Μελέτη των επιγενετικών παθογενετικών μηχανισμών στη Μυελοΐνωση

Transcript

1 ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ 2014 Μελέτη των επιγενετικών παθογενετικών μηχανισμών στη Μυελοΐνωση Κατερίνα Ζώη Εργαστήριο Αιματολογίας Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών Ανδρέας Γιαννόπουλος Εργαστήριο Αιματολογίας Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών Χριστίνα Ζώη Εργαστήριο Αιματολογίας Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών Δεκέμβριος 2014

2 Εισαγωγή Χρόνιες Μυελοϋπερπλαστικές Νεοπλασίες (ΧΜΥΝ) Οι χρόνιες μυελοϋπερπλαστικές νεοπλασίες (ΧΜΥΝ) είναι κλωνικές διαταραχές του αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου όπου παρατηρείται άμετρος και άσκοπος κλωνικός πολλαπλασιασμός των κυττάρων της μυελικής, και σπανιότερα των άλλων, αιμοποιητικών σειρών με σχετικά φυσιολογική ωρίμανση. Ο πολλαπλασιασμός αυτός οδηγεί σε αυξημένο αριθμό κοκκιοκυττάρων, ερυθροκυττάρων ή αιμοπεταλίων στο περιφερικό αίμα. Στις ΧΜΥΝ περιλαμβάνονται η ιδιοπαθής θρομβοκυτταραιμία, η αληθής πολυκυτταραιμία, η πρωτοπαθής μυελοΐνωση και η χρόνια μυελογενής λευχαιμία. Οι διαταραχές αυτές ομαδοποιήθηκαν με βάση τις ομοιότητες στον κλινικό φαινότυπο και την πεποίθηση ότι υπήρχε ένα υποκείμενο ανεξερεύνητο ερέθισμα, υπεύθυνο για την πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των κυττάρων του μυελού των οστών σε αυτά τα νοσήματα. Σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, ΠΟΥ (World Health Organization, WHO) για το 2008, τα ΧΜΥΝ διαιρούνται πλέον στις κλασσικές Μυελοϋπερπλαστικές Νεοπλασίες που φέρουν το χρωμόσωμα Φιλαδέλφεια (Philadelphia chromosome, Ph(+)) (Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία) και στις κλασσικές Μυελοϋπερπλαστικές Νεοπλασίες που δεν φέρουν το Χρωμόσωμα Φιλαδέλφεια (ΜΥΝ Ph( )) και στις οποίες περιλαμβάνονται η ιδιοπαθής θρομβοκυτταραιμία (ΙΘ), η αληθής πολυκυτταραιμία (ΑΠ) και η πρωτοπαθής μυελοΐνωση (ΠΜΙ). Στις ΜΥΝ Ph( ) ταξινομείται και μία άλλη κατηγορία ασθενών που παρουσιάζουν παρόμοιο άμετρο πολλαπλασιασμό, σε συνδυασμό με διάφορες μορφές δυσπλασίας μιας ή περισσότερων αιμοποιητικών σειρών οι διαταραχές αυτές χαρακτηρίζονται ως μυελοϋπερπλαστικές νεοπλασίες/ μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΥΝ/ΜΔΣ) (1). Τα ΧΜΥΝ αποτελούν ίσως την πιο συχνή διάγνωση αιματολογικών νεοπλασιών στο σύνολο του πληθυσμού και συνήθως επηρεάζουν τους ενήλικες μεγαλύτερης ηλικίας. Οι περιπτώσεις ανηλίκων που παρουσιάζουν ανάλογα νοσήματα είναι σπάνιες. Σύμφωνα με μια πρόσφατη έρευνα του NAACCR (North American Association of Central Cancer Registries), που περιλαμβάνει το 82% του πληθυσμού των Ηνωμένων Πολιτειών, η συχνότητα των ΜΥΝ υπολογίστηκε σε 2,1/ άτομα για το χρονικό διάστημα , ενώ το 2004 διαγνώσθηκαν 6328 νέα περιστατικά στο σύνολο του πληθυσμού (2). Επιπλέον, είναι πολύ πιθανό, ότι εξαιτίας της ήπιας κλινικής εικόνας των ΧΜΥΝ κατά την έναρξη της νόσου, πολλά περιστατικά δεν έχουν καταχωρηθεί ή διαγνωσθεί. Σύμφωνα με την παραπάνω μελέτη, σε σύνολο ασθενών με διάγνωση ΜΥΝ, το 45% παρουσίαζε ΑΠ, το 24% ΙΘ και το 10% ΠΜΙ. Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί τεράστια πρόοδος στην κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών της παθογένειας των ΜΥΝ που περιλαμβάνουν είτε επίκτητες αμοιβαίες χρωμοσωμικές μεταθέσεις είτε την ύπαρξη σημειακών μεταλλάξεων τόσο σε γονίδια κινασών της τυροσίνης όσο και σε γονίδια που μετέχουν στην επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Το 2005 χαρακτηρίστηκε η επίκτητη σωματική μετάλλαξη V617F στο εξόνιο 14 του γονιδίου JAK2 (3,4,5,6,7). Η μετάλλαξη αυτή, που θέτει την κινάση JAK2 σε κατάσταση συνεχούς δραστηριοποίησης και οδηγεί σε συνεχή πολλαπλασιασμό των αιμοποιητικών κυττάρων, ανευρίσκεται στο 95% τουλάχιστον των περιπτώσεων με ΑΠ και στο 50% των περιπτώσεων με ΙΘ και ΜΙ (8). Τα επόμενα έτη αναδείχθηκαν νέες μεταλλάξεις, όπως της MPLW515K/L στο γονίδιο του υποδοχέα της θρομβοποιητίνης MPL, που 1

3 ανευρίσκεται στην ΜΙ σε ποσοστό 5 10% (και σπανιότερα στην ΙΘ) (9), καθώς και οι μεταλλάξεις στο εξόνιο 12 στο γονίδιο JAK2, που είναι περισσότερο ειδικές στην ΑΠ αλλά σε μικρότερα ποσοστά (10). Επιπλέον, πρόσφατα, από δυο ανεξάρτητες ομάδες, δημοσιεύθηκε η ύπαρξη μεταλλάξεων στο εξόνιο 9 του γονιδίου της καλρετικουλίνης (CALR). Οι μεταλλάξεις στο εξόνιο 9 του γονιδίου της CALR ανιχνεύονται σε ποσοστό 70 85% των ασθενών με ΙΘ και ΜΙ που είναι αρνητικοί για τις μεταλλάξεις JAK2V617F ή MPLW515L/K (11,12). Επίσης, οι ίδιες μεταλλάξεις εντοπίζονται σε μικρό αριθμό ασθενών με μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο (8%) αλλά χαρακτηριστικά όχι στην αληθή πολυκυτταραιμία, γεγονός που υπερτονίζει την αμοιβαία αποκλειόμενη φύση των τριών μεταλλάξεων. Να σημειωθεί ότι κανένας ασθενής θετικός για τις JAK2V617F ή MPLW515L/K δεν ήταν θετικός για μεταλλάξεις στο γονίδιο της CALR (11,12). Η διαδικασία της νεοπλασματικής εξαλλαγής δεν έχει ακόμη διαλευκανθεί, υπάρχουν όμως ενδείξεις ότι με κάποιο τρόπο ενεργοποιείται και πάλι η οδός μεταγωγής σήματος JAK/STAT. Οι ασθενείς με ΙΘ που φέρουν μεταλλάξεις στο γονίδιο της CALR εμφανίζουν μικρότερο κίνδυνο θρομβώσεων και μεγαλύτερη επιβίωση, πιθανότατα λόγω των χαμηλότερων τιμών αιματοκρίτη και λευκών αιμοσφαιρίων σε σύγκριση με ασθενείς που είναι θετικοί για τη μετάλλαξη JAK2V617. Ο αριθμός των αιμοπεταλίων, αντιθέτως, είναι μεγαλύτερος (12). Ωστόσο, παρά το γεγονός ότι η μετάλλαξη JAK2V617F φαίνεται να παίζει κυρίαρχο ρόλο στην παθογένεια των ΜΥΝ, μάλλον αποτελεί δευτερεύον γεγονός. Ενδεχομένως, περισσότερη σημασία φαίνεται να έχουν διάφορες μεταλλάξεις που απαντώνται συχνότερα σε γονίδια που εμπλέκονται ή μετέχουν στην επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν διαδικασίες όπως η μεθυλίωση και η απομεθυλίωση του DNA, η μεθυλίωση των ιστονών και μη ιστονών πρωτεϊνών, καθώς και άλλες διεργασίες. Συγκεκριμένα: 1. Η μεθυλίωση του DNA, είναι ο μηχανισμός που επιτελεί την αποσιώπηση συγκεκριμένων γονιδίων στόχων και παρατηρείται κατά κύριο λόγο στις νησίδες CpG. Το γονίδιο DNMT3A, συντρέχει στην μεθυλίωση των γονιδίων αυτοανανέωσης των στελεχιαίων αιμοποιητικών κυττάρων (hematopoietic stem cells, HSCs), προκειμένου να προαχθεί η διαφοροποίησή τους, όταν οι συνθήκες το απαιτούν. Κατά συνέπεια, όταν το γονίδιο που κωδικοποιεί το παραπάνω ένζυμο υποστεί μία μετάλλαξη με απώλεια της λειτουργίας της αντίστοιχης πρωτεΐνης, η διαφοροποίηση των προαναφερθέντων κυττάρων αποτρέπεται ενώ ο πολλαπλασιασμός τους προάγεται ανεξέλεγκτα. 2. Επιπλέον, μεταλλάξεις απαντώνται και σε γονίδια που μετέχουν στην απομεθυλίωση του DNA, διαδικασία που μπορεί να είναι παθητική ή ενεργητική και που εμπλέκεται στις φυσιολογικές λειτουργίες του κυττάρου, ενώ η απορρύθμισή της επηρεάζει σαφώς την ομοιόστασή του. Χαρακτηριστικές είναι οι μεταλλάξεις στο γονίδιο ΤΕΤ2, που κωδικοποιεί ένα από τα μέλη της οικογένειας τριών ενζύμων, υπεύθυνων για τη μετατροπή της 5 μεθυλοκυτοσίνης (5 mc) σε 5 υδροξυμεθυλοκυτοσίνη (5 hmc). Η ισορροπία μεταξύ των δύο τελευταίων είναι ιδιαίτερα σημαντική για την εξισορρόπηση μεταξύ πολυδυναμικότητας των κυττάρων και της δέσμευσής τους προς μία συγκεκριμένη κυτταρική σειρά (13). 3. Τέλος, μεταλλάξεις απαντώνται σε γονίδια που μετέχουν στη μεθυλίωση των ιστονών πρωτεϊνών. Η μεθυλίωση των μορίων λυσίνης και αργινίνης σε ιστόνες και μη ιστόνες πρωτεΐνες ρυθμίζει τη δομή της χρωματίνης και κατ επέκταση τη γονιδιακή έκφραση. Τα στοιχεία Polycomb (PcG), που απαρτίζονται από ομάδες πρωτεϊνών καταστολέων, ρυθμίζουν την προσβασιμότητα των ρυθμιστικών περιοχών των γονιδίων, στο μεταγραφικό μηχανισμό. 2

