Struktura nukleoida E. coli. a) u izolovanom nespiralizovanom stanju. b) hromozom podeljen u nekoliko petlji povezanih malim RNK molekulima.

Transcript

1 PRINCIPI GENETIKE 8 Euhromatin i heterohromatin. Struktura i funkcija hromozoma. Genetičke osnove deobe ćelija. Ponašanje hromozoma u mitozi i mejozi. Vanjedarno nasleđivanje. Organizacija genoma mitohondrija

2 Struktura nukleoida E. coli. a) u izolovanom nespiralizovanom stanju. b) hromozom podeljen u nekoliko petlji povezanih malim RNK molekulima. c) svaka petlja se dodatno superspiralizuje. d) tretman spiralizovanog genoma endonukleazom dovodi do relaksacije DNK samo u tretiranim petljama e) tretman RNA-zom raspliće samo delove povezane malim RNK molekulima.

3 NUCLEUS

4 Nivoi pakovanja nasledne informacije u ćeliji

5 Šematska ilustracija strukture nukleozomskog čvorića Svaki nukleozomski čvorić koji se sastoji od histonskog oktamera je obmotan sa DNK koju čini 146 baznih parova. Ovaj proteinski histonski oktamer čini po dva elementa histona H2A, H2B, H3 i H4. Svaki histon se sastoji od amino kiselina. Svaki histonski oktamer vezan je za susedni slobodnim delom vezujuće DNK.

6 Građa nukleozoma

7 Hromatin je kompleks DNK, proteina i malih količina RNK. Hemijske analize izolovanog hromatina govore da se sastoji iz DNK i proteina uz male količine RNK. Proteini su grupisani u dve velike klase: histoni i nehistonski hromozomski proteini. Histoni imaju glavnu ulogu u strukturiranju hromatina. Prisutni su u hromatinu svih viših eukariota u količinama ekvivalentnim količini DNK (približno isti težinski odnos). Histoni obuhvataju 5 različitih proteina: H1, H2a, H2b, H3 i H4, prisutnih skoro u svim tipovima eukariotskih ćelija uz malobrojne izuzetke (u spermatozoidima se umesto histona nalaze mali bazni proteini tzv. Protamini). Histoni su bazni proteini, bogati aminokiselinama lizinom i argininom (sadrže 20-30% arginina i lizina). Pozitivno naelektrisani ostaci baznih aminokiselina histona mogu lako da interreaguju sa kiselim fosfatnim grupama u DNK. Histoni kompleksuju sa DNK i formiraju posebne strukture nukleozome. Svaki nukleozom sadrži po četiri molekula histona H2a, H2b, H3 i H4 (oktamer histona) oko kojih se nalazi DNK

8 Građa nukleozoma.

9 Struktura hromozoma

10 Lokalni region hromozoma se može ponašati kao posebna strukturna jedinica zahvaljujući specijalnoj ulogzi koju imaju histoni H1 u povezivanju nukleozomskih oktamera. Otpuštanjem histona H1, region se može naglo dekondenzovati po primanju informacije od strane nekog spoljašnjeg faktora. Smatra se da se dekondenzacija ovog tipa dešava pri procesu aktivacije gena.

11 Histoni pomažu pakovanju DNK u hromozome; kod čoveka se nalazi skoro 2 m DNK u diploidnom jedru. Otuda se postavlja pitanje kako je DNK upakovana u hromozome. Danas je izvesno da se u svakom hromozomu nalazi isključivo jedan linearni molekul DNK, koji se pruža od jednog kraja hromozoma preko centromere do drugog kraja hromozoma. Najveći hromozom u humanom genomu ima DNK dužine oko 85 mm (85000μm). Ovaj DNK molekul upakuje se u metafazni hromozom dijametra 0,5 μm i dužine oko 10 μm. To znači da se od golog molekula DNK do hromozoma ostvaruje kondenazcija od oko10000 puta. Nasuprot histonima, nehistonski proteini obuhvataju frakciju sastavljenu iz velikog broja jako heterogenih proteina. Sastav nehistonskih proteina jako varira ne samo između različitih vrsta, već i između različitih ćelija unutar istog organizma. Među nehistonskim proteinima treba, pored ostalog, tražiti regulatore genske aktivnosti.

