NUKLEUS. 1) STRUKTURA (hromozomske teritorije, nukleusne organele) 2) FUNKCIJA (formiranje nukleusnih prekursora za sintezu proteina u citoplazmi)

Transcript

1 NUKLEUS 1) STRUKTURA (hromozomske teritorije, nukleusne organele) 2) FUNKCIJA (formiranje nukleusnih prekursora za sintezu proteina u citoplazmi) Saznanja o ćelijama do kojih se došlo posredstvom novih citoloških metoda i kombinacijom citoloških sa metodima molekularne biologije, biohemije, strukturne biologije bacila su potpuno novo svetlo na organizaciju nukleusa kao ćelijske organele. Dosadašnja saznanja predstavljala su nukleus kao najvažniju, centralnu organelu ćelije, osnovni kriterijum po kome se eukarioti razlikuju od prokariota zaduženu za pakovanje dugačkih molekula DNK koji u okviru svake vrste čine genom. Takođe, nukleus je izdvajan kao kompartment ćelije u kome se odigravaju esencijalni procesi za ćeliju: (1) transkripcija molekula RNK i biogeneza preribozoma u smislu opsluživanja translacione mašinerije (sinteze proteina) u citoplazmi, i (2) replikacije/reparacije molekula DNK u smislu održavanja stabilnosti, umnožavanja i diseminacije genoma tokom života ćelije. Danas se uviđa da je nukleus po značaju za ćeliju potpuno ravnopravan sa ostalim organelama. Ipak, tokom života ćelije (ćelijski ciklus sisarske ćelije) nukleus ima potpuno»podeljenu«organizaciju: interfazni je orjentisan na formiranje prekursora citoplazmatične translacione mašine, a mitotički na pravilnu segregaciju genoma i održanje funkcije ćerki ćelija. Kako je 90 % ćelija adultnog sisarskog organizma u stanju diferenciranosti (Go faza ćelijskog ciklusa) i nema mitotički potencijal (nikada ne prolazi ostale faze ćelijskog ciklusa i mitozu) može se, citološki, razmatrati organizacija interfaznog nukleusa diferencirane ćelije u kontekstu sinteze prekursora potrebnih za translaciju u citoplazmi, tj. sintezu proteina. Interfazna, diferencirana ćelija ima citološke zadatke da nasledni materijal (diploidna garnitura/homologi hromozomi) spakuje u nukleus dijametra do 10 mikrometara, a da pri tome aktivni geni budu pristupačni za transkripciju (irnk, rrnk, trnk), obradi irnk, rrnk, i da obrađen, upakovan materijal irnk, trnk i preribozoma»transportuje«u citoplazmu. 1

2 Struktura interfaznog nukleusa diferencirane ćelije Kako je to bilo nekad Struktura interfaznog nukleusa proučavana pola veka na elektronskim mikrografijama bila je identična onoj na nivou svetlosnog mikroskopa: unutrašnjost nukleusa je iz hromatina koji se po bojenim karakteristikama»deli«na tamni- heterohromatin i svetli-euhromatin i strukturno uobličenog nukleolusa. Nikakva pravilnost u rasporedu genoma nije bila uočljiva iako se znalo za mitotičke hromozome. Naime, jedina citološki uočljiva organizacija genoma ćelije postojala je u mitozi. U mitozi ćelija sisara (otvorena ortomitoza) nukleus gubi svoju interfaznu organizaciju, nukleusni ovoj vizuelno nestaje i hromatin se transformiše (kondenzacijom) u set strukturno uobličenih mitotičkih hromozoma definisane strukture (označavaju se i kao metafazni hromozomi jer se najbolje vide i proučavaju u metafazi mitoze). Svaka vrsta ima tačno određeni broj mitotičkih hromozoma. Citogenetičke studije metafaznih hromozoma pokazuju stalnost njihove organizacije: na krajevima hromozoma su regioni koji se označavaju kao telomere. Centromera je primarno suženje i u odnosu