Cytotoxic Effects of Lagenaria siceraria Standl. Extract on Cancer Cell Line

Transcript

1 Cytotoxic Effects of Lagenaria siceraria Standl. Extract on Cancer Cell Line Mohammad Shokrzadeh 1, Atefeh Parvaresh 2, Somayeh Shahani 3, Emran Habibi 3, Zavosh Zalzar 2 1 pharmaceutical Research Center, Department of Toxicology and Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran 2 PhD Student in Pharmacology, Student Research Committee, Faculty of Pharmacy, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran 3 Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran (Received September 22, 2012 ; Accepted November 26, 2012) Abstract Background and purpose: In most cases, drugs used for chemotherapy are ineffective and have unpleasant side-effects. This has made scientists to find more effective drugs with less toxicity. Lagenaria siceraria is an important medicinal plant in the world and anti-tumoral activity of Lagenaria species has been reported in some studies. This study was designed to evaluate the anti-tumoral effect of methanolic extract isolated from Lagenaria siceraria on lung cancer cell line. Materials and methods: Hydroalcoholic extract of Lagenaria siceraria was prepared by percolation method. Cultivated cancer cell line of lung (A549) was incubated with different concentrations (0.1, 1, 10, 100, 250, 1000, 500, and 5000 µg/ml) of the extract for 72 hours and cell growth inhibition was determined using MTT assay. Cisplatin was considered as positive control. The resulting data was analyzed using ANOVA and t-test. Results: Results of MTT assay showed strong and dose-dependent inhibition of cancer cell growth by the extract of Lagenaria siceraria. This extract caused a significant decrease in proliferation of lung cancer cell line (IC50 = ± 6.5 μg/ml). Conclusion: The results of this study suggest anti-tumoral activity of Lagenaria siceraria, however, isolation of efficient compounds of this extract and evaluation of their effects on tumor-bearing animal models are suggested. Keywords: Lagenaria siceraria, tumor cell lines, growth inhibitors, MTT assay J Mazand Univ Med Sci 2013; 23(97): (Persian). 224

2 پژوهشي دوره بيست و دوم شماره 97 بهمن سال ( ) 1391 بررسي اثر سميت سلولي عصاره گياه Lagenaria siceraria بر روي رده سلول سرطاني ريه (A549) چكيده 1 محمد شكرزاده 2 عاطفه پرورش 3 سميه شاهاني 3 عمران حبيبي 2 زاوش زال زر سابقه و هدف: شيمي درماني يكي از روشهاي درمان سرطان ميباشد اما فقدان سايتوتوكسيسيتي انتخابي اغلب منجر به بروز عوارض جانبي غيرقابل تحمل ميگردد.