12 Građa nukleozoma.

13 Pojam heterohromatina i euhromatina HETEROHROMATIN više kondenzovan, tamno obojen a) KONSTITUTIVNI DEO KONSTITUCIJE - centromerni i telomerni regioni b) FAKULTATIVNI inaktivirani X hromozom, Barovo telo EUHROMATIN svetliji, manje kondenzovan, aktivan

14 NUCLEUS

15 X hromozom konstutivni heterohromatin Centromerni heterohromatin euhromatin Humani kariotip (2n = 46, XY) obojen tehnikom G-traka

16 Genetičke analize ukazuju da je heterohromatin uglavnom genetički neaktivan. Većina do danas okarakterisanih eukariotskih gena locirana je u euhromatinskim regionima hromozoma. Štaviše, heterohromatin je, po pravilu, bogat visoko repetitivnim, tandemski raspoređenim DNK sekvencama. Molekularno biološke analize eukariotskoh hromatina pokazale su da postoje tri osnovna tipa DNK sekvenci: - visoko repetitivni nizovi (satelitska DNK) sastavljeni od višestruko ponovljenih kratkih nizova nukleotida, najčešće različitog baznog sastava od ukupne DNK. Prisutni su u svim, ili skoro svim, hromozomima, a sama funkcija ovih nizova još uvek nije dovoljno pojašnjena. - intermedijarna (srednje repetitivna) DNK obuhvata DNK sekvence sa znatno manjim brojem kopija u genomu - u poređenju sa visokorepetitivnom DNK. Pored ostalog, u srednje ponovljene nizove spadaju geni za rrnk, geni za trnk, za histone, α i β globine, tubuline, aktine itd.-

17 - unikalni nizovi ( jedinstvene sekvence) pokazuju veliku raznovrsnost i obuhvataju najveći broj strukturnih gena. Geni se mogu javiti samo u jednoj kopiji (engl. single copy ) ili u svega 2-3 kopije u genomu. Tipovi DNK sekvenci otkriveni su pre svega zahvaljujući proučavanju kinetike renaturacije DNK. Naime, rastavljanje lanaca DNK ostvareno dejstvom visokih temperatura ili hemijskih agenasa označeno je kao denaturacija DNK. Suprotan proces - ponovno uspostavljanje dvolančanog heliksa do kojeg dolazi po uklanjanju agenasa za denaturaciju, naziva se renaturacija DNK. Stepen renaturacije uveliko zavisi od koncentracije DNK u rastvoru i kompeksnosti DNK sekvence. Stoga je proces renaturacije kod visokorepetitivnih DNK najbrži i njaefikasniji, dok se renaturacija unikalnih nizova ostvaruje najsporije. Konačno, treba istaći da eukariotski hromozomi poseduju posebne strukture na svojim krajevima, tzv. telomere.

18 Već decenijama se zna da telomerni regioni imaju jedinstvene karakteristike. Barbara McClintock je pokazala da se odstranjivanjem telomera formiraju lepljivi krajevi hromozoma koji imaju tendenciju da se međusobno spajaju. Nasuprot tome, prirodni krajevi normalnih hromozoma stabilni su i nemaju tendenciju ka međusobnom spajanju. Danas se zna da postoji specifičan enzim telomeraza (transferaza telomera), sposoban da dodaje telomere na krajeve hromozoma. Funkcija samih telomera verovatno se sastoji u: - stabilizaciji hromozoma usled sprečavanja egzonukleaza da vrše degradaciju linearnih DNK s kraja hromozoma - sprečavanju fuzionisanja krajeva hromozoma sa drugim DNK molekulima - olakšavanju replikacije krajeva linearnih DNK. Naime, da nema telomera krajevi hromozoma bi se posle svakog ciklusa replikacije malo skraćivali - zato što na samom kraju lanca sa diskontinuiranom replikacijom ( lagging strand ) ne bi postojala DNK koja omogućuje sintezu RNK početnice sa slobodnim 3 -OH krajem.

19

20 B A C A. K A R I O T I P, B. K A R I O G R A M, C. I D I O G R A M

21 Četkasti hromozomi u ovocitima vodozemaca posmatrani pod svetlosnim

22 Politeni hromozomi pljuvačnih žlezda Drosophila melanogaster posmatrani pod svetlosnim mikroskopom

23 Kariogram psa 2n=78,XY

24 Kariogram mačke 2n=38,XY

25 Kariogram svinje 2n=38,XY

26 Kariogram govečeta 2n=60,XX

27 Kariotip bika obojen tehnikom G-traka, 2n = 60, XY.

28 Kariogram jarca 2n=60,XY

29 Kariogram ovna 2n=54,XY

30 Kariogram kobile 2n=64,XX

31 Kariogram kokoši 2n=18,ZW

32 Kariogram radilice medonosne pčele 2n=32,XX

33 Normalni kariotip svinje (2n=38, XX)

34 FUNKCIJA HROMOZOMA Poređenje kariotipova dve srodne vrste jelena: A. Muntacus reevesi i B. Muntiacus muntiak. (2n=46,XX/XY ) (2n=7,XY 1 Y 2 )