na njen položaj metafazni hromozomi se klasifikuju kao metacentrični, telocentrični, akrocentrični itd. Telo hromozoma pruža se od centromere ka telomerama, i u odnosu na položaj centromere»deli«se na kraći i duži krak. Neki hromozomi (kod čoveka je pet takvih hromozoma) poseduju i sekundarno suženje. Bojenje Gimsa metafaznih hromozoma»otkrilo«je još jednu stalnu strukturu: tamne (G) i svetle (R) trake (pruge) na telu hromozoma. Biohemijskim i molekularno-biološkim metodima utvrđeno je da su svetle trake regioni bogati G-C parovima (aktivni geni, rano replicirajući geni DNK), dok su tamne trake bogate A-T parovima (heterohromatin,»besmisleno ponavljajuće«sekvence, kasno replicirajući regioni). Sa punim pravom G i R trake mogle su se poistovetiti sa hetero-, tj. eu-hromatinom, respektivno. Ovo otkriće postavilo je centralno citološko pitanje:»da li ovakva organizacija postoji i u interfaznom jedru, odnosno da li postoji interfazni hromozom kao organizacioni kontrapunkt mitotičkog hromozoma«? Kako je to danas: organizacija interfaznog hromozoma Interfazni hromozom zaista poseduje sve organizacione domene mitotičkog, metafaznog hromozoma (telomere, centromere, sekundarna suženja, G i R trake) koji su na specifičan način uobličeni u nukleusu. Njegova organizacija studirana je na modelu hromozoma limfocita i HeLa ćelija (a-g). 2

3 Svaki od homologih interfaznih hromozoma okupira u nukleusu diskretnu teritoriju koja se naziva hromozomskom teritorijom (najčešće nisu lokalizovani jedan pored drugog). Većina hromozomskih teritorija lokalizovana je uz nukleusni ovoj iako postoje i centralno pozicionirani hromozomi. (a) Interfazni hromozom limfocita broj 18 leži na nukleusnoj lamini, telomerama je vezan za nukleusni ovoj (preko lamine i specifičnih receptora unutrašnje membrane nukleusnog ovoja, vidi *Organizacija nukleusne lamine). Telo hromozoma u vidu hromozomske teritorije radijalno se pruža ka centru nukleusa i»naslanja«na nukleolus. Površina hromozomske teritorije oivičava interhromozomski prostor i nije glatka jer na sebi nosi brojne duboke uvrate i izvrate sa hromatinsime petljama (aktivni geni su na površini hromozomske teritorije). Celokupni interfazni hromozom upakovan je u tu strukturuhromozomsku teritoriju- pomoću nukleoskeleta. Sekvence DNK hromozoma kojima se vezuje za nukleoskelet specifične su po broju i rasporedu za svaki od hromozoma. (b) Centromera je u slučaju hromozoma 18 humanog limfocita prikačena za nukleusnu laminu. To je transkripciono inaktivan domen. Centromera (a kod kvasca i telomere) ima sposobnost gašenja gena: aktivacijom geni se udaljuju od centromere, a gašenjem joj se približavaju. (c) Stupanj kondenzacije je različit u okviru jedne hromozomske teritorije. Konstitutivni heterohromatin se nalazi uz nukleusnu laminu, delimično u unutrašnjosti hromozomske teritorije (srž) i kao nukleolusni heterohromatin (na vrhu). Konstitutivni euhromatin je lokalizovan na površini hromozomske teritorije. Ostali, veći deo hromozoma u stanju je dinamičke izmene između fakultativnog hetero- i euhromatina (ako je potrebna transkripcija napr. gena 23 koji je u unutrašnjosti hromozomske teritorije i visoko kondenzovan, heterohromatičan doći će do njegove aktivacije i on će rasplitanjem preći u euhromatin i pomeriti se ka površini teritorije, i obrnuto). (d) Raspored regiona interfaznog hromozoma bogatih