METABOLIZAM I REGULACIJA HISTONSKIH IRNK "ŽIVOT

Transcript

1 METABOLIZAM I REGULACIJA HISTONSKIH IRNK "ŽIVOT BEZ POLI-A REPA" Histoni su primarne proteinske komponente hromatina. Na početku se smatralo da su uglavnom uključeni u pakovanje DNK, odnosno da su važni samo za strukturu hromatina. Danas je poznato da imaju važnu ulogu u epigenetičkoj regulaciji ekspresije gena zahvaljujući posttranslacionim modifikacijama njihovih N-krajeva. Procenjuje se da u ćelijama sisara ima oko 10 8 molekula svake vrste histona nukleozoma (H2A, H2B, H3 i H4). Tokom relativno kratke S faze ćelijskog ciklusa ćelija mora da koordiniše replikaciju DNK i sintezu ogromne količine svakog tipa histona, kao i brzo organizovanje roditeljskih i novosintetisanih histona u cilju formiranja hromatina. Obezbeđivanje ogromne količine histona tokom S faze ćelijskog ciklusa omogućeno je postojanjem ponovljenih setova histonskih gena i njihovom koordinisanom ekspresijom koja je čvrsto regulisana ćelijskim ciklusom: histonske irnk se brzo eksprimiraju na početku S faze, prisutne su u visokim koncentracijama tokom S faze, a degraduju se na kraju S faze, ili brzo tokom same S faze ukoliko replikacija DNK zastane. 1. ORGANIZACIJA HISTONSKIH GENA Kod većine organizama geni za pet vrsta glavnih histona, H2A, H2B, H3, H4 i H1, su jedini geni za proteine koji su u genomu prisutni u velikom broju identičnih ili skoro identičnih kopija. Takođe, histonski geni spadaju u retke eukariotske gene koji ne sadrže introne. Histonski geni su organizovani u ponovljene setove (kvintete), sačinjene od 5 različitih gena razdvojenih segmentima koji se ne transkribuju. Raspored gena i smer transkripcije u kvintetima je evoluciono očuvan. Netranskribovane sekvence se značajno razlikuju između vrsta, ali i između ponovljenih kvinteta u istom genomu. Histonski geni su grupisani zajedno u genomima svih ispitivanih eukariota. Histonske grupe gena obično sadrže višestruke kopije gena koji kodiraju pet različitih histona. Postoje dva tipa grupisanih histonskih gena: tandemski ponovljeni setovi gena, u kojma jedinica ponavljanja sadrži po jednu kopiju svakog od pet histonskih gena koje su identično raspoređene (slika 2), i "zbrkani" (eng. jumbled) setovi gena, u kojima ne postoji identičan raspored pet histonskih gena i u kojima pojedinačni geni za svaku vrstu histona nisu identični. Na primer, genom žabe sadrži tandemski ponovljne setove gena za histone, dok genomi ptica i sisara imaju "zbrkane" setove. Ne postoji korelacija između veličine genoma i ukupnog broja histonskih gena. Na primer, ptice i sisari imaju 10 do 20 kopija seta od pet histonskih gena, vinska mušica ima oko 100 (dužine oko 5 kb), a morski jež nekoliko stotina kopija. Dakle, broj setova histonskih gena u genomu D. melanogaster je nekoliko puta veći od broja setova histonskih gena kod sisara, a njen genom je oko 20 puta manji od genoma sisara. Ovo znači da D. melanogaster ima mnogo više histonskih gena nego što je potrebno za ćelijski ciklus somatskih ćelija, sa njihovom relativno dugom S fazom. Međutim, ovoliki broj histonskih gena bi mogao biti potreban za kraj oogeneze kako bi obezbedio dovoljan broj histonskih proteina za rano embrionalno razviće. Alternativno, svaki pojedinačni gen bi mogao biti eksprimiran na 1

2 relativno niskom nivou. U oba slučaja, tandemski ponovljena organizacija gena obezbeđuje da se sintetiše jednaki broj svake histonske irnk, što ujedno daje i jedno od najverovatnijih objašnjenjenja zašto je ovakva genomska organizacija histonskih gena zadržana tokom evolucije. Slika 2. Organizacija histonskih gena kod D. melanogaster. Strelice označavaju smer transkripcije pojedinačnih gena. Jedan od mogućih razloga zašto se setovi histonskih gena fizički održavaju zajedno tokom evolucije jeste da omoguće definisanje nuklearnih subdomena u kojim se dešava efikasna sinteza histonskih irnk. Naime, fizička povezanost ponovljenih setova histonskih gena omogućava da se oni dovedu do Kahalovih tela (eng. Cajal body), nukearnih domena koji su specifično obogaćeni faktorima neophodnim za ekspresiju histonskih gena. U ćelijama sisara i u oocitama žabe Kahalova tela sadrže U7 snrnp, koja je neophodna za specifičnu obradu 3'-kraja histonskih irnk, koje su jedine eukariotske irnk koje ne sadrže poli-a rep. Kahalova tela, slično nuklearnim pegama (eng. nuclear speckles), sadrže faktore splajsovanja, i/ili imaju ulogu kao zalihe faktora za obradu RNK ili predstavljaju sama mesta obrade. Kahalova tela kod kičmenjaka su, takođe, mesta sazrevanja snrna i asembliranja snrnp. Nalaze se na nekoliko mesta u nukleusu, uključujući i mesto koje je u blizini histonskih gena u ćelijama sisara i u oocitama žaba. U nukleusima ćelija D. melanogaster postoji samo jedno Kahalovo telo i odvojeno telo, označeno kao telo histonskog lokusa (eng. histone locus body, HlB). Smatra se da u ovim ćelijama Kahalovo telo ima funkciju u sazrevanju snrnk, dok je HlB asocirano sa setovima histonskih gena i obradom histonskih pre-irnk. Oba tela se nalaze u blizini nukleolusa i često su blizu jedno drugom, ali se ne preklapaju. Nekoliko reči o varijantnim histonima Pored ponovljenih setova gena za histone H2A, H2B, H3, H4 i H1, postoje i geni za nekoliko varijantnih histona koji se ekprimiraju tokom celog ćelijskog ciklusa i čije irnk imaju poli-a repove. Široko zastupljene varijante histona jezgra su H3.3, H2A.Z i H2A.X. Varijantni histoni H3.3 i H2A.Z markiraju aktivne gene i odgovorni su za održavanje otvorene strukture hromatina. Histonski oktameri koji sadrže oba ova varijantna histona su ekstremno osteljivi na disrupciju i uočeno je da se nalaze u promotrima i enhenserima transkripciono aktivnih gena, regionima hromatna koje je u tom trenutku ne sdarže nuklozome. H2A.X je varijantni histon H2A, široko rasprostranjen među nukleozomima. Razlikuje se od H2A po evluciono konzerviasnom motivu na C-kraju, u okviru koga Ser na poziciji 159 može biti fosforilisan. Brza modifikacija ovog tipa dešava se pri pojavi dvolančanih prekida usled različitih fizičkih i hemijskih agenasa, i to u onim H2A.X koji se nalaze u blizini prekida DNK. Ser159 fosforilisana forma H2A.X se označava kao γ-h2a.x. Smatra se da ova 2

3 fosforilacija dovodi do lokalne dekondenzacije hromatina koja olakšava regrutovanje proteina za popravku dvlančanog prekida DNK. Zbog ove osobine γ-h2a.x se koriste kao markeri dvolančanih prekida u ćeliji. 2. HISTONSKE IRNK irnk tranksribovane sa gena za H2A, H2B, H3, H4 i H1 histone, kao i svi drugi transkripti Pol II, imaju strukturu kape na 5'-kraju, ali za razliku od svih drugih eukariotskih irnk ne sadrže poli-a rep. Umesto poli-a repa, njihove irnk na 3'-kraju imaju jedinstvenu strukturu drška-petlja. Za strukturu drška-petlja na 3'-kraju histonskih irnk vezuje se protein SLBP (eng. stem-loop binding protein). Struktura drška-petlja na 3'-kraju histonskih RNK sa vezanim proteinom SLBP je ključna za život histonskih RNK i učestvuje u svim aspektima njihovog metabolizma: omogućava koordinisanu obradu, translaciju i degradaciju svih histonskih irnk, regulaciju ekspresije histonskih irnk čvrsto povezanu sa ćelijskim ciklusom i regulaciju produkcije histona tokom ranog razvića kod