امروزه استفاده از گياهان دارويي در درمان سرطان به دليل عوارض جانبي كمتر از اهميت فوقالعادهاي برخوردار است گياه Lagenaria siceraria Standl به دليل دارا بودن تركيبات پلي فنليك كوكوربيتاسينها پكتين فلاونوي يد و ساپونين براي مطالعات سميت سلولي با اهميت ميباشد. در اين مطالعه اثرات سايتوتوكسيك عصاره ميوه گياه بر رده سلول سرطاني ريه مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روشها: ابتدا عصاره هيدروالكلي ميوه گياه به روش پركولاسيون تهيه شد و سپس اثرات محلولهاي حاوي نمونه با غلظتهاي مختلف μg/ml) 0/1) بر روي رده سلولي سرطاني ريه (A549) توسط متد MTT بررسي شد. داروي سيس پلاتين به عنوان كنترل مثبت در نظر گرفته شد. محاسبات آماري براي مقايسه IC 50 با استفاده از گرفته است. نرمافزار آماري Ver.3 Prism انجام و مقايسه دادهها با روش آناليز واريانس (ANOVA) و t-test صورت يافتهها: يافتهها حاكي از آن است كه ميزان IC50 داروي ضد سرطان سيس پلاتين به عنوان يك داروي رايج در بازار به طور معنيداري كمتر از عصاره گياه كدو قلياني ميباشد با اين حال عصاره اين گياه اثر مهاركنندگي رشد قابل توجهي بر روي سلول سرطاني ريه نشان داد. استنتاج: نتايج نشان داد كه عصاره گياه Lagenaria siceraria يك تركيب سايتوتوكسيك مو ثر بر روي سلولهاي سرطاني ريه ميباشد و و بايد بررسيهاي بيشتري در جهت يافتن تركيبات مو ثر موجود در عصاره گياه صورت گيرد تا گامي در جهت يافتن و طراحي داروهاي جديد و مو ثر در درمان سرطان باشد μg/ml).(ic50 93/094= ± 6/5 واژه هاي كليدي: Lagenaria siceraria رده سلولي سرطاني MTTassay IC 50 مقدمه امروزه سرطانهاي گوناگون در سراسر جهان عامل بخش زيادي از مرگ و مير هستند. روشهاي درمان متفاوتي براي سرطانها وجود دارد كه ميتوان به جراحي شيمي درمان راديوتراپي هورمون درماني ايمنوتراپي و... اشاره داشت. در خصوص سرطان ريه نيز از روشهاي متفاوت استفاده ميشود كه شيمي atefeh_parvaresh@yahoo.com مو لف مسي ول: عاطفه پرورش - ساري: كيلومتر 18 جاده خزر آباد مجتمع دانشگاهي پيامبر اعظم دانشكده داروسازي 1. مركز تحقيقات علوم دارويي گروه سم شناسي/فارماكولوژي دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي مازندران 2. دانشجوي دكتراي داروسازي كميته تحقيقات دانشجويي دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي مازندران 3. گروه فارماكوگنوزي دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي مازندران تاريخ دريافت : 91/7/1 تاريخ ارجاع جهت اصلاحات : 91/7/22 تاريخ تصويب : 91/9/6 5

3 بررسي اثر محافظتي ال كارينيتن بر ليپيدپراكسيداسيون غشاي سلولي در موش صحرايي مواجهه يافته با سم ديازينون درماني سيستميك يكي از اين روشها ميباشد. اما فقدان سميت انتخابي اغلب منجر به بروز عوارض جانبي غيرقابل تحمل ميگردد. غير از روشهاي رايج ذكر شده امروزه استفاده از گياهان دارويي (خصوصا گياهان بومي) در درمان سرطان از اهميت زيادي برخوردار است. از طرف ديگر استفاده از كشت سلولي به منظور سنجش سايتوتوكسيسيته مواد شيميايي دارويي آفتكشها و بررسي In vitro تمامي تركيبات طبيعي و سنتتيك و... پيشرفت شگرفي را پيدا كرده است( 1 ). گياه دارويي كدو قلياني با نام علمي Lagenariaمتعلق siceraria به خانواده Cucurbitaceae ميباشد.اين خانواده تقريبا داراي 118 جنس و 825 گونه ميباشد. اين جنس يك گونه گياه يك ساله رونده دارد كه معمولا در مناطق گرمسيري پراكنده است و بيشتر به خاطر زينتي بودن آن كاشته ميشود. اين گياه در زبان فارسي به نام كدو قلياني شهرت دارد اما در زبان انگليسي به نام Lauki و در زبان هندي و اردو به نام Bottle Gourd شناخته ميشود. گياه كدو قلياني در اصل بومي هند و افريقا ميباشد( 2-4 ). ميوه گياه Lagenaria Siceraria منبعي از ويتامين C بتاكاروتن ويتامينهاي گروهB پكتين سطوح بالاي كولين به عنوان فاكتور ليپوتروپيك ساپونين روغنهاي ثابت ضروري و نيز شامل كوكوربيتاسين H G D B ميباشد. كوكوربيتاسينها دستهاي از تري ترپنوي