A-T i G-C parovima, odnosno regiona siromašnih genima/bogatih genima je relativno stalan unutar hromozomske teritorije. Genima-siromašni hromatin lociran je na periferiji, u bliskom kontaktu sa nukleusnom laminom u nivou nukleusnog ovoja i infoldacijom lamine u srž teritorije kao i oko nukleolusa. Genima-bogati hromatin lociran je između. (e) Funkcioni domeni interfaznog hromozoma su petljaste strukture sa kojih se aktivno transkribuje. Interhromozomski kompartment nukleusa (interhromozomski kanali)»prihvata«transkripte, obrađuje ih i transportuje u formi multimernih kompleksa splajsozoma. 3

4 Dakle, osim petlje kao strukturne forme u nukleusu se susreću fibrili i globule, odnosno granule. Njihovo formiranje, pozicija i pokretljivost duboko reflektuju funkciju nukleusa. Specifično organizovane hromozomske teritorije Ćelije ženki sisara poseduju u genomskoj garnituri dva X-hromozoma od koji je samo jedan aktivan i organizovan u opisanu hromozomsku teritoriju. Drugi X-hromozom inaktiviran je, heterohromatizovan i formira tzv. Barovo telo (bukalna sluzokoža) ili»bubanjski štapić«(heterofilni granulocit). Nukleusne organele Hromatin nije jedina strukturno uočljiva komponenta nukleusa. Postoji čitav niz strukturno uobličenih domena, nukleusnih tela koja se sa pravom mogu označiti kao nukleusne organele. Iako organele nisu uspostavljene membranom specifična organizacija nukleoskeleta i pridruženih proteina»odvaja«ih funkciono od ostatka nukleusa. Nukleolus je najranije uočena i najbolje studirana organela nukleusa.»nastaje«iz oblasti sekundarnog suženja (citološki se označava kao organizator nukleolusa, B. McClintock, 1934) metafaznih hromozoma u telofazi uporedo sa restauracijom interfaznog nukleusa. Može biti pozicioniran i centralno i periferno, uz nukleusni ovoj. Broj nukleolusa varira (1-5), ali je njihova površina u odnosu na nukleus konstantna (veći broj sitnijih nukleolusa ili manji broj krupnijih). Odlikuje se bazofilijom na nivou svetlosne mikroskopije uočava se kao plava granula. Pod elektronskim mikroskopom uočavaju se tri domena, organizovana i obojena na specifičan način. Bledi,»prazni«ili fibrilarni kružni regioni u centru označeni su kao pars chromosoma. To je region hromozoma u kome su smešteni višestruko ponovljeni ribozomalni geni. Oko njih se koncentrično raspoređuju tamne, guste oblasti od tankih fibrila (koji dominiraju) i sitnih granula pars fibrosa. A oko njih se lepezasto, zrakasto pruža pars granulosa, koju čine mnogobrojne krupne granule. U zavisnosti od broja i pozicije hromozoma koji poseduju sekundarno suženje u interfaznom nukleusu mogu se formirati različite morfološke forme nukleolusa: prstenasti ili mrežasti nukleolusi. Ne radi se o različitim tipovima nukleolusa već o razlici u broju i rasporedu ribozomalnih gena u pars chromosoma koji formiraju jednu ili više transkripciono aktivnih petlji. U slučaju jedne petlje, vizuelno će se formirati prstenasti, a u slučaju više petlji mrežasti nukleolus. Strukturnu»podršku«organizaciji nukleolusa daje specifičan nukleoskelet i protein nukleolin. 4