4 Η πρωτεΐνη EZH2, σε συνδυασμό με τις SUZ12 και EED, καθώς και με τους συμπαράγοντες RBBP4, RBBP7 και AEBP2, απαρτίζουν από κοινού το κατασταλτικό σύμπλοκο polycomb 2 (PRC2), που μεθυλιώνει την ιστόνη Η3 στα μόρια λυσίνης 9 και 27 (Η3Κ9 και Η3Κ27). Η τριπλή μεθυλίωση των συγκεκριμένων ιστονών πρωτεϊνών (H3K9me3, H3K27me3) αποτελεί σημάδι μεταγραφικής καταστολής γονιδίων που παίζουν ρόλο στη δέσμευση των στελεχιαίων κυττάρων, καθώς και την αυτοανανέωσή τους. Μεταλλάξεις που οδηγούν σε απώλεια λειτουργικότητας έχουν αναφερθεί στο γονίδιο EZH2, και λιγότερο στα γονίδια SUZ12, EED και JARID2. Επιπλέον το PRC2 υποβοηθά την πρόσδεση των στοιχείων που απαρτίζουν τις DNMTs, στα γονίδια που πρόκειται να κατασταλούν (14,15,16). Επίσης μεταλλάξεις έχουν περιγραφεί και στο γονίδιο ASXL1, που αποτελεί μέλος των στοιχείων PcG (16). Η πρωτεΐνη ASXL1 σχετίζεται με τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που μετέχουν στην ανάπτυξη μέσω αναδιαμόρφωσης της δομής της χρωματίνης. Επιπλέον, συμμετέχουν στην καταστολή της έκφρασης των υποδοχέων του ρετινοϊκού οξέος (retinoic acid receptors, RARs) και αλληλεπιδρούν με τους γαμα ενεργοποιημένους υποδοχείς πολλαπλασιασμού των περοξισωμάτων (peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARG), προς καταστολή της λιπογένεσης. Η πρωτεΐνη ASXL1 εκφράζεται στα περισσότερα αιμοποιητικά κύτταρα, όμως η πλήρης λειτουργία της παραμένει αδιευκρίνιστη, ωστόσο πρόσφατα πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι απώλεια της λειτουργείας της έχει ως αποτέλεσμα απώλεια της σήμανσης H3K27me3 σε υποκινητές γονιδίων του κυττάρου. Τέλος, αποτελεί μη καταλυτικό στοιχείο του συμπλόκου PR DUB που συμμετέχει στην απο ουβικιουτίνωση της λυσίνης 119 της ιστόνης H2A (H2AK119ub1) (17). Πρόσφατες μελέτες καταδεικνύουν ότι η παρουσία μεταλλάξεων στα γονίδια EZH2 και ASXL1 σχετίζεται με πολύ κακή πρόγνωση και με πολύ υψηλότερο κίνδυνο πρόωρης λευχαιμικής εκτροπής σε ασθενείς με μυελοΐνωση (18,19). Επιπλέον, μετά την περιγραφή των μεταλλάξεων στο εξόνιο 9 της CALR, η μελέτη των Tefferi και συνεργατών προτείνει ένα καινούργιο προγνωστικό μοντέλο για την αξιολόγηση του κινδύνου πρόωρης λευχαιμικής εκτροπής σε ασθενείς με μυελοΐνωση. Συγκεκριμένα, οι ασθενείς που φέρουν μεταλλάξεις στο γονίδιο της CALR και είναι αρνητικοί για μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1 φαίνεται να έχουν την καλύτερη δυνατή πρόγνωση, ενώ εκείνοι οι ασθενείς οι οποίοι φέρουν μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1 και είναι αρνητικοί για μεταλλάξεις στο γονίδιο της CALR έχουν τη χειρότερη πιθανή πρόγνωση με το μικρότερο ποσοστό επιβίωσης. Επιπλέον, οι ασθενείς που φέρουν μεταλλάξεις τόσο στο γονίδιο της CALR όσο και στο γονίδιο ASXL1, ως και οι ασθενείς που δεν έχουν μεταλλάξεις στα δύο αυτά γονίδια, κατατάσσονται σε μια κατηγορία ενδιάμεσου κινδύνου σε σχέση με τις δυο προηγούμενες κατηγορίες ασθενών (20). Στόχος της μελέτης Με το σκεπτικό ότι η διαφορά της κλινικής βαρύτητας των ASXL1 θετικών σε σύγκριση με τις ASXL1 αρνητικές περιπτώσεις μυελοΐνωσης μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικές (ποιοτικές ή ποσοτικές) διαταραχές των επιγενετικών μηχανισμών που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση, η παρούσα εργασία εστιάσθηκε στην μελέτη και σύγκριση των μηχανισμών αυτών σε ασθενείς με μυελοΐνωση και σε φυσιολογικά άτομα, καθώς και σε ασθενείς με μυελοΐνωση και μεταλλάξεις στα γονίδια EZH2 και ASXL1 σε σχέση με ασθενείς με μυελοϊνωση αλλά χωρίς μεταλλάξεις στα παραπάνω γονίδια. Δείγματα ασθενών της κατηγορίας αυτής είχαν ήδη συγκεντρωθεί και μελετηθεί για άλλες μεταλλάξεις στο 3