يدهاي چهار حلقهاي هستند كه به علت دارا بودن خواص سايتوتوكسيك و ضد توموري مورد توجه قرار گرفتهاند كوكوربيتاسين ها به طور قراردادي به 12 گروه شامل A-T تقسيم شدهاند خصوصا كوكوربيتاسين E داراي اثرات سايتوتوكسيك ميباشد. اثرات عصاره ميوه كدو قلياني علاوه بر موارد مذكور ناشي از فلاونوي يدها تاننها استروي يدهايي مانند فوكوسترول و كامپسترول فنول و گليكوزيد هم ميباشد( 4-6 ). يك پروتي ين جديد مهاركننده فعاليت ريبوزومي (RIP) هم به نام Lagenin از عصاره ابي لي وفيليزه شده دانههاي گياه Laganaria siceraria جدا شده است كه داراي خواص ايمونوساپرسيو ضد وير سو و ضد HIV ميباشد. اين گياه داراي اثرات انتي اكسيدانت كارديوپروتكتيو هپاتوپروتكتيو ضد درد ضد التهاب ضدهايپرليپيدمي ضدهايپرگلايسمي ديورتيك و تنطيمكننده سيستم ايمنيست( 7-10 ) در مطالعهاي كه توسط آقاي kaushik Ghosh و همكاران در سال 2009 انجام شد پلي ساكاريدي محلول در آب از ميوه گياه Lagenaria siceraria جدا شد كه با متد NMR شناسايي و با متد MTT اثر سميت ان بر روي خط سلولي ادنوكارسينوماي پستان انسان (MCF-7) ثابت شد( ). در مطالعهاي ديگر كه توسط آقاي p,saha و همكاران در سال 2011 انجام شد اثر آنتي توموري عصاره متانولي اندامهاي هوايي گياه Lagenaria siceraria بر سلولهاي Ehrlich, sascites Carcinoma با القاء به موشهاي صحرايي مورد بررسي قرار گرفت و اثرات آن با داروي 5-FU مقايسه شد و در نهايت اثر آنتيتوموري آن با سنجش طول مدت زندگي موشها و سنجش پارامترهاي هماتولوژيكي بيوشيميايي بافت كبد موشها اثبات شد( 9 ). با توجه مطالعات صورت گرفته مشخص شده كه اولا مطالعهاي روي ميوه گونه مورد بررسي اين گياه به عمل نيامده ثانيا اثرات عصاره هيدروالكلي اين گياه روي رده سلولي سرطان ريه نيز مطالعه انجام نشده( 3-10 ) و لذا از آن جايي كه تا كنون تحقيق مشابهي از گونه Lagenaria siceraria در ايران بر روي رده سلولي سرطاني ريه انجام نشده لذا ما اثر عصاره هيدروالكلي اين گياه به منظور مهار رشد سلولهاي مورد نظر (سرطاني ريه)را مورد مطالعه قرار داديم. مواد و روشها الف) نحوه عصاره گيري سال 1390 نوع مطالعه آزمايشگاهي (Experimental) بوده و در مرحله اول جمعآوري ميوه گياه كدو قلياني 6

4 پژوهشي محمد شكرزاده و همكاران siceraria) (Lagenaria بود كه از استان مازندران روستاي دنگسرك شهرستان نكاء در اوايل فصل پاييز سال 1390 جمعآوري گرديد و با نمونه هرباريومي موجود در دانشكده داروسازي تهران مطابقت داده شده و نام علمي گياه توسط متخصص مربوطه تا ييد شده است. گام بعدي خشك كردن ميوه گياه مورد نظر بوده كه اين امر زير هود و در دماي اتاق انجام پذيرفت تا گياه كاملا خشك گرديد. سپس گياه خشك شده به كمك هاون شكسته و دانههايش از پوسته گوشتي جدا شد سپس پوسته ميوه را كه مورد نياز بود به كمك آسياب دستي خرد و ريز شد. در مرحله بعد 500 گرم از پوسته خشك شده به روش پركولاسيون و با حلال متانول 80 درصد عصاره گيري گرديد. عمل عصاره گيري 3 بار و با فاصله زماني 48 ساعت انجام شد. عصاره با استفاده از دستگاه تقطير در خلاء دوار evaporate) Rotary )تغليظ و به كمك دستگاه فريز دراير dryer) (Freeze در دماي 45- به مدت 3 روز كاملا خشك شد و به شكل پودر در آمد. در نهايت پودر خشك در ظرف شيشهاي در بسته و درون يخچال به دور از گرما و نور نگه داري شد تا زمان انجام آزمايشات كشت سلولي فرا برسد. ب) نگهداري و كشت سلولي در اين مطالعه رده سلولي سرطاني ريه انسان A549 كه از