5 Nukleolusu su pridružene dve nukleusne organele: perinukleolarni (perinukleolusni) kompartment, koji je»prilepljen«uz nukleolus i SAM68. Ima ih od 1-10, i varijabilne su veličine (0.25-1μm). Kahalovo (Kajalovo) telo ima ih od 1-10, loptastog su oblika (0.1-1μm). Njima se najčešće pridružuju tzv. blizanac telo (gemini) i seckajuće telo. Broj im je isti kao i broj Kahalovih tela (blizanci) ili je upola manji od njih (seckajuće telo). U nekim ćelijama uz nukleusnu laminu uočava se specifično loptasto telo-pcg telo (to je region gde je centromera prikačena za nukleusni ovoj-pericentromerni heterohromatin). Ima ih 2-100, veličine μm. PML telo se uočava u ćelijama obolelih od promijeloidne leukemije. Ima ih od 10-30, veličine od 0.3-1μm. Pored loptastih, u nukleusu postoje i kompartmenti koju su nukleusne pege (tačke, mrlje, eng. speckles), perihromatinske fibrile, perihromatinske granule i interhromatinske granule. Nukleusne pege su brojne, ima ih 25-50, citološki se javljaju u dve forme: klaster ( μm) i granule (20-25nm). Perihromatinski fibrili i perihromatinske granule, kako im ime kaže, nalaze se na periferiji hromatina, odnosno hromozomskih teritorija i to: fibrili svuda oko hromozomske teritorije, a granule su uglavnom pojedinačne i uz nukleusne pore. Fibrili su različitih dužina i debljina, a granule su dijametra 25-30nm sa»praznim«oreolom. Interhromatinske granule lokalizovane su u interhromozomskim prostorima, veličine oko 20nm, najčešće su u klasterima koji»odgovaraju«mestima lokalizacije nukleusnih pega. Zapravo, kada se posmatra pod svetlosnim mikroskopom vide se pega, a pod elektronskim mikroskopom su interhromatinske granule. Funkcija nukleusnih organela Nukleus interfazne diferencirane ćelije sintetiše, obrađuje i transportuje u citoplazmu irnk, trnk, preribozome i male ribonukleoproteinske komplekse kao SRP (vidi ***Poliribozomicitoplazmatični i granuliranog retikuluma). Nukleusne organele su zapravo dinamične oblasti nukleusa koji učestvuju i kompartmentalizuju ove procese. Kako? Transkripcija rrnk, trnk i biogeneza ribozoma Da je nukleolus vitalan za život ćelije uočio je još Kasperson god. U nukleolusu se odigrava sinteza rrnk i trnk kao i asambliranje preribozoma. U pars chromosoma nalaze se mnogo puta ponovljeni geni za rrnk, koji se prepisuju policistronski u jedan dugačak 5

6 primarni transkript- 45 S rrnk. Kako se sintetiše, 45 S (forma fibrila) se istovremeno udaljava od pars chromosoma ka pars fibrosa. U pars fibrosa on će biti iseckan na tri rrnk koje ulaze u sastav ribozomalnih subjedinica (18 S, 28 S i 5.8 S rrnk), savijen u prostoru i udružen sa proteinima, dajući sukcesivno preribozom. Njima će se pridružiti 5 S rrnk koja se sintetiše u oblasti euhromatina. Zato se u pars fibrosa vide fibrile (međustupnjevi seckanja, 18 S, 28 S i 5.8 S rrnk) i sitne granule (splajsozomi i asamblirajući preribozomi). U pars granulosa dospevaju gotovo formirani preribozomi na finalnu doradu (kompletiranje ribozomalnih proteina). Zato su regioni nukleolusa zapravo»proces praćen na putu«. Transkripcija i obrada irnk Transkripcija irnk odigrava se na petljastim domenima hromozomskih teritorija. Nasintetisanim irnk molekulima pridružuju se proteini koji će ih štititi i obrađivati tokom vođenja do nukleusnih pora kroz interhromozmske hodnike. Obrađivanje primarnog transkripta irnk prilično je složen proces koji uključuje isecanje introna, povezivanje egzona, formiranje specifičnih krajeva itd. Zatim se obrađene irnk kompleksovane sa proteinima transportuju kroz kompleks nukleusne pore. Nukleusne organele su vizuelni «dokaz«kompartmentalizacije transkripcije, obrade irnk i preribozoma u