metazoa. Histonske irnk odlikuju i kratki regioni 5'- i 3'-UTR, od svega nekoliko destina nukleotida (slika 6). U 3'-UTR-u nalazi se sekvenca od 25 ili 26 nukleotida, evoluciono očuvanu kod svih metazoa. Ona uključuje 5 nukleotida pre stukture drška-petlja, region koji formira strukturu drška-petlja, i 4 do 5 nukleotida posle ove strukture. Rastojanje od stop kodona do konzervisane sekvence koja formira strukturu drška-petlja iznosi nekoliko destina nukleotida. Slika 6. Struktura H2A, H2B, H3, H4 i H1 irnk i obrada 3'-kraja. a) Histonske irnk metazoa ne sadrže introne i imaju kratke 5'- i 3'-UTR-ove. Rastojanje od stop kodona do konzervisane sekvence koja formira strukturu drška-petlja u 3'-UTR-u iznosi od 14 do 50 nukleotida. b) Konzervisana sekvenca od 26 nukleotida u 3'-UTR-u formira strukturu drška-petlja i vezuje protein SLBP. Ova sekvenca je praćena sekvencom HDE, koja se bazno sparuje sa U7snRNK. Kompleks za kidanje, koji se sastoji od CPSF73, CPSF100, simplekina, verovatno FIP1 i još nepoznatih faktora, uvodi prekid pet nukleotida nizvodno od strukture drška-petlja, i uzvodno od HDE. Komponenta sa enodukleolitičkom funkcijom je CPSF73. U7snRNK je komponenta snrnp, koja sadrži heptamerni prsten od 5 proteina Sm (plavi krugovi) i dva proteina slična proteinima Sm (LSM10, tamno plavi krug, i LSM11, plavi oval). LSM11 stupa u interakciju sa proteinom ZFP100 (protein sa cinkanimprstima od 100 kd), koji ujedno uspostavlja interakcije i sa kompleksom SLBP-drška-petlja. 3

4 Kod većine vrsta irnk prepisana sa gena za histon H1 ima isti 3'-kraj kao i irnk prepisane sa gena za histone jezgra. Izuzetak su H1 irnk kod C. elegans i C briggsae, čiji je 3'-kraj poliadenilovan. irnk prepisane sa gena za varijantne histone sadrže poli-a rep. 3. METABOLIZAM HISTONSKIH IRNK Karakterističan 3'-kraj histonskih irnk zahteva delom različit set proteina za regulaciju ekspresije i metabolizma u odnosu na irnk sa poli-a repom. Najznačajniji među njima su: SLBP, SLIP1 (eng. SLBP intracting protein 1), U7 snrnp, i drugi (tabela 1). Neki od faktora koji učestvuju u metabolizmu histonskih irnk, učestvuju i u metabolizmu poliadenilovanih irnk (tabela 1): CPSF, LSM1, DCP1-DCP2, Xnr1, Upf1. Tabela 1. Faktori uključeni u metabolizam histonskih irnk Histonske gene sisara konstituitivno transkribuje Pol II, a brzina njihove transkripcije se povećava kako se ćelija približava S fazi. Protein NPAT (eng. nuclear protein ataxiatelangiectasia locus) sadrži domen koji stimuliše transkripciju histonskih gena. On se konstituitivno, tokom celog ćelijskog ciklusa, nalazi u Kahalovim telima koja su lokalizovana blizu histonskih gena. Na početku S faze protein NPAT se fosforiliše pomoću kompleksa ciklin E-ciklin-zavisna kinaze 2 (CycE-CDK2), što rezultuje u povećanoj ekspresiji histonskih gena. S obzirom da geni za histonske proteine ne sadrže introne, njihova obrada podrazumeva samo dodavanje 5'-kape i endonukleolitičko sečenje u 3'-delu rastućeg transkripta. Kroz ova dva koraka nastaju zrele histonske irnk. Interesantno je da eksperimentalna insercija introna u histonski gen dovodi do poliadenilacije irnk prepisane sa takvog konstrukta. Neki od proteina koji učestvuju u endonukleolitičkom oslobađanju histonskih irnk dovode i do oslobađanja poliadenilovanih irnk, dok su neki specifični samo za histonske irnk (tabela 1). Sekvence bitne za oslobađanje histonskih irnk se razlikuju od onih koje dovode do oslobađnja pre-irnk koje će biti poliadenilovane. Endonukleolitičko sečenje se dešava između strukture drška-petlja i nizvodnog histonskog elementa (eng. histone downstream element, HDE), sekvence bogate purinima koja se nalazi 15 nukleotida nizvodno od samog mesta kidanja. 4

5 U prvom koraku formiranja 3'-kraja histonskih irnk, za strukturu drška-petlja na 3'-kraju histonskih irnk vezuje se protein SLBP (slika 6). SLBP je mali protein, sastavljen iz 73 aminokiseline, koji poseduje RNK-vezivni domen, koji nije sličan sa nijednim RNKvezivnim domenom drugih proteina. 5'-kraj U7 snrnk, koja je komponenta U7 snrnp lokalizovane u Kahalovim telima, komplementarno se vezuje za element HDE (slika 6). SLBP i U7 snrnp zajedno regrutuju faktore kidanja CPSF73 (eng. cleavage and polyadenylation specificty factor), CPSF100, simplekin, i verovatno FIP1 (slika 6), od kojih su svi i deo kompleksa za endonukleolitičko kidanje irnk koje će biti poliadenilovane, i među kojima CPSF73 ima aktivnost endonukleaze. CPSF73 u histonskim irnk uvodi prekid pet nukleotida nizvodno od strukture drška-petlja, i uzvodno od HDE. Zrele histonske irnk se transportuju iz nukleusa u citoplazmu gde formiraju kružnu strukturu i efikasno se translatiraju. Cirkularizacija histonskih irnk uključuje drugačiji mehanizam u odnosu na onaj koji dovodi do cirkularizacije poliadenilovanih irnk, međutim 3'-kraj je kod obe grupe irnk esencijalan za translaciju in vivo. Protein SLBP ostaje vezan za histonske irnk i u citoplazmi, i neophodan je za translaciju. Interakcija između SLBP vezanog za 3'-kraj i eifg, vezanog za 5'-kraj, posredovana je proteinom SLIP1 (eng. SLBP interacting protein 1), što dovodi do cirkularizacije histonskih irnk, čime se efikasnost translacije povećava (slika 7). Slika 7. Opšti pregled metabolizma histonskih irnk u ćelijama sisara. Transkripcija histonskih gena i obrada nastale pre-irnk dešava se u blizini Kajalovih tela. U7 snrnp, SLBP i kompleks za kidanje odgovorni su za oslobađanje pre-irnk od matrice DNK i formiranje zrele histonske irnk. Protein SLBP ostaje vezan za histonsku irnk i u citoplazmi, gde dolazi do njene cirkularizacije kroz interkacije proteina SLBP, SLIP1 i EIF4G, što stimuliše translaciju. Na kraju S faze, kratak oligo-u rep se dodaje na hisronske irnk u citoplazmi. Prstenasti kompleks LSM1-LSM7 se vezje ua oligo-u rep i pomaže u regrutovanju kompleksa za otklanjanje 5'-kape i egzozoma, tako da se histonska irnk degraduje u oba smera. Dodatno, kompleks ciklin A-ciklin-zavisna kinaza 1 (CycA-CDK1) fosforiliše 5

6 SLBP kako bi pokrenule njegovu degradaciju na kraju S faze, sprečavajući dalju sintezu histonakih irnk. (CPSF cleavage and polyadenylation specificity factor; DCP mrna decapping enzyme; HDE histone downstream element; LSM Sm-like protein; NPAT nuclear protein ataxiatelangiectasia locus; TUTase terminal uridylyltransferase; XRN1 5 3 exoribonuclease 1). Kako se ćelija približava kraju S faze, potreba za novim histonskim proteinima se smanjuje, i nivo histonskih irnk opada. Smanjenje nivoa histonskih irnk se postiže na nivou transkripcije kod S. cerevisiae, kod kojih je polu-život irnk sam po sebi veoma kratak. Suprotno, kod sisara smanjenje nivoa histonskih irnk je rezultat brzog smanjenja poluživota (brze degradacije) irnk kada se replikacija DNK završi ili blokira. Cis element koji posreduje u njihovoj degradaciji je struktura drška-petlja na 3'-kraju. Degradacija zahteva da struktura drška-petlja bude blizu stop kodona, što je u skladu sa zapažanjem da kod svih histonskih irnk metazoa struktura drška-petlja počinje 25 do 60 nukleotida iza stop kodona. Degradacija histonskih irnk zahteva protein SLBP, koji služi za regrutovanje terminalne uridiltransferaze (TUT-aze), enzima koji će dodati kratak oligo-u rep na histonake irnk (slika 7). Oligo-U rep je optimalno mesto za vezivanje proteina LSM1-7, koji regrutuje enzime za otklanjanje 5'-kape (DCP1-DCP2), što dalje vodi degradaciji histonskih irnk u smeru 5 3' citoplazmatičnom formom egzoribonukleaze Xnr1 (slika 7). Dakle, 3'-kraj i protein SLBP su neophodni za tri koraka u metabolizmu irnk: obradu, translacijiu i degradaciju. Kompleks ciklin A -ciklin-zavisna kinaza 1 (CycA-CDK1) fosforiliše SLBP kako bi se pokrenula njegovu degradaciju na kraju S faze, sprečavajući dalju sintezu histonskih irnk. 4. REGULACIJA HISTONSKIH IRNK ĆELIJSKIM CIKLUSOM Histonske irnk koje kodiraju histone proteinskog jezgra nukleozoma i histon H1, spadaju u irnk koje su čvrsto regulisane ćelijskim ciklusom. U ćelijama sisara postoje četiri regulatorna mehanizma koji doprinose da se histonski proteini akumuliraju odgovarajućom brzinom tokom ćelijskog ciklusa. To su transkripcija histonskih gena, efikasnost obrade histonske pre-irnk, promene u poluživotu histonske irnk i degradacija viška histonskih proteina. Akumulacija histonskih irnk neposredno pred ulazak ćelije u S fazu razultat je trostrukog do petostrukog povećanja transkripcije histonskih gena i oko desetostrukog povećanja efikasnosti obrade histonskih irnk (procenta histonskih irnk koje stignu do citoplazme). Struktura drška-petlja u 3'-UTR-u histonskih irnk je cis element koji određuje posttranskripcionu regulaciju histonskih irnk, i u velikoj meri određuje njihovu ekspresiju koja je strogo regulisana ćelijskim ciklusom. U ćelijama koje se "zarobe" u G1 fazu ćelijskog ciklusa, dolazi do poremećaja u obradi histonskih irnk. U ćelijama sisara koje se kontinuirano dele, protein SLBP je ragulisan ćelijskim ciklusom, i ova regulacija je tesno povezana obradom histonskih irnk tokom ćelijskog ciklusa. Protein SLBP se sintetiše čim ćelija uđe u S fazu, a brzo se degraduje na kraju S faze (slika 7). Ovaj protein je vezan za zrele histonske irnk tokom njihovog životnog ciklusa i direktno učestvuje u njihovoj obradi, translaciji i degradaciji. Dakle, nivo proteina SLBP određuje maksimalan nivo histonskih irnk koje mogu da se akumuliraju u citoplazmi. Kada ćelije stigne do kraja S faze, histonske irnk se brzo degraduju zajedno sa proteinom SLBP. Mada je nivo proteina SLBP i histonskih irnk paralelan tokom ćelijskog ciklusa, molekularni signali koji ih regulišu su različiti (slika 8). Preciznoj regulaciji sinteze histonskih proteina doprinosi i stalno podešavanje poluživota histonskih irnk, tako što se podešava nivo transkripcije histonskih irnk tokom same replikacije DNK. Naime, nivo histonskih irnk 6

7 i replikacija DNK su čvrsto povezane tokom S faze. Inhibicija replikacije DNK u sredini S faze dovodi do brze degradacije histonskih irnk, ali ne i do promene nivoa proteina SLBP. Dodatno, stabilizacija proteina SLBP, ne sprečava degradaciju histonskih irnk na kraju ćelijskog ciklusa. Degradacija SLBP na kraju ćelijskog ciklusa zahteva aktivaciju sa CycA-CDK1. Ekspresija histonskih irnk, koja je ograničena na S fazu i vezana je za njihovu brzu degradaciju na kraju S faze konzervisana je kod svih meatazoa, koje su razvile sofisticiran posttranskripcioni regulatorni sistem koj koristi strukturu drška-petlja i SLBP kao glavne cis i trans elemente. Ovo omogućava razlikovanje histonskih irnk od svih drugih ćelijskih irnk, kao i brzo podešavanje nivoa histonskih irnk. Histonske irnk kod nižih eukarota i kod biljaka su poliadenilovane, ali je njihova akumulacija takođe ograničena na S fazu. Kod kvasca, histonske irnk su primarno regulisane na nivou transkripcije i imaju kratak