ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΗ ΔΙΑΣΡΙΒΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΨΝ ΦΟΛΗ ΕΠΙΣΗΜΨΝ ΤΓΕΙΑ ΣΜΗΜΑ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΟΓΚΟΛΟΓΙΚΟ ΣΜΗΜΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΗ ΔΙΑΣΡΙΒΗ Μελϋτη τησ ϋκφραςησ των πρωτεογλυκανών ςε όγκουσ όρχεων εκ βλαςτικών κυττϊρων και ςυςχϋτιςό τουσ με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενών ΒΑΙΛΙΚΗ Θ. ΛΑΜΠΡΟΠΟΤΛΟΤ ΙΑΣΡΟ ΑΙΜΑΣΟΛΟΓΟ ΠΑΣΡΑ 2010 ΕΠΙΒΛΕΠΨΝ ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΦΑΡΑΛΑΜΠΟ ΚΑΛΟΥΨΝΟ ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑ - ΟΓΚΟΛΟΓΙΑ ΔΙΕΤΘΤΝΣΗ ΟΓΚΟΛΟΓΙΚΟΤ ΣΜΗΜΑΣΟ ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 1

2 2

3 Η παροϑςα διδακτορικό διατριβό εκπονόθηκε ςτα πλαύςια του μεταπτυχιακοϑ προγρϊμματοσ ςπουδϔν του Σμόματοσ Ιατρικόσ Πανεπιςτημύου Πατρϔν. ΣΡΙΜΕΛΗ ΤΜΒΟΤΛΕΤΣΙΚΗ ΕΠΙΣΡΟΠΗ 1. ΚΑΛΟΥΨΝΟ ΦΑΡΑΛΑΜΠΟ, ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑ-ΟΓΚΟΛΟΓΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 2. ΠΕΡΙΜΕΝΗ ΠΕΣΡΟ, ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΟΤΡΟΛΟΓΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 3. ΚΑΡΑΜΑΝΟ ΝΙΚΟΛΑΟ, ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΒΙΟΦΗΜΕΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΦΗΜΕΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 3

4 4

5 ΕΠΣΑΜΕΛΗ ΕΞΕΣΑΣΙΚΗ ΕΠΙΣΡΟΠΗ 1. ΚΑΛΟΥΨΝΟ ΦΑΡΑΛΑΜΠΟ, ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑ-ΟΓΚΟΛΟΓΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 2. ΠΕΡΙΜΕΝΗ ΠΕΣΡΟ, ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΟΤΡΟΛΟΓΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 3. ΚΑΡΑΜΑΝΟ ΝΙΚΟΛΑΟ, ΚΑΘΗΓΗΣΗ ΒΙΟΦΗΜΕΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΦΗΜΕΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 4. ΚΑΡΑΚΑΝΣΖΑ ΜΑΡΙΝΑ, ΑΝΑΠΛΗΡΨΣΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΣΡΙΑ ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΑΙΜΑΣΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΙΜΟΔΟΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 5. ΠΑΠΑΓΕΨΡΓΑΚΟΠΟΤΛΟΤ ΝΙΚΟΛΕΣΣΑ, ΑΝΑΠΛΗΡΨΣΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΣΡΙΑ ΒΙΟΦΗΜΕΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΦΗΜΕΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 6. ΖΟΛΨΣΑ ΒΑΙΛΙΚΗ, ΑΝΑΠΛΗΡΨΣΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΣΡΙΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΣΟΜΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 7. ΚΟΤΡΕΑ ΜΑΡΙΑ ΕΛΕΝΗ, ΕΠΙΚΟΤΡΗ ΚΑΘΗΓΗΣΡΙΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΣΟΜΙΑ, ΣΜΗΜΑΣΟ ΙΑΣΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟΤ ΠΑΣΡΨΝ 5

6 6

7 Περιεχϐμενα ΤΝΣΟΜΟΓΡΑΥΙΕ ΕΠΕΞΗΓΗΕΙ..11 ΠΡΟΛΟΓΟ 17 ΕΙΑΓΨΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΟΤ ΚΑΡΚΙΝΟΤ ΔΙΗΘΗΗ ΚΑΙ ΜΕΣΑΣΑΗ ΚΑΛΟΗΘΕΙ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΕΙ ΟΓΚΟΙ ΥΤΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΣΟΜΙΑ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ ΝΕΟΠΛΑΙΑ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ ΣΑΞΙΝΟΜΗΗ ΣΨΝ ΝΕΟΠΛΑΙΨΝ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ ΟΓΚΟΙ ΠΡΟΕΡΦΟΜΕΝΟΙ ΑΠΟ ΣΑ ΒΛΑΣΙΚΑ ΚΤΣΣΑΡΑ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΟΙΦΕΙΑ ΑΙΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΣΕ ΚΛΙΝΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΕΠΕΚΣΑΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΓΕΝΕΣΙΚΗ ΤΦΕΣΙΗ ΣΑΔΙΟΠΟΙΗΗ ΣΨΝ ΟΓΚΨΝ ΟΡΦΕΨΝ ΠΡΟΔΡΟΜΕ ΑΛΛΟΙΨΕΙ ΑΣΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΕΝΔΟΨΛΗΝΑΡΙΑΚΗ ΝΕΟΠΛΑΙΑ ΕΚ ΒΛΑΣΙΚΨΝ ΚΤΣΣΑΡΨΝ (IGCNU) ΟΓΚΟΙ ΑΠΟΣΕΛΟΤΜΕΝΟΙ ΑΠΟ ΜΙΑ ΜΟΝΟ ΙΣΟΛΟΓΙΚΗ ΜΟΡΥΗ ΕΜΙΝΨΜΑ ΠΕΡΜΑΣΟΚΤΣΣΑΡΙΚΟ ΕΜΙΝΨΜΑ ΕΜΒΡΤΪΚΟ ΚΑΡΚΙΝΨΜΑ ΟΓΚΟΙ ΣΟΤ ΛΕΚΙΘΙΚΟΤ ΑΚΟΤ ΦΟΡΙΟΚΑΡΚΙΝΨΜΑ ΣΕΡΑΣΨΜΑ ΜΙΚΣΟΙ ΟΓΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΣΟΤ ΣΡΨΜΑΣΟ ΣΨΝ ΓΟΝΑΔΨΝ ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΚΤΣΣΑΡΨΝ LEYDIG ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΚΤΣΣΑΡΨΝ SERTOLI ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΟ ΦΨΡΟ.72 7

8 Περιεχϐμενα 4.1. Ο ΡΟΛΟ ΣΟΤ ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΟΤ ΦΨΡΟΤ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΔΟΜΗ ΣΨΝ ΓΛΤΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΒΙΟΤΝΘΕΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΒΙΟΤΝΘΕΗ ΣΨΝ ΓΛΤΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΚΑΣΑΣΑΞΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΣΗ ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΕΝΔΟΚΤΣΣΑΡΙΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΣΟΤΡΓΙΚΟΣΗΣΑ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΠΟΤ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΤΝ ΜΕ ΣΟ ΗΑ ΚΑΙ ΠΡΟΟΜΟΙΑΖΟΤΝ ΜΕ ΛΕΚΣΙΝΕ (HYALECTANS) VERSICAN ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΣΗ ΒΑΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ PERLECAN ΜΙΚΡΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΠΛΟΤΙΕ Ε ΛΕΤΚΙΝΗ (SLRPs) DECORIN ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ Ο ΤΠΟΔΟΦΕΑ CD Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΣΨΝ SYNDECANS Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΣΨΝ GLYPICANS.108 ΚΟΠΟ 111 ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΟ ΜΕΡΟ ΑΠΟΜΟΝΨΗ ΚΑΙ ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΣΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΛΙΚΟ ΚΑΙ Η ΚΑΣΕΡΓΑΙΑ ΣΟΤ ΕΚΦΤΛΙΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΕΝΖΤΜΙΚΗ ΚΑΣΕΡΓΑΙΑ ΜΕ ΦΟΝΔΡΟΪΣΙΝΑΗ ABC ΑΝΑΛΤΣΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΦΡΨΜΑΣΟΜΕΣΡΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΗΛΕΚΣΡΟΥΟΡΗΣΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΟΟΛΟΓΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΜΟΝΨΗ ΣΟΤ RNA ΚΑΙ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ 8

9 Περιεχϐμενα ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΜΕ RT-PCR ΕΚΦΤΛΙΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΨΗ ΣΟΤ RNA ΠΑΡΑΚΕΤΗ cdna ΑΛΤΙΔΨΣΗ ΑΝΣΙΔΡΑΗ ΠΟΛΤΜΕΡΑΗ ΗΛΕΚΣΡΟΥΟΡΗΗ ΚΑΙ ΠΟΟΣΙΚΗ ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΨΝ ΠΡΟΪΟΝΣΨΝ ΣΗ PCR Ε ΠΗΚΣΨΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗ ΑΝΟOΪΣΟΦΗΜΙΚΕ ΦΡΨΕΙ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΠΕΡΙΓΡΑΥΗ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΤ ΣΑΣΙΣΙΚΗ ΑΝΑΛΤΗ 136 ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ ΕΠΙΚΟΠΙΗ ΣΨΝ ΔΕΙΓΜΑΣΨΝ ΜΕΛΕΣΗ ΣΨΝ ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ VERSICAN ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ VERSICAN Ε ΥΤΙΟΛΟΓΙΚΟΤ ΙΣΟΤ ΚΑΙ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΨΗ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ VERSICAN ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ VERSICAN ΣΟΤ ΜΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ VERSICAN ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ DECORIN ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ DECORIN Ε ΥΤΙΟΛΟΓΙΚΟΤ ΙΣΟΤ ΚΑΙ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΨΗ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ DECORIN ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ DECORIN ΣΟΤ ΜΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ 152 9

10 Περιεχϐμενα ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ DECORIN ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕΛΕΣΗ ΣΨΝ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ SYNDECAN ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΚΑΙ ΗΜΙΠΟΟΣΙΚΗ ΑΝΑΛΤΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ Ε ΥΤΙΟΛΟΓΙΚΟΤ ΙΣΟΤ ΚΑΙ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕ RT-PCR ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΣΟΤ ΜΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΣΟ ΣΡΨΜΑ ΣΨΝ ΟΓΚΨΝ ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕΛΕΣΗ ΣΟΤ CD ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΟΤ CD44 ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΟΤ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΟΤ CD44 ΣΟΤ ΜΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΟΤ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΟΤ CD44 ΣΟ ΣΡΨΜΑ ΣΨΝ ΟΓΚΨΝ ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ 172 ΤΖΗΣΗΗ ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ..173 ΠΕΡΙΛΗΧΗ.193 ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ

11 ΤΝΣΟΜΟΓΡΑΥΙΕ - ΕΠΕΞΗΓΗΕΙ 11

12 12

13 υντομογραφύεσ - Επεξηγόςεισ A ABP AcONa ADAMTS ADAMTS-1 ADAMTS-4 AFP AMH bfgf β-hcg C CaMKII cdna CEA CS CS/DSPGs DAB D-ClcA DNA dntps DS ECM EDTA EGF EGFR EMA ΕΜΣ EtBr FAK FGF Αδενύνη ΠρωτεϏνη ενωμϋνη με ανδρογϐνα Οξικϐ νϊτριο Μεταλλοπρωτεϊςεσ τϑπου αδαμαλυςύνησ με περιοχϋσ που ομοιϊζουν ςτη θρομβοςπονδύνη Μεταλλοπρωτεϊςεσ τϑπου αδαμαλυςύνησ με περιοχϋσ που ομοιϊζουν ςτη θρομβοςπονδύνη-1 Μεταλλοπρωτεϊςεσ τϑπου αδαμαλυςύνησ με περιοχϋσ που ομοιϊζουν ςτη θρομβοςπονδύνη-4 Άλφα φετοπρωτεϗνη Ορμϐνη κατϊ των πϐρων του Muller Βαςικϐσ αυξητικϐσ παρϊγοντασ ινοβλαςτϔν Βότα υπομονϊδα τησ χοριακόσ γοναδοτροπύνησ Κυτοςύνη Aςβϋςτιο / καλμοντουλύνη εξαρτϔμενησ κινϊςησ ΙΙ υμπληρωματικϐ δεοξυριβονουκλεώκϐ οξϑ Καρκινοεμβρυικϐ αντιγϐνο Θειώκό χονδροώτύνη Πρωτεογλυκϊνεσ θειώκόσ χονδροώτύνησ / θειώκόσ δερματϊνησ Διαμινοβενζιδύνη D-Γλυκουρονικϐ οξϑ Δεοξυ-ριβονουκλεώκϐ οξϑ Σριφωςφορικϊ δεοξυ-νουκλεοτύδια Θειώκό δερματϊνη Εξωκυττϊριοσ χϔροσ Αιθυλενο-διαμινο-τετρα-οξικϐ οξϑ Επιδερμικϐσ αυξητικϐσ παρϊγοντασ Τποδοχϋασ του επιδερμικοϑ αυξητικοϑ παρϊγοντα Επιθηλιακϐ μεμβρανικϐ αντιγϐνο Μετϊπτωςη απϐ τον επιθηλιακϐ ςε μεςεγχυματικϐ φαινϐτυπο Βρωμιοϑχο αιθύδιο Κινϊςη εςτιακόσ προςκϐλληςησ Αυξητικϐσ παρϊγοντασ ινοβλαςτϔν 13

14 υντομογραφύεσ - Επεξηγόςεισ FSH G GAG Gal GalNAc GAPDH GdnHCl GlcNAc GPI HA HGF hnrna HP HS HSPGs IGCNU IGF kda KS KSPGs LDH LDL LH L-IdoA MAPKs mirna MMPs MMP-2 MMP-9 mrna ΜΣ1-ΜΜΡ NEM PAPS Θυλακιϐτροποσ ορμϐνη Γουανύνη Γλυκοζαμινογλυκϊνη Γαλακτϐζη Ν-ακετυλο-γαλακτοζαμύνη Αφυδρογονϊςη τησ 3 φωςφορικόσ γλυκεραλδεϓδησ Τδροχλωρικό γουανιδύνη Ν-ακετυλο-γλυκοζαμύνη ΓλυκοζυλφωςφατιδυλοϏνοςιτϐλη Ταλουρονικϐ οξϑ Ηπατοκυτταρικϐσ αυξητικϐσ παρϊγοντασ Ετεροπυρηνικϐ ριβονουκλεώκϐ οξϑ Ηπαρύνη Θειώκό ηπαρϊνη Πρωτεογλυκϊνεσ θειώκόσ ηπαρϊνησ Αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα εκ βλαςτικϔν κυττϊρων Αυξητικϐσ παρϊγοντασ ινςουλύνησ 10 3 x 1/12 τησ μϊζασ του ατϐμου του ιςοτϐπου 12 C Θειώκό κερατϊνη Πρωτεογλυκϊνεσ θειώκόσ κερατϊνησ Γαλακτικό αφυδρογονϊςη ΛιποπρωτεϏνη χαμηλόσ πυκνϐτητασ Ωχρινϐτροποσ ορμϐνη L-Ιδουρονικϐ οξϑ Πρωτεώνικϋσ κινϊςεσ που ενεργοποιοϑνται απϐ μιτογϐνα Μικροριβονουκλεώκϐ οξϑ Μεταλλοπρωτεϊςεσ του εξωκυττϊριου χϔρου Μεταλλοπρωτεϊςη-2 του εξωκυττϊριου χϔρου Μεταλλοπρωτεϊςη-9 του εξωκυττϊριου χϔρου Αγγελιοφϐρο ριβονουκλεώκϐ οξϑ Μεμβρανικοϑ τϑπου-1 μεταλλοπρωτεϊςη του εξωκυττϊριου χϔρου Ν-αιθυλο-μηλεώνιμύδιο 3 φωςφοαδενοςινο-5 -φωςφοθειϗκϐ 14

15 υντομογραφύεσ - Επεξηγόςεισ PBS 80 mm Na2HPO4-20 mm NaH2PO M NaCl, ph 7.4 PDGF Αυξητικϐσ παρϊγοντασ αιμοπεταλύων PG Πρωτεογλυκϊνη PKCα Πρωτεώνικό κινϊςη Cα PKCδ Πρωτεώνικό κινϊςη Cδ PLAP Πλακουντιακό αλκαλικό φωςφατϊςη PMSF Υαινυλο-μεθανο-ςουλφονυλο-φθορύδιο RGD Αλληλουχύα αργινύνησ-γλυκύνησ-αςπαραγύνησ RNA Ριβονουκλεώκϐ οξϑ RΝases Ριβονουκλεϊςεσ rrna Ριβοςωμικϐ ριβονουκλεώκϐ οξϑ RT-PCR Αλυςιδωτό αντύδραςη πολυμερϊςησ - αντύςτροφησ μεταγραφϊςησ SDS Θειώκϐ δωδεκυλικϐ νϊτριο SDS-PAGE Ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα πολυακρυλαμιδύου παρουςύα SDS T Θυμύνη TBE Διϊλυμα Tris-Βορικϐ-EDTA TGCTs Όγκοι ϐρχεων προερχϐμενοι απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα TGF-β Αυξητικϐσ παρϊγοντασ μεταςχηματιςμοϑ-β TIMPs Αναςτολεύσ των μεταλλοπρωτεαςϔν Tris-HCl Σρισ-υδροξυ-μεθυλο-αμινο-μεθϊνιο υδροχλωρικϐ Triton X-100 Ιςοοκτυλ-φαινοξυ-πολυαιθοξυ-αιθανϐλη trna Μεταφορικϐ ριβονουκλεώκϐ οξϑ Tween-20 Πολυοξυαιθυλενο-ςορβιταν-μονολεώκϐ VEGF Αυξητικϐσ παρϊγοντασ αγγειακοϑ ενδοθηλύου VEGFR-2 Τποδοχϋασ τϑπου-2 του αυξητικοϑ παρϊγοντα του αγγειακοϑ ενδοθηλύου WHO Παγκϐςμιοσ Οργανιςμϐσ Τγεύασ 15

16 16

17 17 ΠΡΟΛΟΓΟ

18 18

19 Πρϐλογοσ Θα όθελα να εκφρϊςω τισ ευχαριςτύεσ μου ςε ϐλουσ ϐςουσ με βοόθηςαν και μου ςυμπαραςτϊθηκαν κατϊ την εκπϐνηςη τησ διδακτορικόσ διατριβόσ μου. Ιδιαύτερα, θα όθελα να ευχαριςτόςω τον Καθηγητό Παθολογύασ-Ογκολογύασ κ. Φ. Καλϐφωνο για την καθοδόγηςη και την ανεκτύμητη ςυνειςφορϊ του ςε ϐλα τα ςτϊδια τησ ιατρικόσ εκπαύδευςόσ μου, απϐ τα πρϔτα μου βόματα ωσ φοιτότρια Ιατρικόσ ςτο μϊθημα τησ «φυςικόσ εξϋταςησ αςθενοϑσ» ϋωσ την ανϊθεςη και επύβλεψη τησ διδακτορικόσ διατριβόσ μου. Θεωρϔ χρϋοσ μου να εκφρϊςω την ευγνωμοςϑνη μου για την ηθικό ςυμπαρϊςταςη και την εμπιςτοςϑνη που μου προςϋφερε ϐλα αυτϊ τα χρϐνια αλλϊ και για τη διδαχό του τρϐπου με τον οπούο ο επιςτόμονασ και ϊνθρωποσ πρϋπει να πορεϑεται. Θα όθελα επύςησ να ευχαριςτόςω τον Καθηγητό Ουρολογύασ κ. Π. Περιμϋνη, ο οπούοσ όταν πϊντα πρϐθυμοσ να μου προςφϋρει την επιςτημονικό του ϊποψη και για τη ςημαντικό ςυνειςφορϊ του ςτη διατριβό μϋςω τησ διϊθεςησ των ιςτϔν που μελετόθηκαν. Επύςησ, θα όθελα να ευχαριςτόςω τον Καθηγητό Βιοχημεύασ κ. Ν. Καραμϊνο για την καθοριςτικό ςυνειςφορϊ του ςτη μελϋτη καθϔσ ςημαντικϐ μϋροσ των πειραμϊτων εκπονόθηκε ςτο εργαςτόριϐ του. Ευχαριςτϔ ιδιαύτερα, τη Διευθϑντρια Ε..Τ. του Εργαςτηρύου Παθολογικόσ Ανατομύασ κ. Π. Ραβαζοϑλα, για τη δυνατϐτητα που μου ϋδωςε να χρηςιμοποιόςω υλικϐ απϐ το αρχεύο του Εργαςτηρύου και για την πολϑτιμη ςυνειςφορϊ τησ ϐςον αφορϊ την πραγματοπούηςη και ανϊλυςη των εργαςτηριακϔν πειραμϊτων, χωρύσ τη βοόθεια τησ οπούασ δεν θα όταν δυνατό η ολοκλόρωςη τησ παροϑςασ μελϋτησ. Επύςησ, ευχαριςτϔ την Αναπληρϔτρια Καθηγότρια Εργαςτηριακόσ Αιματολογύασ και Αιμοδοςύασ κ. Μ. Καρακϊντζα, για την πολϑτιμη ςυμπαρϊςταςη και ηθικό υποςτόριξη κατϊ την εκπϐνηςη τησ διατριβόσ μου καθϔσ και για την αμϋριςτη βοόθεια και φιλύα τησ. Θα όθελα να ευχαριςτόςω την Αναπληρϔτρια Καθηγότρια Βιοχημεύασ κ. Ν. Παπαγεωργακοποϑλου για το διακριτικϐ αλλϊ ςυνϊμα ουςιαςτικϐ ενδιαφϋρον τησ για την πορεύα τησ διδακτορικόσ διατριβόσ μου. Επύςησ, ευχαριςτϔ την Αναπληρϔτρια Καθηγότρια Παθολογικόσ Ανατομύασ κ. Β. Ζολϔτα για τισ ςημαντικϋσ παρατηρόςεισ τησ κατϊ τη ςυγγραφό και παρουςύαςη τησ μελϋτησ και την εποικοδομητικό κριτικό τησ. 19

20 Πρϐλογοσ Θα όθελα επύςησ να ευχαριςτόςω την Επύκουρη Καθηγότρια Παθολογικόσ Ανατομύασ κ. Μ. Κουρϋα η οπούα όταν πϊντα πρϐθυμη να μου προςφϋρει την επιςτημονικό τησ ϊποψη. Ευχαριςτϔ ιδιαύτερα, τον Καθηγητό Παθολογικόσ Ανατομύασ τησ Ιατρικόσ χολόσ του Ινςτιτοϑτου Karolinska κ. Anders Hjerpe για τη ςημαντικό ςυνειςφορϊ του ςτη μελϋτη καθϔσ μϋροσ τησ διατριβόσ εκπονόθηκε ςτο εργαςτόριϐ του και ςυμμετεύχε ωσ αξιολογητόσ των ανοςοώςτοχημικϔν χρϔςεων. Ευχαριςτϔ το φύλο Γρηγϐρη Οικονϐμου, Επιςτημονικϐ υνεργϊτη του Ογκολογικοϑ Σμόματοσ, για τη πολϑτιμη βοόθειϊ του ςτην επεξεργαςύα των αποτελεςμϊτων. Σϋλοσ, θα όθελα επύςησ να ευχαριςτόςω την οικογϋνειϊ μου για την απλϐχερη υποςτόριξη και βοόθεια που μου προςφϋρει και ιδιαύτερα το ςϑζυγϐ μου Αχιλλϋα για την καθοριςτικό ςυνειςφορϊ του ςτην εκπϐνηςη τησ διδακτορικόσ διατριβόσ μου απϐ τη ςϑλληψη τησ πρωταρχικόσ ιδϋασ ϋωσ την ολοκλόρωςη τησ μελϋτησ. 20

21 21 ΕΙΑΓΨΓΗ

22 22

23 Ειςαγωγό 1. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΟΤ ΚΑΡΚΙΝΟΤ Οι κακοόθεισ νϐςοι ςυμπεριλαμβϊνονται ςτισ κυριϐτερεσ αιτύεσ νοςηρϐτητασ και θνητϐτητασ ςτισ ανεπτυγμϋνεσ χϔρεσ ενϔ η ϋρευνα για την παθογϋνεια και τη θεραπεύα τουσ ελκϑει παγκοςμύωσ το ενδιαφϋρον των ερευνητϔν. Η κυτταρικό διαύρεςη και ο κυτταρικϐσ πολλαπλαςιαςμϐσ εύναι φυςιολογικϋσ λειτουργύεσ που λαμβϊνουν χϔρα ςε ϐλουσ ςχεδϐν τουσ ιςτοϑσ. Προκειμϋνου να εξαςφαλιςτεύ η ακεραιϐτητα των οργϊνων και των ιςτϔν απαιτεύται αυςτηρό ρϑθμιςη μεταξϑ πολλαπλαςιαςμοϑ και προγραμματιςμϋνου κυτταρικοϑ θανϊτου (απϐπτωςη). Ο ϐροσ καρκύνοσ χαρακτηρύζει μια διαδικαςύα που προκϑπτει εξαιτύασ απϔλειασ τησ ικανϐτητασ ρϑθμιςησ τησ ανϊπτυξησ και διαύρεςησ των κυττϊρων ενϐσ ιςτοϑ που ϋχουν ωσ αποτϋλεςμα τον ανεξϋλεγκτο πολλαπλαςιαςμϐ αυτϔν των κυττϊρων. Η παθογϋνεια του καρκύνου αποδύδεται ςε γενετικϋσ αλλαγϋσ ςτο DNA των ςωματικϔν κυττϊρων κατϊ τη διϊρκεια τησ ζωόσ του ατϐμου που προκαλοϑνται υπϐ την επύδραςη ποικύλων παραγϐντων (περιβαλλοντικϔν, διατροφικϔν, χημικϔν, λοιμωδϔν, φαρμακευτικϔν, κ.α.). την περύπτωςη που οι βλϊβεσ αφοροϑν το γονιδύωμα των γενετικϔν κυττϊρων το γενετικϐ ςφϊλμα μεταβιβϊζεται ςτουσ απογϐνουσ. Οι γενετικϋσ αλλαγϋσ θα προκαλϋςουν ανεξϋλεγκτο πολλαπλαςιαςμϐ των καρκινικϔν κυττϊρων, με αποτϋλεςμα αρχικϊ τη δημιουργύα μορφϔματοσ και ςτη ςυνϋχειαςτη ςυνϋχεια ενϐσ ςυμπαγοϑσ ϐγκου ό νεοπλϊςματοσ. Αξύζει να ςημειωθεύ ϐτι η ταχεύα κυτταρικό ανϊπτυξη δεν εύναι ςυνϔνυμη τησ κακοόθειασ καθϔσ παρατηρεύται ςε φυςιολογικϋσ καταςτϊςεισ, ϐπωσ εύναι η φλεγμονό, η εποϑλωςη τραϑματοσ ό κατϊ τη διϊρκεια τησ εγκυμοςϑνησ. Όταν μια φυςιολογικό ταχεύα κυτταρικό ανϊπτυξη ολοκληρωθεύ, ομϊδα γονιδύων δύνει εντολό ςτο κϑτταρο να ςταματόςει τη διαδικαςύα πολλαπλαςιαςμοϑ. Σο καρκινικϐ κϑτταρο ϐμωσ δεν υπακοϑει ςε αυτό την εντολό εξαιτύασ αλλαγϔν ςτο γενετικϐ του υλικϐ, με αποτϋλεςμα ο πολλαπλαςιαςμϐσ να ςυνεχύζεται και τα κακοόθη κϑτταρα να εξακολουθοϑν να διαιροϑνται ανεξϋλεγκτα. Σρεισ κατηγορύεσ γονιδύων ςυμμετϋχουν ςτην καρκινογϋνεςη, ςε περύπτωςη που μεταλλαχθοϑν. Οι κατηγορύεσ αυτϋσ εύναι: Σα ογκογονύδια ό πρωτο-ογκογονύδια Σα ογκο-καταςταλτικϊ γονύδια Σα επιδιορθωτικϊ γονύδια 23

24 Ειςαγωγό Α. Σα πρωτο-ογκογονύδια εύναι γονύδια που προϊγουν την κυτταρικό ανϊπτυξη με ποικύλουσ τρϐπουσ. Ένασ τρϐποσ εύναι μϋςω τησ παραγωγόσ ορμονϔν ό μιτογϐνων που επϊγουν τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ. Ένασ ϊλλοσ τρϐποσ εύναι μϋςω τησ εμπλοκόσ τουσ ςτη μεταγραφό του DNΑ και ςτην πρωτεώνοςϑνθεςη ρυθμύζοντασ μονοπϊτια μεταγωγόσ ςόματοσ και την ϋκφραςη ειδικϔν υποδοχϋων ςτα κϑτταρα. ε περύπτωςη μετϊλλαξησ κϊποιου πρωτο-ογκογονύδιου, μπορεύ να προκληθεύ τροποπούηςη ςτην ϋκφραςη ό ςτη λειτουργύα τησ κωδικοποιοϑμενησ πρωτεϗνησ, με αποτϋλεςμα την αϑξηςη του ποςοϑ τησ ό τησ δραςτικϐτητϊσ τησ, αντύςτοιχα. Σα ογκογονύδια ςυμμετϋχουν ςτην ανεξϋλεγκτη κυτταρικό αϑξηςη και ςτον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ. ε περύπτωςη που μεταλλαχθοϑν, ενιςχυθοϑν ό υπερεκφραςτοϑν εύναι δυνατϐν να δημιουργηθεύ νεϐπλαςμα. Σα ογκογονύδια ανϊλογα με τη λειτουργικϐτητα τησ πρωτεϗνησ που κωδικοποιοϑν και τη θϋςη τουσ ςτο κϑτταρο, χωρύζονται ςε ϋξι κατηγορύεσ, οι οπούεσ εύναι οι εξόσ: 1) οι αυξητικού παρϊγοντεσ (ογκογονύδιο sis), 2) οι υποδοχεύσ αυξητικϔν παραγϐντων (erbb, c- erbb2), 3) οι υποδοχεύσ κινϊςησ τυροςύνησ (abl, src), 4) τα κυτταροπλαςματικϊ ογκογονύδια (raf), 5) τα πυρηνικϊ ογκογονύδια (fos, jun, erba) και 6) τα αποπτωτικϊ ογκογονύδια (bcl-2). Η μετατροπό των πρωτο-ογκογονιδύων ςε ογκογονύδια μπορεύ να γύνει εύτε μϋςω τησ παρουςύασ τουσ ςε υψηλϊ μεταγραφικϐ περιβϊλλον (μεταλλϊξεισ promoter), εύτε εξαιτύασ απϔλειασ μϋρουσ τησ αλληλουχύασ τουσ, με αποτϋλεςμα την απορρϑθμιςη τησ λειτουργύασ τουσ, εύτε τϋλοσ εξαιτύασ ςημειακόσ ό ϊλλησ μετϊλλαξησ. Β. Σα ογκοκαταςταλτικϊ γονύδια εύναι γονύδια που αναςτϋλλουν προςωρινϊ την κυτταρικό διαύρεςη προκειμϋνου να επιτευχθεύ η επιδιϐρθωςη του DNA. υνόθωσ εύναι μεταγραφικού παρϊγοντεσ που ενεργοποιοϑνται απϐ το κυτταρικϐ ςτρεσ ό απϐ βλϊβεσ του DNA. Κωδικοποιοϑν αντι-πολλαπλαςιαςτικϊ ςόματα και πρωτεϗνεσ που καταςτϋλλουν τη μύτωςη και την κυτταρικό ανϊπτυξη. Απενεργοπούηςη των γονιδύων αυτϔν προκαλεύται λϐγω ϋλλειψησ τμόματοσ ό και ολϐκληρου χρωμοςϔματοσ. ε περύπτωςη που τα χρωμοςϔματα ςτα οπούα εδρϊζονται τα ςυγκεκριμϋνα γονύδια παρουςιϊζουν κϊποιο ϋλλειμμα, με αποτϋλεςμα τη μη φυςιολογικό ϋκφραςη αυτϔν, μπορεύ να πυροδοτηθεύ ανεξϋλεγκτοσ κυτταρικϐσ πολλαπλαςιαςμϐσ. Γ. Σϋλοσ, τα επιδιορθωτικϊ γονύδια εύναι γονύδια που κωδικοποιοϑν ϋνζυμα τα οπούα ελϋγχουν το DNA για τυχϐν λϊθη που ςυνϋβηςαν κατϊ τη διϊρκεια τησ αντιγραφόσ ό 24

25 Ειςαγωγό για βλϊβεσ που προκλόθηκαν που προκλόθηκαν απϐ περιβαλλοντικοϑσ παρϊγοντεσ. Η απενεργοπούηςό τουσ οδηγεύ ςε ςυςςϔρευςη γενετικϔν βλαβϔν και αςτϊθεια του γονιδιϔματοσ με αποτϋλεςμα την αϑξηςη του κινδϑνου κακοόθουσ εξαλλαγόσ του κυττϊρου. Διαφαύνεται ϐτι η καρκινογϋνεςη εύναι ςυνόθωσ αθροιςτικϐ αποτϋλεςμα πολλαπλϔν γεγονϐτων που ϋχουν ωσ αποτϋλεςμα την ενεργοπούηςη ογκογονιδύων, την απενεργοπούηςη ογκοκαταςταλτικϔν γονιδύων και την ελλειμματικό επιδιϐρθωςη του DNA ΔΙΗΘΗΗ ΚΑΙ ΜΕΣΑΣΑΗ Σο καρκινικϐ κϑτταρο ϋχει ιδιαύτερεσ βιολογικϋσ ιδιϐτητεσ που του επιτρϋπουν την τοπικό διόθηςη καθϔσ και την απομακρυςμϋνη μετϊςταςη. Ωσ διόθηςη ορύζεται η απ ευθεύασ διεύςδυςη των καρκινικϔν κυττϊρων ςε γειτονικοϑσ ιςτοϑσ, ενϔ ωσ μετϊςταςη η διαδικαςύα κατϊ την οπούα κϑτταρα αποςπϔνται απϐ τον πρωτογενό ϐγκο και μεταφϋρονται μϋςω τησ κυκλοφορύασ του αύματοσ ό/και τησ λϋμφου, ςε ϊλλουσ ιςτοϑσ και ϐργανα, ϐπου ςυνεχύζουν την ανεξϋλεγκτη διαύρεςό τουσ, ςχηματύζοντασ δευτεροπαθεύσ εντοπύςεισ τησ νϐςου (θυγατρικοϑσ ϐγκουσ). Η μετϊςταςη χαρακτηρύζει αποκλειςτικϊ τουσ κακοόθεισ ϐγκουσ. Προκειμϋνου να αποκτόςουν μεταναςτευτικϐ φαινϐτυπο, τα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα (υφύςτανται τροποποιόςεισ που ) αναπτϑςςουν διαδοχικϋσ τροποποιόςεισ που τουσ επιτρϋπουνπουν να επιβιϔςουν και να κυκλοφορόςουν μϋςα ςτον ανθρϔπινο οργανιςμϐ, με ςκοπϐ να εγκαταςταθοϑν και να πολλαπλαςιαςτοϑν ςε ϊλλο ςημεύο του ςϔματοσ. Πρϔτο βόμα εύναι η αποκϐλληςη του καρκινικοϑ κυττϊρου απϐ τον πρωτογενό ϐγκο και η διόθηςη παρακεύμενου ιςτοϑ. Ακολουθεύ η ειςχϔρηςη ςε αγγεύα ό λεμφαγγεύα ϐπου το κϑτταρο πρϋπει να επιβιϔςει, να προςκολληθεύ ςε νϋα απομακρυςμϋνη θϋςη και εν ςυνεχεύα να εξϋλθει απϐ τα αγγεύα ό τα λεμφαγγεύα ςτον παρακεύμενο ιςτϐ και να πραγματοποιηθεύ η ανϊπτυξό του ςτη νϋα ιςτικό θϋςη. Όςα κϑτταρα καταφϋρουν να προςαρμοςτοϑν ςτο νϋο περιβϊλλον και να ενεργοποιόςουν το ςτρϔμα, θα προκαλϋςουν τη δημιουργύα μετϊςταςησ (χόμα 1). 25

26 Ειςαγωγό χόμα 1. ημαντικϊ βόματα κατϊ τη διαδικαςύα τησ μετϊςταςησ. Σα κϑτταρα αποκολλϔνται απϐ τον πρωτογενό ϐγκο και διηθοϑν παρακεύμενουσ ιςτοϑσ ενϔ μϋςω τησ ειςϐδου τουσ ςτην κυκλοφορύα δημιουργοϑν μεταςτϊςεισ ςε ϊλλουσ ιςτοϑσ και ϐργανα ΚΑΛΟΗΘΕΙ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΕΙ ΟΓΚΟΙ Οι ϐγκοι διακρύνονται ανϊλογα με την ικανϐτητα τουσ για διόθηςη ό μετϊςταςη, ςε καλοόθεισ και κακοόθεισ. Οι καλοόθεισ ϐγκοι μποροϑν να εμφανιςτοϑν οπουδόποτε ςτο ςϔμα, παραμϋνουν εντοπιςμϋνοι ςτον ιςτϐ απϐ τον οπούο προϋρχονται χωρύσ να διαθϋτουν ικανϐτητα διόθηςησ ό μετανϊςτευςησ ςε ϊλλουσ ιςτοϑσ. Ωσ κϑρια χαρακτηριςτικϊ ϋχουν την αργό ανϊπτυξη, τη ςαφό οριοθϋτηςη και διαφοροπούηςη απϐ παρακεύμενουσ ιςτοϑσ μϋςω ενϐσ ινϔδουσ περιβλόματοσ ενϔ μποροϑν να εξαιρεθοϑν με χειρουργικό επϋμβαςη. Οι κακοόθεισ ϐγκοι χαρακτηρύζονται ςυνόθωσ απϐ ραγδαύα ανϊπτυξη με υψηλϐ ρυθμϐ κυτταρικόσ διαύρεςησ και εύναι ςυνόθωσ θανατηφϐροι, αν δεν πραγματοποιηθεύ ϋγκαιρα διϊγνωςη και θεραπεύα. Η ανϊπτυξη των κακοόθων ϐγκων ςυνοδεϑεται απϐ προοδευτικό διόθηςη και αποδιοργϊνωςη του περιβϊλλοντοσ ιςτοϑ. Κϑρια χαρακτηριςτικϊ τουσ εύναι τα ατελϔσ καθοριςμϋνα ανατομικϊ ϐρια, η ταχεύα ανϊπτυξη και η ικανϐτητα εξϊπλωςησ με διόθηςη ό μετϊςταςη. 26

27 Ειςαγωγό Για τουσ περιςςϐτερουσ τϑπουσ κακοηθειϔν δεν υπϊρχουν ςαφϔσ καθοριςμϋνοι αιτιογενετικού παρϊγοντεσ. τουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ ο ρυθμϐσ κυτταρικόσ ανϊπτυξησ και κυτταρικοϑ θανϊτου βρύςκονται ςε ιςορροπύα, ενϔ ςτον καρκύνο η ιςορροπύα αυτό ϋχει διαταραχθεύ. Αιτύα τησ διαταραχόσ εύναι εύτε η ανεξϋλεγκτη κυτταρικό αϑξηςη ό η απϔλεια τησ ικανϐτητασ του κυττϊρου για απϐπτωςη και τελικϔσ τα κϑτταρα διαιροϑνται χωρύσ ϋλεγχο και χϊνουν το διακριτϐ τουσ ςχόμα. 2. ΥΤΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΣΟΜΙΑ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ Οι ϐρχεισ εύναι δϑο ςϑνθετοι ςωληνοειδεύσ αδϋνεσ περιβαλλϐμενοι απϐ πτυχό του δϋρματοσ που ονομϊζεται ϐςχεον, ϐπου διατηροϑνται ςε θερμοκραςύα 1 ο ϋωσ 2 ο C χαμηλϐτερη απϐ τη θερμοκραςύα του εςωτερικοϑ του ςϔματοσ, γεγονϐσ που διευκολϑνει την παραγωγό ςπερματοζωαρύων. Ο κϊθε ϐρχισ του ενόλικου ατϐμου ϋχει βϊροσ 40 gr, μόκοσ 4-5 cm, πϊχοσ 2-3 cm και ϐγκο ml. Αποτελοϑν μϋροσ του αναπαραγωγικοϑ ςυςτόματοσ αφοϑ παρϊγουν τα ςπερματοζωϊρια καθϔσ και του ενδοκρινικοϑ ςυςτόματοσ παρϊγοντασ ανδρικϋσ ορμϐνεσ, ϐπωσ η τεςτοςτερϐνη. Και οι δϑο λειτουργύεσ τουσ, βρύςκονται υπϐ τον ϋλεγχο των γοναδοτρϐπων ορμονϔν που εκκρύνονται απϐ το πρϐςθιο λοβϐ τησ υπϐφυςησ. Εξωτερικϊ περιβϊλλονται απϐ ινϔδη χιτϔνα, που αποτελεύται απϐ πυκνϐ ςυνδετικϐ ιςτϐ ο οπούοσ ςυνόθωσ προσ τα βαθϑτερα ςτρϔματα, αντικαθύςταται απϐ χαλαρϐ ςυνδετικϐ ιςτϐ (χόμα 2). Οι ϐρχεισ αποτελοϑνται κατϊ 80% απϐ τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια και το υπϐλοιπο 20% αποτελεύται απϐ ςυνδετικϐ ιςτϐ που περιϋχει κϑτταρα Leydig. Απϐ την εςωτερικό επιφϊνεια του ινϔδουσ χιτϔνα ξεκινοϑν λεπτϊ ορχικϊ διαφρϊγματα που διαχωρύζουν τον ϐρχι ςε ορχικϊ λοβύα. ε κϊθε ορχικϐ λϐβιο αναγνωρύζονται 3-4 ςπερματικϊ ςωληνϊρια τα οπούα ςχηματύζουν μια εςπειραμμϋνη μϊζα απϐ αγκϑλεσ, μόκουσ cm, που εκβϊλλουν ςε ϋνα ςϑςτημα πϐρων το οπούο τελικϊ αποχετεϑει ςτην επιδιδυμύδα, ϐπου ωριμϊζουν και αποθηκεϑονται τα ςπερματοζωϊρια. Απϐ εκεύ, τα ςπερματοζωϊρια μεταφϋρονται μϋςω του ςπερματικοϑ και του εκςπερματικοϑ πϐρου ςτο πϋοσ, προκειμϋνου να εκπεμφθοϑν (χόμα 2). 27

28 Ειςαγωγό χόμα 2. Κϊθετη τομό του ϐρχεοσ. Ο ϐρχισ εξωτερικϊ περιβϊλλεται απϐ τον ινϔδη χιτϔνα, ενϔ εςωτερικϊ βρύςκονται τα ςπερματοφϐρα ςωληνϊρια και η επιδιδυμύδα. Σα ςπερματικϊ ςωληνϊρια αναγνωρύζονται ςτο μικροςκϐπιο ωσ κυκλικϋσ ό ελλειψοειδεύσ τομϋσ. Κϊθε ςωληνϊριο αφορύζεται απϐ ϋνα βαςικϐ υμϋνα που το διαχωρύζει απϐ τα παρακεύμενα τριχοειδό αγγεύα, απϐ τα περιςωληναριακϊ (μυοειδό) κϑτταρα και απϐ τα κϑτταρα Leydig. Σα κϑτταρα Leydig εύναι ςωματικϊ κϑτταρα που βρύςκονται μεταξϑ των ςπερματοφϐρων ςωληνύςκων, παρϊγουν τη βαςικό ανδρογϐνο ορμϐνη, την τεςτοςτερϐνη, η οπούα διοχετεϑεται μϋςα ςτουσ ςπερματοφϐρουσ ςωληνύςκουσ και προϊγει τη ςπερματογϋνεςη. Η παραγωγό τησ τεςτοςτερϐνησ ρυθμύζεται απϐ την ωχρινοτρϐπο ορμϐνη (LH) που εκκρύνεται απϐ την υπϐφυςη και δρα ςτα κϑτταρα Leydig. το εςωτερικϐ του υμϋνα βρύςκονται τα κϑτταρα Sertoli και τα ϊωρα γεννητικϊ κϑτταρα, τα ςπερματογϐνια. Καθϔσ τα ςπερματογϐνια διαιροϑνται και αναπτϑςςονται γϑρω απϐ την περιφϋρεια των ςωληναρύων, ςχηματύζουν κϊτω απϐ αυτϊ ςτόλεσ απϐ ωριμϊζοντα ςπερματικϊ κϑτταρα. Κατϊ τη διϊρκεια τησ ςπερματογϋνεςησ τα ςπερματικϊ κϑτταρα διϋρχονται απϐ 4 διαφορετικϊ ςτϊδια ωρύμανςησ. Αρχικϊ αναγνωρύζονται τα ςπερματογϐνια, με υποςτρϐγγυλο ςχόμα και ςφαιρικϐ πυρόνα, που βρύςκονται πολϑ κοντϊ ό ςχεδϐν ςε επαφό με το βαςικϐ υμϋνα, που εντοπύζεται ακριβϔσ μϋςα απϐ τον ινϔδη χιτϔνα. Ενϔ μερικϊ ςπερματογϐνια παραμϋνουν προγονικϊ, ϊλλα μετϊ απϐ μιτωτικϋσ διαιρϋςεισ γύνονται πρωτογενό ςπερματοκϑτταρα ό ςπερματοκϑτταρα α τϊξησ, τα οπούα εύναι ογκοδϋςτερα των ςπερματογονύων και βρύςκονται ςε μεγαλϑτερο βϊθοσ ςτο ςπερματικϐ τούχωμα (χόμα 3). Με την πρϔτη διαύρεςη τησ μεύωςησ, τα 28

29 Ειςαγωγό ςπερματοκϑτταρα α τϊξησ παρϊγουν δευτερογενό ςπερματοκϑτταρα ό ςπερματοκϑτταρα β τϊξησ που εύναι πολϑ μικρϐτερα των πρωτογενϔν, η χρονικό διϊρκεια τησ ζωόσ τουσ εύναι πολϑ περιοριςμϋνη και τα οπούα με τη δεϑτερη διαύρεςη τησ μεύωςησ παρϊγουν τισ ςπερματύδεσ. Οι ςπερματύδεσ εύναι μικρϊ ςτρογγυλϊ κϑτταρα με ςτρογγυλϐ πυρόνα, που διατϊςςονται ςε 3-4 ςειρϋσ κοντϊ ςτον αυλϐ του ςωληναρύου και μϋςω δεςμοςωμϊτων βρύςκονται ςε επαφό με τα κϑτταρα Sertoli (χόμα 3). Σϋλοσ, με μια διεργαςύα μεταμϐρφωςησ των απλοειδϔν ςπερματύδων που ονομϊζεται ςπερμιογϋνεςη ό ςπερμιοτελεύωςη παρϊγονται τα ςπερματοζωϊρια. Σα ςπερματοζωϊρια εντοπύζονται πολϑ κοντϊ ςτον αυλϐ ό μϋςα ςε αυτϐν ωσ πολϑ επιμηκυμϋνα κϑτταρα ςτα οπούα αρχύζει να διακρύνεται η ουρϊ. Οι ςτόλεσ αυτϋσ με τα ωριμϊζοντα ςπερματικϊ κϑτταρα κεύνται μεταξϑ δϑο παρακεύμενων κυττϊρων Sertoli, καθϋνα απϐ τα οπούα εκτεύνεται απϐ το βαςικϐ υμϋνα μϋχρι τον αυλϐ. Σα κϑτταρα Sertoli εύναι ςωματικϊ κϑτταρα που εκτεύνονται απϐ τα τοιχϔματα προσ το κϋντρο των ςπερματοφϐρων ςωληνύςκων (χόμα 3). Προςδιορύζουν το ρυθμϐ τησ ςπερματογϋνεςησ ελϋγχοντασ το ρυθμϐ μετατϐπιςησ των ςπερματοκυττϊρων απϐ τη βαςικό μεμβρϊνη προσ το κϋντρο του ςπερματοφϐρου ςωληνύςκου. Σα ςπερματοκϑτταρα εύναι βυθιςμϋνα μϋςα ςτισ κοιλϐτητεσ που ςχηματύζονται απϐ τισ αναδιπλϔςεισ τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ των Sertoli ςε καθοριςμϋνη αλληλουχύα και μετατοπύζονται κατϊ μόκοσ των κυττϊρων Sertoli με αποικοδϐμηςη και ανοικοδϐμηςη των ςυνδϋςεϔν τουσ με αυτϊ τα κϑτταρα και με αλλαγό τησ μορφολογύασ των κυττϊρων Sertoli. Σα κϑτταρα Sertoli παρϊγουν την ορμϐνη κατϊ των πϐρων του Muller (AMH) ϋχοντασ ϋτςι ςημαντικϐ ρϐλο ςτο ςχηματιςμϐ του αναπαραγωγικοϑ ςυςτόματοσ του ϊρρενοσ. Επύςησ, τα κϑτταρα Sertoli, υπϐ την επύδραςη τησ θυλακιοτρϐπου ορμϐνησ (FSH) που εκκρύνεται απϐ την υπϐφυςη, απελευθερϔνουν την ενωμϋνη με ανδρογϐνα πρωτεϗνη (ABP). Λϐγω τησ ΑΒP, τα κϑτταρα Sertoli δεςμεϑουν την τεςτοςτερϐνη και εν ςυνεχεύα η δεςμευμϋνη τεςτοςτερϐνη ςυντηρεύ τη ςπερματογϋνεςη (Ζϊγκρησ, 2005). 29

30 Ειςαγωγό Α) Β) χόμα 3. Α) Κϊθετη τομό του ϐρχεοσ, ϐπου διακρύνονται τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια, τα κϑτταρα Sertoli και τα κϑτταρα Leydig. Β) Πορεύα ωρύμανςησ των ςπερματικϔν κυττϊρων. 3. ΝΕΟΠΛΑΙΑ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ Η νεοπλαςύα των ϐρχεων τυπικϊ αναπτϑςςεται ςε ϋναν απϐ τουσ δϑο ϐρχεισ του ϊνδρα. Εύναι ςε μεγϊλο ποςοςτϐ θεραπεϑςιμη και εμφανύζεται ςε νϋουσ ϊνδρεσ ηλικύασ ετϔν, αλλϊ μπορεύ να παρουςιαςθεύ και ςε ϊνδρεσ μεγαλϑτερησ ηλικύασ. Σα περιςτατικϊ νεοπλαςιϔν των ϐρχεων αυξϊνονται ςταθερϊ τα τελευταύα 40 χρϐνια. Ο ςυγκεκριμϋνοσ τϑποσ κακοόθειασ φαύνεται να εύναι πιο ςυνηθιςμϋνοσ ςτουσ πληθυςμοϑσ τησ βϐρειασ Ευρϔπησ με ρυθμϐ ανϊπτυξησ ςυμβϊντων μεταξϑ 4 και 10 ανδρϔν ςτουσ , ενϔ μεταξϑ των Αςιατϔν, των Αφρικανϔν και των Αφροαμερικανϔν ο ρυθμϐσ ανϊπτυξησ του καρκύνου εύναι χαμηλϐτεροσ και κυμαύνεται μεταξϑ 0.2 και 1 περιςτατικοϑ ςτουσ ϊνδρεσ. Σα ποςοςτϊ επιβύωςησ των αςθενϔν ϋχουν βελτιωθεύ ςημαντικϊ κατϊ τα τελευταύα 30 χρϐνια υπερβαύνοντασ το 90% των περιςτατικϔν. Σα ακριβό αύτια των νεοπλαςιϔν των ϐρχεων δεν ϋχουν ακϐμα διευκρινιςτεύ. Ωςτϐςο, μετϊ απϐ ανϊλυςη των υπαρχϐντων ςτατιςτικϔν ςτοιχεύων, προκϑπτουν κϊποιοι πιθανού παρϊγοντεσ κινδϑνου (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). 30

31 Ειςαγωγό 3.1. ΣΑΞΙΝΟΜΗΗ ΣΨΝ ΝΕΟΠΛΑΙΨΝ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ Περύπου το 95% των ϐγκων ϐρχεων προϋρχεται απϐ τα βλαςτικϊ κϑτταρα. Οι περιςςϐτεροι απϐ αυτοϑσ του ϐγκουσ εύναι αρκετϊ επιθετικού και ικανού για γρόγορη και ευρεύα διαςπορϊ. Παρϐλα αυτϊ, η θνηςιμϐτητα των αςθενϔν με κακοόθεισ ϐγκουσ ϐρχεων ϋχει μειωθεύ εντυπωςιακϊ λϐγω τησ αποτελεςματικϐτητασ τησ χημειοθεραπεύασ που περιλαμβϊνει cisplatin. Αντύθετα, οι ϐγκοι που δεν προϋρχονται απϐ τα βλαςτικϊ κϑτταρα εύναι ςε γενικϋσ γραμμϋσ καλοόθεισ. Η ταξινϐμηςη των ϐγκων των ϐρχεων δυςτυχϔσ ποικύλει ςε μεγϊλο βαθμϐ λϐγω τησ διαφορετικόσ αντύληψησ ςχετικϊ με την ιςτογϋνεςη των ϐγκων, τησ ποικιλύασ ςτη μορφολογύα ενϐσ ιςτολογικοϑ τϑπου καθϔσ και τησ παρουςύασ περιςςοτϋρων του ενϐσ ιςτολογικϔν τϑπων εντϐσ ενϐσ ϐγκου (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Η ταξινϐμηςη των ϐγκων ϐρχεων με βϊςη τον Παγκϐςμιο Οργανιςμϐ Τγεύασ (WHO) αναγρϊφεται παρακϊτω: (Σαξινόμηςη των όγκων όρχεων κατϊ WHO) ΟΓΚΟΙ ΠΡΟΕΡΦΟΜΕΝΟΙ ΑΠΟ ΒΛΑΣΙΚΑ ΚΤΣΣΑΡΑ Όγκοι αποτελούμενοι από ϋνα ιςτολογικό τύπο (αμιγεύσ μορφϋσ) εμύνωμα εμύνωμα με ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα περματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα περματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα με ςϊρκωμα Εμβρυώκϐ Καρκύνωμα Όγκοσ του λεκιθικοϑ αςκοϑ Σροφοβλαςτικού ϐγκοι Φοριοκαρκύνωμα Σροφοβλαςτικϊ νεοπλϊςματα εκτϐσ χοριοκαρκινϔματοσ Μονοφαςικϐ χοριοκαρκύνωμα Πλακουντιακϐσ τϑποσ τροφοβλαςτικοϑ ϐγκου Σερϊτωμα Δερμοειδόσ κϑςτη Μονοδερμικϐ τερϊτωμα Σερϊτωμα με ςωματικοϑ τϑπου κακοόθειεσ 31

32 Ειςαγωγό Όγκοι αποτελούμενοι από πολλούσ ιςτολογικούσ τύπουσ (μικτού όγκοι) Μικτϐ εμβρυώκϐ καρκύνωμα με τερϊτωμα (τερατοκαρκύνωμα) Μικτϐ τερϊτωμα με ςεμύνωμα Φοριοκαρκύνωμα με τερϊτωμα / εμβρυώκϐ καρκύνωμα Άλλοι ςυνδυαςμού ΟΓΚΟΙ ΣΟΤ ΣΡΨΜΑΣΟ ΣΨΝ ΓΟΝΑΔΨΝ/ΠΕΡΜΑΣΙΚΟΤ ΣΟΝΟΤ Αμιγεύσ μορφϋσ Όγκοσ των κυττϊρων Leydig Κακοόθησ ϐγκοσ των κυττϊρων Leydig Όγκοσ των κυττϊρων Sertoli Όγκοσ των κυττϊρων Sertoli πλοϑςιοσ ςε λιπύδια κληρυντικϐσ ϐγκοσ των κυττϊρων Sertoli Αποτιτανωμϋνοσ ϐγκοσ απϐ μεγϊλα κϑτταρα Sertoli Κακοόθησ ϐγκοσ των κυττϊρων Sertoli Κοκκιωματϔδησ ϐγκοσ Κοκκιωματϔδησ ϐγκοσ ενηλύκων Νεανικϐσ κοκκιωματϔδησ ϐγκοσ Όγκοι που κατατϊςςονται ςτην κατηγορύα θόκωμα / ύνωμα Θόκωμα Ίνωμα Ατελϔσ διαφοροποιημϋνοι ϐγκοι Μικτού ϐγκοι του ςτρϔματοσ των γονϊδων / ςπερματικοϑ τϐνου Κακοόθεισ ϐγκοι του ςτρϔματοσ των γονϊδων / ςπερματικοϑ τϐνου Μικτού ϐγκοι που περιλαμβϊνουν ςτοιχεύα εκ βλαςτικϔν κυττϊρων, του ςτρϔματοσ των γονϊδων και του ςπερματικοϑ τϐνου Γοναδοβλϊςτωμα Αταξινϐμητοσ ϐγκοσ εκ βλαςτικϔν κυττϊρων-ςπερματικοϑ τϐνου / ςτρϔματοσ των γονϊδων ΑΛΛΟΙ ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ Καρκινοειδϋσ Όγκοι ωοθηκϔν επιθηλιακόσ αρχόσ 32

33 Ειςαγωγό Ορϔδησ ϐγκοσ οριακόσ κακοόθειασ Ορϔδεσ καρκύνωμα Ενδομητρικϐ καρκύνωμα καλϊ διαφοροποιημϋνο Βλεννϔδεσ κυςταδϋνωμα Βλεννϔδεσ κυςταδενοκαρκύνωμα Νεφροβλϊςτωμα Παραγαγγλύωμα ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΕΚΥΟΡΗΣΙΚΨΝ ΠΟΡΨΝ ΚΑΙ ΟΡΦΙΚΟΤ ΔΙΚΣΤΟΤ Αδϋνωμα Καρκύνωμα ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΠΑΡΑΟΡΦΙΚΨΝ ΔΟΜΨΝ Αδενωματϔδησ ϐγκοσ Κακϐηθεσ μεςοθηλύωμα Καλϐηθεσ μεςοθηλύωμα Θηλϔδεσ μεςοθηλύωμα καλϊ διαφοροποιημϋνο Κυςτικϐ μεςοθηλύωμα Αδενοκαρκύνωμα τησ επιδιδυμύδοσ Θηλϔδεσ κυςταδϋνωμα τησ επιδιδυμύδοσ Μελανωματϔδησ νευρο-εξωδερματικϐσ ϐγκοσ Δεςμοπλαςτικϐσ ϐγκοσ απϐ μικρϊ ςτρογγυλϊ κϑτταρα ΜΕΕΓΦΤΜΑΣΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΣΟΤ ΠΕΡΜΑΣΙΚΟΤ ΣΟΝΟΤ ΚΑΙ ΣΨΝ ΕΞΑΡΣΗΜΑΣΨΝ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ ΔΕΤΣΕΡΟΠΑΘΕΙ ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ 33

34 Ειςαγωγό 3.2. ΟΓΚΟΙ ΠΡΟΕΡΦΟΜΕΝΟΙ ΑΠΟ ΣΑ ΒΛΑΣΙΚΑ ΚΤΣΣΑΡΑ Η πλειοψηφύα των πρωτοπαθϔν ϐγκων των ϐρχεων προϋρχονται απϐ τα βλαςτικϊ κϑτταρα και ςε ποςοςτϐ που υπερβαύνει το 50% οι ϐγκοι περιλαμβϊνουν περιςςϐτερουσ του ενϐσ ιςτολογικοϑσ τϑπουσ: ςεμύνωμα, εμβρυώκϐ καρκύνωμα, ϐγκο λεκιθικοϑ αςκοϑ, χοριοκαρκύνωμα και τερϊτωμα. Όλοι οι ιςτολογικού τϑποι εύναι ικανού για διόθηςη και μετϊςταςη και ςε αναλογύα 90% η ιςτολογικό ταυτϐτητα τησ μετϊςταςησ εύναι πανομοιϐτυπη με αυτό του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου. Όμωσ, ςε ποςοςτϐ 10% των περιπτϔςεων, τα ιςτολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των μεταςτϊςεων μπορεύ να διαφϋρουν απϐ την ιςτολογικό ταυτϐτητα του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου. Επιπλϋον τομϋσ μποροϑν να τεκμηριϔςουν την παρουςύα ενϐσ επιπρϐςθετου κυτταρικοϑ ςτοιχεύου ςτον πρωτοπαθό ϐγκο. Σο γεγονϐσ αυτϐ επιςημαύνει την αναγκαιϐτητα για ενδελεχό μικροςκοπικό εξϋταςη του ιςτολογικοϑ παραςκευϊςματοσ, πλόρη μακροςκοπικό περιγραφό, ςυνεκτύμηςη των κλινικϔν χαρακτηριςτικϔν και των ορολογικϔν δεικτϔν. Η ηλικύα του αςθενοϑσ παρϋχει μια ιςχυρό ϋνδειξη για τον πιθανϐ ιςτολογικϐ τϑπο με ςυχνϐτερο το νεανικϐ κοκκιωματϔδη ϐγκο ςτα νεογϋννητα. Η παρουςύα ςεμινϔματοσ εύναι εξαιρετικϊ ςπϊνια πριν την εφηβεύα ενϔ οι ϐγκοι του λεκιθικοϑ αςκοϑ και τα καλϊ διαφοροποιημϋνα τερατϔματα θεωροϑνται οι ςυχνϐτεροι ϐγκοι ςε αςθενεύσ αυτόσ τησ ηλικύασ. Αντιθϋτωσ, το ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα και το κακϐηθεσ λϋμφωμα ςυνόθωσ εμφανύζονται ςε αςθενεύσ προχωρημϋνησ ηλικύασ. Η ταξινϐμηςη των ϐγκων ϐρχεων βαςύζεται ςτο γεγονϐσ ϐτι η πλειονϐτητα τουσ προϋρχεται απϐ τα βλαςτικϊ κϑτταρα. Σα κϑτταρα αυτϊ μποροϑν εύτε να οδηγόςουν ςτο ςχηματιςμϐ ςεμινϔματοσ ό μποροϑν να διαφοροποιηθοϑν ςε πολυδϑναμα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα, προκαλϔντασ το εμβρυώκϐ καρκύνωμα. Επαγωγικϊ, το εμβρυώκϐ καρκύνωμα περιϋχει αρχϋγονα κϑτταρα για ϐλουσ τουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Ανϊλογα με το βαθμϐ διαφοροπούηςησ των κυττϊρων του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ, ϋχουμε τη δημιουργύα ϐγκων με διαφορετικϐ ιςτολογικϐ πρϐτυπο. Η πιο αδιαφοροπούητη κατϊςταςη παρουςιϊζεται ςτα κϑτταρα του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ, ενϔ το χοριοκαρκύνωμα και ο ϐγκοσ του λεκιθικοϑ αςκοϑ δημιουργοϑνται απϐ αρχϋγονα κϑτταρα που ϋχουν διαφοροποιηθεύ ςε ςυγκεκριμϋνουσ εξωεμβρυώκοϑσ τϑπουσ κυττϊρων. Σο τερϊτωμα δημιουργεύται απϐ διαφοροπούηςη του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ και ςτισ τρεισ ςτιβϊδεσ των 34

35 Ειςαγωγό αρχϋγονων κυττϊρων και ςυνεπϔσ το τερϊτωμα περιϋχει τη μεγαλϑτερη ποικιλύα νεοπλαςματικϔν κυττϊρων και ιςτϔν. ε μερικϋσ περιπτϔςεισ, διαφοροποιημϋνοι ϐγκοι ϐπωσ το τερϊτωμα ό ο ϐγκοσ του λεκιθικοϑ αςκοϑ φαύνεται να δημιουργοϑνται απευθεύασ απϐ τα πολυδϑναμα αρχϋγονα κϑτταρα και ϐχι μϋςω του ενδιϊμεςου ςταδύου του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ. Αυτϐ το πλϊνο παρϋχει μια λογικό εξόγηςη ςτην περιπλοκϐτητα των ιςτολογικϔν μοτύβων και υποςτηρύζεται απϐ τισ ακϐλουθεσ παρατηρόςεισ: 1) απϐ τη ςυνόθη αλλϊ ϐχι ςταθερό ςυνϑπαρξη του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ και του τερατϔματοσ ςτουσ ϐρχεισ, 2) απϐ την παρουςύα τερατϔματοσ ό χοριοκαρκινϔματοσ ςε μετϊςταςη του ϐγκου, ο οπούοσ ςτην αρχικό του θϋςη χαρακτηρύζεται ωσ εμβρυώκϐ καρκύνωμα, και 3) απϐ την ομοιϐτητα μεταξϑ των κυττϊρων του ςεμινϔματοσ και των φυςιολογικϔν ορχικϔν αρχϋγονων κυττϊρων (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Σα ςεμινϔματα μποροϑν να χωριςτοϑν ςτα κλαςςικϊ (ό τυπικϊ) ςεμινϔματα και ςτα ςπερματοκυτταρικϊ ςεμινϔματα. Οι μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι χωρύζονται ςε τϋςςερισ κϑριεσ κατηγορύεσ: το εμβρυώκϐ καρκύνωμα, το καρκύνωμα του λεκιθικοϑ αςκοϑ, το χοριοκαρκύνωμα, και το τερϊτωμα. το παρελθϐν, οι μη-ςεμινωματϔδεισ και οι ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι ανιχνεϑονταν ςχεδϐν ςε ύςα ποςοςτϊ, ϐμωσ τα τελευταύα χρϐνια παρατηρεύται αϑξηςη τησ επύπτωςησ των ςεμινωμϊτων. Οι ϐγκοι που περιϋχουν μικτϐ κυτταρικϐ πληθυςμϐ απϐ ςεμινωματϔδη και μη-ςεμινωματϔδη κϑτταρα θεραπεϑονται ωσ μη-ςεμινωματϔδεισ εφϐςον αυτού οι ϐγκοι παρουςιϊζουν επιθετικϐτερη βιολογικό ςυμπεριφορϊ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΟΙΦΕΙΑ Η ςυχνϐτητα των ϐγκων ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων (Testicular Germ Cell Tumors) εμφανύζουν αξιοςημεύωτη γεωγραφικό διακϑμανςη. Η μεγαλϑτερη ςυχνϐτητα εμφανύζεται ςτην Δανύα, Γερμανύα, Νορβηγύα, Ουγγαρύα και Ελβετύα (8-10 περιπτϔςεισ ανϊ ϊνδρεσ) (Ferlay J et al. 2001). Παρϐμοια ςυχνϐτητα εμφανύζεται μϐνο ςτουσ Μαϐρι ςτην Νϋα Ζηλανδύα (7 περιπτϔςεισ ανϊ ϊνδρεσ) (Parkin DM et al. 2003). την Αφρικό, την Καραώβικό και την Αςύα η ςυχνϐτητα βρύςκεται ςε ποςοςτϊ μικρϐτερα των 2 περιπτϔςεων ανϊ ϊνδρεσ. Γενικϊ, η ςυχνϐτητα αυτϔν των ϐγκων αυξϊνεται προοδευτικϊ ςτουσ Ευρωπαώκοϑσ πληθυςμοϑσ τισ τελευταύεσ δεκαετύεσ (ColemanMP et al. 1993). Η 35

36 Ειςαγωγό ηλικιακό κατανομό των ϐγκων εύναι επύςησ αςυνόθησ. Η ςυχνϐτητα αυξϊνει αμϋςωσ μετϊ την εφηβεύα και εμφανύζει μϋγιςτο ςτισ ηλικύεσ μεταξϑ ετϔν. Ακολοϑθωσ, η ςυχνϐτητα ελαττϔνεται ςε πολϑ χαμηλϊ ποςοςτϊ ςτουσ ϊνδρεσ ηλικύασ 60 ετϔν και ϊνω. Η καμπϑλη ςυχνϐτητασ ςε ςχϋςη με την ηλικύα εύναι παρϐμοια ςτα ςεμινϔματα και ςτουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ, ϐμωσ η μϋςη ηλικύα εμφϊνιςησ εύναι 10 ϋτη νωρύτερα ςτουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Πιθανϐτερη αιτύα θεωρεύται η επιθετικϐτερη βιολογικό ςυμπεριφορϊ των μη-ςεμινωματωδϔν ϐγκων που οφεύλεται ςτην ταχεύα ανϊπτυξη και την ικανϐτητϊ τουσ για αιματογενό διαςπορϊ και μετϊςταςη. Οι ϐγκοι ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςυνδϋονται με την παρουςύα αταξινϐμητησ ενδοςωληναριακόσ νεοπλαςύασ εκ βλαςτικϔν κυττϊρων (Intratubular Germ Cell Neoplasia,Unclassified type). Η ςυςχϋτιςη εύναι πολϑ ιςχυρό και ειδικό (Møller H 1993). Η ςυχνϐτητα τησ εμφϊνιςησ καρκινϔματοσ in situ ςε ϋνα πληθυςμϐ ανδρϔν αντιςτοιχεύ ςχεδϐν ακριβϔσ ςτο ύδιο ποςοςτϐ κινδϑνου εμφϊνιςησ νεοπλαςύασ των ϐρχεων ςε αυτϐν τον πληθυςμϐ και κυμαύνεται λιγϐτερο απϐ 1% ςτουσ φυςιολογικοϑσ ϊνδρεσ ςτη Δανύα (Giwercman A et al. 1991), περύπου 2-3% ςε ϊνδρεσ με ιςτορικϐ κρυψορχύασ (Giwercman A et al. 1989) και 5% ςτον ετερϐπλευρο ϐρχι ςε ϊνδρεσ που ϋχουν όδη εμφανύςει ϐγκο ςτον ϋνα ϐρχι (Dieckmann KP & Loy V 1998). Η αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα εκ βλαςτικϔν κυττϊρων εμφανύζεται πρακτικϊ πϊντοτε ςτον ιςτϐ που περιβϊλλει τον ϐγκο και δεν ϋχει παρατηρηθεύ ποτϋ αυτϐματη εξαφϊνιςό τησ. Απϐ τισ ανωτϋρω παρατηρόςεισ, ςυνϊγεται το ςυμπϋραςμα ϐτι το κρύςιμο βόμα για την ανϊπτυξη του ϐγκου εύναι η ανϔμαλη διαφοροπούηςη των αρχϋγονων βλαςτικϔν κυττϊρων που οδηγεύ ςε εμμϋνουςα αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα, η οπούα ςτη ςυνϋχεια εξελύςςεται ςε διηθητικϐ νεϐπλαςμα ΑΙΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΣΕ Η ϋρευνα για τισ αιτύεσ τησ νϐςου οδηγεύται απϐ την υπϐθεςη ϐτι η εμφϊνιςη τησ νϐςου ξεκινϊ απϐ την εμβρυώκό ζωό και προκαλεύται απϐ την ανϔμαλη διαφοροπούηςη των εμβρυώκϔν αρχϋγονων βλαςτικϔν κυττϊρων. Ιςχυρϋσ ενδεύξεισ υποςτηρύζουν ϐτι οι ϐγκοι ϐρχεων απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα ςυνδϋονται με παθολογικϋσ καταςτϊςεισ κατϊ την εμβρυώκό ζωό. 36

37 Ειςαγωγό ϑνδεςη με ςυγγενεύσ ανωμαλύεσ του γεννητικοϑ ςυςτόματοσ των ανδρών Η κρυψορχύα ςχετύζεται ςταθερϊ με αυξημϋνο κύνδυνο εμφϊνιςησ ϐγκου ϐρχεων. Η ςυχνϐτητα εμφϊνιςησ ϐγκου ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςε ϊνδρεσ με ιςτορικϐ κρυψορχύασ εύναι περύπου 3-5 φορϋσ αυξημϋνη (Anon 1994a). τουσ ϊνδρεσ με κρυψορχύα του ενϐσ ϐρχεοσ και οι δϑο ϐρχεισ (και ο μη κατερχϐμενοσ και ο φυςιολογικϐσ ϐρχισ) εμφανύζουν αυξημϋνο κύνδυνο εμφϊνιςησ νεοπλαςύασ (Møller H et al. 1996). Η ςυχνϐτητα εμφϊνιςησ ϐγκου των ϐρχεων φαύνεται αυξημϋνη ςε ϊνδρεσ με υποςπαδύαςη και βουβωνικό κόλη αλλϊ τα ευρόματα εύναι λιγϐτερο ιςχυρϊ απϐ αυτϊ τησ κρυψορχύασ (Prener A et al. 1996). Η ατροφύα του ϐρχεοσ αυξϊνει επύςησ τον κύνδυνο εμφϊνιςησ ϐγκου τϐςο ςτην περύπτωςη προβληματικϊ κατερχϐμενου ϐρχι ϐςο και ςε φυςιολογικϊ κατερχϐμενο ϐρχι (Dieckmann KP & Loy V 1996, Harland SJ et al. 1998, Møller H et al. 1996). Η παρουςύα ατροφύασ ςε προβληματικϊ κατερχϐμενουσ ϐρχεισ αποτελεύ κϑριο παρϊγοντα εμφϊνιςησ νεοπλαςύασ εκ βλαςτικϔν κυττϊρων. Προγεννητικού παρϊγοντεσ κινδϑνου Μελϋτεσ ϋχουν δεύξει εμμϋνουςα ςυςχϋτιςη ςτην εμφϊνιςη ϐγκου ϐρχεων με το χαμηλϐ βϊροσ νεογνϔν κατϊ τη γϋννηςη και τη γϋννηςη πρϐωρων νεογνϔν υποδεικνϑοντασ κϊποιο παθογενετικϐ ρϐλο ςτην καθυςτερημϋνη ανϊπτυξη ενδομητρύωσ (Akre O et al. 1996, Møller H & Skakkebaek NE 1997). Παρϐμοια ςυςχϋτιςη παρατηρεύται και κατϊ την εμφϊνιςη κρυψορχύασ και υποςπαδύαςησ (Weidner IS et al. 1999). Παρϊγοντεσ που ςχετύζονται λιγϐτερο με τισ νεοπλαςύεσ των ϐρχεων εύναι η προχωρημϋνη ηλικύα τησ μητϋρασ και ο νεογνικϐσ ύκτεροσ (Renshaw AA 1998, Sabroe S & Olsen J 1998). Έκθεςη κατϊ την ενηλικύωςη Δεν υπϊρχουν ιςχυρϊ ευρόματα για ςυςχϋτιςη των ϐγκων ϐρχεων με παρϊγοντεσ κινδϑνου κατϊ την ενόλικο ζωό, αν και κϊποιοι αιτιολογικού παρϊγοντεσ ϋχουν ενοχοποιηθεύ, ϐπωσ εύναι η περιοριςμϋνη φυςικό ϊςκηςη, η υψηλό κοινωνικοοικονομικό θϋςη και η ανοςοκαταςτολό τϐςο ςε αςθενεύσ με ςϑνδρομο επύκτητησ ανοςοανεπϊρκειασ ϐςο ςε μεταμοςχευμϋνουσ αςθενεύσ με μϐςχευμα νεφροϑ (Anon 1994b, Birkeland SA et al. 1995, Goedert JJ et al. 1998). 37

38 Ειςαγωγό Τπογοναδιςμϐσ τειρϐτητα Η υπογονιμϐτητα και η ςτειρϐτητα ςχετύζονται με αυξημϋνο κύνδυνο ανϊπτυξησ ϐγκων ϐρχεων (Jacobsen R et al. 2000, Møller H & Skakkebaek N 1999). Τποθϋτουμε ϐτι κοινού αιτιολογικού παρϊγοντεσ δροϑν προγεννητικϊ και προκαλοϑν υπογονιμϐτητα και νεοπλαςύεσ ςτουσ ϐρχεισ. Ειδικού παρϊγοντεσ Τποςτηρύζεται ϐτι η δρϊςη των ενδογενϔν οιςτρογϐνων τησ μητϋρασ επηρεϊζει αρνητικϊ την ανϊπτυξη των αρρϋνων εμβρϑων (Henderson BE et al. 1979). Πρϐςφατα δϐθηκε ϋμφαςη ςτην επύδραςη των περιβαλλοντικϔν οιςτρογϐνων και αντι-ανδρογϐνων, αν και η υπϐθεςη δεν ϋχει αποδειχθεύ πλόρωσ. Η παρακολοϑθηςη ομϊδασ ανδρϔν που εύχαν εκτεθεύ ςε ςυνθετικϊ οιςτρογϐνα κατϊ την εμβρυώκό ζωό ϋχει δεύξει αυξημϋνη επύπτωςη κρυψορχύασ και πιθανό αν και μη-ςτατιςτικϊ ςημαντικό αϑξηςη τησ επύπτωςησ ϐγκων ϐρχεων και των δϑο κϑριων ιςτολογικϔν κατηγοριϔν (ςεμινϔματα και μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι) φανερϔνοντασ ϐτι οι αιτιολογικού παρϊγοντεσ ςε αυτϋσ τισ περιπτϔςεισ εύναι ύδιοι (Strohsnitter WC et al. 2001, Møller H & Skakkebaek NE 1997, Richiardi L et al. 2002). Επιδημιολογύα και αιτιολογύα ϊλλων ϐγκων ϐρχεων εκ βλαςτικών κυττϊρων Εκτϐσ των ϐγκων ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςτουσ ενόλικουσ ϊνδρεσ, διϊφοροι ϊλλοι τϑποι ϐγκων των γονϊδων μποροϑν να αναφερθοϑν περιληπτικϊ. τη βρεφικό ηλικύα εμφανύζεται μια ξεχωριςτό καμπϑλη ϐςον αφορϊ τη ςυχνϐτητα εμφϊνιςησ ϐγκων ϐρχεων. Οι ϐγκοι αυτού εύναι κυρύωσ τερατϔματα και ϐγκοι του λεκιθικοϑ αςκοϑ οι οπούοι δε φαύνεται να ςχετύζονται με καρκινϔματα in situ ενϔ η επιδημιολογύα και η αιτιολογύα τουσ δεν εύναι πλόρωσ γνωςτό. Σο ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα εμφανύζεται ςε γηραιϐτερουσ ϊνδρεσ, δεν ςχετύζεται με αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα εκ βλαςτικϔν κυττϊρων και δε φαύνεται να ϋχει προγεννητικό αιτιολογύα. Πιθανϐν να εύναι ϋνασ ϐγκοσ που προϋρχεται απϐ τα διαφοροποιημϋνα ςπερματογϐνια και η αιτιολογύα του εύναι ϊγνωςτη. Όγκοι των ωοθηκϔν εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςτισ γυναύκεσ, ϐπωσ εύναι το τερϊτωμα και το δυςγερμύνωμα (ανϊλογο των ςεμινϔματοσ), μπορεύ να ϋχουν παρϐμοιουσ αιτιολογικοϑσ παρϊγοντεσ με τισ αντύςτοιχεσ περιπτϔςεισ ςτουσ ϊνδρεσ ϐμωσ εμφανύζουν πολϑ χαμηλϐτερη ςυχνϐτητα (Møller H & Evans H 2003). Η 38

39 Ειςαγωγό οικογενόσ προδιϊθεςη και η γενετικό ευαιςθηςύα που θεωροϑνται ςημαντικού παρϊγοντεσ ςτην ανϊπτυξη των ϐγκων ϐρχεων θα αναλυθοϑν ςτη ςυνϋχεια ΚΛΙΝΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ημεύα και ςυμπτώματα Η ςυνόθησ κλινικό εμφϊνιςη εύναι η παρουςύα οζιδύου ό ανϔδυνησ διϐγκωςησ του ενϐσ ϐρχεοσ. Σο ϋνα τρύτο των αςθενϔν παραπονεύται για ϋνα βϑθιο πϐνο ό αύςθημα βϊρουσ ςτο εφηβαύο ό ςτο κατϔτερο μϋροσ τησ κοιλιϊσ. υχνϊ διαγιγνϔςκεται επιδιδυμύτιδα και ο υπερηχογραφικϐσ ϋλεγχοσ ενδεύκνυται για την καλϑτερη διερεϑνηςη κατϊ τη διαγνωςτικό προςϋγγιςη τησ νϐςου. το 10% των αςθενϔν, η παρουςύα μετϊςταςησ μπορεύ να εύναι η πρωταρχικό αιτύα εμφϊνιςησ ςυμπτωμϊτων τησ νϐςου. Οςφυαλγύα ό κοιλιακϐ ϊλγοσ, γαςτρεντερικϊ ενοχλόματα, βόχασ ό δϑςπνοια μπορεύ να εύναι κϊποια απϐ τα αρχικϊ ςυμπτϔματα τησ νϐςου. Γυναικομαςτύα εμφανύζεται επύςησ ςτο 5% των περιπτϔςεων. Απεικονιςτικϋσ μϋθοδοι Σο υπερηχογρϊφημα εύναι η πρωταρχικό απεικονιςτικό μϋθοδοσ για την εκτύμηςη τησ παθολογύασ ςτο ϐςχεο. Έχει εϑκολη εφαρμογό και ευαιςθηςύα που πληςιϊζει το 100% ςτην ικανϐτητα ταυτοπούηςησ των μορφωμϊτων του ϐρχεοσ. Κατϊ την εκτύμηςη μιασ ψηλαφητόσ μϊζασ με υπερηχογρϊφημα, ο κϑριοσ ςτϐχοσ εύναι ο καθοριςμϐσ τησ εντϐπιςησ τησ βλϊβησ (ενδο-ορχικό ό εξω-ορχικό) και ο περαιτϋρω χαρακτηριςμϐσ τησ βλϊβησ (κυςτικό ό ςυμπαγόσ). Η παρουςύα ςυμπαγοϑσ ενδο-ορχικόσ μϊζασ θα πρϋπει να θεωρεύται κακοόθησ, με εξαύρεςη ελϊχιςτεσ περιπτϔςεισ. Αν και οι περιςςϐτερεσ εξω-ορχικϋσ βλϊβεσ εύναι καλοόθεισ, ςτην περύπτωςη εμφϊνιςησ χαρακτηριςτικϔν ϑποπτων για κακοόθεια θα πρϋπει να εξαιροϑνται χειρουργικϔσ. Η υπερηχογραφικό απεικϐνιςη των ϐγκων ϐρχεων αντανακλϊ τη μακροςκοπικό μορφολογύα και τον υποκεύμενο ιςτολογικϐ τϑπο. Εφϐςον το υπερηχογρϊφημα εύναι εϑκολη, χαμηλοϑ κϐςτουσ και υψηλόσ διαγνωςτικόσ ακρύβειασ εξϋταςη, ςπϊνια απαιτεύται η διερεϑνηςη των ϐγκων των ϐρχεων με μαγνητικό τομογραφύα. Αντιθϋτωσ, η μαγνητικό τομογραφύα θεωρεύται χρόςιμο διαγνωςτικϐ εργαλεύο ςτον καλϑτερο χαρακτηριςμϐ των εξω-ορχικϔν μορφωμϊτων. Η αξονικό τομογραφύα δεν εύναι χρόςιμη ςτη διαφορικό διϊγνωςη 39

40 Ειςαγωγό των εξεργαςιϔν ςτο ϐςχεο αλλϊ εύναι η κϑρια απεικονιςτικό μϋθοδοσ που χρηςιμοποιεύται ςτη ςταδιοπούηςη των ϐγκων ϐρχεων (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Ορολογικού δεύκτεσ του ϐγκου Δϑο εύναι οι κϑριοι δεύκτεσ ςτον ορϐ: η α-φετοπρωτεϗνη (AFP) και η β- υπομονϊδα τησ ανθρϔπινησ χοριακόσ γοναδοτροπύνησ (β-hcg). Η AFP εμφανύζεται ςε αςθενεύσ με ϐγκουσ του λεκιθικοϑ αςκοϑ και τερατϔματα, ενϔ η β-hcg ςε αςθενεύσ ςτουσ οπούουσ περιλαμβϊνονται ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα ςτον ϐγκο. Υυςιολογικϊ, η AFP ςυντύθεται απϐ τον εμβρυώκϐ λεκιθικϐ αςκϐ, το όπαρ και το ϋντερο. Αυξϊνεται ςτο 50-70% των ϐγκων ϐρχεων και ϋχει χρϐνο ημύςειασ ζωόσ ςτον ορϐ περύπου 4.5 ημϋρεσ (Bower M & Rustin G 2002, Klein EA 1993). Η HCG εκκρύνεται απϐ τα τροφοβλαςτικϊ κϑτταρα του πλακοϑντα και αναγνωρύζονται δϑο υπομονϊδεσ, η α- και β-υπομονϊδα. Η β-υπομονϊδα αυξϊνεται ςτο 50% των αςθενϔν και ϋχει χρϐνο ημύςειασ ζωόσ ϔρεσ. Οι αςθενεύσ με ςεμύνωμα εμφανύζουν περιοριςμϋνη αϑξηςη του δεύκτη, ςτο 10-25% των περιπτϔςεων, ενϔ ϐλοι οι αςθενεύσ με χοριοκαρκύνωμα εμφανύζουν αϑξηςη τησ β- HCG (Klein EA 1993). Εϊν τα επύπεδα των δεικτϔν δεν ελαττωθοϑν μετϊ την ορχεκτομό, ϐπωσ αναμϋνεται απϐ τουσ χρϐνουσ ημύςειασ ζωόσ, ςε φυςιολογικϊ επύπεδα, τϐτε πρϋπει να ελεγχθεύ η παρουςύα πιθανϐν υπολειππϐμενησ νϐςου. Επιπλϋον, η παρουςύα φυςιολογικϔν επιπϋδων των ορολογικϔν δεικτϔν δεν αποκλεύει την παρουςύα υπολειππϐμενησ νϐςου. Η γαλακτικό αφυδρογονϊςη (LDH) μπορεύ επύςησ να αυξηθεύ και υπϊρχει ευθεύα ςυςχϋτιςη των επιπϋδων τησ με το φορτύο τησ νϐςου. Όμωσ, ο ϋλεγχοσ τησ LDH δεν εύναι απϐλυτα ειδικό εξϋταςη αν και ο βαθμϐσ αϑξηςόσ τησ φαύνεται να ςχετύζεται με το φορτύο τησ νϐςου ΕΠΕΚΣΑΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ Σα λεμφαγγεύα του δεξιοϑ ϐρχεοσ παροχετεϑουν τη λϋμφο ςτουσ λεμφαδϋνεσ πρϐςθια, ετερϐπλευρα και ςτο μϋςο τησ κϊτω κούλησ φλϋβασ. Ο αριςτερϐσ ϐρχισ παροχετεϑει τη λϋμφο ςε λεμφαδϋνεσ περιφερικϊ, ετερϐπλευρα και πρϐςθια τησ κοιλιακόσ αορτόσ πϊνω απϐ το επύπεδο τησ κατϔτερησ μεςεντϋριασ αρτηρύασ. τη 40

41 Ειςαγωγό ςυνϋχεια, οι οπιςθοπεριτοναώκού λεμφαδϋνεσ παροχετεϑουν τη λϋμφο μϋςω του θωρακικοϑ πϐρου ςτουσ αριςτεροϑσ υπερκλεύδιουσ λεμφαδϋνεσ και ακολοϑθωσ ςτην υποκλεύδιο φλϋβα ΓΕΝΕΣΙΚΗ ΤΦΕΣΙΗ Η επιδημιολογύα, η κλινικό ςυμπεριφορϊ, η ιςτολογύα και οι χρωμοςωμικϋσ ανωμαλύεσ οδηγοϑν ςτη διϊκριςη τριϔν ομϊδων ϐγκων ϐρχεων απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα (Looijenga LH & Oosterhuis JW 1999, Looijenga LH & Oosterhuis JW 2002, Oosterhuis JW et al. 1997). την πρϔτη κατηγορύα περιλαμβϊνονται τα τερατϔματα και οι ϐγκοι του λεκιθικοϑ αςκοϑ των νεογϋννητων και των παιδιϔν, ςτη δεϑτερη τα ςεμινϔματα και οι μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι ςτουσ εφόβουσ και τουσ ενόλικεσ (TGCTs) και ςτην τρύτη το ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα των ηλικιωμϋνων. Γενετικό προδιϊθεςη (οικογενεύσ ϐγκοι) Οι οικογενεύσ ϐγκοι ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςτουσ ενόλικεσ αποτελοϑν το 1.5-2% του ςυνϐλου των ϐγκων αυτόσ τησ κατηγορύασ. Η ςυνόθωσ πρϔιμη εμφϊνιςη τησ νϐςου, η αυξημϋνη ςυχνϐτητα εμφϊνιςησ τησ νϐςου και ςτουσ δϑο ϐρχεισ και η αυξημϋνη βαρϑτητϊ τησ αποδύδεται ςε γενετικοϑσ λϐγουσ που εύναι υπεϑθυνοι για την εμφϊνιςη τησ νϐςου ςε ζευγϊρια πατϋρων υιϔν (Han S & Peschel RE 2000). Περιβαλλοντικού και κληρονομικού παρϊγοντεσ ϋχουν αναλυθεύ και το εκτιμοϑμενο ποςοςτϐ εμφϊνιςησ κακοόθειασ λϐγω γενετικϔν βλαβϔν ανϋρχεται ςτο 25% των TGCTs ςτουσ ενόλικεσ ενϔ εξύςου ςημαντικό κρύνεται η επύδραςη περιβαλλοντικϔν παραγϐντων κατϊ την παιδικό ηλικύα ςτην εμφϊνιςη καρκύνου των ϐρχεων (17%). Δεν παρατηρόθηκαν διαφορϋσ ςτισ χρωμοςωμικϋσ ανωμαλύεσ μεταξϑ των ςποραδικϔν ϐγκων και των οικογενϔν ϐγκων που εμφανύζονται και ςτουσ δϑο ϐρχεισ (Skotheim RI et al. 2001). Ωςτϐςο, βρϋθηκε ϋνα γονύδιο ςτο χρωμϐςωμα Φq27 το οπούο εμπλϋκεται ςτην ανϊπτυξη ϐγκων ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων και το οπούο εμπλϋκεται επύςησ και ςτη μη-φυςιολογικό κϊθοδο του ϐρχεοσ ςτο ϐςχεο (Rapley EA et al. 2000). Αν και ο ρϐλοσ των γενετικϔν παραγϐντων ςτην αιτιολογύα των ϐγκων ϐρχεων φαύνεται ϐτι εύναι ςημαντικϐσ, η εμπλοκό ενϐσ μϐνο γονιδύου ςτην εμφϊνιςη τησ νϐςου εύναι θεωρύα αμφιςβητόςιμη. Εύναι πιο πιθανϐ, ϐτι η γενετικό προδιϊθεςη ςε ςυνδυαςμϐ με την ενδομότρια ϋκθεςη και την 41

42 Ειςαγωγό επύδραςη περιβαλλοντικϔν παραγϐντων κατϊ την παιδικό ηλικύα ςυνειςφϋρουν ςτο μηχανιςμϐ μοριακόσ παθογϋνεςησ των ϐγκων. Ανωμαλύεσ γονϊδων Άτομα με 46,ΦΤ ό 45,Φ/46,ΦΤ δυςγενεςύεσ γονϊδων εμφανύζουν ιδιαύτερα αυξημϋνο κύνδυνο εμφϊνιςησ ϐγκων των βλαςτικϔν κυττϊρων. Ο απϐλυτοσ κύνδυνοσ κυμαύνεται μεταξϑ 10-50% (Rutgers JL & Scully RE 1987, Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Γενωμικό αποτϑπωςη Η γενωμικό αποτϑπωςη αναφϋρεται ςε ϋνα μοναδικϐ φαινϐμενο ςτα θηλαςτικϊ που ςχετύζεται με διαφορετικό λειτουργύα ενϐσ αριθμοϑ γονιδύων λϐγω τησ ξεχωριςτόσ προϋλευςόσ τουσ απϐ τουσ δϑο γονεύσ. Αυτό η διαφορϊ γεννϊται και διειςδϑει ςτουσ απογϐνουσ μϋςω των γεννητικϔν κυττϊρων. Ο τϑποσ τησ γενωμικόσ αποτϑπωςησ ϋχει ςημαντικό επύδραςη ςτο δυναμικϐ ανϊπτυξησ των κυττϊρων (Solter D 1988). Οι ϐγκοι των ϐρχεων εμφανύζουν ςταθερό ϋκφραςη αποτυπωμϋνων γονιδύων και ςτα δϑο αλληλϐμορφα (Gillis AJ et al. 1997, Looijenga LH et al. 1999, Looijenga LH et al. 1997, Mishina M et al. 1996, Nonomura N et al. 1997, Rachmilewitz J et al. 1996, van Gurp RJ et al. 1994). Τποςτηρύζεται ϐτι ςτουσ TGCTs, η ϋκφραςη των αποτυπωμϋνων γονιδύων και ςτα δϑο αλληλϐμορφα δεν εύναι αποτϋλεςμα τησ απϔλειασ τησ αποτϑπωςησ αλλϊ εύναι χαρακτηριςτικϐ των κυττϊρων απϐ ϐπου προϋρχονται οι ϐγκοι. Αυτϐ μπορεύ επύςησ να εξηγεύ την παρουςύα δραςτικϐτητασ τελομερϊςησ ςτουσ ϐγκουσ των ϐρχεων εκτϐσ των ϔριμων τερατωμϊτων (Albanell J et al. 1999). Σα τερατϔματα και οι ϐγκοι του λεκιθικοϑ αςκοϑ των ανηλύκων εμφανύζουν μια ελαφρϔσ διαφορετικό εικϐνα γενωμικόσ αποτϑπωςησ που υποςτηρύζει την ϊποψη τησ διαφορετικόσ προϋλευςησ αυτϔν των νεοπλαςμϊτων απϐ ϋνα πιο πρϔιμο ςτϊδιο ανϊπτυξησ των βλαςτικϔν κυττϊρων (Ross JA et al. 1999, Schneider DT et al. 2001). Αν και λύγα εύναι γνωςτϊ για τη γενωμικό αποτϑπωςη ςτο ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα, τα δεδομϋνα δεύχνουν ϐτι αυτού οι ϐγκοι ϋχουν όδη υποςτεύ πατρικό αποτϑπωςη (Verkerk AJ et al. 1997). 42

43 Ειςαγωγό Χρωμοςωμικϋσ ανωμαλύεσ Όλοι οι ϐγκοι των ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςυμπεριλαμβανομϋνων και των πρϐδρομων μορφϔν (αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα) εύναι ανευπλοειδεύσ (Oosterhuis JW et al. 1989). Σα ςεμινϔματα και η αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα εύναι υπερτριπλοειδεύσ, ενϔ τα κϑτταρα των μηςεμινωματωδϔν ϐγκων, ανεξϊρτητα του ιςτολογικοϑ τϑπου, εύναι υποτριπλοειδό. Αυτό η παρατόρηςη προτεύνει ϐτι ο πολυπλοειδιςμϐσ εύναι το αρχικϐ γεγονϐσ που οδηγεύ ςτην τετραπλοειδό αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα, η οπούα ςτη ςυνϋχεια ακολουθεύται απϐ χρωμοςωμικό ελϊττωςη (Oosterhuis JW et al. 1989). Η ανευπλοειδύα ςτουσ ϐγκουσ των ϐρχεων ϋχει ςχετιςτεύ με την ενύςχυςη των κεντροςωμϊτων (Mayer F et al. 2003). Με διϊφορεσ τεχνικϋσ ϋχει δειχθεύ ϋνα ςϑνθετο αλλϊ παρϐμοιο πρϐτυπο υπερϋκφραςησ ό μεύωςησ τησ ϋκφραςησ μϋρουσ διαφϐρων χρωμοςωμϊτων ςτουσ ςεμινωματϔδεισ και μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Μϋροσ των χρωμοςωμϊτων 4, 5, 11, 13, 18 και Τ εμφανύζουν ελϊττωςη, ενϔ μϋρη των χρωμοςωμϊτων 7, 8, 12, και Φ εμφανύζουν αϑξηςη τησ ϋκφραςόσ τουσ. Σα ςεμινϔματα εμφανύζουν αϑξηςη του αριθμοϑ των χρωμοςωμϊτων 7, 15, 17, 19, και 22 αιτιολογϔντασ την πολυπλοειδικό δομό τουσ (Rosenberg C et al. 1999, van Echten J et al. 1995). Αυτό η παρατόρηςη προτεύνει μια κοινό αρχό ϐλων των ιςτολογικϔν μορφϔν των TGCTs, γεγονϐσ που υποςτηρύζεται απϐ τη ςυνϑπαρξη τϐςο ςεμινωματωδϔν ϐςο και μη-ςεμινωματωδϔν ϐγκων ςε κϊποιεσ περιπτϔςεισ (Castedo SM et al. 1988, Gillis AJ et al. 1994, Rothe M et al. 1999). Αϑξηςη του χρωμοςώματοσ 12p και των γονιδύων του Η μϐνη ςταθερό χρωμοςωμικό ανωμαλύα που παρατηρεύται ςτουσ διηθητικοϑσ ϐγκουσ των ϐρχεων εύναι η ενύςχυςη μϋρουσ του χρωμοςϔματοσ 12p το οπούο αναφϋρεται ςυχνϊ ωσ ιςοχρωμϐςωμα 12p [i(12p)] (Sandberg AA et al. 1996). Η μοριακό ανϊλυςη ϋχει δεύξει ϐτι το ιςοχρωμϐςωμα 12p προϋρχεται απϐ ϋνα πατρικϐ χρωμϐςωμα και δημιουργεύται απϐ το διπλαςιαςμϐ του ρ-μϋρουσ του χρωμοςϔματοσ και την απϔλεια του q-μϋρουσ. Εύναι ενδιαφϋρον ϐτι το i(12p) δεν περιορύζεται μϐνο ςτουσ ςεμινωματϔδεισ και μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ των ϐρχεων αλλϊ εμφανύζεται επύςησ ςε ϐγκουσ των ωοθηκϔν, του πρϐςθιου μεςοθωρακύου και τησ μϋςησ γραμμόσ του εγκεφϊλου. Η πλειονϐτητα των TGCTs (περύπου το 80%) εμφανύζουν το i(12p) (van Echten J et al. 1995), ενϔ ςτισ 43

44 Ειςαγωγό υπϐλοιπεσ περιπτϔςεισ εμφανύζονται επιπλϋον αντύγραφα μϋρουσ ό ολϐκληρου του χρωμοςϔματοσ 12p (Rodriguez E et al. 1993, Suijkerbuijk RF et al. 1993). Αυτϐ οδηγεύ ςτο ςυμπϋραςμα ϐτι η ενύςχυςη μϋρουσ του χρωμοςϔματοσ 12p εύναι κρύςιμη για την ανϊπτυξη αυτόσ τησ κακοόθειασ και ςχετύζεται ιδιαύτερα με την ικανϐτητα πολλαπλαςιαςμοϑ και διόθηςησ (Rosenberg C et al. 2000). Διϊφορα γονύδια ϋχει προταθεύ ϐτι εμπλϋκονται ςτην ενύςχυςη του 12p. Μεταξϑ αυτϔν εύναι το γονύδιο K- ras, το οπούο εμφανύζει ςπϊνια μεταλλϊξεισ και μερικϋσ φορϋσ υπερεκφρϊζεται ςτουσ ϐγκουσ των ϐρχεων (Moul JW et al. 1992, Mulder MP et al. 1989, Olie RA et al. 1995, Ridanpää M et al. 1993, Skotheim RI et al. 2002) και η κυκλύνη D2 (Houldsworth J et al. 1997, Schmidt BA et al. 2001, Sicinski P et al. 1996, Skotheim RI et al. 2002). Η κυκλύνη αυτό πιθανϐν να εμπλϋκεται προκαλϔντασ απορρϑθμιςη του ςημεύου ελϋγχου μεταξϑ των φϊςεων G1-S. Μια πιο εντοπιςμϋνη προςϋγγιςη ςτην ταυτοπούηςη γονιδύων που εμπλϋκονται ςτην ανϊπτυξη των ϐγκων ϐρχεων ξεκύνηςε ϋπειτα απϐ την εϑρεςη ενϐσ μεταςτατικοϑ ςεμινϔματοσ με ενύςχυςη ενϐσ περιοριςμϋνου τμόματοσ του χρωμοςϔματοσ 12p που ταυτοποιόθηκε κυτταρογενετικϊ ϐτι όταν η περιοχό 12p11.2-p12.1 (Suijkerbuijk RF et al. 1994). Ακολοϑθωσ, πρωτοπαθεύσ ϐγκοι ϐρχεων βρϋθηκαν να περιϋχουν τϋτοιεσ ενιςχϑςεισ (Zafarana G et al. 2002, Korn WM et al. 1996, Mostert MC et al. 1998, Mostert MM et al. 1996). Η ενύςχυςη του 12p απαντϊται ςτο 8-10% των περιπτϔςεων του ςεμινϔματοσ ιδιαύτερα ςε εκεύνα ϐπου δεν παρατηρεύται το ιςοχρωμϐςωμα 12p ενϔ αναγνωρύζεται ςημαντικϊ ςπανιϐτερα ςτουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (Zafarana G et al. 2002). Αυτϐ προτεύνει την παρουςύα δϑο μονοπατιϔν που οδηγοϑν ςτην υπερϋκφραςη των γονιδύων ςτο τμόμα 12p, εύτε μϋςω τησ δημιουργύασ του ιςοχρωμοςϔματοσ 12p ό μϋςω εναλλακτικοϑ μηχανιςμοϑ που οδηγεύ ςε υψηλό ενύςχυςη τησ περιοχόσ αυτόσ του χρωμοςϔματοσ. Σα ςεμινϔματα με ενύςχυςη τησ περιοχόσ αυτόσ του χρωμοςϔματοσ 12p εμφανύζουν ελαττωμϋνη ευαιςθηςύα ςτην απϐπτωςη και ϋνα γονύδιο που πιθανϐν να εμπλϋκεται εύναι το γονύδιο DAD-R (Zafarana G et al. 2002). Εύναι επύςησ πιθανϐ, ϐτι περιςςϐτερα γονύδια ςε αυτό την περιοχό ενύςχυςησ βοηθοϑν τα κϑτταρα του ϐγκου να υπεριςχϑςουν τησ απϐπτωςησ και να πολλαπλαςιαςτοϑν (Frisch SM & Francis H 1994). 44

45 Ειςαγωγό Μοριακϋσ γενετικϋσ μεταβολϋσ Αρκετϋσ μελϋτεσ ϋχουν δημοςιευτεύ ςχετικϊ με το ρϐλο τησ αδρανοπούηςησ ογκο-καταςταλτικϔν γονιδύων και την ενεργοπούηςη πρωτο-ογκογονιδύων ςτην ανϊπτυξη των ϐγκων ϐρχεων. Μια ςημαντικό διαφορϊ μεταξϑ των ςεμινωμϊτων εύναι η υπομεθυλύωςό τουσ, ςε ςχϋςη με τουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐπου παρατηρεύται υπερμεθυλύωςη (Gillis AJ et al. 1997, Smiraglia DJ et al. 2002). Αυτϐ μπορεύ να αντικατοπτρύζει την εμβρυώκό τουσ προϋλευςη και την ικανϐτητα των μηςεμινωματωδϔν ϐγκων να μιμοϑνται την εμβρυώκό και την εξωεμβρυώκό ανϊπτυξη, γεγονϐσ που υποςτηρύζεται απϐ το μοντϋλο ϋκφραςησ του γονιδύου OCT3/4 καθϔσ και τη δραςτικϐτητα τελομερϊςησ που εμφανύζουν (Palumbo C et al. 2002, Looijenga LH et al. 1997a). Διϊφορεσ μελϋτεσ ϋχουν πραγματοποιηθεύ για την ταυτοπούηςη γενωμικϔν απωλειϔν, ιδιαύτερα την ταυτοπούηςη τησ απϔλειασ ετεροζυγωτύασ, με ςκοπϐ να αναγνωριςτοϑν ογκο-καταςταλτικού γονιδιακού τϐποι. Όμωσ, λϐγω τησ ανευπλοειδύασ του DNA ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων καθϔσ και τησ εμβρυώκόσ τουσ φϑςησ αυτϊ τα ςτοιχεύα πρϋπει να αναλϑονται με προςοχό (Looijenga LH et al. 1994a). Πρϊγματι, τα ανευπλοειδό κϑτταρα πιςτεϑεται ϐτι χϊνουν γενωμικϋσ αλληλουχύεσ που οδηγοϑν ςε απϔλεια τησ ετεροζυγωτύασ και επηρεϊζουν περύπου περιοχϋσ του γονιδιϔματοσ, οι οπούεσ μπορεύ να μην εμπλϋκονται ςτην ϋναρξη τησ κακοόθειασ (Loeb LA 2001). Επιπροςθϋτωσ, τα πολυδϑναμα εμβρυικϊ προγονικϊ κϑτταρα εμφανύζουν διαφορετικό ςυχνϐτητα και τϑπουσ μεταλλϊξεων ςε ςχϋςη με τα ςωματικϊ κϑτταρα (Cervantes RB et al. 2002) και εμφανύζουν αυξημϋνη απϔλεια χρωμοςωμϊτων και διπλαςιαςμοϑσ που οδηγοϑν ςε μονογονεώκϋσ διςωμύεσ οι οπούεσ ανιχνεϑονται ςαν απϔλειεσ ετεροζυγωτύασ. Η πλειονϐτητα των μελετϔν για απϔλειεσ ετεροζυγωτύασ ϋχουν εςτιαςτεύ ςτα χρωμοςϔματα 1, 3, 5, 11, 12, και 18 και ϋχουν δειχθεύ απϔλειεσ ογκοκαταςταλτικϔν γονιδύων που εδρϊζονται ςτουσ γενετικοϑσ τϐπουσ αυτϔν των γονιδύων (Bala S et al. 2000, Ejeskär K et al. 2001, Kraggerud SM et al. 2002, Looijenga LH et al. 1994, Lothe RA et al. 1993, Murty VV et al. 1994a, Murty VV et al. 1992, Murty VV et al. 1994b, Peng HQ et al. 1999). ΣΡ53 και μικροδορυφορικό αςτϊθεια και ανταπϐκριςη ςτη θεραπεύα Ανοςοώςτοχημικϋσ χρϔςεισ ϋχουν δεύξει την υπερϋκφραςη τησ αγρύου τϑπου (wild type) πρωτεϗνησ ΣΡ53 ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων ενϔ πολϑ δϑςκολα ανιχνεϑονται 45

46 Ειςαγωγό μεταλλϊξεισ που απενεργοποιοϑν αυτό την πρωτεϗνη. Η παρουςύα υψηλοϑ τύτλου του wild type ΣΡ53 μπορεύ να ερμηνεϑει την εξαιρετικό χημειοευαιςθηςύα των ϐγκων ϐρχεων ϐμωσ η απενεργοπούηςη αυτόσ τησ πρωτεϗνησ φαύνεται ϐτι ευθϑνεται για την ανθεκτικϐτητα ςτη θεραπεύα μϐνο ςε μια μικρό μειοψηφύα των TGCTs (Houldsworth J et al. 1998). την πραγματικϐτητα, η υπερευαιςθηςύα αυτϔν των ϐγκων πιθανϐν να ςχετύζεται με την εμβρυικό τουσ προϋλευςη ςε αντύθεςη με την πλειοψηφύα των ςυμπαγϔν ϐγκων. Η χημειοανθεκτικϐτητα των ςεμινωματωδϔν και μηςεμινωματωδϔν ϐγκων ϋχει ςχετιςτεύ με γενωμικό ενύςχυςη ςε διϊφορουσ γενετικοϑσ τϐπουσ ϐπωσ για παρϊδειγμα ςτην περιοχό 9q22 (Rao PH et al. 1998). Σο γονύδιο ΦΡΑ που εμπλϋκεται ςτην επιδιϐρθωςη του DNA εντοπύζεται ςε αυτό την περιοχό. Φαμηλό ϋκφραςό του ϋχει ςχετιςτεύ με ευαιςθηςύα των ϐγκων ςτη θεραπεύα με cisplatin πιθανϐτατα μϋςω τησ ελαττωμϋνησ αποκοπόσ νουκλεοτιδύων κατϊ την επιδιϐρθωςη (Köberle B et al. 1999). Η αυξημϋνη ϋκφραςη του μηχανιςμοϑ επιδιϐρθωςησ, μϋςω αποκοπόσ βϊςεων, ϋχει προταθεύ ωσ υπεϑθυνη για τη χημειοανθεκτικϐτητα ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων (Robertson KA et al. 2001). Ένασ ϊλλοσ μηχανιςμϐσ για την ανθεκτικϐτητα ϋναντι τησ cisplatin εύναι η αποςϑζευξη του μονοπατιοϑ μεταξϑ τησ βλϊβησ του DNA και τησ επαγωγόσ τησ απϐπτωςησ. Σο μονοπϊτι επιδιϐρθωςησ των αταύριαςτων βϊςεων εύναι πολϑ πιθανϐ να εμπλϋκεται ςτην ταυτοπούηςη τησ βλϊβησ του DNA και ςτην ϋναρξη τησ απϐπτωςησ παρϊ ςτην επιδιϐρθωςη τησ βλϊβησ. Η αναςτολό αυτοϑ του μονοπατιοϑ που εμφανύζεται ςε μικροδορυφορικϋσ αςτϊθειεσ εύναι ςυχνϐ εϑρημα ςε μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ που υποτροπιϊζουν μετϊ τη θεραπεύα με cisplatin και δεν εύναι γενικϐ εϑρημα ςτουσ TGCTs (Mayer F et al. 2002, Peltomäki P et al. 1993). Γονιδιακϊ πρϐτυπα ϋκφραςησ Σρεισ ανεξϊρτητεσ μελϋτεσ ανϋδειξαν ϐτι τα μοντϋλα ϋκφραςησ γονιδύων εύναι διαφορετικϊ ςτουσ διϊφορουσ ιςτολογικοϑσ τϑπουσ καρκύνου των ϐρχεων. Η ταξινϐμηςη βαςύςτηκε ςτην ιεραρχικό ανϊλυςη ομϊδασ 501 διαφορετικϊ εκφραζϐμενων γονιδύων. Διαπιςτϔθηκε ϐτι τα γονύδια GRB7 και JUP υπερεκφρϊζονται απϐ το μακρϐ ϊκρο του χρωμοςϔματοσ 17 (Skotheim RI et al. 2002). Άλλεσ μελϋτεσ εντοπύςτηκαν ςτο βραχϑ ϊκρο του χρωμοςϔματοσ 12 ιδιαύτερα ςτην περιοχό p11.2-p12.1 και ανϋδειξαν ϐτι ϐγκοι με περιοριςμϋνη ενύςχυςη αυτόσ τησ περιοχόσ δεν υπερεκφρϊζουν γονύδια αυτοϑ του τϐπου (Rodriguez S et al. 2003). 46

47 Ειςαγωγό Δϑο απϐ τα πιο ενδιαφϋροντα γονύδια όταν τα GCT1 και GCT2 που εύχε ταυτοποιηθεύ ϐτι υπερεκφρϊζονται ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων (Bourdon V et al. 2002). Όμωσ, επϐμενεσ ϋρευνεσ ανϋδειξαν ϐτι εντοπύζονται εκτϐσ αυτόσ τησ περιοχόσ και εκφρϊζονται ευρϑτατα. Μια ϊλλη μελϋτη ςτην ύδια περιοχό υπϋδειξε ϐτι το γονύδιο BCAT1 εύναι επύςησ ενδιαφϋρον και ςχετύζεται με τουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (Rodriguez S et al. 2003) ΣΑΔΙΟΠΟΙΗΗ ΣΨΝ ΟΓΚΨΝ ΣΨΝ ΟΡΦΕΨΝ Οι ϐγκοι των ϐρχεων ταξινομοϑνται (Πύνακασ 1) και ςταδιοποιοϑνται (Πύνακασ 2) με βϊςη το ςϑςτημα που αξιολογεύ την εντϐπιςη του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου (Σ), την προςβολό των λεμφαδϋνων (Ν) και την παρουςύα απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων (Μ). τη ςταδιοπούηςη ϋχει προςτεθεύ και μια τϋταρτη παρϊμετροσ (S) που αναφϋρεται ςτη ςυγκϋντρωςη των δεικτϔν (AFP, β-hcg και LDH) ςτον ορϐ των αςθενϔν. Έτςι ςτο πρϔτο ςτϊδιο η νϐςοσ εντοπύζεται ςτουσ ϐρχεισ, ςτο δεϑτερο ςτϊδιο εμφανύζει μεταςτϊςεισ ςτον οπιςθοπεριτοναώκϐ χϔρο, ενϔ ςτο τρύτο ϋχει εξαπλωθεύ και ςε ϊλλουσ λεμφαδϋνεσ, ςτο γαςτρεντερικϐ, ϊνω του διαφρϊγματοσ ό ςε ςυμπαγό ϐργανα (Πύνακασ 2). 47

48 Ειςαγωγό Πύνακασ 1. Σαξινϐμηςη των ϐγκων των ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων κατϊ TNM. Σαξινόμηςη (pσνμ) Πρωτογενόσ όγκοσ (Σ) pσx Ο πρωτογενόσ ϐγκοσ δεν μπορεύ να εκτιμηθεύ pσ0 Μη ϑπαρξη πρωτογενοϑσ ϐγκου pσis Ενδοςωληναριακό υπερπλαςύα εκ γαμετικϔν κυττϊρων (in situ καρκύνωμα) pσ1 Όγκοσ που εντοπύζεται ςτον ϐρχι και την επιδιδυμύδα χωρύσ διόθηςη αγγεύων ό λεμφαγγεύων, ο ϐγκοσ μπορεύ να διηθεύ τον ινϔδη χιτϔνα αλλϊ ϐχι τον ελυτροειδό χιτϔνα pσ2 Όγκοσ που εντοπύζεται ςτον ϐρχι και την επιδιδυμύδα που διηθεύ αγγεύα ό λεμφαγγεύα, ό που διηθεύ τον ινϔδη χιτϔνα και επεκτεύνεται ςτον ελυτροειδό χιτϔνα pσ3 Όγκοσ που διηθεύ τον ςπερματικϐ τϐνο με ό χωρύσ διόθηςη αγγεύων ό λεμφαγγεύων pσ4 Όγκοσ που διηθεύ το ϐςχεο με ό χωρύσ διόθηςη αγγεύων ό λεμφαγγεύων Σοπικού λεμφαδϋνεσ (Ν) pnx Οι τοπικού λεμφαδϋνεσ δεν μποροϑν να εκτιμηθοϑν pn0 Μη προςβολό τοπικϔν λεμφαδϋνων pn1 Μετϊςταςη ςε λεμφαδϋνα μεγϋθουσ ϋωσ 2 εκατοςτϊ ςε διϊμετρο και 5 ό λιγϐτεροι θετικού λεμφαδϋνεσ κανϋνασ ϐμωσ μεγαλϑτεροσ των 2 εκατοςτϔν ςε διϊμετρο pn2 Μετϊςταςη ςε λεμφαδϋνα μεγϋθουσ απϐ 2 ϋωσ 5 εκατοςτϊ ςε διϊμετρο και περιςςϐτεροι απϐ 5 θετικού λεμφαδϋνεσ κανϋνασ ϐμωσ μεγαλϑτεροσ των 5 εκατοςτϔν ςε διϊμετρο ό ςτοιχεύα εξω-λεμφαδενικόσ επϋκταςησ του ϐγκου pn3 Μετϊςταςη με λεμφαδενικό μϊζα μεγαλϑτερη των 5 εκατοςτϔν Απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ (Μ) Mx Οι απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ δεν μποροϑν να εκτιμηθοϑν M0 Μη ϑπαρξη απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων M1 Απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ M1a Μετϊςταςη ςε μη-τοπικοϑσ λεμφαδϋνεσ ό τουσ πνεϑμονεσ M1b Μεταςτϊςεισ ςε ϊλλεσ θϋςεισ Δεύκτεσ του όγκου ςτον ορό (S) LDH hcg (mlu/ml) AFP (ng/ml) S1 < 1.5 x N και < 5000 και <1000 S x N ό ό S3 >10 x N ό > ό > SX Μη ύπαρξη δεδομένων για τουσ ςυγκεκριμένουσ δείκτεσ N, το άνω όριο τησ φυςιολογικήσ τιμήσ LDH 48

49 Ειςαγωγό Πύνακασ 2. ταδιοπούηςη των ϐγκων των ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων (WHO). ταδιοπούηςη τϊδιο 0 pσis N0 M0 S0, SX τϊδιο Ι pσ1-4 N0 M0 SX τϊδιο ΙΑ pσ1 N0 M0 S0 τϊδιο ΙΒ pσ2-4 N0 M0 S0 τϊδιο ΙS Κϊθε pσ/tx N0 M0 S1-3 τϊδιο ΙΙ Κϊθε pσ/tx N1-3 M0 SX τϊδιο ΙΙΑ Κϊθε pσ/tx N1 M0 S0-1 τϊδιο ΙΙΒ Κϊθε pσ/tx N2 M0 S0-1 τϊδιο ΙΙC Κϊθε pσ/tx N3 M0 S0-1 τϊδιο ΙΙΙ Κϊθε pσ/tx Κϊθε N M1, M1a SX τϊδιο ΙΙΙΑ Κϊθε pσ/tx Κϊθε N M1, M1a S0-1 τϊδιο ΙΙΙΒ Κϊθε pσ/tx Κϊθε N M0, M1, M1a S2 τϊδιο ΙΙΙC Κϊθε pσ/tx Κϊθε N M0, M1, M1a, M1b Κϊθε S, S ΠΡΟΔΡΟΜΕ ΑΛΛΟΙΨΕΙ ΑΣΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΕΝΔΟΨΛΗΝΑΡΙΑΚΗ ΝΕΟΠΛΑΙΑ ΕΚ ΒΛΑΣΙΚΨΝ ΚΤΣΣΑΡΨΝ (IGCNU) Φαρακτηρύζεται απϐ την παρουςύα βλαςτικϔν κυττϊρων με ϊφθονο κενοτοπιϔδεσ κυτταρϐπλαςμα, μεγϊλουσ ακανϐνιςτουσ πυρόνεσ και ϋντονη παρουςύα πυρηνύςκων που εντοπύζονται εντϐσ των ςπερματοφϐρων ςωληναρύων. τουσ ενόλικεσ με ιςτορικϐ κρυψορχύασ εμφανύζεται ςτο 2-4 % ςε αντύθεςη με τα νεαρϊ παιδιϊ που εμφανύζεται ςτο 0.5% των περιπτϔςεων (Burke AP & Mostofi FK 1988a, Giwercman A et al. 1989, Hamper UM et al. 1990, Pedersen KV et al. 1987, Rogers E et al. 1998, Bettocchi C et al. 1994, Schutte B 1988). ε μελϋτεσ υπογονιμϐτητασ-ςτειρϐτητασ η επύπτωςη εύναι 1% ενϔ ςε αςθενεύσ με ενδιϊμεςα φυλετικϊ χαρακτηριςτικϊ και ϋνα Τ χρωμϐςωμα εμφανύζεται ςτο 6-25% των 49

50 Ειςαγωγό περιπτϔςεων (Burke AP 7 Mostofi FK 1988a, Schutte B 1988, Armstrong GR et al. 1991, Cassio A et al. 1990, Ramani P et al. 1993, Williams JC et al. 1994). ε ϐρχεισ με ταυτοποιημϋνουσ ϐγκουσ, αναγνωρύζεται αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα ςτον παρακεύμενο φυςιολογικϐ ιςτϐ ςτο 82% των περιπτϔςεων. Εφϐςον, ο κύνδυνοσ εμφϊνιςησ ϐγκου και ςτον ετερϐπλευρο ϐρχι αυξϊνει φορϋσ, μερικϊ κϋντρα ςτην Ευρϔπη πραγματοποιοϑν βιοψύεσ ςτον ετερϐπλευρο ϐρχι με ποςοςτϊ τεκμηρύωςησ αταξινϐμητησ ενδοςωληναριακόσ νεοπλαςύασ ςε % των περιπτϔςεων (Dieckmann KP & Loy V 1996, von der Maase H et al. 1987). το 42% των αςθενϔν με οπιςθοπεριτοναώκοϑσ ϐγκουσ εκ βλαςτικϔν κυττϊρων παρουςιϊζεται IGCNU αλλϊ πολϑ ςπϊνια ανευρύςκεται ςε αςθενεύσ με αντύςτοιχουσ ϐγκουσ μεςοθωρακύου (Böhle A et al. 1986, Daugaard G et al. 1992, Hailemariam S et al. 1997, Hofmann MC et al. 1989). Διϊφορεσ μελϋτεσ ςε νεκροψύεσ ϋχουν δεύξει ϐτι η ςυχνϐτητα τησ αταξινϐμητησ ενδοςωληναριακόσ νεοπλαςύασ εύναι παρϐμοια με τη ςυχνϐτητα των ϐγκων ϐρχεων απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα ςτο γενικϐ πληθυςμϐ (Dieckmann KP & Skakkebaek NE 1999). Εύναι δϑςκολο να υπολογιςθεύ η ςυχνϐτητα τησ αταξινϐμητησ ενδοςωληναριακόσ νεοπλαςύασ εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςτην προεφηβικό ηλικύα. Εμφανύζεται ςπϊνια ςε περιπτϔςεισ μη φυςιολογικόσ ορχικόσ καθϐδου, ενδιϊμεςων φυλετικϔν χαρακτηριςτικϔν και ςε μερικϋσ περιπτϔςεισ ϐγκων λεκιθικοϑ αςκοϑ και τερατωμϊτων. Η IGCNU εμφανύζεται ςτο 2-8% των περιπτϔςεων κρυψορχύασ (Krabbe S et al. 1979). Η απουςύα του ιςοχρωμοςϔματοσ 12p ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων ςτα παιδιϊ, ςυνηγορεύ ϐτι ο μηχανιςμϐσ παθογϋνεςόσ τουσ πιθανϐν να εύναι διαφορετικϐσ απϐ των ενηλύκων. Σα ςυνοδϊ ςυμπτϔματα και ςημεύα τησ νϐςου εύναι η παρουςύα ατροφύασ των ϐρχεων, η ςτειρϐτητα, η μη-φυςιολογικό κϊθοδοσ των ϐρχεων, τα ενδιϊμεςα φυλετικϊ χαρακτηριςτικϊ και τϋλοσ η παρουςύα ψηλαφητοϑ μορφϔματοσ ςτον ϐρχι. Σα κακοόθη κϑτταρα εύναι μεγαλϑτερα απϐ τα φυςιολογικϊ ςπερματογϐνια και ϋχουν ϊφθονο διϊφανο ό κενοτοπιϔδεσ κυτταρϐπλαςμα πλοϑςιο ςε γλυκογϐνο. Ο πυρόνασ εύναι μεγϊλοσ, ακανϐνιςτοσ και υπερχρωματικϐσ με ϋναν ό περιςςϐτερουσ μεγϊλουσ και ακανϐνιςτουσ πυρηνύςκουσ. υχνϊ εμφανύζουν φυςιολογικϋσ και ανϔμαλεσ μιτϔςεισ. Σα κϑτταρα βρύςκονται ςυνόθωσ μεταξϑ των κυττϊρων Sertoli και η ςπερματογϋνεςη ςυνόθωσ απουςιϊζει. Η προςβολό των ςωληναρύων εύναι ςυνόθωσ εντοπιςμϋνη αλλϊ μπορεύ να εύναι και διϊχυτη. Απομονωμϋνα κακοόθη κϑτταρα ςτο μεςοκυττϊριο χϔρο ό ςτα λεμφαγγεύα εύναι δεύκτησ μικροδιηθητικόσ 50

51 Ειςαγωγό νϐςου. Η παρουςύα λεμφοκυτταρικόσ αντύδραςησ ςυχνϊ ςυνοδεϑει την IGCNU και τη μικροδιηθητικό νϐςο. Η πλακουντιακό αλκαλικό φωςφατϊςη (PLAP) αναγνωρύζεται ςτο % των περιπτϔςεων τησ αταξινϐμητησ ενδοςωληναριακόσ νεοπλαςύασ και χρηςιμοποιεύται ωσ δεύκτησ διϊγνωςησ (Burke AP & Mostofi FK 1988a, Burke AP & Mostofi FK 1988b, Hofmann MC et al. 1989, Jacobsen GK et al. 1984). Άλλοι δεύκτεσ που εκφρϊζονται ετερογενϔσ εύναι οι: CD117 (c-kit), M2A, 43-9F, TRA την αταξινϐμητη ενδοςωληναριακό νεοπλαςύα, το περιεχϐμενο του DNA εύναι μεταξϑ υποτριπλοειδικοϑ και υποπενταπλοειδικοϑ και εύναι παρϐμοιο με αυτϐ των διηθητικϔν νεοπλαςιϔν χωρύσ ϐμωσ την ενύςχυςη του 12p, προτεύνοντασ ϐτι η ενύςχυςη δεν αποτελεύ το πρωταρχικϐ αύτιο για την ανϊπτυξη των ϐγκων ϐρχεων (de Graaff WE et al. 1992, el-naggar AK et al. 1992, Nistal M et al. 1989, Looijenga LH et al. 2000, Rodriguez E et al. 1993, Rosenberg C et al. 2000). Αυτϐ αποδεικνϑει ϐτι ο πολυπλοειδιςμϐσ προηγεύται τησ δημιουργύασ του ιςοχρωμοςϔματοσ 12p. Περύπου 50% των περιπτϔςεων IGCNU εξελύςςονται ςε διηθητικοϑσ ϐγκουσ μϋςα ςε 5 ϋτη και περύπου 90% ςε 7 ϋτη ενϔ ςε ςπϊνιεσ περιπτϔςεισ δεν εξελύςςονται (Burke AP & Mostofi FK 1988a, Giwercman A et al. 1993, Pryor JP et al. 1983) ΟΓΚΟΙ ΑΠΟΣΕΛΟΤΜΕΝΟΙ ΑΠΟ ΜΙΑ ΜΟΝΟ ΙΣΟΛΟΓΙΚΗ ΜΟΡΥΗ ΕΜΙΝΨΜΑ Σο ςεμύνωμα εύναι ϐγκοσ που προϋρχεται απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα, τα οπούα ϋχουν γενικϊ παρϐμοια μορφολογύα με διϊφανο κυτταρϐπλαςμα ό κυτταρϐπλαςμα που περιϋχει μεγϊλεσ ποςϐτητεσ γλυκογϐνου. Παρουςιϊζουν ϋνα μεγϊλο κανονικϐ πυρόνα με ϋνα ό περιςςϐτερουσ πυρηνύςκουσ και ϋχουν ςαφϔσ περιγεγραμμϋνα ϐρια. Η ςυχνϐτητα των ςεμινωμϊτων και των μη-ςεμινωματωδϔν νεοπλαςμϊτων αυξϊνει παρϐμοια ςτουσ λευκοϑσ αςθενεύσ και ο χρϐνοσ διπλαςιαςμοϑ τησ εύναι περύπου 30 ϋτη. Η ςυχνϐτητα τησ νϐςου παρουςιϊζει διακυμϊνςεισ ςτο λοιπϐ πληθυςμϐ εμφανύζοντασ αϑξηςη ςτουσ Ιϊπωνεσ και τουσ Μαορύ τησ Νϋασ Ζηλανδύασ και ςταςιμϐτητα ςτουσ Αφροαμερικανοϑσ (Parkinson C & Harland SJ 1999, Raghavan D et al. 1997). 51