5 εργαστήριό μας. Στα δείγματα αυτά αναζητήθηκαν επίσης μεταλλάξεις στο εξόνιο 9 του γονιδίου της CALR. Συνοπτικά ακολουθήθηκαν τα παρακάτω στάδια: 1. Χαρακτηρισμός και επιλογή κλινικού υλικού, οπότε και πραγματοποιήθηκε: α. Μοριακή διερεύνηση για την ύπαρξη μεταλλάξεων στο εξόνιο 9 του γονιδίου της CALR με τη μέθοδο HRM A (High Resolution Melting curve Analysis) β. Μοριακή διερεύνηση για την ύπαρξη μεταλλάξεων στο εξόνιο 12 του γονιδίου ASXL1 με τη μέθοδο HRM A (High Resolution Melting curve Analysis) γ. Προσδιορισμός αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (Sanger Sequencing). 2. Μελέτη της μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων, με: α. Υπολογιστική ανάλυση δεδομένων (in silico data mining), β. Ποιοτική ανάλυση μεθυλίωσης με τη μέθοδο MS HRM (Methyl Specific High Resolution Melting curve Analysis), γ. Ποσοτική ανάλυση μεθυλίωσης με τη μέθοδο MSRE PCR (Methyl Specific Restriction Enzyme PCR) και δ. Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση μεθυλίωσης με τη μέθοδο της πυροαλληλούχισης (Pyrosequencing). 3. Μελέτη των αλλαγών στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης ασθενών με ΜΙ, με: α. Αλληλούχιση μεταγραφήματος ασθενών με ή χωρίς μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1, και αλληλούχιση του μεταγραφήματος 1 υγιούς δότη, β. Βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων. Μεθοδολογία 1. Επιλογή κλινικού υλικού Τα δείγματα ασθενών που μελετήθηκαν περιλαμβάνουν 7 ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο EZH2, 18 ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1, 2 ασθενείς με μεταλλάξεις και στα δύο αυτά γονίδια, 45 ασθενείς με μυελοΐνωση αδιευκρίνιστου γονότυπου (προς χαρακτηρισμό των μεταλλάξεων CALR και ASXL1), καθώς και 6 δείγματα φυσιολογικών ατόμων ως αντιπαραβολή. Τα δείγματα αυτά έχουν μελετηθεί και χαρακτηριστεί κατά το παρελθόν από το εργαστήριο Αιματολογίας του ΙΙΒΕΑΑ. Σημειώνεται ότι για όλους τους ασθενείς καθώς και τους υγιείς δότες που μελετήθηκαν υπήρχε ήδη έγγραφη συγκατάθεση, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι Μοριακή διερεύνηση για την ύπαρξη μεταλλάξεων στο εξόνιο 9 του γονιδίου της CALR και στο εξόνιο 12 του γονιδίου ASXL1 με τη μέθοδο HRM A (High Resolution Melting curve Analysis) Για το χαρακτηρισμό νέων δειγμάτων ως προς την ύπαρξη ήδη γνωστών μεταλλάξεων για τα γονίδια CALR και ASXL1 αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα ανίχνευσης, με χρήση της τεχνικής HRM A. Οι αλληλουχίες των γονιδίων που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των παραπάνω γονιδίων (CALR, NG_ , ASXL1, NG_ ) προέρχεται από τη βάση δεδομένων NCBI (26). Το σύνολο των μεταλλάξεων που έχουν ανιχνευτεί και δημοσιευτεί έως σήμερα, στα υπό μελέτη γονίδια περιλαμβάνονται στη βάση δεδομένων COSMIC (27). 4

6 Θέση (Position) Μετάλλαξη (στην κωδικοποιούσα αλληλουχία, CDS) Μετάλλαξη (στην αμινοξική ακολουθία, AA) Διακριτικό στη βάση δεδομένω ν (COSM ID) 367 c.1092_1143del52 p.l367fs* c.1154_1155insttgt C p.k385fs* c.1091_1142del52 p.e364fs* c.1102_1135del34 p.k368fs* c.1095_1140del46 p.l367fs* Φορές που έχει αναφερθε ί (Counts) Τύπος μετάλλαξη ς (Type) Deletion Frameshift Insertion Frameshift Deletion Frameshift Deletion Frameshift Deletion Frameshift Πίνακας 1. Οι πιο κοινές μεταλλάξεις για το γονίδιο CALR, που έχουν ανιχνευτεί έως σήμερα, όπως καταγράφεται στη βάση δεδομένων COSMIC (adopted) (27). Θέση (Position ) Μετάλλαξη (στην κωδικοποιούσα αλληλουχία, CDS) Μετάλλαξη (στην αμινοξική ακολουθία, AA) Διακριτικό στη βάση δεδομένων (COSM ID) Φορές που έχει αναφερθεί (Counts) Τύπος μετάλλαξης (Type) 1934 c.1934_1935insg p.g646fs* Insertion 1900 c.1900_1922del2 3 p.e635fs* Deletion 3306 c.3306g>t p.e1102d c.2077c>t p.r693* Substitutio n Substitutio n 1772 c.1772_1773insa p.y591fs* Insertion c.1902_1924del2 3 c.1888_1910del2 3 p.e635fs* Deletion p.e635fs* Deletion 1830 c.1830c>t p.g610g Substitutio n 1934 c.1934_1934delg p.g645fs* Deletion 1888 c.1888_1909del2 2 p.h630fs* Deletion Πίνακας 2. Οι πιο κοινές μεταλλάξεις για το γονίδιο ASXL1, που έχουν ανιχνευτεί έως σήμερα, όπως καταγράφεται στη βάση δεδομένων COSMIC (adopted) (27). Για τις περιοχές όπου εντοπίζονται οι παραπάνω μεταλλάξεις σχεδιάστηκαν ζεύγη εκκινητών (Giannopoulos et. al in preparation), τα οποία αναλύθηκαν ως προς την ικανότητά τους να 5

7 επεκτείνουν το υπόστρωμα σε διάφορες θερμοκρασίες με gradient PCR και ακόλουθη ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι περιοχές αυτές μπορεί να είναι είτε φυσιολογικές, είτε να περιέχουν κάποια από τις παραπάνω μεταλλάξεις. Το ποσοστό φυσιολογικών προς μεταλλαγμένων αλληλουχιών είναι κυμαινόμενο και μπορεί να εξαρτάται από το δείγμα, καθώς και από την έκταση της μετάλλαξης στον συνολικό πληθυσμό των κυττάρων του ασθενούς. Η ανάλυση των προϊόντων της επέκτασης με PCR μπορεί να γίνει μεταγενέστερα σε πήκτωμα αγαρόζης, όταν η μετάλλαξη επηρεάζει αρκετά νουκλεοτίδια. Όταν όμως αφορά σε σημειακές μεταλλάξεις προσθήκης/αφαίρεσης ή αντικατάστασης νουκλεοτιδίων, τότε απαιτούνται πιο ευαίσθητες τεχνικές για την ανίχνευσή τους. Η μελέτη της καμπύλης τήξης των προϊόντων της PCR (HRM PCR) είναι μία πολύ ευαίσθητη τεχνική (με ποσοστό ευαισθησίας έως και 5%) που υπό κατάλληλες συνθήκες μπορεί να ανιχνεύσει και τις πιο δύσκολες περιπτώσεις μεταλλάξεων όπως είναι η αντικατάσταση μίας βάσης από μία άλλη. Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε για τις αναλύσεις είναι o θερμικός κυκλοποιητής LightCycler 480 (Roche Life Sciences), ο οποίος μπορεί να παρακολουθεί σε πραγματικό χρόνο τη σύνθεση των προϊόντων. Με το πέρας ενός αντίδρασης ανιχνεύει σε μικρό χρονικό διάστημα και χωρίς καμία επιπλέον τεχνική και αναλώσιμα, την ύπαρξη ή μη μεταλλάξεων. Τα προϊόντα που έχουν συντεθεί ταξινομούνται σε διακριτές κατηγορίες με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού προγράμματος. Για την επιβεβαίωση των νέων μεταλλάξεων για το γονίδιο CALR πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός αλληλουχίας κατά Sanger, ενώ το ίδιο πραγματοποιήθηκε και για την επιβεβαίωση των γνωστών μεταλλάξεων τόσο για το γονίδιο CALR όσο και για το ASXL1. 2. Μελέτη της μεθυλίωσης υποκινητών γονιδίων 2.1. Υπολογιστική ανάλυση δεδομένων (in silico data mining) Έχει πραγματοποιηθεί υπολογιστική ανάλυση δεδομένων, η οποία περιλαμβάνει εκτενή διαδικασία ανάλυσης των δικτύων αλληλεπίδρασης που σχηματίζουν οι πρωτεΐνες ASXL1 και EZH2, με άλλα στοιχεία του κυττάρου. Ως εκ τούτου, πριν ξεκινήσει η πειραματική διαδικασία, θα πρέπει πρώτα να υπάρξει μία συρρίκνωση των πιθανών γονιδίων στόχων, δεδομένου ότι δεν είναι εφικτή η μελέτη του πλήρους γονιδιώματος, λόγω μεγέθους (> γονίδια), με συμβατικές τεχνικές. Η ανάλυση αυτή περιλαμβάνει εύρεση και συσχέτιση των πληροφοριών (data mining) που υπάρχουν διαθέσιμες στο διαδίκτυο, σε ιστότοπους, όπως NCBI, STRING, INTACT (του EMBL ΕΒΙ), UNIPROT, BIOCARTA, που ασχολούνται με τη μελέτη των δικτύων αλληλεπίδρασης των γονιδιακών προϊόντων του κυττάρου και με την επίδραση αυτών σε συγκεκριμένους γενετικούς τόπους Προετοιμασία δειγμάτων αναφοράς (control samples) Ως δείγματα αναφοράς της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν : Πλήρες μεθυλιωμένο γονιδίωμα ανθρώπου. Η ενζυμική μεταφορά μεθυλομάδων στη θέση 5, του δακτυλίου της κυτοσίνης (5mC), όταν η τελευταία ακολουθείται από μία βάση γουανίνης (CpG) επιτελείται από το ένζυμο CpG μεθυλτρανσφεράση (M.SssI) (NEB, M0226S). Πλήρες μη μεθυλιωμένο γονιδίωμα ανθρώπου. Η διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε αφορά στην τεχνητή (in vitro) επέκταση ολόκληρου του γονιδιώματος (multiple displacement whole genome amplification, WGA) με χρήση του ενζύμου phi29 DNA Polymerase (NEB, M0269S). 6