poluživot, što dovodi do njihovog brzog nestanka kada transkripcija prestane na kraju S faze. Molekularna osnova regulacije histonskih irnk kod biljaka nije poznata do detalja. Slika 8. Regulacija histonskih irnk tokom ćelijskog cikusa kod metazoa. Prikazan je nivo histonskih irnk, proteina SLBP i irnk za SLBP tokom ćelijskog ciklusa kod sisara. Tokom G1 faze postoji nizak nivo histonskih irnk i proteina SLBP. Akumulacija histonskih irnk zahteva aktivaciju CycE-CDK2 i fosforilaciju proteina NPAT. Tada dolazi do brzog povećanja nivao histonskih irnk, što koinicidra sa ulaskom ćelije u S fazu. Završetak replikacije DNK na kraju S faze ili inhibicija replikacije, na primer usled otećenja DNK, rezultuju u brzoj redukciji nivoa histonskih irnk. Nivo proteina SLBP se takođe brzo povećava kako se ćelija približava S fazi, a redukuje se aktivacijaom cyca-cdk1 na kraju S faze, ali ne i inhibicijom replikacije DNK tokom S faze. Nepravilnost u U7 snrnp dovodi do zarobljavanja u G1 fazi ćeijskog ciklusa, što ukazuje na postojanje kontrolne tačke za histone. (cyclin E (cyce) CDK2 cyclindependent kinase 2, NPAT phosphorylation of nuclear protein, ataxiatelangiectasia locus). Pored regulacije histonskih irnk, postoji i mehanizam koji degraduje višak histonskih proteina, koji se verovtno nagomilavaju tokom kratkog perioda pre nego što ćelija degraduje histonske irnk na kraju S faze. Targetiranje viška histonskih proteina za degradaciju uključuje specifičnu fosforilaciju histona i proteinski kompleks koji sadrži kinazu RAD53, koja spada u kinaze koje proveravaju kontrolne tačke ćelijskog ciklusa. Ovaj sistem je 7

8 okarakterisan kod S. cerevisiae, i verovatno je prisutan kod svih eukariota, ali to još uvek čeka potvrdu. Ćelije sisara imaju sofisticirane regulatorne mehanizme, označene kao "kontrolne tačke", kako bi bile sigurne da ne napredaju kroz faze ćelijskog ciklusa a da posotje oštećenja u DNK ili nedovoljno izvora da se završi određena faza ciklusa. Kontrolne tačke tokom S faze, mitoze i G1 faze proveravaju da li u ćeliji ima dovoljno ribozomskih proteina neophodnih za ćelijski rast. Skoriji rezultati podržavaju mogućnost u G1 fazi postoji kontrolna tačka za proveru histonskih proteina. Naime, uklanjenje komponenti U7 snrnp, posebno ZFP100 (koji je komponenta aktivne U7 snrnp), dovodi do zarobljavanja ćelije u G1 fazi ćelijskog ciklusa, što ukazuje da je prisustvo aktivne U7 snrnp esencijalno za progeresiju kroz G1 fazu i ulazak u S fazu. 5. REGULACIJA HISTONA TOKOM RANOG RAZVIĆA Odmah nakon oplodnje, zigoti metazoa, koji ne sintetišu DNK ali sadrže uskladištne faktore neophodne za replikaciju hromatina, iniciraju biohemijske puteve neophodne za replikaciju hromozoma. Nakon, oplodnje, hromatin spermatozoida se remodeluje i histonski proteini uskladišteni u oociti pakuju DNK spermatozoida. Mnogi organizmi čiji se embrioni razvijaju van tela majke (na primer, vodozemci, insketi, bodljkošci i neke ribe) odlikuju se ranim razvićem sa brzom serijom deoba, povećavajući količinu hromatina u embronu nekoliko stotina do nekoliko hiljda puta za samo nekoliko sati. Ovi ćelijski ciklusi se često karakterišu naizmeničnim S i M fazama, dok G faze izostaju. Takođe, tokom ovog vrmenena izostaje i rast embriona, i obično nema transkripcije. Ovo znači da sve komponente neophodne za ovakvo rano razviće moraju biti uskladištene u oocitama i da je ekspresija gena regulisana na translacionom nivou. Tokom ranog embrionalnog razvića potrebe za histonskim proteinima u mnogim vrstama su veće nego tokom bilo kojeg stadijuma razvića organizma, i ove potrebe se rešavaju skadištenjem