35 Ne postoji direktna korelacija između stepena filogentskog razvoja i broja hromozoma. Mada se kod srodnih vrsta može da javi sličan broj hromozoma, poznati su primeri da broj hromozoma znatno razlikuje kod veoma srodnih vrsta. Poređenjem broja hromozoma dve veoma srodne vrste jelena, utvrđeno je da vrsta Muntiacus munitak iz Indije ima samo dva para autozoma i tri polna hromozoma, dok vrsta Muntiacus reevesi iz Kine ima 22 autozoma i dva polna hromozoma Pojava blokova sa identičnim rasporedom gena u kariotipovima srodnih vrsta naziva se sintenijom hromozoma. Poređenjem genoma miša i čoveka pronađeno je ne samo da ove dve vrste imaju veliki broj zajedničkih gena, već veliki blokovi u genomu miša i čoveka sadrže isti redosled gena. Sintenija hromozoma svedoči o preuređivanjima (rearanžmanima) blokova gena tokom evolucije genoma. Hromozomi svojim ponašanjem tokom ćelijskog ciklusa omogućavaju ispoljavanje genetičkog materijala potrebno za ostvarivanje fenotipa ćelije, kao i ravnomernu raspodelu genetičkog materijala u ćerke ćelije pri ćelijskoj deobi

36 U periodu između dve ćelijske deobe (interfaza) hromozomi su u relativno dekondenzovanom stanju, tako da su omogućeni procesi transkripcije i translacije. Sintezom specifičnih proteina ostvaruje se karakterističan izgled i funkcionisanje ćelije. Pored toga, u interfazi dolazi do replikacije DNK, što predstavlja jedan od osnovnih preduslova da se ćelija kasnije podeli. Nakon replikacije svaki hromozom ima dve sestrinske hromatide, a svaka od njih sadrži isti molekul DNK. Za vreme deobe ćelije, hromozomi se prevode u maksimalno kondenzovan oblik pri čemu svaki hromozom sadrži dva identična molekula DNK u svojim sestrinskim hromatidama. Visok stepen kondenzacije DNK i proteina u metafaznim hromozomima neophodan je radi ravnomerne podele naslednog materijala. Velika količina DNK u eukariotskim genomima stvorila je potrebu za evolutivnim postankom kompleksno građenih hromozoma i ćeljskog ciklusa.

37 Šematski prikaz ćelijskog ciklusa

38 Faze ćelijskog ciklusa tipične ćelije sisara

39 Šematski prikaz osnovnih faza deobe životinjske ćelije

40 Šematski prikaz deobnog vretena kod životinjskih ćelija

41 b c Mitoza somatskih ćelija korenčića crnog luka a 1. INTERFAZA a) ćelijski zid; b) citoplazma; c) jedro; 1

42 d Mitoza somatskih ćelija korenčića crnog luka 2. PROFAZA d) hromatin 2

43 e Mitoza somatskih ćelija korenčića crnog luka 3. METAFAZA e) hromozomi u ekvatorijalnoj ravni; f) vlakna deobnog vretena; f 3

44 h g Mitoza somatskih ćelija korenčića crnog luka 4. ANAFAZA g) interhromozomska vlakna deobnog vretena; h) homologi hromozomi u razdvajanju; 4

45 i Mitoza somatskih ćelija korenčića crnog luka 5. TELOFAZA i) fragmoblast 5

46 b a c Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke 1. INTERFAZA a) ćelijska membrana; b) citoplazma; c) jedro; 1

47 d Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke 2. PROFAZA d) hromatin 2

48 e Mitoza somatskih e ćelija embriona pastrmke 3. METAFAZA e) hromozomi u ekvatorijalnoj ravni; f) aster; f 3

49 g Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke h 4. ANAFAZA g) interhromozomska vlakna deobnog vretena; h) homologi hromozomi u razdvajanju; 4

50 i Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke 5. TELOFAZA i) konstrikciona brazda 5

51 Ploidnost ćelije tokom mejoze i mitoze kod diploidne vrste organizama

52 Sinaptonemalni kompleks elektromikrografija Šematski prikaz mejoze I. Šematski prikaz Sinaptonemalnog kompleksa

53 a) b) Sinaptonemalni kompleks: a) elektronska mikrografija; b) šematski prikaz Diploten Pahiten