8 Τυχαίες εξαμερείς αλληλουχίες (Exo Resistant Random Primer, 5' NpNpNpNpNpSNpSN 3') (Thermo Scientific, SO181), οι οποίες ανθίστανται της 3 5 δράσης εξονουκλεάσης του ενζύμου, ενσωματώνονται σε πολλαπλές θέσεις στο γονιδίωμα. Έτσι καθίσταται δυνατή η επέκτασή του έως και 1000 φορές. Καθώς, το ένζυμο δεν έχει τη δυνατότητα να εισάγει μεθυλομάδες στο γονιδίωμα που συνθέτει, αυτό οδηγεί στη δόμηση πλήρως μημεθυλιωμένου υποστρώματος, κατάλληλου για χρήση ως πρότυπου για περαιτέρω μελέτες (21) Ποιοτική ανάλυση με MS HRM (Methyl Specific High Resolution Melting curve analysis) Η προσέγγιση αυτή περιλάμβανε την επεξεργασία των υποστρωμάτων και των δειγμάτων αναφοράς, με δισουλφίδιο του νατρίου (EZ DNA Methylation Gold Kit, D5005, Zymo Research), ενίσχυση με Real Time PCR και ανάλυση με προσδιορισμό της καμπύλης τήξης των προϊόντων για την ύπαρξη μεθυλίωσης στους υποκινητές των γονιδίων EED, SUZ12 και STAT3 (LightCycler 480 High Resolution Melting Master, , Roche Life Science) (22). Η επεξεργασία του DNA με δισουλφίδιο του νατρίου οδηγεί στην εκτίμηση της διαφορικής μεθυλίωσης των υποστρωμάτων. Όπως περιγράφεται και στην Εικόνα 1, η επώαση με δισουλφίδιο του νατρίου έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή των μη μεθυλιωμένων κυτοσινών (C) του γονιδιώματος σε μόρια ουρακίλης (U) και τελικά σε θυμίνες (T). Ανεπηρέαστες ωστόσο παραμένουν οι επιγενετικά τροποποιημένες μεθυλκυτοσίνες (5 mc) και υδροξυμεθυλκυτοσίνες (5 hmc), που προηγούνται μορίου γουανίνης. Έτσι μετά τη διεργασία αυτή, οι περιοχές που περιέχουν μεθυλιωμένα μόρια κυτοσίνης θα είναι διακριτές σε σχέση με εκείνες που δε φέρουν σημάδι μεθυλίωσης ύστερα από ανάλυση της καμπύλης τήξης των προϊόντων, με ειδική για τη μεθυλίωση, υψηλής διακριτικής ικανότητας Real Time PCR (MS HRM). Εικόνα 1. Επώαση του DNA με δισουλφίδιο του νατρίου Ποσοτική ανάλυση με MSRE PCR (Methyl Specific Restriction Enzyme Polymerase Chain Reaction) Κατά τα μέθοδο MSRE PCR πραγματοποιείται πέψη των υποστρωμάτων και των δειγμάτων αναφοράς με περιοριστικά ένζυμα (EpiJET DNA Methylation Analysis Kit (MspI/HpaII), K1441, Thermo Scientific) (23). 7

9 HpaII: λειτουργικό, MspI: λειτουργικό 5'...C C G G...3' HpaII: λειτουργικό, MspI: μη λειτουργικό 5'...C me C G G...3' 3'...G G C C...5' 3'...G G C me C...5' Εικόνα 2. Το ένζυμο MspI πέπτει το DNA ανεξάρτητα της κατάστασης μεθυλίωσης, ενώ η δράση του HpaII αναστέλλεται από τη μεθυλίωση της εσωτερικής κυτοσίνης (C) που προηγείται βάσης γουανίνης (G). Ωστόσο και τα δύο ένζυμα αναγνωρίζουν την αλληλουχία CCGG και κόβουν κατά το ίδιο πρότυπο (ισοσχιζομερή). Τα προϊόντα των δύο πέψεων, μαζί με ένα μη επεξεργασμένο υπόστρωμα, αναλύονται με Real Time PCR και η διαφορά στους χρόνους ανάδειξης των προϊόντων τους (Crossing time, Ct) χρησιμοποιείται για να υπολογιστεί το ποσοστό της μεθυλίωσης του υποκινητή. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν εκκινητές για περιοχές των υποκινητών των γονιδίων SUZ12, EED και STAT3. Οι εκκινητές ελέγχθηκαν με gradient PCR και αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης, όπως περιεγράφηκε προηγουμένως Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση με πυροαλληλούχιση (Pyrosequencing) Με τη μέθοδο της πυροαλληλούχισης (PyroMark Q96, Qiagen) μελετήθηκε το πρότυπο της μεθυλίωσης των υποκινητών των γονίδιων HOXA9 και LINE 1, ενώ επιβεβαιώθηκε το πρότυπο μεθυλίωσης των γονιδίων SUZ12, EED και STAT3. Η πυροαλληλούχιση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως σε μελέτες μεθυλίωσης του γονιδιώματος, και αποτελεί ίσως την μέθοδο επιλογής για τέτοιου είδους μελέτες. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν δείγματα DNA επεξεργασμένα με δισουλφίδιο του νατρίου και εκκινητές κατάλληλοι για αυτά. 3. Μελέτη των αλλαγών στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης ασθενών, μέσω αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA sequencing) Η ανάλυση με αλληλουχιτές 3 ης γενιάς (Next generation sequencing) χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αλλαγών συνολικά στο πρότυπο έκφρασης μίας κατάστασης συγκριτικά με μία άλλη. Το σύνολο των μορίων ριβονουκλεϊκών οξέων (RNAs) που συνθέτει ένα κύτταρο (μεταγράφημα), αποτελεί την μεταβιβαζόμενη πληροφορία του γονιδιώματος για τη σύνθεση πρωτεϊνών. Οι μεταλλάξεις στα γονίδια ASXL1 και EZH2, επιφέρουν δομικές αλλαγές στις αντίστοιχες πρωτεΐνες ως και απώλεια της λειτουργικότητας τους και αυτές με τη σειρά τους μπορούν να επιφέρουν τροποποιήσεις σε ιστόνες πρωτεΐνες, οι οποίες θα εκφραστούν τελικώς με αλλαγές στο μεταγράφημα. Συγκρίνοντας το μεταγράφημα ασθενών με μεταλλάξεις στα προαναφερθέντα γονίδια, σε σχέση με φυσιολογικά άτομα, μπορούμε να βρούμε διαφορές στη γονιδιακή έκφραση. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του μεταγραφήματος 3 ασθενών με μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1, 2 ασθενών με μυελοΐνωση, αλλά χωρίς ανιχνεύσιμες μεταλλάξεις στο γονίδιο αυτό, καθώς και 1 υγειούς δότη. Η προετοιμασία των δειγμάτων πριν σταλούν για αλληλούχιση, περιλάμβανε ποιοτικό έλεγχο των απομονωθέντων RNA από περισσότερα κατάλληλα για ανάλυση δείγματα, ώστε να επιλεγούν τα ποιοτικότερα. Ακολούθησε βιοπληροφορική ανάλυση οι οποία περιλάμβανε: 8

10 Μετατροπή των δεδομένων (raw data) που εξήχθησαν από την αναλυτική συσκευή Illumina Hi Seq 2500, σε αρχεία μεγάλου όγκου δεδομένων (fasta), που περιείχαν τις μικρές αλληλουχίες 50 βάσεων μονής κατεύθυνσης (single end 50 bp reads) οι οποίες αλληλουχήθηκαν. Ποιοτική ανάλυση των αλληλουχιών αυτών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε κατάλληλο λογισμικό πρόγραμμα (FastQC) (28). Τοποθέτηση (alignment) των παραπάνω αλληλουχιών επί της γνωστής αλληλουχίας μεταγραφώματος ανθρώπου (Feb GRCh37/hg19; RefSeq Genes, refflat), διαθέσιμο από τη βάση δεδομένων του UCSC. Για αυτή την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν οι αλγόριθμοι Tophat2 (29) και Bowtie2 (30). Τα αρχεία που εξήχθησαν από την παραπάνω υπολογιστική ανάλυση (bam) μετατράπηκαν σε αρχεία με μορφή κατάλληλη για περαιτέρω ανάλυση (sam), με χρήση κατάλληλου λογισμικού (SAMtools) (31). Από τα τελευταία αρχεία, ύστερα από προσέγγιση με κατάλληλο αλγόριθμο (HTSeqcount) (32), προέκυψαν αρχεία με αριθμητικά δεδομένα (tsv), τα οποία αφορούν στην συχνότητα εμφάνισης του κάθε μετάγραφου (counts), που παρουσίασε έκφραση, σε κάθε δείγμα που αναλύθηκε, τη δεδομένη χρονική στιγμή που εκείνο απομονώθηκε. Δύο διαφορετικοί αλγόριθμοι (Cufflinks (33) και DESeq (34) ) χρησιμοποιήθηκαν για την συγκριτική ανάλυση της συχνότητας εμφάνισης των μετάγραφων των δειγμάτων που αναλύθηκαν, στις διάφορες καταστάσεις. Το περιθώριο σφάλματος που χρησιμοποιήθηκε είναι 10% (FDR<10%). Αποτελέσματα 1. Μοριακή διερεύνηση για την ύπαρξη μεταλλάξεων στο εξόνιο 9 του γονιδίου της CALR και στο εξόνιο 12 του γονιδίου ASXL1 με τη μέθοδο HRM A (High Resolution Melting curve Analysis) Για το χαρακτηρισμό νέων δειγμάτων ως προς την ύπαρξη ήδη γνωστών μεταλλάξεων για τα γονίδια CALR και ASXL1 αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα ανίχνευσης, με χρήση της τεχνικής HRM A. Συνολικά ελέγχθηκαν 45 ασθενείς με μυελοΐνωση για τις πιο συχνά εμφανιζόμενες μεταλλάξεις στα γονίδια CALR και ASXL1. Μέχρι στιγμής, μεταλλάξεις που αφορούν στο γονίδιο της CALR έχουν βρεθεί σε 7 ασθενείς (15,56%). Από αυτές τις μεταλλάξεις οι 3 είναι μεταλλάξεις προσθήκης (6,67%), ενώ οι υπόλοιπες 4 είναι μεταλλάξεις διαγραφής νουκλεοτιδίων (8,89%). Αξίζει να σημειωθεί ότι η μία εκ των μεταλλάξεων διαγραφής που έχει ανιχνευτεί, αφορά σε περιοχή μικρότερη (37 βάσεις) από τις ήδη αναγνωρισμένες μέχρις στιγμής στη βιβλιογραφία. Για το γονίδιο ASXL1 εντοπίστηκαν μεταλλάξεις σε μόλις 1 νέο δείγμα (2,22%). Κανένας από τους ασθενείς που μελετήθηκαν δεν έφερε μεταλλάξεις και στα δύο αυτά γονίδια ταυτόχρονα. 9

