Varthemia Persica (Var.persica) DC

Transcript

1 دوره هجدهم شماره 63 فروردين و ارديبهشت سال ) ( بررسي كمي و كيفي فلاونوييدهاي موجود در اندامهاي هوايي گل و ميوه گياه عطر سنگ Varthemia Persica (Var.persica) DC نصرا... قاسمي **(Ph.D.) محمدرضا شمس اردكاني ***(Ph.D.) امير سياهپوش (Ph.D.) * غلامرضا اصغري **(Ph.D.) چكيده سابقه و هدف: گياه عطرسنگ گياهي معطر از خانواده كاسني و انحصاري فلات ايران ميباشد. اين گياه حاوي روغنهاي فرار بوده در بررسي روغن فرار گياه مشخص گرديد كه اصليترين مواد متشكله روغن فرار سزكويي ترپنها (Sesquiterepens) ميباشد. تاكنون هيچگونه مطالعهاي در زمينه فلاونوييدهاي اين گياه منتشر نشده است. مواد و روشها : از پودر گل ميوه و اندام هوايي كه توسط فريز دراير خشك گرديده بود توسط متانول آبكي 50 درصد و اسيدكلريدريك 1/2 مولار عصاره تهيه شده و توسط HPLC فلاونوييدها شناسايي و مقدار آنها تعيين شد. يافتهها : فلاونوييدهاي ميرستين كوي رستين لوتي ولين آپي ژنين و كامپفرول در گل ميوه و اندام هوايي در فصل گلدهي و ميوهدهي شناسايي و اندازگيري شد. استنتاج : نتايج بررسي فلاونوييدها نشان ميدهد كه گل حاوي هر 5 فلاونوييد فوق بوده ميوهها و اندامهاي هوايي در فصل گلدهي و ميوهدهي حاوي كامپفرول لوتي ولين كوي رستين ميباشد. اين گياه غني از فلاونوييدها بوده و ميتواند مورد مناسبي براي بررسيهاي فارماكولوژيك باشد. واژه هاي كليدي : فلاونوييدها عطر سنگ Varthemia persica HPLC مقدمه ايران با داشتن بيش از 8000 گونه گياهي كه تعداد قابل توجهي از آنها آندميك (endemic) ميباشند ميتواند جايگاه ويژه و با ارزشي در زمينه گياهان دارويي داشته باشد. نيل به اين هدف نياز مند مطالعات وسيع و گسترده بر روي گياهان بومي ايران به خصوص گياهان اندميك ميباشد. گياه عطرسنگ با نامعلميDC Varthemia Persica گياهي معطر از خانواده كاسني و منحصر به فلات ايران مولف مسي ول: دكتر امير سياهپوش اهواز جاده گلستان دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز * متخصص فارماكوگنوزي دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز ** متخصص فارماكوگنوزي دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي اصفهان Amirsiahpoosh@yahoo.com تاريخ دريافت : 85/10/19 تاريخ ارجاع جهت اصلاحات : 85/12/23 *** متخصص فارماكوگنوزي دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي تهران تاريخ تصويب: 87/2/4 28

2 بررسي كمي و كيفي فلاونوييدهاي گياه عطر سنگ ال ميباشد و تنها گونه موجود از اين جنس در ايران است. اين گياه پايا ايستاده و محكم سبز متمايل به كبود يا زردفام پر ساقه در پايه چوبي پوشيده از غدههاي بدون پايه در لمس كمي زبر و خشن به طول 2050 سانتيمتر ميباشد( 1 ) واريته 3 و داراي persica stenocephala Bornm. Ex Rech.f. و squarrosula ميباشد( 2 ). بر روي اين گياه تاكنون مطالعه فارماكولوژيك صورت نگرفته است ولي برايگونههاي ديگر اين جنس اثرات ضد باكتري و ضد قارچ ضد اسپاسم وكاهش دهنده قندخون گزارش شده است( 4 3 ). بررسي فلاونوييدهاي گونه Varthemia iphionoides نشان ميدهد كه اين گياه حاوي فلاونوييدهاي 2 1 كوماتاكنين گزانتوميكرول جاسيدي