54 Shematski prikaz spermatogeneze (levo) i ovogeneze (desno) kod sisara

55 Faze gametogeneze

56 Uporedni prikaz spermatogeneze i oogeneze

57 Uporedni prikaz mejoze i mitoze

58 Poređenje mitoze i mejoze.

59 Vanjedarno (ekstranuklearno) nasleđivanje

60 Pod vanjedarnim (ekstranuklearnim) nasleđivanjem podrazumeva se ne- Mendelovski način distribucije fenotipskih osobina kod potomaka determinisanih genima u mitohondrijama ili plastidima. Izuzetno, neke bakterije i virusi, takođe, mogu predstavljati materijalnu osonvu vanjedarnih genetičkih elemeanta. Osnovni kriterijumi po kojima se može utvrditi da je reč o vanjedarnom nasleđivanju su: -razlike u fenotipskim odnosima pri recipročnim ukrštanjima. Pri recipročnim ukrštanjima sparuju se ženke soja A sa mužjacima soja B, a zatim mužjaci soja A sa ženkama soja B. Pod uslovom da se isključi nasleđivanje vezano za polne hromozome (odnosno u slučaju autozomalnih gena), razlike u fenotipskim odnosima pri recipročnim ukrštanjima ukazuju da jedan roditelj (najčešće ženka) ima veći uticaj na ispoljavanje osobine od drugog roditelja (mužjaka). -ženski gamet obično sadrži znatno više citoplazme od muškog gameta, te se može očekivati da utiče na odstupanje od Mendelovih pravila. Organele i simbionti u citoplazmi mogu da se izoluju i analiziraju i ukoliko se vanjedarna DNK dovede u vezu sa prenošenjem praćenih osobina, smatra se da je dokazano vanjedarno nasleđivanje.

61 - hromozomalni geni imaju svoje mesto na hromozomima u odnosu na ostale gene. Ukoliko se ne može ustanoviti vezanost sa nekim od hromozomalnih gena, osnovano se pretpostavlja da on pripada vanjedarnim genetičkim sistemima. -odsustvo Mendelovskog načina segregacije gena i nepostojanje tipičnih Mendelovih odnosa pri pojedinim tipovima ukrštanja navodi na sumnju da je reć o vanjedarnom nasleđivanju, - ukoliko se nakon eksperimenta zamene jedara, osobine prenose nezavisno od jedarnih gena, postoje jake indicije da su praćene osobine determinisane vanjedarnim genima.

62 Evolutivni put nastanka mitohondrija

63 - Mitohondrijalna DNK (mtdnk) nalazi se u nekoliko kopija u matriksu mitohondrija gde je obično raspoređena u nekoliko grupacija (nukleoidi). Nukleoidi su pričvršćeni za unutrašnju membranu mitohondrija. Po svojoj strukturnoj organizaciji nukleotidi su znatno bliži bakterijskim DNK, a ne eukariotskom hromatinu. Kao i kod bakterija, u sastavu mitohondrijalnih nukleoida nema histona. Veličina mtdnk slična je virusnim DNK i kreće se u rasponu od oko 6000 bp (Plasmodium falciparum, izazivač malarije kod čoveka) do preko bp kod nekih kopnenih biljaka. Kao i kod bakterija, molekuli mtdnk su većinom cirkularni, mada su primećene linearne mtdnk. Kod sisara je mitohondrijalni genom predstavljen cirkularnom DNK od oko bp (manje od 0,001% od veličine jedarnog genoma). Približno ista veličina mtdnk kao kod sisara, konstatovana je kod nekih jako udaljenih vrsta kao što su Drosophila i morski ježevi.

64 Relativna količina mtdnk u nekim tipovima eukariotskih ćelija Organizam Tkivo ili tip ćelija DNK molekula po organeli Organela po ćeliji % mtdnk od ukupne ćelijske DNK Pacov Jetra Kvasac* Vegetativna ćel Žaba Jajna ćelija

65 U ćelijama sisara mtdnk zauzima manje od 1% ukupne ćelijske DNK (Tabela 1). Međutim, u jajniim ćelijama vodozemaca, gde su potrebne velike rezverve mitohondrija za ranu embirogenezu, mtdnk zauzima čak 99% ukupne ćelijske DNK. Zahvaljujući relativno maloj veličini humane mtdnk, celokupna sekvenca od nukleotidnih parova određena je još godine. Primećene su neke neobične karakteristike humane mtdnk kojih nema ne samo u jedarnom genomu, već isto tako ni kod DNK bakterija i hloroplasta. Za razliku od ostalih genoma, u humanoj mtdnk skoro svaki nukleotid je deo kodirajućih sekvenci (za protein ili za rrnk), tako da je količlina regulatornih DNK sekvenci svedena na minimum. Pored toga, postoje svega 22 trnk koje učestvuju u sintezi proteina u humanim mihohondrijama (u hloroplastima ima bar 30 različitih trnk). Stoga su normalna pravila sparivanja kodon-antikodon u mitohondrijama fleksibilna. Naime, veći broj trnk prepoznaje samo prva dva kodona, dok na trećem kodonu postoji kolebljivost. Na taj način, sinteza proteina moguća je sa manjim brojem trnk nego u drugim genomima.