11 Εικόνα 3. Τα προϊόντα της αντίδρασης αυξάνονται εκθετικά με ρυθμό που πλησιάζει τα δύο νέα αντίγραφα σε κάθε κύκλο (~2 n, όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης). Στον άξονα x παρουσιάζονται οι κύκλοι της αντίδρασης, ενώ στον y τα επίπεδα φθορισμού των προϊόντων. Ο φθορισμός αυξάνει καθώς συσσωρεύονται νέα προϊόντα (exponential phase), ξεπερνά ένα ελάχιστο επίπεδο φθορισμού (cycle threshold), περνά σε λογαριθμική φάση (linear phase), ενώ τέλος φτάνει σε ένα οριακό επίπεδο (plateau phase) πέραν του οποίου δεν αυξάνει πλέον. Επάνω: Καμπύλη σύνθεσης προϊόντων CALR έπειτα από 50 κύκλους αντίδρασης. Κάτω: Αντίστοιχη καμπύλη για τα προϊόντα της αντίδρασης για ASXL1, έπειτα από 45 κύκλους. Εικόνα 4. Ταξινόμηση των προϊόντων των αντιδράσεων σε διακριτές κατηγορίες. Επάνω: Ανάλυση των μεταλλάξεων του γονιδίου CALR. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται δείγματα με φυσιολογικό φαινότυπο, εκείνα με μεταλλάξεις διαγραφής περιοχών διαφορετικού μεγέθους με κόκκινο και γκρι, ενώ με πράσινο αυτά με μεταλλάξεις ένθεσης (Giannopoulos et al, in preparation). Κάτω: Ανάλυση μίας εκ των περιοχών του ASXL1, όπου εντοπίζονται οι πιο συχνές μεταλλάξεις. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται δείγματα με φυσιολογικό γονότυπο, ενώ εκείνα με μεταλλαγμένο, εμφανίζονται με κόκκινο. Η συγκεκριμένη εικόνα αφορά σε μετάλλαξη προσθήκης ενός νουκλεοτιδίου (ASXL1 c.1934_1935insg). 10

12 Για την επιβεβαίωση των νέων μεταλλάξεων για το γονίδιο CALR πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός αλληλουχίας κατά Sanger, ενώ το ίδιο πραγματοποιήθηκε και για την επιβεβαίωση των γνωστών μεταλλάξεων τόσο για το γονίδιο CALR όσο και για το ASXL1. Εικόνα 5. Αλληλούχιση κατά Sanger για την περιοχή ενδιαφέροντος του γονιδίου CALR. Επάνω (Α): Διακρίνονται οι μεταλλάξεις διαγραφής 52 και 37 βάσεων συγκριτικά με το δείγμα φυσιολογικού γονότυπου. Κάτω (Β): Αντιπαραβάλλεται μία μετάλλαξη ένθεσης νουκλεοτιδίων, με ένα δείγμα φυσιολογικού γονότυπου (Giannopoulos et al, in preparation). Η ανάπτυξη της συγκεκριμένης μεθοδολογίας αποτελεί πλέον πολύτιμο εργαλείο για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων σε νέους ασθενείς που προστίθενται στη μελέτη. Η εφαρμογή της στην κλινική πράξη είναι επίσης πολύ σημαντική γιατί αποτελεί μια γρήγορη, ευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδο ανίχνευσης μεταλλάξεων τόσο στο γονίδιο της CALR, όπου λύνεται το πρόβλημα της διάγνωσης ασθενών με ΜΥΝ με τον πλέον ανώδυνο και ασφαλή τρόπο, όσο και της ανίχνευσης μεταλλάξεων στο γονίδιο ASXL1, η παρουσία των οποίων συσχετίζεται με πάρα πολύ κακή πρόγνωση και απαιτεί ταχεία λήψη κλινικών αποφάσεων, όπως για παράδειγμα η αλλογενής μεταμόσχευση μυελού των οστών. 11

13 2. Μελέτη της μεθυλίωσης υποκινητών γονιδίων Η μελέτη των υποκινητών των γονιδίων EED, SUZ12 και STAT3, που συσχετίστηκαν ύστερα από βιοπληροφορική ανάλυση (data mining), προσεγγίστηκε με δύο διακριτές τεχνικές (MS HRM και MSRE PCR), για επαλήθευση των αποτελεσμάτων, ενώ ακολούθησε μία διαφορετική προσέγγιση (pyrosequencing) για την ανάλυση των υποκινητών των HOXA9 και LINE1, σε μία προσπάθεια να εντοπίσουμε την πιο κατάλληλη τεχνική για τις συγκεκριμένες αναλύσεις, αλλά ταυτόχρονα να εξάγουμε αξιοποιήσιμα αποτελέσματα Ποιοτική ανάλυση με MS HRM (Methyl Specific High Resolution Melting curve analysis) Η μελέτη περιλάμβανε την επεξεργασία των υποστρωμάτων και των δειγμάτων αναφοράς, με δισουλφίδιο του νατρίου, ενίσχυση με Real Time PCR και ανάλυση με προσδιορισμό της καμπύλης τήξης των προϊόντων για την ύπαρξη μεθυλίωσης στους υποκινητές των γονιδίων EED, SUZ12 και STAT3. Για την ανάλυση αυτή σχεδιάστηκαν εκκινητές ειδικοί για επεξεργασμένα με δισουλφίδιο του νατρίου υποστρώματα. Η ποιοτική εκτίμηση αυτών έγινε με ενίσχυση σε διαφορετικές θερμοκρασιακές τιμές (gradient PCR) (DNA Engine Dyad; Peltier Thermal Cycler, PTC220, Bio Rad) για εύρεση της βέλτιστης θερμοκρασίας πρόσδεσης τους στο υπόστρωμα. Ακολούθησε ανάλυση των προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης. Για να ελεγχθεί η ειδικότητά τους ως προς την επιλεκτική ενίσχυση των επεξεργασμένων με δισουλφίδιο του νατρίου δειγμάτων, η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε και για μη επεξεργασμένα υποστρώματα. Τα αποτελέσματα φαίνονται στις εικόνες κάτωθι. Εικόνα 6. Ανίχνευση της βέλτιστης θερμοκρασίας πρόσδεσης των τριών ζευγών εκκινητών με χρήση gradient PCR και ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι εκκινητές είναι ειδικοί μόνον για υπόστρωμα επεξεργασμένο με δισουλφίδιο του νατρίου (επάνω τμήμα κάθε εικόνας), ενώ δεν συντίθεται προϊόν από μη επεξεργασμένο υπόστρωμα (κάτω τμήμα κάθε εικόνας). Από την ανάλυση που έγινε δεν προέκυψαν διαφορές στη μεθυλίωση των υπό μελέτη υποκινητών γονιδίων τόσο σε δείγματα ασθενών, με ή χωρίς γνωστές μεταλλάξεις, στα γονίδια ASXL1 και EZH2, όσο και σε δείγματα από φυσιολογικούς δότες. 12

