade masni, odnosno uljasti sloj. Jaka kiselina HCl istiskuje slabu organsku kiselinu. b) Dokazivanje prisustva nezasićenih masnih kiselina Na 2 ml otopine nehidroliziranog lecitina ili njegovog ekstrakta dodavati jod u hloroformu (raditi u digestoru), uz mućkanje i zagrijavanje. 25

27 3. ZADACI I VJEŽBE - Odgovorite na slijedeća pitanja: 1. Koje funkcije imaju lipidi: a) javljaju se kao strukturni sastojci biomembrane b) služe kao oblik u kome se akumulira metabolička toplota c) nose genetičku informaciju d) imaju zaštitnu funkciju 2. Koji spojevi se odnose na lipide: a) fosfolipidi b) kefalini c) vitamini d) neutralne masti 3. Navedite karakteristične osobine dvostrukih veza nezasićenih masnih kiselina koje ulaze u sastav lipida: a) dvostruka veza u većini slučajeva se nalazi između C-9 i C-10 b) dopunske dvostruke veze se obično nalaze između C-10 i metilne grupe na kraju lanca c) dvostruke veze imaju trans konfiguraciju d) dvostruke veze imaju cis konfiguraciju e) u masnim kiselinama se nalaze dvije ili više dvostrukih veza, ali se one nikada ne nalaze povezane 4. Koji spojevi pripadaju fosfolipidima: a) kefalin b) lecitin c) fosfatidilserin d) lanolin 5. Koji spojevi spadaju u steroide: a) žučne kiseline b) hormoni nadbubrega c) polni hormoni d) sfingomijelini 6. Šta je funkcionalna grupa kod triglicerida? 26

28 7. Prikazati jednačinu kiselinske hidrolize gliceriletanoata? 4. REZULTATI Uzorak Reakcija Opažanja i rezultat 27

29 Uzorak Reakcija Opažanja i rezultat OVJERA VJEŽBE: 28

30 Vježba broj 5 1. TEORETSKI DIO ODREĐIVANJE VAŽNIJIH HEMIJSKIH KONSTANTI UZORAKA LIPIDA Kvalitet prostih lipida utvrđuje se na bazi određivanja nekih hemijskih pokazatelja. Veličina izvjesnih fizičko-hemijskih pokazatelja mijenja se u zavisnosti od porijekla ulja ili masti, animalnog tkiva ili biljnog organa (sjeme, plod), koji služe kao njihov izb or, zatim od načina dobijanja ulja kao i od načina i uslova njihovog čuvanja. Tako je poznato da pri čuvanju masla dolazi do razlaganja triglicerida, pri čemu dolazi do povećanj a kiselosti uslijed nagomilavanja slobodnih masnih kiselina. Povećana kiselost doprinosi sniženju kvaliteta ulja. Promjena kvaliteta ulja javlja se i kao posljedica oksidacije masnih kiselina na mjestu dvostruke veze u lancu, i kao posljedica toga dolazi do povećanja sadržaja aldehida, peroksidnih oblika i drugih raspada triglicerida. Kao posljedica tih promjena javlja se užeglost ulja. Kao kriteriji fizičko-hemijskih osobina prostih lipida služe: saponifikacijski broj, kiselinski broj, esterski broj, jodni broj, određivanje, indeks loma itd. Tako npr., smanjenje jodnog broja i povećanje saponifikacijskog broja u toku čuvanja ulja ili masti javljaju se kao pokazatelji njegove užeglosti. Saponifikacijski broj predstavlja broj miligrama KOH ili NaOH potreban za potpunu saponifikaciju 1g masti. Značaj određivanja ovog broja leži u odnosu između saponifikacijskog broja i dužine lanca ostatka masne kiseline. Iz vrijednosti saponifikacijskog broja dobija se uvid o zastupljenosti masnih kiselina u uzorcima lipida. Ovaj broj je manji ukoliko je molekulska masa masnih kiselina veća. U toku saponifikacije hidroliza triglicerida se vrši postepeno. Slika 5: Opšta reakcija saponifikacije Kiselinski broj je broj miligrama KOH ili NaOH potreban za neutralizaciju slobodnih masnih kiselina u 1 g masti. U praksi ima važnost pri određivanju ispravnosti namirnica, ukazuje na proces raspadanja tokom stajanja masti ili ulja. Esterski broj predstavlja razliku saponifikacijskog i kiselinskog broja, a ukazuje na broj vezanih COOH grupa. Jodni broj je broj grama J 2 koji se adira na 100g masti ili ulja. Ovaj broj je veći ukoliko su masti ili ulja tečniji tj. ukoliko je sadržaj nezasićenih masnih kiselina, na čije dvostruke veze se i vrši adicija joda, veći. 29