ن 3 و گليكوزيدهاي متيل كوي زستين ميباشد( 4 ). آناليز روغن فرار حاصل از اين گياه نشان ميدهد كه روغن فرار حاوي 3/28 درصد مونوترپن 1/82 درصد مونوترپن اكسيژنه 44/91 درصد سزكويي ترپن و 36/49 درصد سزكوييترپن اكسيژنه ميباشد وبيشترين تركيبات روغن 4 فرار شامل كادينن 9/7) درصد) سلين 11 4 نا 5/3) 5 درص د) 4/9) 6 ژرماكرن دي درص د) ميباشد( 5 ) تاكنون هيچ مطالعهاي بر روي فلاونوييدهاي اين گياه انجام نگرفته است. فلاونوييدها از تركيبات مهم در درمان ميباشند كه به منظور شناسايي كيفي و كمي آنها تحقيقات فراواني انجام شده است( 7 6 ) گزارش شده است كه مصرف روزانه فلاونوييدهاي مركبات باعث كاهش عبور اريتروسيتهاي خطرناك از جفت در خلال حاملگي ميشوند( 8 ). مطالعات اپيدميولوژيك نشان ميدهد در افرادي كه ميزان مصرف فلاونوييدها بالا ميباشد خطر بيماريهاي قلبي عروقي و مغزي عروقي كاهش پيدا ميكند( 9 ). ميزان ورود فلاونوييدها به بدن به طور قابل قبولي با ميزان مرگ و مير ناشي از بيماريهاي كرونر ارتباط معكوس داشته و ارتباط نيز معكوس با شيوع آنفاركتوس ميوكارد كشنده و غيركشنده دارد( ). در مطالعه بر روي سالمندان نشان داده شده است كه ميزان فلاونوييدهاي آپي ژنين كامپفرول لوتي ولين ميرستين و كوي رستين با بيماريهاي قلبي ارتباط معكوس دارد( 12 ). در اين تحقيق 5 فلاونوييد شامل كوي رستين ميرستين و كامپفرول از دسته فلاونولها آپي ژنين و لوتي ولين از دسته فلاونها كه داراي اثرات ضدسرطاني و ضد موتاژني در درون تستي( Invivo ) و برون( Invitro ) تستي ميباشند مورد بررسي قرار گرفت( ). مواد و روش ها 1 تهيه مواد گياهي گياه Varthemia persica DC در دو فصلگلدهي (اواخر شهريور اوايل مهرماه) و ميوهدهي (اواخر آبان اوايل آذر) سال 1380 از دامنه شمالي كوههاي كركس در روستاي طامه از توابع شهرستان نطنز (استان اصفهان) در ارتفاع جمعآوري گرديد و توسط مهندس مهرگان شناسايي و نمونه هرباريوم گياه در هرباريوم دانشكده داروسازي اصفهان با شماره 1278 به ثبت رسيد. گياهان جمعآوري شده توسط فريزدراير خشك و سپس به صورت پودر درآورده شده و در فريز نگهداري گرديدند. روش استخراج باتوجه به اينكه شناسايي گليكوزيد فلاونوييدها در گياهان به دليل فقدان استانداردهاي آنها و وجود بيش از 50 گليكوزيد مختلف از آگليكون فلاونوييدهاي معمول در گياهان بسيار مشكل ميباشد هيدروليز تمام 1. Kumatakenin 4. Cadinen 2. Xanthomicrol 5. Selin11en4ol 3. Jaceidine 6. Germacrene D 29

3 امير سياهپوش و همكاران گليكوزيدها به آگليكون آنها يك نوع روش عملي و نسبتا آسان براي شناسايي فلاونوييدها ميباشد( 11 ). بدين منظور 40 ميلي ليتر متانول آبكي 62/5 درصد (حاوي 0/1 درصد بوتيل هيدروكسي تولوي ن به عنوان آنتياكسيدان) را به نموده 0/5 به آن گرم پودر گياهي فريزدراي شده اضافه 10 ميليليتر اسيد كلريدريك مولار 6 افزوده و به دقت هم زده شد. سپس به مدت 2 ساعت در دماي 90 درجه سانتيگراد با همزدن رفلاكس شد. بعد از سرد شدن صاف گرديده و توسط متانول به حجم 100 رسانيده شد و به مدت 5 دقيقه در سونيكاتور Korea) (Hawashin: powersonic 410, قرار داده شد. حدود 2 ميليليتر از آن را از خلال فيلتر 0/45 ميكرومتر مخصوص حلالهاي آلي Corporation) (PTFE, Pall براي تزريق به HPLC صاف گرديد( 11 ). تهيه محلولهاي استاندارد براي تهيه استانداردهاي كوي رستين ميرسين كامپفرول آپي ژنين و لوتي ولين Germany) (Roth, مطابق زير عمل شد. ابتدا يك استوك از استانداردها با غلظت 500 ميكروگرم بر ليتر تهيه گرديد. 