14 Εικόνα 7. Η ανάλυση που έγινε για τις καμπύλες τήξης των προϊόντων της αντίδρασης ενίσχυσης, δεν εμφάνισε διαφοροποιήσεις μεταξύ των δειγμάτων για τους υποκινητές των γονιδίων που μελετήθηκαν όπως φαίνεται χαρακτηριστικά στην εικόνα που παρατίθεται. Η ομαδοποίηση έγινε με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού προγράμματος Ποσοτική ανάλυση με MSRE PCR (Methyl Specific Restriction Enzyme Polymerase Chain Reaction) Η μελέτη περιλάμβανε πέψη των υποστρωμάτων και των δειγμάτων αναφοράς με περιοριστικά ένζυμα. Τα προϊόντα των δύο πέψεων, μαζί με ένα μη επεξεργασμένο υπόστρωμα, αναλύθηκαν με Real Time PCR και η διαφορά στους χρόνους ανάδειξης των προϊόντων τους (Ct) χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το ποσοστό της μεθυλίωσης του υποκινητή. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν εκκινητές για περιοχές των υποκινητών των γονιδίων SUZ12, EED και STAT3. Οι εκκινητές ελέγχθηκαν με gradient PCR και αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εικόνα 8. Χαρακτηριστικές καμπύλες ενίσχυσης των προϊόντων της αντίδρασης PCR για ένα δείγμα με μετάλλαξη στο γονίδιο EZH2, ένα με μετάλλαξη στο ASXL1 και ένα δείγμα με φυσιολογικό φαινότυπο (από αριστερά προς δεξιά). Το χρονικό σημείο όπου το συσσωρευμένο προϊόν υπερβαίνει ενός οριακού σημείου της διαδικασίας ενίσχυσης (Ct), χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της κατάστασης μεθυλίωσης. Μικρές διαφοροποιήσεις στα ποσοστά μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων που μελετήθηκαν, παρατηρήθηκαν σε ορισμένα από τα δείγματα που έφεραν μεταλλάξεις στο EZH2, ενώ σχεδόν καθόλου διαφορές δεν εντοπίστηκαν σε δείγματα με μεταλλάξεις στο ASXL1. Κατά την ανάλυση παρατηρήθηκαν μικρές αλλαγές στα ποσοστά μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου ΕED σε συγκεκριμένα δείγματα ασθενών, οι οποίες ωστόσο δεν ήταν στατιστικά σημαντικές ώστε να μπορέσουμε να εξάγουμε σαφή συμπεράσματα. Στη συγκεκριμένη μελέτη ως δείγματα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν τα in vitro, πλήρως μεθυλιωμένα και απομεθυλιωμένα δείγματα DNA. Τα ποσοστά μεθυλίωσης μελετήθηκαν σε δείγματα ασθενών με ή χωρίς γνωστές μεταλλάξεις στα γονίδια ASXL1 και EZH2, καθώς και σε δείγματα από φυσιολογικούς δότες. 13

15 2.3. Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση με πυροαλληλούχιση (Pyrosequencing) Βιβλιογραφικά δεδομένα αναφέρουν ότι το γονίδιο HOXA9 έχει βρεθεί ότι επηρεάζεται από μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1 (17). Επιπλέον, από στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι τα μεταθετά στοιχεία LINE 1, παρουσιάζουν μειωμένα ποσοστά μεθυλίωσης σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμβάλλοντας έτσι σε γενετική αστάθεια και στην εξέλιξη της νόσου. Υπό φυσιολογικές συνθήκες δε, το ποσοστό της μεθυλίωσης τους διατηρείται σε αρκετά υψηλά επίπεδα (24). Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας επιβεβαιώθηκε το πρότυπο μεθυλίωσης των γονιδίων SUZ12, EED και STAT3 με τη μέθοδο της πυροαλληλούχισης (PyroMark Q96, Qiagen), ενώ επιπλέον μελετήθηκε το πρότυπο της μεθυλίωσης των υποκινητών των γονίδιων HOXA9 και LINE 1, ενώ. Εικόνα 9. Σχεδιασμός εκκινητών για πυροαλληλούχιση. Ο εκκινητής αριστερά σε συνδυασμό, με τον κάτω δεξιά ενισχύουν την περιοχή που εσωκλείουν με PCR. Ο πρώτος φέρει μία ομάδα βιοτίνης (biotin group) στο 5 άκρο του. Αυτή η χημική τροποποίηση είναι χρήσιμη για τη διαλογή της συγκεκριμένης αλυσίδας με χρήση σφαιριδίων στρεπταβιδίνης (streptavidin beads), η οποία αλληλεπιδρά με τη βιοτίνη. Τα απομονωθέντα σφαιρίδια συγκρατούν την αλυσίδα με τη βιοτίνη σε μονόκλωνη κατάσταση, ενώ η συμπληρωματική αλυσίδα απορρίπτεται. Κατά την πυροαλληλούχιση ο επάνω δεξιά εκκινητής που είναι συμπληρωματικός με την απομονωθείσα αλυσίδα και ενισχύει το προς ανάλυση τμήμα DNA. Εδώ παρατίθεται ενδεικτικά η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου HOXA9. Το πρότυπο της μεθυλίωσης σε άτομα που νοσούν και φέρουν μεταλλάξεις στα γονίδια ASXL1 και EZH2, δεν παρουσίασε διαφορές, σε σύγκριση με εκείνο ατόμων που δεν φέρουν μεταλλάξεις στα παραπάνω γονίδια, τόσο για την περιοχή ανοδικά του HOXA9, όσο και για εκείνη ανοδικά του LINE1. 14

16 Α. Β. Εικόνα 10. Α: Χρωματογράφημα του υποκινητή του στοιχείου LINE1 για δύο φυσιολογικά δείγματα (CTRL, 7972) και δύο παθολογικά, ένα με μετάλλαξη στο ASXL1 (3752) και ένα με μετάλλαξη στο EZH2 (1919). Τα ποσοστά της μεθυλίωσης όλων των δειγμάτων που μελετήθηκαν κυμαίνονται σε φυσιολογικά υψηλά επίπεδα, για τη συγκεκριμένη περιοχή. Β: Χρωματογράφημα του υποκινητή του στοιχείου ΗΟΧΑ9 για τα ίδια δείγματα. Τα επίπεδα μεθυλίωσης της συγκεκριμένης περιοχής κυμαίνονται σε μηδενικά επίπεδα σε όλα τα δείγματα που μελετήθηκαν. Όπως προκύπτει από τα παραπάνω πειράματα, οι μεταλλάξεις στα γονίδια ASXL1 και EZH2 δεν φαίνεται να επηρεάζουν απευθείας το πρότυπο της μεθυλίωσης των γονιδίων SUZ12, 15

17 EED, STAT3 και HOXA9, καθώς και των μεταθετών στοιχείων LINE1. Επιπλέον, φαίνεται ότι η ποιοτική και ποσοτική ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων με τις μεθόδους MS HRM και MSRE PCR αν και είναι γρήγορη και αποτελεσματική, ωστόσο δεν είναι το ίδιο ευαίσθητη και πληροφοριακή, όσο η μέθοδος της πυροαλληλούχισης, η οποία φαίνεται να είναι και η πλέον κατάλληλη για τέτοιου είδους μελέτες (25). 3. Μελέτη των αλλαγών στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης ασθενών, μέσω αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA sequencing) Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του μεταγραφήματος 3 ασθενών με μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1, 2 ασθενών με μυελοΐνωση, αλλά χωρίς ανιχνεύσιμες μεταλλάξεις στο γονίδιο αυτό, καθώς και 1 υγειούς δότη. Η προετοιμασία των δειγμάτων πριν σταλούν για αλληλούχιση, περιλάμβανε ποιοτικό έλεγχο των απομονωθέντων RNA από περισσότερα κατάλληλα για ανάλυση δείγματα, ώστε να επιλεγούν τα ποιοτικότερα. Εικόνα 11. Η χρήση της τεχνικής PCR αντίστροφης μεταγραφής, αποτελεί ένδειξη της ύπαρξης καλής ποιότητας RNA, στα απομονωθέντα δείγματα. Η εικόνα αφορά στο γονίδιο c abl oncogene 1, το οποίο κωδικοποιεί το μετάγραφο ABL1, μία κινάση τυροσίνης με μήκος 386 βάσεων, το οποίο εκφράζεται καθολικά στα κύτταρα ανθρώπινου αίματος (House Keeping Gene, HKG). 16