odgovarajuće količine histonskih proteina ili irnk. Različiti organizmi koriste različite strategije da odgovore na potrebe za histonskim proteinima tokom ranog razvića, kontrolišući promene u metabolizmu histona tokom sazrevanja oocita i tokom razvića ranog embriona (slika 9). Kod svih strategija, jedinstevni 3'-kraj histonskih irnk ima glavnu ulogu. Kod D. melanogaster, histonski proteini se čuvaju u jajnim ćelijama u količini dovoljnoj za razvoj stadijuma od nekoliko hiljada ćelija. Tokom tog vremena, histonski proteini se nalaze u kompleksu sa histonskim šapreonima (N1-N2 za histone H3 i H4 i nukleoplazmin za histone H2A-H2B), koji služe kao proteini za skladištenje histona. irnk koja se koristi da sintetiše ove embrionalne histone sintetiše se u nurse ćelijama tokom kratkog vremenskog perioda na kraju oogeneze. U ranom embrionu, protein SLBP nije aktivan i nema transkripcije histonskih gena, a koriste se uskladišteni histonski proteini dok se ne aktivira transkripcija histonskih gena. Sinteza histonskih irnk u embrionu, počinje tek nakon tog perioda. X. laevis koristi različitu stratgiju da reši ovaj problem. On ima potrebu za produkcijom mnogo veće količine histonskih proteina (100 do 1000 puta), s obzirom na mnogo veći genom i veći broj ćelijskih deoba tokom ranog razviča, pre nego što se opet inicira transkripcija histonskih gena. I histonske irnk i histonski proteini se akumuliraju tokom rane oogeneze. U zrelim oocitama velika količina histonskih irnk se ne translatira zato što je za 8

9 njih vezan protein SLBP karakteristilan za oocite, xslbp2. xslbp2 ima sličan domen za vezivanje za RNK kao i xslbp1, ali što je važno ne sadrži domen za interkaciju sa xslip1, koji zapravo aktivira translaciju. U ovoj situaciji xslbp2 reprimira translaciju histonskih irnk. xslbp2 se degraduje 6 sati nakon tretmana sa progesteronom kako bi se inicirala sazrevanje oocite, što omogućava vezivanje xslbp1 i aktivaciju translacije. odnosno sinteze histonskih proteina. Ova strategija postojanja dva SLBP proteina, od kojih jedna služi za inaktivaciju translacije sa histonskih irnk, je izgleda evoluciona novina prisutna samo kod vodomzemaca. Sisari su razvili opet drugačiji mehanizam za reguaciju početka produkcije histona tokom ranog razvića. Histonske irnk se čuvaju u oocoti, ali se ne translatiraju, verovatno usled niskog nivoa proteina SLBP. Kada dođe do sazrevanja oocite, SLBP irnk se translatiraju, rezultujući u povećanju količine proteina SLBP i aktivaciji translacije histonskih irnk. Slika 9. Strategije za snadbevanje histonskim proteinima tokom ranog razvića. a) Kod D. melanogaster, histonske irnk se sintetišu na kraju oogeneze, translatiraju u proteine i irnk dospevaju u oocitu iz nurese ćelija. U ranom embrionu, protein SLBP nije aktivan i nema transkripcije histonskih gena., a koriste se uskladišteni histonski proteini dok se ne aktivira transkripcija histonskih gena. b) Kod X. laevis, histonske irnk se produkuju tokom rane oogeneze i translatiraju kako bi se uskladištili histonski proteini. Histonske irnk produkovane tokom kasnije oogeneze se čuvaju u asocijaciji sa xslbp2, koji repeimira njihovu tranlsaciju. xslbp2 se razgrađuje tokom maturacije oocite, a za histonske irnk se zatim vezuje xslbp1 i aktivira se translacija uskladištenih histonskih irnk. d) Kod M. musculus, histonake irnk i irnk za SLBP se sintetišu u oocitama, ali ne dolazi do akumulacije proteina SLBP. Tokom sazrevanja oocite, dolazi do akumualcije proteina SLBP usled translacije maternalne irnk. Proteini SLBP zatim aktiviraju translaciju maternalnih histonskih irnk. 9