1 ميليليتر از آن با 20 ميليليتر محلول متانول آبكي 62/5 درصد (حاوي 0/1 درصد بوتيل هيدروكسي تولوي ن) كلريدريك 5 و 6 رسانده شد( ). آناليز با HPLC ميليليتر اسيد مولار افزوده و با متانول به حجم آناليز كروماتوگرافي با ستون: نرمافزاريMillennium وPDA Millennium انجامگرفت( 11 ). دو سيستم حلال به صورت ايزوكراتيك مورد استفاده قرار گرفت سيستم حلال I: محلول 25 درصد استونيتريل در ديهيدروژن فسفات پتاسيم ) 4 (KH 2 PO (0/025 مولار) با سرعت جريان 1 ميلي ليتر بر دقيقه و سيستم حلال 45 محلول :II درصد متانول در دي هيدروژن فسفات پتاسيم (0/025 مولار) با سرعت جريان 0/2 ميلي ليتر بر دقيقه. تعيين مقدار فلاونوييدها براساس سيستم حلال I بوده و از سيستم حلال II براي اثبات خلوص پيكها و هنگامي كه هر فلاونوييدهاي كوي رستين و لوتي ولين وجود دارد براي جدا سازي و تعيين مقدار آنها استفاده گرديد. مقايسه پيكها با استاندارد بر اساس زمان بازداري شكل طيف ماوراء بنفش (UV) ( نانومتر) و نقاط جذب ماكزيمم انجام گرفت. براي تعيين حضور فلاونوييدهاي مورد نظر مقايسه با استانداردها بر اساس زمان بازداري شكل طيف UV ( نانومتر) و نقاط جذب ماكزيمم با استفاده از نقاط جذب ماكزيمم با استفاده از برنامه نرم PDA Millennium انجام گرديد (شكل شماره افزاري (3.(12 11) تعيين مقدار فلاونوييدها بدين منظور منحني استاندارد براي هر استاندارد به طور جداگانه رسم گرديده و سطح زير منحني نمونهها براساس آن تعيين گرديد. سطح زيرمنحني (شدت پيك) و خلوص توسط برنامه Millennium PDA تعيين و بررسي براي هر نمونه 3 بار تكرار گرديد. اختلاف بيش از 15 درصد بين نتايج قابل قبول نبود و در اين صورت دوباره آزمايشها تكرارگرديد. لازم به ذكر است جذب پيكها در 370 نانومتر بررسي شد( ). با توجه به نياز از آزمونANOVA و تست Duncan با استفاده از برنامه نرم افزاري SPSS var 12 استفاده گرديد. 50 NovaPack C 18 MA) (Waters Associaion, Milford, به مشخصات μm) : (3/9 ستون محافظ 150 mm 4 μm) 40 3/9) و HPLC با مشخصات لوپ: 20 μl دتكتور 2 (2996, Waters) PDA پمپ Waters) (515, و برنامه 1. Guard Column 2. Photo Diode Array 30

4 بررسي كمي و كيفي فلاونوييدهاي گياه عطر سنگ تنظيم منحني استاندارد بدين منظور از استاندارد فلاونوييدها لوتي ولين كوي رستين آپيژنين كامپفرول) (ميرستين غلظتهاي 0/ ميكروگرم بر ليتر (منحني استاندارد فلاونوييدها معمولا در محدود 0/525 ميكروگرم بر ليتر خطي ميباشد) تهيه گرديد و ميزان جذب (3 بار) توسط HPLC و سيستم حلال I تعيين و منحني استاندارد توسط برنامه نرمافزاري Excel رسم گرديد. در صورتي R 2 كه كمتر از 0/9995 بود ساخت استاندارد دوباره انجام گرفت (15 11). يافته ها شناسايي فلاونوييدها 5 فلاونوييد شامل كوي رستين ميرستين و كامپفرول از دسته فلاوونولها آپي ژنين و لوتي ولين از دسته فلاونها در گل ميوه و اندام هوايي در