18 Εικόνα 12. Αποτελέσματα ελέγχου ποιότητας RNA στα υποψήφια προς μελέτη δείγματα ύστερα από ανάλυση σε ηλεκτροφερογράφημα με τη χρήση της τεχνολογίας Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, ώστε να διασφαλιστεί η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων του RNA Seq. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν ύστερα από βιοπληροφορική ανάλυση, στην έκφραση ατόμων παθολογικής κατάστασης σε σύγκριση με το φυσιολογικό πρότυπο δείγμα, αφορούν στο σύνολο σχεδόν των γονιδίων. Η βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων της διερευνητικής αυτής αρχικής μελέτης (pilot study) παρέχει μία εικόνα για τις διαφορές που εμφανίζονται στις καταστάσεις που διερευνώνται. Παρακάτω παρουσιάζονται μερικές από τις αναλύσεις που έγιναν για το σκοπό αυτό. Οι αναλύσεις που έχουν γίνει δε βασίζονται σε στατιστικές μεθόδους ανάλυσης, περισσότερο δε σε παρατηρητική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Αυτή η συμβατική προσέγγιση ακολουθήθηκε λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων που αναλύθηκαν. Ωστόσο, τα αποτελέσματα είναι αξιοποιήσιμα, ενώ μελλοντικές επαναλήψεις με νέα δείγματα θα πλαισιώσουν την ήδη υπάρχουσα πληροφορία οδηγώντας σε ισχυρότερους συσχετισμούς και συρρικνώνοντας την λίστα των γονιδίων που χρίζουν περαιτέρω μελέτης. Τα διαγράμματα Venn παρέχουν πληροφορίες αναφορικά με τη σύγκριση μεγάλου όγκου δεδομένων για τις διαφορετικές καταστάσεις που αναλύονται. Τα διαγράμματα που παρατίθενται παρακάτω περιέχουν δεδομένα γονιδίων που προέκυψαν έπειτα από ανάλυση της συχνότητας των διαβασμάτων ανά μετάγραφο (reads), με χρήση των αλγόριθμων DESeq και Cufflinks (36). 17

19 Εικόνα 13. Α: Διαγράμματα Venn για την ανάλυση των γονιδίων που εμφανίζονται με πιο έντονη διαφοροποιημένη έκφραση (log 2 Fold Change) μεταξύ 2 ασθενών που εμφάνισαν μυελοΐνωση, με μετάλλαξη στο γονίδιο ASXL1, σε σύγκριση με 1 άτομο φυσιολογικού γονότυπου. Α: Γονίδια με αυξημένη έκφραση στην ομάδα παθολογικών δειγμάτων. Β: Γονίδια με αυξημένη έκφραση στο φυσιολογικό άτομο που μελετήθηκε. Η ανάλυση έγινε με δύο αλγόριθμους, DESeq (μπλε) και Cufflinks (κίτρινο). Τα κοινά στοιχεία των δύο αναλύσεων εμφανίζονται στην τομή των δύο ομάδων δεδομένων και είναι εκείνα που χρησιμοποιήθηκαν για τις περαιτέρω αναλύσεις (36). Για την ομαδοποίηση των δεδομένων, ώστε να αναδείξουμε τα μονοπάτια που επηρεάζονται στην παθολογική κατάσταση σε σχέση με τη φυσιολογική, χρησιμοποιήθηκαν οι αναλυτικές μηχανές των συστημάτων βιοπληροφορικών αναλύσεων DAVID (37,38) και GΟrilla (39,40). Οι παρακάτω εικόνες (Εικόνες 14,15,16,17) αποδίδουν σχηματικά την αυξημένη έκφραση διαφόρων γονιδίων που διαπιστώνεται στην ομάδα των ασθενών με μυελοΐνωση οι οποίοι φέρουν μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1, σε σύγκριση με δείγμα φυσιολογικού ατόμου. Τα γονίδια που εμφανίζουν στατιστικά σημαντική αυξημένη έκφραση σημειώνονται με κόκκινους αστερίσκους. Παρατηρείται είναι ο αυξημένος πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των κυττάρων της μυελικής σειράς, ο αυξημένος μεταβολισμός της αιμοσφαιρίνης και η αυξημένη λειτουργία του συστήματος διαμεμβρανικής μεταφοράς ιόντων. Επίσης διακρίνεται ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων κυττάρων ως απόκριση σε εξωγενή ερεθίσματα και μόλυνση από μικροοργανισμούς που ενδεχομένως συνδέονται με τη μυελοΐνωση. 18

20 Εικόνα 14. Το παραπάνω δενδρόγραμμα προέρχεται από την ανάλυση των δεδομένων με τη βοήθεια της πλατφόρμας βιοπληροφορικών αναλύσεων GOrilla (39,40). Τα μονοπάτια όπου συναντώνται τα περισσότερα, ιδιαιτέρως αυξημένης έκφρασης γονίδια, εμφανίζονται με κίτρινο και πορτοκαλί χρώμα. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση σε γονίδια τα οποία συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο, σε τυπικές καρκινικές διεργασίες (όπως η αγγειογένεση και η αποφυγή της απόπτωσης) και στην αιμοποίηση. Ο κυτταρικός κύκλος φαίνεται να απορρυθμίζεται ισχυρότερα από κάθε άλλο μονοπάτι παρουσιάζοντας αυξημένη σύνθεση μεταγράφων από πολλά γονίδια που μετέχουν σε διεργασίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η αποφυγή της απόπτωσης και η αγγειογένεση (Εικόνα 15). Επιπλέον, φαίνεται να υπάρχει αυξημένη σύνθεση ιντερλευκινών (ILs) και πρωτεϊνών επιφάνειας (CDs) των κυττάρων της μυελοειδούς σειράς γεγονός που σχετίζεται με την κλινική εικόνα των μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασιών (Εικόνα 16). 19

21 Εικόνα 15. Η απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου είναι ιδιαίτερα έντονη. Αρκετά γονίδια παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση σε ασθενείς με μετάλλαξη στο γονίδιο ASXL1, σε σύγκριση με το φυσιολογικό δείγμα. Ο Bcl XL συμβάλλει στην αποφυγή της απόπτωσης των κυττάρων. Η CyclinA1 επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ενώ η IL6 και ο E2F οδηγούν προς διαφοροποίηση τα κύτταρα της μυελοειδούς σειράς. Έντονα ενισχυμένη φαίνεται να είναι και η διαδικασία της αγγειογένεσης, όπου παρατηρούνται αυξημένα τα μετάγραφα πολλών γονιδίων που συμμετέχουν σε αυτή, όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες MMP8 και MMP9, όπως και ο VEGF. Τέλος οι παράγοντες GADD45 και p21 εκφράζονται έντονα ως απόκριση στις στρεσογόνες συνθήκες του κυττάρου. Με κόκκινους αστερίσκους εμφανίζονται τα γονίδια που παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση. Το παραπάνω διάγραμμα προέρχεται από την ανάλυση των δεδομένων με τη βοήθεια της πλατφόρμας βιοπληροφορικών αναλύσεων DAVID (37,38). 20

22 Εικόνα 16. Αύξηση παρατηρείται και στη συνθετική ικανότητα των γονιδίων που αφορούν σε διαδικασίες αιμοποίησης, κυρίως στα γονίδια των ιντερλευκινών (IL) και των αντιγόνων επιφανείας (CDs) των κυττάρων της μυελοειδούς σειράς, αλλά και της λεμφοειδούς. Με κόκκινους αστερίσκους εμφανίζονται εκείνα τα γονίδια που παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση. Το παραπάνω διάγραμμα προέρχεται από την ανάλυση των δεδομένων με τη βοήθεια της πλατφόρμας βιοπληροφορικών αναλύσεων DAVID (37,38). 21