بانك سلولي انيستيتو پاستور تهران خريداري شدهاند از پاساژهاي سلولي بين 26 تا 31 در محيط كشت DMEM با 10 درصد سرم جنين گاوي (FBS) سديم پيرووات 100 ميلي مولار 1/5 سديم g/l بيكربنات و 1 درصد آنتيبيوتيك پ ين سيلين- استرپتومايسين كه در انكوباتور USA) (BINDER, در دماي 37 درجه سانتيگراد و رطوبت كافي و ميزان 5 درصد دي اكسيد كربن استفاده شد. براي انجام تستهاي مختلف زماني كه سلولها حداقل به 70 درصد رشد سلولي رسيدند توسط تريپسين- اتيلن دي آمين تترا استيك اسيد به مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ شدند. رسوب سلولي در يك سيسي محيط كشت به حالت سوسپانسيون تهيه شد و درصد زنده بودن سلولهاي موجود در سوسپانسيون سلولي با مخلوط شدن نسبت مساوي از تريپان بلو با استفاده از لام هموسايتومتر و بررسي با ميكروسكوپ نوري تعيين شد. پس از حصول اطمينان از عدم آلودگي سلولها از سلولهاي با درصد زنده بودن بالاي 90 درصد براي انجام تست استفاده شد( 8 3 ). ج) بررسي سميت سلولي گياه كدو قلياني با روش MTT assay به منظور بررسي اثر عصاره كدو قلياني بر رشد و تكثير سلولهاي سرطاني از روش رنگ سنجيام تيتي استفاده شد( ). اين روش يك تست متابوليك رقابتي ميتوكندريايي است و بر اساس شكستن نمك تترازوليوم توسط آنزيم سوكسينات دهيدروژناز ميتوكندريايي سلولهاي زنده استوار است. در اين روش ميزان 100 ميكرو ليتر محيط كشت حاوي تعداد 10 4 سلول در هر چاهك پليت 96 خانه قرار داده شد. پس از 24 ساعت انكوباسيون غلظتهاي / و ميكروگرم بر ميليليتر از عصاره گياه كدو به سلولها اضافه شد و طي 72 ساعت انكوبه شد پس از طي زمان مذكور به هر چاهك پليت 20 ميكرو ليتر ام تيتي (از شركت سيگما با غلظت 5 ميليگرم بر ميليليتر) اضافه شد و به مدت 4 ساعت ديگر در تاريكي انكوبه شد. پس از طي زمان لازم محيط كشت حاوي ام تيتي به دقت خارج شد و به هر خانه پليت ميزان 50 ميكرو ليتر محلول DMSO رقيق شده جهت حل كردن فورمازان ارغواني رنگ اضافه شد. پس از 15 دقيقه انكوباسيون در دماي اتاق جذب نوري هر چاهك با استفاده از دستگاه الايزا در طول موج 490 و 630 نانومتر قراي ت شد( 8 7 ). نتايج حاصله به صورت درصد بقاي سلولي در برابر غلظت عصاره گزارش ميشود. درصد بقاي سلولي اينگونه محاسبه ميشود: 100 (جذب نوري كنترل/ جذب نوري تست) = ميزان بقاي سلولي 1500 از ته فلاسك جدا شده و در دورrpm (EDTA) 7

5 بررسي اثر محافظتي ال كارينيتن بر ليپيدپراكسيداسيون غشاي سلولي در موش صحرايي مواجهه يافته با سم ديازينون تحليل آماري دادهها با روش ANOVA و T-test انجام شد. يافتهها مقدار IC50 عصاره گياه كدو قلياني بر روي سلول سرطاني ريه (A549) 6/5 93/094 ± ميكروگرم بر ميليليتر ميباشد و اين مقدار براي داروي ضد سرطان سيس پلاتين 0/35 ± 5/37 ميكروگرم بر ميلي ليتر ميباشد. مقايسه دادههاي IC 50 عصاره گياهي و داروي سيس پلاتين بر روي رده سلولي سرطاني ريه (A549) نشان داد كه تفاوت معناداري بين تمامي دادهها وجود دارد <0/05).(p نتايج نشان داد كه معنيداري بسيار كمتر از <0/01) (p (نمودار شماره.(1 IC 50 داروي سيس پلاتين به طور IC 50 عصاره گياه بوده است نمودار شماره 2 : ميزان بقاي سلولي (درصد) رده A549 در مواجهه با داروي سيس پلاتين طي زمان انكوباسيون 72 ساعت نمودار شماره 1: مقايسه ميزان IC50 عصاره گياه Lagenaria siceraria و داروي سيس پلاتين بر روي رده A549 طي زمان انكوباسيون 72 ساعت <0/01) (p با استفاده از ميزان جذبهاي خوانده شده در رده سلولي A549 ميزان درصد زنده ماندن سلولها (viability%) پس از مواجهه با عصاره گياه كدو قلياني و اتمام تست MTT تعيين گرديد (نمودارهاي شماره 2 و 3 ). نمودار شماره 3: ميزان بقاي سلولي (درصد) رده A549 در مواجهه با عصاره گياه Lagenaria siceraria طي زمان انكوباسيون 72 ساعت بحث استفاده از روشهاي كشت سلولي درك بسيار عميقتري از تا ثير داروهاي مختلف بر روي سلولهاي سرطاني و نرمال پديد ميآورد. اثرات و تغييراتي كه تركيبات مختلف مانند سيس پلاتين و عصاره گياه كدو 8

6 پژوهشي محمد شكرزاده و همكاران قلياني (كه در اين تحقيق مورد بررسي قرار گرفتند) بر سلولها در فضاي كنترل شده و قابل بررسي كشت سلولي ايجاد مينمايند شناساي ي دقيقتر مكانيسمها و اثرات بيولوژيكي آنها و هم چنين اثرات آنها بر فاكتورهاي متفاوت داخل سلولي را امكان پذير ميسازد. اين امكانات شناسايي هر چه بهتر فرآيندها و فعل و انفعالات داخل سلولي طي دارو درماني سرطان را ممكن ميسازد كه ميتواند به ارتقاء روشهاي درماني منجر گردد( 10 ). به هر حال يكي از مهمترين كانديداهاي سنتز داروهاي ضد سرطان به منظور مصرف در شيمي درماني سرطانها تركيبات داراي اثرات سمي و خصوصا سميت سلولي هستند كه امروزه سميت سلولي آنها با استفاده از روشهاي سنجش سميت بر روي كشت سلولي و بافتي قابل اندازه گيري ميباشد( 11 ). از سوي ديگر امروزه تركيبات با منشا طبيعي (گياهي حيواني و معدني) به علت فراواني عوارض جانبي و تداخلات دارويي كمتر ارزان بودن و... كانون توجه داروسازان و پزشكان به منظور سنتز داروهاي نوين و درمان بيماريها (خصوصا بيماريهايي كه درمان و رژيم دارويي قطعي يا داراي اثربخشي كافي آنها وجود ندارد) م ي باشند( ). با نظر اجمالي به جداول نمودارها و مطالب اراي ه شده در نتايج ميتوانيم دريابيم كه گرچه تفاوت معنيداري ميان مقدار IC 50 عصاره گياه Lagenaria siceraria در مقايسه با داروي ضد سرطان سيس پلاتين وجود دارد اما ميتوان ادعا كرد كه عصاره اين گياه داراي اثر مهاركنندگي رشد قابل توجهي بر روي رده سلولي سرطاني ريه (A549) بوده است. داروي سيس پلاتين يك داروي رسمي است كه به طور وسيعي در درمان سرطانهاي ريه تخمدان بيضه مثانه و لنفوم و... به كار ميرود علت اختلاف معنيدار IC 50 داروي سيس پلاتين با عصاره گياه كدو قلياني بر رده سلولي مورد ارزيابي در اين ميباشد كه داروي سيس پلاتين يك تركيب خالص شيميايي است اما عصاره گياه كدو قلياني مخلوط تعداد زيادي از تركيبات از جمله كوكوربيتاسين ماده غيرفعال كننده ريبوزوم (lagenin) پلي ساكاريد فلاونوي يد و... ميباشد كه چه بسا در نتيجه مطالعات بيشتر تركيبات خالص شده بتوانند با اثربخشي قويتر و عارضه كمتر جايگزين مناسبي براي داروهايي همچون سيس پلاتين باشند( ). با توجه به ساير مطالعات صورت گرفته بر روي اجزاء اين گياه (دانه- گل و...) مشخص شده كه گياه كدو قلياني به دليل دارا بودن ويتامين C بتاكاروتن ويتامينهاي گروه B پكتين سطوح بالاي كولين به عنوان فاكتور ليپوتروپيك ساپونين كوكوربيتاسين B فلاونوي يدها تاننها استروي يدهايي مانند فوكوسترول و كامپسترول فنول گليكوزيد يك پروتي ين مهاركننده فعاليت ريبوزومي بهنام Lagenin و پلي ساكاريدي محلول در آب سميت بر روي رده هاي سلول سرطاني MCF-7, HepG2, EAC داشته از جمله گياهان دارويي با ارزشي به شمار ميرود كه ما نيز اثر عصاره هيدروليك ميوه اين گياه را بر روي رده سلولي سرطاني ريه (A549) بررسي نموديم كه خوشبختانه مشخص گرديده كه عصاره ميوه اين گياه توانسته مهار قابل