31 Tabela 4: Vrijednosti saponifikacijskog broja za neke masti i ulja Uzorak Saponifikacijski broj Uzorak Saponifikacijski broj Orahovo ulje Pamučno ulje Kokosovo ulje Laneno ulje Kukuruzno ulje Svinjska mast Maslinovo ulje Loj EKSPERIMENTALNI DIO Određivanje saponifikacijskog broja Odvagati 0,5-1,0 g masti u suhoj erlenmajerovoj tikvici, dodati 50 ml NaOH u etanolu (c= 0,1 mol/l) i kuhati jedan sat na vodenom kupatilu uz povratno hladilo. Nakon toga smjesa se retitrira sa 0,1 mol/l HCl uz indikator fenolftalein. Dobijeni volumen predstavlja volumen HCl koji je utrošen na titraciju viška NaOH (koji se nije saponificirao). Pored glavne izvodi se i kontrolna proba koja sadrži istu količinu alkohola i baze koji su dodani pri saponifikaciji, a titrira se sa HCl. Utrošena količina HCl odgovara količini NaOH koja je bila prisutna prije početka procesa saponifikacije. Iz razlike ove količine i količine NaOH koji se nije saponificirao dobije se količina NaOH koja se saponificirala sa masnim kiselinama u uzorku masti. Ako je rađeno sa tačno 1 g masti dobijena masa NaOH izražena u miligramima, predstavlja saponifikacijski broj, a ako to nije slučaj preračunati na 1g. 3. ZADACI I VJEŽBE -Odgovorite na slijedeća pitanja: 1. Koji od navedenih pokazatelja karakteriše stepen nezasićenosti masnih kiselina: a) esterski broj b) jodni broj c) saponifikacijski broj d) kiselinski broj 2. Koji od navedenih pokazatelja daje mogućnost da se odredi sadržaj slobodnih masnih kiselina u nuetralnim mastima: a) saponifikacioni broj b) jodni broj c) kiselinski broj d) esterski broj 30

32 3. Odredite jodni broj ulja ako njegova masa iznosi 0,375g i ako se za titraciju ove mase utroši 5,8 ml rastvora hiposulfita (0,05 mol/l) u kontroli i 3,8 ml u eksperimentu? 4. Odredite kiselinski broj ulja čija je masa 0,2521g i ako se za titraciju ove mase utroši 1,2 ml (0,01 mol/l) rastvora kalijhidroksida? 5. Zašto je proces saponifikacije pomoću alkoholnih rastvora baza brža u odnosu na vodene rastvore baza? 31

