ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΝΟΣΟΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΤΗ ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙ Α C

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΗΛΟΝΙ ΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΝΟΣΟΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΤΗ ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙ Α C ΕΛΕΝΗΣ Π. ΓΙΓΗ ΙΑΤΡΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΗΛΟΝΙ ΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΝΟΣΟΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΤΗ ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙ Α C ΕΛΕΝΗΣ Π. ΓΙΓΗ ΙΑΤΡΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΠΟΝΤΗΣ

4 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Μ. ΑΝΙΗΛΙ ΗΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΚΥΡΙΑΖΗΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Μ. ΑΝΙΗΛΙ ΗΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΚΥΡΙΑΖΗΣ, ΑΝ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΦ. ΜΑΓΟΥΛΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Γ. ΗΛΟΝΙ ΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ε. ΟΡΦΑΝΟΥ-ΚΟΥΜΕΡΚΕΡΙ ΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ

5

6 Στους γονείς µου

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα µελέτη σχεδιάστηκε µε σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος των ΤΗ1 (IFN-γ, IL-2) και ΤΗ2 (IL-4, IL-10) τύπου κυτταροκινών στην ανοσοπαθογένεια της χρόνιας ηπατίτιδας C. Οπως είναι γνωστό, οι κυτταροκίνες αυτές διαδραµατίζουν βασικό ρόλο στην άµυνα του ξενιστή έναντι των ιογενών λοιµώξεων ενορχηστρώνοντας και καθορίζοντας το είδος ή την επικράτηση κάποιας ανοσιακής απάντησης και επηρεάζοντας την έκβαση της οξείας λοίµωξης προς ίαση ή χρόνια νόσο. Τα βιβλιογραφικά δεδοµένα σχετικά µε την συµµετοχή των ΤΗ1 και ΤΗ2 τύπου κυτταροκινών στην εξέλιξη της οξείας HCV λοίµωξης και στην χρόνια ηπατίτιδα C είναι αντιφατικά. Η πρωτοτυπία της µελέτης αυτής έγκειται στα εξής : α) στην χρησιµοποίηση µίας πολύ ευαίσθητης τεχνικής PCR, την Real Time PCR (PCR πραγµατικού χρόνου), για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης του mrna των κυτταροκινών. Με την µέθοδο αυτή είναι εφικτή η ανίχνευση πολύ χαµηλών επιπέδων έκφρασης του mrna και β) στην επιλογή της οµάδας των ατόµων µε αυτοπεριορισθείσα HCV λοίµωξη προς σύγκριση των ευρηµάτων µε την οµάδα των ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα C. Οι βιβλιογραφικές αναφορές που αφορούν την οµάδα αυτή είναι ελάχιστες και είτε ελέγχουν άλλες παραµέτρους της ανοσιακής απάντησης ή χρησιµοποιούν διαφορετικές µεθοδολογίες. Η διδακτορική διατριβή αποτελείται από τα εξής µέρη: 1) τον πρόλογο 2) το γενικό µέρος, στο οποίο αναλύονται οι γνώσεις που αφορούν την ανοσολογία του ήπατος, την χρόνια ηπατίτιδα C, την ανοσιακή απάντηση έναντι των λοιµώξεων, τους µηχανισµούς διαφυγής των ιών, τις κυτταροκίνες, τις ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκίνες, την ανοσοπαθογένεια της χρόνιας ηπατίτιδας C και τον ρόλο των ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκινών στην ανοσοπαθογένεια της χρόνιας ηπατίτιδας C 3) το ειδικό µέρος, το οποίο αποτελείται από το υλικό και τις µεθόδους που χρησιµοποιήθηκαν, τη στατιστική ανάλυση, τα αποτελέσµατα 1

8 και τη συζήτηση 4) την περίληψη και τα συµπεράσµατα της µελέτης 5) την περίληψη και τα συµπεράσµατα στην Αγγλική γλώσσα και 6) τη βιβλιογραφία. Θα ήθελα να εκφράσω στη συνέχεια, τις ευχαριστίες µου στον Καθηγητή κ. Κ. Αρβανιτάκη που µού έδωσε τη δυνατότητα εκπόνησης της διατριβής αυτής. Θερµές ευχαριστίες οφείλω στον επιβλέποντα Καθηγητή, Αν. Καθηγητή κ. Α. Γαρύφαλλο για τον σχεδιασµό της µελέτης αυτής, την πολύτιµη καθοδήγησή του σε όλα τα στάδια, βήµα προς βήµα, της µελέτης και την αµέριστη συµπαράστασή του. Επίσης θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στα άλλα δύο µέλη της Συµβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθηγητές κ. Μ. ανιηλίδη και Γ. Κυριαζή για την ουσιαστική βοήθειά τους και τις συµβουλές τους. Θερµές ευχαριστίες οφείλω στον Καθηγητή κ. Ι. Κλωνιζάκη, υπεύθυνο του Αιµατολογικού Εργαστηρίου της Β Παθολογικής Κλινικής, για τη συνολική του συµπαράσταση. Επίσης θερµές ευχαριστίες οφείλω στους βιολόγους κ. Α. Καλογερίδη, Επιµελητή του Αιµατολογικού Εργαστηρίου της Β Παθολογικής Κλινικής και στην κα Σ. Μάνσιου, για την ουσιαστική βοήθειά τους στον σχεδιασµό και στην διενέργεια του ερευνητικού πρωτοκόλου των µοριακών τεχνικών όπως και για τις γνώσεις που µου µετέδωσαν σχετικά µε τη µοριακή βιολογία που αφορούσε την παρούσα µελέτη. Θερµές ευχαριστίες απευθύνω σε όλους τους συνεργάτες του Ηπατολογικού Τµήµατος και του Ηπατολογικού-Ανοσολογικού Εργαστηρίου της Β Παθολογικής Κλινικής, ιδιαίτερα στην Αν. Καθηγήτρια κ. Ε. Ορφανού-Κουµερκερίδου για την βοήθειά της στην τεχνική PCR και τη συµπαράστασή της. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τις τεχνολόγους κ. Ε. Χαïδευτού, Μ. Πανζέη και Α. Πανδέρη για την βοήθειά τους στις αιµοληψίες και τη συµβολή τους σε ορισµένα τµήµατα του πρωτοκόλου. Θερµά ευχαριστώ επίσης την Καθηγήτρια κ. Ε. Βρεττού για την ενδελεχή ιστολογική µελέτη των ηπατικών βιοψιών των ασθενών και τις γνώσεις επί του θέµατος που µου µετέφερε. 2

9 Ευχαριστίες απευθύνω προς τους ιατρούς συνεργάτες στην Β Παθολογική Κλινική, κ. Β. Τσάπα για τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων και κ. Π. Σκένδρο για την καλλιτεχνική επιµέλεια των περισσοτέρων σχηµάτων. Ενα µεγάλο ευχαριστώ οφείλω στην Εταιρεία BIOANALYTICA, αποκλειστικό διανοµέα στην Ελλάδα των προϊόντων της Εταιρείας ROCHE Molecular Diagnostics, στους κ.κ.. Χρήστου και Ι. Μπατάκη, για την προσφορά του αντιγόνου του HCV, των γονιδίων αναφοράς, των πλασµιδίων των κυτταροκινών, των primers και probes των γονιδίων αναφοράς και των κυτταροκινών που σχεδιάστηκαν για την παρούσα µελέτη καθώς και για τη χρησιµοποίηση για πρώτη φορά του Combas Tacqman 48 για την εφαρµογή ερευνητικού πρωτοκόλου. Ευχαριστώ επίσης την κ. Α. εγκιάρη για την πολύτιµη γραµµατειακή υποστήριξη. Τέλος, την µητέρα µου, Καθηγήτρια κ. Μ. Ραπτοπούλου-Γιγή, ευχαριστώ θερµά για την ηθική υποστήριξη καθόλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής αυτής διατριβής. 3

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος 1 Γενικό µέρος Ο ρόλος του ήπατος στην ανοσιακή απάντηση. 6 Χρόνια Ηπατίτιδα C. 21 Ανοσιακή απάντηση έναντι των ιών.43 Μηχανισµοί διαφυγής των ιών και εγκατάσταση χρόνιας λοίµωξης..53 Κυτταροκίνες 55 ΤΗ1-TH2 Κυτταροκίνες...74 Ανοσοπαθογένεια της HCV λοίµωξης 79 Ειδικό µέρος Υλικό Μέθοδοι Στατιστική ανάλυση 144 Αποτελέσµατα.146 Συζήτηση.167 Περίληψη και συµπεράσµατα 184 Summary and Conclusions..189 Bιβλιογραφία

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5

12 O ρόλος του ήπατος στην ανοσιακή απάντηση Το ήπαρ αποτελεί ένα όργανο το οποίο δέχεται πολλές προκλήσεις και απαντάει σ αυτές προβάλλοντας ποικίλες ανοσιακές απαντήσεις. Θεωρείται ότι αποτελεί ένα προνοµιακό όργανο του ανοσιακού συστήµατος το οποίο προάγει την ανοσιακή περιφερική ανοχή αναστέλλοντας τη διέγερση της ανοσιακής απάντησης, ακριβώς διότι συµµετέχοντας στην κάθαρση ή αποµάκρυνση ξένων αντιγόνων και τοξικών ουσιών τα οποία προέρχονται από το γαστρεντερικό σωλήνα, διεγείρει µηχανισµούς µε τους οποίους αποφεύγεται η άσκοπη ενεργοποίηση του ανοσιακού συστήµατος. Συγχρόνως, µε τον τρόπο αυτό αποφεύγεται η καταστροφή των ηπατοκυττάρων. Από την άλλη µεριά όµως, το ήπαρ έχει την ικανότητα εφόσον λειτουργεί ως ένα λεµφικό όργανο µε λεµφικά κύτταρα, να απαντάει σε κάθε λοίµωξη από παθογόνους µικροοργανισµούς προβάλοντας µια ικανή τοπική ανοσιακή απάντηση µε µηχανισµούς φυσικής ή επίκτητης ανοσίας. Ουσιαστικό ρόλο στην τοπική ανοσιακή απάντηση παίζουν και τα «ήρεµα» (naive) Τ κύτταρα τα οποία, σε µια προσπάθεια περιορισµού της λοίµωξης, µπορούν δυνητικά να ενεργοποιηθούν παρουσία τοπικών αντιγόνων. Εντούτοις, εφόσον δέχεται πλείστες ανοσιακές προκλήσεις, είναι δυνατόν ενίοτε, και παρά την ικανότητά του να εγείρει µια έντονη ανοσιακή απάντηση, οι προκλήσεις αυτές να οδηγούν σε εκδήλωση νόσου, όπως εµµένουσα λοίµωξη, αυτοάνοσα νοσήµατα, αυτοάνοσες εκδηλώσεις από φάρµακα ή νεοπλασίες. Επιπλέον, το ήπαρ διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο όχι µόνο στην τοπική ανοσιακή απάντηση έναντι αντιγόνων, αλλά και στη ρύθµιση της συστηµατικής ανοσιακής απάντησης και στην συστηµατική φλεγµονή, µέσω της παραγωγής µεσολαβητών και παρουσίας κυττάρων που επιτελούν αντιδράσεις στα πλαίσια της φυσικής αλλά και της επίκτητης ανοσίας. 6

13 Α. Κυτταρικοί υποπληθυσµοί στο φυσιολογικό ήπαρ Το ήπαρ αποτελείται από τα εξής κύτταρα : α)τα ηπατοκύτταρα, τα οποία αποτελούν το 70-80% του συνόλου των κυττάρων β) τα ενδοθηλιακά κύτταρα των ηπατικών κολποειδών (LSEC, liver sinusoidal endothelial cells) γ) τα φαγοκύτταρα (κύτταρα Kupffer και δενδριτικά κύτταρα), τα οποία συµµετέχουν στην φυσική ανοσία δ) τα ΝΚ κύτταρα ε) τα ΝΚΤ κύτταρα και τέλος στ) τα Τ και Β λεµφοκύτταρα, τα οποία επιτελούν αντιδράσεις της επίκτητης ανοσίας (Σχήµατα 1,2) 1. Ενδοθηλιακά κύτταρα των ηπατικών κολποειδών (LSEC) 2 Τα κύτταρα αυτά επιτελούν ένα σηµαντικό ρόλο στην ανοσιακή απάντηση του ήπατος εφόσον : α) στον χώρο του Diesse λειτουργούν ως φίλτρο µεταξύ του αίµατος των κολποειδών και του πλάσµατος, β) δρουν ως «καθαριστές» (scavenger) για αντιγόνα ή ουσίες που έρχονται από το γαστρεντερικό σωλήνα, γ) εκκρίνουν διάφορους µεσολαβητές της ανοσιακής απάντησης όπως κυτταροκίνες (TGF-β - transforming growth factor-, µεταµορφωτικός αυξητικός παράγοντας), δ) εκφράζουν µόρια προσκόλλησης (CAM) είτε αυτόµατα (ICAM-1, CD54, CD102 (ICAM-2), CD58 (LFA-3) ή µετά από διέγερση παρουσία αντιγόνου (VCAM-1). Η ιδιότητα των LSEC να εκφράζουν µόρια προσκόλλησης (CAM) έχει ως αποτέλεσµα την παγίδευση των ενεργοποιηµένων από κάποιο αντιγόνο CD8+ T κυττάρων στην περιοχή των κολποειδών µε αποτέλεσµα τα Τ κύτταρα να παραµένουν εκεί, να µην προάγονται ανοσιακές απαντήσεις στο ήπαρ και τελικά το ήπαρ να λειτουργεί ως «δεξαµενή Τ κυττάρων», 7

14 ε) παρόλα αυτά σε άλλες περιπτώσεις τα LSEC έχουν τη δυνατότητα να λειτουργούν ως αντιγόνοπαρουσιαστικά κύτταρα και να παρουσιάζουν αντιγόνο στα CD8+ T κύτταρα. Η λειτουργία αυτή δεν έρχεται σε πλήρη αντίθεση µε την προηγούµενη, διότι η ενεργοποίηση των CD8+ Τ κυττάρων τελικά αποσκοπεί στην πρόκληση ανοχής µάλλον παρά διέγερσης κάποιας ανοσιακής απάντησης, η οποία δυνητικά θα µπορούσε να προκαλέσει ιστολογική βλάβη στο ήπαρ. Κύτταρα Kupffer 1,3,4 Τα κύτταρα του Kupffer αποτελούν τον µεγαλύτερο πληθυσµό των ιστικών µακροφάγων του ανθρώπινου οργανισµού, προσκολλώνται στα LSEC και επικαλύπτουν τα κολποειδή. Τα κύτταρα αυτά είναι ενεργά φαγοκύτταρα και εκφράζουν αρκετούς υποδοχείς επιφανείας όπως υποδοχείς για το συµπλήρωµα (CR), για το Fc τµήµα της ανοσοσφαιρίνης, υποδοχείς λεκτίνης. Στους υποδοχείς αυτούς συνδέονται µόρια προσκόλλησης (ICAM-1) και µικροβιακές ή προερχόµενες από τον ξενιστή πολυσακχαρίδες. Τα κύτταρα του Kupffer ενεργοποιούνται µετά από επίδραση αντιγονικών ερεθισµάτων όπως οι βακτηριακές ενδοτοξίνες (LPS) και τα υπεραντιγόνα. Μετά την ενεργοποίηση τους εκκρίνουν πρωτεϊνες οξείας φάσης και φλεγµονώδεις κυτταροκίνες όπως IL-1, IL-6, TNF-α, GM-CSF, MΙΡiα και Rantes (χηµειοκίνες), µε σκοπό τον περιορισµό της φλεγµονής και της καταστροφής των αντιγόνων αυτών. Επιπλέον, µετά την ενεργοποίηση τους, παράγουν ΙL-12 και IL- 18, οι οποίες στη συνέχεια ενεργοποιούν τα ΝΚ κύτταρα και τα ΝΚ1.1 Ag + Τ κύτταρα. Η ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών προκαλεί παραγωγή και έκκριση IFN-γ, η οποία προάγει στη συνέχεια, την κυτταροτοξική τους δράση έναντι βακτηριδίων ή νεοπλασµατικών κυττάρων. 8

15 ενδριτικά κύτταρα Μόλις πρόσφατα οι µελέτες των ερευνητών έχουν εστιασθεί στα δενδριτικά κύτταρα του ήπατος και στον ρόλο που διαδραµατίζουν στην τοπική ανοσιακή απάντηση. Τα κύτταρα αυτά ανευρίσκονται σε πολύ µικρό αριθµό στο ήπαρ, αλλά έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται µετά από επίδραση διαφόρων αντιγονικών ερεθισµάτων, εµφανίζοντας φαινότυπο άωρων δενδριτικών κυττάρων µε χαµηλή έκφραση µορίων τάξης ΙΙ του MHC καθώς και CD80 και CD86 µόρια προσκόλλησης. Η διαφοροποίηση τους επιτυγχάνεται παρουσία κυτταροκινών του µικροπεριβάλλοντος του ήπατος, µε αποτέλεσµα να λειτουργούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα στα CD4+ Τ κύτταρα. Εντούτοις θεωρείται ότι τα κύτταρα αυτά µάλλον οδηγούν σε πρόκληση ανοσιακής ανοχής και όχι ανοσιακής διέγερσης 5. Αστεροειδή κύτταρα (stellate cells) Tα κύτταρα αυτά ανευρίσκονται στον υπενδοθηλιακό χώρο του Diesse και έχουν την ικανότητα να συνθέτουν πρωτεΐνες στρώµατος (κολλαγόνο 1 και 4, λαµινίνη και πρωτεογλυκάνες). Τα κύτταρα αυτά δυνητικά µετατρέπονται σε ινοβλάστες προάγοντας την ινογένεση του ήπατος, η οποία τελικά οδηγεί σε διαταραχή της αρχιτεκτονικής του και κίρρωση. Επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων (BEC) Τα κύτταρα αυτά επικαλύπτουν τους ενδοηπατικούς και εξωηπατικούς χοληδόχους πόρους και έχουν την ικανότητα να εκκρίνουν χηµειοκίνες και κυτταροκίνες. Επιπλέον έχουν την ικανότητα να συµµετέχουν στην ανοσιακή απάντηση έναντι αντιγόνων µέσω της έκφρασης µορίων προσκόλλησης (CAM) και συν-διεγερτικών µορίων (CD40), χαρακτηριστικά που είναι όµοια µε εκείνα των «επαγγελµατικών» αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων 6. 9

16 Αρχέγονα κύτταρα (stem cells) Τα κύτταρα αυτά ανευρίσκονται σε πολύ µικρό αριθµό στο ήπαρ, υποστηρίζουν την αιµοποίηση και θεωρείται ότι συντελούν στην αναγέννηση του ήπατος. Τα κύτταρα αυτά φέρουν τον δείκτη CD34 των προγονικών µυελικών κυττάρων 7. Λεµφοκύτταρα Η παρουσία των λεµφοκυττάρων στο ήπαρ συνήθως συνδέεται µε την παρουσία νόσου και τη συµµετοχή των κυττάρων αυτών στην παθογένεσή της. Πρόσφατες όµως µελέτες έδειξαν ότι τα κύτταρα του λεµφικού ιστού ανευρίσκονται στο φυσιολογικό ήπαρ και παρουσιάζουν µοναδικά φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, γεγονός που συνδέεται µε τον ειδικό ρόλο που παίζουν τα κύτταρα αυτά στο ήπαρ 7. Ο αριθµός τους ανέρχεται περίπου στα 1x10 10 κύτταρα, τα οποία βρίσκονται κυρίως γύρω από τα πυλαία διαστήµατα και ορισµένα είναι διασκορπισµένα µέσα στο ηπατικό παρέγχυµα 8. Τα λεµφοκύτταρα αποτελούνται από διάφορους υποπληθυσµούς, από τα κλασσικά λεµφοκύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν τα αντιγόνα µέσω της αντιγονοπαρουσίασής τους µε MHC Ι και ΙΙ µόρια, εως τα λεµφοκύτταρα που συµµετέχουν στους µηχανισµούς φυσικής ανοσίας και αναγνωρίζουν τα αντιγόνα µέσω των υποδοχέων της επιφανείας τους και είναι: α) ΝΚ κύτταρα : αποτελούν ποσοστό 20-25% των κυττάρων, εµφανίζουν τον δείκτη CD56, συµµετέχουν στις αντιδράσεις φυσικής ανοσίας κυρίως έναντι ενδοκυττάριων αντιγόνων στα οποία δρουν µέσω µιας ADCC αντίδρασης (κυτταρικής αντίδρασης εξαρτώµενης από αντίσωµα) και µέσω της παραγωγής κυτταροκινών 9. β) Τ κύτταρα 1 - CD4 + T µε αβ υποδοχείς - CD8 + T - Tγδ λεµφοκύτταρα : πρόκειται κυρίως για CD8 + Τ κύτταρα τα οποία συµµετέχουν στην πρώτης γραµµής άµυνα έναντι 10

17 αντιγόνων που έρχονται από το έντερο και έχουν ανοσορυθµιστικές ιδιότητες. - ΝΚΤ κύτταρα : εκφράζουν TCR, CD56 και CD57 (δείκτες ΝΚ κυττάρων), έχουν µνήµη, εκκρίνουν IL-4 και έχουν ιδιότητες ενεργοποιηµένων κυτταροτοξικών λεµφοκυττάρων. - CD4 -, CD8 - Τ κύτταρα - Οµοδιµερή CD8 - T κύτταρα τα οποία εκφράζουν µόνον την άλυσο α του TCR. Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι τα Τ κύτταρα µε αβ αλύσους που προέρχονται από το αίµα είναι δυνατόν να ενεργοποιηθούν τοπικά στο ήπαρ. Ο αριθµός αυτών των Τ κυττάρων είναι µικρός και παρατηρείται αντίστροφη από αυτήν του περιφερικού αίµατος CD4/CD8 αναλογία. α)νκ κύτταρα (αρχικά Pit κύτταρα) Τα ΝΚ κύτταρα αποτελούν κύτταρα κλειδιά στους µηχανισµούς φυσικής ανοσίας έναντι ορισµένων ιών, ενδοκυττάριων βακτηριδίων, παρασίτων και διαφοροποιηµένων κυττάρων αναγνωρίζοντας µεταβολές στην έκφραση της γλυκοπρωτεΐνης της µεµβράνης των κυττάρων στόχων. Η δράση τους ρυθµίζεται µέσω υποδοχέων, οι οποίοι προκαλούν την ενεργοποίηση ή αναστολή της δράσης τους µετά τη σύνδεσή τους στους συνδέτες των κυττάρων στόχων και µέσω κυτταροκινών όπως η IFN-γ, IL- 2, IL-12 και IL-15. Υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων, οι οποίοι προκαλούν ενεργοποίηση, είναι ο CD16, ο Fc υποδοχέας της IgG o oποίος προκαλεί ADCC, η έκκριση κυτταροκινών µετά τη σύνδεση των ΝΚ κυττάρων µε αντισώµατα στην επιφάνεια των κυττάρων στόχος 3 και τα συν-διεγερτικά µόρια και µόρια προσκόλλησης (CD2, CD11α/CD18, CD69 και CD49d). Ένα σηµαντικό χαρακτηριστικό των ΝΚ κυττάρων είναι ότι καταστρέφουν κύτταρα στόχους, τα οποία δεν έχουν τα κλασσικά µόρια ιστοσυµβατότητας. Στο ήπαρ, αποτελούν το 50% του λεµφοκυτταρικού πληθυσµού και ο αριθµός τους αυξάνει στο 90% σε ασθενείς µε ηπατική νεοπλασία. Η φαινοτυπική διαφορά τους από το περιφερικό αίµα συνίσταται 11

18 στο ότι τα ΝΚ κύτταρα του ήπατος δεν εκφράζουν το µόριο CD16 συνηγορώντας, κατά ορισµένους ερευνητές, ότι τα ΝΚ του ήπατος δεν επιτελούν ADCC αντιδράσεις 10,11. β) Τ λεµφοκύτταρα Τα Τ λεµφοκύτταρα όπως είναι γνωστό αποτελούν τους βασικούς ενορχηστρωτές της επίκτητης ανοσιακής απάντησης. Μετά την αναγνώριση των αντιγόνων που είναι συνδεδεµένα µε τάξης ΙΙ (CD4+ βοηθητικά Τ κύτταρα) ή τάξης Ι (CD8+ κυτταροτοξικά Τ κύτταρα) υπόκεινται σε κλωνικό πολλαπλασιασµό. Μετά τη διέγερσή τους προάγουν τη διαφοροποίηση των Β κυττάρων σε πλασµατοκύτταρα, προκαλούν τον θάνατο των κυττάρων στόχων και απελευθερώνουν ένα πλήθος κυτταροκινών οι οποίες διεγείρουν άλλους παράγοντες που συµµετέχουν στην ανοσιακή απάντηση. Στο ήπαρ έχει διαπιστωθεί ότι ένας µεγάλος αριθµός Τ κυττάρων είναι κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Τα περισσότερα ηπατικά Τ κύτταρα εκκρίνουν κυτταροκίνες τύπου ΤΗ1 όπως IFN-γ, ΤΝF-α και ΙL-2 και µόνον ένα ποσοστό 5% των ηπατικών Τ κυττάρων εκκρίνουν ΤΗ2 τύπου κυτταροκίνες 12. Εντούτοις, τα περισσότερα ΤΗ2 κύτταρα που παράγουν IL-4 παράγουν και IFN-γ συνηγορώντας ότι πρόκειται για ΤΗ0 κύτταρα δηλαδή, είτε µη διαφοροποιηµένα ή ρυθµιστικά κύτταρα. Ένα άλλο µοναδικό λειτουργικό χαρακτηριστικό των ηπατικών Τ λεµφοκυττάρων είναι η παρουσία ενός πληθυσµού δυνητικών LAK κυττάρων τα οποία µετά από διέγερσή τους παρουσία κυτταροκινών προκαλούν τον θάνατο µεγάλου αριθµού νεοπλασµατικών κυττάρων. Τα περισσότερα Τ κύτταρα είναι CD8 + Τ και παρατηρείται αναστροφή της αναλογίας CD4/CD8 σε σχέση µε το περιφερικό αίµα. Ένα µεγάλο ποσοστό των Τ κυττάρων (35%) εκφράζουν TCR γδ και τα περισσότερα είναι ΝΚΤ κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά θεωρούνται ότι αποτελούν κύτταρα τα οποία λειτουργούν ως 12

19 λειτουργική γέφυρα µεταξύ συστηµάτων της φυσικής και επίκτητης ανοσίας και καλούνται «φυσικά λεµφοκύτταρα». γ ) ΝΚΤ λεµφοκύτταρα ή «φυσικά λεµφοκύτταρα» Εκφράζουν TCR καθώς και υποδοχείς διέγερσης και αναστολής των ΝΚ κυττάρων (ΝΚ 1.1, Ly49 και IL-2R β, χαµηλά επίπεδα TCR). Τα NK T κύτταρα προκαλούν τη λύση νεοπλασµατικών κυττάρων χωρίς να προηγηθεί αντιγονικός ερεθισµός µέσω µιας ADCC τύπου καταστροφής και παράγουν µεγάλες ποσότητες ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκινών. Αποτελούν στο ήπαρ το 1/3 των ηπατικών Τ κυττάρων σε αντίθεση µε το 2% του περιφερικού αίµατος. Σε ένα µεγάλο ποσοστό τα ΝΚΤ έχουν φαινότυπους ενεργοποίησης/µνήµης (CD45RΟ +, CD45RA -, CD25, CD69, CD56). Ενας βασικός ρόλος των κυττάρων αυτών είναι ότι παρεµβαίνουν και τροποποιούν το ανοσιακό περιβάλλον στο ήπαρ µέσω της παραγωγής κυτταροκινών όπως IFN-γ, ΤΝF-α, IL-2 και IL-4. Β. O ρόλος των ηπατικών λεµφοκυττάρων στην ανοσολογία του ήπατος α) Το φυσιολογικό ήπαρ είναι πλούσιο σε διαφορετικούς υποπληθυσµούς λεµφοκυττάρων γεγονός που συνηγορεί ότι τα κύτταρα αυτά παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ηπατική ανοσιακή απάντηση. Υπέρ της άποψης αυτής είναι ότι τα περισσότερα ηπατικά Τ λεµφοκύτταρα εκφράζουν δείκτες ενεργοποίησης και κατά συνέπεια υποδηλώνουν τη συνεχή παρουσία ανοσιακών απαντήσεων παρά την απουσία λοίµωξης ή νόσου, µε σκοπό τη διατήρηση της ανοσιακής οµοιόστασης. β) Η ειδική συµµετοχή του ήπατος ως όργανο στο οποίο διενεργούνται ανοσιακές αντιδράσεις φυσικής ανοσίας τεκµηριώνεται από την παρουσία µεγάλου αριθµού ΝΚ, ΝΚΤ, 13

20 Τγδ κυττάρων τα οποία αναγνωρίζουν αντιγόνα (µη πρωτεϊνικά συστατικά µικροοργανισµών, ή αυτοαντιγόνα) χωρίς MHC περιορισµό. Τα αντιγόνα αυτά δεν υπόκεινται σε µετάλλαξη αλλά είναι σταθερά. γ) Τα κύτταρα αυτά αντιδρούν σε αυτοαντιγόνα τα οποία προκύπτουν µετά από ιική λοίµωξη ή διαφοροποίηση των κυττάρων. Επίσης διηθούν όγκους και συµµετέχουν στην απόρριψή τους. δ) Τα ηπατικά λεµφοκύτταρα λειτουργούν ως διάµεσοι συντελεστές της φυσικής και επίκτητης ανοσίας διότι και τα κανονικά Τ, αλλά και τα ΝΚΤ και τα Τγδ κύτταρα έχουν την ικανότητα να παράγουν µεγάλες ποσότητες ΤΗ2 ή ΤΗ1 κυτταροκινών µετά από πρωτογενή διέγερση και στη συνέχεια να ρυθµίζουν την επίκτητη ανοσιακή απάντηση επηρεάζοντας τις κυτταροκίνες υπέρ µιας ΤΗ1 ή ΤΗ2 τύπου, µιας φλεγµονώδους αντίδρασης δηλαδή ή µιας αντίδρασης χυµικής ανοσίας. ε) Επίσης διαπιστώνεται ότι τα Τγδ κύτταρα ελαττώνουν την απάντηση των Ταβ κυττάρων, γεγονός που συνηγορεί ότι παίζουν ρόλο κατασταλτικό και ρυθµιστικό στο ήπαρ, προάγοντας τη διάκριση µεταξύ ακίνδυνων διαιτητικών αντιγόνων και παθογόνων µικροοργανισµών ή νεοπλασµατικών κυττάρων. στ) ιαταραχή της ισορροπίας µεταξύ ΤΗ1/ΤΗ2 κυτταροκινών από τα Τ και ΝΚΤ κύτταρα θεωρείται ότι παίζει ρόλο στην εµφάνιση αυτοανόσων νοσηµάτων ή και ιογενών λοιµώξεων του ήπατος 6. ζ) Το ήπαρ θεωρείται ακόµη ότι αποτελεί τον τόπο καταστροφής των ενεργοποιηµένων Τ κυττάρων µε µηχανισµούς απόπτωσης. Υπέρ της άποψης αυτής είναι το γεγονός ότι µετά την ενεργοποίηση των περιφερικών CD8 + T κυττάρων, η ελάττωση της έκφρασης του TCR στα κύτταρα αυτά, σχετίζεται µε τη µετακίνηση τους από τους λεµφαδένες και τον σπλήνα προς το ήπαρ όπου και υφίστανται απόπτωση. 14

21 Γ. Ρύθµιση της ανοσιακής απάντησης στο ήπαρ Μετά την είσοδο αντιγόνων και λευκοκυττάρων από το αίµα στο ήπαρ, αυτά έρχονται πρώτα σε επαφή µε τα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολποειδών και τα κύτταρα Kupffer τα οποία τα προσλαµβάνουν µε µηχανισµούς ενδοκύττωσης και φαγοκυττάρωσης 13, 14. Συγχρόνως όµως τα κύτταρα Kupffer όπως και τα LSΕC λειτουργούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα ενεργοποιώντας τα ηπατικά CD4 + T κύτταρα. Η ενεργοποίηση όµως αυτή δυνατόν να προβεί επικίνδυνη αν δεν υπάρχουν ρυθµιστικοί µηχανισµοί διότι µπορεί να προκαλέσει καταστροφή του ηπατικού παρεγχύµατος. Το µικροπεριβάλλον του ήπατος χαρακτηρίζεται από την παρουσία βακτηριακών αντιγόνων ή συστατικών των βακτηριδίων όπως η LPS (τα οποία προέρχονται από το γαστρεντερικό σωλήνα µέσω της πυλαιοφλεβικής οδού) και διαφόρων µεσολαβητών που εκκρίνονται από διάφορους κυτταρικούς υποπληθυσµούς του ήπατος σε απάντηση προς τα παραπάνω αντιγόνα. Συγκεκριµένα, τα κύτταρα Kupffer απαντούν στην LPS εκφράζοντας IL-10 πολύ γρήγορα, µέσα σε 2 ώρες σε αντίθεση µε τα περιφερικά µονοπύρηνα στα οποία η έκφραση της IL-10 επιτυγχάνεται µέσα σε 24h. Στη συνέχεια, τα κύτταρα Kupffer απελευθερώνουν την IL-10 στον αυλό των κολποειδών και από εκεί µέσω του αίµατος η IL-10 κατανέµεται κατά µήκος των κολποειδών. Όταν η συγκέντρωση της κυτταροκίνης αυτής είναι επαρκής, τότε δρα αρνητικά στα κύτταρα Kupffer, λειτουργώντας ως ένα αρνητικό αυτορυθµιστικό σύστηµα. Η IL- 10 στη συνέχεια δρα αναστέλλοντας την ενεργοποίηση των CD4 + Τ κυττάρων από τα APC (αντιγονοπαρουσιατικά κύτταρα) µε τον εξής µηχανισµό : αναστέλλει την επίδραση του αντιγόνου στους υποδοχείς (ΤCR) των CD4 + T κυττάρων, ελαττώνει την 15

22 έκφραση των MHC τάξης ΙΙ µορίων στα APC κύτταρα και ελαττώνει την έκφραση των συν-διεγερτικών µορίων CD80 και CD Η δράση της IL-10 στο ήπαρ ασκείται µόνον όσο χρόνο η κυτταροκίνη αυτή βρίσκεται στα κολποειδή. Ο ΤΝF-α που επίσης απελευθερώνεται από τα κύτταρα Kupffer σε απάντηση στην LPS επίσης ελαττώνει την ενεργοποίηση των CD4 + T κυττάρων από τα αντιγονοπαρουσιαστικά ενδοθηλιακά κύτταρα των κολποειδών. Συµπερασµατικά, φαίνεται ότι οι µεσολαβητές που εκκρίνονται από τα κύτταρα Kupffer ελαττώνουν την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων από τα LSEC ασκώντας αυτοκρινή και παρακρινή δράση. Η παραγωγή των προστανοειδών από τα LSEC αυξάνει µετά την επαφή µε την LPS. Αν η παραγωγή αυτή αποφευχθεί µέσω της ανασταλτικής δράσης της κυκλοξυγενάσης, τότε η ενεργοποίηση των CD4 + Τ κυττάρων από τα LSEC αυξάνει.. Ρύθµιση της αντιγονοπαρουσίασης από την LPS Φυσιολογικά η LPS προκαλεί έντονη ανοσιακή απάντηση σε εξωηπατικούς ιστούς. Αντίθετα όµως στο ήπαρ δεν προκαλεί φλεγµονή διότι ελαττώνει την αντιγονοπαρουσίαση των LSEC στα CD4 + Τ κύτταρα και προκαλεί ελάττωση της έκκρισης IFN-γ από τα ενεργοποιηµένα Τ κύτταρα κατά 50%. Η ανασταλτική αυτή δράση της LPS επιτυγχάνεται µέσω διαταραχής της παρουσίασης του αντιγόνου λόγω πρόκλησης αλκαλικού περιβάλλοντος στο ενδοσωµικό/λυσσωσοµικό διαµέρισµα. Επίσης ελαττώνει την έκφραση ΜΗC τάξης ΙΙ µορίων, CD80, CD86 και αυξάνει την έκφραση των CD54 +, CD Tην ίδια δράση έχουν και τα κύτταρα Kupffer παρουσία LPS. Eπιπλέον ο TGF-β (transforming growth factor), ο οποίος αποτελεί µια ισχυρή ανοσοκατασταλτική κυτταροκίνη, εκφράζεται επίσης από τα κύτταρα Kupffer και τα LSEC και η έκφραση αυτή αυξάνει σηµαντικά παρουσία LPS. 16

23 Ε. Πρόκληση ανοχής στο ήπαρ Η πρόκληση ανοχής µπορεί να επιτευχθεί µέσω καταστροφής των Τ κυττάρων ή µέσω ανοσιακής εκτροπής α) Απόπτωση 1) Η απόπτωση των Τ κυττάρων επιτελείται στο ήπαρ ή τα Τ κύτταρα που πρόκειται να πεθάνουν συγκεντρώνονται στο ήπαρ; ιαπιστώνεται ότι η παγίδευση των αποπτωτικών κυττάρων αποτελεί µια ενεργό µεσολαβούµενη από τους υποδοχείς των LSEC διαδικασία. Εντούτοις, δεν υπάρχουν αρκετές ενδείξεις ότι η απόπτωση επιτυγχάνεται τοπικά στο ήπαρ και δεν συγκεντρώνονται απλά τα αποπτωτικά κύτταρα εκεί. 2) Ποια κύτταρα εµπλέκονται στην πρόκληση της απόπτωσης; Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα LSEC, τα κύτταρα Kupffer και τα ηπατικά κύτταρα προάγουν την απόπτωση των Τ κυττάρων 17. 3) Τι ρυθµίζει την πρόκληση της απόπτωσης στα Τ κύτταρα; Αν η πρόκληση της απόπτωσης ήταν µη ειδική, τότε όλα τα ενεργοποιηµένα λεµφοκύτταρα που έρχονται στο ήπαρ δεν θα προκαλούσαν ανοχή αλλά συστηµατική ανοσοκαταστολή. Φαίνεται λοιπόν ότι η απόπτωση είναι ειδική του αντιγόνου, αν και δεν υπάρχουν µέχρι σήµερα πληροφορίες επ αυτού. Συµπερασµατικά, φαίνεται ότι η απόπτωση αποτελεί έναν µηχανισµό ανοσορύθµισης στο ήπαρ. β. Τοπική αντιγονοπαρουσίαση: είναι απαραίτητη; Τα κύτταρα Kupffer (συντελεστές φυσικής ανοσίας) αποτελούν το 80% όλων των µακροφάγων, βρίσκονται στις περιπυλαίες περιοχές όπου και το αίµα εισέρχεται στο ήπαρ. Τα κύτταρα αυτά καθαρίζουν διάφορα υλικά, αντιγόνα ή παθογόνους µικροοργανισµούς µε µηχανισµούς φαγοκυττάρωσης και 17

24 συνεργάζονται µε τα πολυµορφοπύρηνα µε αποτέλεσµα την απόλυτη αντιµικροβιακή προστασία του ήπατος. Επίσης, συµβάλουν στην αναχαίτιση γενικά των βακτηριακών λοιµώξεων. Εντούτοις, υπάρχουν µικροοργανισµοί οι οποίοι στοχεύουν και πολλαπλασιάζονται µέσα στα ηπατοκύτταρα (µη κυτταροτοξικοί- nοn-cytopathic). Εκεί ασφαλώς δεν µπορούν να δράσουν τα κύτταρα Kupffer, τα ΝΚ ή τα λευκοκύτταρα και κατά συνέπεια προστατεύονται από την επίθεση του ανοσιακού συστήµατος. ιάφορες σχετικές µελέτες έχουν δείξει µέχρι σήµερα τα εξής : α) Τα ηπατοκύτταρα προστατεύονται από την επίθεση των λευκοκυττάρων µέσω των LSEC β) Καταστροφή των ηπατοκυττάρων και απελευθέρωση µεσολαβητών απαιτείται για να εξαλειφθεί ο φραγµός των LSEC και να είναι δυνατή η επίδραση των Τ κυττάρων στα ηπατοκύτταρα 18. γ) Η αντιγονοπαρουσίαση από τα ηπατοκύτταρα δεν οδηγεί σε ενεργοποίηση των Τ κυττάρων σε φυσιολογικές συνθήκες, εφόσον δεν υπάρχει φλεγµονή. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι στις περισσότερες λοιµώξεις των ηπατοκυττάρων από παθογόνα, η παρουσίαση του αντιγόνου στα CD8 + T κύτταρα γίνεται ως εξής: το παθογόνο πολλαπλασιάζεται µέσα στο ηπατοκύτταρο και στη συνέχεια απελευθερώνονται αντιγόνα του παθογόνου µικροοργανισµού από τα ηπατοκύτταρα. Τα αντιγόνα αυτά προσλαµβάνονται από τα LSEC και παρουσιάζονται στα CD8 + Τ κύτταρα. Η διαδικασία αυτή της ενεργοποίησης των CD8 + Τ µέσω ΜΗC I µορίων καλείται διασταυρούµενη παρουσίαση, µια διαδικασία που µέχρι πρόσφατα επιτελούνταν από τα δενδριτικά κύτταρα και τα µακροφάγα. Τα ενεργοποιηµένα CD4 + ή CD8 + Τ κύτταρα εκκρίνουν τις κυτταροκίνες ΤΝF-α και IFN-γ και µε τον τρόπο αυτόν επηρεάζεται (αναστέλλεται) ο πολλαπλασιασµός των παθογόνων µικροοργανισµών µέσα στα ηπατοκύτταρα. 18

25 Συµπερασµατικά, η ενεργοποίηση των Τ κυττάρων πρέπει να γίνει στην περιοχή των κολποειδών διότι δεν υπάρχει άµεση επαφή Τ κυττάρων και ηπατοκυττάρων. Σχήµα 1. Κυτταρικοί υποπληθυσµοί στο φυσιολογικό ήπαρ (%) 1 Μη-ηπατοκύτταρα Ηπατοκύτταρα Λεµφοκύτταρα Κύτταρα Ενδοθηλιακά Αστεροειδή Κύτταρα Kupffer κύτταρα κύτταρα χοληφόρων 25 ~ NK NKT T B (2)* (13)* (75)* (10)* αβ γδ (97) (3) *=% στο περιφερικό αίµα 19

26 Σχήµα 2. Κατανοµή κυτταρικών υποπληθυσµών στο ηπατικό παρέγχυµα 1 ΗΠΑΤΙΚΟ ΠΑΡΕΓΧΥΜΑ Ενδοθηλιακό κύτταρο Κύτταρο Kupffer NKT κύτταρο (Pit ΚΟΛΠΟΕΙ ΕΣ ΝΚ κύτταρο ΧΩΡΟΣ DISSE Κολλαγόνο Αστεροειδές κύτταρο ΗΠΑΤΟΚΥΤΤΑΡΑ ΧΟΛΗΦΟΡΑ 20

27 Χρόνια Ηπατίτιδα C Η ηπατίτιδα C αποτελεί σήµερα την κυριότερη αιτία χρόνιας ηπατικής νόσου και την πιο συχνή ένδειξη µεταµόσχευσης του ήπατος. Yπολογίζεται ότι περισσότερο από άνθρωποι έχουν µολυνθεί µε τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) 19. Παρά το γεγονός ότι οι ασθενείς αυτοί παραµένουν ασυµπτωµατικοί για πολλά ίσως χρόνια, η λοίµωξη µε τον HCV ευθύνεται για τη χρόνια ηπατική νόσο, η οποία κυµαίνεται από την χρόνια ηπατίτιδα, την κίρρωση του ήπατος έως τον ηπατοκυτταρικό καρκίνο (ΗΚΚ). Ιδιαίτερα όσον αφορά στην αύξηση του ΗΚΚ παγκόσµια στην παθογένεση του οποίου εµπλέκεται ο HCV, η HCV λοίµωξη, στις περισσότερες περιπτώσεις, έχει επέλθει πριν από δεκαετίες 19,20. H ηπατίτιδα C µεταδίδεται µετά από επαφή µε µολυσµένο αίµα ή προϊόντα αίµατος. Σήµερα ο κυριότερος τρόπος µετάδοσης είναι η ενδοφλέβια χρήση ναρκωτικών ουσιών. Αλλοι δυνητικοί τρόποι µετάδοσης είναι η επαγγελµατική έκθεση, η σεξουαλική µετάδοση, η ενδορινική χρήση κοκαΐνης, το τατουάζ, το τρύπηµα του σώµατος και η µετάδοση από τη µητέρα στο παιδί. Ο κίνδυνος της µετάδοσης µέσω των προϊόντων αίµατος ή τη µεταµόσχευση οργάνων, ουσιαστικά ελαχιστοποιήθηκε µετά τη δυνατότητα ανίχνευσης των antihcv αντισωµάτων στα µέσα του Σήµερα τα υψηλότερα ποσοστά HCV λοίµωξης (70-90%) αναφέρονται σε ΕΦ χρήστες ναρκωτικών ουσιών και σε ασθενείς µε αιµορροφιλία οι οποίοι ελάµβαναν παράγοντες πήξεως πριν από το ,21. 21

28 Φυσική ιστορία της HCV λοίµωξης Η µελέτη της φυσικής ιστορίας της HCV λοίµωξης παρουσιάζει ιδιαίτερα προβλήµατα διότι: α) ο ακριβής χρόνος µόλυνσης είναι δύσκολο να καθορισθεί εφόσον στις περισσότερες περιπτώσεις η οδός µετάδοσης είναι άγνωστη, παρά µόνον στις περιπτώσεις αναφερόµενης µετάγγισης αίµατος πριν από το 1992 ή χρόνου έναρξης χρήσης ενδοφλέβιων ναρκωτικών ουσιών β) ακόµη και όταν οι HCV φορείς παρουσιάσουν χρόνια νόσο σπάνια προσέρχονται στο νοσοκοµείο διότι είναι συνήθως ασυµπτωµατικοί και γ) η εξέλιξη της νόσου σε κίρρωση ή ΗΚΚ επέρχεται πολλά χρόνια µετά την HCV λοίµωξη. Η διερεύνηση της φυσικής ιστορίας της HCV λοίµωξης µελετήθηκε σε πολλές µελέτες οι οποίες: α) µελέτησαν ασθενείς οι οποίοι είχαν εκτεθεί σε µετάγγιση αίµατος ή προϊόντα αίµατος και είχαν γνωστή HCV λοίµωξη από χρόνια, β) προσδιόρισαν τον ρυθµό εξέλιξης προς κίρρωση σε βιοψίες ασθενών κατά τη διάγνωση της νόσου και προσδιόρισαν τη διάρκεια της νόσου και γ) µελέτησαν την εξέλιξη προς ίνωση σε διαδοχικές βιοψίες ήπατος. Τελικά προέκυψε το παρακάτω µοντέλο εξέλιξης της HCV λοίµωξης 22 (Πίνακας 1) : Οξεία ηπατίτιδα C Αυτοπεριορισθείσα Χρόνια HCV λοίµωξη 15% 85% Σταθερή Κίρρωση 80% (85%) 20% (17%) Βραδεία Εξέλιξη ΗΚΚ Ηπατική ανεπάρκεια 75% 25% (13%) (4%) 22

29 * Τα ποσοστά στην παρένθεση αφορούν το σύνολο των ασθενών µετά την ΗCV λοίµωξη. Από τον πίνακα αυτό διαπιστώνεται ότι η εξέλιξη της χρόνιας ηπατίτιδας C σε κίρρωση αφορά µόνον σε ένα ποσοστό 20% των ασθενών και επέρχεται µέσα σε 2 δεκαετίες και µόνον ένα ποσοστό 4% από αυτούς θα αναπτύξουν ηπατική νόσο τελικού σταδίου. Εντούτοις, παρά το γεγονός ότι τα νούµερα αυτά φαίνονται µικρά, αν αναχθούν ως προς το σύνολο των ασθενών µε χρόνια HCV λοίµωξη, ο αριθµός των ασθενών µε κίρρωση ήπατος και ανάγκης µεταµόσχευσης ήπατος τελικά είναι ιδιαίτερα σηµαντικά υψηλός. Οξεία λοίµωξη. Η οξεία νόσος παρουσιάζει παρόµοια κλινικά και βιοχηµικά ευρήµατα µε τις άλλες µορφές οξείας ηπατίτιδας. H επώαση µετά την έκθεση στον ιό αναφέρεται ότι κυµαίνεται από 2-26 εβδοµάδες, µε συχνότερο χρόνο 6-12 εβδοµάδες. Μετά την αρχική έκθεση, το HCVRNA ανιχνεύεται στον ορό µεταξύ 1-3 εβδοµάδες ή σε λίγες µέρες. Στην πλειονότητα των ασθενών η νόσος είναι ασυµπτωµατική και ανικτερική (65-75%) ή εµφανίζει άτυπα συµπτώµατα. Στην συµπτωµατική µορφή, τα συµπτώµατα συνήθως υποχωρούν µέσα σε 2-12 εβδοµάδες. Η µετάπτωση σε οξεία κεραυνοβόλο ηπατίτιδα θεωρείται εξαιρετικά σπάνια (<1%). Τα αnti HCV ανιχνεύονται στο 90% των ασθενών, 3 µήνες µετά την εµφάνιση της οξείας νόσου. Η HCV λοίµωξη είναι αυτοπεριοριζόµενη και ιάσιµη µόνο στο 15-20% των περιπτώσεων όπου και εξαφανίζεται το HCVRNA από τον ορό και οι τιµές των αµινοτρανσφερασών επανέρχονται σε φυσιολογικά επίπεδα. Παρόλα αυτά σήµερα θεωρείται ότι η αυτοπεριοζόµενη οξεία ηπατίτιδα δεν είναι τόσο σπάνια και είναι δυνατόν να παρατηρηθεί στο 30-50% των περιπτώσεων οξείας συµπτωµατικής ή και ασυµπτωµατικής ηπατίτιδας C, η οποία όµως δεν σχετίζεται µε λοίµωξη µετά µετάγγιση

30 Χρόνια ηπατίτιδα Μετά την οξεία νόσο, ο HCV παραµένει σε περίπου 80-85% των περιπτώσεων και η συχνότερη πορεία της νόσου είναι προϊούσα, µε αυξηµένες τιµές τρανσαµινασών ή κατά διαστήµατα φυσιολογικές τιµές ή και φυσιολογικές τιµές τρανσαµινασών (1/3 των ασθενών) για πολλούς µήνες ή και χρόνια. Οι ασθενείς αυτοί εµφανίζουν εµµένουσα ιαιµία, αν και είναι δυνατόν παροδικά να µην ανιχνεύεται ο ιός. Οι ιστολογικές αλλοιώσεις κατά την εµµένουσα λοίµωξη µπορεί να είναι από ελάχιστες εως µέτριες. Η µετάπτωση σε χρονιότητα της οξείας ηπατίτιδας C σε τόσο υψηλή αναλογία αποτελεί ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της νόσου που την καθιστούν ως λοίµωξη, ιδιαίτερα προβληµατική. Οσον αφορά τους παράγοντες κινδύνου εξέλιξης της χρόνιας ηπατικής νόσου, φαίνεται ότι στην εξέλιξη της νόσου οι παράγοντες που σχετίζονται µε τον ΗCV (ιικό φορτίο, γονότυπος, σχεδόν είδη/quasi-species) δε διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο σε αντίθεση µε παράγοντες του ξενιστή όπως: η ηλικία >40 κατά την µόλυνση, το αλκοόλ, οι αυξηµένες ALT, η βαριά φλεγµονώδης αντίδραση στην ηπατική βιοψία, η ηπατική στεάτωση και η συν-λοίµωξη µε τους HIV ή HBV 24,25. Στους περισσότερους ασθενείς, η χρόνια µορφή της νόσου είναι ασυµπτωµατική µε την κόπωση να αποτελεί το συχνότερο σύµπτωµα και η εξέλιξη της βραδεία. Επιπλέον, οι ασυµπτωµατικοί ασθενείς µε φυσιολογικές τρανσαµινάσες και HCVRNA (+) για µεγάλα χρονικά διαστήµατα, εµφανίζουν ιδιαίτερα προβληµατική πρόγνωση, καθόσον διαπιστώθηκε ότι στο 90% των περιπτώσεων αυτών η ιστολογία του ηπατικού παρεγχύµατος αποκαλύπτει βαρειές αλλοιώσεις 26, οι οποίες σχετίζονται µε το ιικό φορτίο. Αντίθετα στους ασθενείς µε σταθερά φυσιολογικές αµινοτρανσφεράσες, η πορεία της νόσου είναι ήπια, και οι ιστολογικές αλλοιώσεις σπάνιες. H ανάλυση µεγάλου αριθµού ασθενών στους οποίους ο χρόνος λοίµωξης µπορούσε να καθορισθεί και συγχρόνως ήταν δυνατόν 24

31 να προσδιοριθεί η ετήσια εξέλιξη της ηπατικής ίνωσης έδειξε ότι στο 1/3 των ασθενών η εξέλιξη της χρόνιας νόσου ήταν ταχεία (χρόνια ηπατίτιδα κίρρωση < 20 χρόνια, στο 1/3 ήταν µέση (20-50 χρόνια) και στο 1/3 ήταν βραδεία 27. Κίρρωση Η κίρρωση αποτελεί φυσική εξέλιξη της χρόνιας ηπατίτιδας στο περίπου 25% των ασθενών και το τελικό στάδιο µιας παθολογικής εξεργασίας στην οποία η ίνωση παίζει τον πρωταρχικό ρόλο. Η µετάπτωση αυτή επιτελείται µέσα σε 2 δεκαετίες από την αρχική λοίµωξη. Εντούτοις είναι δυνατόν η µετάπτωση αυτή να είναι ραγδαία. Η εξέλιξη της χρόνιας ηπατίτιδας προς κίρρωση φαίνεται ότι ακολουθεί τον εξής δρόµο: η ηπατοκυτταρική νέκρωση και η φλεγµονή οδηγούν στην απελευθέρωση κυτταροκινών, πρωτεασών και οξειδωτικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές πυροδοτούν τη µετατροπή των λιποκυττάρων (κύτταρα Ito) σε κύτταρα τύπου µυοϊνοβλαστών τα οποία οδηγούν στην παραγωγή και εναπόθεση κολλαγόνων ινών. Μεσολαβητής της σύνθεσης του κολλαγόνου από τα κύτταρα αυτά είναι ο TGF-β ο οποίος παράγεται από τα κύτταρα Kupffer και τα φλεγµονώδη κύτταρα που διηθούν τον ηπατικό ιστό και δευτεροπαθώς από τα ενεργοποιηµένα λιποκύτταρα. Οι µυοΐνοβλάστες προκαλούν σύσπαση του ιστού που τελικά οδηγεί στην ίνωση 28. H εξέλιξη σε κίρρωση επηρεάζει την πρόγνωση της νόσου διότι η κίρρωση αποτελεί τον ισχυρότερο παράγοντα µη απάντησης στη θεραπεία. Η έκφραση του mrna του υποδοχέα της ιντερφερόνης ελαττώνεται και η ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώµατος είναι σπάνια απουσία κίρρωσης 28. Οι βασικές επιπλοκές της κίρρωσης του ήπατος, οι οποίες και συµβάλλουν στην αυξηµένη θνητότητα και θνησιµότητα περιλαµβάνουν την κιρσορραγία, τον ασκίτη και την ηπατική εγκεφαλοπάθεια. Αναφέρεται ότι ο χρόνος επιβίωσης σε ασθενείς µε αντιρροπούµενη κίρρωση ανέρχεται σε 10 έτη ενώ µετά την εµφάνιση οποιασδήποτε επιπλοκής κατά τη µετάπτωση 25

32 στη µη αντιρροπούµενη κίρρωση, κυµαίνεται σε 5 έτη σε ποσοστό 50% των ασθενών και 10 έτη σε 30%. Το ποσοστό θνητότητας στους ασθενείς µε µη αντιρροπούµενη κίρρωση, ανέρχεται σε 3-5% ανά έτος. Οσον αφορά στην ανάπτυξη ΗΚΚ, η συχνότητα κυµαίνεται σε 5-10%/έτος. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η χρησιµοποίηση του µοντέλου Markov στη µελέτη της φυσικής ιστορίας της HCV λοίµωξης. Στο µοντέλο αυτό µελετώνται οι φάσεις της νόσου σε διάφορες οµάδες ασθενών (ασυµπτωµατικός φορέας, χρόνια ηπατίτιδα, κίρρωση, ΗΚΚ) και ενσωµατώνονται σε ένα σύστηµα µεταβατικής πιθανότητας µετάπτωσης από το ένα στάδιο στο άλλο κατά τη διάρκεια ενός κύκλου (µέσα σε ένα χρόνο συνήθως). Στη συνέχεια µε το µοντέλο αυτό προσδιορίζεται η πιθανή εξέλιξη της HCV λοίµωξης από τον ασυµπτωµατικό φορέα στο ΗΚΚ µέσα στα επόµενα χρόνια 29. Ιός της ηπατίτιδας C (HCV) 30,31,32 Ο HCV είναι ένας θετικός µονής έλικας RNA ιός και αποτελεί το µοναδικό µέλος του Hepacivirus της οικογένειας Flaviviridae. Το γονιδίωµα του HCV αποτελείται από µονόκλωνο RNA θετικής κατεύθυνσης, έχει µήκος 9500 νουκλεοτιδικών βάσεων µε ένα και µοναδικό πλαίσιο ανάγνωσης. Του πλαισίου αυτού προηγούνται στο 5 άκρο και έπονται στο 3 άκρο αριθµός νουκλεοτιδίων που συνιστούν τις µη κωδικογραφούσες περιοχές (UTR-nontranslated regions) (Σχήµα 3). To πλαίσιο ανάγνωσης κωδικογραφεί µια πρωτεΐνη µήκους 3010 αµινοξέων, η οποία µετά τη µετάφρασή της διαιρείται στις δοµικές πρωτεΐνες του ιού. Η δοµική περιοχή κωδικογραφεί την πρωτεΐνη του πυρηνοκαψιδίου (p22) και τις 2 γλυκοπρωτεΐνες του περιβλήµατος Ε1 (gp35) και Ε2/ΝS1 (gp72). Οι µη δοµικές πρωτεΐνες κωδικογράφουν τις ΝS2, NS3, NS4 και NS5. Η NS3 έχει ιδιότητες πρωτεΐνάσης µε ρόλο την επεξεργασία της πολυπρωτεΐνης καθώς και ελικάσης σχετιζόµενης µε τον 26

33 πολλαπλασιασµό του ιού. Η ΝS5 λειτουργεί ως RNA πολυµεράση. Χαρακτηριστικό όλων των ιών, οι οποίοι, όπως ο HCV, πολλαπλασιάζονται µέσω µιας RNA-εξαρτώµενης RNA πολυµεράσης, είναι το σχετικό υψηλό ποσοστό εµφάνισης αυτόµατων µεταλλάξεων µε αποτέλεσµα να επικρατεί µια γενετική ετερογένεια. ηλαδή σε κάθε στιγµή, ο ιός που υπάρχει σε έναν ασθενή αποτελείται από έναν πληθυσµό σχεδόν ιών (quasispecies). Η ικανότητα του ιού να µεταλλάσσεται σε ταχύ ρυθµό έχει ως αποτέλεσµα ο ιός να επιβιώνει σε κάθε πίεση προερχόµενη είτε από την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή είτε από τη θεραπευτική παρέµβαση. Η προκύπτουσα ετερογένεια αφορά ιδιαίτερα ορισµένες περιοχές του γονιδιώµατος όπως η υπερµεταβλητή περιοχή (HVR) της E2 πρωτεΐνης. Πολλαπλασιασµός του HCV Η είσοδος του ιού στο κύτταρα επιτυγχάνεται µετά τη σύνδεσή του σε διάφορα µόρια που σχηµατίζουν τους υποδοχείς στην επιφάνεια του κυττάρου για τον ιό : το CD81 µόριο, τον υποδοχέα Β τύπου 1, το διακυττάριο µόριο προσκόλλησης 3, µία ιντεγκρίνη (DC-SIGN) των δενδριτικών κυττάρων, το διακυττάριο µόριο προσκόλλησης 3 (ΙCAM-3) του ήπατος/λεµφαδένων, τον υποδοχέα της λιποπρωτεΐνης (LDR-R) ή τον υποδοχέα της ασιαλογλυκοπρωτεΐνης (ASGR-R). Η γλυκοπρωτεΐνη Ε2 του ιού θεωρείται ότι είναι υπεύθυνη για την αρχική σύνδεση του ιού στο κύτταρο ξενιστή. Μετά την ενδοκύττωση, ο HCV απελευθερώνεται από το νουκλεοκαψίδιο µέσα στο κυτταρόπλασµα και το γονιαδικό RNA µεταγράφεται άµεσα και µαζί µε το RNA που έχει συνδεθεί, συνιστούν το αγγελιοφόρο RNA για τη σύνθεση της πολυπρωτεΐνης. Κατά την ΗCV λοίµωξη σχηµατίζεται ένα σύµπλεγµα πολλαπλασιασµού του ιού στο οποίο συµµετέχουν ιικές πρωτεΐνες, κυτταρικά στοιχεία και νεοδηµιουργηθέντα RNA γονιδιώµατα. 27

34 Τελικά, ο κύκλος πολλαπλασιασµού του HCV θα µπορούσε να συνοψισθεί ως εξής (Σχήµα 4) : α) διείσδυση του ιού στο κυττάρο ξενιστή και απελευθέρωση γονιδιακού RNA θετικής κατεύθυνσης (+RNA) από το ιικό σωµατίδιο στο κυτταρόπλασµα. β) µεταγραφή του RNA, επεξεργασία της πολυπρωτεΐνης και σχηµατισµός συµπλέγµατος ρεπλικάσης που σχετίζεται µε τις κυτταρικές µεµβράνες γ) χρησιµοποίηση του +RNA για τη σύνθεση του γονιδιακού RNA αρνητικής κατεύθυνσης (-) δ) παραγωγή νέων +RNA µορίων τα οποία µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την σύνθεση RNA τα οποία χρησιµεύουν για την έκφραση πολυπρωτεΐνης ή το πακετάρισµα των προγονιδιακών ιοσωµατίων ε) απελευθέρωση του ιού από το µολυσµένο κύτταρο Προς το παρόν δεν είναι δυνατόν να µελετηθεί ακριβώς ο κύκλος πολλαπλασιασµού του HCV σε συστήµατα κυτταροκαλλιεργειών έτσι ώστε να διευκρινισθούν οι αντιδράσεις ιού-ξενιστή κατά τις αρχικές φάσεις της HCV λοίµωξης. Η γνώση αυτών των αντιδράσεων θα βοηθούσε σηµαντικά στην ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων οι οποίες και θα διέκοπταν τις οδούς πολλαπλασιασµού του HCV πριν από τη σύνθεση της πολυπρωτεΐνης. Γονότυποι του HCV Με βάση την ποικιλοµορφία της νουκλεοτιδικής ακολουθίας του HCV, διακρίνονται 6 γονότυποι του ιού (1-6) και >50 υπότυποι. Ο HCV γονότυπος και υπότυπος δεν µεταβάλλεται κατά την πορεία της HCV λοίµωξης στον ίδιο ασθενή 33,34. Επιπλέον οι γονότυποι δεν σχετίζονται µε την κλινική πορεία ή τις επιπλοκές της λοίµωξης. Εντούτοις, καθορίζουν άµεσα την απάντηση στη θεραπεία και τη διάρκεια της θεραπείας. 28

35 Η διαφορά στον επιπολασµό των διαφόρων γονοτύπων του HCV σχετίζεται µε τη γεωγραφική κατανοµή της νόσου και την πηγή λοίµωξης. ιάγνωση της HCV λοίµωξης Στην κλινική πράξη, η πρώτη δοκιµασία που χρησιµοποιείται για τη διάγνωση της HCV λοίµωξης είναι η αναζήτηση των antihcv αντισωµάτων (τεχνική EIA). Στη συνέχεια, η τεκµηρίωση της ιαιµίας επιτυγχάνεται µε την ποιοτική ή ποσοτική µέτρηση των επιπέδων του HCVRNA στον ορό των ασθενών. Η ποιοτική µέτρηση του HCVRNA χρησιµεύει για την ανίχνευση της ιαιµίας και ακολουθεί άµεσα την ανίχνευση των θετικών antihcv αντισωµάτων. Σε περίπτωση που το HCVRNA είναι αρνητικό και παραµένει αρνητικό µετά από επανειλληµένους ελέγχους κατά τακτά χρονικά διαστήµατα σε έναν ασθενή µε antihcv (+), υποδηλώνει αυτοπεριορισθείσα HCV λοίµωξη. Η ποσοτική ανίχνευση του HCVRNA απαιτείται για την έναρξη, τροποποίηση της θεραπείας, ως προγνωστικός παράγοντας απάντησης στη θεραπεία ή και διακοπής της σε περίπτωση κατά την οποία ο ασθενής δεν απαντάει στη θεραπεία. Θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας C Στόχος θεραπείας. Ο αντικειµενικός στόχος της θεραπείας είναι η εκρίζωση του ιού και κατά συνέπεια η πρόληψη των δυνητικών επιπλοκών της χρόνιας ηπατίτιδας C. Η αποτελεσµατικότητα της θεραπείας διαπιστώνεται µε τη µέτρηση του ιικού φορτίου του HCV, ή την µη ανίχνευσή του. Εκρίζωση της νόσου και επίτευξη µακράς διάρκειας ιολογικής απάντησης (sustained virologic response, SVR) χαρακτηρίζεται ως η µη ανίχνευση του HCVRNA κατά το τέλος της θεραπείας και 6 µήνες µετά τη διακοπή της. 29

36 Η πιθανότητα επίτευξης SVR είναι δυνατόν να προσδιορισθεί στους ασθενείς µε λοίµωξη µε τον γονότυπο 1, µε τον προσδιορισµό της πρώιµης ιολογικής ανταπόκρισης, δηλαδή ελάττωσης του ιικού φορτίου κατά 2 log ή µη ανιχνεύσιµο HCVRNA, 12 εβδοµάδες µετά την έναρξη της θεραπείας (Πίνακας 2) 35. Στους ασθενείς που υποτροπιάζουν µετά το τέλος της θεραπείας, το HCVRNA µπορεί να είναι µη ανιχνεύσιµο κατά τη διάρκεια της θεραπείας, αλλά ανιχνεύεται εκ νέου στον ορό των ασθενών µετά τη διακοπή της θεραπείας. Στους ασθενείς που δεν απαντούν στη θεραπεία, τα επίπεδα του HCVRNA παραµένουν θετικά καθ όλη τη διάρκειά της. Ποιοι ασθενείς θα πρέπει να υποβάλλονται σε θεραπεία Η απόφαση έναρξης θεραπείας σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C θα βασισθεί στην βαρύτητα της νόσου, την πιθανότητα απάντησης στη θεραπεία και στη θέληση του ασθενούς να υποβληθεί και να ανεχθεί τη θεραπεία 14. Ετσι, στην κλινική πράξη, φαίνεται ότι η απόφαση της έναρξης θεραπείας είναι κάθε άλλο παρά απλή διότι: α) η HCV λοίµωξη είναι πολλές φορές αδιάγνωστη εφόσον οι περισσότεροι ασθενείς είναι ασυµπτωµατικοί ακόµη και όταν έχει ήδη εγκατασταθεί η κίρρωση β)το ποσοστό µετάπτωσης στην κίρρωση είναι µικρό 22 γ) ορισµένοι ασθενείς δεν µπορούν να ανεχθούν τη θεραπεία λόγω κατάθλιψης, αναιµίας, θροµβοπενίας ή ενεργού χρήσης ουσιών ή αλκοόλ. Εντούτοις, η θεραπεία θα πρέπει να συνιστάται α) σε ασθενείς µε βαριά νόσο όπως διαπιστώνεται µε τη βιοψία του ήπατος, β) σε ασθενείς µε συν-λοίµωξη µε τους ιούς HIV και HBV, γ) σε ασθενείς µε µεγαλύτερη πιθανότητα απάντησης στη θεραπεία (HCV λοίµωξη µε τους γονότυπους µη 1). Παράλληλα, σήµερα υπάρχουν ορισµένες αντενδείξεις για τη χορήγηση της συνδυασµένης θεραπείας πεγκυλιωµένης ιντερφερόνης και ριµπαβιρίνης όπως ασθενείς : 1) µε βαριά κατάθλιψη 2) µε µεταµόσχευση νεφρού, καρδιάς ή πνευµόνων 30

37 3) µε αυτοάνοσα νοσήµατα, τα οποία επιβαρύνονται µε τη χορήγηση ιντερφερόνης 4) µε βαριά υπέρταση, καρδιακή ανεπάρκεια, στεφανιαία νόσο, µη ρυθµιζόµενο σακχαρώδη διαβήτη, αποφρακτική νόσο των πνευµόνων 5) που δεν δέχονται να πάρουν µέτρα αντισύλληψης 6) που είναι <3 χρόνων 7) που έχουν γνωστή υπερευαισθησία στα φάρµακα που χρησιµοποιούνται για την HCV λοίµωξη 8) που είναι ενεργοί χρήστες ΕΦ ουσιών, αν και σε τελευταίες µελέτες δοκιµάζεται η θεραπεία στην οµάδα αυτή των ασθενών µε καλά αποτελέσµατα 9) που δεν πρόκειται να συµµορφωθούν µε τη θεραπεία 10) µε αιµοσφαιρινοπάθειες οι οποίοι συνήθως υποβάλλονται σε µονοθεραπεία µε ιντερφερόνη. Παράγοντες που επηρεάζουν την απάντηση στη θεραπεία Παρά τη βελτίωση στη θεραπευτική προσέγγιση της χρόνιας ηπατίτιδας C τα τελευταία χρόνια, εντούτοις υπάρχουν ορισµένοι πληθυσµοί ασθενών οι οποίοι δεν απαντούν καλά, γεγονός που σχετίζεται αφενός µε τα χαρακτηριστικά του ίδιου του ιού όπως : α) λοίµωξη µε τους γονότυπους 1 και 4 β) υψηλή ιαιµία πριν από την έναρξη της θεραπείας γ) αυξηµένη ετερογένεια των σχεδόνιών(quasi-species) δ) µεταλλάξεις στην NS5A πρωτεΐνη, ή αφετέρου µε παράγοντες που σχετίζονται µε τον ασθενή : 1) ασθενείς που δεν είχαν απαντήσει σε προηγούµενη θεραπεία µε ιντερφερόνη ή ιντερφερόνη απλή και ριµπαβιρίνη 2) ασθενείς που ανήκουν σε ιδιαίτερες εθνότητες (ΑφροΑµερικανοί) 3) ασθενείς που είναι µεγαλύτερης ηλικίας 4) υπέρβαροι ασθενείς 5) ασθενείς µε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια 6) ασθενείς µε µη αντιρροπούµενη κίρρωση 7) ασθενείς οι οποίοι δεν συµµορφώνονται στο θεραπευτικό σχήµα 37,38,39. Αντι-ιική θεραπεία σήµερα Παρά το γεγονός ότι δοκιµάσθηκαν διάφορα φάρµακα στη θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας C, η µόνη δραστική θεραπεία βασίζεται στη χορήγηση σχηµάτων που συµπεριλαµβάνουν την ιντερφερόνη α. 31

38 Η ιντερφερόνη-α2β ήταν η πρώτη που χρησιµοποιήθηκε ως µονοθεραπεία της µη-α µη-β ηπατίτιδας το 1986, τρία χρόνια πριν αποµονωθεί ο HCV 40. Τα ποσοστά ιολογικής µακράς διάρκειας απάντησης (SVR) ανέρχονταν στο 10-20% µε υψηλά ποσοστά υποτροπής. Το 1998 διαπιστώθηκε ότι η συνδυασµένη θεραπεία ιντερφερόνης-α µε ριµπαβιρίνη διπλασίασε τα ποσοστά SVR 41. Εντούτοις, η σηµαντική πρόοδος στη θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας C σηµειώθηκε µετά τη χρησιµοποίηση της πεγκυλιωµένης ιντερφερόνης. Η προσθήκη του µορίου της πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG) στο µόριο της ιντερφερόνης α διαπιστώθηκε ότι αυξάνει τη βιολογική δράση της ιντερφερόνης και τον χρόνο ηµίσειας ζωής, χωρίς να αυξάνονται οι παρενέργειες 42. Ετσι, σήµερα η συνδυασµένη θεραπεία πεγκυλιωµένης ιντερφερόνης α2β ή α2α µαζί µε ριµπαβιρίνη αποτελεί την κλασική πλέον θεραπευτική αντιµετώπιση της χρόνιας ηπατίτιδας C 34,35,39. Οπως έδειξαν δύο µεγάλες πολυκεντρικές µελέτες α)µε πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη-α2β σε συνδυασµό µε ριµπαβιρίνη στην οποία η δόση της PEGIFΝ καθορίσθηκε σύµφωνα µε το βάρος του ασθενή (1.5µg/Kg) 35 και β) µε πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη-α2α σε σταθερή δόση των 180µg µαζί µε ριµπαβιρίνη 1000 ή 1200mg ανάλογα µε το βάρος 43, διαπιστώθηκε επίτευξη SVR για τους ασθενείς µε γονότυπο 1 που κυµαίνονταν από 42-56%, ενώ στους ασθενείς µε γονότυπο 2 ή 3 ανέρχονταν στο 75-84%. Στους ασθενείς µε γονότυπο 1 διαπιστώθηκε ότι το αρχικό ιικό φορτίο έπαιζε σηµαντικό ρόλο στην επίτευξη SVR. Οι ασθενείς µε χαµηλό ιικό φορτίο και γονότυπο 1 παρουσίαζαν SVR σε ποσοστό 52-56%. Σε µια τρίτη µεγάλη µελέτη 44 η ριµπαβιρίνη χορηγούνταν σε δόση 800mg ή σε υψηλότερες δόσεις ανάλογα µε το βάρος του ασθενούς. Στη µελέτη αυτή διαπιστώθηκε και στη συνέχεια καθιερώθηκε, στους ασθενείς µε γονότυπο 1 η διάρκεια της 32

39 θεραπείας να είναι 48 εβδοµάδες ενώ στους ασθενείς µε γονότυπο 2 ή 3 να είναι 24 εβδοµάδες 45,46. Ο θεραπευτικός αλγόριθµος που προτείνεται για τους ασθενείς µε γονότυπο 1 και ασθενείς µε γονότυπο 2 3 φαίνεται στους πίνακες 3 και 4. Θεραπεία σε ειδικές οµάδες ασθενών Α.Οι ασθενείς που δεν απήντησαν στη συνδυασµένη θεραπεία µε απλή IFN-α και ριµπαβιρίνη ή υποτροπίασαν µετά το τέλος της θεραπείας, είναι δυνατόν να ωφεληθούν από την χορήγηση συνδυασµένης θεραπείας µε πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη και ριµπαβιρίνη. Το θέµα αυτό µελετήθηκε σε µεγάλες πολυκεντρικές µελέτες τα αποτελέσµατα των οποίων έδειξαν ότι µετά τη διακοπή της θεραπείας παρατηρείται υποτροπή της ιαιµίας σε υψηλό ποσοστό των ασθενών 47. Επιπλέον, έγινε µια προσπάθεια εξατοµίκευσης της θεραπείας σε ασθενείς υπό θεραπεία ανάλογα µε την ιολογική απάντηση στις 6 εβδοµάδες (ταχεία, βραδεία, επίπεδη ή µη απάντηση) µε σκοπό τη βελτίωση της SVR. Η θεραπεία εξατοµίκευσης περιελάµβανε: µονοθεραπεία µε PEGIFN (48 εβδοµάδες), µικρότερης διάρκειας συνδυασµένη θεραπεία (24 εβδοµάδες), τριπλή θεραπεία µε ισταµίνη (48 εβδοµάδες) ή 72 εβδοµάδες συνδυασµένη θεραπεία. Εντούτοις, τα αποτελέσµατα δεν δικαίωσαν το αρχικό σκεπτικό της µελέτης 48. Β. Ασθενείς µε φυσιολογικές τρανσαµινάσες Τα τελευταία χρόνια υπήρξε µια σοβαρή διαφωνία όσον αφορά στη θεραπεία ή µη των ασθενών µε φυσιολογικές ALT και σταθερά θετικό HCVRNA. Οπως είναι γνωστό οι τιµές των ALT ποικίλουν ανάλογα µε το φύλο, τη µάζα σώµατος, την κατανάλωση αλκοόλ, τα φάρµακα κλπ. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι : α) είναι δυνατόν το ήπαρ να παρουσιάζει σοβαρή ιστολογική βλάβη σε ένα ποσοστό 5-30%, των ασθενών αυτών β) οι ασθενείς αυτοί είναι δυνατόν να 33

40 εµφανίσουν εξέλιξη της νόσου µε αύξηση των ALT κατά την µακρόχρονη παρακολούθηση. Για τους λόγους αυτούς, εγκρίθηκε η θεραπεία στην οµάδα αυτή των ασθενών µετά από αξιολόγηση και της ιστολογικής βλάβης του ήπατος 49,50. Θεραπεία της HCV κίρρωσης Η θεραπεία των ασθενών µε αντιρροπούµενη κίρρωση παρουσιάζει αρκετά προβλήµατα διότι οι ασθενείς αυτοί είναι ήδη θροµβοπενικοί ή έχουν λευκοπενία, οπότε χρειάζεται να αντιµετωπισθούν µε ελαττωµένες δόσεις φαρµάκων και τα ποσοστά επίτευξης SVR είναι πολύ µικρότερα από τους ασθενείς χωρίς κίρρωση 51. Στην οµάδα αυτή των ασθενών εκτός από την επίτευξη SVR, η θεραπεία στοχεύει στην επιβράδυνση της ιστολογικής εξέλιξης. Σε µια ανάλυση που αφορούσε 3000 ασθενείς αναφέρεται ουσιαστική ελάττωση της εξέλιξης της ίνωσης σε ασθενείς υπό θεραπεία και µάλιστα αναφέρεται υποστροφή της κίρρωσης σε ποσοστό 49% των ασθενών παρόλο που µόνον το 1/3 αυτών των ασθενών είχαν απαντήσει στη θεραπεία και παρουσίαζαν SVR 52. Εντούτοις, δεν υπάρχουν πολλές µελέτες που να τεκµηριώνουν τα παραπάνω και οι πληροφορίες είναι ελλειπείς, προέρχονται από µεταανάλυση µεγάλων κλινικών δοκιµών, στις οποίες συµµετείχαν ασθενείς µε βαριά ίνωση και «αρχόµενη» κίρρωση, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε συνδυασµένη θεραπεία πεγκυλιωµένης ιντεφερόνης και ριµπαβιρίνης 35,43,53. Ενα άλλο βασικό σηµείο είναι η επαναθεραπεία ασθενών µε προχωρηµένου σταδίου ίνωση ή κίρρωση οι οποίοι δεν απήντησαν σε προηγούµενη θεραπεία µε την απλή ιντερφερόνη µε ή χωρίς ριµπαβιρίνη. Τα πρόδροµα ευρήµατα µιας µεγάλης µελέτης (HALT-C) στην οποία οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε επαναθεραπεία µε PEG-IFN-α2α και ριµπαβιρίνη για τουλάχιστον 24 εβδ. και αν το HCVRNA ήταν αρνητικό συνέχισαν για άλλες 24 εβδοµάδες, έδειξαν ότι το ποσοστό SVR 34

41 ήταν 11% στους ασθενείς µε κίρρωση και 23% στους ασθενείς µε βαρειά ίνωση χωρίς κίρρωση. Οσον αφορά στους ασθενείς µε αντιρροπούµενη κίρρωση δεν υπάρχουν δηµοσιευµένες µελέτες συνδυασµένης θεραπείας PEG- IFN και ριµπαβιρίνης. Τα πρόδροµα ευρήµατα µιας µελέτης υπό εξέλιξη στην οποία χορηγήθηκε η PEG-IFN-α2β ως µονοθεραπεία ή σε συνδυασµό µε ριµπαβιρίνη έδειξαν πρώιµη ιολογική ανταπόκριση σε ποσοστό 39% των ασθενών µε µονοθεραπεία και 49% µε συνδυασµένη θεραπεία 51. Τα αποτελέσµατα αυτά είναι αρκετά ελπιδοφόρα εφόσον επιτυγχάνεται καταστολή της ιαιµίας σε περίπου 1/3 των ασθενών µε προχωρηµένη κίρρωση, παρά το υψηλό ποσοστό διακοπής της θεραπείας λόγω µη ανοχής ή λόγω αιµατολογικών διαταραχών. Θεραπεία ασθενών µε µη αντιρροπούµενη κίρρωση Οι ασθενείς µε µη αντιρροπούµενη κίρρωση αποτελούν µια ιδιαίτερα προβληµατική οµάδα ασθενών, εφόσον το πρώτο επεισόδιο µη αντιρρόπησης σηµατοδοτεί 5ετή επιβίωση <50% και η µόνη ριζική και αποτελεσµατική θεραπεία είναι πλέον η µεταµόσχευση ήπατος. Μετά βέβαια την µεταµόσχευση, η υποτροπή της HCV λοίµωξης είναι σχεδόν καθολική, ιδιαίτερα όταν το HCVRNA είναι θετικό αµέσως πριν από τη µεταµόσχευση. Η υποτροπή της νόσου συνήθως επέρχεται ταχέως και αρκετές µελέτες έδειξαν ότι η θεραπεία συνδυασµού IFN-α και ριµπαβιρίνης, ενώ είναι δυνατή, το ποσοστό όµως της SVR είναι χαµηλό και η θεραπεία στην οµάδα αυτή των ασθενών σχετίζεται µε σοβαρές παρενέργειες 54. Οι ασθενείς µε µη αντιρρροπούµενη κίρρωση συνήθως υποβάλλονται σε θεραπεία των επιπλοκών της νόσου, αναρρώνουν από τα οξέα επεισόδια και σταθεροποιούνται τουλάχιστον προσωρινά. Οι ασθενείς αυτοί εκτιµούνται για µεταµόσχευση ήπατος και αποτελούν το 40% των ασθενών που βρίσκονται στη λίστα αναµονής για µεταµόσχευση ήπατος. 35

42 Επιπλέον, αναφέρεται ότι η ανάλυση του MELD Score στις ΗΠΑ σε 90% των ασθενών στη λίστα για µεταµόσχευση ήπατος είναι 18. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι αν οι ασθενείς αυτοί διατηρούν σταθερή ηπατική και νεφρική λειτουργία, όπως εκτιµάται µε τις τιµές της χολερυθρίνης, κρεατινίνης και του χρόνου προθροµβίνης, παραµένουν σταθεροί παρά το οξύ επεισόδιο µη αντιρρόπησης και το MELD Score παραµένει το ίδιο, µε αποτέλεσµα η άµεση επιβίωση να µη µεταβάλλεται 54. Μέχρι πρόσφατα, οι ασθενείς µε µη αντιρροπούµενη κίρρωση δεν υποβάλλονταν σε θεραπεία συνδυασµού ιντερφερόνηςριµπαβιρίνης µε το σκεπτικό ότι µια τέτοια θεραπεία θα είχε ως αποτέλεσµα επιδείνωση της µη αντιρρόπησης. Εντούτοις, τα δεδοµένα που αναπτύχθηκαν παραπάνω δείχνουν ότι οι ασθενείς αυτοί µπορούν να διατηρήσουν σταθερούς εργαστηριακούς δείκτες και η τελευταία συναινετική διάσκεψη που αφορούσε τη µεταµόσχευση ήπατος και την ηπατίτιδα C συνηγορούσε υπέρ της θεραπείας σε ασθενείς µε MELD Score 18 ή λιγότερο 55. Η εµπειρία της θεραπευτικής αντιµετώπισης των ασθενών αυτών είναι µικρή και προτείνονται σχήµατα µε χαµηλή αυξανόµενη δόση του θεραπευτικού σχήµατος 56. Σε µια πιο πρόσφατη µελέτη 57,στην οποία οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία συνδυασµού ιντερφερόνης-ριµπαβιρίνης µε αρχικά χαµηλές δόσεις φαρµάκων σταδιακά αυξανόµενες, αναφέρεται επίτευξη SVR σε ποσοστό 22% των ασθενών. Αξίζει να σηµειωθεί ότι οι µισοί περίπου ασθενείς είχαν 1 ή περισσότερες επιπλοκές πριν από την έναρξη της θεραπείας (κιρσορραγία, ασκίτη, αυτόµατη βακτηριακή περιτονίτιδα ή εγκεφαλοπάθεια) και το µέσο Child Turcott Pugh Score ήταν 7.1±2. Τα ευρήµατα αυτά θεωρούνται πολύ ενθαρρυντικά για έναν επιπλέον λόγο: στους ασθενείς µε SVR δεν παρατηρήθηκε υποτροπή της λοίµωξης µετά τη µεταµόσχευση. Προγνωστικοί παράγοντες επίτευξης SVR ήταν ο γονότυπος µη-1 και η ικανότητα χορήγησης της συνολικής δόσης των φαρµάκων. 36

43 Συνοπτικά θα έλεγε κανείς ότι : α) Τα κέντρα που επιχειρούν τη θεραπεία σε ασθενείς µε µη αντιρροπούµενη κίρρωση θα πρέπει να έχουν πολύ καλή εµπειρία στην αντιµετώπιση της βαριάς ηπατικής νόσου αλλά και της υποτροπής της ηπατίτιδας C στους λήπτες µοσχευµάτων ήπατος β) Οι διαταραχές στις εργαστηριακές εξετάσεις, η εµφάνιση κλινικών συµβαµάτων και το status του ασθενούς όπως υπολογίζεται µε το CTP και MELD Score πριν από την έναρξη της θεραπείας βοηθούν σηµαντικά ως προγνωστικοί παράγοντες της ανοχής στη θεραπεία και της κλινικής εξέλιξης γ) Θα πρέπει να υπάρχει στενή παρακολούθηση των ασθενών κατά τη θεραπεία για την αντιµετώπιση της ουδετεροπενίας, θροµβοπενίας και αναιµίας, για τη χορήγηση αυξητικών παραγόντων, για την τροποποίηση της δόσης των φαρµάκων και τη διάρκεια της και για την ενδεχόµενη υποτροπής της νόσου µετά τη διακοπή της θεραπείας (αναφέρεται υποτροπή στους 1,3 και 6 µήνες)

44 Σχήµα 3. O ιός της ηπατίτιδας C και το γονιδίωµα του HCV Το γονιδίωµα του HCV 5 δοµικές µη δοµικές 3 C E1 E2 p A 4B 5A 5B 38

45 Σχήµα 4. Πολλαπλασιασµός του HCV 5 (+) RNA µεταγγραφή επεξεργασία 3 3 (-) RNA 5 Golgi C E1 E2 p7 C E1 E B αντιγραφάση ενδοπλασµατικό δίκτυο πυρήνας 39

46 Πίνακας Η χρησιµοποίηση της πρώιµης ιολογικής ανταπόκρισης ως δείκτη της απάντησης στη θεραπεία Θεραπεία µε PEG ιντερφερόνη Ελάττωση κατά 2 log ή αρνητικό HCVRNA κατά την 12 εβδοµάδα. Ναι Οχι 65-72% SVR 0-3% SVR 40

47 Πίνακας 3. Προτεινόµενος θεραπευτικός αλγόριθµος σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C και γονότυπο 1 46 Χρόνια ηπατίτιδα C PEG IFN/Ribavirin θεραπεία Ποσοτικό HCVRNA Εβδ. 12 θεραπείας 2-log ελάττωση του HCVRNA Mικρή ή καθόλου µεταβολή HCVRNA HCV RNA Αρνητικό HCV RNA θετικό ιακοπή θεραπείας/συνέχιση για την βελτίωση της ίνωσης Θεραπεία 48 εβδοµάδες Επανάληψη HCVRNA εβδ.24 ΗCVRNA (-) ΗCVRNA (+) Θεραπεία 48 εβδ. ιακοπή θεραπείας 41

48 Πίνακας 4. Θεραπευτικός αλγόριθµος σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C και γονότυπο 2 ή 3 46 PEG IFN ή Standard ιντερφερόνη 800mg/ηµ ριµπαβιρίνη Παρακολούθηση ΗCVRNA στο HCVRNA (+) ή τέλος της θεραπείας (όχι απάντηση) ασθενής σε κλινική µελέτη ή HCV RNA µη ανιχνέυσιµο συνέχιση θεραπείας µε IFN ΗCV RNA στις 24 ΗCVRNA (+) ή εβδ. µετά το τέλος της θεραπείας άλλη θεραπεία HCV RNA (-) SVR 42

49 (59, 60, 61, 62, AΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΙΩΝ 63, 64, 65, 66) ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ-ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΤΩΝ ΙΩΝ Οι ιοί είναι υποχρεωτικά ενδοκυττάριοι µικροοργανισµοί, πολλαπλασιάζονται δηλαδή εντός των κυττάρων, χρησιµοποιώντας συνήθως για τη σύνθεση των νουκλεϊνικών οξέων και των πρωτεϊνών τους, τους γενετικούς µηχανισµούς του ξενιστή. Το µέγεθος τους ποικίλει από 15 έως 300µm. Τα ιικά σωµάτια (virions) αποτελούνται από ένα ή περισσότερα µόρια νουκλεϊνικών οξέων (ssrna, dsdna ή σπανιότερα ssdna), τα οποία περιβάλλονται από πρωτεϊνικό περίβληµα που ονοµάζεται καψίδιο (capsid). Το σύµπλεγµα του νουκλεϊνικού οξέος µε τις πρωτεΐνες (νουκλεοκαψίδιο) φέρεται είτε ελεύθερο είτε εντός λιποπρωτεϊνικού περιβλήµατος (envelope). Μετά την είσοδο του ιού στον οργανισµό, ακολουθούν µία ή περισσότερες φάσεις ιαιµίας (ο ιός βρίσκεται στο αίµα) και στη συνέχεια ο ιός προσβάλλει κάποιο συγκεκριµένο όργανο-στόχο, που διαφέρει ανάλογα µε το είδος του ιού (τροπισµός του ιού).ο τροπισµός αυτός σε ένα βαθµό, εξηγείται από την κατανοµή των ειδικών του ιού υποδοχέων στα διάφορα κύτταρα. H είσοδος του ιού στα κύτταρα του ξενιστή επιτυγχάνεται µέσω της σύνδεσής του µε λειτουργικής σηµασίας µεµβρανικά µόρια (ειδικούς υποδοχείς) των φυσιολογικών κυττάρων. Η σύνδεση µε τους υποδοχείς συνεπάγεται είτε την ενδοκυττάρωση του ιού είτε, στην περίπτωση που υπάρχει περίβληµα, τη σύντηξή του µε την κυτταρική µεµβράνη. Μέσα στο κύτταρο τα λυσοσωµατικά ένζυµα καταστρέφουν τις καψιδικές πρωτεΐνες και αποκαλύπτεται το γονιδίωµα του ιού. Στη συνέχεια, τον πολλαπλασιασµό του γονιδιώµατος ακολουθεί η σύνθεση των πρωτεϊνών για το σχηµατισµό του καψιδίου και η απελευθέρωση του ιικού σωµατιδίου µετά λύση του κυττάρου (ιοί χωρίς έλυτρο), ή µετά από εκβλάστηση από την κυτταρική επιφάνεια (ιοί µε έλυτρο). Η αντιγραφή των ιών είναι δυνατό να 43

50 προκαλέσει άµεση λύση των κυττάρων του ξενιστή, είτε επηρεάζοντας τη σύνθεση και τη λειτουργία των φυσιολογικών πρωτεϊνών, είτε αυξάνοντας τη διαβατότητα των λυσοσωµατικών µεµβρανών και προκαλώντας την απελευθέρωση λυσοσωµατικών ενζύµων στο κυτταρόπλασµα, είτε παραβλάπτοντας τη λειτουργία της κυτταρικής µεµβράνης. Οι ιοί που προκαλούν τέτοιου είδους βλάβες λέγονται κυτταροπαθητικοί. Άλλοι ιοί ενσωµατώνουν το γονιδίωµά τους στο γονιδίωµα του κυττάρου, µε αποτέλεσµα να παράγονται πρωτεΐνες ξένες για τον ξενιστή, η παρουσία των οποίων επάγει ειδική ανοσιακή απάντηση. Οι ιοί αυτοί λέγονται µη κυτταροπαθητικοί και η κυτταρική βλάβη στην περίπτωση αυτή είναι αποτέλεσµα της φυσιολογικής ανοσιακής απάντησης του ξενιστή εναντίον του ιού. Γενικά η ανοσιακή απάντηση έναντι των ιών χαρακτηρίζεται από την πολύπλοκη αλληλοεπίδραση των ιών µε το ανοσιακό σύστηµα, η έκβαση της οποίας θα καθορίσει τελικά και την έκβαση της λοίµωξης αλλά και τις στρατηγικές πρόληψης και θεραπείας. Οι λοιµώξεις από ιούς θα µπορούσαν να διαχωριστούν σε αυτές που η ανοσιακή απάντηση επιτυγχάνει να εξουδετερώσει τον ιό και σε αυτές που ο ιός παραµένει παρά την υπάρχουσα ανοσιακή απάντηση. Στην τελευταία περίπτωση, ο ιός παραµένει είτε υπό τη µορφή λανθάνουσας λοίµωξης, µε ή χωρίς ενδιάµεσα στάδια πολλαπλασιασµού ή υπό τη µορφή χρόνιας νόσου (HIV, HCV). Τα ιικά γονιδιώµατα παραµένουν µέσα στα κύτταρα του ξενιστή, όπου είτε ενσωµατώνονται στο γονιδίωµα του κυττάρου ξενιστή (HIV), ή είναι ανεξάρτητα µέσα στο κύτταρο (HSV). Ακριβώς επειδή οι ιοί παρασιτούν και χρησιµοποιούν τις µεταβολικές οδούς των κυττάρων για τον πολλαπλασιασµό τους, µπορούν άµεσα να µεταβάλλουν την δοµή και λειτουργία του κυττάρου ξενιστή. Ακόµη χρησιµοποιούν διαφόρους µηχανισµούς διαφυγής της ανοσιακής επίθεσης ή µεταβάλλουν την ανοσολογική απάντηση του ξενιστή. 44

51 ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΙΩΝ Τα αρχικά στάδια µιας ιογενούς λοίµωξης θα µπορούσε κανείς να πει ότι είναι ένας αγώνας δρόµου µεταξύ του ιού και του αµυντικού συστήµατος του ξενιστή. Το αποτέλεσµα καθορίζει και την έκβαση της λοίµωξης. Η ανοσιακή απάντηση έναντι των ιών διακρίνεται στη µη ειδική (φυσική) και ειδική (επίκτητη) ανοσιακή απάντηση. Α. Μη ειδικοί µηχανισµοί - Φυσική ανοσία έναντι των ιών 1. Ιντερφερόνες α και β (IFNs) Παράγονται από διάφορα κύτταρα σε απάντηση έναντι των λοιµώξεων από ιούς. Ειδικότερα οι RNA ιοί θεωρούνται ότι προάγουν περισσότερο την παραγωγή των IFNs. Η αντιική δράση των ιντερφερονών επιτυγχάνεται µετά από σύνδεση τους σε ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων (για την IFN-α και β είναι γλυκοπρωτεΐνη που κωδικοποιείται από γονίδιο του χρωµοσώµατος 21). Ο µηχανισµός της αντιικής δράσης τους δεν είναι τελείως τεκµηριωµένος, αλλά φαίνεται ότι αναστέλλουν τη µεταγραφή των ιικών mrna ή και επεµβαίνουν στη διείσδυση των ιών στα κύτταρα, στην καταστροφή του καψιδίου τους και στην εκβλάστηση. Επιπλέον αρκετές µελέτες έδειξαν ότι η δράση τους επιτυγχάνεται µε τους εξής µηχανισµούς: α. Αύξηση της έκφραση των τάξης Ι και ΙΙ ΜΗC µορίων, διευκολύνοντας έτσι την αναγνώριση των ιικών αντιγόνων από το ανοσιακό σύστηµα. β. Ενεργοποίηση κυττάρων που δύνανται να καταστρέψουν τον ιό, όπως µακροφάγων και ΝΚ κυττάρων. γ. Άµεση αναστολή του ιικού πολλαπλασιασµού. Το τελευταίο φαίνεται ότι επιτυγχάνεται µετά από σύνδεση της IFN σε υποδοχείς των γειτονικών κυττάρων προκαλώντας σύνθεση ορισµένων αντιικών πρωτεϊνών από αυτά, όπως είναι η πρωτεϊνική κινάση και η 2-5 ολιγοαδενυλική συνθετάση. Η πρώτη αδρανοποιεί ένα ένζυµο που είναι απαραίτητο για τη 45

52 συσσώρευση των ριβοσωµατίων και η δεύτερη καταλύει µία σειρά ενζύµων τα οποία διασπούν το mrna. Αποτέλεσµα είναι η εκλεκτική αναστολή της σύνθεσης των ιικών πρωτεϊνών. 2. Παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF) Έχει διαπιστωθεί ότι ο TNF ασκεί παρόµοια αντι-ιική δράση µε την ιντερφερόνη, πιθανόν δρώντας µέσω άλλης οδού. Επίσης έχει διαπιστωθεί ότι δρα συνεργικά µε την IFN. 3. NK κύτταρα 67, 68,69 Τα ΝΚ κύτταρα είναι ικανά να διαχωρίζουν µεταξύ των φυσιολογικών και µολυσµένων από ιό κυττάρων ή των κυττάρων που υπόκεινται σε νεοπλασµατική µεταµόρφωση. Η καταστροφή από τα ΝΚ κύτταρα των κυττάρων στόχων επιτελείται µέσω µιας ΝΚ κυτταροτοξικής αντίδρασης η οποία είναι το αποτέλεσµα της σύνθετης λειτουργίας µεταξύ των υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων που προκαλούν ενεργοποίηση και αυτών που είναι ανασταλτικοί και της έκφρασης των αντίστοιχων συνδετών επάνω στα κύτταρα στόχους.τα ΝΚ κύτταρα παίζουν σηµαντικό ρόλο στην πρώϊµη φάση της ιογενούς λοίµωξης και φλεγµονής σε συνεργασία µε άλλα κύτταρα της φυσικής ανοσίας. Η συνοµιλία αυτή µεταξύ των κυττάρων θεωρείται κριτική διότι ρυθµίζει την ανοσιακή απάντηση έναντι των παθογόνων µικροοργανισµών και την περαιτέρω επίδραση της στην ειδική ανοσιακή απάντηση. Η ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων κατά τη λοίµωξη επιτυγχάνεται : α) µέσω σηµάτων από τους παθογόνους µικροοργανισµούς στους Toll υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων, β) αναγνώρισης από αυτά συνδετών επάνω στα µολυσµένα από τον ιό κύτταρα, γ) µέσω των κυτταροκινών IL-12 και IL-15 που παράγονται από τα δενδριτικά κύτταρα. Μετά την ενεργοποίηση τους, ασκούν κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα-στόχους και εκκρίνουν κυτταροκίνες όπως ο TNF-α και η IFN-γ, οι οποίες µε την σειρά τους προάγουν την ωρίµανση των δενδριτικών κυττάρων που περιέχουν ιικά αντιγόνα. Τα ΝΚ κύτταρα στη συνέχεια καταστρέφουν τα µολυσµένα από τον ιό µη ώριµα 46

53 δενδριτικά κύτταρα σε αντίθεση µε τα ώριµα δενδριτικά κύτταρα τα οποία µεταναστεύουν στα λεµφικά όργανα και αντιδρούν µε τα Τ λεµφοκύτταρα δρώντας ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Τελικά φαίνεται ότι µε τον τρόπο αυτόν, της επιλογής δηλαδή της επιβίωσης των ώριµων δενδριτικών κυττάρων από τα ΝΚ κύτταρα ρυθµίζεται η ενεργοποίηση των Τ λεµφοκυττάρων έναντι των ιικών αντιγόνων. Η συνολική λειτουργία των ΝΚ κυττάρων κατά την ιογενή λοίµωξη επηρεάζεται από τις κυτταροκίνες που εκκρίνονται από άλλα κύτταρα της φυσικής ανοσίας. Για παράδειγµα, τα σιτευτικά κύτταρα παράγουν µεγάλη ποσότητα IFN τύπου 1 συµµετέχοντας στους µηχανισµούς φυσικής ανοσίας αλλά συγχρόνως ενεργοποιούν και τα ΝΚ κύτταρα. Η IL-4 βέβαια που παράγεται επίσης από τα σιτευτικά κύτταρα µπορεί να µεταβάλει την ειδική ανοσία προς µια ΤΗ2 απάντηση και είναι δυνατόν να τροποποιήσει τη συνεργασία ΝΚ κυττάρων και δενδριτικών κυττάρων. 4. Φαγοκυττάρωση Τα υποεπιθηλιακά µακροφάγα, τα µακροφάγα των λεµφαδενικών κόλπων και τέλος τα µακροφάγα και τα σιτευτικά κύτταρα του ήπατος και του σπλήνα είναι υπεύθυνα για τη φαγοκυττάρωση των ιών. Η αντι-ιική δράση των φαγοκυττάρων εκδηλώνεται είτε µε κατευθείαν δράση επί του ιού ή µε απελευθέρωση αντι-ιικών µεσολαβητών. Ορισµένοι όµως ιοί προκαλούν διαταραχή στη λειτουργία των φαγοκυττάρων, επηρεάζοντας µε τον τρόπο αυτό την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή. Ακόµη είναι δυνατόν τα κύτταρα αυτά να λειτουργούν ως "δεξαµενή του ιού", όπως συµβαίνει µε τα µακροφάγα στην ΗIV λοίµωξη, από όπου ο ιός δύναται να εξέρχεται κατά διαστήµατα και να µολύνει παρακείµενα κύτταρα ή ιστούς. 47

54 Β. Ειδικοί µηχανισµοί - Ειδική ανοσία Η επίκτητη ανοσιακή απάντηση έναντι των ιών µεσολαβείται από ποικίλους χυµικούς και κυτταρικούς µηχανισµούς, που δρουν µόνοι ή σε συνδυασµό. 1. Τ-κυτταρική αντίδραση Τα Τ λεµφοκύτταρα παράγονται στο µυελό των οστών, στη συνέχεια όµως µεταναστεύουν στο θύµο, όπου και ωριµάζουν. Οι σηµαντικότεροι υποπληθυσµοί των Τ κυττάρων είναι τα βοηθητικά Τ κύτταρα (Helper T cells), που κατά κανόνα φέρουν στην επιφάνειά τους το µόριο CD4, και τα κυτταρολυτικά ή κυτταροτοξικά Τ κύτταρα ( Cytolytic T cells,ctls), που χαρακτηρίζονται από την έκφραση του µορίου CD8. Τα Τ κύτταρα δεν αναγνωρίζουν διαλυτά αντιγόνα, αλλά µόνο αντιγονικά πεπτίδια που παρουσιάζονται στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, συνδεδεµένα µε πρωτεΐνες του MHC. Τα Τ λεµφοκύτταρα (Τ κυτταρική απάντηση) είναι κατεξοχήν υπεύθυνα για την ειδική ανοσιακή απάντηση έναντι των ιών. Η δράση τους ασκείται σε διάφορα επίπεδα, που αφορούν τόσο την αντισωµατική απάντηση (εφόσον η αντισωµατική απάντηση είναι θυµοεξαρτώµενη απαιτείται η παρουσία και ενεργοποίηση των CD4+ Τ κυττάρων), όσο και την κυτταρική. Τελικά η ενεργοποίηση των CD4+ κυττάρων και οι κυτταροκίνες που παράγονται από αυτά α) προκαλούν την ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Β λεµφοκυττάρων, προάγοντας έτσι την παραγωγή αντισωµάτων έναντι του ιού β) βοηθούν στην ενεργοποίηση των CD8+ κυτταροτοξικών Τ κυττάρων και γ) βοηθούν στην ενεργοποίηση των µακροφάγων στην περιοχή της φλεγµονής. Τα CD4+ κύτταρα ενεργοποιούνται αναγνωρίζοντας τα ϊικά αντιγόνα που έχουν υποστεί επεξεργασία από τα 48

55 αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC) µόνον όταν αυτά παρουσιασθούν στην επιφάνεια του APC µαζί µε MHC τάξης ΙΙ. Εντούτοις τα βασικά κύτταρα της ανοσοεπιτήρησης έναντι των ιών είναι τα κυτταροτοξικά CD8+ Τ κύτταρα. Τα CD8+ κύτταρα, αφού αναγνωρίσουν τα ιικά πεπτίδια στην επιφάνεια των µολυσµένων από τον ιό κυττάρων µαζί µε µόρια της τάξης Ι του MΗC, στη συνέχεια προβαίνουν στην καταστροφή των κυττάρων αυτών. Η όλη αντίδραση έχει ως εξής: το CTL (κυτταροτοξικό κύτταρο) µετά την ενεργοποίησή του από τις κυτταροκίνες (IL-2),συνδέεται στην επιφάνεια του µολυσµένου κυττάρου µέσω του υποδοχέα του (TCR). Ο επερχόµενος θάνατος του µολυσµένου κυττάρου επιτυγχάνεται στη συνέχεια µε δυο µηχανισµούς: α) Με τη δράση κυτταροτοξικών ουσιών που περιέχονται στα κοκκία του CΤL κυττάρου, οι οποίες προκαλούν βλάβες στην επιφάνεια των κυττάρων στόχων, που προσοµοιάζουν µε αυτές που παράγονται από το σύµπλεγµα προσβολής µεµβράνης του συµπληρώµατος. Η όλη διαδικασία εκτυλίσσεται µε τη σύνδεση του CΤL κυττάρου στο κύτταρο στόχος και την εξωκύττωση του περιεχοµένου των κοκκίων του επάνω στο κύτταρο στόχος. Βασικό συστατικό των κοκκίων αποτελούν οι περφορίνες, οι οποίες πολυµερίζονται στην επιφάνεια του κυττάρου και σχηµατίζουν δακτυλιοειδή διαµεµβρανικά κανάλια, µε αποτέλεσµα την αύξηση της διαπερατότητας της κυτταρικής µεµβράνης και το θάνατο του κυττάρου. Την ίδια διαδικασία προφανώς χρησιµοποιούν και τα κύτταρα που συµµετέχουν στην ΑDCC. Τα CD8+ Τ κύτταρα εκκρίνουν επίσης την κυτταροκίνη TNF-β, η οποία έχει κυτταροτοξικές ιδιότητες. β) Με την επιτάχυνση της απόπτωσης, του προγραµµατισµένου δηλαδή κυτταρικού θανάτου. Στην περίπτωση αυτή, η σύνδεση των CD8 Τ λεµφοκυττάρων στην επιφάνεια του κυττάρουστόχου προάγει την έκφραση γονιδίων απόπτωσης, µε αποτέλεσµα το θάνατο του κυττάρου-στόχου, µε άλλα λόγια το κύτταρο στόχος οδηγείται προς αυτοκτονία. Συγχρόνως αποτρέπεται η µόλυνση από τον ιό παρακειµένων κυττάρων, 49

56 αφού το είδος αυτό του κυτταρικού θανάτου δεν έχει σαν αποτέλεσµα την απελευθέρωση του περιεχοµένου του κυττάρου. Μετά το θάνατο του κυττάρου-στόχου, το CD8+ κύτταρο αποσυνδέεται από αυτό και επιτίθεται σε άλλα µολυσµένα από τον ιό κύτταρα. Στον άνθρωπο, εκτός από τα CD8+ Τ κυτταροτοξικά κύτταρα, µία σηµαντική αναλογία των CD4+ Τ κυττάρων παρουσιάζει επίσης κυτταροτοξικές ιδιότητες, οι οποίες επιτυγχάνονται µε τους ίδιους περίπου µηχανισµούς. 2. Ο ρόλος των Τ ρυθµιστικών κυττάρων (T regulatory 70,71, 72, 73 cells) Η λεπτή ισορροπία µεταξύ της ανοσιακής απάντησης έναντι κάποιου παθογόνου µικροοργανισµού ή γενικά έναντι κάποιου αντιγόνου και της εγκατάστασης µηχανισµών ανοχής, είναι θεµελιώδους σηµασίας κατά τη διάρκεια της ανοσιακής απάντησης. Τα τελευταία χρόνια διαπιστώθηκε η παρουσία ενός υποπληθυσµού Τ ρυθµιστικών κυττάρων (T regulatory cells ή Treg) ο οποίος προάγει µηχανισµούς ανοχής και αναστέλλει τη δράση των CD4+ και CD8+ Τ κυττάρων. Τα Treg εκφράζουν τους δείκτες CD4 +, CD25 + στην επιφάνεια τους, είναι CTLA + και η ενεργοποίηση τους επιτελείται µέσω της οδού Β7-CD28. Αποτελούν το 5-10% των περιφερικών Τ κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά δεν ενεργοποιούνται από τα ώριµα δενδριτικά κύτταρα που εκφράζουν υψηλή ποσότητα CD80, CD86, CD58, CD40 και από τις κυτταροκίνες IL-12, IL-15 και IL-18. Τα Treg εκκρίνουν IL-10 και µικρές ποσότητες IL-2, IL-4 και TGFβ. Η κατασταλτική τους δράση επιτυγχάνεται µε 3 µηχανισµούς : α) µέσω της καταστολής έκφρασης των CD40, CD80, και CD86 (συν-διεγερτικά µόρια) επάνω στα δενδριτικά κύτταρα, β) µέσω της έκκρισης IL-10 και TGFβ και γ) µέσω της καταστροφής των 50

57 CD8+ Τ κυττάρων διά της αποπτωτικής οδού (οδός FAS-FAS συνδέτη ). Από µελέτες διαπιστώθηκε ότι τα CD4 +, CD25 + κύτταρα εκτός από τις άλλες κατασταλτικές τους ιδιότητες, καταστέλλουν την Τ κυτταρική ανοσιακή απάντηση σε οξείες και χρόνιες βακτηριακές και ιογενείς λοιµώξεις 74. Ειδικότερα, είναι πιθανόν τα κύτταρα αυτά να ευθύνονται για την παραµονή των ιών και την µετάπτωση µιας οξείας ιογενούς λοίµωξης σε χρόνια. Σε πρόσφατη µελέτη 75 διαπιστώθηκε ότι στη χρόνια HCV λοίµωξη σε ασθενείς µε φυσιολογικές τρανσαµινάσες τα CD4 + CD25 + Τ regulatory κύτταρα καταστέλλουν την απάντηση των CD4 + Τ κυττάρων µε αποτέλεσµα την ελάττωση της ιστολογικής βλάβης άµεσα ή έµµεσα µέσω της ελαττωµένης ενεργοποίησης των δενδριτικών κυττάρων από τα CD4 + T κύτταρα η οποία οδηγεί σε ελάττωση της δράσης των HCV ειδικών κυτταροτοξικών CD8 + Τ κυττάρων (CTL). Εντούτοις τα ευρήµατα αυτά οδηγούν στον εξής προβληµατισµό: προστατεύουν τελικά τα Τ ρυθµιστικά κύτταρα από την ιογενή λοίµωξη ή την επιβαρύνουν ; Μια ικανή ανοσιακή απάντηση έναντι του ιού συνοδεύεται από έντονη φλεγµονώδη αντίδραση η οποία αποσκοπεί στην εκρίζωση του ιού αλλά συγχρόνως δυνητικά µπορεί να προκαλέσει σοβαρή ιστολογική βλάβη. Η ενεργοποίηση κατά συνέπεια των CD4 + CD25 + Τ reg κυττάρων πιθανόν να ελαττώνει την Τ κυτταρική απάντηση αλλά διαιωνίζει τη λοίµωξη. 3. Αντισωµατική απάντηση Τα αντισώµατα αποτελούν σηµαντικό αµυντικό µηχανισµό για την αντιµετώπιση των ιογενών λοιµώξεων, κυρίως κατά τη φάση εισόδου των ιών στον οργανισµό. Ιδιαίτερος είναι ο ρόλος των εξουδετερωτικών IgA αντισωµάτων έναντι των ιών που εισέρχονται στον οργανισµό δια του πεπτικού ή του αναπνευστικού συστήµατος. Όταν οι ιοί εισέλθουν πλέον στην αιµατική κυκλοφορία, τα αντισώµατα αδυνατούν να προλάβουν την εµφάνιση της λοίµωξης και η δράση τους είναι µόνον 51

58 υποβοηθητική των κυτταρικών µηχανισµών που τίθενται σε λειτουργία. Η δράση των ειδικών αντι-ιικών αντισωµάτων έγκειται είτε στην εξουδετέρωση των ιών, είτε στη µεσολάβησή τους στην ADCC (εξαρτώµενη από το αντίσωµα, µεσολαβούµενη από κύτταρα κυτταροτοξικότητα) των µολυσµένων κυττάρων, αφού συνδεθούν µε τα ιικά αντιγόνα που τα τελευταία εκφράζουν στην επιφάνειά τους. Η εξουδετέρωση των ιών από τα αντισώµατα επιτυγχάνεται κυρίως µε την άµεση σύνδεσή τους µε τα ιικά σωµάτια, µε αποτέλεσµα να είναι αδύνατη η σύνδεση των τελευταίων µε τους αντίστοιχους κυτταρικούς υποδοχείς. Η ενεργοποίηση του συµπληρώµατος από τα συνδεδεµένα µε τους ιούς αντισώµατα προάγει τόσο τη λύση των ιικών σωµατίων όσο και την οψωνινοποίησή τους. Η οψωνινοποίηση των ιών από τα αντισώµατα και τα προϊόντα ενεργοποίησης του συµπληρώµατος διευκολύνει κατά κανόνα τη φαγοκυττάρωσή τους. Σε αρκετές όµως περιπτώσεις η σύνδεση των οψωνινοποιηµένων ιών µε τους ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς χρησιµοποιείται σαν µηχανισµός εισόδου των ιών στα κύτταρα. Η σύνδεση των αντισωµάτων µε ορισµένα ιικά αντιγόνα, όπως π.χ. του ιού της ηπατίτιδας Β, είναι επίσης δυνατό να οδηγήσει στον σχηµατισµό ανοσοσυµπλεγµάτων, η εναπόθεση των οποίων στο αγγειακό τοίχωµα έχει ως αποτέλεσµα την εκδήλωση αγγειίτιδας. Ανοσοπαθολογία ως αποτέλεσµα της αντι-ιικής ανοσιακής απάντησης Η ανοσιακή απάντηση έναντι των ιών είναι δυνατόν να ευθύνεται για την ιστική καταστροφή. Άλλωστε, το γεγονός ότι η απάντηση αυτή µπορεί να έχει προστατευτικό ρόλο και συγχρόνως παθογενετικό στην πρόκληση της ιστικής βλάβης, αποτελεί σήµερα τεκµηριωµένη γνώση. Η ιστική βλάβη µπορεί να προκληθεί είτε άµεσα, από την δράση των κυτταροτοξικών Τ λεµφοκυττάρων, είτε έµµεσα από κυτταροκίνες που παράγονται από την ενεργοποίηση των Τ 52

59 βοηθητικών κυττάρων ή από την ενεργοποίηση άλλων µηχανισµών. Κλασσικό παράδειγµα αποτελούν οι ΗΒV και HCV στην πρόκληση της ηπατικής βλάβης. Επιπρόσθετα οι ιοί, στην προσπάθεια τους να διαφύγουν την ανοσολογική επίθεση, διαταράσσουν ή αδρανοποιούν διάφορους ανοσολογικούς µηχανισµούς. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΙΑΦΥΓΗΣ ΤΩΝ ΙΩΝ ΚΑΙ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΧΡΟΝΙΑΣ ΛΟΙΜΩΞΗΣ Α. ιαφυγή της Τ-κυτταρικής αναγνώρισης 62,74 1. Εγκατάσταση λανθάνουσας λοίµωξης: Ορισµένοι ιοί, ιδιαίτερα οι ερπητοϊοί και οι ρετροϊοί, έχουν την ιδιότητα να προκαλούν λανθάνουσες λοιµώξεις στον ξενιστή, κατά τις οποίες υπάρχει εξαιρετικά περιορισµένη έκφραση ιικών αντιγόνων. Με τον τρόπο αυτό ο ιός γίνεται ουσιαστικά αόρατος από το ανοσιακό σύστηµα και συνεπώς τα µολυσµένα από τον ιό κύτταρα δεν καταστρέφονται. 2. Πολλαπλασιασµός και εγκατάσταση σε θέσεις που δεν είναι προσιτές στο ανοσιακό σύστηµα Μία άλλη στρατηγική που ασκείται από πολλούς ιούς είναι η παραµονή τους σε θέσεις που δεν είναι προσιτές στο ανοσιακό σύστηµα, ή / και σε κυτταρικούς πληθυσµούς οι οποίοι δεν αναγνωρίζονται από τα Τ κύτταρα. 3. Καταστολή της έκφρασης των MΗC µορίων και των µορίων προσκόλλησης Η ικανότητα ορισµένων ιών να ελαττώνουν την έκφραση των MHC τάξης Ι µορίων ή των µορίων προσκόλλησης στα κύτταρα τα οποία µολύνουν, συνεπάγεται την αδυναµία των µολυσµένων κυττάρων να επάγουν την αναγνώριση από τα CD8+ Τ κύτταρα. 53

60 4. Αντιγονική ποικιλία Όλοι οι ιοί, ειδικότερα οι RΝΑ ιοί, υφίστανται µεταλλάξεις σε ταχύ ρυθµό έτσι ώστε συχνά να συνυπάρχουν πολλά στελέχη ή "σχεδόν είδη" του ίδιου ιού συγχρόνως. Έτσι υπό ανοσολογική πίεση είναι δυνατόν να προκύψουν µεταλλαγµένες µορφές, οι οποίες διαφεύγουν της κύριας ανοσολογικής απάντησης, που έχει ήδη εδραιωθεί έναντι ενός συγκεκριµένου στελέχους-τύπου του ιού. Αποτέλεσµα είναι η παραµονή και η µη εξουδετέρωση του συγκεκριµένου ιού. Παράδειγµα οι ΗΙV, ΕΒV, ΗΒV, ΗCV. Β. Καταστολή της ανοσιακής απάντησης του ξενιστή 62,74 1. Πρόκληση γενικευµένης ανοσοκαταστολής Αποτελεί µία ελκυστική στρατηγική µε την οποία ο ιός είναι δυνατόν να προκαλέσει εµµένουσα in vivo λοίµωξη. Αυτό επιτυγχάνεται µε διάφορους µηχανισµούς: α) Ο ιός µπορεί να παράγει ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες β) Ο ιός είναι δυνατό να πολλαπλασιάζεται µέσα στα ανοσοϊκανά κύτταρα και να τα καταστρέφει άµεσα, να στρέφει την ανοσιακή απάντηση έναντι αυτών, ή να προκαλεί λειτουργικές διαταραχές (π.χ. ο HIV). 2. Παρέµβαση σε επίπεδο κυτταροκινών Ορισµένοι ιοί αναστέλλουν τις αντιικές ιδιότητες των IFN-α/β, των κυτταροκινών δηλαδή που παίζουν βασικό ρόλο στην µη ειδική άµυνα του οργανισµού έναντι των ιών. 3. Πρόκληση ανοχής στα ειδικά του ιού Τ κύτταρα Η πιο ειδική παρέµβαση των ιών στην αντιική ανοσιακή απάντηση θεωρείται η πρόκληση εκλεκτικής διαταραχής στην λειτουργία των ειδικών του ιού Τ κυττάρων. Ο µηχανισµός αυτός διαφυγής προκαλείται στην περίπτωση λοίµωξης µε τον ιό στην νεογνική ηλικία. Στην περίπτωση αυτή, τα ειδικά του συγκεκριµένου ιού Τ κύτταρα υφίστανται αρνητική επιλογή από τον θύµο, µε αποτέλεσµα ο καθ όλα ανοσοϊκανός ξενιστής να µην προβάλλει καµία ανοσιακή απάντηση έναντι του ιού αυτού 54

61 σε όλη την υπόλοιπη ζωή του. Παράδειγµα αποτελεί η ενδοµήτρια ή κατά τον τοκετό λοίµωξη από τον ΗΒV. 4. Εξάντληση των ειδικών του ιού Τ κυττάρων ιαταραχή της Τ κυτταρικής απάντησης έναντι κάποιου ιού είναι δυνατόν να ακολουθήσει λοίµωξη κατά την ενήλικα ζωή. Ο µηχανισµός της διαταραχής αυτής θεωρείται ότι οφείλεται σε υπέρ-διέγερση των Τ κυττάρων µετά έκθεσή τους σε πολύ υψηλό ιικό φορτίο. Σε ορισµένες λοιµώξεις απο ιούς είναι δυνατόν να µην εξαντλούνται όλα τα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα και να παραµένει µία µικρή CTL αντίδραση, η οποία συντηρεί την εµµένουσα λοίµωξη. Παράδειγµα αποτελεί η παραµονή του HBV και η χρόνια νόσος στο 10% των ασθενών µε HBV λοίµωξη. Τα άτοµα αυτά διατηρούν κάποια CTL απάντηση, η οποία όµως δεν επαρκεί για να εξουδετερώσει τον ιό, µε αποτέλεσµα να παραµένουν χρόνιοι φορείς. ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ 60 Οι κυτταροκίνες αποτελούν πρωτεϊνες (πολυπεπτίδια), εκκρίνονται από τα κύτταρα που συµµετέχουν στους µηχανισµούς της φυσικής και επίκτητης ανοσίας και δρουν ως µεσολαβητές ρυθµίζοντας τη λειτουργία των κυττάρων αυτών. Παράγονται σε απάντηση σε αντιγόνα ενεργοποιώντας την ανοσιακή απόκριση σ αυτά ως εξής : ενεργοποιούν τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των λεµφοκυττάρων και επίσης ενεργοποιούν και όλα σχεδόν τα κύτταρα που συµµετέχουν στην καταστροφή και αποµάκρυνση των ξένων αντιγόνων (παθογόνων µικροοργανισµών). Συνοπτικά θα έλεγε κανείς ότι δρουν ως µεσολαβητές ενεργοποιώντας και ενορχηστρώνοντας της ανοσιακές αντιδράσεις στα πλαίσια τόσο της φυσικής όσο και της επίκτητης ανοσίας. 55

62 Οι κυτταροκίνες παρά το γεγονός ότι δρουν ποικιλοτρόπως, εντούτοις έχουν ορισµένα κοινά χαρακτηριστικά : 1) η έκκριση τους είναι βραχεία και αυτοπεριοριζόµενη, 2) η δράση τους είναι α) πλειοτροπική, δηλαδή είναι δυνατόν η ίδια κυτταροκίνη να δρα σε διαφορετικά κύτταρα προκαλώντας διαφορετικές βιολογικές επιδράσεις και β) επαναλαµβανόµενη, δηλαδή διαφορετικές κυτταροκίνες να έχουν τις ίδιες λειτουργικές επιδράσεις, 3) Οι κυτταροκίνες επιδρούν ρυθµίζοντας τη σύνθεση και δράση άλλων κυτταροκινών 4) Οι δράσεις των κυτταροκινών χαρακτηρίζονται από ότι είναι δυνατόν να επιτελούνται τοπικά, στη περιοχή της βλάβης ή και περιφερικά στη συστηµατική ανοσιακή απάντηση 5) Λειτουργούν όπως και οι ορµόνες µετά τη σύνδεση τους σε ειδικούς υποδοχείς των κυττάρων 6) Η έκφραση των υποδοχέων των κυτταροκινών ρυθµίζεται µετά από την επίδραση εξωτερικών σηµάτων (αντιγόνων) και στη συνέχεια µετά τη σύνδεση των κυτταροκινών σ αυτούς, οι κυτταροκίνες επιδρούν και επηρεάζουν την ανοσιακή απάντηση των κυττάρων 7) Η κυτταρική απάντηση στις κυτταροκίνες έχει ως αποτέλεσµα τη µεταβολή στη γονιδιακή έκφραση των κυττάρων-στόχων, εκτός από τις χηµειοκίνες οι οποίες προκαλούν ταχεία µετανάστευση κυττάρων χωρίς γονιδιακή µεταβολή. Συνοπτικά, οι κυτταροκίνες αποτελούν µια ετερογενή οµάδα µικροµοριακών πρωτεϊνών και γλυκοπρωτεϊνών οι οποίες όµως έχουν ορισµένα κοινά χαρακτηριστικά όπως : 1) Παράγονται και συµµετέχουν, στη συνέχεια, ρυθµίζοντας την εξέλιξη της ενεργοποίησης της φυσικής και επίκτητης ανοσίας 2) Η έκκριση τους παρουσιάζει µοναδικά χαρακτηριστικά : είναι ταχεία, βραχείας διάρκειας και αυτοπεριοριζόµενη. Η 56

63 σύνθεση τους από τα κύτταρα είναι αποτέλεσµα παροδικής µεταγραφής γονιδίων 3) Μια κυτταροκίνη είναι δυνατόν να παράγεται από διάφορα είδη κυττάρων 4) Συχνά ασκούν πολλαπλή διαφορετική επίδραση στους ίδιους κυτταρικούς στόχους 5) Οι κυτταροκίνες επηρεάζουν τη σύνθεση και δράση άλλων κυτταροκινών µε αποτέλεσµα να εµφανίζουν κλιµακωτή παραγωγή (καταρράκτη) κατά την οποία µια δεύτερη ή τρίτη στη σειρά παραγωγή κυτταροκίνης λειτουργεί ως µεσολαβητής της δράσης της πρώτης. Το αποτέλεσµα της συνεργικής δράσης των διαφόρων κυτταροκινών µπορεί να είναι αθροιστικό ή ανταγωνιστικό ή να επιτείνει επι µέρους δράσεις ή να προκαλεί νέες εκδηλώσεις. 6) Οι κυτταροκίνες επιτυγχάνουν τη δράση τους µετά τη σύνδεση τους σε ειδικούς µεµβρανικούς υποδοχείς 7) Σε πολλούς κυτταρικούς υποπληθυσµούς οι κυτταροκίνες δρουν ως ρυθµιστές της κυτταρικής διαίρεσης, δηλαδή ως αυξητικοί παράγοντες 60, 77,78,79. Oσον αφορά τους υποδοχείς των κυτταροκινών στα κύτταρα, αυτοί διαχωρίζονται σε 5 οικογένειες : α) Τύπου Ι υποδοχείς: οι οποίοι και καλούνται υποδοχείς αιµοποιητίνης, αποτελούναι από ένα ή δύο αντίγραφα ενός τµήµατος από 2 συντηρηµένα ζεύγη υπολοίπων κυστείνης και µια ακολουθία από τρυπτοφάνη-σερίνη-χ (χ=οποιοδήποτε αµινοξύ)-τρυπτοφάνη-σερίνη (WSXWS). Οι κυτταροκίνες συνδέονται στα συντηρηµένα τµήµατα των υποδοχέων και είναι οι: IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 9, IL-11, IL-12, IL-18, IL-15, GM-CSF, G-CSF, αυξητική ορµόνη και προλακτίνη. β) Τύπου ΙΙ υποδοχείς : είναι παρόµοιοι µε τους τύπου Ι και συνδέουν τις κυτταροκίνες IFN-α/β, IFN-γ, IL-10 γ) Υποδοχείς της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών : περιέχουν ανοσοσφαιρίνη και συνδέουν τις κυτταροκίνες: IL- 1, M-CSF, παράγοντα βλαστοκυττάρων (stem cell factor) 57

64 δ) Υποδοχείς TNF : µετά τη σύνδεση των κυτταροκινών σ αυτούς, ενεργοποιούνται ενδοκυττάριες πρωτεϊνες οι οποίες προάγουν την απόπτωση ή διεγείρουν την έκφραση γονιδίων. Σ αυτούς συνδέονται οι TNF-γ, CD40 συνδέτης, Fas συνδέτης, παράγοντας αύξησης των νεύρων ε) 7 διαµεµβρανικοί α-ελικοειδείς υποδοχείς (υποδοχείς σερπεντίνης) : οι υποδοχείς αυτοί προκαλούν ταχείας και βραδείας διάρκειας απάντηση στις χηµειοκίνες. Οι κυτταροκίνες για να µπορέσουν να ασκήσουν τη βιολογική τους δράση στα κύτταρα στόχους, πρέπει να προκαλέσουν ορισµένα ενδοκυττάρια σήµατα (signals) τα οποία θα διεγείρουν την παραγωγή ενεργών παραγόντων µεταγραφής και την έκφραση γονιδίων. Μετά τη σύνδεση της κυτταροκίνης στον υποδοχέα της επάνω στο κύτταρο, ακολουθεί διµερισµός ή πολυµερισµός των πολυπεπτιδίων του υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου. Ο τρόπος αυτός ισχύει για τους τύπου Ι και ΙΙ υποδοχείς των κυτταροκινών. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι δεν είναι ακόµη γνωστός ο τρόπος µε τον οποίον διατηρείται η ειδικότητα του σήµατος που παράγεται εφόσον διαφορετικοί υποδοχείς κυτταροκινών χρησιµοποιούν τις ίδιες κυτταροπλασµατικές οδούς σήµατος. Η έναρξη της µεταφοράς σήµατος επιτελείται µετά την ενεργοποίηση των JAK κινασών, οι οποίες αποτελούν µια οικογένεια διαλυτών κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνοτυροσινικών κινασών, οι οποίες αντιδρούν µε τα κυτταροπλασµατικά τµήµατα του υποδοχέα. Αποτέλεσµα είναι η φωσφορυλίωση των ιζηµάτων της τυροσίνης που βρίσκονται στο κυτταροπλασµατικό τµήµα του υποδοχέα και η φωσφορυλίωση των παραγόντων µεταγραφής, γνωστών ως STAT (Signal transducers and activators of transcription= µεταγωγείς σήµατος και ενεργοποιητές µεταγραφής). Μετά την φωσφορυλίωση τους, οι STAT υφίστανται διµερισµό και µετατοπίζονται από το κυτταρόπλασµα στον πυρήνα του κυττάρου όπου συνδέονται µε περιοχές των γονιδίων τα οποία επάγονται από τη συγκεκριµένη 58

65 κυτταροκίνη. Με τον τρόπο αυτό κορυφώνεται η βιολογική δράση της κυτταροκίνης σε κυτταρικό επίπεδο 80. Συµµετοχή των κυτταροκινών στη φυσική ανοσία Οι κυτταροκίνες που συµµετέχουν και ενεργοποιούν ή τροποποιούν τους µηχανισµούς της φυσικής ανοσίας είναι : 1.Ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF) Η κυτταροκίνη αυτή αποτελεί τον κυριότερο µεσολαβητή της οξείας φλεγµονώδους απάντησης έναντι των gram-αρνητικών βακτηριδίων και άλλων µικροβίων και ευθύνεται για πλείστες συστηµατικές επιπλοκές που ακολουθούν σε βαρειές λοιµώξεις. Η βασική της δράση είναι η διέγερση της συγκέντρωσης πολυµορφοπυρήνων και µονοκυττάρων στην περιοχή της φλεγµονώδους βλάβης και η ενεργοποίηση στη συνέχεια αυτών των κυττάρων για τον περιορισµό και την τελική καταστροφή των παθογόνων µικροοργανισµών. Σε βαρειές λοµώξεις ο ΤΝF παράγεται σε µεγάλες ποσότητες προκαλώντας σοβαρές κλινικές και ιστολογικές διαταραχές και όταν η συγκέντρωση του ανέρχεται σε 10-7 Μ, τότε προκαλείται σηπτικό shock, ενδαγγειακή πήξη και σοβαρές µεταβολικές διαταραχές (77). 2. Ιντερλευκίνη 1 (IL-1) Η βασική δράση της IL-1 είναι παρόµοια µε του TNF : αποτελεί σηµαντικό µεσολαβητή στην απάντηση του ξενιστή έναντι των λοιµώξεων και δρά συνεργικά µε τον TNF. Οι βιολογικές της δράσεις συνοψίζονται ως εξής : α)σε µικρές ποσότητες δρα στην τοπική φλεγµονώδη βλάβη, β) σε µεγάλες ποσότητες, εισέρχεται στην κυκλοφορία και ασκεί ενδοκρινική δράση, παρόµοια µε τον TNF (81). Παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιηµένα µονοπύρηνα φαγοκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, προάγοντας την πρόκληση πυρετού, την αύξηση παραγωγής πρωτεϊνών οξείας φάσης από το ήπαρ και την επαγωγή καχεξίας. 59

66 3. Χηµειοκίνες Αποτελούν µια µεγάλη οικογένεια κυτταροκινών οι οποίες διεγείρουν την κίνηση των λευκοκυττάρων και ρυθµίζουν την µετανάστευσή τους από το περιφερικό αίµα στους ιστούς. Ρυθµίζουν επίσης τη µετακίνηση (traffic) των λεµφοκυττάρων και άλλων λευκοκυττάρων στα λεµφικά όργανα. 4. Ιντερλευκίνη 12 (IL-12) Η IL-12 παράγεται από τα ενεργοποιηµένα µονοπύρηνα µακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα. Ερέθισµα παραγωγής της αποτελεί η LPS των ενδοκυττάριων βακτηρίων. Επιπλέον τα ενεργοποιηµένα Τ βοηθητικά κύτταρα προάγουν την παραγωγή της από τα µακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα, όπως και η IFN-γ (ιντερφερόνη-γ) που παράγεται από τα ΝΚ κύτταρα. Η ΙL-12 αποτελεί τον βασικό µεσολαβητή της πρώιµης απάντησης της φυσικής ανοσίας έναντι ενδοκυτταρίων µικροβίων και επίσης αποτελεί έναν µεσολαβητή «κλειδί» της κυτταρικής ανοσίας (επίκτητης) έναντι των παθογόνων αυτών µικροοργανισµών. Ετσι, η IL-12 θεωρείται ότι κατέχει κριτικό ρόλο σε µια σειρά ανοσιακών απαντήσεων στην οποία συµµετέχουν τα µακροφάγα, τα ΝΚ κύτταρα και τα Τ κύτταρα, συντελεστές που εµπλέκονται στη µάχη για περιορισµό και εκρίζωση των ενδοκυτταρίων µικροβίων. Ολα αυτά επιτυγχάνονται ως εξής : 1.Η IL-12 διεγείρει την παραγωγή της IFN-γ από τα ΝΚ και τα Τ κύτταρα 2.Η IL-12 διεγείρει τη διαφοροποίηση των CD4+ Τ βοηθητικών κυττάρων σε κύτταρα που παράγουν IFN-γ : δηλαδή ΤΗ1 κύτταρα 3. Η IL-12 διεγείρει την κυτταροτοξική δράση τόσο των ΝΚ όσο και των CD8+ κυτταροτοξικών Τ κυττάρων Κατά συνέπεια η IL-12 αποτελεί έναν συνδετικό κρίκο µεταξύ φυσικής και επίκτητης ανοσίας (78) 60

67 5. Τύπου Ι ιντερφερόνες 82, 83, 84 Συνιστούν 2 οµάδες ιντερφερονών (IFN), την IFN-α και την IFN-β. H ΙFN-α παράγεται κυρίως από τα µακροφάγα ενώ η IFN-β απο διάφορα κύτταρα και τους ινοβλάστες. Η παραγωγή τους προάγεται µετά από ιογενείς λοιµώξεις. Παρά το γεγονός ότι η IFN-α και η IFN-β διαφέρουν δοµικά, συνδέονται στον ίδιο υποδοχέα και προκαλούν παρόµοιες βιολογικές δράσεις, οι οποίες στοχεύουν κυρίως στην προστασία έναντι των ιογενών λοιµώξεων και διεγείρουν την κυτταρική ανοσία έναντι των ενδοκυτταρίων µικροβίων : α) αναστέλλουν τον πολλαπλασιασµό των ιών µέσω της επίδρασης τους στα κύτταρα προς παραγωγή ενζύµων, µε κύριο αντιπρόσωπο την 2 5 ολιγοαδενυλική συνθετάση η οποία παρεµβαίνει αναστέλλοντας τη µεταγραφή του ιικού RNA ή DNA, άρα και τον πολλαπλασιασµό του ιού. Επιπλέον δρουν µε παρακρινή µηχανισµό, δηλαδή τα µολυσµένα από τον ιό κύτταρα παράγουν IFN και προστατεύουν τα γειτονικά κύτταρα από την είσοδο του ιού σ αυτά. Επίσης, δρούν µε ενδοκρινή τρόπο, δηλαδή το µολυσµένο από ιό κύτταρο το οποίο παράγει ιντερφερόνη, τη χρησιµοποιεί για την αναστολή του πολλαπλασιασµό του ιού που βρίσκεται µέσα σ αυτό β) αυξάνουν την έκφραση της τάξης Ι µορίων του MHC ασκώντας έτσι ανοσοτροποποιητική δράση µέσω της αναγνώρισης των αντιγόνων µαζί µε MHC Ι µόρια από τα κυτταροτοξικά CD8+ Τ κύτταρα και την έκφραση της τάξης ΙΙ µορίων του MHC ενεργοποιώντας έτσι τα Τ βοηθητικά κύτταρα γ) προάγουν την διαφοροποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων σε ΤΗ1 τύπου κύτταρα δ) αναστέλλουν τον πολλαπλασιασµό πολλών κυττάρων µέσω της επαγωγής σύνθεσης των ιδίων ή πιθανόν και διαφορετικών ενζύµων που εµπλέκονται στην αναστολή του πολλαπλασιασµού των ιών. Συµπερασµατικά διαπιστώνεται ότι οι τύπου Ι ιντερφερόνες συµµετέχουν στη φυσική και στην επίκτητη ανοσιακή απάντηση. 61

68 6. Ιντερλευκίνη 10 (IL-10) 85,86 Η κυτταροκίνη αυτή προκαλεί αναστολή της ενεργοποίησης των µακροφάγων σε αντίθεση µε τις άλλες κυτταροκίνες και µε τον τρόπο αυτό διατηρεί τον οµοιοστατικό έλεγχο τόσο των µηχανισµών της φυσικής όσο και της επίκτητης ανοσίας. Παράγεται από τα ενεργοποιηµένα µακροφάγα αλλά και άλλα κύτταρα, όπως τα CD4+ Τ κύτταρα, τα CD8+ Τ κύτταρα, τα Β λεµφοκύτταρα, τα κερατινοκύτταρα και διάφορα νεοπλασµατικά κύτταρα. Οι δράσεις της συνοψίζονται ως εξής : α) προκαλεί αναστολή της παραγωγής των κυτταροκινών IL-12 και TNF από τα ενεργοποιηµένα µακροφάγα, όπως και της παραγωγής της IFN-γ β) αναστέλει την έκφραση των συν-διεγερτικών µορίων και των µορίων τάξης ΙΙ του MHC στα µακροφάγα και κατά συνέπεια αναστέλεται η αντιγονοπαρουσίαση των µακροφάγων προς τα Τ κύτταρα µε απώτερο αποτέλεσµα τη µη ενεργοποίηση των βοηθητικών CD4+ κυττάρων 7. Ιντερλευκίνη 6 (IL-6) 87,88 Η κυτταροκίνη αυτή συµµετέχει τόσο στη φυσική όσο και στην επίκτητη ανοσία. Παράγεται από τα µακροφάγα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τους ινοβλάστες και άλλα κύτταρα σε απάντηση έναντι µικροβιακών αντιγόνων ή στις κυτταροκίνες IL-1 και TNF. Η βιολογική της δράση έγκειται στα εξής: α) στα πλαίσια της φυσικής ανοσίας, διεγείρει την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης και µε τον τρόπο αυτό συµβάλλει στη συστηµατική φλεγµονή β) στα πλαίσια της επίκτητης ανοσίας, διεγείρει τα Β λεµφοκύτταρα προς διαφοροποίησή τους σε πλασµατοκύτταρα και παραγωγή αντισωµάτων, όπως επίσης δρα ως αυξητικός παράγοντας στα νεοπλασµατικά πλασµατοκύτταρα (στα κύτταρα του µυελώµατος). 62

69 8. Ιντερλευκίνη 15 (ΙL-15) Παράγεται από τα µακροφάγα ως απάντηση σε λοιµώξεις από ιούς και στην LPS των µικροβίων. Η βιολογική της δράση έγκειται στην επαγωγή του πολλαπλασιαµού των ΝΚ κυττάρων. 9. Ιντερλευκίνη 18 (IL-18) Παράγεται από τα µακροφάγα σε απάντηση στην LPS ή άλλα µικροβιακά προϊόντα. Προάγει την παραγωγή της IFN-γ από τα ΝΚ κύτταρα και τα Τ κύτταρα και δρα συνεργικά µε την IL-12. Σε συνδυασµό µε την ΙL-12 αποτελεί επαγωγικό παράγοντα µηχανισµών της επίκτητης ανοσίας. Κυτταροκίνες που συµµετέχουν και ρυθµίζουν την επίκτητη ή ειδική ανοσία Κατά την ανοσιακή απάντηση στα πλαίσια της ειδικής ή επίκτητης ανοσίας, αναγνωρίζονται διάφορες φάσεις : Α) Κατά τη φάση της αναγνώρισης του αντιγόνου, το λεµφοκύτταρο δέχεται 2 µηνύµατα ή σήµατα (signals) : το πρώτο µήνυµα µεταδίδεται µετά την σύνδεση του υποδοχέα του Τ κυττάρου µε το ειδικό αντιγόνο όπως παρουσιάζεται από τα APC µαζί µε µόρια τάξης Ι και ΙΙ του MHC και το δεύτερο, από τους παθογόνους µικροοργανισµούς και από τους µηχανισµούς της φυσικής ανοσίας Β) Κατά τη φάση της ενεργοποίησης, το λεµφοκύτταρο πολλαπλασιάζεται, υφίσταται κλωνική έκπτυξη (expansion) και διαφοροποιείται σε κύτταρο ειδικό έναντι του συγκεκριµένου αντιγόνου παράγοντας αντισώµατα αν είναι Β λεµφοκύτταρο ή µετατρεπόµενο σε ώριµο κυτταροτοξικό CD8+ Τ κύτταρο (CTL). Γ) Κατά τη φάση δράσης εξουδετερώνεται ο παθογόνος οργανισµός µέσω είτε των αντισωµάτων, είτε των ΝΚ κυττάρων 63

70 είτε ακόµη, όταν είναι ενδοκυττάριος, µέσω καταστροφής του µολυσµένου κυττάρου από το κυτταροτοξικό Τ κύτταρο (CTL). Σε όλες αυτές τις φάσεις της ανοσιακής απάντησης, ορισµένες κυτταροκίνες συµµετέχουν προάγοντας την αναγνώριση του αντιγόνου από τα λεµφοκύτταρα, τον πολλαπλασιασµό και την διαφοροποίηση των λεµφοκυττάρων και την τελική δράση και εξουδετέρωση του παθογόνου µικροοργανισµού από τα λεµφοκύτταρα. Οι κυριότερες κυτταροκίνες που συµµετέχουν στην ειδική ανοσία είναι : 1.Η ιντερλευκίνη 2(IL-2). Η IL-2 αποτελεί αυξητικό παράγοντα για τα ενεργοποιηµένα από το αντιγόνο Τ λεµφοκύτταρα και ευθύνεται για την κλωνική εξάπλωση των Τ λεµφοκυττάρων µετά την αναγνώριση του αντιγόνου. Η IL-2 παράγεται από τα CD4+ Τ λεµφοκύτταρα κυρίως, αλλά και από τα CD8+ Τ κύτταρα σε µικρότερες ποσότητες. Μετά την ενεργοποίηση των CD4+ Τ κυττάρων από κάποιο αντιγόνο, προάγεται η µεταγραφή του γονιδίου της IL-2 και στη συνέχεια η σύνθεσή της και η απέκκριση της από τα Τ κύτταρα, 8-12 ώρες µετά την ενεργοποίηση των CD4+ Τ κυττάρων από το αντιγόνο. Ο υποδοχέας της IL-2 (IL-2R) αποτελείται από 3 πρωτείνες: α, β και γ συνδεδεµένες µε οµοιοπολικούς δεσµούς. Οι α και β άλυσοι συνδέουν την IL-2, ενώ οι β και γ ευθύνονται για την µεταβίβαση σήµατος στο κύτταρο. Η πρωτεϊνη IL-2 R εκφράζεται σε µικρές ποσότητες στα ήρεµα Τ κύτταρα και στα ΝΚ. Η IL-2 προκαλεί αύξηση των κυττάρων που εκφράζουν τον υποδοχέα IL-2R βγc. Εντούτοις, τα κύτταρα τα οποία εκφράζουν τον IL-2Rα µαζί µε τον IL-2Rβγc συνδέουν πιο στερεά την IL-2. Η διέγερση των Τ κυττάρων από το αντιγόνο προάγει την έκφραση ολόκληρου του IL-2R και κατά συνέπεια τα Τ κύτταρα που διεγείρονται από το αντιγόνο συγχρόνως πολλαπλασιάζονται υπό την επίδραση των φυσιολογικών επιπέδων IL-2 τα οποία παράγονται κατά την ειδική ανοσιακή απάντηση. ηλαδή το Τ κύτταρο εκφράζει σε αυξηµένο βαθµό 64

71 IL-2R υπό την αντιγονική επίδραση και συγχρόνως προάγεται ο πολλαπλασιασµός του από την υπερπαραγωγή της IL-2(Σχήµα 5) Σχήµα 5. Ρύµιση της έκφρασης του υποδοχέα της IL-2 IL-2Rβγ c σύµπλεγµα Τ-κυτταρική ενεργοποίηση από αντιγόνο και συνδιέγερση ΑΠΚ Β7 CD28 Παρθένο CD4+ Τ-κύτταρο β γc IL-2Rβγ c IL-2 Έκκριση IL-2 Έκφραση IL-2Rααλύσου, διαµόρφωση συµπλέγµατος υψηλής συγγένειας (IL-2Rαβγ c ) IL-2Rαβγ c σύµπλεγµα β γc IL-2Rαβγ c α Πολλαπλασιασµός Τκυττάρων επαγόµενος από την IL-2 65

72 T-κύτταρο Ιντερλευκίνη-2 (IL-2) NK-κύτταρο U U U U T-κυτταρικός πολλαπλασιασµός Αύξηση παραγωγής (IL-4, IFNγ) Β-κύτταρο Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Β-κυτταρικός πολλαπλασιασµός Παραγωγή αντισωµάτων Y U U U U U U U U U U Πολλαπλασιασµός ΝΚ κυττάρων Αύξηση κυτταροτοξικής δράσης Σχήµα 6. Η βιολογική δράση της IL-2 H εκκρινόµενη IL-2 είναι µια γλυκοπρωτεϊνη βάρους 14-17KDa, παράγεται και εκκρίνεται από τα Τ λεµφοκύτταρα. Η σύνθεσή της είναι παροδική και η έκκριση της είναι µεγίστη 4 ώρες µετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Η βιολογική δράση της IL-2 συνοψίζεται ως εξής : (Σχήµα 6) : 1) Η IL-2 αποτελεί αυξητικό παράγοντα για τα Τ λεµφοκύτταρα 2) Η IL-2 η οποία παράγεται από τα Τ κύτταρα µετά την αναγνώριση του αντιγόνου από αυτά, ευθύνεται στη συνέχεια για τον πολλαπλασιασµό των ειδικών του αντιγόνου Τ κυττάρων µε τρόπο αυτοκρινή. Εντούτοις, 66

73 ορισµένες φορές η δράση της είναι και παρακρινής, διεγείροντας γειτονικά Τ κύτταρα 3) ιεγείρει τον πολλαπλασιασµό και την διαφοροποίηση των CD8+ Τ κυττάρων (CTL), αποτελώντας ένα δεύτερο σήµα ενεργοποίησης προς αυτά (το πρώτο σήµα ενεργοποίησης επέρχεται από το αντιγόνο που είναι συνδεδεµένο µε µόρια τάξης Ι του MHC στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα). 4) ιεγείρει την σύνθεση άλλων κυτταροκινών από τα Τ κύτταρα : όπως IFN-γ και λεµφοτοξίνη 5) Ενισχύει την αύξηση και την κυτταροτοξική δράση των ΝΚ κυττάρων συνδεόµενη σ αυτά, στον υποδοχέα IL- 2Rβγc τον οποίο εκφράζουν τα ΝΚ κύτταρα. Για τον λόγο αυτό, δηλαδή της έκφρασης µόνον του IL-2βγc υποδοχέα, τα ΝΚ κύτταρα διεγείρονται µόνον όταν τα επίπεδα της IL-2 είναι υψηλά. Η δράση της IL-2 στα ΝΚ κύτταρα συνδέεται µε την παραγωγή των κυττάρων LAK (lymphokine-activated killer cells) τα οποία έχουν την ικανότητα να φονεύουν κύτταρα στόχους. 6) ρα ως αυξητικός παράγοντας των Β λεµφοκυττάρων και επάγει τη διαφοροποίηση τους προς πλασµατοκύτταρα τα οποία παράγουν αντισώµατα 7) Προάγει τον αποπτωτικό θάνατο των Τ κυττάρων που έχουν ενεργοποιηθεί από κάποιο αντιγόνο µέσω της έκφρασης του συνδέτη Fas (Fas ligand). Φαίνεται ότι όταν η ανοσιακή απάντηση είναι εµµένουσα και τα Τ κύτταρα έχουν εκτεθεί σε αυξανόµενες ποσότητες IL-2, επικρατούν οι προ-αποπτωτικές δράσεις της IL-2 µε αποτέλεσµα τον τερµατισµό της ανοσιακής απάντησης. 2. Ιντερλευκίνη-4 (IL-4) Η IL-4 παράγεται κυρίως από τα CD4+ Τ λεµφοκύτταρα και ειδικότερα από τον υποπληθυσµό των ΤΗ2 κυττάρων. Η παραγωγή της IL-4 αποτελεί κριτήριο για την κατάταξη των CD4+ Τ λεµφοκυττάρων στον υποπληθυσµό των ΤΗ2 λεµφοκυττάρων, δρώντας ως κυτταροκίνη η οποία διεγείρει αλλά 67

74 και συγχρόνως προάγει τη δράση των κυττάρων αυτών, ενώ το αντίστοιχο κριτήριο κατάταξης στον υποπληθυσµό των ΤΗ1 λεµφοκυττάρων είναι η παραγωγή της IFN-γ. Η IL-4 παράγεται επίσης από τα ενεργοποιηµένα σιτευτικά κύτταρα και βασεόφιλα, καθώς επίσης και από ορισµένα CD8+ Τ λεµφοκύτταρα. Η βιολογική δράση της IL-4 συνοψίζεται ως εξής (Σχήµα 7): Η IL-4 είναι η κύρια κυτταροκίνη η οποία διεγείρει την παραγωγή της IgE από τα Β λεµφοκύτταρα, προκαλώντας τη µεταστροφή της τάξης (switching) των αντισωµάτων από IgM σε IgE. Η IgE αποτελεί τον βασικό µεσολαβητή των αντιδράσεων άµεσης υπερευαισθησίας (αλλεργικώντύπου Ι), κατά συνέπεια η IL-4 παίζει κεντρικό ρόλο στην εµφάνιση της αλλεργίας. Επιπλέον τα αντισώµατα IgE συµµετέχουν στην άµυνα έναντι των λοιµώξεων από αρθρόποδα και έλµινθες-άλλωστε αυτή ακριβώς είναι µια από τις κύριες λειτουργίες των ΤΗ2 CD4+ λεµφοκυττάρων. Η IL-4 αποτελεί αυξητικό παράγοντα και παράγοντα διαφοροποίησης των Τ λεµφοκυττάρων και ιδιαίτερα των ΤΗ2 CD4+ Τ-λεµφοκυττάρων. Η IL-4 προάγει την διαφοροποίηση των παρθένων (naive) Τ-κυττάρων, που έχουν ενεργοποιηθεί από κάποιο αντιγόνο, σε ΤΗ2 Τ- λεµφοκύτταρα, ενώ στη συνέχεια συµβάλλει και στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων του υποπληθυσµού αυτού. Η IL-4 διεγείρει την έκφραση ορισµένων µορίων προσκόλλησης και ιδιαίτερα του VCAM-1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα, µε αποτέλεσµα την αύξηση της σύνδεσης σε αυτά των λεµφοκυττάρων, µονοκυττάρων και ηωσινοφίλων. Επιπλέον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα υπό την επίδραση της IL-4 εκκρίνουν χηµειοκίνες της οικογένειας C-C, όπως η χηµειοτακτική πρωτεΐνη των µονοκυττάρων 1 (MPC-1). Συνεπώς υψηλές τοπικές συγκεντρώσεις IL-4 επάγουν φλεγµονώδεις αντιδράσεις στις οποίες «πρωταγωνιστούν» µονοκύτταρα και βασεόφιλα. 68

75 Η IL-4 αποτελεί αυξητικό παράγοντα των σιτευτικών κυττάρων. ρά συνεργικά µε την IL-3 και διεγείρει τον πολλαπλασιασµό τους. Σχήµα 7.Η βιολογική δράση της IL-4 Β-κύτταρο Y Y Y Y Ιντερλευκίνη-4 (IL-4) Παρθένο CD4+ Τ-κύτταρο Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Ισοτυπική στροφή προς IgE και IgG4 Y Y Y Y Y Y Μακροφάγο Αναστολή της ενεργοποίησης του µακροφάγου Ανάπτυξη και κλωνική έκπτυξη Th2 κυττάρων 69

76 3. Ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) 60,80 Η IFN-γ είναι γλυκοπρωτεΐνη η οποία αποτελείται από δυο υποοµάδες µοριακού βάρους kd η καθεµία. Παράγεται από τα ενεργοποιηµένα από κάποιο αντιγόνο CD4+ ΤΗ1 και CD8+ Τ λεµφοκύτταρα καθώς και από τα ΝΚ κύτταρα. Οι κυτταροκίνες IL-2 και IL-12 διεγείρουν την παραγωγή της. Η παραγόµενη από τα ΝΚ κύτταρα IFN-γ δρα ως µεσολαβητής της φυσικής ανοσιακής απάντησης και συµµετέχει στην παθογένεια του σηπτικού shock. Ο υποδοχέας της IFN-γ αποτελείται από δυο δοµικά οµόλογα πολυπεπτίδια που ονοµάζονται IFN-γ-Rα και IFN-γ-Rβ. Η IFN-γ έχει πολλές ανοσορυθµιστικές ιδιότητες, που τη διακρίνουν λειτουργικά από τις IFNs τύπου Ι. Η IFN-γ ειδικότερα, δεν έχει έντονη αντι-ιική δράση αλλά λειτουργεί κυρίως ως ανοσορυθµιστική κυτταροκίνη και η παραγωγή της χαρακτηρίζει την ενεργοποίηση των ΤΗ1 κυττάρων (Σχήµα 8): Η IFN-γ είναι ένας ισχυρός διεγερτικός παράγοντας των µονοπύρηνων/ µακροφάγων. Επάγει τη σύνθεση ενζύµων που επιτρέπουν στα µακροφάγα να καταστρέφουν τα µικρόβια, τα οποία έχουν ήδη φαγοκυτταρωθεί, προάγοντας την σύνθεση ενεργών µεταβολιτών οξυγόνου και νιτρικού οξειδίου. Το τελευταίο επιτυγχάνεται µέσω της ενεργοποίησης από την IFN-γ της µεταγραφής ενζύµων τα οποία και προκαλούν την σύνθεση των µεταβολιτών. Οι κυτταροκίνες που έχουν τη δυνατότητα να προκαλούν τέτοιου είδους λειτουργικές µεταβολές στα µονοπύρηνα / µακροφάγα ονοµάζονται διεγερτικοί παράγοντες των µακροφάγων (macrophage-activating factors MAFs). H IFN-γ είναι ο κυριότερος MAF, εξασφαλίζοντας τις συνθήκες που απαιτούνται για την ενεργοποίηση των µακροφάγων από τα Τ λεµφοκύτταρα. Άλλες κυτταροκίνες που ανήκουν σε αυτήν την κατηγορία είναι ο GM-CSF και σε µικρότερο βαθµό η IL-1, ο TNF και η λεµφοτοξίνη (LT). Η ενεργοποίηση των µακροφάγων από την IFN-γ έχει σαν αποτέλεσµα κυρίως 70

77 την εξουδετέρωση από αυτά των παθογόνων µικροοργανισµών που έχουν ήδη φαγοκυτταρωθεί και σε µικρότερο βαθµό την καταστροφή νεοπλασµατικών κυττάρων. Η IFN-γ αυξάνει την έκφραση των µορίων MHC τάξης Ι ενώ επίσης σε αντίθεση µε τις IFNs τύπου Ι αυξάνει την έκφραση και των µορίων MHC τάξης ΙΙ σε µια µεγάλη ποικιλία κυττάρων, όπως και την έκφραση συνδιεγερτικών µορίων στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Με τη δράση της αυτή η IFN-γ προάγει την επεξεργασία του αντιγόνου, την παρουσίασή του στα Τ λεµφοκύτταρα και την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Προάγει την ενεργοποίηση των CD4+ βοηθητικών Τ λεµφοκυττάρων κατά τη φάση αναγνώρισης του αντιγόνου και κατά συνέπεια ενισχύει τόσο την κυτταρική όσο και τη χυµική ανοσιακή απάντηση. Η IFN-γ προάγει τη διαφοροποίηση των Τ λεµφοκυττάρων και πιο συγκεκριµένα τη διαφοροποίηση των παρθένων CD4+ Τ κυττάρων προς ΤΗ1 κύτταρα. Επίσης παίζει σηµαντικό ρόλο στην ωρίµανση των CD8+ Τ λεµφοκυττάρων (CTLs). Η IFN-γ δρα στα Β λεµφοκύτταρα προκαλώντας µεταστροφή της τάξης των παραγόµενων αντισωµάτων (switching) από IgM σε υπότυπους των ΙgG. Τα ΙgG αντισώµατα δεσµεύουν τους αντίστοιχους υποδοχείς στα φαγοκύτταρα και ΝΚ κύτταρα, ενώ συγχρόνως αποτελούν και τους πιο ισχυρούς ενεργοποιητές του συµπληρώµατος. Κατά συνέπεια η IFN-γ επάγει τις αντισωµατικές εκείνες απαντήσεις που συµµετέχουν στην καταστροφή των παθογόνων µικροοργανισµών από τα φαγοκύτταρα, εφόσον προάγει την οψωνινοποίηση. Η IFN-γ ενεργοποιεί τα πολυµορφοπύρηνα, σε µικρότερο όµως βαθµό σε σχέση µε τον TNF ή τη λεµφοτοξίνη. Η IFN-γ ενισχύει την κυτταρολυτική δράση των κυττάρων ΝΚ, σε µεγαλύτερο βαθµό από ότι οι IFNs τύπου Ι. 71

78 Η IFN-γ είναι επίσης ενεργοποιητής των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων, µε αποτέλεσµα να προάγει την προσκόλληση των CD4+ T λεµφοκυττάρων στο ενδοθήλιο και να επιφέρει σε αυτά µορφολογικές µεταβολές απαραίτητες για την εξαγγείωσή τους. Επιπρόσθετα η IFN-γ ενισχύει τις επιδράσεις του TNF στο ενδοθήλιο. Σχήµα 8. Βιολογική δράση της IFN-γ Μακροφάγο Ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) Αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο (ΑΠΚ) Β-κύτταρο Y Y Y Παρθένο CD4+ Τ-κύτταρο Y Ενεργοποίηση µακροφάγου Αύξηση µικροβιοκτόνου δράσης Y Y Αύξηση έκφρασης MHC και αντιγονοπαρουσίασης Ισοτυπικήστροφήσεαντισώµατα που οψωνοποιούν Ανάπτυξη Th1 δραστικών κυττάρων 72

79 4. Ιντερλευκίνη-5 (IL-5) Η ιντερλευκίνη-5 παράγεται από τα ΤΗ2 βοηθητικά Τ λεµφοκύτταρα και από τα ενεργοποιηµένα σιτευτικά κύτταρα. Ο υποδοχέας της IL5 ανήκει στους υποδοχείς κυτταροκινών τύπου Ι. Η βιολογική της δράση έγκειται στη διέγερση του πολλαπλασιασµού και της διαφοροποίησης των ηωσινόφιλων, καθώς και στην ενεργοποίηση των ώριµων ηωσινόφιλων, ώστε να καταστούν ικανά να καταστρέψουν τα αρθρόποδα και τους έλµινθες. Μαζί µε την IL-4 αποτελούν τις δύο βασικές πρωτείνες που παράγονται από τα ΤΗ2 τύπου κύτταρα και δρούν συνεργικά ως εξής: η IL-4 προάγει την παραγωγή της IgΕ η οποία οψωνοποιεί τους έλµινθες προκαλείται η σύνδεση στα ηωσινόφιλα και η IL-5 ενεργοποιεί τα ηωσινόφιλα έτσι ώστε να καθίστανται ικανά να καταστρέψουν τους έλµινθες. Με τον τρόπο αυτόν, συµβάλλει στις µεσολαβούµενες από τα ΤΗ2 κύτταρα αλλεργικές αντιδράσεις και στις ανοσιακές απαντήσεις σε αρθρόποδα και έλµινθες. Επιπλέον διεγείρει τον πολλαπλασιασµό των Β λεµφοκυττάρων προς παραγωγή της IgA. 5. Αυξητικός παράγοντας της βλαστικής µεταµόρφωσης (Transforming Growth Factor β TGF-β) Ο TGF-β παράγεται από διάφορους κυτταρικούς πληθυσµούς, κυρίως από τα µακροφάγα και τα Τ λεµφοκύτταρα. Η σηµαντικότερη δράση του είναι να αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό και να ανταγωνίζεται τις Τ λεµφοκυτταρικές απαντήσεις. Ο TGF-β ασκεί επίσης επίδραση και σε άλλα κύτταρα, όπως είναι τα πολυµορφοπύρηνα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, ανταγωνιζόµενος τις δράσεις των φλεγµονωδών κυτταροκινών σε αυτά. Κατά συνέπεια η κυτταροκίνη αυτή είναι ένας αρνητικός ρυθµιστικός παράγοντας της ανοσιακής και της φλεγµονώδους απάντησης. 73

80 6. Λεµφοτοξίνη (LT) Η λεµφοτοξίνη ή TNF-β είναι γλυκοπρωτεΐνη µοριακού βάρους kd, εµφανίζει κατά 30% περίπου οµολογία µε τον TNF και ανταγωνίζεται µε αυτόν για τη σύνδεση στους ίδιους υποδοχείς. Η LT παράγεται κυρίως από ενεργοποιηµένα Τ λεµφοκύτταρα και η βιολογική της δράση είναι παρόµοια µε αυτήν του TNF. Εντούτοις, οι παραγόµενες ποσότητες της LT είναι πολύ µικρότερες από αυτές του TNF, ο οποίος παράγεται από τα ενεργοποιηµένα από τους λιποπολυσακχαρίτες (LPS) µονοπύρηνα και για τον λόγο αυτό η LT αποτελεί έναν τοπικώς δρώντα παρακρινή παράγοντα και όχι έναν µεσολαβητή συστηµατικών αντιδράσεων. Η LT είναι ισχυρός παράγοντας ενεργοποίησης των ουδετερόφιλων συµβάλλοντας έτσι στη ρύθµιση της οξείας φλεγµονής από τα λεµφοκύτταρα. Η δράση της στα ουδετερόφιλα είναι ισχυρότερη από αυτήν της IFN-γ. Η LT δρα επίσης ως παράγοντας ενεργοποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων, προκαλώντας παραγωγή κυτταροκινών και µορφολογικές µεταβολές των λευκοκυττάρων απαραίτητες για την προσκόλληση τους στο τοίχωµα του αγγείου και την εξαγγείωσή τους. Οι δράσεις αυτές, όπως και οι αντίστοιχες του TNF, ενισχύονται από την IFN-γ. ΤΗ1-ΤΗ2 ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ Οι κυτταροκίνες αποτελούν σηµαντικότατους µεσολαβητές των εξαρτώµενων από τα Τ λεµφοκύτταρα ανοσιακών απαντήσεων έναντι πρωτεϊνικών αντιγόνων. Κατά συνέπεια το είδος των κυτταροκινών που παράγονται κατά την εξέλιξη µιας ανοσιακής απάντησης, καθορίζει τόσο τη φύση όσο και την αποτελεσµατικότητα της απάντησης αυτής. Η επίκτητη ανοσιακή απάντηση εµφανίζει υψηλό βαθµό εξειδίκευσης, µε σκοπό πάντα την αποτελεσµατικότερη εξουδετέρωση των παθογόνων µικροοργανισµών. Ένα άλλο 74

81 χαρακτηριστικό γνώρισµα της ειδικής ανοσίας, εκτός από την εξειδίκευση, είναι και η ετερογένεια, η οποία βασίζεται στην ικανότητα των Τ λεµφοκυττάρων που έρχονται αντιµέτωπα µε τα αντιγόνα των παθογόνων µικροοργανισµών, να διαφοροποιούνται σε υποοµάδες δραστικών κυττάρων τα οποία παράγουν διαφορετικές κυτταροκίνες και εκδηλώνουν διαφορετικές λειτουργίες. Μόλις πριν από 20 χρόνια, µελέτες που έγιναν σε καλλιέργειες Τ βοηθητικών λεµφοκυττάρων ποντικών, έδειξαν ότι τα CD4+ Τ λεµφοκύτταρα µπορούσαν να διακριθούν σε δύο υποπληθυσµούς µε βάση τις εκκρινόµενες από αυτά κυτταροκίνες. Οι δυο αυτοί υποπληθυσµοί των Τ βοηθητικών λεµφοκυττάρων ονοµάστηκαν ΤΗ1 και ΤΗ2 Τ κύτταρα , 91. Οι ΤΗ1 κλώνοι των Τ κυττάρων χαρακτηρίζονταν από την παραγωγή των IFN-γ και IL-2 κυτταροκινών και οι ΤΗ2 κλώνοι από την παραγωγή των Il-4, IL-5, IL-6 και IL-10 κυτταροκινών. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι ορισµένες ΤΗ1-ΤΗ2 κυτταροκίνες παρουσίαζαν µια αρνητική αλληλεπίδραση µεταξύ τους, δηλαδή η IFN-γ προκαλούσε αναστολή της παραγωγής της IL-4 και το ίδιο συνέβαινε µε την IL-4 προς την παραγωγή της IFN-γ. Ως ΤΗ0 χαρακτηρίστηκαν οι κλώνοι των Τ βοηθητικών κυττάρων οι οποίοι είχαν την ικανότητα να παράγουν κυτταροκίνες και των δύο τύπων: ΤΗ1 και ΤΗ2. Οσον αφορά τη λειτουργική τους δράση, διαπιστώθηκε ότι οι ΤΗ1 κλώνοι προήγαγαν την κυτταρική ανοσία ενώ οι ΤΗ2 την παραγωγή αντισωµάτων. Αρκετά χρόνια µετά, διαπιστώθηκε η παρουσία ΤΗ1 και ΤΗ2 βοηθητικών Τ κυττάρων στον άνθρωπο, σε κλώνους Τ κυττάρων, στο περιφερικό αίµα και στους ιστούς, γεγονός που έδωσε νέο φως στην κατανόηση της αλληλοεξάρτησης και 92, 93, αλληλεπίδρασης µεταξύ της κυτταρικής και χυµικής ανοσίας 94,95. Ετσι φαίνεται ότι οι υποπληθυσµοί αυτοί των Τ κυττάρων και οι κυτταροκίνες που παράγουν αποτελούν τον κεντρικό άξονα ο οποίος καθορίζει την ένταση της ανοσιακής απάντησης σε µικροβιακά αντιγόνα µέσω µηχανισµών κυτταρικής ή / και χυµικής ανοσίας (Σχήµα 9). 75

82 Σχήµα 9. Επαγωγή των ΤΗ1 και ΤΗ2 υποπληθυσµών ΑΠΚ Παρθένο CD4+ Τ-κύτταρο IL-2 Ενεργοποιηµένα µακροφάγα, δενδριτικά Ενεργοποιηµένα Τ-κύτταρα IL-12 IL-4 Άλλα κύτταρα;; V Π STAT 4 STAT 6 Th1 κύτταρα Th2 κύτταρα Η ενεργοποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων προς κύτταρα που παράγουν ΤΗ1 ή ΤΗ2 κυτταροκίνες προάγεται µε διάφορους µηχανισµούς 96 : α) τα δενδριτικά κύτταρα ως 76

83 αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα διεγείρουν την τύπου Ι ανοσιακή απάντηση έναντι µικροβιακών αντιγόνων β) τα Β λεµφοκύτταρα προκαλούν µια ΤΗ2 τύπου απάντηση όταν λειτουργούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα γ) σε πειραµατικές µελέτες διαπιστώθηκε ότι τα µακροφάγα επάγουν την ΤΗ1 απάντηση 97 δ) η ποσότητα του αντιγόνου είναι δυνατόν να επηρεάζει την ισορροπία της ΤΗ1/ΤΗ2 ανοσιακής απάντησης 60 ε) τα συνδιεγερτικά µόρια φαίνεται ότι επίσης επηρεάζουν την ΤΗ απάντηση 98 και ζ) διάφορες κυτταροκίνες επηρεάζουν σηµαντικά την διαφοροποίηση της ΤΗ απάντησης: η IL-12 προάγει την ΤΗ1 και η IL-4 την ΤΗ2 απάντηση. Σήµερα είναι γνωστό ότι τα ΤΗ1 κύτταρα παράγουν IL-2, IFN-γ, IL-12 και ΤNF-β, ενώ τα ΤΗ2 κύτταρα παράγουν IL-4, IL-5, IL- 6, IL-10 και IL-13. Η έκκριση αυτή διαφορετικών κυτταροκινών καθορίζει και τη διαφορετική λειτουργία και δράση των υποπληθυσµών ΤΗ1 και ΤΗ2. Τα ΤΗ1 και ΤΗ2 κύτταρα φαίνεται ότι προέρχονται από ένα κοινό πρόδροµο Τ κύτταρο, το ΤΗ0 κύτταρο, που χαρακτηρίζεται από την ικανότητά του να εκκρίνει τόσο IFN-γ όσο και IL-4. Σηµαντικότερη µεταξύ των ΤΗ1 κυτταροκινών θεωρείται η IFNγ, η οποία διεγείρει τη µικροβιοκτόνο δράση των φαγοκυττάρων, προάγοντας µε αυτόν τον τρόπο την ενδοκυττάρια καταστροφή των µικροοργανισµών που έχουν φαγοκυτταρωθεί. Επίσης προάγει την οψωνινοποίηση των µικροοργανισµών, την σύνδεση αυτών στους κυτταρικούς υποδοχείς, διεγείροντας µε τον τρόπο αυτόν την φαγοκυττάρωση Κατά συνέπεια µια από τις κύριες δράσεις των ΤΗ1 κυττάρων και των ΤΗ1 τύπου κυτταροκινών είναι να προάγουν τη µεσολαβούµενη από τα φαγοκύτταρα ανοσοαπάντηση έναντι των µικροβιακών λοιµώξεων. Επιπλέον τα ΤΗ1 τύπου λεµφοκύτταρα παράγουν την IL-2, η οποία δρα αφενός ως αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας και αφετέρου, µαζί µε την IFN-γ, διεγείρει τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των CD8+ 77

84 Τ λεµφοκυττάρων (κυτταροτοξικών CTL). Τέλος τα ΤΗ1 τύπου λεµφοκύτταρα παράγουν τη λεµφοτοξίνη (LT ή TNF-β), η οποία ενισχύει την «στρατολόγηση» και ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων. Οι πιο χαρακτηριστικές από τις ΤΗ2 κυτταροκίνες είναι η IL-4 και η IL-5. Κατά συνέπεια τα ΤΗ2 κύτταρα ρυθµίζουν την παραγωγή αντισωµάτων από τα Β λεµφοκύτταρα και δρουν ως µεσολαβητές των αλλεργικών αντιδράσεων και της ανοσιακής απάντησης έναντι των λοιµώξεων από αρθρόποδα και έλµινθες. Επιπρόσθετα, τα ΤΗ2 κύτταρα παράγουν κυτταροκίνες (όπως η IL-4, η IL-10 και η IL-13), οι οποίες ανταγωνίζονται τις δράσεις της IFN-γ, καταστέλλοντας την ενεργοποίηση των µακροφάγων. Κατά τον τρόπο αυτόν,τα ΤΗ2 κύτταρα δρουν ως ρυθµιστές της ανοσιακής απάντησης, εξισορροπώντας δυνητικά βλαπτικές ΤΗ1 απαντήσεις. Εντούτοις, υπερβολικά έντονες και µη ελεγχόµενες ΤΗ2 τύπου αντιδράσεις οδηγούν σε ανεπαρκή κυτταρικού τύπου ανοσιακή απάντηση η οποία είναι σηµαντική για την άµυνα του οργανισµού έναντι των λοιµώξεων από ενδοκυττάριους µικροοργανισµούς, όπως είναι οι ιοί. Συνοψίζοντας, µπορούµε να πούµε ότι τα ΤΗ1 κύτταρα ή οι ΤΗ1-τύπου κυτταροκίνες προάγουν την κυτταρική ανοσία, τη φαγοκυττάρωση, την παρουσίαση του αντιγόνου και την ειδική κυτταροτοξική αντίδραση, ενώ οι ΤΗ2-τύπου κυτταροκίνες ρυθµίζουν την παραγωγή των αντισωµάτων, παίζουν σηµαντικό ρόλο στις αλλεργικές απαντήσεις και καταστέλλουν την κυτταρική ανοσία η οποία είναι σηµαντική για την άµυνα του οργανισµού έναντι των λοιµώξεων από ιούς. Επιπλέον οι κυτταροκίνες που παράγονται από τον έναν υποπληθυσµό δύνανται να αναστείλουν τη δράση των κυτταροκινών που παράγονται από τον άλλον υποπληθυσµό των Τ βοηθητικών κυττάρων. Μελέτες έδειξαν ότι η ανοσιακή απάντηση στην οποία προέχει η δράση των ΤΗ1 κυττάρων προστατεύει τον ξενιστή έναντι των 78

85 ενδοκυττάριων µικροοργανισµών, ενώ η ΤΗ2 απάντηση προστατεύει έναντι των εξωκυττάριων µικροοργανισµών 90,91. Βέβαια η τελική επικράτηση της ΤΗ1 ή ΤΗ2 ανοσιακής απάντησης µετά από λοίµωξη µε κάποιον παθογόνο µικροοργανισµό εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως την ποσότητα του αντιγόνου, την οδό λοίµωξης, τον ιστό που προσβάλλεται, το τοπικό περιβάλλον των κυτταροκινών και τα τοπικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Πρέπει να τονιστεί ότι τα ΤΗ1 και ΤΗ2 βοηθητικά Τ κύτταρα προέρχονται από το ίδιο πρόδροµο κύτταρο, που είναι το παρθένο (naive) βοηθητικό Τ λεµφοκύτταρο και δεν αποτελούν ξεχωριστούς κυτταρικούς υποπληθυσµούς µε προκαθορισµένη δράση πριν από την έκθεση στο αντιγόνο, αλλά προϊόντα ενός σταδίου διαφοροποίησης των Τ βοηθητικών κυττάρων µετά την ενεργοποίηση τους από το αντιγόνο. ΑΝΟΣΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΤΗΣ HCV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Η ηπατίτιδα C προκαλείται από έναν µικρό RNA ιό ο οποίος εµφανίζει µεγάλη ετερογένεια και µοναδική ικανότητα όπως άλλωστε όλοι οι RNA ιοί- να µεταλάσσεται µε ταχύ ρυθµό υπό την ανοσολογική πίεση που υφίσταται. Η συµµετοχή της ανοσιακής απάντησης, ιδιαίτερα της κυτταρικής ανοσίας, στην άµυνα του ξενιστή έναντι του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) αλλά και στη γένεση της ηπατοκυτταρικής βλάβης, θεωρείται σήµερα αναµφισβήτητη για τους εξής λόγους 99 : 1) στην πρωτογενή HCV λοίµωξη η καταστροφή των ηπατοκυττάρων δεν επέρχεται άµεσα µετά την λοίµωξη µε τον HCV ο οποίος πολλαπλασιάζεται, αλλά αργότερα, µετά την ενεργοποίηση της ανοσιακής απάντησης έναντι του ιού 2) ο ιός δυνατόν να πολλαπλασιάζεται χωρίς να υπάρχει καταστροφή των ηπατοκυττάρων 3) σε πειραµατικό επίπεδο, ο HCV δε φαίνεται να έχει άµεση κυτταροτοξική δράση 4) η καταστολή της ανοσιακής απάντησης σε ασθενείς µε χρόνια HCV λοίµωξη 79

86 συνοδεύεται µε ελάττωση των επιπέδων των τρανσαµινασών και αύξηση του ιικού φορτίου και 5) η ηπατοκυτταρική καταστροφή συνοδεύεται από φλεγµονώδη διήθηση µε HCV δραστικά ανοσοκύτταρα. Α. Αντισωµατική απάντηση έναντι του ιού Μετά την µόλυνση µε τον HCV, οροµετατροπή παρατηρείται συνήθως µετά την 4 η εβδοµάδα, ενώ η ιαιµία εµφανίζεται µετά από 1 εβδοµάδα. ιαπιστώθηκε παραγωγή αντισωµάτων έναντι διαφόρων δοµικών και µη πρωτεϊνών του HCV. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα αντισώµατα αυτά δεν είναι εξουδετερωτικά. Όπως είναι γνωστό, τα εξουδετερωτικά αντισώµατα παρέχουν την πρώτης γραµµής άµυνα χυµικής ανοσίας σε λοιµώξεις, προκαλώντας ελάττωση της διασποράς του ιού. Τα αντισώµατα αυτά κατατάσσονται σε 2 κατηγορίες : α) τα ειδικά του στελέχους (strain specific) του παθογόνου µικροοργανισµού, τα οποία προκαλούν εξουδετέρωση µόνον του αυτόλογου ιού και β) τα αντισώµατα τα οποία εµφανίζουν διασταυρούµενη αντίδραση (cross reactive) και τα οποία εξουδετερώνουν τους αυτόλογους και τους ετερόλογους ιούς. Θεωρείται ότι τα τελευταία στρέφονται έναντι πιο συντηρηµένων περιοχών των ιικών γλυκοπρωτεϊνών µε αποτέλεσµα να προκαλούν πιο έντονο περιορισµό στον ιό και να ελαττώνουν τη συχνότητα εµφάνισης µεταλλάξεων διαφυγής. Η εµφάνιση των εξουδετερωτικών αντισωµάτων µελετήθηκε σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C και διαπιστώθηκε ότι η αντισωµατική απάντηση είναι βραδεία µετά την αρχική λοίµωξη και εξαρτάται από τον τρόπο µετάδοσης και το αρχικό φορτίο του ιού. Ετσι, είναι πιθανόν ο µηχανισµός της µετάπτωσης σε χρονιότητα και παραµονής του ιού να οφείλεται στο γεγονός ότι η αντισωµατική απάντηση (διασταυρούµενη) να καθυστερεί να εµφανισθεί, ώστε τελικά η κυτταρική ανοσιακή απάντηση να καθίσταται µη λειτουργική και ανήµπορη να καταστρέψει τα µολυσµένα από τον ιό ηπατοκύτταρα

87 Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι στους πρώτους 6 µήνες της HCV λοίµωξης ανευρίσκονται εξουδετερωτικά αντισώµατα ειδικά του στελέχους σε πολύ χαµηλά επίπεδα και είναι αρνητικά στους ασθενείς στους οποίους αυτοπεριορίσθηκε η νόσος 101. Από την άλλη µεριά, η νόσος αυτοπεριορίζεται ακόµη και επί απουσίας οποιασδήποτε αντισωµατικής απάντησης έναντι των πρωτεϊνών του φακέλου 102. Η ετερογένεια της υπερµεταβλητής περιοχής (HVR) του γονιδιώµατος του HCV θεωρήθηκε επίσης ότι σχετίζεται µε τη µετάπτωση της νόσου σε χρονιότητα, µε το σκεπτικό της εµφάνισης συχνών µεταλλάξεων και σχεδόν-ιών (quasispecies) του ιού 103. Εντούτοις, η σηµασία των µεταλλάξεων της Ε2HVR περιοχής στην παραµονή του HCV δεν έχει ακόµη διευκρινισθεί εφόσον διαπιστώθηκε χρόνια νόσος µε πολύ µικρή ετερογένεια της περιοχής αυτής 104. Συµπερασµατικά, φαίνεται ότι παρά την παρουσία των αντισωµάτων η αντισωµατική απάντηση έναντι του ΗCV δεν είναι δραστική στον έλεγχο και περιορισµό του ιού. Β. Ανοσιακή απάντηση στα πλαίσια της φυσικής ανοσίας Η HCV λοίµωξη προκαλεί πρώιµη αύξηση της µεταγραφής των γονιδίων της IFN, εντούτοις η µη ειδική αυτή απάντηση δεν φαίνεται να επηρεάζει την εξέλιξη της λοίµωξης 105 για τους εξής πιθανούς λόγους : 1) η HCVNS34A πρωτεάση της σερίνης µπλοκάρει τον µεταγγραφικό παράγοντα IRF-3(interferon response factor), ο οποίος προάγει την παραγωγή των IFN I (IFNa και IFN-β) 106. Όπως είναι γνωστό, µετά τη λοίµωξη των κυττάρων από κάποιον ιό, η IRF-3 φωσφορυλιώνεται και µεταβαίνει στον πυρήνα του κυττάρου, όπου συγκεντρώνονται και οι άλλοι παράγοντες µεταγραφής όπως η ΝF-κb και προάγουν την έκφραση των γονιδίων της IFN-β και IFN-α1 µε αποτέλεσµα την παραγωγή των IFNs αυτών. Οι ιντερφερόνες αυτές εκκρίνονται και µέσω αυτοκρινούς ή παρακρινούς σύνδεσης και αντίδρασης µε τους αντίστοιχους υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων. Μετά την 81

88 σύνδεσή τους, προάγεται η µεταφορά µηνύµατος προς το κύτταρο διά της Jak-Stat οδού. Επιπλέον, ο IRF-7 συµµετέχει σε περαιτέρω έκφραση γονιδίων IFN 107. Εντούτοις, και ο µηχανισµός αυτός παραγωγής ιντερφερονών αναστέλλεται από την πρωτεάση της σερίνης του HCV ) Η Ε2 και η NS5A του HCV αναστέλλουν τη λειτουργία της PKR (πρωτεινική κινάση). Η δράση της HCV Ε2 συνίσταται στην καταστροφή της ΡΚR επειδή η Ε2 παρουσιάζει οµολογία µε τα τµήµατα φωσφορυλίωσης του ενζύµου και του υποστρώµατος του. Τα ευρήµατα αυτά αποκτούν ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι διαπιστώνεται ότι η επίδραση της Ε2 στην PKR είναι ιδιαίτερα έντονη σε ασθενείς µε λοίµωξη από τον γονότυπο 1 οι οποίοι και δεν απαντούν καλά στη θεραπεία, εξηγώντας έτσι έναν ακόµη λόγο της διαφορετικής συµπεριφοράς των ασθενών αυτών στη θεραπεία έναντι των ασθενών µε γονότυπο 2-3. Η NS5A δηµιουργεί ετεροδιµερή µε την PKR και µε τον τρόπο αυτό αναστέλλει τη λειτουργία της. 3) Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη ΝS5Α προάγει την έκφραση της IL-8 η οποία σχετίζεται µε αναστολή της δράσης της IFN. Εκτός από την άµεση επίδραση του HCV στην ιντερφερόνη, ο HCV επεµβαίνει και αναστέλλει τη δράση των δραστικών κυττάρων που συµµετέχουν στη φυσική ανοσία και κυρίως των ΝΚ κυττάρων, όπως διαπιστώθηκε από µελέτες σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C 111. Στους ασθενείς αυτούς τα ΝΚ κύτταρα παρουσιάζουν διαταραχή της ικανότητας τους να διεγείρουν τα δενδριτικά κύτταρα 109. Γ. Επίδραση του HCV στα δενδριτικά κύτταρα Λοίµωξη των δενδριτικών κυττάρων και διαταραχή της λειτουργίας τους θεωρείται ότι αποτελεί µια από τις στρατηγικές που προβάλλουν διάφοροι ιοί έτσι ώστε να διαφύγουν της ανοσιακής επίθεσης του ξενιστή. 82

89 Τα δενδριτικά κύτταρα 110 αποτελούν έναν ετερογενή πληθυσµό αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων τα οποία επιτελούν έναν σηµαντικό ρόλο έναντι των ιών, ενεργοποιώντας τόσο τη φυσική όσο και την ειδική ανοσιακή απάντηση. Τα κύτταρα αυτά είναι πολύ ικανά να δεσµεύουν εξωγενείς παράγοντες ως «µη ώριµα» δενδριτικά κύτταρα, τα οποία εκφράζουν σε µικρό βαθµό µόρια του MHC, συνδιεγερτικά µόρια και µόρια προσκόλλησης. Μετά την επαφή τους όµως µε το αντιγόνο, µεταβάλλονται, ωριµάζουν και ελαττώνεται η ικανότητα τους να προσλαµβάνουν αντιγόνα ενώ αντίθετα αυξάνεται η έκφραση του MHC, των συνδιεγερτικών µορίων και των µορίων προσκόλλησης. Στη φάση αυτή τα δενδριτικά κύτταρα παράγουν κυτταροκίνες, οι οποίες επάγουν την δράση των Τ κυττάρων. Η ωρίµανση των δενδριτικών κυττάρων επάγεται από µόρια των παθογόνων µικροργανισµών, τα οποία αναγνωρίζονται από τους Toll-like υποδοχείς. Οσον αφορά στην συµπεριφορά των δενδριτικών κυττάρων στην HCV λοίµωξη, διαπιστώθηκε ότι υπάρχει µια διαταραχή της λειτουργίας τους από τον HCV : α) είτε άµεσα από τις πρωτεΐνες του HCV που εκφράζονται µέσα στα κύτταρα αυτά, β) είτε µετά από σύνδεση των ιικών πρωτεϊνών στα κύτταρα, γ) είτε ακόµη έµµεσα, από την επίδραση άλλων κυτταρικών παραγόντων στα κύτταρα αυτά. Οσον αφορά τη διαταραχή της λειτουργίας τους, αυτή σχετίζεται µε :α) την επαγωγική τους δράση, δηλαδή την ελαττωµένη ικανότητά τους να απαντούν σε ερεθίσµατα και να εκφράζουν συνδιεγερτικά µόρια, όπως το CD86. Αποτέλεσµα είναι η Τ κυτταρική απάντηση να υπολείπεται σε παραγωγή IFNγ και να υπερπαράγεται η IL-4 (ειδική ανοσία) β) την επαγωγική τους δράση στα ΝΚ κύτταρα (φυσική ανοσία) γ) την ικανότητα τους προς παραγωγή τύπου Ι ιντερφερονών 112 (φυσική ανοσία) δ) την ελαττωµένη παραγωγή IL Αποτέλεσµα των δύο τελευταίων διαταραχών είναι η µεταστροφή της ΤΗ απάντησης από ΤΗ1 σε ΤΗ2. 83

90 . Κυτταρική ανοσία Η ισχυρή και ικανή ενεργοποίηση των Τ κυττάρων έναντι διαφόρων αντιγόνων επιτελείται µετά από την επίδραση διαφόρων σηµάτων, όπως από την παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC), το φορτίο και την διάρκεια της αντιγονική διέγερσης, την παρουσία των βοηθητικών CD4+ κυττάρων, την κινητοποίηση κυτταροκινών που επάγουν την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και τελικά τη συνεργασία όλων αυτών των παραγόντων, έτσι ώστε να διατηρηθεί η µνήµη έναντι του συγκεκριµένου αντιγόνου που προκάλεσε όλη αυτήν την αντίδραση µε τη διαφοροποίηση Τ κυττάρων σε µνηµονικά δραστικά κύτταρα (CCR7). Εντούτοις ενίοτε, ιδιαίτερα στην ανοσιακή απάντηση έναντι ορισµένων ιών, τα σήµατα (signals) που δέχονται τα Τ κύτταρα δεν είναι αρκετά ισχυρά έτσι ώστε να προκληθεί µια ισχυρή ανοσιακή απάντηση, ικανή να περιορίσει τον ιό, αλλά αντίθετα είτε προκαλείται ανοσιακή ανοχή ή διαταραχή στην ενεργοποίηση των µνηµονικών κυττάρων. Τελικό αποτέλεσµα είναι η ελαττωµένη ικανότητα των Τ κυττάρων να πολλαπλασιάζονται και να διαφοροποιούνται σε δραστικά κύτταρα, µε απώτερο αποτέλεσµα την παραµονή του ιού και τη χρόνια νοσο 114. Εφόσον σε ένα ποσοστό 15-40% των ασθενών η οξεία HCV λοίµωξη αυτοπεριορίζεται και ο HCV εξουδετερώνεται, η φάση αυτή της HCV λοίµωξης αποτελεί και την κριτική φάση της ανοσιακής απάντησης όπου µια ισχυρή και εµµένουσα, τύπου Ι (ΤΗ1) ειδική CD4+ Τ κυτταρική απάντηση και µια πρώιµη πολυκλωνική CD8+T κυτταρική απάντηση έχει ως αποτέλεσµα την εξουδετέρωση του ιού

91 Η CD4 Τ κυτταρική απάντηση έναντι του HCV Σε ασθενείς µε HCV λοίµωξη, αναγνωρίζονται ειδικά του HCV CD4+ κύτταρα στο ήπαρ και στο περιφερικό αίµα. Τα κύτταρα αυτά αναγνωρίζουν τόσο τις δοµικές όσο και τις µη δοµικές πρωτεΐνες του HCV. Η απάντηση των περιφερικών ειδικών του HCV CD4+ Τ κυττάρων παρουσιάζει µια ισχυρή συσχέτιση µε την κλινική πορεία της οξείας ηπατίτιδας C. Αρκετοί ερευνητές διαπίστωσαν ότι υπάρχει άµεση συσχέτιση µε την εξουδετέρωση του HCV όταν η απάντηση των ειδικών του ιού CD4+ Τ κυττάρων είναι ισχυρή εµµµένουσα και πολυκλωνική (ειδικά έναντι των µη δοµικών αντιγόνων του HCV) στο περιφερικό αίµα ασθενών µε οξεία ηπατίτιδα C 116,117, 118, 119, 120, 121. Eνδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι αρκετοί ασθενείς, οι οποίοι τελικά θα εµφανίσουν χρόνια ηπατίτιδα, παρουσιάζουν µια παροδική φάση κατά την οποία υπάρχει έλεγχος του ιικού πολλαπλασιασµού µε µη ανιχνεύσιµο ή χαµηλό ίικό φορτίο (<10 4 IU/ml) και πολύ ισχυρή ειδική έναντι πολλών αντιγόνων του HCV CD4+ T κυτταρική απάντηση 122. Η απάντηση αυτή προσοµοιάζει µε αυτή που παρατηρείται στην αυτοπεριοριζόµενη οξεία ηπατίτιδα C όσον αφορά στον αριθµό των επιτόπων του HCV έναντι των οποίων στρέφεται η ανοσιακή απάντηση και το προφίλ των κυτταροκινών 123. Η φάση αυτή ακολουθείται από αύξηση της ιαιµίας και εξασθένηση της CD4+ Τ κυτταρικής απάντησης, η οποία και παραµένει πτωχή καθόλη τη διάρκεια της χρόνιας νόσου 116. Αντίθετα οι ασθενείς µε αυτοπεριορισθείσα οξεία ηπατίτιδα C, διατηρούν την έντονη CD4+ ειδική του ιού απάντηση για πολλά χρόνια ή και επ αόριστο χρόνο. Η ελάττωση της CD4+T κυτταρικής απάντησης αφού έχει προηγηθεί η έντονη απάντηση στην οξεία νόσο, στους ασθενείς που θα µεταπέσουν σε χρονιότητα, αποτελεί ένα φαινόµενο ανεξήγητο. Κατά τη χρόνια νόσο, η CD4+ Τ κυτταρική απάντηση διατηρείται πολυκλωνική, αλλά κυρίως στρέφεται έναντι του 85

92 αντιγόνου του πυρήνα του HCV σε αντίθεση µε την αυτοπεριορισθείσα οξεία νόσο στην οποία η απάντηση στρέφεται έναντι των µη δoµικών αντιγόνων του HCV (ΝS3, ΝS4, ΝS5) και είναι έντονη 117. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι οι ασθενείς µε HCVRNA (+) χωρίς ένδειξη ενεργού νόσου σε ιστολογικό και ορολογικό επίπεδο, παρουσιάζαν σηµαντικά µεγαλύτερη απάντηση των περιφερικών λεµφοκυττάρων (CD4+) στην ικανότητα να πολλαπλασιάζονται παρουσία του πυρηνικού αντιγόνου του HCV σε σύγκριση µε ασθενείς µε ενδείξεις ενεργού χρόνιας ηπατίτιδας 124. Τα ευρήµατα αυτά όσον αφορά στην συµπεριφορά των CD4+ Τ κυττάρων στην ιστολογικά ανενεργό ηπατίτιδα C δείχνουν ότι τα CD4+ κύτταρα έχουν την ικανότητα να ελέγχουν ή να προστατεύουν το ήπαρ από την ηπατοκυτταρική βλάβη. Εντούτοις, τα ευρήµατα αυτά αµφισθητήθηκαν από άλλους ερευνητές. Αντίθετα, µελέτες σε ηπατικά CD4+ κύτταρα έδειξαν ότι στην χρόνια νόσο τα κύτταρα αυτά αναγνωρίζουν και απαντούν µόνον στην ΝS4 πρωτεϊνη και σε κανένα άλλο αντιγόνο του HCV. Σε µια προσπάθεια ερµηνείας της διαφορετικής συµπεριφοράς των περιφερικών µε τα ενδοηπατικά CD4+ Τ κύτταρα, διαπιστώθηκε ότι οι δύο αυτοί υποπληθυσµοί φέρουν διαφορετικούς υποδοχείς επιφανείας, γεγονός που δείχνει ότι υπάρχει διαµερισµατοποίηση των Τ κυτταρικών κλώνων στο ήπαρ 125, εκεί όπου τελικά στοχεύει ο HCV ως ηπατοτρόπος ιός. Σε άλλες µελέτες που έγιναν στις οποίες µελετήθηκε η Τ κυτταρική απάντηση των ενδοηπατικών και περιφερικών ειδικών του ιού CD4+ κυττάρων, διαπιστώθηκε η παρουσία λειτουργικά ενεργών Τ κυττάρων στο ήπαρ στους µισούς περίπου ασθενείς, τα οποία αναγνώριζαν πρωτεΐνες του πυρήνα και µη δοµικές πρωτεΐνες του HCV, ενώ το ποσοστό των κυττάρων αυτών στο περιφερικό αίµα ήταν µόνον 19%. Εντούτοις όµως, τα ευρήµατα αυτά δεν σχετίζονταν µε την ηπατική βλάβη ή το ιικό φορτίο 126. Ο ρόλος τελικά των κυττάρων αυτών στην εµµένουσα λοίµωξη δεν έχει πλήρως διευκρινισθεί διότι ούτε η ενδοηπατική, αλλά ούτε η περιφερική CD4+ T κυτταρική απάντηση φαίνεται να 86

93 σχετίζεται µε την ενεργότητα της νόσου ή την βαρύτητα της ηπατικής βλάβης. Παρόλα αυτά, φαίνεται ότι υπάρχει συσχέτιση µεταξύ της έντασης της απάντησης των HCV ειδικών CD4+ Τ κυττάρων του περιφερικού αίµατος και της κλινικής πορείας της νόσου, όπως διαπιστώθηκε από µελέτες στις οποίες παρατηρήθηκε ηπιότερη χρόνια νόσος (όσον αφορά της τρανσαµινάσες, την φλεγµονώδη δραστηριότητα και την ίνωση) όταν η απάντηση αυτή ήταν έντονη 117,124. Η CD8+ Τ κυτταρική απάντηση έναντι του ιού Τα ειδικά έναντι του ιού CD8+ Τ κύτταρα αποτελούν και τα τελικά δραστικά κύτταρα έναντι του HCV. Τα CD8+ Τ κύτταρα αναγνωρίζουν ιικά πεπτίδια τα οποία παρουσιάζονται µαζί µε µόρια τάξης Ι του MHC επάνω στα µολυσµένα από τον ιό κύτταρα. Η αντι-ιική τους δράση µεσολαβείται, είτε µέσω της λύσης των µολυσµένων κυττάρων, είτε µε µη-κυτταρολυτικούς µηχανισµούς µέσω της καταστολής του πολλαπλασιασµού του ιού υπό την επίδραση κυτταροκινών (IFN-γ, TNFa). Η παρουσία ειδικών του HCV CD8+ Τ κυττάρων (CTL) στη χρόνια HCV λοίµωξη έχει τεκµηριωθεί όπως φαίνεται από µια σειρά µελετών. Τα κύτταρα αυτά αναγνωρίζουν και στρέφονται έναντι πολλών επιτόπων από τις δοµικές και µη περιοχές του HCV. Η διαφοροποίηση των CD8+Τ κυττάρων σε CTL κύτταρα, ειδικά του HCV, στο περιφερικό αίµα, επέρχεται κυρίως µετά από in vitro διέγερση των κυττάρων αυτών µε αντιγόνα του HCV, σε αντίθεση µε τα ενδοηπατικά CD8+Τ κύτταρα, τα οποία είναι ήδη διαφοροποιηµένα σε CTL κύτταρα. Τα ευρήµατα αυτά δείχνουν ότι ο αριθµός των CTL κυττάρων είναι µικρός στο περιφερικό αίµα και ότι τα κύτταρα αυτά ευρίσκονται κατεξοχήν στον τόπο της βλάβης, δηλαδή στο ήπαρ 127. CD8+ (CTL) Τ κυτταρική απάντηση έναντι του HCV παρατηρείται τόσο στο ήπαρ όσο και στο περιφερικό αίµα κατά την οξεία ηπατίτιδα και σχετίζεται άµεσα µε την εξέλιξη της οξείας νόσου : η πρώιµη, έντονη και πολυκλωνική ενδοηπατική κυτταροτοξική Τ απάντηση (CTL) σχετίζεται µε εξουδετέρωση 87

94 του HCV, όπως διαπιστώθηκε στο πειραµατικό µοντέλο (χιµπατζή) 128 και στον άνθρωπο από την έντονη απάντηση των περιφερικών CTL Τ κυττάρων 129. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι κατά την οξεία νόσο η οποία αυτοπεριορίζεται, διακρίνονται δύο διαφορετικοί υποπληθυσµοί ειδικών του HCV CD8+ T κυττάρων: α) στην υπεροξεία αρχική φάση τα CD8+ T κύτταρα είναι έντονα ενεργοποιηµένα (CD38+ και CD69+) αλλά δεν παράγουν IFN-γ και σχετίζονται µε την έναρξη της ηπατικής φλεγµονώδους αντίδρασης και β) στην οξεία φάση που ακολουθεί την υπεροξεία, η εξουδετέρωση του ιού και η ύφεση της ηπατικής φλεγµονής σχετίζεται µε την παρουσία λιγότερο ενεργοποιηµένων CD8+ Τ κυττάρων και παραγωγή IFN-γ 129,130. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι ο αριθµός των HCV ειδικών CD8+ κυττάρων είναι µεγαλύτερος τις πρώτες εβδοµάδες µετά την λοίµωξη και σχετίζεται µε την ηπατική φλεγµονή 131. Εντούτοις διαπιστώθηκε, όπως και για τα CD4+ Τ κύτταρα, ότι το εύρος (η αναγνώριση επιτόπων του HCV) της CD8+ Τ απάντησης δεν διαφέρει στην οξεία ηπατίτιδα η οποία θα εξελιχθεί σε χρόνια από αυτήν που θα αυτοπεριορισθεί. Στη συνέχεια όµως, µε την εγκατάσταση της χρόνιας νόσου, τόσο το εύρος όσο και η ένταση της ελαττώνεται, ενώ παραµένει ίδια µε την οξεία νόσο στους ασθενείς µε αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C. Η πτωχή CD8+ απάντηση των ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα C, φαίνεται να αφορά µόνον τον HCV εφόσον διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς αυτοί, διατηρούν την ικανότητα να εγείρουν µια αποτελεσµατική απάντηση έναντι άλλων ιών 129. 'Οσον αφορά στον ρόλο των CD8+ Τ κυττάρων στην εξέλιξη της χρόνιας ηπατίτιδας C, δε διαπιστώθηκε συσχέτιση µε την ενεργότητα της νόσου ή µε την παραµονή ή εξουδετέρωση του HCV. Παρόλα αυτά, φαίνεται ότι υπάρχει µια ανάστροφη συσχέτιση µεταξύ της CD8+ Τ απάντησης στο περιφερικό αίµα και του ιικού φορτίου ή των επιπέδων των τρανσαµινασών σε πειραµατικό επίπεδο

95 Παρόµοια, διαπιστώθηκε ότι η παρουσία CTL ενδοηπατικής απάντησης συσχετίζονταν µε χαµηλό ιικό φορτίο στο ήπαρ, αλλά αντίθετα µε το περιφερικό αίµα, η ηπατική διήθηση µε CTL κύτταρα παρουσίαζε µικρή συσχέτιση µε τα επίπεδα των τρανσαµινασών 133. Τελικά, φαίνεται ότι ο ρόλος των CD8+ Τ κυττάρων είναι δύσκολο να διευκρινισθεί και τα αποτελέσµατα των διαφόρων µελετών είναι συχνά αντιφατικά, αν και πιθανολογείται ότι η ανεπαρκής HCV-ειδική CTL αντίδραση αδυνατεί να καταστρέψει όλα τα µολυσµένα από τον ιό ηπατοκύτταρα µε απώτερο αποτέλεσµα, την παραµονή του ιού. Επιπλέον, αυτή η συνεχής ανεπαρκής CTL απάντηση είναι δυνατόν να ευθύνεται και για τη χρόνια ηπατική βλάβη. Υπερ της άποψης αυτής είναι και τα ευρήµατα µελετών στις οποίες διαπιστώθηκε η παρουσία ενεργοποιηµένων CD8+ Τ κυττάρων, τα οποία συνιστούσαν ένα σηµαντικό αριθµό των ενδοηπατικών ενεργοποιηµένων Τ κυττάρων σε ασθενείς µε χρόνια νόσο, συνηγορώντας υπέρ του ρόλου-κλειδί των ειδικών CTL κυττάρων στην καταστροφή του ηπατικού παρεγχύµατος 125. Ε.Ανοσιακοί µηχανισµοί που συµµετέχουν στον περιορισµό του ιού και στην πρόκληση της ηπατικής βλάβης. Μηχανισµοί διαφυγής του ιού Στην συνολική ανοσιακή απάντηση έναντι των ιών συµµετέχουν, όπως είναι γνωστό, τα CD4+-HLA τάξης ΙΙ περιορισµού-τ κύτταρα, τα οποία ενεργοποιούνται από αντιγόνα που έχουν ενδοκυττωθεί και επεξεργασθεί από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και τα CTL-HLA τάξης Ι περιορισµού-τ κύτταρα, τα οποία αναγνωρίζουν ιικά πεπτίδια επάνω στα µολυσµένα από τον ιό κύτταρα. Τα CTL όµως κύτταρα πριν προκαλέσουν τον θάνατο των µολυσµένων από τον ιό κυττάρων θα πρέπει να ενεργοποιηθούν µε 2 τρόπους α) µέσω της IL-2 η οποία παράγεται µετά την ενεργοποίηση των CD4+ Τ κυττάρων από τα APC, β) την 89

96 αναγνώριση των ιικών αντιγόνων µαζί µε µόρια τάξης Ι του HLA στην επιφάνεια των µολυσµένων κυττάρων. Μετά την ενεργοποίηση τους, τα CD8+ Τ κύτταρα πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται σε CTL κύτταρα τα οποία στη συνέχεια προκαλούν τον θάνατο των µολυσµένων από τον ιό κυττάρων στόχων τα οποία φέρουν στην επιφάνεια τους τα ιικά αντιγόνα µαζί µε τάξης Ι µόρια του HLA (MHC). Η κυτταροτοξική τους δράση επιτυγχάνεται ως εξής : α) µέσω του σχηµατισµού διαµεµβρανικών καναλίων στα κύτταρα στόχους, η οποία επιτελείται από την επίδραση µορίων τα οποία εκκρίνονται από τα CTL π.χ. την περφορίνη. Αποτέλεσµα της αύξησης της διαπερατότητας της κυτταρικής µεµβράνης των κυττάρων στόχων είναι ο θάνατος του κυττάρου µε την είσοδο ύδατος. Επιπλέον, η έκκριση από τα CTL µιας σειράς πρωτεασών της σερίνης οι οποίες εισέρχονται στο κύτταρο στόχο και αντιδρούν µε ενδοκυττάρια συστατικά του κυττάρου, προάγει την απόπτωση 134. β) µετα από αντίδραση του Fas/Apo1 αντιγόνου στην επιφάνεια του κυττάρου στόχου µε τον συνδέτη (υποδοχέα) επάνω στο ενεργοποιηµένο CD8+T κύτταρο προάγεται η απόπτωση 135. γ) µε την παραγωγή IFN-γ και TNF-α από το ενεργοποιηµένο CTL κύτταρο, οι οποίες όπως είναι γνωστό ανακόπτουν άµεσα τον ιικό πολλαπλασιασµό στα µολυσµένα κύτταρα. Μετά τη δροµολόγηση των παραπάνω κυτταροτοξικών µηχανισµών στο συγκεκριµένο κύτταρο στόχο, το CTL αποσπάται από αυτό και επιτίθεται σε άλλο γειτονικό µολυσµένο από τον ιό κύτταρο. Στην ΗCV λοίµωξη υπάρχουν σαφείς ενδείξεις 127 των µηχανισµών καταστροφής των µολυσµένων από τον ιό ηπατοκυττάρων από τα CTL όπως: α) η ηπατική έκφραση του c- fas είναι αυξηµένη στη χρόνια HCV λοίµωξη, ιδιαίτερα στις περιοχές όπου τα ηπατοκύτταρα βρίσκονται κοντά στις λεµφοκυτταρικές διηθήσεις, β) υπάρχει παραγωγή IFN-γ και TNF-α όταν τα CTL αναγνωρίζουν αντιγόνα του HCV επάνω στα ηπατοκύτταρα, όπως επίσης και άλλων κυτταροκινών (GM- 90

97 CSF, IL-8) oι οποίες προάγουν την παραγωγή πολυµορφοπυρήνων και µακροφάγων ή δρουν ως χηµειοτακτικοί παράγοντες για τα πολυµορφοπύρηνα, γ) τα ειδικά του HCV Τ κύτταρα υπόκεινται σε αυξηµένη απόπτωση µετά την έκθεσή τους σε µολυσµένα από τον ιό ηπατοκύτταρα. Εντούτοις, παρά το γεγονός αυτό, οι µηχανισµοί που διέπουν την µη εξουδετέρωση του ιού και την µετάπτωση της νόσου σε χρονιότητα δεν έχουν ακόµη διευκρινισθεί επακριβώς. Επίσης, δεν είναι γνωστό αν τελικά η µη ισχυρή CD4+/CD8+ Τ κυτταρική απάντηση έναντι του ιού ευθύνεται για την εµµένουσα λοίµωξη. Πρόσφατες µελέτες 136 έθεσαν το εξής σκεπτικό: είναι δυνατόν όχι µόνον τα ειδικά αλλά και τα µη ειδικά του HCV κύτταρα να διαταράσσονται στην HCV λοίµωξη και οι λειτουργικές διαταραχές που παρατηρούνται στην Τ κυτταρική ανοσιακή απάντηση στην ΗCV λοίµωξη µπορεί να µη σχετίζονται µόνον µε την ειδική του αντιγόνου απάντηση. Για παράδειγµα, διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη του πυρήνα του HCV ασκεί ρόλο ανοσοκατασταλτικό όσον αφορά στην ωρίµανση των CTL, που οδηγεί τελικά στην εµφάνιση ενός πληθυσµού CCR7-αρνητικών δραστικών κυττάρων 137, τα οποία παρουσιάζουν διαταραχή στην ικανότητα τους για απάντηση. Επειδή στο ήπαρ υπάρχει η µεγαλύτερη ποσότητα του HCV που πολλαπλασιάζεται, η συγκέντρωση µη-λειτουργικών CCR7- CD8+ Τ κυττάρων, η οποία παρατηρείται σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C θα µπορούσε να αποτελεί µια βασική αιτία µη εξουδετέρωσης του ιού. Ένα άλλο σηµείο/µηχανισµός διαταραχής των CD8+ T κυττάρων είναι η ανεύρεση διαταραχής της ενεργοποίησης των CD8+ Τ κυττάρων του ήπατος µέσω του υποδοχέα του (TCR) 136. Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι τα CD4+CD25+ ρυθµιστικά Τ κύτταρα (Treg) τα oποία είναι ιδιαίτερα ενεργά στη χρόνια λοίµωξη δρουν προκαλώντας ανοσοκαταστολή, καταστέλλοντας δηλαδή, την CD8+ Τ κυτταρική απάντηση έναντι του HCV 138,

98 Η σηµασία των Tregs στη χρόνια HCV λοίµωξη και η επίδραση τους στη CD4+ Τ κυτταρική απάντηση µελετήθηκε πρόσφατα σε ασθενείς µε χρόνια HCV λοίµωξη µε αυξηµένες ή φυσιολογικές τρανσαµινάσες. ιαπιστώθηκε ότι α) τόσο η παραγωγή IFN-γ όσο και η ικανότητα των CD4+ Τ κυττάρων να πολλαπλασιάζονται in vitro ήταν µεγαλύτερες στους ασθενείς µε αυξηµένες τρανσαµινάσες και β) υπήρχε µια ανάστροφη συσχέτιση µεταξύ της ειδικής του ιού TGF-β απάντησης από τα Treg σε σχέση µε τις τρανσαµινάσες. Τα ευρήµατα αυτά συνηγορούν ότι η αύξηση των ειδικών του HCV Treg προκαλεί ελάττωση της ειδικής του ιού CD4+T κυτταρικής απάντησης µε αποτέλεσµα µικρότερη χρόνια φλεγµονώδη αντίδραση και ηπατοκυτταρική βλαβη όπως διαπιστώνεται µε τα φυσιολογικά επίπεδα τρανσαµινασών στον ορό, εις βάρος βέβαια της εξουδετέρωσης του ιού 75. Η διαταραχή αυτή των CD4+ Τ κυττάρων θα µπορούσε επίσης να εµπλέκεται στη διαταραχή των CD8+ T κυττάρων, εφόσον ένα µείζον σήµα ενεργοποίησης και διαφοροποίησης των κυττάρων αυτών προέρχεται από τη σωστή και ικανή ενεργοποίηση αρχικά των HCV ειδικών CD4+ κυττάρων 120. Την ειδική ανοσοκατασταλτική δράση των CD4+CD25+(Treg) κυττάρων θα µπορούσε να την εκτιµήσει κανείς και από µία άλλη σκοπιά : στα πλαίσια της οµοιόστασης, το ανοσιακό σύστηµα προβάλει µια σειρά ανοσοκαταλτικών µηχανισµών στην προσπάθειά του να ελαττώσει µία εκσεσηµασµένη ιστική βλάβη ως αποτέλεσµα των Τ κυτταρικών απαντήσεων έναντι κάποιου αντιγόνου, υπό τη µορφή της ενεργοποίησης των Tregs ή των ειδικών του HCV CD8+ Τ ρυθµιστικών κυττάρων που παράγουν IL , ή µέσω του µηχανισµού εξάντλησης (exhaustion) των Τ κυτταρικών απαντήσεων µε την έκφραση του µορίου PD-1, έναν υποδοχέα θανάτου, ο συνδέτης του οποίου υπερεκφράζεται στα µολυσµένα από τον ιό κύτταρα 114. 'Eνας άλλος πιθανός µηχανισµός βασίζεται στο γεγονός ότι η ειδική του HCV Τ κυτταρική απάντηση και η στη συνέχεια µεταφορά της στο ήπαρ επέρχεται 5-9 εβδοµάδες µετά την 92

99 είσοδο του HCV, όταν αντίθετα το ιικό φορτίο αυξάνει ήδη στην πρώτη εβδοµάδα 141. Για την καθυστέρηση αυτή της εµφάνισης της ειδικής ανοσίας έχουν προταθεί διάφοροι λόγοι : α) ιαταραχή σε επίπεδο δενδριτικών κυττάρων και κατά συνέπεια διαταραχή της αντιγονοπαρουσίασης, β) Λόγω του αυξηµένου ρυθµού του πολλαπλασιασµού του HCV, ο ιός υπερσκελίζει την ειδική ανοσιακή απάντηση. Η παρουσία σχεδόν ιών και µεταλλάξεων όπως και ο ταχύς ρυθµός πολλαπλασιασµού του HCV συµβάλουν στην ταχεία διαφοροποίηση του ιικού πληθυσµού. Οι αντιγονικές µεταβολές επηρεάζουν την κυτταροτοξική απάντηση ελαττώνοντας τη συγγένεια σύνδεσης του αντιγονικού πεπτιδίου µε τα µόρια MHC, επηρεάζοντας την αντίδραση συµπλέγµατος πεπτιδίου- MHC µε τον Τ κυτταρικό υποδοχέα (TCR) και µεταβιβάζοντας διαφορετικό µήνυµα προς το Τ κύτταρο που τελικά απενεργοποιεί. Η παρέµβαση στην παρουσίαση του αντιγόνου επιβεβαιώνεται από τη διαπίστωση ότι ένα µεταλλαγµένο πεπτιδικό τµήµα της αντιγονικής περιοχής του πυρήνα του HCV, το οποίο δεν αναγνωρίζεται από το Τ κύτταρο, συνδεόµενο µε τα µόρια MHC II δρα ανταγωνιστικά, αποτρέποντας την αναγνώριση του αντιγόνου από τα Τ κύτταρα. Επίσης διαπιστώθηκε ότι ένας µεταλλαγµένος επίτοπος στην περιοχή NS3 του HCV δρα ανταγωνιστικά έναντι των CTL 142, 143, 144, 103. Με άλλα λόγια, η επιλογή επιτόπου υπαγορεύει την επάρκεια της ανοσιακής απάντησης µέσα στο ήπαρ, όπως και το εύρος της ανοσιακής απάντησης η οποία στη συνέχεια προδικάζει την ικανότητα του ιού που πολλαπλασιάζεται να διαφύγει της Τ κυτταρικής απάντησης. Μετά την εγκατάσταση της διαφυγής είναι πολύ δύσκολο να αναλάβει η ανοσιακή απάντηση τον έλεγχο του HCV λόγω εξάντλησης (όπως αναφέρθηκε παραπάνω) ή αδυναµίας νέας ανοσιακής απάντησης έναντι των αναδυοµένων µεταλλαγµένων στελεχών. Έτσι όταν µια τέτοια κατάσταση έχει εδραιωθεί η 93

100 εγκατάσταση της χρόνιας νόσου είναι πλέον αναπόφευκτη 145,146,147. γ) Αρκετοί ερευνητές διαπίστωσαν ότι υπάρχει ατελής διαφοροποίηση και διαταραχή της λειτουργίας των HCV-ειδικών T κυττάρων. Θεωρήθηκε ότι σχετική ανεπάρκεια της IL-2 στην οξεία φάση της λοίµωξης ευθύνεται για την ασθενή CD8+ T κυτταρικής απάντησης 137. δ) Υπάρχει διαφοροποίηση και διαταραχή της ισορροπίας των ΤΗ1/ΤΗ2 τύπου κυτταροκινών ε) Οι εξωηπατικές δεξαµενές του HCV αποτελούν έναν ακόµη τρόπο διαφυγής του ιού 148. Ο ΗCV παράγει αντιγόνα, τα οποία όχι µόνον µεταβάλλουν την κυτταρική ανοσιακή απάντηση, αλλά εισβάλουν σε άλλα κύτταρα του ανοσιακού συστήµατος. Πράγµατι, διαπιστώθηκε µε PCR, η παρουσία γονιδιακού υλικού του HCV και αρνητικής αλύσου HCVRNA µέσα στα λεµφοκύτταρα του περιφερικού αίµατος σε χρόνιους HCV ασθενείς και όχι σε HCV φορείς, ευρήµατα που δείχνουν ότι ο HCV όχι µόνον διηθεί τα λεµφοκύτταρα του περιφερικού αίµατος αλλά και πολλαπλασιάζεται µέσα σ αυτά 149,150, όπως και το ίδιο διαπιστώθηκε ότι συµβαίνει και σε άλλους ιστούς. Η πιθανότητα ότι οι εξωηπατικοί αυτοί ιστοί λειτουργώντας ως δεξαµενές του HCV να παίζουν έναν σηµαντικό ρόλο στην παραµονή του HCV µεταβάλλοντας την ανοσιακή απάντηση ή επάγοντας την επαναµόλυνση -ή συνεχή µόλυνση- των ηπατοκυττάρων, συζητείται µεταξύ των ερευνητών. 94

101 Σχήµα 10. Πιθανή επίδραση του HCV στην αντι-ιική δράση των δενδριτικών κυττάρων ανεπαρκής ενεργοποίηση ΝΚ NK λύση µολυσµένων κυττάρων Μυελοειδές δενδριτικό κύτταρο Ώριµο δενδριτικό κύτταρο IL-12 ελαττωµατική αντιγονοπαρουσίαση στα Τ-κύτταρα CD4 CD8 CD4 CD4 CD4 κυτταροκίνες ανεπαρκής Τ-κυτταρική ενεργοποίηση και έκπτυξη Χρόνια λοίµωξη Ιογενή νουκλεϊκά οξέα ήπρωτεΐνες διαταραχή ενεργοποίησης και ωρίµανσης δενδριτικών κυττάρων CD8 CD8 CD8 λύση µολυσµένων κυττάρων Ηπατοκύτταρο ανοσοτροποποιητικές δράσεις Πλασµατοκυτταροειδές δενδριτικό κύτταρο IFN-I αντιϊικές δράσεις 95

102 Σχήµα 11. Ειδικοί έναντι του HCV ανοσιακοί µηχανισµοί που συµµετέχουν στην κάθαρση του ιού Ήπαρ HCV MHC I IL-2 TCR CTL Κυτταροτοξικότητα IFNγ TNFα CD40L TCR Th CD40 IL-4, IL-5 MHC I TCR MHC II B ενδριτικό κύτταρο Y Y Y Y Y Y Έκκριση αντισωµάτων 96

103 Σχήµα 12. Ο ρόλος των Τ κυτταρικών απαντήσεων στην καταστροφή του ήπατος και στην εξέλιξη της νόσου Ιός Ιικό πεπτίδιο MHC-I TCR Μολυσµένο από ιό κύτταρο στόχος φόνευση ραστικό CTL 97

104 Σχήµα 13. Ρύθµιση της διαφοροποίησης των δραστικών ανοσοικανών κυττάρων από ιικούς παράγοντες στην HCV λοίµωξη HCVcore CCR7- τελικά διαφοροποιηµένα δραστικά CTLs ενδριτικό κύτταρο CCR7+ παρθένα ή κεντρικά µνήµονα CTLs pmapks IL-2 CCR7+ κεντρικά µνήµονα CTLs CCR7- ηµί-δραστικά CTLs Η χρόνια χαµηλού-επιπέδου φλεγµονή εξασφαλίζει: - ιική εµµονή - µακράς διάρκειας επιβίωση του ξενιστή 98

105 Σχήµα 14. Ρύθµιση της διαφοροποίησης των δραστικών ανοσοικανών κυττάρων από τους ιικούς παράγοντες στην HCV λοίµωξη Ιικοί µηχανισµοί: - διαφυγή µε µεταλλάξεις - «υπονόµευση» ανοσιακού συστήµατος φλεγµονώδεις ιστοί Μηχανισµοί του ξενιστή: - ρυθµιστικά Τ-κύτταρα - Τ-κυτταρική εξάντληση (PD-1/PD-L1 διαµεσολάβηση;;;) Εµµένουσα αντιγονική πρόκληση (χρόνια HCV λοίµωξη) CCR7-/CD62Lδραστικά CTLs Εµµένουσα αντιγονική πρόκληση ενδριτικό κύτταρο CCR7+/CD62L+ παρθένα CTLs CCR7+/CD62L+ κεντρικά µνήµονα CTLs λεµφικά όργανα Ηχρόνιαχαµηλού-επιπέδου φλεγµονή: - περιορισµένη ανοσοπαθολογία - περιορισµένη ιική διασπορά - εξασφάλιση επιβίωσης µακράς διάρκειας στον ξενιστή 99

106 Σχήµα 15. Ρύθµιση της ενεργοποίησης των CD8 Τ κυττάρων µέσω της έκφρασης της PD1 στα CD8 Τ κύτταρα κατά την χρόνια λοίµωξη Η PD-1/PD-L1 αλληλεπίδραση επάγει την εξάντληση των CD8+ κυττάρων LCMV CD8+ T-κύτταρο αναστολή PD-1 PD-L1 TCR MHC Y Y ενεργοποίηση Κύτταρο µολυσµένο από ιό Y Y Αντί-PD-L1 αντισώµατα Y πολλαπλασιασµός IFNγ καιtnfα κυτταροτοξικότητα ιός Η χορήγηση αντί-pd-l1 αντισωµάτων αποκαθιστά την Τ-κυτταρική ενεργοποίηση 100

107 Σχήµα 16. Ρύθµιση της διαφοροποίησης των δραστικών κυττάρων από ιικούς παράγοντες και παράγοντες του ξενιστή στην HCV λοίµωξη Ρυθµιστικά CD8+ LILs Ελέγχουν τα δραστικά κύτταρα στη θέση της λοίµωξης σε επαρκή βαθµόπροκειµένου να «συγκρατούν» το παρασιτούµενο παθογόνο CD4+/CD25+/FoxP3+ Tregs HCVcore IL-10 CCR7- τελικά διαφοροποιηµένα δραστικά CTLs CCR7- ηµί-δραστικά CTLs καταστολή IL-2 ενδριτικό κύτταρο CCR7+ παρθένα ή κεντρικά µνήµονα CTLs CCR7+ κεντρικά µνήµονα CTLs ιατηρούν τα µνήµονα Τ-κύτταρα Καταστέλλουν παθολογικές αντιµικροβιακές ανοσιακές αποκρίσεις που προκαλούν ιστική καταστροφή, επιτρέποντας στον ξενιστή επιβίωση µακράς διάρκειας 101

108 Σχήµα 17.Μηχανισµοί διαφυγής του HCV από τις ανοσιακές απαντήσεις του ξενιστή ΗΠΑΡ ΛΕΜΦΑ ΕΝΕΣ ΑΙΜΑ ΗΠΑΡ Φυσική ανοσιακή απόκριση Μολυσµένα ηπατοκύτταρα HCV TGF-β Κ IL-10 IFN-α/β NK HCV Αντίσταση στη δράση των τύπου Ι IFN;; πρόσληψη HCV αντιγόνων τροποποίηση της λειτουργίας των Κ;; CD94/ NKG2A CD81 αναστολή των ΝΚ από τις HCV πρωτεΐνες του φακέλου;; CD25 Foxp3 CD4 CD8 CD8 HCVcore IL-2 IL-12 C1qR C1qR αναστολή από Treg CD4 µειωµένος πολλαπλασιασµός Κ µειωµένη Τ-κυτταρική πρωτοευαισθητοποίηση Τ-κυτταρική βοήθεια Y Y Y Επίκτητη ανοσιακή απόκριση διαταραγµένη διαφοροποίηση και ωρίµανση;; CD8 CD8 Y B CD4 CD4 CD4 CD4 CD4 CD8 CD4 CXCR3+ CCR5+ B B B HCV HCV µεταλλάξεις: διαφυγή από τηναντισωµατική και Τ-κυτταρική απόκριση καθυστερηµένη και περιορισµένη χυµική ανοσιακή απόκριση καθυστερηµένη κυκλοφορία προς το ήπαρ;; πολυ-και µονοκλωνική Β-κυτταρική έκπτυξη διαταραγµένες δραστικές λειτουργίες B B HCV B CXCR3+ CCR5+ IL

109 ΣΤ. Ο ρόλος των κυτταροκινών Οι κυτταροκίνες και ιδιαίτερα αυτές που παράγονται από τα CD4+ Τ κύτταρα, παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ανοσιακή απάντηση, µετά τη διαφοροποίησή τους σε ΤΗ1 και ΤΗ2 τύπου και τη διατήρηση της ισορροπίας τους ή την υπερίσχυση κάποιου τύπου ανοσιακής απάντησης. Οι κυτταροκίνες διαδραµατίζουν βασικό ρόλο στην άµυνα έναντι των ιογενών λοιµώξεων, καθορίζοντας το είδος ή την επικράτηση κάποιας ανοσιακής απάντησης του ξενιστή και αναστέλλοντας άµεσα τον πολλαπλασιασµό του ιού. Εντούτοις, στα πλαίσια της φλεγµονώδους αντίδρασης που προκαλούν, είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε ιστική βλάβη 151. Κατά συνέπεια, φαίνεται ότι επηρεάζουν την έκβαση της ιογενούς λοίµωξης και καθορίζουν την ισορροπία µεταξύ άµυνας και ιστικής καταστροφής. Οπως είναι γνωστό, οι ΤΗ1 και ΤΗ2 τύπου κυτταροκίνες, όπως άλλωστε και όλες οι κυτταροκίνες, παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ενορχήστρωση ποικίλων φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών 125. Η συνολική ανοσιακή απάντηση και ιδιαίτερα ο ρόλος των κυτταροκινών στην χρόνια HCV λοίµωξη δεν έχει πλήρως διευκρινισθεί, διότι ο HCV φαίνεται ότι παρουσιάζει ανθεκτικότητα έναντι της δράσης των κυτταροκινών και τελικά η εµµένουσα φλεγµονώδης αντίδραση έχει ως αποτέλεσµα την καταστροφή του ήπατος και την αδυναµία πλήρους κάθαρσης του ιού. Ορισµένοι µάλιστα ερευνητές πιστεύουν ότι υπάρχει µια «ανορθόδοξη» συµπεριφορά των ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκινών στην χρόνια ηπατίτιδα C, έναντι αντιγόνων του HCV, η οποία οδηγεί σε εκρίζωση του ιού µόνον σε µια µειονότητα των ασθενών 152. Ένα επιπρόσθετο χαρακτηριστικό της χρόνιας HCV λοίµωξης αποτελεί το γεγονός ότι τα επίπεδα της ιαιµίας δεν σχετίζονται µε την εξέλιξη της ηπατικής φλεγµονής. Ενώ λοιπόν υπάρχει ελεύθερος ιός στον ορό των ασθενών, ορισµένοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι ο HCV εκτός από τα ηπατοκύτταρα µολύνει και τα περιφερικά λεµφοκύτταρα και µάλιστα θεωρούν ότι το 103

110 CD81 µόριο λειτουργεί ως υποδοχέας του HCV στα Β λεµφοκύτταρα 152. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι οι περισσότεροι ασθενείς παράγουν ΤΗ2 τύπου κυτταροκίνες µετά από διέγερση των περιφερικών λεµφοκυττάρων µε αντιγόνα του HCV, συνηγορώντας ότι υπάρχει ανοχή έναντι του HCV στο περιφερικό αίµα παρά την παρουσία µιας ΤΗ1 τύπου απάντησης στο ηπατικό παρέγχυµα. Ετσι λοιπόν προτείνουν τα εξής : το περιφερικό αίµα αποτελεί µια «δεξαµενή» του HCV, από την οποία συνεχώς επαναµολύνεται το ήπαρ 149, 153, 154. Εντούτοις, άλλοι ερευνητές, όπως θα αναφερθεί παρακάτω, δεν συµφωνούν µε τα ευρήµατα αυτά. Γεγονός παραµένει ότι η ανοσιακή απάντηση ΤΗ1 ή ΤΗ2 τύπου συµµετέχει ουσιαστικά στην έκβαση της HCV λοίµωξης και για το λόγο αυτό συγκέντρωσε τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών, οι οποίοι µελέτησαν τα επίπεδα των κυτταροκινών αυτών στον ορό των ασθενών, την έκφραση του mrna των κυτταροκινών στα περιφερικά αλλά και στα ηπατικά λεµφοκύτταρα, την ικανότητα παραγωγής τους σε καλλιέργειες λεµφοκυττάρων παρουσία αντιγόνων του HCV ή την αποτύπωση-σε ένα επίπεδο- των κυτταροκινών στα ηπατικά ή περιφερικά λεµφοκύτταρα. Τα ευρήµατα των µελετών αυτών είναι αντιφατικά και το γεγονός αυτό, µερικώς τουλάχιστον, φαίνεται να οφείλεται στη διαφορετική ευαισθησία των µεθόδων που χρησιµοποιήθηκαν, όπως και στην επιλογή των οµάδων των ασθενών και των οµάδων των µαρτύρων. Ετσι, οι µελέτες ανίχνευσης των ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκινών στον ορό των ασθενών έδειξαν : 1) Αύξηση όλων των κυτταροκινών ΤΗ1 και ΤΗ2 τύπου 153 2) Σηµαντική αύξηση της IL-10 η οποία µάλιστα ήταν αυξηµένη σε όλες τις οµάδες ασθενών: στους ασθενείς µε χρόνια ΗCV λοίµωξη µε ή χωρίς κίρρωση και στους HCV φορείς, και αύξηση της IL-15 (η οποία µοιράζεται πολλές ανοσιακές δραστηριότητες µε την IL-10) σε όλους τους ασθενείς. Η αύξηση αυτών των δύο κυτταροκινών θεωρήθηκε ότι αντανακλά το βαθµό της 104

111 φλεγµονής στο ήπαρ και την εξέλιξη της χρόνιας νόσου προς ηπατοκυτταρικό καρκίνο )Αύξηση της IL-12 στον ορό σε υψηλά επίπεδα. Η IL-12 είναι µια κυτταροκίνη η οποία παράγεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα σε απάντηση σε αντιγονικά ερεθίσµατα και προάγει την κυτταρική ανοσία και την επικράτηση της ΤΗ1 τύπου ανοσιακής απάντησης. Παρουσία ενός δεύτερου αντιγονικού ερεθίσµατος, της IFN-γ, αυξάνει η έκφραση της IL-12 στα µονοκύτταρα. Η IL-12 διαπιστώθηκε ότι αναστρέφει την ανοσιακή ανεπάρκεια που προκαλείται από τους ιούς. Οι ίδιοι ερευνητές µελέτησαν την παραγωγή της ΙL-12 σε υπερκείµενα καλλιεργειών περιφερικών µονοκυττάρων παρουσία IFN-γ και διέγερσης µε λιποπολυσακχαρίτη (LPS) και διαπίστωσαν αυξηµένη παραγωγή IL-12 στους ασθενείς. ιαπιστώθηκε ότι η ποσότητα της IL-12 που παράγονταν, σχετίζονταν θετικά µε τη βαρύτητα της νεκροφλεγµονώδους αντίδρασης στο ήπαρ. εν διαπιστώθηκε συσχέτιση µε τον γονότυπο ή τα επίπεδα της ιαιµίας, γεγονός το οποίο δείχνει ότι η κυτταροκίνη αυτή δεν συµµετέχει στην αναστολή του πολλαπλασιασµού του ιού 156. Ετσι, συµπεραίνεται ότι η IL-12 συµµετέχει τόσο στις ανοσιακές απαντήσεις κυτταρικής ανοσίας, προάγοντας µια ΤΗ1 απάντηση, η οποία στοχεύει στην κάθαρση του ιού από τα µολυσµένα κύτταρα 157, όσο και στην ανοσοπαθογένεια της χρόνιας νόσου ως κυτταροκίνη προάγουσα τη φλεγµονή )Αύξηση των επιπέδων της IL-4 στον ορό σε ποσοστό 49% και της ΙL-10 σε ποσοστό 30% των ασθενών, χωρίς να υπάρχει συσχέτιση µε το φύλο, την ηλικία, την οδό µετάδοσης, τα επίπεδα των ALT, την ιαιµία, τον γονότυπο ή την ιστολογία του ήπατος. Στο ήπαρ των ασθενών αυτών παρατηρήθηκαν CD30+ λεµφοκύτταρα τα οποία είχαν φαινότυπο ΤΗ2. Η ΙL-4 όµως δεν ανιχνεύθηκε στο ήπαρ γεγονός που συνηγορεί ότι οι ΤΗ2 κυτταροκίνες (σε χαµηλό επίπεδο) µάλλον αντανακλούν µια περιφερική απάντηση

112 Μια άλλη οµάδα µελετών εστιάστηκε στην έκφραση και έκκριση των ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκινών παρουσία ανασυνδυασµένων αντιγόνων του HCV : 1) Ενδιαφέρον παρουσιάζει η µελέτη των Tsai και συν 160 οι οποίοι µελέτησαν την έκφραση του mrna και την παραγωγή ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκινών σε καλλιέργειες περιφερικών µονοπυρήνων παρουσία ανασυνδυασµένων αντιγόνων του πυρήνα, του περιβλήµατος (Ε1, Ε2) και των µη δοµικών περιοχών του γονιδιώµατος του HCV (NS3/NS4/NS5) σε ασθενείς µε οξεία ηπατίτιδα C και στη συνέχεια ανέλυσαν τα ευρήµατά τους ανάλογα µε την εξέλιξη της οξείας νόσου. ιαπίστωσαν ότι: α) στους ασθενείς που στη συνέχεια η νόσος αυτοπεριορίσθηκε, παρατηρήθηκε παραγωγή και έκφραση της IFN-γ και της IL-2 και όχι των IL-4 και IL-10, β) στους ασθενείς οι οποίοι µετέπεσαν σε χρόνια νόσο, τα ευρήµατα ήταν παρόµοια αλλά σε σηµαντικά χαµηλότερα επίπεδα και παρατηρήθηκαν ΤΗ2 κλώνοι µετά από πολλαπλασιασµό των λεµφοκυττάρων παρουσία αντιγόνων του πυρήνα του HCV. Κατά συνέπεια, στους ασθενείς που µετέπεσαν σε χρονιότητα διαπιστώνεται µια µεικτή ΤΗ1 και ΤΗ2 ανοσιακή απάντηση. Η παρουσία της ΤΗ2 απάντησης φαίνεται ότι προστατεύει το ήπαρ από µια µαζική καταστροφή κατά την οξεία νόσο, εις βάρος όµως της κάθαρσης του ιού. 2) Σε άλλη µελέτη διαπιστώθηκε 161 : α) έκφραση του mrna των κυτταροκινών ΤΗ2 τύπου (IL-4, IL-6, IL-10) και ΤΗ3 τύπου (TGF-β) στα περιφερικά λεµφοκύτταρα σε µικρό µόνον αριθµό ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα C, β) η έκφραση των mrna των κυτταροκινών ΤΗ1 τύπου, όσον αφορά στην IFN-γ δεν διέφερε µεταξύ ασθενών και µαρτύρων όσο αφορά την IL-2 δεν παρατηρήθηκε καµιά έκφραση σε όλες τις οµάδες. Η έκφραση του mrna της IFN-γ τόσο στους µάρτυρες όσο και στους ασθενείς θα µπορούσε να αποδοθεί στην ευαισθησία της µεθόδου 106

113 (PCR) ή στον µεγαλύτερο χρόνο ζωής του mrna της ΙFN-γ σε σχέση µε το mrna της IL-2. 3) Η ικανότητα πολλαπλασιασµού των Τ κυττάρων, η έκκριση ΤΗ1-ΤΗ2 κυτταροκινών στα υπερκείµενα καλλιεργειών και η έκφραση των κυτταροκινών αυτών παρουσία του ΝS3 αντιγόνου του HCV έδειξε 162 : α) έντονη ικανότητα πολλαπλασιασµού των Τ κυττάρων σε όλους τους ασθενείς αλλά όχι στα φυσιολογικά άτοµα β) παρουσία του NS3 διαπιστώθηκε έκκριση IFN-γ και IL-10 και όχι της IL-2 γ) δεν διαπιστώθηκε έκφραση του mrna της IL-2, ενώ διαπιστώθηκε έκφραση του mrna της IL-4, της IL-15 και της IFN-γ. Το παράδοξο σε πολλές ιογενείς λοιµώξεις είναι ότι ενώ διαπιστώνεται αναγνώριση του ιού από το ανοσιακό σύστηµα, ο ιός παραµένει. Σε µια προσπάθεια ερµηνείας του φαινοµένου αυτού από τους ερευνητές, έχουν πιθανολογηθεί διάφοροι µηχανισµοί : α) Στη µελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι τα περιφερικά λεµφοκύτταρα των ασθενών διατηρούν την ικανότητα να απαντούν στο NS3 αντιγόνο. Παρά τη σηµαντική όµως απάντηση και την έγερση ικανότητας πολλαπλασιασµού, κανείς από τους ασθενείς δεν παρήγαγε σηµαντικές ποσότητες IL-2, ούτε και παρουσίασε έκφραση της IL-2 ενώ παρήγαγαν IFN-γ, IL-10, IL-4 και IL-15. Την ικανότητα πολλαπλασιασµού δυνατόν να διεγείρουν οι IL-4 και IL-15. Επιπλέον, η αυξηµένη παραγωγή της IL-10 είναι δυνατόν να ευθύνεται για τη µη παραγωγή της IL-2 λόγω αναστολής της ενεργοποίησης των CD80 και CD86 µορίων προσκόλλησης, τα οποία µεταφέρουν µήνυµα σταθεροποίησης της IL-2 µέσω του CD28. β) Επίσης, τα ευρήµατα πιθανολογούν ότι ο HCV ελαττώνει την ένταση της αντι-ιικής απάντησης µπλοκάροντας την ΙL-2 σε επίπεδο RNA. 107

114 4) ιαπιστώθηκε παραγωγή ΤΗ1 τύπου κυτταροκινών από τα περιφερικά λεµφοκύτταρα παρουσία των αντιγόνων NS3 και του πυρήνα του HCV σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C όπως ελέγχθηκε µε την ενζυµική τεχνική immunospot (Elispot) και συγκεκριµένα της IFN-γ και πολύ µικρή ποσότητα IL-5 και IL- 4, συνηγορώντας υπέρ του ότι η ειδική ανοσιακή απάντηση µέσω της IFN-γ είναι σηµαντική για την παθογένεση της εξελισσόµενης χρόνιας HCV νόσου ) Παρόµοια, σε µια πρόσφατη µελέτη, σε περιφερικά λεµφοκύτταρα µετά από καλλιέργεια παρουσία µη δοµικών αντιγόνων και αντιγόνου του πυρήνα του HCV διαπιστώθηκε µε τη µέθοδο Elispot ότι στη χρόνια ηπατίτιδα διατηρείται η ικανότητα παραγωγής IFN-γ αλλά µόνο λίγα κύτταρα παράγουν IL-2 σε αντίθεση µε ασθενείς στους οποίους η νόσος είχε αυτοπεριορισθεί και οι οποίοι παρήγαγαν IFN-γ και IL-2. Πιθανολογείται ότι η ελαττωµένη ικανότητα παραγωγής IL-2 στους ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C µπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της έκκρισης IFN-γ και στην ικανότητα πολλαπλασιασµού των κυττάρων, µια κατάσταση η οποία χαρακτηρίζει την κυτταρική ανοσιακή απάντηση τόσο των CD4+ όσο και των CD8+ κυττάρων στη χρόνια ηπατίτιδα C ) Σε µια άλλη µελέτη παρατηρήθηκαν τα εξής 165 : α)με την µέθοδο της κυτταροµετρίας, διαπιστώθηκε ότι µετά από ενεργοποίηση µε µιτογόνο η αναλογία των ΤΗ2 κυττάρων (IL-4+ ή IL-13+) ήταν σηµαντικά αυξηµένη στους υποπληθυσµούς των CD4+, CD8+, naïve CD45RA+ και στα µνηµονικά CD45RO+ Τ κύτταρα, χωρίς να υπάρχει διαφορά µεταξύ ασθενών και µαρτύρων β) Επίσης, στα υπερκείµενα των διεγερµένων µε µιτογόνο ολικών Τ κυττάρων (µε ELISA) η έκκριση κυτταροκινών δεν παρουσίαζε διαφορές µεταξύ ασθενών και οµάδες ελέγχου (controls). γ) Μετά θεραπεία µε IFN-α παρατηρήθηκε ελάττωση της απάντησης των ΤΗ1 κυτταροκινών σ αυτούς που αρνητικοποίησαν το HCVRNA 108

115 δ) Η έκφραση των κυτταροκινών των CD4+ µετά από τη διέγερση µε αντιγόνο του πυρήνα του HCV, έδειξε µεταβολή στην απάντηση των κυτταροκινών σε 74% των ασθενών και παραγωγή IFN-γ µόνον σε 26%. Συµπερασµατικά, δεν παρατηρείται µεταβολή της απάντησης των κυτταροκινών από ΤΗ1 τύπου σε ΤΗ2 στους ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C. Κατά συνέπεια, τα αποτελέσµατα της µελέτης αυτής είναι αντίθετα από άλλες µελέτες. Πιθανόν αυτό οφείλεται στη µεθοδολογία και ειδικότερα στη µέτρηση µε Elisa των κυτταροκινών σε δείγµα ορού των ασθενών διότι στον ορό υπάρχουν ειδικές πρωτεΐνες, οι οποίες συνδέονται στις κυτταροκίνες (π.χ. αυτοαντισώµατα, α2-µακροσφαιρίνη, ετεροφιλικά αντισώµατα, διαλυτοί υποδοχείς κυτταροκινών) οι οποίες και παρεµβαίνουν στην ανίχνευση των κυτταροκινών 166. Επιπλέον, η µέτρηση στον ορό των κυτταροκινών τις ανιχνεύει µετά τη σύνθεση της πρωτεΐνης τους, την κατανάλωσή τους και τη βιοδιάσπασή τους. Αντίθετα, η χρησιµοποιούµενη µέθοδος µε FACS ανάλυση προσδιορίζει την παραγωγή των κυτταροκινών από τα Τ λεµφοκύτταρα, ελέγχοντας συγχρόνως το είδος των λεµφοκυττάρων (µε προσδιορισµό δεικτών επιφανείας) που τα παράγουν και την παραγωγή των κυτταροκινών µαζί µε τον προσδιορισµό των κυτταροκινών στα υπερκείµενα των καλλιεργειών σε µη διαχωρισµένα (unfractioned) CD4, CD8 Τ λεµφοκυττάρων. Επιπλέον, µετά από διέγερση των CD4+ Τ κυττάρων µε αντιγόνο του πυρήνα του HCV, διαπιστώθηκε µια ικανή απάντηση σε επίπεδο κυτταροκινών και η απάντηση αυτή ήταν του τύπου της IFN-γ. Τα ευρήµατα αυτά συνηγορούν ότι στη χρόνια ηπατίτιδα C δεν υπάρχει «ακατάλληλη» ή µεγαλύτερη έκκριση ΤΗ2 τύπου κυτταροκινών, η οποία και θα εµπλέκονταν στην πρόκληση διαταραχής της λειτουργίας/µνήµης των Τ κυττάρων µνήµης σε επίπεδα κλώνων και ότι τα Τ δραστικά/µνήµης κύτταρα βρίσκονται σε διαρκή κίνηση µε λειτουργικά χαρακτηριστικά 109

116 ειδικού του αντιγόνου Τ κλώνου που βρίσκονται υπό την επίδραση αντιγόνου 167. Εντούτοις, πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη έµφαση στο γεγονός ότι η ικανότητα του ανοσιακού συστήµατος να προβάλει µια προστατευτική CD4+ δραστική απάντηση, δεν εξαρτάται µόνον από τα ειδικά του αντιγόνου µνηµονικά Τ κύτταρα αλλά και από τον λειτουργικό φαινότυπο των κυττάρων αυτών. Για τον λόγο αυτό, τα ευρήµατα της µελέτης αυτής συνηγορούν υπέρ των απόψεων αυτών, δηλαδή διαπιστώθηκε µόνον αύξηση της IFN-γ και καθόλου παραγωγή της IL-2. Kατά συνέπεια αυτή η έλλειψη παραγωγής της IL-2 µπορεί να ευθύνεται για την συνολική δραστική απάντηση έναντι του HCV, περιορίζοντας την στρατολόγηση, διαφοροποίηση και εξάπλωση/έκπτυξη (expansion) του CD8+ δραστικών Τ κυττάρων, ή των ΝΚ κυττάρων. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ευρήµατα των Lechman και συν 168 τα οποία έδειξαν ότι οι ασθενείς µε εµµένουσα HCV ιαιµία και χρόνια ηπατική νόσο έχουν µικρότερο αριθµό περιφερικών λεµφοκυττάρων µε ικανότητα IFN-γ και IL-2 απάντησης έναντι του αντιγόνου του πυρήνα του HCV από τους ασθενείς µε αυτοπεριορισθείσα λοίµωξη. Υπέρ της παρουσίας συσχέτισης µεταξύ του χρόνιου ιικού πολλαπλασιασµού και της ΤΗ1 υπεροχής συνηγορεί και το γεγονός ότι διαπιστώθηκε σηµαντική ελάττωση αυτής της ΤΗ1 απάντησης όταν το HCVRNA ήταν µη ανιχνεύσιµο µετά θεραπεία των ασθενών µε IFN-α, δείχνοντας ότι η απάντηση στη θεραπεία και η αρνητικοποίηση του HCVRNA εξάλειψαν το αντιγονικό ερέθισµα το οποίο και προήγαγε την ΤΗ1 απάντηση. Οσον αφορά την παραγωγή των ΤΗ1/ΤΗ2 τύπου κυτταροκινών στο ήπαρ, οι πιο πολλές µελέτες, χρησιµοποιώντας διάφορες διαγνωστικές προσεγγίσεις και µεθοδολογίες όπως παραγωγή κυτταροκινών α) από κλώνους ενδοηπατικών Τ κυττάρων 169, β) µέτρησης της έκφρασης του mrna των κυτταροκινών από τα ενδοηπατικά Τ κύτταρα 170,171 ή γ) παραγωγή κυτταροκινών από κυτταρικές σειρές ενδοηπατικών κυττάρων παρουσία δοµικών 110

117 και µη αντιγόνων του HCV µε την ενζυµική µέθοδο immunospot 126, έδειξαν ότι η επικρατούσα ανοσιακή απάντηση ήταν ΤΗ1 τύπου. Αυτή η απάντηση µπορεί να θεωρηθεί ως µια προσπάθεια του ανοσιακού συστήµατος να αναστείλει τον πολλαπλασιασµό του ιού και να περιορίσει τη φλεγµονή του ήπατος. Εντούτοις, ο µηχανισµός αυτός φαίνεται ότι είναι ανεπαρκής. Ιδιαίτερα, παρατηρείται µεγαλύτερη παραγωγή της IFN-γ σε σχέση µε την IL-2, χωρίς το εύρηµα αυτό να µπορεί να εξηγηθεί, διότι δεν παρατηρείται συσχέτιση των ειδικών HCV CD4+ κυττάρων που παράγουν IFN-γ µε το ιικό φορτίο, τον βαθµό της φλεγµονώδους αντίδρασης του ήπατος, τον γονότυπο του HCV ή τα επίπεδα των ALT. Πιθανόν αυτά τα ειδικά του HCV CD4+ κύτταρα, τα οποία ευρίσκονται σε µικρό αριθµό, να ευθύνονται για την εµµένουσα λοίµωξη και τη χρόνια νόσο. Επιπλέον, οι ΤΗ1 κυτταροκίνες φαίνεται ότι σχετίζονται µε την πρόκληση της ηπατοκυτταρικής βλάβης. Συµπερασµατικά φαίνεται ότι παρά την πληθώρα µελετών, δεν υπάρχει οµοφωνία µεταξύ των διαφόρων ερευνητών όσον αφορά στην επικράτηση της ΤΗ1 ή ΤΗ2 απάντησης, κυρίως όσον αφορά το περιφερικό αίµα, αν και οι περισσότεροι διαπιστώνουν αύξηση της IFN-γ χωρίς όµως αύξηση της IL

118 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 112

119 Όπως είναι γνωστό, ο ιός της ηπατίτιδας C δεν είναι άµεσα ηπατοκυτταροτοξικός, αλλά η ιστολογική βλάβη του ήπατος προέρχεται από την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή έναντι των µολυσµένων από τον ιό ηπατοκυττάρων. Οπως είναι επίσης γνωστό, η εξέλιξη µιας ιογενούς λοίµωξης προς ίαση ή εµµένουσα (χρόνια) λοίµωξη είναι αποτέλεσµα της ισορροπίας και της έντασης της ανοσιακής απάντησης που προβάλλει ο ξενιστής έναντι του ιού και των µηχανισµών διαφυγής έναντι αυτής που αναπτύσσει ο ίδιος ο ιός. Με το σκεπτικό, αυτό και προς διερεύνηση της ανοσοπαθογένειας της χρόνιας HCV λοίµωξης, έχουν διεξαχθεί πολλές µελέτες στις οποίες διερευνήθηκε η ειδική ανοσιακή απάντηση έναντι του HCV στους ασθενείς µε χρόνια νόσο, σε πολλά επίπεδα: λειτουργικότητας και ειδικής απάντησης των CD4+T και CD8+Τ κυττάρων, καθώς και παραγωγής/δράσης διαφόρων κυτταροκινών. Τα ευρήµατα όµως των µελετών αυτών είναι πολλές φορές αντιφατικά, πιθανόν διότι χρησιµοποιούνται διαφορετικές τεχνικές και διαφορετικοί πληθυσµοί ασθενών. Με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος των ΤΗ1 και ΤΗ2 στην ανοσοπαθογένεια της χρόνιας HCV λοίµωξης, µελετήθηκαν στην παρούσα µελέτη τα επίπεδα έκφρασης του mrna των κυτταροκινών σε καλλιέργειες περιφερικών λεµφοκυττάρων, µετά προσθήκη ή µη του αντιγόνου NS3 του γονιδιώµατος του HCV µε τη χρησιµοποίηση πολύ ευαίσθητων µοριακών τεχνικών. H τελική ανίχνευση του mrna έγινε µε real time PCR, χρησιµοποιώντας primers και probes των κυτταροκινών και των γονιδίων αναφοράς, τα οποία σχεδιάστηκαν ειδικά για την παρούσα µελέτη και την χρησιµοποίηση για πρώτη φορά του COBAS TAQMAN 48 για την εφαρµογή σε ερευνητικό πρωτοκόλλο. Τα επίπεδα έκφρασης του mrna των ΤΗ1 και ΤΗ2 κυτταροκινών µελετήθηκαν σε ασθενείς µε χρόνια HCV λοίµωξη και σε άτοµα µε αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C. 113

120 ΥΛΙΚΟ Στην παρούσα µελέτη συµετείχαν 60 άτοµα τα οποία διαχωρίστηκαν σε 2 οµάδες: ΟΜΑ Α Α. Αποτελείτο από 31 ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C, 21 άνδρες / 10 γυναίκες, ηλικίας έτη (µέση ηλικία 36.39±10.04). Οι ασθενείς είχαν antihcv(+), αυξηµένα επίπεδα τρανσαµινασών και ΗCVRNA (+), τόσο στην ποιοτική όσο και στην ποσοτική, ανίχνευση (PCR, Combas Amplicor HCV και Amplicor HCV Monitor- ROCHE Diagnostics) σε επανειλληµένους ελέγχους. Στους ασθενείς προσδιορίσθηκε επίσης ο γονότυπος του HCV (ΙΝΝΟLIPA, BAYER Diagnostics). Προς εκτίµηση της νεκροφλεγµονώδους αντίδρασης του ήπατος (ΗΑΙ=Histological activity Index) και του σταδίου της ίνωσης, χρησιµοποιώντας το τροποποιηµένο σύστηµα αξιολόγησης Knodell, έγινε βιοψία ήπατος σε 21/31 ασθενείς, οι οποίοι και δέχτηκαν να υποβληθούν σε βιοψία ήπατος. Το ως άνω σύστηµα αξιολογείται ως εξής: ΗΑΙ=0-3 καθόλου φλεγµονή ΗΑΙ=4-8 ήπια ΗΑΙ=9-12 µέτρια ΗΑΙ=13-18 έντονη Οσον αφορά στην ίνωση, µετράται σε 4 στάδια, το δε 4 είναι πλέον ανάπτυξη κίρρωσης του ήπατος. Οι ασθενείς δεν είχαν υποβληθεί σε κανένα θεραπευτικό σχήµα. ΟΜΑ Α Β. Αποτελείτο από 29 άτοµα 11 άνδρες/18 γυναίκες, ηλικίας έτη (µέση ηλικία 36.83±12.37), τα οποία είχαν αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C όπως διαπιστώθηκε από την παρουσία στον ορό antihcv (+), µόνιµα φυσιολογικά επίπεδα τρανσαµινασών και HCVRNA (-) (σε πολλαπλούς ελέγχους κατά 6µηνα χρονικά διαστήµατα). 114

121 Κανένα από τα 60 άτοµα δεν έπασχε από άλλη χρόνια λοίµωξη ή από αυτοάνοσο νόσηµα. Η µελέτη εγκρίθηκε από τον Τοµέα Παθολογίας, την Γενική Συνέλευση, την Επιτροπή ιδακτορικών ιατριβών και την Επιτροπή εοντολογίας της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ. Όλα τα άτοµα που συµµετείχαν στην µελέτη συγκατατέθηκαν για την λήψη των δειγµάτων αίµατος. Tα δηµογραφικά χαρακτηριστικά των δύο ΟΜΑ ΩΝ φαίνονται στους Πίνακες 1 και 2 και στα σχήµατα

122 Πϊνακας 1. ηµογραφικά χαρακτηριστικά των ατόµων µε αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C (ΟΜΑ Α Β) Νο ΗΛΙΚΙΑ ΦΥΛΟ 1 39 ΑΡΡΕΝ 2 44 ΑΡΡΕΝ 3 24 ΘΗΛΥ 4 27 ΘΗΛΥ 5 26 ΘΗΛΥ 6 28 ΘΗΛΥ 7 30 ΘΗΛΥ 8 53 ΘΗΛΥ 9 31 ΑΡΡΕΝ ΑΡΡΕΝ ΘΗΛΥ ΘΗΛΥ ΘΗΛΥ ΑΡΡΕΝ ΑΡΡΕΝ ΑΡΡΕΝ ΘΗΛΥ ΑΡΡΕΝ ΘΗΛΥ ΘΗΛΥ ΑΡΡΕΝ ΘΗΛΥ ΘΗΛΥ ΑΡΡΕΝ ΘΗΛΥ ΑΡΡΕΝ ΘΗΛΥ ΘΗΛΥ ΘΗΛΥ Mean 36,83 S.D. 12,37 116

123 Πίνακας 2. ηµογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα C (ΟΜΑ Α Α) No ΗΛΙΚΙΑ HCVRNA c/ml AST* ALT* ΦΥΛΟ ,40 2,71 ΑΡΡΕΝ ,10 4,35 ΑΡΡΕΝ ,16 1,68 ΑΡΡΕΝ ,13 2,00 ΑΡΡΕΝ ,80 1,17 ΑΡΡΕΝ ,05 2,48 ΑΡΡΕΝ ,67 1,84 ΑΡΡΕΝ ,40 1,84 ΑΡΡΕΝ ,90 1,73 ΘΗΛΥ ,29 2,64 ΘΗΛΥ ,00 1,24 ΑΡΡΕΝ ,35 2,35 ΑΡΡΕΝ ,83 2,33 ΑΡΡΕΝ ,51 5,51 ΑΡΡΕΝ ,48 2,62 ΑΡΡΕΝ ,13 1,88 ΑΡΡΕΝ ,89 1,26 ΑΡΡΕΝ ,10 1,64 ΑΡΡΕΝ ,90 0,85 ΘΗΛΥ ,00 1,84 ΑΡΡΕΝ ,54 2,53 ΘΗΛΥ ,22 1,52 ΘΗΛΥ ,45 1,14 ΘΗΛΥ ,48 0,48 ΑΡΡΕΝ ,00 4,06 ΘΗΛΥ ,24 2,37 ΑΡΡΕΝ ,25 0,44 ΘΗΛΥ ,16 2,11 ΑΡΡΕΝ ,61 2,29 ΘΗΛΥ ,32 2,24 ΑΡΡΕΝ ,4 2,1 ΘΗΛΥ Mean 36, ,55 1,41 2,10 SD 10, ,27 0,56 1,05 * Τιµές Χ φυσιολογικών επιπέδων 117

124 Σχήµα 1. Κατανοµή του φύλου στα άτοµα µε αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C Φύλο 38% θηλυ ΑΡΡΕΝ 62% 118

125 Σχήµα 2. Κατανοµή του φύλου στους ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C Ασθενείς - Φύλο 32% ΘΗΛΥ ΑΡΡΕΝ 68% 119

126 MEΘΟ ΟΙ Το πρωτόκολλο που εφαρµόστηκε στην παρούσα µελέτη, αποτελεί ένα συνδυασµό πρωτοκόλλων µε βάση τη βιβλιογραφία 160,172,173, ενώ έγιναν- όπου απαιτούντανορισµένες τροποποιήσεις µε σκοπό αφενός τη βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου και αφετέρου την προσαρµογή του στην υλικοτεχνική υποδοµή των εργαστηρίων Αιµατολογικού και Ηπατολογικού-Ανοσολογικού της Β Παθολογικής Κλινικής. 1. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΩΝ ΑΠΟ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΟΛΙΚΟ ΑΙΜΑ Πρίν ξεκινήσει η εφαρµογή του πρωτοκόλλου έγιναν τα κάτωθι: Από κάθε ασθενή έγινε συλλογή α) περίπου 30ml ολικού περιφερικού αίµατος σε ειδικά σωληνάρια τα οποία περιείχαν - ως αντιπηκτικό- EDTA και β)10ml ολικού αίµατος το οποίο τοποθετήθηκε σε ειδικά σωληνάρια χωρίς αντιπηκτική ουσία. Όλα τα αντιδραστήρια τα οποία επρόκειτο να χρησιµοποιηθούν τοποθετήθηκαν στους 37 C σε υδατόλουτρο για περίπου 15 min. Στη συνέχεια µεταφέρθηκαν σε θερµοκρασία δωµατίου. Η όλη διαδικασία πραγµατοποιήθηκε σε απαγωγό επιπέδου τρία αφού πρώτα αποστειρώθηκε µε UV για περίπου 30 min και καθαρίστηκε µε διάλυµα αιθυλικής αλκοόλης 70%. Με αυτό τον τρόπο εξασφαλίστηκαν οι όσο το δυνατόν πιο άσηπτες συνθήκες της εφαρµογής του πρωτοκόλλου. Στην συνέχεια η εφαρµογή του πρωτοκόλλου περιλάµβανε τα εξής στάδια: 1. Το ολικό αίµα µοιράζονταν σε 2 falcon των 50 ml, ανά 15 ml. 2. Τοποθέτηση ίσου όγκου διαλύµατος µηδέν (0) το οποίο αποτελείται από θρεπτικό υλικό RPMI 1640 (GIBCO- 120

127 Invotrogen) µε 2% FCS (Fetal Calf Serum- Heat inactivated). 3. Ηπια ανακίνηση ώστε το διάλυµα αίµατος και θρεπτικού υλικού να γίνει οµογενές. 4. Τοποθέτηση σε 2 νέα falcon των 50ml, 15ml ειδικού διαχωριστικού διαλύµατος Histopaque και στην συνέχεια µε πιπέτα των 10 ml µε πολύ απαλές κινήσεις τοποθέτηση από πάνω το µίγµα αίµατος και θρεπτικού υλικού αντίστοιχα από κάθε falcon (30 ml). 5. Φυγοκέντρηση στις rpm για 30 min. 6. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης επιτυγχάνονταν ο εξής διαχωρισµός των κυττάρων : στον πυθµένα µαζεύονταν τα ερυθρά αιµοσφαίρια και τα πολυµορφοπύρηνα, στο µέσο συλλέγονταν τα λεµφοκύτταρα και τα µονοκύτταρα τα οποία ξεχώριζαν σαν ένα λευκό νέφος ενώ τέλος στο υπερκείµενο βρίσκονταν οι πρωτεΐνες και το πλάσµα. 7. Συλλογή προσεκτικά του νέφους των κυττάρων σε 2 νέα αντίστοιχα falcon των 50ml. Η ποσότητα του νέφους των κυττάρων από κάθε falcon, ήταν περίπου 15 ml. 8. Προσθήκη ίσου όγκου, δηλ άλλα 15 ml, από το ιάλυµα µηδέν (0). 9. Ήπια ανάδευση µε αποστειρωµένο πουάρ και φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 20 min, µε βασικό σκοπό την πλύση των κυττάρων και την αποµάκρυνση του διαχωριστικού διαλύµατος αλλά και ότι άλλου υπήρχε από πρωτεΐνες κ.λ.π. 10. Αποµάκρυνση του υπερκείµενου και από τα 2 falcon αφήνοντας σε κάθε ένα από 100µl. 11. Προσθήκη στο ένα από τα 2 falcon, 10 ml από το διάλυµα Α, το οποίο αποτελούνταν από τα παρακάτω συστατικά διαλυµένα µέσα σε θρεπτικό υλικό RPMI ΙΑΛΥΜΑ Α: 1. RPMI 1640 των 100 ml (αφαιρούνταν 11,6ml) µε L- glutamine 2mM. 121

128 2. 1 ml Na-pyruvate 3. 10µl Heparin µl penicillin-streptomycin µl gentamycin 6. 10% FCS-Heat inactivated (10ml) 12. Καλή ανάµιξη µε την βοήθεια αποστειρωµένου πουάρ µέχρι να διαλυθούν τα κύτταρα στο παραπάνω διάλυµα (εάν δεν διαλύονταν εύκολα, προσθήκη µl EDTA). Μεταφορά όλου του περιεχοµένου του πρώτου falcon µε τη βοήθεια πιπέτας των 10 ml στο δεύτερο falcon, και εκ νέου ανάµιξη ώστε να διαλυθούν και αυτά τα κύτταρα µαζί µε τα υπόλοιπα. 13. Φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 15 min. 14. Απόρριψη του υπερκειµένου και στο ίζηµα των κυττάρων προσθήκη εκ νέου 5 ml από το διάλυµα Α. 15. Ηπια ανάµιξη µε πουάρ και νέα φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 15 min. 16. Απόρριψη και πάλι του υπερκειµένου, προσθήκη εκ νέου 5 ml ιαλύµατος Α και ανάµιξη µε τη βοήθεια πουάρ. 17. οκιµασία βιωσιµότητας των κυττάρων µε τη βοήθεια µια ειδικής χρωστικής, του trypan blue. Βασικός σκοπός της δοκιµασίας αυτής ήταν: α) να εκτιµηθεί ο αριθµός των κυττάρων για καλλιέργεια αλλά και β) να καταγραφεί ο αριθµός των ζωντανών κυττάρων τα οποία θα πρέπει να είναι πάνω από 70-80% περίπου των κυττάρων έτσι ώστε η καλλιέργεια να είναι επιτυχής. Η µέθοδος του trypan blue βασίζεται στο ότι αφού γίνει ανάµιξη ίσης ποσότητας χρωστικής και εναιωρήµατος κυττάρων (συνήθως από 10 µl ), τα κύτταρα τοποθετούνται σε ειδική πλάκα Newbauer και µετρώνται στα µεσαία τετράγωνα τόσο τα ζωντανά κύτταρα, τα οποία είναι λευκά εξαιτίας του ότι έχουν την ικανότητα να εµποδίζουν την χρωστική να εισέρθει και να βάψει το πυρήνα και το κυτταρόπλασµα µπλέ, αλλά και τα νεκρά τα οποία είναι µπλε διότι η χρωστική εισέρχεται 122

129 ανεµπόδιστα µέσα στο κύτταρο. Στη συνέχεια εφαρµόζεται ο τύπος : Αριθµός ζωντανών κυττάρων/ Συνολο ζωντανών νεκρών Χ 100 = Βιωσιµότητα (Viability). 18. Υπολογισµός του αριθµού των κυττάρων στο 1ml, έτσι ώστε να υπάρχουν σε κάθε φλάσκα περίπου 1,5 Χ 10 7 κύτταρα. 19. Ετοιµασία του ιαλύµατος Β το οποίο και αποτελούσε το τελικό διάλυµα της καλλιέργειας και αποτελούνταν από τα παρακάτω συστατικά: ΙΑΛΥΜΑ Β: 30 ml RPMI 1640 plus L-glutamine (αφαιρούνταν 3,5 ml περίπου) εµπλουτισµένο µε τα παρακάτω συστατικά: 1.300µl Na-pyruvate 2. 3µl Heparin 3. 30µl pen-strep µl gentamycin 5. 3ml pooled ανθρώπινος ορός (ο οποίος είχε συλλεγεί, µετά από φυγοκέντρηση, από τα δείγµατα αίµατος χωρίς αντιπηκτική ουσία) *Παρατήρηση: Εάν το θρεπτικό υλικό δεν είχε εξαρχής L- glutamine, προστίθονταν περίπου 450µl στο διάλυµα. Όλα τα συστατικά χορηγούνταν διερχόµενα από syringe filter ώστε να εξασφαλιστούν όσο το δυνατόν πιο άσηπτες συνθήκες κατά την καλλιέργεια των κυττάρων. 20. Προσθήκη τόσων ml από το ιάλυµα Β ώστε ο τελικός όγκος του θρεπτικού υλικού ανά φλάσκα να είναι 10 ml. 123

130 21. Για κάθε δείγµα ετοιµάζονταν 2 φλάσκες Τ75. Η µια φλάσκα έφερε τον κωδικό αριθµό του δείγµατος µόνο και περιείχε το ιάλυµα Β και την ανάλογη ποσότητα, όπως είχε ήδη υπολογισθεί, από το εναιώρηµα των κυττάρων. Η άλλη φλάσκα έφερε επίσης τον κωδικό αριθµό του δείγµατος µε το επιπλέον χαρακτηρισµό (Ag) που έδειχνε ότι πέρα από τα παραπάνω συστατικά και την ποσότητα του εναιωρήµατος των κυττάρων είχαν προστεθεί και 5µl από το Αντιγόνο Hepatitis C NS3 (ΗCA της Εταιρείας IBT-Immunological and Biochemical Test Systems GmbH, Reutlingen, Germany). Το αντιγόνο αυτό είναι ανασυνδυασµένο αντιγόνο, παράγεται σε Escherichia Coli και καλύπτει από την περιοχή της αλανίνης 1192 εως την κυστεїνη 1457 της πολυπρωτεϊνης του γονιδιώµατος του HCV και αντιστοιχεί στο c33c αντιγόνο. Η καθαρότητα είναι >90%. Η περιεκτικότητα του µετά τη διάλυση σε 50mM TrisHCL, 50mM NaCL, 10mM DTT, 1mM EDTA και ph 7.4, ήταν 1µg/ml αντιγόνου. 22. Οι δύο φλάσκες τοποθετούνταν πολύ προσεκτικά, αφού πρώτα ανακινούνταν ήπια, σε επωαστικό κλίβανο σε συνθήκες 5%CO 2 και 37 C για 2 ηµέρες (48 ώρες). 2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 1. Μετά το πέρας των 48h, οι φλάσκες έβγαιναν από τον κλίβανο και γινόταν µια πρώτη παρατήρηση µε ανάστροφο µικροσκόπιο µε φακό Χ10 προκειµένου να εκτιµηθεί η µορφολογία των κυττάρων καθώς και η περίπτωση τυχόν επιµόλυνση τους. 2. Μεταφορά όλου του περιεχοµένου κάθε φλάσκας, το οποίο περιείχε κατά κύριο λόγο λεµφοκύτταρα (αφού τα µονοκύτταρα είχαν προσκολληθεί στην επιφάνεια της φλάσκας κατά την επώαση), σε falcon φυγοκέντρησης των 15 ml. 3. Φυγοκέντρηση στις 1800rpm για 15 min. 124

131 4. Απόρριψη υπερκειµένου και προσθήκη 5 ml PBSστο ίζηµα. 5. Ανάδευση µε την βοήθεια ειδικού αποστειρωµένου πουάρ των 3 ml και νέα φυγοκέντρηση µε βασικό σκοπό, την πλύση των κυττάρων και την αποµάκρυνση όλων των συστατικών του θρεπτικού υλικού αλλά και των µεταβολισµένων προϊόντων των κυττάρων, τα οποία µπορούσαν να δράσουν ανασταλτικά στην εφαρµογή του πρωτοκόλλου αποµόνωσης του RNA που θα ακολουθούσε. 6. Αποµάκρυνση του υπερκειµένου και µεταφορά του ιζήµατος των κυττάρων σε ειδικό αποστειρωµένο απαγωγό για να γίνει η αποµόνωση του ολικού κυτταρικού RNA. 3. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ RNA Για την αποµόνωση του ολικού κυτταρικού RNA χρησιµοποιήθηκε το ειδικό ΚΙΤ της QIAGEN (QIAamp RNA Blood and cells mini KIT) µε στήλες. Το πρωτόκολλο τροποποιήθηκε σε ορισµένες περιπτώσεις ώστε να γίνει όσο το δυνατόν καλύτερη η αποµόνωση του ολικού RNA από τα κύτταρα της καλλιέργειας. Η διαδικασία περιγράφεται παρακάτω: 1) Προσθήκη στο ίζηµα των κυττάρων, 350µl ειδικού διαλύµατος RLT + β-µερκαπτοαιθανόλη. Γρήγορη ανάδευση µε την βοήθεια πιπέτας. Σε περίπτωση που το διάλυµα παρουσίαζε υψηλό ιξώδες, ανακίνηση σε vortex για sec. Λύση όλων των κυττάρων κάτω από τις υψηλές αποδιατακτικές συνθήκες του διαλύµατος RLT (υψηλής αλατότητας ρυθµιστικό διάλυµα) και αδρανοποίηση -µε τη δράση της β-µερκαπτοαιθανόλης- των RNασών, οι οποίες µε τη λύση των κυττάρων απελευθερώνονται µέσα στο διάλυµα λύσης και µπορούν στα επόµενα στάδια να καταστρέψουν το RNA. Η όλη διαδικασία της αποµόνωσης, όσο αυτό είναι εφικτό, πρέπει να γίνεται πολύ γρήγορα, σε υψηλής αποστείρωσης χώρους, 125

132 µε υλικά τα οποία θα χρησιµοποιούνται µόνο για αποµόνωση του RNA. 2) Μεταφορά του διαλύµατος λύσης και τοποθέτηση απευθείας µέσα στα ειδικά σωληνάρια οµογενοποίησης (QIAshredder spin column) τα οποία φέρουν ειδικό φίλτρο (silica- gel based membrane). Το φίλτρο αυτό είναι έτσι κατασκευασµένο ώστε να δεσµεύει όλα τα συστατικά του κυττάρου (πρωτείνες, υπολείµµατα από κυτταρικές µεµβράνες κ.λ.π) ενώ ταυτόχρονα καταστρέφει τα κύτταρα που δεν έχουν λυθεί. Τα νουκλεϊκά οξέα όπως το DNA και το RNA διέρχονται διαµέσω του φίλτρου και συλλέγονται µέσα στο διάλυµα οµογενοποίησης. Φυγοκέντρηση στις rpm για 2 min. Συλλογή του οµογενοποιήµατος στο κάτω µέρος του σωληναρίου. 126

133 3) Απόρριψη του φίλτρου και στο απόσταγµα προσθήκη ίσης ποσότητας (350µl) αιθυλικής αλκοόλης 70%. Καλή ανάδευση µε βοήθεια πιπέτας. Με τον τρόπο αυτό προκαλείται αφυδάτωση των νουκλεϊκών οξέων ενώ ταυτόχρονα ρυθµίζονται οι συνθήκες σύνδεσης των νουκλεϊκών οξέων στο επόµενο φίλτρο. 4) Μεταφορά του διαλύµατος DNA και RNA στην επόµενη στήλη, µε ένα άλλο σωληνάριο (QIAamp spin column). Σύντοµη φυγοκέντρηση για 25 sec. Το RNA και µέρος του DNA συνδέονται χηµικά µε το φίλτρο, καθώς το διάλυµα της οµογενοποίησης περνά µέσα από αυτό. 5) Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο. Προσθήκη 50µl διαλύµατος DNase απευθείας στο φίλτρο και παραµονή του δείγµατος για περίπου 45 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Η DNase είναι µία εξωνουκλεάση η οποία διασπά κατά την κατεύθυνση 5 3 τους φωσφωδιεστερικούς δεσµούς των νουκλεοτιδίων µόνο του DNA. Με τον τρόπο αυτό καταστρέφεται το DNA για να αποφευχθεί επιµόλυνση (contamination) κατά το στάδιο εφαρµογής της Real Time PCR. 6) Τοποθέτηση 200µl ρυθµιστικού διαλύµατος (DNase wash solution) επάνω στο φίλτρο και παραµονή για 1min. Φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min. 7) Τοποθέτηση πάλι 200µl του ίδιου ρυθµιστικού διαλύµατος και φυγοκέντρηση για 2min. Με τον τρόπο αυτόν εκπλύνεται το φίλτρο και αποµακρύνεται το DNA, ενώ παραµένει καθαρό πλέον µόνο το RNA µέσα στο φίλτρο. 8) Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο και προσθήκη 700µl RW1 (διάλυµα υψηλής αλατότητας το οποίο περιλαµβάνει χαοτροπικές ουσίες που αποµακρύνουν τυχόν προσµίξεις του RNA µε άλλες ουσίες ενώ ταυτόχρονα διατηρεί τις RNases απενεργοποιηµένες). 9) Φυγοκέντρηση στις rpm για 25 sec 127

134 10) Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο και προσθήκη 500µl από το διάλυµα RPE (διάλυµα πλύσεως του RNA και αποµάκρυνσης προσµίξεων του προηγούµενου διαλύµατος και τυχόν επιµολύνσεων του RNA). 11) Φυγοκέντρηση στις rpm για 25 sec. 12) Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο και προσθήκη εκ νέου 500µl διαλύµατος RPE. 13) Φυγοκέντρηση στις rpm για 3 min. 14) Μεταφορά τoυ φίλτρου σε νέο σωληνάριο, χωρίς προσθήκη άλλου διαλύµατος. Φυγοκέντρηση για 1min στις rpm για την καλύτερη αποµάκρυνση όλων των διαλυµάτων που χρησιµοποιήθηκαν για το πλύσιµο του RNA, τα οποία εάν παραµείνουν ίσως δράσουν ανασταλτικά κατά την εφαρµογή της RT-PCR ή της Real Time PCR 15) Μεταφορά του φίλτρου στο ειδικό σωληνάριο συλλογής και προσθήκη απευθείας επάνω στο φίλτρο 30µl ειδικό απεσταγµένο νερό RNase ελέυθερο (free). Παραµονή για 1,5min. 16) Φυγοκέντρηση στις rpm για 1min. 17) Προσθήκη άλλων 20µl απεσταγµένου νερού επάνω στο φίλτρο και παραµονή για 30sec. 18) Φυγοκέντρηση στις rpm για ακόµα 1 min. 19) Απόρριψη του φίλτρου και παραλαβή του σωληναρίου που περιέχει το προϊόν έκλουσης, δηλαδή το ολικό κυτταρικό RNA σε τελικό όγκο 50µl. 20) Μεταφορά του σωληναρίου στους -70 C για συντήρηση. 4. ΜΕΘΟ ΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΟΥ RNA Για την ανίχνευση του ολικού κυτταρικού RNA που αποµονώθηκε µε την παραπάνω µέθοδο, ακολουθούνται δύο τρόποι εναλλακτικά: 1. Ανίχνευση του ολικού RNA µετά από ηλεκτροφόρηση του δείγµατος σε γέλη Αγαρόζης 1,7%. 128

135 2. Ανίχνευση του ολικού RNA µετά από φωτοµέτρηση σε µήκος κύµατος 260nM όπου µας δίνεται η δυνατότητα να εξετάσουµε το RNA ως προς την ποσότητα του αλλά και ως προς την καθαρότητα του. Α. Ηλεκτροφόρηση του RNA Α1. ΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΓΕΛΗΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ 1. Τοποθέτηση 1,7 gr Αγαρόζης σε 100ml ειδικού διαλύµατος TBEX1 µέσα σε κωνική φιάλη. 2. Ανακίνηση για να γίνει διάλυση της σκόνης µέσα στο διάλυµα και θέρµανση στους 100 C µε ταυτόχρονη ανακίνηση για 3-4min. 3. Μετά τη διάυγαση του διαλύµατος, ανακίνηση της φιάλης κάτω από νερό βρύσης µε σκοπό την πτώση της θερµοκρασίας στους 65 C. 4. Προσθήκη 8µl EthBr (Βρωµιούχο-Αιθίδιο) (10mg/ml) και ταυτόχρονη ανακίνηση ώστε να γίνει πλήρης οµογενοποίηση. Το βρωµιούχο αιθίδιο είναι µια ουσία της οποίας τα µόρια έχουν την ικανότητα να προσδένονται επάνω στις έλικες του DNA ή του RNA αντίστοιχα και να φθορίζουν όταν επάνω στο νουκλεϊκό οξύ προσπίπτει υπεριώδης ακτινοβολία UV. 5. Απόρριψη του περιεχοµένου της φιάλης σε ειδικό υποδοχέα (tray). Αποµάκρυνση τυχόν φυσαλίδων και τοποθέτηση ειδικών «κτενών». Μετά την πήξη του gel της Αγαρόζης, η αφαίρεση των κτενών δηµιουργεί ειδικές θέσεις για την τοποθέτηση των δειγµάτων (πηγαδάκια). 6. Τοποθέτηση του υποδοχέα µε το gel σε ειδική συσκευή ηλεκτροφόρησης και κάλυψη µε ειδικό buffer TBEX1. 7. Ετοιµασία των δειγµάτων RNA για το φόρτωµα. 129

136 Α2. ΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΙΓΜΑΤΩΝ RNA ΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ 1. Παραλαβή των δειγµάτων του RNΑ από τους -70 C και τοποθέτηση σε υδατόλουτρο για δευτερόλεπτα. Η όλη διαδικασία πρέπει να γίνεται γρήγορα γιατί οι RNases µε την πτώση της θερµοκρασίας ενεργοποιούνται και αρχίζει η καταστροφή του RNA. 2. Ετοιµασία µικρών σωληναρίων για την τοποθέτηση των δειγµάτων που είναι στον πάγο. 3. Φυγοκέντρηση για 3-4 sec των δειγµάτων του RNA και τοποθέτηση στον πάγο για να επιβραδυνθεί η δράση των RNασών. 4. Τοποθέτηση σε κάθε σωληνάριο 7-8µl από το κάθε δείγµα RNA προς εξέταση και προσθήκη 2µl ειδικού χρωστικού διαλύµατος (loading buffer) το οποίο περιέχει µπλε της βρωµοφαινόλης, κυανούν του ξυλενίου, γλυκερόλη 50% και απεσταγµένο νερό. 5. Φυγοκέντρηση για 3-4 sec και τοποθέτηση στον πάγο. 6. Μεταφορά των αρχικών δειγµάτων του RNA στους - 70 C. 7. Τοποθέτηση των δειγµάτων στην συσκευή της PCR. Θέρµανση στους C για 6-10min. 8. Τοποθέτηση στον πάγο. Παραµονή για 3-4 min. Με τον τρόπο αυτόν επιτυγχάνεται αρχικά, µέσω της αυξηµένης θερµότητας, η πλήρης αποδιάταξη του RNA το οποίο αν και µονόκλωνο, δηµιουργεί από µόνο του δευτεροταγείς δοµές, ενώ µε την τοποθέτηση στον πάγο, διατηρείται αυτή η αποδιαταγµένη κατάσταση του RNA. 9. Τοποθέτηση των δειγµάτων µε ειδική πιπέτα στη θέση υποδοχής (πηγαδάκι) µε µεγάλη προσοχή. Τοποθέτηση του κατάλληλου marker. 10. Hλεκτροφόρηση σε συνθήκες τάσης Volt και έντασης Αmber για 45 min. 130

137 11. Μεταφορά του gel σε ειδικό σκοτεινό θάλαµο. Φωτογράφιση µετά από έκθεση σε ακτινοβολία UV. 12. Ανάλυση των ζωνών µε τη βοήθεια του ειδικού software (GELPRO). Στο gel παρατηρούνται συνήθως 2 βασικές ζώνες που αντιπροσωπεύουν τα 2 ριβοσωµικά RNA (28SrRNA 5,0 Kbp και 18SrRNA 1,9Kbp) To mrna επειδή είναι πολύ λίγο σε σχέση µε τα υπόλοιπα, δεν φαίνεται τόσο ευκρινώς, αλλά συνήθως βρίσκεται ανάµεσα στις παραπάνω ζώνες δηµιουργώντας µια ασθενή σε ένταση «σκάλα». Οποιαδήποτε άλλη εικόνα διάχυσης είναι ενδεικτική µετουσίωσης ή καταστροφής του RNA από τη δράση των RNασών. Ηλεκτροφόρηση RNA 131