66 Opšta organizacija humane mitohondrjalne DNK

67 - Konačno, možda najmarkantnija razlika, je da 4 od ukupno 64 kodona u sastavu humane mtdnk imaju drugačije značenje (odstupanje od univerzalnosti genetičkog koda) Kodon Univerzalni kod sisari Mitohondrijalni kodovi* beskičme njaci kvasci biljke UGA STOP Trp Trp Trp STOP AUA Ile Met Met Met Ile CUA Leu Leu Leu Thr Leu AGA ili AGG Arg STOP Ser Arg Arg * kodovi koji odstupaju od univerzalnosti predstavljeni belom bojom

68 Univerzalnost genetičkog koda predstavlja jedan od osnovnih dokaza da svi organizmi potiču od istih predaka (monofiletsko poreklo života na Zemlji). Smatra se da usled neobično malog broja proteina kodiranih mtdnk, mogu da se tolerišu povremene promene u značenjima kodona, dok bi takva promena u velikom genomu ugrozila funkciju mnogih proteina i doprinela uništavanju ćelije. Ovu pretpostavku podržavaju nalazi da odstupanja od univerzalnosti genetičkog koda nisu ista u različitim gupama organizama. Interesanto je da se u mtdnk zamena nukleotida tokom evolucije javlja oko 10 puta brže u poređenju sa jedarnom DNK. Uzrok ove pojave može se tražiti u smanjenoj vernosti replikacije i/ili nedovoljno efikasnoj reparaciji mtdnk. Relativno velika brzina evolucije mitohondrijalne DNK omogućava da se poređenjem nukleotidnih sekvenci mtdnk kod bliskih vrsta odrede njihovi filogenetski odnosi.

69 MATERINSKIO NASLEĐIVANJE Pri materinskom nasleđivanju fenotip potomaka određen je jedarnim genima prisutnim u jajnoj ćeliji. Prema tome, za razliku od biparentalnog nasleđivanja u kome su fenotipske osobine potomaka određene jedarnim genima oba roditelja, pri materinskom nasleđivanju dolazi do prepisivanja (transkripcija) nasledne informacije ženskog gameta i akumulacije genskog produkta (irnk ili protein) u jajnoj ćeliji. Nakon oplođenja, akumulirani genski produkti tokom ranog razvića utiču na ispoljavanje fenotipskih osobina kod potomaka. Materinsko nasleđivanje može da se identifikuje na osnovu različitih fenotipskih odnosa kod potomaka iz recipročnih ukrštanja. Opisani su primeri trajne promene fenotipa pod uticajem gena majke, kao što je oblik uvijanja ljušture kod puža Limnaea peregra.

70 Jedinke genotipa dd imaju sinistralne (uvijene na levo) ljušture, dok se kod ostalih (genotipovi DD i Dd) javljaju dekstralne (na desno uvijene) ljušture. S obzirom da su ovi puževi hermafroditi mogu se izvršiti različiti oblici ukrštanja i samooplođenja. Pri recipročnim ukrštanjima rezultat zavisi od genotipa ženskog roditelja. Ženke genotipa DD ili Dd produkuju isključivo potomke sa dekstralnom ljušturom, dok su potomci dd ženki uvek sa sinistralnom ljušturom. Interesantno je da oblik ljušture zavisi samo od genotipa ženke, nezavisno od njenog fenotipa. Istraživanja ranog razvića Limnaea pokazala su da orijentacija deobnog vretena u prvoj deobi nakon oplođenja odrećuje pravac uvrtanja ljušture. Orijentacija deobnog vretena zavisna od dejstva materinskih gena koji se ispoljavaju još tokom ovogeneze. Ustanovljeno je da DD ili Dd ženke imaju funkcionalan genski produkt D alela koji se akumulira u citoplazmi jajne ćelije. Čak i u slučaju kada ovocit kod ovih ženki nakon mejoze sadrži genski alel d i oplodi se spermatozoidom sa genskim alelom d, potomci su genotipa dd ali će ipak imati dekstralne ljušture.

71 Nasleđivanje oblika ljušture kod Limnaea peregra