nukleusu i transporta do kompleksa nukleusnih pora Sa citološkog gledišta opisana priča izgleda ovako: perihromatinski fibrili (primarni transkripti irnk) pomeraju se iz oblasti periferije hromozomskih teritorija u unutrašnjost interhromatinskih prostora i postupno obrađuju (interhromatinske granule u nukleusnim pegama- splajsozomalna ostrvca) i»postaju«perihromatinske granule koje su pristigle u oblast nukleusnih pora. A šta sa ostalim, brojnim nukleusnim organelama? One su depoi svih proteina, enzima (pol I, II i III), transkripcionih faktora, splajsozomalnih faktora i dr., koji su neophodni za odigravanje gore opisanih procesa. Tako se Kahalovo telo smatra najvećim depoom pobrojanih faktora koji se u njemu asambliraju u komplekse- transkrptozome ili splajsozome i kao preformatirani kompleksi»prilaze«mestima delovanja. Nepostojanje membrana oko nukleusnih organela može se objasniti upravo zahtevom za brzom izmenom molekularnih kompleksa i molekula između domena. Jedino što se citološki u interfaznom nukleusu ne može uočiti u opisanom putu jeste transkripcija (najverovatnije usled brzine procesa, i maskiranosti transkriptozomima i pratećim proteinima). Ovaj proces moguće je citološki studirati in vitro, tako na elektronmikrografijama uočavamo strukturu»božićno drvce«- citološki dokaz sinteze i obrade 6

7 primarnih transkripata irnk (odn. rrnk): RNK-polimeraza kao niz granula na niti DNK, niz rastućih fibrila u jednom smeru (rastući primarni transkript), a na njihovim vrhovima granulesplajsozomi. Ipak, u živom svetu postoje ćelije koje poseduju posebne, specijalizovane hromozome koji su usled svoje»preuveličane«funkcije sami strukturno»preuveličani«tako da je moguće uočiti procese transkripcije i in vivo. Specijalizovani hromozomi Četkasti (petljasti) hromozomi su mejotički spareni hromozomi u oocitama, spojeni hijazmama (4 molekula DNK). To su džinovski hromozomi, dobro se vide pod svetlosnim mikroskopom, poseduju džinovske petlje i ekstremno su aktivni u transkripciji (oocite imaju veliku potražnju za preribozomima). Politeni, višenitni, paf-hromozomi (puff) nalaze se u nukleusima pljuvačnih žlezdi Drosophila. Jako su zadebljali i na njima se uočavaju svetle i tamne trake (potpuno liče na zadebljale metafazne hromozome) i balončići odn. pafovi sa leve i desne strane u nivoima pojedinih gena. Izgled i višenitnost hromozoma potiču od mnogostruke duplikacije DNK, (funkciona poliploidija). Interesantno je da replikacija DNK duž hromozoma nije homogena, odnosno telo hromozoma je višenitno, dok je nukleolus loptast, sa mnogo manje niti. Naime, strukturni geni nalaze se u jednoj kopiji u telu hromozoma, a u nukleolusu ribozomalni geni su višestruko ponovljeni, tako da se različitim stepenom replikacije nukleolusa i tela hromozoma kompenzuje razlika u»dozi«gena. U nivou pafova dominantne su petlje (mesta aktivne transkripcije) Balbijanijevi prstenovi, sa kojih se transkripcijom formiraju Balbijanijeva telašca (irnk) sa proteinima. Transport translacione mašine u citoplazmu kroz kompleks pore Kompleks nukleusne pore je dijametra 9nm. Sve što je veće od toga transportuje se aktivnim transportom pomoću regulatornih faktora. Regulatorni faktori prepoznaju s jedne strane to što želimo da transportujemo, i sa druge strane- kompleks pore. (Citološki je ispravnije reći transport kroz kompleks nukleusne pore, a ne nukleo-citoplazmatski transport). Da li se produkti transkripcije- irnk i rrnk transportuju odvojeno ili zajedno kroz kompleks pore? Stara citološka teorija informozoma postulira da irnk iz nivoa euhromatina prolazi kroz nukleolus gde vezuje»svoje«preribozome i trnk čineći funkcioni paket. Citološki, u kontekstu strukture nukleusa, deluje»rasipnički«da ćelija sintetiše irnk, rrnk i trnk na 7

8 različitim mestima, da one izlaze kroz različite komplekse pora, a onda u citoplazmi nasumično formiraju poliribozome. Balbijanijevi prstenovi, tj. Balbijanijeva telašca su citološki dokaz da kroz kompleks nukleusne pore prolaze informozomi (raspliće se Balbijani telašce, prateći proteini ostaju u nukleusu, pora se širi, irnk prelazi u citoplazmu, pri čemu se odmah asamblira sa već prisutnim ribozomima u poliribozome i translacija odmah započinje). Signali za smer transporta kroz kompleks nukleusne pore- nukleus-lokalizujuša sekvenca (NLS) i nukleus eksportna sekvenca (NES) Šta određuje u kom smeru će se dešavati transport kroz poru? (nukleus i citoplazma aktivno komuniciraju). Smer određuju regulatorni proteini: importini (unose u nukleus) i eksportini (iznose iz nukleusa). Najpoznatije klase su a i ß importin, i eksportin1. Sistem prepoznavanja određeni domeni proteina koji se transportuje kroz kompleks pore od 1-8 aminokiselinasu- nukleus lokalizujući signal, (NLS sekvenca) i nukleus eksportna sekvenca (NES). Importin se vezuje za NLS, dok eksportin prepoznaje NES. Citoplazmatični i nukleusni domeni kompleksa pore prihvataju transportne komplekse, pora se širi i omogućava transport. Širenje pore omogućava vezivanje importina ili eksportina za nukleoporine kompleksa pore, jer dovodi do»otpuštanja«određenog broja nukleoporina. Kako se importini i eksportini transportuju zajedno sa molekulima neophodno je njihovo vraćanje u matični kompartment (nukleus ili citoplazma). Ran-GTP azni sistem vrši vraćanje importina/eksportina tako što postoji u dve forme Ran-GTP i Ran-GDP koji predominantno imaju različitu distribuciju u nukleusu, odnosno citoplazmi i to je»sila«koja ih tera da se vraćaju u matični kompartment, noseći pri tome i importine/eksportine. Prstenaste lamele Poseban način transporta translacionih mašina u citoplazmu jesu prstenaste lamele. To su paketi paralelno poređanih membrana organizovanih kao nukleusni ovoj sa dvema membranama, cisternom i porama, jer i potiču od njih. Naime, u slučaju kada ćelija ima izrazitu potrebu za sintezom proteina i to na granulisanom retiklulumu, nukleus je prinuđen da osim informozoma citoplazmi transportuje i membrane. Ti paketi membranskih lamela sukcesivno sazrevaju u granulirani endoplazmin retikulum. Sadržaj nukleusnih pora transformiše se u poliribozome, membrane fuzionišu i formira se sistem endomembrana za sintezu proteina. 8

9 Sinteza proteina odigrava se u različitim kompartmentima ćelije Iako se sinteza proteina na modelu poliribozma školski studira u citoplazmi ili na membranama endoplazminog retikuluma (granulirani endoplazmin retikulum), u ćeliji postoje i drugi kompartmenti na i u kojima se odigrava translacija. Tako, mitohondrije poseduju sopstvene ribozome i vrše translaciju u matriksu, poliribozomi se mogu prikačiti i za spoljašnju membranu nukleusnog ovoja, ali i sam nukleus može vršiti sintezu proteina (procenjuje se na 10-15% ukupne sinteze proteina u ćeliji). 9