بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی سرطان کلون شنهای آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9

Transcript

1 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... مقاله پژوهشی مجله سلول و بافت )علمی - پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز 6341 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی سرطان کلون شنهای آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9 HT29 و آنالیس بیان 3 *2 س ب لیشی M.Sc. ؿ ش صاسع کبسیضی Ph.D. ؼین حیبتی س دثبسی Ph.D. بص یي فش بدیبس کارض اس ارضذ گر زیست ض اسی احذ عل م تحقیقات دا طگا آزاد اسالهی ت راى ایراى دا طگا آزاد اسالهی احذ راهیي-پیط ا گر زیست ض اسی راهیي ایراى دا طگا آزاد اسالهی احذ عل م تحقیقات گر زیست ض اسی ت راى ایراى دا طگا آزاد اسالهی احذ راهیي-پیط ا گر ضیوی راهیي ایراى 4 Ph.D * پست الكترونیك نویسنده مسئول: Shohrehzare@yahoo.com تبسیخ دسیبفت: 1396/6/20 تبسیخ پزیشؽ: 1396/8/23 چکید دف: ذف اص هغبلؼ حبضش ثشسػی اثشات ػویت ػل لی ب رس اکؼیذ ػشین س ی سد ػل لی ػشعب ی کل ى HT29 آ بلیض ثیبى طى بی آپ پت صیؼی کبػپبص 9 3 هیثبؿذ. م اد ي ريش ا: دس ایي هغبلؼ ػل ل بی HT 29 دس ف اكل صهب ی ػبػت تحت تبثیش غلظت بی 3/12 1/56 0/ /5 6/25 هیلیگشم ثش هیلیلیتش اص ب رس اکؼیذ ػشین لشاس گشفت هیضاى ثمبی ػل ل ب ت ػظ س ؽ )-4,5)-3 MTT )dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ا ذاص گیشی ؿذ. ػپغ هیضاى ثیبى طى بی کبػپبص 9 3 ثب س ؽ Real Time PCR دس ػل ل بی HT29 تیوبس ؿذ ثب غلظت IC50 ب رس دس هذت صهبى 24 ػبػت المبی آپ پت صیغ ت ػظ س ؽ فل ػبیت هتشی هخق ؿذ. وتایج: تبیح تؼت MTT بى داد ک ب رس دس هذت صهبى 72 ػبػت دس غلظت بی هیلیگشم ثش هیلیلیتش ثیتشیي ػویت ػل لی سا س ی سد ػل لی HT29 داؿت اػت. نچ یي تبیح Real Time PCR بى داد ک ثیبى ؼجی طى بی کبػپبص 3 9 دس سد ػل لی ػشعب ی HT-29 تیوبس ؿذ ثب ب رس ث تشتیت ث هیضاى )p 0/05( )p 0/05( 2/36±0/76 3/4±0/95 عی 24 ػبػت افضایؾ داؿت تبیح فل ػبیت هتشی هیضاى آپ پت صیغ 16 دسكذ دسكذی سا بى داد. وتیج گیری: ػویت ػل لی ب رس اکؼیذ ػشین ثشای ػل ل بی ػشعب ی HT-29 اثؼت ث د ص صهبى اػت. ک دس آی ذ ثب هغبلؼبت ثیتش ثب ذفو ذ کشدى ایي ب رس ث ػ اى یک تشکیت داس یی کب ذیذ خ ت ا ذاف دسهب ی هیت اى اػتفبد کشد. ياشگان کلیدی: سد ػل لی HT29 کبػپبص 9 3 ب رس اکؼیذ ػشین مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز

2 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... مقدمه ػشعبى ثیوبسی اػت ک دس آى ػل ل بی غیشعجیؼی ث ك ست ک تشل ذ تکثیش یبفت هیت ا ذ ثبفت بی هدب س سا دسگیش ک ذ. ایي اهش دس پی ل ع چ ذ الؼ ط تیکی اص خول غیش فؼبل ؿذى طى بی ػشک ة گش ت ه س فؼبل ؿذى آ ک طى ب هیت ا ذ اتفبق ثیبفتذ )1(. هب یت ایي لبیغ ؿبهل ا اع خ ؾ ب فمذاى تش صیگ ػیتی خبه ؿی اپیط تیکی س ؿت طى ب ت ػظ یپشهتیالػی ى پش ه تش تکثیش طى ل ع خ ؾ بی کؼت ػولکشد هیثبؿذ )2(. ػشعبى بی گ اسؿی دس هیبى هشداى ػشعبى ػی اص ؿبیغتشیي ػشعبى ب دس هیبى ص بى اػت )3(. هغبلؼبت بى هید ذ ک ؿی ع ػشعبى کل ى دس ػي پبییي دس حبل افضایؾ اػت دس چ ذ ػبل آی ذ ث یک هکل اػبػی دس ػالهت ػو هی تجذیل خ ا ذ ؿذ )4(. ػشعبى کل ى صهب ی اتفبق هیافتذ ک ػل ل بی غیش عجیؼی دس آػتش س د ثضسگ )کل ى( یب ساػت س د )سکت م( ث ك ست پ لیپ ایدبد هیؿ ذ )5( اهش ص اص س ؽ بی هختلف خشاحی ؿیوی دسهب ی اؿؼ دسهب ی خ ت دسهبى ػشعبى اػتفبد هیؿ د لی یکی اص هؼبیت ػ اسم خب جی ایي س ؽ ب اص ثیي ثشدى ػل ل بی ػبلن هیثبؿذ. ایي اهش ػجت ؿذ اػت ک هحممبى ث ػوت س ؽ بی خذیذ دسهبى ثب کب ؾ ػ اسم خب جی پیؾ س ذ )6 7( ایي س ؽ ب هوکي اػت ث ثبفت بی ػبلن یض آػیت سػب ذ یب ثبفت بی ػشعب ی سا بلق اص ثیي ثجش ذ. مق دس ایي س ؽ ب ثبػث ؿذ تب هحممبى ث د جبل س ؽ بی خذیذ خ ت تخیق دسهبى ػشعبى ثب ػ اسم خب جی کوتش ثبؿ ذ )8(. ف ب سی ب هیت ا ذ ػیل ای ثشای ذف لشاس دادى هؼتمین ا تخبثی ػل ل بی ػشعب ی افضایؾ اثش ثخی دس اختیبس پضؿکبى لشاس د ذ )9(. ب رسات دس ه اسد هختلفی هب ذ سػب ذى داس ث ػل ل بی ػشعب ی نچ یي خ ت تل یش ثشداسی اص ػل ل بی ػشعب ی هب ذ دلیكتش آى ب کبسثشد داس ذ داسای پتب ؼیل خ ثی ثشای تخیق دسهبى ػشعبى ؼت ذ )10(. رسات دس ا ذاص بی ب هتش هیت ا ذ ث ه اد داس یی دس اثؼبد ب هتشیک هتلل ؿذ ث ك ست اختلبكی ت ػظ ػل ل بی ػشعب ی خزة ؿ ذ. ثب ایي س ؽ ػل ل بی ػبلن دس هؼشم ه اد داس یی لشاس ویگیش ذ ػ اسم خب جی داس کوتش هیؿ د )11(. یکی اص ایي ب رسات ب رس اکؼیذ ػشین اػت. عی هغبلؼبت اخیش بى داد اػت ک ایي ب رس اثش ػویت ػل لی س ی ػل ل بی ػشعب ی داسد لزا ثشسػی ثیتش خ ت تؼییي ػ اسم خب جی اػتفبد اص آى دس دسهبى ػشعبى ب ه سد ا ویت هیثبؿذ )12(. ب رسات اکؼیذ ػشین اص یک ػشین احبع ؿذ ت ػظ ؿجک بی اکؼیظى تکیل ؿذ اػت. ایي ب رس داسای سفتبس بی آ تی اکؼیذا تی ؿبهل ػ پشاکؼیذاص دیؼو تبص فؼبلیت آ ضین کبتبلیضی ه بس سادیکبل اکؼیذ یتشیک ه بس سادیکبل یذس کؼیل نچ یي سفتبس بی اکؼیذا ی داسد ک ؿشایظ هختلف اص لجیل ph هحیظ ع فؼبلیت ایي ب رس سا تؼییي هیک ذ )13(. ایي ب رس دس ػل ل بی پؼتب ذاساى ثب هؼیش بی چ ذگب اص خول ا ذ ػیت ص ثب اػغ گیش ذ اسد ػل ل ب هی ؿ د. ب رسات اکؼیذ ػشین لبدس ذ فبکت س بی دخیل دس فشای ذ آپ پت صیغ ػل لی سا اص عشیك افضایؾ ت لیذ Species) (Reactive Oxygen ROS ک ث ك ست غیشآ ضیوی ػوذتب دس هیت ک ذسی ث یظ دس کوپلکغ بی Ⅲ Ⅰ ا تمبل الکتش ى هیت ک ذسی ث خ د هیآیذ سا فؼبل ک ذ )14(. ػغح ثبالی ROS ثبػث اص ثیي سفتي غبی خبسخی داخلی هیت ک ذسی آصاد ؿذى ػیت کش م C فؼبل ؿذى آثبس آپ پت صیؼی هیؿ د )15(. اص آ دبییک ػشعبى کل ى خض یکی اص ػشعبى بی ؿبیغ دس ایشاى اػت فشا ا ی آى س ذ س ث افضایی داسد دس هغبلؼ حبضش ثشسػی اثشات ػبیت ت کؼیک ب رس ػشین اکؼبیذ دس دػت س کبس لشاس گشفت. صیشا هغبلؼبت گؼتشد ای هج ی ثش تبثیش ب رس هزک س س ی ػشعبى کل ى خ د ذاسد. مواد و روشها يیصگی واو ذرات اکسید سریم: ایي هغبلؼ تدشثی اص فش سدیي تب ؿ شی س هب 1395 دس دا گب آصاد اػالهی احذ ػل م تحمیمبت ت شاى ث ا دبم سػیذ اػت. دس ایي تحمیك ب رس اکؼیذ ػشین اص ؿشکت پیگبهبى ب ه اد ایشا یبى ثب ثش ذ US Nano خشیذاسی ؿذ. ا ذاص رسات 10 تب 30 ب هتش ث ك ست پ دس ؿیشی س گ ث د. اص ظش ه سف ل طیکی رسات کش ی ث د چگبلی ػغحی آى 0/8 تب 442 مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز 6341

3 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... 1/1 گشم ثش ػب تیهتش هکؼت دسكذ گضاسؽ ؿذ. ثب دس كذ خل ف 99/97 کطت رد سل لی سرطان کل ن :HT29 سد ػل لی HT-29 کل ى ػشعب ی اص ثب ک ػل لی ا ؼتیت پبػت س ایشاى خشیذاسی ؿذ. اثتذا ػل ل ب دس هحیظ کت RPMI USA( )Biosera, غ ی ؿذ ثب )v/v( دسكذ 1 پ یػیلیي- اػتشپت هبیؼیي 10 دسكذ FBS کت داد ؿذ ذ دس دهبی 37 دسخ ػب تیگشاد 5 دسكذ سع ثت لشاس داد ؿذ ذ. ثشای ػل ل ب 80 دسكذ دس ظش گشفت ؿذ. ا دبم تؼت بی ثؼذی تشاکن بررسی سمیت سل لی واو ذر اکسید سریم با استفاد از تست :MTT ثشای ثشسػی ػویت ػل لی ب رس اکؼیذ ػشین صهبى بی هختلف اص س ؽ س ی سد ی ػل لی HT-29 MTT Assay دس اػتفبد ؿذ. اثتذا تؼذاد یکؼبى ػل ل )10000 ػل ل( دس ش یک اص چب ک بی پلیت غلظت بی 96 هیلیگشم ثش هیلیلیتش خب ای سیخت ؿذ. ث د جبل آى 3/12 1/0 56/ /5 6/ اص ب رس ت ی ؿذ دس فبكل صهب ی ػبػت س ی سد ػل لی HT-29 تبثیش داد ؿذ 20 هیکش لیتش اص هحل ل س گ MTT ث داخل ش چب ک اضبف کشد ث هذت 4 ػپغ س گ یبفت. حزف MTT ػبػت ا ک ثبػی ى اداه 100 ؿذ DMSO ث ش چب ک اضبف ؿذ. هیکش لیتش خزة دس ع ل ه ج 570 یب 590 ب هتش ثب اػتفبد اص Stat (ELISA Reader )fax baraie ELISA خ ا ذ ؿذ. توبهی هشاحل آصهبیؾ 3 ثبس تکشاس هیضاى دسكذ ػل ل بی ص ذ ثب اػتفبد اص فشه ل صیش هحبػج ؿذ. % Cell inhibition= 100 [(At-Ab)/(Ac-Ab)] )هیب گیي خزة و ک تشل/ هیب گیي خزة و تیوبس (-دسكذ ػل ل بی ص ذ ;At خزة و ه سد تؼت Ab ;خزة و ثال ک ;Ac خزة و ک تشل اػت. ن چ یي احذ )غلظتی ک IC50 دسكذ 50 ؼت ذ( یض هحبػج ؿذ. ػل ل ب 50 دسكذ هشد ص ذ بررسی بیان شن ای آپ پت زیسی کاسپاز 3 ي 9 ت سط ريش آپ پت صیؼی کبػپبص :Real Time PCR )Casp3( 3 Real Time PCR طى ثیبى )Casp9(9 ثب س ؽ ػ دیذ ؿذ. دس اثتذا کل ػل ل بی تیوبس ؿذ ذ ثب ب رس ثب اػتفبد اص کیت اػتخشاج RNA )کیبطى اهشیکب( عجك دػت سالؼول آى اػتخشاج ؿذ غلظت آى ت ػظ دػتگب فت ب هتش), GmbH IMPLEN آلوبى( ا ذاص گیشی ؿذ. ػ تض cdna ثبکیت Revert AidTM First strand Fermentas(cDNA Synthesis Kit آهشیکب( ا دبم گشفت ک دس آى هخل ط اک ؾ حب ی 5 هیکش لیتش ثبفش RNA یک هیکش گشم 5x کلئ تیذی تلبدفی 0/5 هیکش لیتش آغبصگش ؿؾ 0/5 هیکشلیتش آغبصگشالیگdT د هیکش لیتش هخل ط داکؼی کلئ تیذ تشی فؼفبت هیلی ه الس( 10( احذ ه بسک ذ آ ضین 10 20( RNase احذ دس هیکش لیتش( یک هیکش لیتش آ ضین س ؿت ثشداس هؼک ع آة همغش د ثبس تمغیش )تب حدن بیی هیکش لیتش( ث د. ثش به دهبیی-صهب ی ث ك ست ػب تیگشاد ث هذت دلیم )ثشای اتلبل آغبصگش( دسخ 42 دسخ ػب تیگشاد ث هذت 60 دلیم )ػبخت )cdna 70 دسخ ػب تی گشاد دلیم 5 ث هذت )غیش فؼبل ؿذى س ؿت ثشداس هؼک ع( 4 دسخ ػب تیگشاد ث هذت 5 دلیم ا دبم گشفت. دس ایي هغبلؼ اص GAPDH ث ػ اى ک تشل داخلی اػتفبد ؿذ. ت الی آغبصگش بی سفت ثشگتی طى ذف Casp3 ث ك ست : 5'-ATGGGAGCAAGTCAGTGGAC -3' سفت 5'-GTACCAGAGCGAGATGACA-3' ثشگتی ث د. ت الی آغبصگش بی سفت ثشگتی طى ذفCasp9 ث ك ست : GGCGGAGCTCATGATGTCTGTG-3' 3' سفت 5'- 5'- - TTCCGGTGTGCCATCTCCATCAثشگتی ثشای طى هشخغ :GAPDH 5'-CGTCTGCCCTATCAACTTTCG-3' 5'-CGTTTCTCAGGCTCCCTCT-3' سفت ثشگتی اػت. دس بیت اک ؾ Real Time PCR ثب اػتفبد اص دػتگب Bioneer( Light cycler کش ( ثب ؿشایظ دهبیی 95 دسخ ػب تیگشاد: 1 دلیم 95 دسخ ػب تی گشاد 20 ثب ی 62 دسخ ػب تی گشاد 40 ثب ی ا دبم گشفت )16(. آوالیس میسان آپ پت زیس/وکريزیس ی ا سل ل HT29 ت سط ريش فل سایت متری: ث ه ظ س ثشسػی هیضاى المبی آپ پت صیغ دس ػل ل HT29 تیوبس ؿذ RNA مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز

4 ی ا بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... ثب ب رس اکؼیذ ػشین ایي ػل ل ب ثب اػتفبد اص س ؽ Apoptosis ( AnnexinV/propidium iodide (PI) )detection kit, Roch, Germany دػتگب فل ػبیت هتش flow( )Flumax baraie ثش اػبع دػت سالؼول هشث ع ه سد هغبلؼ لشاس گشفت ذ. ػل ل اثتذا ػل ل HT29 ثب غلظت بی 3/12 1/0 56/ /5 6/ هیلیگشم ثش هیلیلیتش اص ب رس اکؼیذ ػشین تیوبس ؿذ ذ. ػپغ دسكذ ص ذ هب ذى ػل ل ب پغ اص هذت صهبى ػبػت ثشسػی ؿذ. تبیح ػویت ػل لی بى داد ک تیوبس ػل ل HT29 دس هذت صهبى 24 ػبػت ث تشتیت ػجت کب ؾ ثمبی ػل ل ب ث هیضاى 94/5±0/26 89±0/51 53/7±0/25 60/5±0/35 68/5±0/41 80±0/38 32/75±0/45 40/5±0/29 ؿذ. نچ یي دس هذت صهبى 48 ػبػت ب رسات اکؼیذ ػشین دس وبى غلظت ب ث تشتیت ثبػت کب ؾ ثمبی ػل ل ب ث هیضاى 85/3±0/25 39/5±0/39 50/5±0/52 66/5±0/48 72/5±0/42 16/75±0/24 20/7±0/27 31±0/31 ؿذ. ث د جبل آى تیوبس ػل ل HT29 ثب غلظت بی ف ق الزکش دس هذت صهبى 72 ػبػت ث تشتیت ػجت کب ؾ ثمبی ػل لی ث هیضاى 73/2±0/42 59/5±0/28 51/2±0/32 1/7±0/29 23±0/47 29/5±0/55 41/5±0/38 ؿذ )ؿکل 1(. نچ یي تبیح بى داد ک همذاس IC50 دس صهبى بی ػبػت دس ػل ل بی ػشعب ی HT29 ث تشتیت 2/96 6/08 31/54 هیلیگشم دس هیلیلیتش ث د. )105 1 HT29 ػل ل/چب ک( ثب غلظت IC50 ب رس ث هذت 24 ػبػت تیوبس ؿذ ػل ل بی تیوبس ذ HT29 ث ػ اى ک تشل ه سد اػتفبد لشاس گشفت ذ. دس بیت هیضاى کش ص/آپ پت صیغ ؿذ ت ػظ دػتگب فل ػبیت هتشی ه سد هغبلؼ لشاس گشفت ذ. آنالیز آماری هحبػج آهبسی ایي هغبلؼ ثب اػتفبد اص شم افضاس SPSS 16 ا دبم ؿذ تبیح ثب آ بلیض اسیب غ یکعشف ( One )way ANOVA ه سد ثشسػی لشاس گشفت. اعالػبت ث ك ست (SD) mean±standard deviation وبیؾ داد ؿذ ا ذ p 0/05 هؼ یداس دس ظش گشفت ؿذ. ثشای آ بلیض ثیبى طى یض اص فشه ل ΔΔCt 2 اػتفبد ؿذ. هؼ یداس ث دى یب ج دى تبیح یض ثش اػبع آصه ى T-test )p 0/05( اسصیبثی گشدیذ. نتایج وتایج سىجص سمیت واو ذر اکسید سریم با ريش آزم ن MTT ضکل 1: درصذ بقای سل ل HT29 در برابر غلظت ای هختلف ا رر اکسیذ سرین در هذت زهاى ساعت. تایج ب ص رت درصذ بقا در هقایس با و ای ک ترل گسارش ضذ است p 0/05:*(.)n=3 :p 0/001 *** p 0/01:** 442 مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز 6341

5 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... وتایج بررسی بیان شن ی ا Casp3 ي Casp9 ت سط Real Time PCR دس ایي تؼت تغییش دس ثیبى طى بی آپ پت صیؼی Casp3 ػل ل دس Casp9 HT29 IC50 تیوبس ؿذ ثب غلظت ب رس اکؼیذ ػشین ثب اػتفبد اص س ؽ Real Time PCR اسصیبثی ؿذ. آ بلیض داد بی Real Time ثش اػبع PCR ه ح ی ر ة ػب تیگشاد طى همبیؼ چشخ آػتب ا دبم ؿذ آ بلیض Casp9 دس دهبی ر ة 82 GAPDH ثب دهبی ر ة 85/8 Casp3 ػب تیگشاد ػب تیگشاد ا دبم ؿذ. ثب دهبی ر ة 88/6 دسخ دسخ دسخ دس ایي هغبلؼ اختالف چشخ بی آػتب ث دػت آهذ اص و بی ه سد آصهبیؾ )ػل ل بی تیوبس ؿذ ثب ب رس ( و بی ک تشل )ػل ل بی تیوبس ذ ثب ب رس ( هحبػج هیضاى ثیبى طى ثب اػتفبد اص فشه ل ΔΔCt ) ؼجت طى ذف ث طى هشخغ )GAPDH( اص عشیك 2 )ΔΔCt هحبػج ؿذ. تبیح بى داد ک ثیبى طى Casp9 Casp3 ؼجت ث طى هشخغ دس سد ػل لی ػشعب ی HT29 ث تشتیت ث هیضاى )p 0/05( 2/36±0/76 )p 0/05( ±0/95 3/4 عی 24 ػبػت افضایؾ یبفت ( ؿکل.)2 ضکل 2: بیاى شى ای Casp9 Casp3 سبت ب شى هرجع GAPDH در رد سل لی سرطا ی کل ى HT29 تیوار ضذ با ا رر اکسیذ سرین ب ترتیب ب هیساى )p 0/05( )p 0/05( 2/36±0/76 ±0/95 3/4 طی 24 ساعت افسایص یافت. دس عی فبص ا لی آپ پت صیغ فؼفبتیذیل ػشیي ث خبسج اص غب ه تمل ؿذ ت ػظ Annexin V س گ هی ؿ د س گ PI ث ؼت دس صهبى کش ص هتلل هیؿ د. تبیح فل ػبیت هتشی دس ؿکل 3 بى داد ؿذ اػت د هشثغ ثبال )Q1 Q2( هیضاى آپ پت صیغ سا بى هید ذ. وبىع سیک تبیح بى هید ذ ب رس اکؼیذ ػشین سا 16 دسكذ ػل ل HT29 سا ث ػوت آپ پت صیغ وتایج فل سایت متری ج ت تعییه میسان آپ پت زیس القا ضد در رد سل ل ای سرطاوی کل ن ث ه ظ س ثشسػی کوی هیضاى آپ پت صیغ کش صیغ دس ثیي س ؽ ب س ؽ فل ػبیت هتشی س ؿی دلیك تش تکشاس پزیشتش هیثبؿذ ک خ ت تؼییي هیضاى آپ پت صیغ المب ؿذ دس ػل ل HT29 تیوبس ؿذ ثب ب رس اکؼیذ ػشین ایي ػل ل ب ثب FITC Annexin V and PI س گ آهیضی ؿذ ت ػظ س ؽ فل ػبیت هتشی هغبلؼ ؿذ ذ. ذایت کشد اػت )ؿکل 3(. مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز

6 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... ضکل 3: تایج آ الیس فل سایت هتری تاثیر ا رر اکسیذ سرین بر ی رد سل لی A(.HT29 و تیوار طذ B( و تحت تیوار. د هربع ک چکQ1 Q2 در تایج هیساى آپ پت زیس را طاى هید ذ. واىط ریک تایج طاى هید ذ ا رر اکسیذ سرین را 16 درصذ ب سوت آپ پت زیس ذایت کرد است. بحث اهش ص اثتال ث ػشعبى یکی اص ه اسد ؿبیغ هشگ هیش دس ػشتبػش د یب ث ؿوبس هیس د )17(. اػتفبد اص س ؽ بی ک ی ؿیوی دسهب ی سادی تشاپی دس دسهبى ػشعبى داسای هؼبیجی اػت. یکی اص ایي هؼبیت آػیت سػیذى ث ػل ل بی ػبلن اعشاف ت ه س هیثبؿذ )18(. اص ایيس یک ػولکشد تک ل طیک آ سا ثشای حل ایي هکل ثب اػتفبد اص ب رسات ث ػ اى پش ة بی دس ى ػل لی اػت.)19( دس ػبل بی اخیش سا کبس اػتفبد اص ب رسات ث ػ اى ػیؼتن حبهل ثشای دسهبى ا تمبل داس پیشفت لبثل ت خ ی کشد اػت )20(. یکی اص ایي ب رسات ک ت خ هحممبى سا ث خ د خلت کشد اػت ب رس اکؼیذ ػشین اػت ک دس ػبل بی اخیش اص آى ث ػ اى یک ػبهل دسهبى ثشای تؼذادی اص ثیوبس اص خول ػشعبى دس ؿشایظ in vivo و in vitro اػتفبد کشد ا ذ )21(. ب رس ػشین اکؼبیذ یک ب رس فلضی اػت ثشای ػل ل بی ػشعب ی ػوی اػت ثبػث ه بس ت بخن حؼبع ؿذى ػل ل ب ث پشت دسهب ی ؿیویدسهب ی هحبفظت گ بی اکؼیظى فؼبل (ROS) افضایؾ آپ پت صیغ دس ػل ل هیؿ د. وچ یي ایي ب رس ثبػث ه بس هتبػتبص یض هیؿ د )22(. هی فیجش ثالػت ب تب حذ صیبدی اػغ ػیگ بلی گ اپیتلیبل اػتش هبل ؼت ذ ک مؾ ه وی دس ثیبى اخضای هبتشیکغ خبسج ػل لی هب ذ آلفب اکتیي ػضالت كبف کالطى ث ه ظ س تؼ یل دس ت بخن ت ه س سگصایی داسد. ایي ب رس داسای ت ا بیی ت ظین کشدى تکیل هی فیجش ثالػت تغییش اص فیجش ثالػت ث هی فیجش ثالػت ت ػظ TGF-B1 ک بؿی اص افضایؾ ثیبى ROS اثؼت ث اکتیي ػضالت كبف اػت. وب غ س ک ثشخی هی فیجش ثالػت ب دس ت ه س بی ه بخن ؼت ذ دسهبى ثب 444 مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز 6341

7 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... ایي ب رس ثبػث کب ؾ ت ا بیی هی فیجش ثالػت دس ت بخن ػل ل بی ػ گفشؿی ه بخن هیؿ د. وچ یي ب رس ػشین اکؼبیذ ثبػث کب ؾ راتی ػل ل بی ت ه س ػ گفشؿی ثشای حول هیؿ د )23(. دس ایي هغبلؼ اثشات ػویت ػل لی ب رس اکؼیذ ػشین دس غلظت ب صهبى بی هختلف دس سد ػل لی ػشعبى کل ى ه سد هغبلؼ لشاس گشفت. تبیح ایي هغبلؼ بى داد ک ایي ب رس ثیتشیي اثش ػویت خ د سا دس غلظت بی 12/5 تب 100 هیلیگشم دس هیلیلیتش بى داد اختالف هؼ یداسی ثب ػل ل بی ک تشل داؿت اػت )0.05>p( اثشات ػویت ػل لی آى اثؼت ث د ص اػت. ن چ یي تبیح بى داد ک اثشات ایي ب رس اثؼت ث صهبى اػت یؼ ی ثب افضایؾ صهبى هیضاى ػویت ػل لی آى یض افضایؾ هییبثذ. ث ع س کلی ثب افضایؾ صهبى غلظت ب رس ب رسات فشكت ثیتشی ثشای س د ػل ل پیذا هیک ذ اثشات ػویت خ د سا ثب ایدبد اػتشع اکؼیذاتی )ت لیذ سادیکبل بی ػوی اکؼیظى( دس دس ى ػل ل المب هیک ذ. اػتشع اکؼیذاتی ه خت ثش نصدى و ػتبصی دس ى ػل لی ثش نک ؾ ثب هبکش ه لک ل بی ػل لی هب ذ DNA پش تئیي ب لیپیذ ب هیؿ ذ. ث ع سیک ایي اػتشع اکؼیذاتی ثبػث ؿکؼت بی DNA د سؿت ای ؿذ ثبػث هشگ ػل ل بی ػشعب ی هیؿ د )24(. هغبلؼبت هختلفی دس صهی ثشسػی اثشات ػویت ػل لی ب رس اکؼیذ ػشین دس سد بی ػل لی هختلف ا دبم ؿذ اػت. دس هغبلؼ ای ت ػظSandeep وکبساى )25( س ی اثش ب رس اکؼیذ ػشین س ی ػل ل بی ػشعب ی سی )A549( ا دبم داد ذ بى داد ؿذ ک ایي ب رس ثبػث ػویت لبثل هالحظ تغییشات ه سف ل طیکی دس سد ػل لیA549 هیؿ د. تحمیك Pešić M وکبساى )26( ث ثشسػی اثش ػیت ت کؼیک CONPs س ی چ ذ ع ػشعبى سد ػل ل عجیؼی پشداخت خبكیت تغییش سد کغ داخل ػل لی سا ثشسػی کشد ذ. تبیح بى داد ک CONPs ثبػث افضایؾ هشگ ػل لی گ اکؼیظى فؼبل هیؿ د ثیتشیي حؼبػیت ث ب رس اکؼیذ ػشین دس سد ػل ل کبسػی هب 518A2 هال هب HT-29 کل سکتبل آد ثب اسصؽ IC50 ثبال دیذ ؿذ. دس بیت تید گیشی ؿذ ک ROS ثبػث افضایؾ هشگ ػل لی ؿذ اػت. Saikat Jana وکبساى )27( تحمیمی دس ه سد اثش ػویت ب رس اکؼیذ ػشین س ی سد ػل لی HCT-15 ا دبم داد ذ. دس ایي آصهبیؾ ن ROS پشاکؼیذاػی ى لیپیذی ک ؿبخق اػتشع اکؼیذاتی ػویت ػل لی ؼت ذ ث همذاس لبثل ت خ ی ثبت خ ث دص افضایؾ پیذا کشد اػت. Lin وکبساى )28( یض اثش ب رس اکؼیذػشین سا س ی سد ػل ل بی سی ثشسػی کشد ذ. دس بیت تبیح تبییذ ک ذ ایي اهش ث د ک ب رس اکؼیذ ػشین ثبػث افضایؾ هشگ ػل ل بی ػشعب ی ؿذ اػتشع اکؼیذاتی سا ث ػل ل المب هیک ذ. هکب یؼن دیگش اثشات ػویت ػل لی ب رس اکؼیذ ػشین آصاد ؿذى ػیت کش م c فؼبل ؿذى کبػپبص 9 3 هیثبؿذ. دس الغ ثبػث افضایؾ آپ پت صیغ دس ػل ل بی ػشعب ی ث ػیل ؿش ع هشگ ػل لی هیت ک ذسیبیی ثذ ى تغییشات ؿیویبیی اص عشیك ذف لشاس دادى هیت ک ذسی هیؿ د )29(. ث ع س کلی المبی هشگ ثش به سیضی ؿذ ػل لی یب آپ پت صیغ یکی اص س یکشد بی خزاة دس دس دسهبى ػشعبى ث ؿوبس هیس د. هؼیش هشگ ػل لی هی ت ا ذ ؿبهل فؼبل ػبصی س یذاد بی پش آپ پت تیک دس ػل ل ثبؿذ ک ثب ف رپزیشی غب ا ذاهک هیت ک ذسی ت ػظ پش تئیي بی c ؿش ع ؿذ ه خت آصاد ػبصی ػیت کش م Bak Bax اص آى بیتب فؼبل ؿذى کبػپبص 9 ػپغ کبػپبص 3 هیؿ د )30(. ػال ثش ایي پش تئیي بی Bclxl Bcl2 ثب لشاس گشفتي دس ػغح ؿجک ا ذ پالػوی هیت ک ذسی ؼت اص ک بس ن لشاس گشفتي پش تئیي بی Bak Bax خل گیشی هی وبیذ. ث بثشایي فؼبلیت ضذ آپ پت صیؼی بى هید ذ )31(. دس هغبلؼ حبضش اثشات ب رس اکؼیذ ػشین دس افضایؾ ثیبى طى بی آپ پت صیؼی کبػپبص 9 3 دس ػل ل بی ػشعب ی کل ى المبی هشگ ثش به سیضی ؿذ ػل لی بى داد ؿذ. اهب ثشسػی ثیتشی الصم اػت تب ثت اى اثجبت کشد ک آیب پش فبیل ثیب ی mrna ایي طى ب هیت ا ذ هذسکی ثشای مؾ آى دس پیؾگ یی اختلبكی دلیك تش پبػخ ػشعبى ث دسهبى ثبؿذ ػال ثش ایي دس ثخؾ فل ػبیت هتشی ثشای اسصیبثی هیضاى آپ پت صیغ کش صیغ المب ؿذ ت ػظ ب رس اص غلظت IC50 اػتفبد ؿذ. تبیح ایي هغبلؼ بى داد ک ب رس ت ا بیی المبی 16 دسكذی آپ پت صیغ سا داسد. ث ع س کلی ظشفیت فل ػبیت هتشی ثشای آ بلیض ػشیغ مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز

8 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... AcadGeneeskd Belg. 2010; 72(5-6): Meng X, Zhong J, Liu S, Murray M, Gonzalez-Angulo AM. A new hypothesis for the cancer mechanism.cancer Metastasis Rev. 2012; 31(1-2): Kolligs FT. Diagnostics and epidemiology of colorectal cancer.visc Med. 2016; 32(3): Faivre J, Lemmens VE, Quipourt V, Bouvier AM. Management and survival of colorectal cancer in the elderly in populationbased studies.eur J Cancer. 2007; 43(15): Williamson B. Strum, M.D. New Engandl Journal of Medicine. 2016; 374: Stacey LH, Nikki C. Chemokine signaling in cancer: Implications on the tumor microenvironment and therapeutic targeting. Cancer Ther. 2009; 14: 7(2): Golfinopoulos V, Pentheroudakis G, Pavlidis N. Treatment of colorectal cancer in the elderly: a review of the literature. Cancer Treat Rev. 2006; 32(1): Aschele C, Bergamo F, Lonardi S.Chemotherapy for operable and advanced colorectal cancer.cancer Treat Rev. 2009; 35(6): Ediriwickrema A, Saltzman WM. Nanotherapy for Cancer: Targeting and Multifunctionality in the Future of Cancer Therapies. ACS BiomaterSci Eng Feb 9;1(2): Babu A, Templeton AK, Munshi A, Ramesh R.Nanodrug delivery systems: a promising technology for detection, diagnosis, and treatment of cancer. AAPS PharmSciTech. 2014; 15(3): Ghaz-Jahanian MA, Abbaspour-Aghdam F, Anarjan N, Berenjian A, et al. Application of chitosan-based nanocarriers in tumortargeted drug delivery.molbiotechnol. 2015; 57(3): Das S, Dowding JM, Klump KE, McGinnis JF, et al. Cerium oxide nanoparticles: applications and prospects in nanomedicine. Nanomedicine (Lond). 2013; ه حلش ث فشد تؼذاد صیبدی ػل ل آى سا ثشای هغبلؼبت هشگ ػل لی ایذ آل هیک ذ. دس ایي تؼت اص د هؼشف Annexin V ک بى د ذ آپ پت صیغ پش پیذی م یذیذ )PI( ک وبیب گش کش ص هیثبؿذ اػتفبد ؿذ. ایي س ؽ هیضاى آپ پت صیغ سا ثش اػبع خبث خبیی فؼفبتیذیل ػشیي الی داخلی غبی پالػوبیی ث الی خبسخی آى دس فبص آپ پت صیغ )32(. هیثبؿذ دس ایي هغبلؼ تبیح فل ػبیت هتشی تبثیش ب رس اکؼیذ ػشین بى داد ک ایي ب رس ت ا بیی المبی آپ پت صیغ سا دس ػل ل HT29 سا داسد. ث ع س کلی تبیح ایي هغبلؼ بى داد ک ب رس ثش س ی سد ػل لی ػشعبى کل ى خبكیت ک ذگی چنگیشی داسد. ث بثشایي پی بد هیؿ د ک هغبلؼبت ثیتش دس ه سد خ اف صیؼتی ایي ب رس ا دبم گیشد تب ا ویت پضؿکی ایي ب رس ثیتش هخق ؿ د ث ػ اى یک تشکیت ضذػشعب ی اهیذثخؾ ث هشاکض داس یی پی بد ؿ د. نتیجهگیری تبیح ایي هغبلؼ بى داد ک ب رس اکؼیذ ػشین داسای اثشات ػویت ػل لی ػلی ػل ل بی ػشعبى کل ى هیثبؿذ هیت ا ذ آپ پت صیغ سا دس ایي ػل ل ب المب ک ذ. ث بثشایي پی بد هیؿ د ک هغبلؼبت ثیتش دس ه سد خ اف صیؼتی ایي ب رس ا دبم گیشد تب ا ویت پضؿکی ایي ب رس ثیتش هخق ؿ د ث ػ اى یک تشکیت ضذػشعب ی اهیذثخؾ ث هشاکض داس یی پی بد ؿ د. تشکر و قدردانی ایي همبل حبكل ثخی اص پبیبى به ثب ػ اى ثشسػی اثشات ػیت ت کؼیک ب رس اکؼیذ ػشین دس سد ػل لی ػشعبى کل ى آ بلیض ثیبى طى بی آپ پت صیؼی کبػپبص 3 9 دس همغغ کبسؿ بػی اسؿذ دس ػبل 1395 هی ثبؿذ ک ثب حوبیت دا گب آصاد اػالهی احذ ػل م تحمیمبت ت شاى اخشا ؿذ اػت. منابع 1. De Wever O, Lapeire L, De Boeck A, Hendrix A. Cellular and molecular mechanisms of cancer cell invasion. Verh K 336 مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز 6341

9 بررسی سمیت سلولی نانوذره اکسید سریم روی رده سلولی... 8(9): Celardo I, Pedersen JZ, Traversa E, Ghibelli L. Pharmacological potential of cerium oxide nanoparticles.nanoscale. 2011; 3(4): Clark A, Zhu A, Sun K, Petty HR. Cerium oxide and platinum nanoparticles protect cells from oxidant-mediated apoptosis. J Nanopart Res. 2011; 13(10): Baumber j,ball BA,Gravance CG,Medina V,DaviesMorel MC.2000.The effect of reactive oxygen species on equine sperm mobility viability acrosomal integrity mitochondrial membrane potential and membrane lipid peroxidation.j Androl. 21(6): Sun BH, Zhang J, Wang BJ, Zhao XP, et al. Analysis of in vivo patterns of caspase 3 gene expression in primary hepatocellular carcinoma and its relationship to p21(waf1) expression and hepatic apoptosis. World J Gastroenterol. 2000; 6(3): Pukkala E, Martinsen JI, Lynge E, Gunnarsdottir HK, et al. Occupation and cancer - follow-up of 15 million people in five Nordic countries. ActaOncol. 2009; 48(5): Sudhakar A. History of cancer, ancient and modern treatment methods.j Cancer SciTher. 2009: 1;1(2): Shannon AM, Williams KJ. Antiangiogenics and radiotherapy.j Pharm Pharmacol. 2008; 60(8): Sánchez-Moreno P, Ortega-Vinuesa JL, Peula-García JM, Marchal JA, et al. Smart drug-delivery systems for cancer nanotherapy. Curr Drug Targets. 2016: 27(1): Celardo I, Pedersen JZ, Traversa E, Ghibelli L. Pharmacological potential of cerium oxide nanoparticles.nanoscale. 2011; 3(4): Ying Gao, Kan Chen, Jin-lu Ma, Fei Gao Cerium oxide nanoparticles in cancer. Dovo press journal. 27(7): Can Xu and Xiaogang Qu Cerium oxide nanoparticle: a remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials (2014) 6, e90; doi: /am Xia T, Kovochich M, Liong M, Mädler L, et al. Comparison of the mechanism of toxicity of zinc oxide and cerium oxide nanoparticles based on dissolution and oxidative stress properties. ACS Nano. 2008: 28; 2(10): Sandeep M, Alok KP. Cerium oxide nanoparticles induced toxicity in human lung Cells: role of ROS mediated DNA damage and apoptosis. BioMed Research International. 2014: 14(2): Article ID , 14 pages. 26. Pešić M, Podolski-Renić A, Stojković S, Matović B, et al. Anti-cancer effects of cerium oxide nanoparticles and its intracellular redox activity.elsevire. 2015; 232: Saikat Kumar Jana, Priyanka Banerjee, Soumen Das, Sudipta Seal, et al. Redox-active nanoceria depolarize mitochondrial membrane of human colon cancer cells.journal of Nanoparticle Research. 2014; 16: Lin W, Huang YW, Zhou XD, Ma Y. Toxicity of cerium oxide nanoparticles in human lung cancer cells.int J Toxicol. 2006; 25(6): Arya A, Sethy NK, Das M, Singh SK, et al. Cerium oxide nanoparticles prevent apoptosis in primary cortical culture by stabilizing mitochondrial membrane potential. Free Radic Res. 2014; 48(7): Lalier L, Cartron PF, Juin P, Nedelkina S, et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis.apoptosis. 2007; 12(5): Billen LP, Shamas-Din A, Andrews DW. Bid: a Bax-like BH3 protein. Oncogene. 2008; 27 Suppl 1: S Demchenko AP. Beyond annexin V: fluorescence response of cellular membranes to apoptosis. Cytotechnology. 2013; 65(2): مجله سلول و بافت )علمی- پژوهشی( جلد 3 شماره 3 پاییز

10 Journal of Cell & Tissue (JCT) Autumn 2018; 8(3) Original Article Cytotoxicity of cerium oxide nano-particles (CeO2) on colon cancer cell line (HT29) and evaluation of caspase 3 and 9 apoptosis gene expression using Real Time PCR and flow-cytometry methods Nasiri R, MSc. 1, Zare Karizi Sh, Ph.D. 2*,Hayati Roodbari N, Ph.D. 3, Farhadyar N, Ph.D. 4 1.Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran Iran 2.Department of Biology, Varamin- Pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin, Iran 3.Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran Iran 4.Department of chemistry, Varamin- Pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin, Iran * corresponding author: Shohrehzare@yahoo.com Received: 11 Sep Accepted: 14 Nov Abstract Aim: In the current study, effect of cerium oxide nano-particles cytotoxicity was investigated on the colon cancer cell line HT29 and evaluation of caspase 3 and 9 apoptosis genes expression. Material and Methods: In this experimental study, the HT29 cell line was treated with different concentrations of cerium oxide nano-particles, including 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5,25 50 and 100 mg/ml in 24, 48 and 72 hours and the cell viability was determined using MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ) test. Then, the gene expression level of caspase 3 and 9 genes was evaluated by using Real Time PCR in treated HT29 cell line with IC50 value during 24 h. Finally, the apoptosis induction was assessed by flow-cytometry. Results: The MTT results show that cerium oxide nano-particles had maximum cytotoxicity on HT29 cell line in 25, 50 and 100 mg/ml concentrations in 72 h. Moreover, the Real Time PCR results indicated that the relative expression level of caspase 3 and 9 was up-regulated significantly (2.36±0.76 and 3.4±.95, respectively) in HT29 cell line treated with nano-particle. The flow-cytometry results revealed the 16% apoptosis in HT29 cell line. Conclusion: Findings showed that the cytotoxicity of cerium oxide was based on time and applied dose. Thus, it appears that this nano-particle could be used in pharmaceutical applications with further studies about selective targeting of cerium oxide nano-particles. Key words: caspase 3 and 9, cerium oxide nanoparticles, HT29 cell line. Journal of Cell & Tissue, Autumn 2018; 8(3)