ملاحظهاي را بر اين رده سلولي سرطاني داشته و با مطالعه بيشتر بر روي ميوه اين گياه تركيبات خالص را جداسازي و پس از مطالعات تكميلي به تركيبي دست يافت كه بتوان از آن در درمان سرطان ريه استفاده درماني نمود( 3-10 ). لذا ما پيشنهاد مينماييم كه علاوه بر اين نوع عصاره (هيدروالكلي) اثرات عصارههاي تام ديگر (آبي- استوني- اتيل استاتي و...) بر روي ردههاي سلولي سرطاني نيز مورد بررسي قرار گيرند و هم چنين مواد مو ثره اعضاي مختلف اين گياه (برگ- گل- ميوه- دانه و...) را جداسازي نموده و سپس اثرات آنها بر مهار رشد ردههاي سلولي سرطاني مختلف نيز ارزيابي گردد و در پايان مكانيسمهاي مختلف مهار رشد را مورد بررسي قرار دهيم. سپاسگزاري اين مقاله حاصل پايان نامه خانم عاطفه پرورش دانشجوي دكتراي داروسازي ميباشد. 9

7 بررسي اثر محافظتي ال كارينيتن بر ليپيدپراكسيداسيون غشاي سلولي در موش صحرايي مواجهه يافته با سم ديازينون References 1. Dorsley k. Encyclopedia of Medicinal plants. 1 st ed. London:CRC press; Mozaffarian v. Farhang namhaye giyahan iran.5 th ed. Tehran: Ghadyani press (persian). 3. Tyagi N, Sharma G, Hooda, V, Phytochemical and pharmacological profile of lagenaria siceraria. International research journal of pharmacy (2012); 3: Shah b, seth a. pharmacognostic studies of the lagenaria siceraria (molina) standley. international journal of pharmtech research. (2010),2, Dhiman k, Gupta a, Sharma d. k,gill,n.s, Goyal a,a review on the medicinally important plants of the family cucurbitaceae. Asian journal of clinical nutrition (2012), 4, Kubde m, khadabadis. farooqui,i.a.,deore,s.l. Lagenariasiceraria: phytochemistry, pharmacognosy and pharmacological studies.report and opinion (2010),2, Sankari m. chitra v. jubilee r. silambu p. raju d. Immunosuppressive activity of aqueous extract of Lagenaria siceraria in mice. scholars research library (2010),2, Ghosh k, chandra,k, ojha a, sarkar s, islam s. Structural identification and cytotoxic activity of a polysaccharide from the fruits of Lagenaria siceraria. Carbohydrate research. (2009), 344, p, kundu s, bala a, mazumder u k, halder p k. Evaluation of anticancer activity of Lagenaria siceraria aerial parts. International journal of cancer research (2011), Deshpande j, choudhari a, mishra M.R, meghre v.s, wadodkar s.g, dorle a.k. Beneficial effects of Lagenaria siceraria fruit epicarp in animal models. Indian journal of experimental biology (2008); 46: Mongelli E. Cytotoxic and DNA interaction activity of extracts from medicinal plants used in Agrentina. Journal of Ethnopharmacology (2000); 71: Miller, M. Basic Chemical Information of cisplatin. Available at: bris.ac.uk/motm/cisplatin/htmlonly. Accessed June 14,2012,(2008). 13. Anonymus, Cisplatin is the Penicillin of Cancer. Available at: org. Accessed Aug 2,2012,(2011). 14. Shokrzadeh M, Azadbakht M, Ahangar N, Naderi H, Saeedi Saravi SS, Comparison of the cytotoxic effects of Juniperus sabina and Zataria multiflora extracts with Taxus baccata extract and Cisplatin on normal and cancer cell lines, Pharmacognosy Magazine (2010);6 (22):