33 1. REZULTATI Određivanje saponifikacijskog broja OVJERA VJEŽBE: 32

34 Vježba broj 6 IZOLACIJA OLEINSKE KISELINE IZ MASLINOVOG ULJA 1. TEORETSKI DIO Plodovi maslina imaju mesnate plodove pune ulja, a iznutra sjemenke, u kojima također ima ulja, ali slabijeg kvaliteta. Maslinovo ulje dobiva se postupkom mljevenja (gnječenja) i presanja zrelih plodova masline. Proces proizvodnje maslinovog ulja odvija se u dvije faze. U prvoj fazi se zdravi plod masline drobi gnječenjem, a potom se u drugoj fazi presanjem smjese zdrobljenih plodova cijedi čisto maslinovo ulje. Hladno presanje je najčistija tehnologija obrade maslina. Maslinovo ulje se prema kvaliteti dijeli na nekoliko vrsta: o Ekstra djevičansko maslinovo ulje (olio di oliva extravergine) dobija se nakon prvog presanja zdravog ploda masline, a kiselost mu ne prelazi 0,8 % ( izraženo u oleinskoj kiselini) Uz zadovoljenje hemijskih parametara, ulje mora još proći organoleptičku provjeru i ne smije imati niti jedan miris koji nije svojstven ulju. o Djevičansko ulje (vergine) se dobiva nakon prvog presanja slabijeg ploda masline, pa mu je kiselost u odnosu na ekstra djevičansko ulje nešto veća, ali sadržaj masnih kiselina ne prelazi 2 %. o Maslinovo ulje se dobiva miješanjem rafiniranog ulja i određene količine ekstra djevičanskog ulja koje poboljšava boju i okus, a kiselost ovako proizvedenog ulja je oko 5 %. o Sansa ulje ( olio di sansa) se dobija hemijskim izdvajanjem iz krutih ostataka ploda masline nakon presanja. Ovako proizvedeno ulje je slabije kvalitete, ali se može koristiti za prženje. Maslinovo ulje karakterizira ugodna i jedinstvena aroma koja potječe od različitih sastojaka (vitamina E, fenola, hidrokarbon a, sterola, aromatičnih tvari) koji su prisutni u vrlo malim količinama. Najveći dio ulja (više od 95%) čine masne kiseline, od kojih je najzastupljenija mononezasićena oleinska kiselina (65 85%), zbog koje je maslinovo ulje najzdravije i ujedno najstabilnije. Nezasićene masne kiseline smanjuju tzv. loši holesterol ili LDL holesterol, a oleinska još povisuje koncentraciju HDL - lipoproteina. Pored toga, oleinska kiselina djeluje još i antitrombotično. Dobro je poznato blagotvorno djelovanje maslinovog ulja na sluznicu želuca. Također je svakodnevna upotreba maslinovog ulja preporučljiva u prevenciji različitih vrsta raka (debelog crijeva, dojke, prostate), te u prevenciji kardiovaskularnih bolesti. Pored toga, zbog velikog sadržaja polifenola, te alfa - tokoferola i beta - karotena, maslinovo ulje se ubraja u namirnice sa snažnim antioksidativnim djelovanjem. Također, povećava imunitet i omogućuje odbranu organizma od upalnih procesa. Djelovanje maslinovog ulja na kožu je također blagotvorno. Omogućava koži dugo zadržavanje vode i tako spriječava suhoću kože, ali i brže cijeljenje rana. Uobičajeni postupak pripreme viših masnih kiselina jest alkalna hidroliza triacilglicerola. Na taj način kuhanjem maslinova ulja s etanolskom otopinom kalij-hidroksida najprije se dobije kalij-oleat (sapun), koji se zatim dodavanjem mineralne kiseline prevodi u slobodnu kiselin u. Alkalna hidroliza triacilglicerola jest nukleofilna supstitucija, u kojoj hidroksilni ion djeluje kao nukleofil. Sustavno ime oleinske kiseline je cis-odnosno (Z) -9-oktadecenkiselina. U 33

35 prisustvu katalizatora tipa slobodnih radikala ta kiselina izomerizira u trans-odnosno (E)-oblik koji se naziva elaidinska kiselina Slika 6: Hemijska formula oleinske i elaidinske kiseline 2. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni reagensi: - Maslinovo ulje - KOH - Etanol - HCl:voda - Eter - Na 2 SO 4, bezvodni Na tikvici s okruglim dnom se pripremi otopina 3g KOH u 35ml etanola. U slučaju da se KOH ne rastvara, potrebno je smjesu zagrijati u ključalom vodenom kupatilu. U malo ohlađenu smjesu se doda 10,5 ml (10g) maslinovog ulja. Zaostalo ulje sa stijenki menzure ispere se u tikvicu s pomoću 5ml etanola. Na tikvicu se stavi povratno hladilo i zagrijava 1 sat na vodenom kupatilu. Zatim se sadržaj tikvice razrijedi s 30ml vode i prebaci u lijevak za odvajanje. Nakon što se ohladila na sobnu temperaturu, otopini kalij-oleata se dodaje vodena otopina hloridne kiseline (1:1) do ph 1-2 (približno 25ml ). Pritom se sirove masne kiseline izdvoje kao gornji uljasti sloj. Sadržaj lijevka se izmućka s 30ml etera. Nakon odvajanja gornjega eterskog sloja, iz vodenog se sloja ostatak masnih kiselina izdvaja s još 20ml etera. Vodeni sloj se odbaci, a sjedinjeni se eterski ekstrakti u lijevku ispiru vodom do neutralne reakcije. Isprani sloj se suši 15min u erlenmajerovoj tikvici s bezvodnim natrij-sulfatom. Dobijena sirova oleinska kiselina se dekantira u vaganu tikvicu. Literaturni prinos: 8,5g T.t.= 13,4 o C 34

36 3. ZADACI I VJEŽBE 1. Odredite molarni odnos između lipida i proteina u membrani koja sadrži 40% lipida i 60% proteina, ako srednja molekulska masa lipida iznosi 800, a proteina 50000? 2. Odredite molekulsku masu nepoznate monokarbonske kiseline ako se pri titraciji 10mg ove kiseline utroši 3,5 ml alkoholnog rastvora 0,01 mol/l natrijhidroksida? 3. U kojim se ćelijskim djelovima vrši oksidacija masnih kiselina: a) jedru b) mitohondrijama c) ribozomima d) citoplazmi 4. Na koji način se vrši razgradnja viših masnih kiselina: a) redukcijom b) ω-oksidacijom c) α-oksidacijom d) β-oksidacijom 35

37 5. U sastav kojih neutralnih masti (triglicerida) ulazi linoleinska i linolna kiselina: a) palminog ulja b) lanenog ulja c) suncokretovog ulja d) ulja konoplje e) svinjskog sala 4. REZULTATI - Masa dobijene sirove oleinske kiseline je. OVJERA VJEŽBE 36

38 Vježba broj 7 KVALITATIVNO ODREĐIVANJE AMINOKISELINA I PROTEINA 1. TEORETSKI DIO Aminokiseline su organske kiseline koje u svojoj molekuli sadrže najmanje jednu amino i jednu karboksilnu grupu. Prema broju karboksilnih, odnosno amino-grupa aminokiseline dijelimo na: Monoamino-monokarboksilne koje se dalje dijele na alifatske nerazgranate (glicin, alanin, β-alanin, α-aminobuterna kiselina, γ-aminobuterna kiselina, norvalin, norleucin); alifatske razgranate (valin, leucin, izoleucin); oksiaminokiseline (serin, treonin); tioaminokiseline (cistein, cistin, metionin); ciklične aminokiseline (fenil - alanin, tirozin, triptofan, histidin, prolin, oksiprolin). Monoamino-dikarboksilne kiseline (asparaginska, glutaminska, oksiglutaminska) Diamino-monokarboksilne kiseline (ornitin, citrulin, arginin, lizin, oksilizin). Prema sposobnosti ljudskog organizma da ih sintetizira dijelimo ih u dvije grupe: Esencijalne koje moramo stalno unositi putem hrane (valin, leucin, izol eucin, metionin, treonin, fenilalanin, triptofan, lizin, arginin i histidin) Neesencijalne koje organizam sam sintetizira Opšte osobine aminokiselina Rastvorljivost - Prirodne aminokiseline su kristalne i bezbojne supstance. Sve su osim prolina i oksiprolina rastvorljive u vodi, a ne u alkoholu i drugim organskim rastvaračima. Amfoterne osobine aminokiselina - Zbog toga što imaju amino i karboksilnu grupu tj. baznu i kiselu komponentu pri dodatku baze reagira amino kraj dipola (NH + 3 ), a pri dodatku kiseline reagira karboksilni kraj dipola (COO - ). Prema tome aminokiseline su amfoterna jedinjenja. Vrijednost izoelektrične tačke se dobije ako se vrijednosti negativnog logaritma konstante disocijacije kisele (pk 1 ) i bazne komponente (pk 2 ) saberu i podijele sa dva. Optička aktivnost - Sve prirodne aminokiseline osim glicina, β-alanina, γ- aminobuterne kiseline imaju jedan ili više asimetričnih C-atoma u molekuli pa su optički aktivne supstance. Konfiguracija aminokiselina - Sve prirodne aminokiseline imaju lijevu konfiguraciju (L). 37

39 Reaktivnost aminokiselina - Aminokiseline stupaju u reakcije s čitavim nizom jedinjenja, pri čemu nastaju derivati, pom oću kojih se neke aminokiseline mogu identificirati, druge se kvantitativno određuju, a neke od njih se mogu izolirati. Kao amfoterna jedinjenja reaguju sa jakim kiselinama i bazama pri čemu nastaju soli. Opšta hemijska svojstva su povezana prisutnošću karboksilne i amino grupe, a s druge strane prisutnost reaktivnog R ostatka objašnjava specifična svojstva pojedinih aminokiselina. Reakcije karakteristične na karboksilnoj grupi su: Esterifikacija alkoholima u prisustvu jakih kiselina Reakcija dekarboksilacije i nastajanje amina (moguća je hemijskim i enzimskim putem) Stvaranje amida (reakcija aminokiselina sa aminima) Reakcije karakteristične na amino grupi su: Dezaminacija (sa nitratnom kiselinom, uz nastajanje kiseline (alkohola) i oslobađanje nitrogena) Stvaranje imina (kondenzacijom sa aromatskim aldehidima) Reakcije sa fenilizotiocijanatom u baznoj sredini Denziliranje aminokiselina sa denzilhloridom pri čemu nastaje fluorescentni derivat. 38