23 Συμπεράσματα Παραδοτέα Σκοπό της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η μελέτη των μηχανισμών επιγενετικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης διαφόρων γονιδίων σε ασθενείς με μυελοΐνωση και σε φυσιολογικά άτομα, καθώς και σε ασθενείς με μυελοΐνωση που φέρουν μεταλλάξεις στα γονίδια EZH2 και ASXL1 σε σχέση με ασθενείς χωρίς μεταλλάξεις στα παραπάνω γονίδια. Στα πλαίσια της μελέτης πραγματοποιήθηκε μελέτη μεθυλίωσης υποκινητών γονιδίων που αλληλοεπιδρούν με τα γονίδια EZH2 και ASXL1, καθώς και μελέτη των αλλαγών στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης ασθενών με μυελοΐνωση. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής συνοψίζονται στη συνέχεια : 1. Από την ποιοτική ανάλυση μεθυλίωσης με τη μέθοδο MS HRM δεν προέκυψαν διαφορές στη μεθυλίωση των υπό μελέτη υποκινητών των γονιδίων EED, SUZ12 και STAT3 που μελετήθηκαν τόσο σε δείγματα ασθενών, με ή χωρίς γνωστές μεταλλάξεις, στα γονίδια ASXL1 και EZH2, όσο και σε δείγματα από φυσιολογικούς δότες. 2. Οι μικρές αλλαγές που παρατηρήθηκαν κατά την ανάλυση της μεθυλίωσης με τη μέθοδο MSRE PCR στα ποσοστά μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου ΕED σε συγκεκριμένα δείγματα ασθενών, δεν ήταν στατιστικά σημαντικές ώστε να μπορέσουμε να εξάγουμε σαφή συμπεράσματα. Στη συγκεκριμένη μελέτη ως δείγματα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν τα in vitro, πλήρως μεθυλιωμένα και απομεθυλιωμένα δείγματα DNA. 3. Το πρότυπο μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων SUZ12, EED και STAT3 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη μέθοδο της πυροαλληλούχισης, ενώ επιπλέον με την ίδια μέθοδο η μελετήθηκε το πρότυπο της μεθυλίωσης των υποκινητών των γονίδιων HOXA9 και LINE 1. Ωστόσο τα έως τώρα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι το πρότυπο της μεθυλίωσης σε άτομα που νοσούν και φέρουν μεταλλάξεις στα γονίδια ASXL1 και EZH2, δεν παρουσίασε διαφορές, σε σύγκριση με εκείνο των ασθενών που δεν έχουν μεταλλάξεις στα συγκεκριμένα γονίδια, τόσο για την περιοχή ανοδικά του HOXA9, όσο και για εκείνη ανοδικά του LINE1. Συμπερασματικά, οι μεταλλάξεις στα γονίδια ASXL1 και EZH2 δεν φαίνεται να επηρεάζουν απευθείας το πρότυπο της μεθυλίωσης των γονιδίων SUZ12, EED, STAT3 και HOXA9, καθώς και των μεταθετών στοιχείων LINE1. Επιπλέον, φαίνεται ότι η ποιοτική και ποσοτική ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων με τις μεθόδους MS HRM και MSRE PCR αν και είναι γρήγορη και αποτελεσματική, ωστόσο δεν είναι το ίδιο ευαίσθητη και πληροφοριακή, όσο η μέθοδος της πυροαλληλούχισης. 4. Προκειμένου να μελετηθούν απευθείας οι αλλαγές στο πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης ασθενών με μυελοΐνωση και υγειών δοτών πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του μεταγραφήματος (RNA Sequencing) 3 ασθενών με μεταλλάξεις στο γονίδιο ASXL1, 2 ασθενών με μυελοΐνωση, αλλά χωρίς ανιχνεύσιμες μεταλλάξεις στο γονίδιο αυτό, καθώς και 1 υγιούς δότη. 5. Η βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων του RNA Sequencing απέδωσε διαφορές στη γονιδιακή έκφραση ασθενών με μυελοΐνωση σε σύγκριση με το φυσιολογικό πρότυπο δείγμα σε ένα πολύ μεγάλο αριθμό γονιδίων. Τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση, γεγονός που συνάδει με τη βιβλιογραφία όπου αναφέρεται απώλεια της σύνθεσης λειτουργικού προϊόντος από το γονίδιο ASXL1 λόγω μεταλλάξεων η οποία φαίνεται να επάγει την απώλεια της σήμανσης H3K27me3 και οδηγεί σε χαλαρότερη δομή της χρωματίνης, με συνέπεια την ευκολότερη πρόσβαση των ρυθμιστικών περιοχών από στοιχεία που συμμετάσχουν στην έκφραση των γονιδίων. 22

24 6. Από την ανάλυση με τις πλατφόρμες βιοπληροφορικών αναλύσεων DAVID και Gorilla παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση σε γονίδια με αυξημένη έκφραση τα οποία συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο, σε τυπικές καρκινικές διεργασίες (όπως η αγγειογένεση και η αποφυγή της απόπτωσης) και στην αιμοποίηση. Συγκεκριμένα, τα γονίδια που διαφοροποιούνται ισχυρά φαίνονται στις Εικόνες 14, 15, 16. Ο κυτταρικός κύκλος φαίνεται να απορρυθμίζεται ισχυρότερα από κάθε άλλο μονοπάτι παρουσιάζοντας αυξημένη σύνθεση μεταγράφων από πολλά γονίδια που μετέχουν σε διεργασίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η αποφυγή της απόπτωσης και η αγγειογένεση (Εικόνα 15). Επιπλέον, φαίνεται να υπάρχει αυξημένη σύνθεση ιντερλευκινών (ILs) και πρωτεϊνών επιφάνειας (CDs) των κυττάρων της μυελοειδούς σειράς γεγονός που σχετίζεται με την κλινική εικόνα των μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασιών. 7. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας μελέτης αναπτύχθηκε η μεθοδολογία για τη μοριακή ανίχνευση μεταλλάξεων στο εξόνιο 9 του γονιδίου της CALR και στο εξόνιο 12 του γονιδίου ASXL1 με τη μέθοδο HRM A (High Resolution Melting curve Analysis). Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε είναι πολλά υποσχόμενη σε ότι αφορά τη γρήγορη κι ευαίσθητη ανίχνευση των μεταλλάξεων σε περιφερικό αίμα και/ή μυελό των οστών ασθενών με ΜΥΝ. Η ανάπτυξη της συγκεκριμένης μεθοδολογίας αποτελεί πλέον πολύτιμο εργαλείο για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων σε νέους ασθενείς που προστίθενται στη μελέτη. Η εφαρμογή της στην κλινική πράξη είναι επίσης πολύ σημαντική γιατί αποτελεί μια γρήγορη, ευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδο ανίχνευσης μεταλλάξεων τόσο στο γονίδιο της CALR, όπου λύνεται το πρόβλημα της διάγνωσης ασθενών με ΜΥΝ με τον πλέον ανώδυνο και ασφαλή τρόπο, όσο και της ανίχνευσης μεταλλάξεων στο γονίδιο ASXL1, η παρουσία των οποίων συσχετίζεται με πάρα πολύ κακή πρόγνωση και απαιτεί ταχεία λήψη κλινικών αποφάσεων. Τα έως τώρα αποτελέσματα χρήζουν περαιτέρω επεξεργασίας και επιβεβαίωσης με πειράματα RQPCR, ενώ παράλληλα βρίσκεται σε εξέλιξη η προετοιμασία αλληλούχιση του μεταγραφήματος (RNA Sequencing) 6 επιπλέον δειγμάτων ασθενών με μυελοΐνωση, προκειμένου να εξάγουμε ασφαλέστερα συμπεράσματα από τη σύγκριση του μεταγραφήματος των δύο υποομάδων ασθενών. Από τη συγκεκριμένη μελέτη δημοσιεύθηκε η ακόλουθη Εργασία: Molecular pathogenesis of atypical CML, CMML and MDS/MPN unclassifiable. Zoi K, Cross NC. Int J Hematol Sep 12. (Epub ahead of print) Επιπλέον, σε προετοιμασία υποβολής προς δημοσίευση βρίσκεται η ακόλουθη Εργασία: A rapid and sensitive method to detect CALR mutation with high resolution melting curve analysis (HRM A). Giannopoulos A, Zoi C, Politou M., Mantzourani M., Zoi K. Ευχαριστίες Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε το Λέκτορα Μοριακής Ογκολογίας στο Πανεπιστήμιο του Λίβερπουλ, Δρ. Λάκη Λιλόγλου, για την πολύτιμη συνεισφορά του τόσο στην ανάπτυξη του 23

25 πρωτοκόλλου της πυροαλληλούχισης, όσο και στην βοήθεια που παρείχε για την εκτέλεση των σχετικών πειραμάτων. Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε το Κοινωφελές Ίδρυμα Ιωάννη Σ. Λάτση για την επιχορήγηση της παρούσας πρότασης στα πλαίσια των Ερευνητικών Μελετών Η επιχορήγηση αυτή έπαιξε σημαντικό και καταλυτικό ρόλο στην ερευνά μας. Βιβλιογραφία 1. Mughal T, Cortes J, Cross NC, Donato N, Hantschel O, Jabbour E, Kantarjian H, Melo JV, Skorski T, Silver RT, Goldman JM. Chronic myeloid leukemia some topical issues. Leukemia Jul;21(7): Rollison DE, Howlader N, Smith MT, Strom SS, Merritt WD, Ries LA, Edwards BK, List AF. Epidemiology of myelodysplastic syndromes and chronic myeloproliferative disorders in the United States, , using data from the NAACCR and SEER programs. Blood Jul 1;112(1): Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, Vassiliou GS, Bench AJ, Boyd EM, Curtin N, Scott MA, Erber WN, the Cancer Genome Project and Green AR. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet : Kralovics R, Passamonti F, Buser AS et al. A gain of function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders.n Engl J Med. 2005;352: Jones, A.V., Kreil, S., Zoi, K., Waghorn, K., Curtis, C., Zhang, L., Score, J., Seear, R., Chase, A.J., Grand, F.H., White, H., Zoi, C., Loukopoulos, D., Terpos, E., Vervessou, E.C., Schultheis, B., Emig, M., Ernst, T., Lengfelder, E., Hehlmann, R., Hochhaus, A., Oscier, D., Silver, R.T., Reiter, A., Cross, N.C. (2005) Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood, 106, Levine RL, Wadleigh M, Cools J et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005;7: Vardiman JW, Brunning RD, Harris NL. WHO histological classification of Chronic Myeloproliferative Diseases. In: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (eds). World Health Organization Classification of Tumors: Tumours of the Haematopoietic and Lymphoid Tissues. International Agency for Research on Cancer (IARC) Press: Lyon, France, 2001: Zhao R, Xing S, Li Z et al. Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythemia vera. J Biol Chem 2005, 280, Pardanani AD, Levine RL, Lasho T, Pikman Y, Mesa RA, Wadleigh M, Steensma DP, Elliott MA, Wolanskyj AP, Hogan WJ, McClure RF, Litzow MR, Gilliland DG, Tefferi A. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood Nov 15;108(10):