فصل گلدهي و ميوهدهي شناسايي شدند. زمان بازداري استانداردهاي فلاونوييدهاي فوق در هر دو سيستم حلال مورد استفاده در HPLC در جدول شماره 1 و شكلهاي شماره 1 و 2 نمونه طيف HPLC نمونه گياهي در شكل شماره 3 و نتايج وجود فلاونوييدهاي مورد نظر در گل ميوه و اندام هوايي در مراحل رويشي گلدهي و ميوه دهي در جدول شماره 2 آورده شده است. جدول شماره 1 : سيستم حلال HPLC فلاونوييدها زمان بازداري فلاونوييدهاي مورد استفاده در دو زمان بازداري** (سيستم حلال (min II زمان بازداري* ) سيستم حلال (min I 3/78 7/07 7/41 13/46 15/76 3/98 5/02 5/59 6/79 7/35 Myricetin Luteolin Quercetin Apigenin Kaempferol *: محلول 25 درصد استونيتريل در )KH 2 PO 4 0/025 مولار) با سرعت جريان 1ml/min **: محلول 45 درصد متانول در )KH 2 PO 4 0/025 مولار) با سرعت جريان 0/2ml/min Myrcetin Luteolin Quercetin Apigenin Kaempferol شكل شماره 1 :كروماتوگرامHPLC استانداردهاي فلاونوييدها درطول موج 370nm درسيستم حلال I و طيف UV آنها (گرفته شده توسط دتكتور (PDA 31

5 امير سياهپوش و همكاران شكل شماره 2: كروماتوگرام HPLC استانداردهاي فلاونوييدها در طول موجnm 370 در سيستم حلال II شكل شماره 3: كروماتوگرام HPLC فلاونوييدهاي اندام هوايي در فصل گل دهي در سيستم حلال I 32

6 بررسي كمي و كيفي فلاونوييدهاي گياه عطر سنگ بحث جدول شماره : 2 مقايسه وجود فلاونوييدها در گل ميوه و اندام هوايي در مراحل رويشي گل دهي و ميوه دهي فلاونوييدهاي بررسي شده Myricetine گل ميوه اندام هوايي در فصل گل دهي اندام هوايي در فصل ميوه دهي Luteolin Quercetin Apigenin Kaempferol : وجود تركيب : عدم وجود تعيين مقدار فلاونوييدها به منظور تعيين مقدار فلاونوييدها ابتدا بر اساس غلظتهايمختلف استانداردها وسطح زيرمنحنيپيكها منحني استاندارد رسم گرديده سپس بهترين خط با R 2 بزرگتر از 0/9995 رسم و براساس معادله خط غلظت فلاونوييدها تعيين گرديد (11 7). ميزان فلاونوييدهاي يافت شده در گل ميوه و اندام هوايي در مراحل رويشي گلدهي و ميوهدهي در شكل شماره 4 آورده شده است. شكل شماره : 4 ميزان فلاونوييدهاي يافت شده در گل ميوه و اندام هوايي در فصل گل دهي و ميوهدهي *: نتايج بهصورت Mean±SD مربوط به 3 بار تكرار ميباشد. *: غلظت بر اساس ميليگرم در 100 گرم نمونه با مراجعه به نمودار شماره 1 مشاهده ميشود كه بيشترين تجمع فلاونوييدها در گل بوده كه با توجه به اينكه رنگ زرد گلها بيشتر به دليل وجود فلاونوييدها و كاروتنوييدها است قابل توجيه ميباشد( 16 تا 18 ). ميرستين و آپي ژنين فقط در گل توليد شده است. اختصاصيبودن بعضي از فلاونوييدها به بافتهاي خاص در گياه عناب (Zizyphus mistol) نيز گزارش شده است( 19 ). ميزان كوي رستين و لوتي ولين در گل به مراتب از ميوه و اندام هوايي در فصل گلدهي و ميوهدهي بيشتر است و اين اختلاف با احتمال 0/05>P از لحاظ آماري قابل قبول ميباشد. نكته جالب اينكه بين ميزان كامپفرول در 4 نمونه اختلافي وجود ندارد. فلاونوييد مذكور به رويشگاه خاص يا بافت خاصي از گياه عطر سنگ وابسته نميباشد. در حاليكه در گياه كاسيا alata) (Cassia نشان داده شده است كه كامپفرول بيشتر در برگ و كمتر در گل وجود دارد( 20 ). ضرورت حضور برخي از فلاونوييدها كه نقش دفاعي در گياه دارند تاكيد شده است( 21 ). در گياه سياه گيله myrtills) (Vaccinium كوي رستين چنين نقشي دارد و ميزان آن در اندامهاي مختلف گياه يكسان است( 22 ). مقايسه فلاونوييدها نشان ميدهد كه فلاونوييدهاي اندام هوايي در مراحل رويشي گلدهي و ميوهدهي بيشترين شباهت را داشته و فلاونوييدهاي گل بيشترين تفاوت را با فلاونوييدهاي 3 دسته ديگر دارد. به نظر ميرسد كه نقش اندام در تجمع فلاونوييدها در گياه عطرسنگ بيشتر از تاثير مرحله رويشي باشد. در گياه ايزوكما acradenia) (Isocoma و گياه نعناع piperita) (Mentha تغييري در ميزان 5 فلاونوييد مذكور مشاهده نشده است( ). در گياه شبه رز laurifolius) (Cistus ميزان كوي رستين در بافت جوان و ميرستين دربافت رسيده بيشتراست( 25 ). ميزان آپيژنين 33

7 امير سياهپوش و همكاران كوي رستين و لوتي ولين در گياه عطر سنگ با افزايش سن از مرحله گلدهي به ميوه دهي تفاوتي نداشت ولي در برگهاي هويج carota) (Daucus مسنتر شده باعث كاهش ميزان فلاونوييدها شده است( 26 ). اينگونه تغييرات در گياه درمنه tridentate) (Artemisia نيز گزارش شده است( 27 ). با شناخت نوع فلاونوييد و ميزان آن در گياه عطرسنگ زمينه انجام امكان بررسيهاي فارماكولوژي اين گياه فراهم شده است. سپاسگزاري اين تحقيق با حمايت مالي معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي اصفهان انجام شده كه بدينوسيله از معاونت مزبور تشكر ميگردد. References 1. Ghahreman A. Flora de l Iran en couleurs naturelles.institut de Recherches des forêts et pasturages Téhéran Iran. 2002; Riedl H. Flora Iranica 1 st ed. Rechinger KH. Academische Druckverlagsantalt, Graz 1963; 145: Afifi F, Saket M, Jaghabir M, Aleisaw D. Effect of Varthemia iphionoides on blood glucose level of normal rats and rats with streptozocin induced diabetes mellitus. Cur Ther Res 1997; 58(11): Aburjai T, Darwish RM, AlKhalil S, Mahafzah A, AlAbbadi A. Screening of antibiotic resistant inhibitors from local plant materials against two different strains of Pseudomonas aeruginosa. J Ethnopharmacol 2001; 76: Ghasemi N, Asghari G, Shams Ardakani M, Siahpoosh A. Characterization af volatile constituents from aerial parts of Varthemia persica DC. (var. persica). Iranian J Pharm Res 2003; Solar A, Colaric M, Usenik V, Stampar F.Seasonal variations of selectedflavonoids, phenolic acids and quinines in annual shoots of common walnut (Juglans regia L.). Plant Sci 2006; 170: Erlund I. Review of flavonoids quercetin, hesperetin and naringenin. Dietary sources, bioactivities, bioavailability and epidemiology. Nutr Res 2004; 24: Havsteen GH. The biochemistry and medical significance of flavonoids. Pharmacol Therapeut 2002; 96: Prior RL, Cao G. Flavonoid: diet and health relationships. Nutr Clin Care 2000; 3(5): Hollman PCH, Hertog MGI, Katan MB. Analysis and health effects of flavonoids. Food Chem 1996; 57: Hertog MGL, Sweetnam PM, Fehily AM, Elwood PC, Kromhout D. Antioxidant flavonols and ischemic heart disease in a Welsh population of men: the Caerphilly study. Am J Clin Nutr 1997; 65:

8 بررسي كمي و كيفي فلاونوييدهاي گياه عطر سنگ 12. Hertog MGL, Feskens EJ, Hollman PC, Katan MB, Kromhout D. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart diesease: the Zutphen Elderly study. Lancet 1993; 342: Wei H, Tye L, Bresnick E, Birt DF. Inhibitory effect of apigenin, a plant flavonoid, on epidermal ornithin decarboxylase and skin tumor promotion in mice. Cancer Res 1990; 50: Verma AK, Johnson JA, Gould MN, Tanner MA, Inhibition of 7, 12dimethylbenz (a) anthracene and NNitrosomethylurea induced rat mammary cancer by dietary flavonol quercetin. Cancer Res 1988; 48: Hertog MGL, Kromhout D, Aravanis C, Blackbum H, Buzina R, Fidanza F, et al. Flavonoid intake and long term risk of coronary heart disease and cancer in seven countries study. Arch Intern Med 1995; 155: Bruneton J. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal plants. London, Lavoisier publishing, 1995: Mikanagi Y, Yokoi M, Ueda Y, Saito N. Flower flavonols and anthocyanin distribution in subgenus Rosa. Biochem Syst Ecol 1995; 23: Kazuma K,Noda N, Suzuki M. Flavonoid composition related to petal color in different lines of Clitoria ternatea. Phytochemistry 2003; 64: Pellotto JP, Maria A, Martinez DP. Flavonoid variation with the plant age inzyzyphus mistol leaves. Biochem Syst Ecol 1993; 2: Moriyama H, Lizuka T, Nagai M, Murata Y. HPLC quantification of kaempferol 3Ogentiobioside in Cassia alata. Fitoterapia 2003; 74: Witzell G, Gref R, Nasholm T. PlantPart specific and temporal variation in phenolic compounds of boreal bilberry (Vaccinium myrtillus) plants. Biochem Syst Ecol 2003; 31: Vvedenskaya IO, Vorsa N. Flavonoid composition over fruit development and maturation in American canberry. Vaccinium macrocarpon Ait. Plant Sci 2004; 167: Lisa E, Clark LE, Clark WD. Seasonal Variation in leaf exudates flavonoids of Isocoma acradenia (Asteraceae). Biochem Syst Ecol 1990; 14: Voirin B, Saunois A, Bayet C. free flavonoids aglycones from Mentha piperita: Developmental, chemotaxonomical and physiological aspects. Biochem Syst Ecol 1999; 22: Vogt T, Gerhard P. Accumulation of flavonoids during leaf development in Cistus laurifolius. Phytochemistry 1994; 36: Brooks JS, Paul Feeny PM. Seasonal variation in Daucus carota leafsurface 35

9 امير سياهپوش و همكاران and leaftissue chemical profiles. Biochem Syst Ecol 2004; 32: Wilt FM, Miller GC. Seasonal variation of coumarin and flavonoid concentration in persistent leaves of Wyoming Big Sagebrush (Artemisia tridentate ssp. Wyuomingensis: Asteraceae). Biochem Syst Ecol 1992; 20: