Določanje strukture. mikrobne združbe

Transcript

1 Določanje strukture mikrobne združbe 1

2 Določanje strukture mikrobne združbe mikroskopija gojenje (fiziološka različnost) FAME, PLFA imunološki testi tipizacije (fagotipizacija, ribotipizacija) analiza DNA in RNA (16S rrna, PCR, ARDRA, DGGE, RFLP, RAPD, DNA/RNA sonde, metagenomika) GFP 2

3 Nivoji ločljivosti za posamezne metode družina rod vrsta sev RFLP ribotipizacija DNA amplifikacija (AFLP, AP-PCR, rep-pcr, RAPD, ARDRA) fagotipizacija serologija cimologija elektroforeza vseh proteinov DNA-DNA hibridizacija 3

4 Nivoji ločljivosti za posamezne metode družina rod vrsta sev %GC poliamini, kinoni FAME celična stena fiziološki testi (Biolog, API) rrna DNA probe DNA sekvence 4

5 Klasični fenotipski testi Hidroliza UREAe povzroči sproščanje amonija, ki sprememni ph in posledično barvo gojišča Hidroliza arginina povzroči sproščanje amonija, ki ga lahko detektiramo s Neslerjevim reagentom Redukcijo nitratov do nitritov lahko določimo s SA+NEDA reagentom 5

6 Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov: Biolog v mikrotitersko ploščo dodamo različne vire ogljika in nacepimo neznane mikroorganizme (npr. okoljski vzorec) zaradi rasti mikroorganizmov pride do spremembe barve tetrazolijevih soli (meri aktivnost dehidrogenaz) odčitamo rezultate s pomočjo podatkovne baze identificiramo mikroorganizem 6

7 Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov: API celice nacepimo v liofilizirana gojišča, ki smo jih predhodno omočili rast mikroorganizmov se kaže kot sprememba barve spomočjo numeričnih oznak za spremembo barve določimo kodo, ki jo primerjamo z znanimi vnosi v podatkovni bazi 7

8 Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov Rapid ANA Rapid One MicroResp MicroID VITEK BBL Crystal Riboprinter 8

9 Določanje strukture mikrobne združbe na osnovi makromolekul - lipidi - proteini - nukleinske kisline 9

10 Molekularna identifikacija - FAME (Fatty Acid Methyl Esters) V celicah je veliko različnih lipidov (> 100), ki so zastopani v različnih deležih. Za analizo lipide izoliramo, modificiramo do metilnih estrov, analiziramo s plinsko kromatografijo. Kromatogrami lipidnih profilov dajejo značilne vzorce, ki jih med seboj primerjamo. Pri analizi uvrstimo lipide v več skupin: -nasičene maščobne kisline -nenasičene maščobne kisline - ciklopropanske maščobne kisline -razvejane maščobne kisline - hidroksilne maščobne kisline 10

11 Zakaj uporabljamo maščobne kisline (predvsem fosfolipide - PLFA)? so esencialne komponente vsake žive celice in imajo uporabne biomarkerje, ker so strukturno zelo raznolika skupina molekul z visoko biološko specifičnostjo lahko jih uporabljamo za oceno aktivne biomase, zato ker je: - fosfatna skupina je tako po propadu organizma porabljena -običajno fosfolipidov ne najdemo v rezervnih snoveh mikrobov -običajno so zastopani v dokaj konstantnih deležih v biomasi 11

12 PLFA ločljivost primerjava celotnega PLFA vzorca z multivariantno statistiko pokaže na spremembe v mikrobni združbi sprememba določene PLFA komponente je indikator za spremembo specifične skupine mikrorganizmov 12

13 Procedura ekstrakcija separacija lipidov saponifikacija/metilacija GC analiza podatkovna analiza in intepretacija 13

14 Ekstrakcija maščobnih kislin iz tal 1-25 g tal (zračno suha tla) kloroform : metanol : fosfatni pufer (2:1:0.8) centrifuga, filtracija in odstranjevanje kloroforma sušenje z N 2 14

15 Separacija lipidov uporaba silicijeve kolone. Lipide ločimo z naslednjimi eluenti: - nevtralne lipide s kloroformom - glikolipide z acetonom - fosfolipide z metanolom metilacija z uporaba 2M KOH raztopljenega v MeOH uporaba GC-FID uporaba standardov za identifikacijo kromatografskih pikov 15

16 Primer kromatograma identifikacija s standardi pa 120 FID1 A, (C:\DOCUME~1\JENN\MYDOCU~1\RESEARCH\GC-FID~1\ D) 16:0 18:2 w6,9 18:1 w9c 18:1 w7c :0 cy :0 15:0i 15:0a 16:0 10 Me min :0 10 Me

17 Nomenklatura maščobnih kislin Maščobne kisline označujemo tako, da najprej označimo skupno število ogljikovih atomov, nato število dvojnih vezi, mesto formiranja zadnje dvojne vezi gledano od metilne skupine molekule označimo z ω, v primeru, ko gledamo od karboksilnega dela molekule označimo mesto formiranja zadnje dvojne vezi z. 17

18 Primer nomenklature maščobnih kislin ime: 5,8,11,14,17-eicosapentaenojska kislina trivialno ime: EPA kratka oznaka: 20:5ω3 pomeni, da gre za 20-C maščobno kislino s 5 dvojnimi vezmi, zadnja se začenja na poziciji 3 od metilnega dela, ostale dvojne vezi so na mestih 5, 8, 11, 14, in 17 18

19 Nomenklatura maščobnih kislin predpona i in a označujeta izo in anzeizo maščobno kislino, anteizo je razvejanje na tretjem ogljikovem atomu od konca verige -cy pomeni ciklopropansko maščobno kislino -Me pomeni metilno razvejanje iz karboksilnega dela verige okrajšave t pomeni trans konfiuracijo dvojne vezi okrajšave c pomeni cis konfiuracijo dvojne vezi 19

20 Primer nomenklature maščobnih kislin kratka oznaka: i16:0 maščobna kislina ima metilno skupino na prvem ogljikovem atomu iz w konca kratka oznaka: 10Me16:0 maščobna kislina ima metilno razvejanje na 10 ogljikovem atomu iz karboksilnega konca 20

21 Interpretacija maščobne kisline 15:0i, 17:0i, 15:0a, i15:0, i17:0, cy17:0, cy19:0 cy17:0, cy19:0, 18:1 11c 16:1ω8c, 16:1ω5c, 16:1ω8t, 18:1ω8c, 18:1ω8t, 18:1ω6c mikrobna skupina G pozitivne bakterije anaerobne G negativne bakterije G negativne bakterije 10 Me18:0, 10 Me17:0, 10 Me16:0 aktinomicete 18:2ω6,9, 18:1ω9c, 18:3ω6, 18:3ω3 20:3ω6, 20:4ω6 20:5ω3, 18:3ω3 10Me16:0, i17:1ω7, i17:1ω6 glive protozoji alge sulfat reducirajoče bakterije 16:1ω5 arbuskularne mikorizne glive metanotrofi 20:5, 22:6 barofili/psihrofili 18:2ω6 cijanobakterije 21

22 Interpretacija vsoto naslednjih maščobnih kislin lahko uporabimo za določanje bakterijske biomase: i15:0, a15:0, i16:0, 16:1ω9, 16:1ω7t, i17:0, a17:0, 17:0, cy17:0, 18:1ω7 in cy19:0 naslednji dve maščobni kislini lahko uporabimo za določanje biomase gliv 18:2ω6,9 in 18:1ω9c ciklopropilne maščobne kisline so značilne za stacionarno fazo, do njihove produkcije pride pri stresnih pogojih (prekurzorja za cy17:0 in cy19:0 sta:16:1ω7c in 18:1ω7c) 22

23 Prednosti PLFA omogoča bolj natančno določanje žive biomase kot fumigacijske metode lahko detektiramo mikrobno strukturo v naravnih vzorcih brez predhodnega gojenja uporabno za detekcijo sprememb strukture v različnih talnih, vodnih in vzorcih iz sedimenta relativno enostavna omogoča veliko število vzorcev 23

24 Pomankljivosti PLFA ne omogoča določanje vrstne sestave arhej ne moremo določiti natančno ne more določiti maščobnih kislin v zelo nizkih koncentracijah, ki pa lahko kljub temu predstavljajo pomembne skupine PLFA profilom ne moremo direktno vezati na funkcijo ekosistema podatkovna baza je vezana na maščobne profile pridobljene iz bakterij v čistih kulturah 24

25 Proteinski vzorci elektroforetska primerjava proteinov neznanega izolata z elektroforetskim profilom znanega mikroorganizma uporaba pulzne elektroforeze ali 2D elektroforeze za kompleksne okoljske vzorce manj primerno, ker zahteva gojitev mikroorganizmov v čisti kulturi 25

26 Rezultati analize skupnih proteinov različnih sevov Lactococcusov in Lactobacillov 26

27 2D Gel elektroforeza - princip IEF SDS PAGE ph 27

28 Identifikacija proteinov z MS in 2D gel 28

29 Mikrosekvenciranje elektro-blotting generira sekvenco z N-terminalnega dela uporabna za nizke koncentracije proteina (5-50 ng) lahko preberemo do 20 aminokislin, kar omogoča ID proteinov relativno počasna 29

30 Proteinski čipi (Protein Arrays) razporeditev protiteles razporeditev antigenov razporediterv ligandov Detekcija z: MS, fluorescenco, SPR, electrokemijsko, radioaktivnost 30

31 Funkcionalni proteinski čipi Niklova prevleka 31

32 Imunološke metode za identifikacijo Uporabljamo označeno protitelo, ki ga vežemo na mikrobni antigen. Specifično vezavo protitelesa na antigen določimo z: imunofluorescenco radioimunskimi testi (RIA - radioimumunoassay) encimsko imunsko reakcijo (ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay) encimsko reakcijo kombinirano s fluorescenco (ELFA - Enzyme Linked Fluorescence Assay) aglutinacijo imunomagnetno precipitacijo (IMS - Immuno Magnetic Separation) 32

33 ELISA S P protitelo z encimom E protein ELISA 33

34 Metode za določanje strukture mikrobne družbe na osnovi nukleinskih kislin sekvenciranje DNA DNA hibridizacije PCR kloniranje metagenomika 34

35 vzorec Molekularne metode ekstrakt DNA PCR PCR in kloniranje restrikcija mikroskopija pregled klonov profil združbe FISH dizajn in izbira ustreznih prob sekvenciranje in ID individualni kloni T-RFLP knjižnica klonov 35

36 Molekularna identifikacija: sekvenciranje DNA 3 C G A C T C G A T T C 5 DNA, ki jo sekvenciramo -AG -AGCTAAG radioaktivno označen začetnik ddgtp ddatp ddttp ddctp -AGCT -AGC -A -AGCTA -AGCTAA G A T C avtomatsko sekvenciranje s fluorescenčno označenimi dideoksi nukleotidi 36

37 Molekularna identifikacija: GC deleži Organizmi s podobnimi fenotipi imajo podobna GC razmerja. Po drugi strani pa imajo organizmi lahko podobne GC deleže, vendar so taksonomsko in filogenetsko različni. 37

38 Hibridizacija DNA vrsta A vrsta B vrsta C A G C A A T G C T C G T T A C G A G T T T C A A T C G T T A C G T T T C C G A A T C G T T A C G Tarčna DNA in označena neznana DNA sta homologni in zato dobro hibridizirata. Tarčna DNA in neznana DNA sta delno homologni in zato delno hibridizirata. Tarčna DNA in nznana DNA sta nehomologni in ne hibridizirata. 38

39 Molekularna identifikacija - restrikcijska analiza DNA vrsta A DNA vrsta B Restrikcijsko analizo lahko naredimo za celoten genom (RFLP makrorestrikcijska analiza), ali pa za izbrani gen (npr. ribotipizacija). Predhodno lahko željeni del DNA namnožimo s PCR in tako dobimo AFLP profil. 39

40 RAPD - PCR, (Random Amplification of Polymorphic DNA) uporabljamo za identifikacijo specifične variabilnosti med vrstami izbrane začetne oligonukleotide za amplifikacijo kromosomske DNA uporabljamo pri manj strogih pogojih PCR namnoževanja (npr. nižje temperature), kar omogoča vezavo tudi na nesorodno DNA zaradi variabilnosti DNA različnih organizmov pride do različnega števila in velikosti PCR pomnožkov, kar omogoča identifikacijo 40

41 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) s PCR selektivno pomnožimo restrikcijske fragmente, ki smo jih predhodno dobili z restrikcijskimi endonukleazami PCR pomnožke ločimo z gelsko elektroforezo AFLP ne zahteva predhodnega poznavanja specifičnih zaporedij DNA in poteka z uporabo dveh specifičnih oligonukleotidnih začetnikov metoda je predvsem uporabna za tipizacijo in preiskavo DNA različnega izvora 41

42 SSCP (single stranded conformational polymorphysm) PCR pomnožke segrejemo na 95 o C in jih nato zelo hitro ohladimo enovrvična DNA se zvije v 3D strukturo, ki je odvisna od baznih parov različne DNA imajo različne 3D strukture, ki različno hitro potujejo na elektroforezi pri homolognih DNA fragmentih dobimo eno liso pri heterolognih pa dve (občutljivost za mutacije, npr. insercije, delecije) 42

43 Heterodupleks analiza dva PCR pomnožka sta zmešana v enekih deležih in denaturirana pri 95 o C mešanica se nato počasi ohladi med ohlajanjem pride do renaturacije in tvorbe heterodupleksov vsaka napaka pri nalaganju se bo poznala kot različna 3D struktura in posledično različna mobilnost na elektroforezi 43

44 Molekularna identifikacija: ribotipizacija polimorfizem na celotnem genomu se velikokrat kaže tudi na posameznih genih geni za ribosomsko RNA so običajno evolucijsko stabilni in imajo zaradi tega bolj enostaven restrikcijski vzorec naredimo RFLP polimorfizem genov za rrna po encimskem razrezu DNA identificiramo rdna fragmente s Southeren blot analizo primerjamo restrikcijske vzorce različnih organizmov 44

45 Molekularna identifikacija - FISH z ribosomsko tarčo A T T C G A C Vezava označene probe na ribosome tarčnega organizma mikroskopija 45

46 Sestava bakterijskega ribosoma 50S 23S rrna + 5S rrna 30S 16S rrna 23S rrna 5S rrna 16S rrna ~ 2900 nukleotidov ~ 120 nukleotidov ~ 1500 nukleotidov 46

47 Bakterijski ribosom 50S 30S proteini rrna 47

48 16S rrna 48

49 Določanje 16S rrna sekvence mikroorganizem izolirana DNA 16S rrna gen PCR pomnoževanje DNA Sekvenciranje 16S rrna PCR pomnožka 49

50 Konstrukcija klonske knjižnice iz rdna ekstrakcija DNA pomnožitev DNA s PCR kloniranje pomnoženih genov v E. coli gojitev E.coli, prenos na titrske plošče ekstrakcija individualnih DNA fragmentov in elektroforeza sekvenciranje in identifikacija 50

51 Ločevanje PCR pomnožkov Če želimo ločit PCR pomnožke 16S rrna, potem je navadna gelska elektroforeza nezadostna, ker so vsi pomnožki približno enako veliki. Alternative: ARDRA TRFLP ITS-RFLP DGGE TGGE 51

52 ARDRA-PCR 16S rdna (amplified ribosomal DNA restriction analysis) Staphilococcov 52

53 Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) vrsta A C A B E D vrsta B vrsta C profil združbe vrsta D vrsta E Fluorescenčni primer mesto, kjer reže encim 53

54 DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis) majhni DNA fragmenti potujejo pri elektroforezi skozi poliakrilamidni gel v gradientu formamida ali urea DNA fragmenti se pri kritični koncentraciji denaturanta raztopijo (iz dvojne vijačnice nastane enojna) pri tem se jim spremeni struktura in se prenehajo gibati v električnem polju GC spona na enem koncu prepreči popolno razpiranje vijačnic zaradi razlik v sestavi DNA dobimo raztapljanje pri različnih koncentracijah denaturanta 54

55 TGGE (temperature gradient gel electrophoresis) majhni DNA fragmenti potujejo pri elektroforezi skozi poliakrilamidni gel v temperaturnem gradientu DNA fragmenti se pri kritični temperaturi raztopijo pri tem se jim spremeni struktura in se prenehajo gibati v električnem polju GC spona na enem koncu prepreči popolno razpiranje vijačnic zaradi razlik v sestavi DNA dobimo raztapljanje pri različnih temperaturah lahko uporabljamo tudi za analizo RNA in proteinov 55

56 ITS-RFLP (Intergenic spacer-restriction fragment length polymorphism) ITS1 ITS2 začetni oligonukleotid v 18S 18S 5.8S 28S začetni oligonukleotid v 28S 5.8S PCR produkt 56

57 Metode za nukleinske kisline PCR in kloniranje ekstrakt DNA vzorec ekstrakt mrna pregled klonov reverzna transkripcija DNA sekvenciranje in ID dizajn prajmerjev za vrsto ali gen kventifikacija vrste ali gena knjižnica klonov Q-PCR kvantifikacija genske ekspresije 57

58 Kvantitativni real-time PCR polimerizacija R Q ločevanje fluorescenčne probe 3 R Q cepitev fluorescenčne probe 3 5 R Q 5 3 S cepitvijo fluorescenčne probe se sprosti quenching fluorofora, kar omogoča polimerizacija komnčana 3 R Q 5 povečan kvantni prinos fluorescence

59 DNA mikročipi za določanje strukture mikrobne združbe mikročip je sestavljen iz več različnih celotnih genomskih DNA iz dobro okrakteriziranih referenčnih organizmov ali pa iz okoljskih vzorcev dodamo izolirano DNA in ugotavljamo hibridizacijo z znanimi vrstami, kar nam omogoča določitev strukture mikrobne združbe uporabni za nativne vzorce, za sledenje sprememb v združbi zaradi polucije ali druge fizikalno-kemijske spremembe 59

60 2003 Metagenomika vzamemo okoljski vzorec pridobimo celotno DNA sekvenciramo DNA (shot gun tehnika) z matematičnimi algoritmi obdelamo dobljene sekvence preverimo kateri genomi in kateri geni so prisotni v vzorcu 60

61 Diverziteta ali podobnost mikroorganizmov, ki tvorijo mikrobno združbo Katerakoli metoda, ki nam omogoča kvantitativno razlikovanje med mikroorganizmi je uporabna za izgradnjo statističnih sorodstvenih dreves (npr. PLFA, 16s rrna). 61

62 Evolucijske razdalje Povprečno število različnih nukleotidov na 100 nukleotidov. A B C D E A 0.00 B C D E A in B sta si najbližja, zato ju združimo A B 62

63 Evolucijske razlike Povprečno število različnih nukleotidov na 100 nukleotidov. A-B C D C 1.54 D E Primer izračuna razdalja od klade (A-B) do C = (A-C+B-C)/2 = ( )/2 = 1.54 Od vseh klonov je najbližje A-B kladi klon C C A B 63

64 Evolucijske razlike Število različnih nukleotidov na 100 mest. A-B-C D D E Primer izračuna razdalja od klade (A-B-C) do E D C A B D = (A-D+B-D+C-D)/3 = ( )/3 = 3.0 Od vseh klonov je najbližje kladi A-B-C klon D. Klada A-B-C je zelo blizu politomije, kjer ne moremo zanesljivo ločiti, katera vrsta se je evolucijsko prej ločila. 64