transkripcija Matrica i enzimi Transkripcija Sličnosti između replikacije i transkripcije Razlike između replikacije i transkripcije

Transcript

1 Transkripcija Sinteza RNK molekula. DNK lanac služi kao matrica za sintezu RNK. Transkripcija Tip RNK molekula Ribozomalna RNK (rrnk) Male RNK (trnk; snrnk; 5S rrnk; scrnk; mirnk ) Informaciona RNK (irnk ili mrnk) % zastupljenost u eukariotskoj ćeliji Uloga 75 Formira jezgro ribozomalne subjedinice i katalizuje sintezu proteina 15 Transport AK., splajsing, regulacija genske ekspresije, transport proteina itd. 10 Kodira proteine Sličnosti između replikacije i transkripcije Oba procesa koriste DNK lanac kao matricu. Fosfodiestarske veze se formiraju u oba slučaja. Kod oba procesa pravac sinteze je u 5-3 smeru. replikacija transkripcija matrica Oba lanca Jedan lanac substrat dntp NTP primer (začetnik) da enzim DNK polimeraza RNK polimeraza ne produkt dsdnk ssrna bazni parovi Razlike između replikacije i transkripcije A-T, G-C A-U, T-A, G-C Matrica i enzimi Ceo genom treba da se replikuje, ali samo mali deo genoma treba da se transkribuje i to kao odgovor na fiziološke potrebe u organizmu. Delovi DNK koji se transkribuju u RNK nazivaju se strukturni geni. 1

2 Matrica Matrični lanac je onaj lanac koji služi kao šablon za sintezu RNK. On se takođe naziva i antismisaoni lanac (antisense strand). Kodirajući lanac (coding strand) je lanac čiji redosled baza kodira amino kiseline proteina, još se naziva i smisaoni lanac (sense strand). G C A G T A C A T G T C coding strand C G T C A T G T A C A G template strand transkripcija G C A G U A C A U G U C RNA Asimetričan proces Samo jedan od dva lanca DNK služi kao matrica za transkripciju Ali oba lanaca mogu se koristiti kao matrica. Smer transkripcije različitih lanaca je suprotan. RNK polimeraza Enzimi odgovorni za sintezu RNK DNK-zavisne RNK polimeraze. Prokariotska RNK polimeraza je protein izgrađena od više podjedinica, mase od oko~480kd. Eukarioti imaju tri vrste RNK polimeraza koje su zadužene za transkripciju različitik RNK. Holoenzim Holoenzim RNK-pol kod E.coli sastoji se iz 5 subjedinica: 2. Telo enzima Holoenzim 2

3 RNA-pol E. Coli subjedinica MW funkcija Determiniše koja će se DNK transkribovati Katalizuje polimerizaciju Vezivanje i otvaranje DNK matrice Prepoznaje promotor i inicira transkripciju Rifampicin, lek koji se koristi kod bolesnika sa tuberkulozom vezuje se za subjedinicu RNK-pol, i inhibira RNK sintezu. RNK-pol drugih prokariota slična je po strukturi i funkciji RNK pol E. coli. RNK-pol I II III produkt Sensitivnost na Amanitin RNK-pol eukariota 45S rrnk (5,8S; 18S;28S ) hnrnk snrnk;scrnk 5S rrnk trnk U6 snrnk Ne visoka umerana Prepoznavanje početka transkripcije Pojedinačni transkripcioni region se naziva operon. Operon uključuje strukturne gene i uzvodno regulatorne sekvence. Promotor je sekvenca na DNK za koju se vezuje RNK-pol. Ključna tačka za kontrolu transkripcije. Amanitin je specifican inhibitor RNK-pol. Promotor Građa promotora prokariota regulatory sequences promotor RNA-pol structural gene region T T G A C A A A C T G T -10 region start T A T A A T A T A T T A (Pribnow box) Konsenzus sekvence 3

4 -35 nukleotoda nalazi se region TTGACA -10 nukleotoda nalazi se region TATAAT (Pribnovljeva kutija) PROCES TRANSKRIPCIJE Osnovni koncept Tri faze: inicijacija, elongacija i terminacija. Prokariotska RNK pol se direktno vezuje za DNK i otpočinje transkripcioni proces. Kod eukariota RNK pol se vezuje zajedno sa transkripcionim faktorima za DNK lanac i otpočinju proces transkripcije. Transkripcija kod prokariota Inicijacija: RNK-pol prepoznaje promotor i otpočinje transkripcija. Elongacija: RNK lanac kontinuirano raste Terminacija: RNK-pol zaustavlja sintezu i nastala RNK-a se odvaja od DNK matrice. Inicijacija RNK-pol prepoznaje TTGACA region, i spusti se do TATAAT regiona, tako se otvaras DNK heliks. Otvoreni region je dužine 17 1 bp. Prvi nukleotid u transkripciji RNK je uvek purin trifosfat. GTP je mnogo češći od ATP. pppgpn-oh struktura ostaje sve dok se ne završi transkripcija Ova tri molekula formiraju transkripcioni inicijalni kompleks. RNK-pol ( 2 ) - DNK - pppgpn- OH 3 4

5 Prajmer (začetnik) nije neophodan za sintezu RNK. subjedinica se vezuje na prepoznavajuću sekvencu. Telo enzima se kreće duž DNK i otpočinje elongacija. 1) RNK pol se veže nespecifično za DNK i kreće duž molekula 2) σ subjedinica se veze za -35 i -10 sekvence i tako nastaje zatvoreni promotorski kompleks. 3) RNK pol raspliće dnk lanac i počinje polimerizacija slobodnih NTP u 5-3 smeru 4) σ subjedinica potom disocira od srži RNK pol koja se kreće duž DNK i vrši elongaciju Elongacija Rast polinukleotidnog lanaca RNK Telo RNK pol i elongacioni faktori uspostavlja fosfodiestarske veze između nukleotida, raspliće lanace DNK i rekonstrukcija heliksa DNK po ugrađenim nukleotidima. RNK-pol, DNK segment od ~40bp i nascentna RNK formiraju kompleks nazvan transkripcioni mehur. 3 kraj nascentne RNK hibridizuje sa DNK matricom, dok 5 kraj rastućeg lanca RNK izlazi van transkripcionog mehura. Transkripcioni mehur Terminacija Završetak sinteze RNK. Vrši se na sekvenci koja se naziva terminator. Terminacija moze biti : -zavisna ili - nezavisna. 5

6 zavisna terminacija Bez učešća posebnih faktora Sekvenca bogata obrnutim ponavljanjem GC parova iza koje slede četiri A Formira se struktura petlje nalik na ukosnicu -nezavisna terminacija Formiranje petlje Disocijacija RNK sa kalupa DNK faktor, hexamer, je istovremeno ATP-aza i helikaza. Transkripcija eukariota Inicijacija Za inicijaciju transkripcije neophodan je promotor i ushodni regulatorni kontrolni elementi. Cis-delujući elementi su specifične sekvence na DNK matrici koji regulišu transkripciju jednog ili više gena. enhancer Cis-delujući elementi cis-acting element structural gene GCGC CAAT TATA exon intron exon start GC box TATA box (Hogness box) CAAT box Transkripcioni faktori TF koji učestvuju u transkripciji RNK-pol ne može da se veže direktno za promotor. RNK-pol II udružuje se sa 6 TF, TFII A - TFII H. Trans-delujući faktori su proteini koji prepoznaju i vezuju se direktno ili indirektno za cis-delujuće elemente i tako regulišu aktivnost. 6

7 Prvo se vezuje jedna subjedinica TFIID za TATA blok (koji se nalazi uzvodno od mesta početka transkriocije i ima ulogu da postavi preinicijacioni kompleks). To je molekul sedlastog oblika sa dva simetrična domena od kojih svaki nosi po jednu petlju koja oblikom podseća na uzengiju. Zatim se za subjedinicu TFIID vezuje bar još osam proteina Zatim dolaze TFIIA i TFIIB TFIIF vezuje se za RNA polimerazu II i donosi je do promotora (kao δ subjedinica prokariota) posle vezivanja RNA polimeraze II dolaze TFIIE,TFIIH i TFIIJ. Time se završava formiranje kompleksa i sledi njegova aktivacija za koju je potrebna hidroliza ATP-a katalizovana faktorom TFIIH. Preinicijalni kompleks (PIK) Transkripcija pomoću RNK polimeraze I (gena za rrnk) Geni za rrnk nemaju TATA kutiju. TBF se veže za Inr nizove (tkz.inicijator). Inicijacija transkripcije rrnk. TF UBF(faktor koji se veže uzvodno) i SF1 (selekcioni faktor 1) vežu se za promot rrnk a potom se veže i RNK poli I stvarajući tako inicijalni kompleks. Transkripcija pomoću RNK polimeraze III (gena za trnk, 5S rrnk) Geni koje prepisuje RNK poli III imaju dva tipa promotora: Promotor gena za 5S rrnk i trnk nalaze se nizvodno od mesta inicijacije transkripcije. Promotor gena za U6 snrnk je uzvodno od mesta inicijacije. Elongacija Slična kao kod prokariota Procesi transkripcije i translacije se ne odvijaju istovremeno. Terminacija Terminaciona sekvenca je AATAAA sledi posle GT ponovaka. Terminacija je spregnuta sa posttranskripcionom modifikacijom. POST-TRANSKRIPCIONA MODIFIKACIJA 7

8 Sintetisana RNK=primarni transkript. Modifikacijom primanog transkripta nastaju funkcionalane trnk, rrnk,i irnk. irnk- modifikacija hnrnk Primarni transkript za irnk se naziva heteronuklearna RNK (hnrnk). hnrna je duža od zrele irnk. Modifikujacije: Dodavanje kape na 5 - kraj Dodavanje polia rep na 3 - kraj Splajsing Editovanje irnk Dodavanje kape na 5 - kraj OH OH N H 2 N N O O O O N H 2 C O P O P O P O CH 2 N HN O O O O N O CH 3 Pi O OH O P O O O NH N NH 2 AAAAA-OH Kapa irna ima ulogu u prepoznavanju inicijalnih faktora translacije (cap-binding protein). Dodavanje kape se odvija pre splajsinga. m 7 GpppGp metil-guanozintrifosfat Kapa se dodaje posle ugrađenih nukleotida Poly-A rep na 3 - kraju (poliadenilacija) Splajsing (splicing) Posle više od 1000 bp na 3 kraju (10-35 bp iza sekvence AAUAAA signalna sekvenca i uzvodno od druge signalne sekvence bogate GU parovima) endonukleaza preseca lanac i polimeraza dodaje poly A rep. i RNK za histone nemaju poly A rep Povećava stabilnost irnk, učestvuje u transportu i interakciji sa ribozomom. DNK irnk Zrela irnk je mnogo kraća od DNK matrice. 8

9 Geni eukariota Strukturni geni se sastoje iz kodirajućih delova egzona i nekodirajućih delova introna. irnk splajsing Tačka grananja Kidanje na 5 mestu prekrajanja i spajanje za A u intronu. Nastaje poluproizvod sličnog lasu. I korak bp L A B C D E F G Kidanje na 3 mestu prekrajanja i spajanje egzona. II korak A-G nekodirajući regioni 1-7 kodirajući regioni Spalajsozom proteini i snrnk (U1-U6)=snRPN Vezivanje U1snRPN za mesto prekrajanja na 5, kraju (SS). N amastu grananja se vezuje U2 snrpn. U4/U6 i U5 snrpn ulaze u splajsozom i vrše isecanje introna i spajanje egzona. Alternativni splajsing Editovanje irnk Odvija se na nivou transkripcije Jedan gen odgovoran za više od jednog proteina Npr. apolipoprotein B (apo B) hnrnk ( baza) CAA u UAA (glut- STOP) At 6666 Jetra apo B100(500 kd) creva apo B48(240 kd) trna Duga od bp- 4s Sekundarna struktura u obliku trolisne deteline 4 mesta ( 2 nespecifična i 2 specifična) Nespecifična: mesto vezivanje ak.-cca i mesto za interakciju sa ribozomom Specifična: antikodonsko mesto i mesto za interakciju sa aminoacil-trnk sintetazom Obrada trnk Pre trnk RNazaP (ribozim P) kida na 5 kraju trnk RNaza kida na 3 kraju Dodavanje CCA na 3 kraj Modifikacija baza Uridin se modifikuje u: ribotimidin (T), dihidrouridin (DHU) i pseudouridin (ψ). Guanozin se modifikuje u: inozin (I), metilguanozin (mg) 9

10 rrna Obrada rrnk 45S transkript u jedru je prekursor za tri vrste rrnk. Zdrele rrnk zajedno sa proteinima čine ribozom 10