52 Ειςαγωγό Ο ςυχνϐτεροσ τρϐποσ εμφϊνιςησ τησ νϐςου εύναι διϐγκωςη των ϐρχεων, ανϔδυνη που ςυχνϊ ςυνοδεϑεται απϐ υδροκόλη ενϔ ϋνα ποςοςτϐ ςεμινωμϊτων εμφανύζεται ςε μια ατροφικό γονϊδα. Οι ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι ϋχουν ιδιαύτερα υπερηχογραφικϊ χαρακτηριςτικϊ. Αφορύζονται ςαφϔσ, εύναι υποηχογενεύσ και μπορεύ να ςχηματύζουν λοβϔδη ό πολυοζϔδη μορφϔματα. Ο ςχηματιςμϐσ κϑςτεων και η αιμορραγύα δεν εύναι ςυχνϊ ευρόματα και η επϋκταςη τησ νϐςου μϋςω τησ προςβολόσ τησ επιδιδυμύδοσ και του ςπερματικοϑ τϐνου εύναι αςυνόθησ. Σο ςεμύνωμα μεθύςταται αρχικϊ μϋςω των λεμφαγγεύων ςτουσ παραορτικοϑσ λεμφαδϋνεσ και ϋπειτα ςτουσ μεςοθωρϊκιουσ και υπερκλεύδιουσ λεμφαδϋνεσ. Η αιματογενόσ μετϊςταςη ακολουθεύ ςε αργϐτερα ςτϊδια και περιλαμβϊνει την προςβολό του όπατοσ, των πνευμϐνων, των οςτϔν και ϊλλων οργϊνων. Σο ςεμύνωμα αποτελεύται τυπικϊ απϐ ομοιϐμορφα κϑτταρα που οργανϔνονται ςε ελϊςματα ό χωρύζονται ςε ομϊδεσ ό ςτόλεσ με λεπτϐ ινϔδεσ δύκτυο και ςυνοδεϑονται απϐ ςυςςϔρευςη λεμφοκυττϊρων, ενϔ πλαςματοκϑτταρα και ηωςινϐφιλα ςυναντϔνται περιςταςιακϊ. Λιγϐτερο ςυχνϊ, ςυνοδεϑονται απϐ πυκνϐ ινϔδεσ ςτρϔμα και κϑςτεισ που δημιουργοϑνται απϐ την παρουςύα οιδόματοσ ενδιαμϋςωσ του ϐγκου. Κοκκιωματϔδησ αντύδραςη και ύνωςη παρατηρεύται ςυχνϊ, που περιςταςιακϊ μπορεύ να εύναι τϐςο ϋντονη ϔςτε να αφανύςει τον ϐγκο. Σα ςεμινϔματα ςυνόθωσ εξαλεύφουν τη χαρακτηριςτικό αρχιτεκτονικό των ϐρχεων. Όμωσ, εύναι δυνατϐν να εμφανύζουν επιπλϋον τϑπουσ ανϊπτυξησ προκαλϔντασ διόθηςη ςτον εξωκυττϊριο χϔρο ό ςχηματύζοντασ ϋνα μικρϐ ϐγκο που αδυνατεύ να παρϊγει μια ψηλαφητό μϊζα ό ωσ επιμϋρουσ μϐρφωμα ςτα ϐρια ενϐσ μεγϊλου ϐγκου, ό τϋλοσ προκαλϔντασ ενδοςωληναριακό διόθηςη. Σϑποι ςεμινώματοσ Ηθμοειδόσ, ψευδοαδενικϐσ και ςωληνοειδόσ τϑποσ του ςεμινώματοσ Σα κϑτταρα του ςεμινϔματοσ μπορεύ να διατϊςςονται ςε ψευδοαδενικοϑσ ό κυψελιδικοϑσ ςχηματιςμοϑσ ό να αναπτϑςςονται ςχηματύζοντασ ϋνα διϊτρητο πρϐτυπο με ςποραδικό παρουςύα λεμφοκυττϊρων (Damjanov I et al. 1980). Μπορεύ να εμφανύζουν και ςωληνοειδό διϊταξη που προςομοιϊζει τουσ ϐγκουσ απϐ κϑτταρα Sertoli (Young RH et al. 1989). Η ταυτοπούηςη του αμιγοϑσ ςεμινϔματοσ απαιτεύ την 52

53 Ειςαγωγό παρουςύα θετικόσ χρϔςησ για την PLAP και τον υποδοχϋα CD117 και αρνητικόσ ϋκφραςησ τησ inhibin, AFP και του CD30. εμύνωμα με αυξημϋνεσ μιτώςεισ Σα ςεμινϔματα με μεγϊλο βαθμϐ κυτταρικοϑ πλειομορφιςμοϑ, υψηλό μιτωτικό δραςτηριϐτητα και ςποραδικό παρουςύα λεμφοκυττϊρων ςτο ςτρϔμα χαρακτηρύζονται ωσ ϊτυπα ςεμινϔματα ό αναπλαςτικϊ ςεμινϔματα, ό ςεμινϔματα με υψηλϐ μιτωτικϐ δεύκτη (Mostofi FK & Sesterhenn IA 1998, Mostofi FK & Sobin LH 1977, Thackray AC & Crane WA 1976). Δεν υποκατηγοριοποιοϑνται πϊντοτε ςε μια ξεχωριςτό κατηγορύα λϐγω τησ κλινικόσ τουσ εξϋλιξησ που εύναι παρϐμοια με αυτό του κλαςςικοϑ ςεμινϔματοσ. ε αντύθεςη, μελϋτεσ υποςτηρύζουν ϐτι τα ςεμινϔματα με υψηλϐ μιτωτικϐ δεύκτη, μεγαλϑτερο ποςοςτϐ κυττϊρων ςτην S φϊςη, αυξημϋνο μϋςο πυρηνικϐ ϐγκο και ανευπλοειδύα μπορεύ να ϋχουν χειρϐτερη πρϐγνωςη, υψηλϐτερη ςυχνϐτητα μεταςτϊςεων και εύναι μεγαλϑτερου ςταδύου κατϊ την εμφϊνιςό τουσ (Mor Y et al. 1995, Warde P et al. 1997, Fujikawa K et al. 2000, Hori K et al. 1997a, Nativ O et al. 1997, Tickoo SK et al. 2002). Όμωσ, η προγνωςτικό ςημαςύα αυτϔν των χαρακτηριςτικϔν παραμϋνει αμφιλεγϐμενη. εμύνωμα με ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα ε αυτό την περύπτωςη ανευρύςκονται γιγϊντια κϑτταρα του ϐγκου με μορφολογικϊ χαρακτηριςτικϊ ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϔν κυττϊρων (Sehested M & Jacobsen GK 1987). Αυτϊ εύναι ςυνόθωσ πολυπϑρηνα με ϊφθονο, ελαφρϊ βαςεϐφιλο κυτταρϐπλαςμα και μπορεύ να φϋρουν ενδοκυτταροπλαςματικϋσ κρϑπτεσ, αν και κϊποια εμφανύζουν ϋντονα ςυςςωματϔματα πυρόνων, δύκην μοϑρου. Μπορεύ να περιβϊλλονται απϐ αιμορραγικϋσ περιοχϋσ, αν και δεν ςχετύζονται με την παρουςύα κυτταροτροφοβλαςτικϔν κυττϊρων και δεν εμφανύζουν χαρακτηριςτικϊ χοριοκαρκινϔματοσ. Σα κϑτταρα εύναι θετικϊ για την παρουςύα τησ ανθρϔπινησ χοριακόσ γοναδοτροπύνησ, ϊλλων πρωτεώνϔν που ςχετύζονται με την εγκυμοςϑνη και διαφϐρων κυτταροκερατινϔν (Damjanov I et al. 1990). υγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα αναγνωρύζονται περύπου ςτο 7% των ςεμινωμϊτων ενϔ κϑτταρα θετικϊ για την ϋκφραςη τησ ανθρϔπινησ χοριακόσ γοναδοτροπύνησ εμφανύζονται ςτο 25% των ςεμινωμϊτων, μερικϊ απϐ τα οπούα εύναι μονοπϑρηνα (Jacobsen GK et al. 1995, Mostofi FK & Sesterhenn IA 1985). Η παρουςύα των θετικϔν για την β-hcg κυττϊρων 53

54 Ειςαγωγό ςχετύζεται με αυξημϋνα επύπεδα τησ ςτον ορϐ. Τψηλϋσ τιμϋσ β-hcg αντικατοπτρύζουν την παρουςύα ογκϔδουσ νϐςου αλλϊ πιθανϐτερα την παρουςύα χοριοκαρκινϔματοσ (Hori K et al. 1997b, Weissbach L et al. 1999). Σα ςεμινϔματα με παρουςύα ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϔν κυττϊρων ό με αυξημϋνα επύπεδα β-hcg δεν ϋχουν χειρϐτερη πρϐγνωςη ςε ςχϋςη με το κλαςςικϐ ςεμύνωμα παρομούου ϐγκου και ςταδύου (Hori K et al. 1997b, Weissbach L et al. 1999). υχνϊ, ςτα ςεμινϔματα ανευρύςκονται επιπλϋον γιγϊντια κϑτταρα που ςυνόθωσ εύναι μη-νεοπλαςτικϊ γιγϊντια κϑτταρα Langerhans και ςχετύζονται με την παρουςύα φλεγμονϔδουσ αντύδραςησ ςτο ςτρϔμα. Ανοςοώςτοχημικϊ χαρακτηριςτικϊ Η PLAP εμφανύζεται ςτο % των περιπτϔςεων κλαςςικοϑ ςεμινϔματοσ, εντοπύζεται μεμβρανικϊ ό ϋχει κοκκιϔδη περιπυρηνικό εντϐπιςη και εμφανύζεται ϋντονα ςτισ νεκρωτικϋσ περιοχϋσ (Cheville JC et al. 2000, Ulbright TM et al. 1999, Florentine BD et al. 2002). Ο υποδοχϋασ c-kit (CD117) παρουςιϊζει παρϐμοια ςυχνϐτητα ϋκφραςησ και κατανομό χρϔςησ (Leroy X et al. 2002, Tickoo SK et al. 2002). Σο μετατρεπτικϐ ϋνζυμο τησ αγγειοτενςύνησ 1 (CD143) προςομοιϊζει ςε κατανομό με τουσ δϑο παραπϊνω δεύκτεσ, αλλϊ δεν ϋχει παρϐμοια διαγνωςτικό αξύα (Tickoo SK et al. 1999). Αντιθϋτωσ, οι πανκυτταροκερατύνεσ Cam 5.2 και AE1/3 και ο CD30 εμφανύζονται λιγϐτερο ςυχνϊ και ςυνόθωσ ϋχουν εντοπιςμϋνη κατανομό (Cheville JC et al. 2000, Tickoo SK et al. 2002). Διαφορικό διϊγνωςη Σα μορφολογικϊ χαρακτηριςτικϊ ςτα οπούα ςτηρύζεται ο διαχωριςμϐσ μεταξϑ ςεμινϔματοσ και εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ εύναι η παρουςύα ομοιϐμορφου πληθυςμοϑ ςτο ςεμύνωμα ςε αντύθεςη με την πλειομορφύα του κυτταρικοϑ πληθυςμοϑ ςτο εμβρυώκϐ καρκύνωμα. Επιπλϋον, το ςεμύνωμα τυπικϊ ςυνοδεϑεται απϐ λεμφοκυτταρικό διόθηςη ό κοκκιωματϔδη αντύδραςη, χαρακτηριςτικϊ που ανευρύςκονται εξαιρετικϊ ςπϊνια ςτο εμβρυώκϐ καρκύνωμα. Η PLAP και το CD117 παρουςιϊζουν διϊχυτη κατανομό ςτο ςεμύνωμα ενϔ το CD30 και οι πανκυτταροκερατύνεσ προεξϊρχουν ςτο εμβρυώκϐ καρκύνωμα. Ενϔ, ςτη διαφορικό διϊγνωςη μεταξϑ ςεμινϔματοσ και ςπερματοκυτταρικοϑ ςεμινϔματοσ η παρουςύα τησ PLAP παύζει καθοριςτικϐ ρϐλο ςτη διϊγνωςη υπϋρ του πρϔτου. 54

55 Ειςαγωγό Δυςκολύα παρουςιϊζεται ςτην τυποπούηςη ϊλλων ϐγκων πιθανϐτατα λϐγω τησ ςπανιϐτητϊσ τουσ, ϐπωσ: ϐγκοι κυττϊρων Leydig (ειδικϊ αυτϔν με διαυγϋσ/κενοτοπιϔδεσ κυτταρϐπλαςμα), ϐγκοι κυττϊρων Sertoli ςτουσ οπούουσ η ςωληνϔδησ μορφολογύα προςομοιϊζει με τον ςωληνϔδη υπϐτυπο του ςεμινϔματοσ και τϋλοσ η μεταςτατικό νϐςοσ (π.χ. μελϊνωμα). ε ϐλα αυτϊ τα νεοπλϊςματα η απουςύα τησ IGCNU, ο χαρακτηριςτικϐσ ανοςοφαινϐτυποσ του τυπικοϑ ςεμινϔματοσ και τα ανοςοώςτοχημικϊ χαρακτηριςτικϊ των κυττϊρων Leydig, Sertoli ό ενϐσ μεταςτατικοϑ ϐγκου καθορύζουν τη διϊγνωςη. Προγνωςτικού παρϊγοντεσ Σο μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ ςεμινϔματοσ, η παρουςύα νϋκρωςησ, αγγειακόσ προςβολόσ και διόθηςησ του χιτϔνα εύναι παρϊγοντεσ που ςχετύζονται με το κλινικϐ ςτϊδιο κατϊ την εμφϊνιςη τησ νϐςου (Marks LB et al. 1990, Tickoo SK et al. 2002). Αναφορικϊ με τουσ αςθενεύσ ςταδύου Ι, που παρουςιϊζουν υψηλϊ ποςοςτϊ επιβύωςησ, αναδρομικϋσ μελϋτεσ υποςτηρύζουν ωσ ανεξϊρτητουσ προγνωςτικοϑσ δεύκτεσ υποτροπόσ τησ νϐςου το μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου και τη διόθηςη του ορχικοϑ δικτϑου (Jacobsen GK et al. 1995, Warde P et al. 2002). Η επιβύωςη ελεϑθερη υποτροπόσ ςτα 4 ϋτη όταν 94, 82 και 64% για ϐγκουσ <3, 3-6, >6εκ, αντύςτοιχα (von der Maase H et al. 1993). Η αγγειακό ό λεμφαγγειακό προςβολό ϋχει ςυχνϊ ςχετιςθεύ με την υποτροπό τησ νϐςου αλλϊ δεν ϋχει τεκμηριωθεύ ςταθερό ςτατιςτικό ςημαντικϐτητα ενϔ επύςησ η ϋκφραςη των κυτταροκερατινϔν και του CD30 θεωρεύται αμφύβολησ προγνωςτικόσ αξύασ για τουσ ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (Cheville JC et al. 2000, Tickoo SK et al. 2002) ΠΕΡΜΑΣΟΚΤΣΣΑΡΙΚΟ ΕΜΙΝΨΜΑ Ο ϐγκοσ απαρτύζεται απϐ κϑτταρα ποικύλων διαςτϊςεων μεγϋθουσ λεμφοκυττϊρων ϋωσ γιγαντύων κυττϊρων, περύπου 100μm ςε διϊμετρο, με την πλειοψηφύα των κυττϊρων να κυμαύνεται ςε μϋςο μϋγεθοσ. Σο ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα εύναι ςπϊνιο με ςυχνϐτητα που κυμαύνεται μεταξϑ % και δεν αναγνωρύζεται διαφορϊ ςτη φυλετικό κατανομό ςε ςχϋςη με τουσ ϊλλουσ ϐγκουσ των βλαςτικϔν κυττϊρων (Burke AP & Mostofi FK 1993, Jacobsen GK et al. 1984). ε μια μελϋτη με 79 αςθενεύσ κανϋνασ δεν εύχε ιςτορικϐ 55

56 Ειςαγωγό κρυψορχύασ (Burke AP & Mostofi FK 1993). Οι περιςςϐτεροι ϐγκοι εμφανύζονται ςε ηλικιωμϋνουσ αςθενεύσ με μϋςη ηλικύα εμφϊνιςησ τα 52 ϋτη, μπορεύ ϐμωσ να εμφανιςτεύ και ςε αςθενεύσ μεταξϑ ετϔν. Σο ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα εντοπύζεται μϐνο ςτουσ ϐρχεισ και ςυνόθωσ εύναι μονϐπλευρο. Γενικϊ, το κϑριο ςϑμπτωμα εύναι ανϔδυνη διϐγκωςη του ϐρχεοσ ποικύλησ διϊρκειασ ενϔ δεν παρατηροϑνται αυξημϋνα επύπεδα δεικτϔν ςτον ορϐ (Burke AP & Mostofi FK 1993). Σα κϑτταρα του ϐγκου εύναι χαλαρϊ προςκολλημϋνα μεταξϑ τουσ και υποςτηρύζονται απϐ λιγοςτϐ εξωκυττϊριο ςτρϔμα το οπούο μπορεύ να εύναι οιδηματϔδεσ. Ίνεσ κολλαγϐνου μπορεύ να περικλεύουν τμόματα του ϐγκου. πϊνια ανευρύςκονται ςυςςωρευμϋνα λεμφοκϑτταρα και κοκκιωματϔδησ αντύδραςη ςτο ςτρϔμα. Ο ϐγκοσ αποτελεύται κυρύωσ απϐ τρεισ τϑπουσ κυττϊρων (Burke AP & Mostofi FK 1993, Jacobsen GK et al. 1984, Masson P 1946, Mostofi FK & Price EB 1973, Mostofi FK & Sesterhenn IA 1998, Rosai J et al. 1969). Ο κυρύαρχοσ τϑποσ εύναι κυκλικϊ κϑτταρα ποικύλου μεγϋθουσ με ποικύλο ποςϐ ηωςινϐφιλου κυτταροπλϊςματοσ. Ο κυκλικϐσ πυρόνασ ςυχνϊ εμφανύζει ινϔδη ό ςπειροειδό κατανομό χρωματύνησ, παρϐμοια με αυτό που εμφανύζεται ςτα ςπερματοκϑτταρα. Ο δεϑτεροσ τϑποσ αποτελεύται απϐ μικρϊ κϑτταρα με ςκουρϐχρωμο πυρόνα και λιγοςτϐ ηωςινϐφιλο κυτταρϐπλαςμα. Ο τρύτοσ τϑποσ αποτελεύται απϐ μονο- ό ςπανιϐτερα πολυπϑρηνα γιγϊντια κϑτταρα με κυκλικϐ ό ελλειψοειδό πυρόνα. Αυτϊ εμφανύζουν ςυχνϊ ςπειροειδό κατανομό τησ χρωματύνησ. Κϊποιεσ φορϋσ τα κϑτταρα εύναι ςχετικϊ μονϐτονα με κυρύαρχουσ πυρηνύςκουσ (Albores-Saavedra J et al. 1996). Ανϔμαλοι τϑποι μιτϔςεων εμφανύζονται αρκετϊ ςυχνϊ. Αγγειακό, διαφραγματικό διόθηςη ό διόθηςη ςτην επιδιδυμύδα αναγνωρύζεται επύςησ ςυχνϊ. τα γειτονικϊ ςπερματοφϐρα ςωληνϊρια μπορεύ να υπϊρχει ενδοςωληναριακό ανϊπτυξη δύχωσ ϐμωσ να τεκμηριϔνεται IGCNU. Πολλού απϐ τουσ δεύκτεσ που εμφανύζονται ςε ϊλλουσ τϑπουσ ϐγκων ϐρχεων εύναι απϐντεσ ςτο ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα. Η PLAP ανευρύςκεται ςε λύγεσ περιπτϔςεισ, ενϔ η β-hcg, η AFP, η ακτύνη, η δεςμύνη και ο CD30 δεν ανιχνεϑονται. Επύςησ, κϊποιοι ϋχουν ταυτοποιόςει την παρουςύα του υποδοχϋα c-kit ενϔ ϊλλοι ερευνητϋσ δεν μπϐρεςαν να το επιβεβαιϔςουν (Satie AP et al. 2002). Σο περιεχϐμενο του DNA ςτο ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα διαφϋρει απϐ αυτϐ του ςεμινϔματοσ και εύναι διπλοειδϋσ ό υπερδιπλοειδϋσ (Dekker I et al. 1992, Müller J et al. 1987, Rosenberg C et al. 1998, Talerman A et al. 1984). Σα μικρϊ 56

57 Ειςαγωγό κϑτταρα εύναι διπλοειδό ό ςχεδϐν διπλοειδό, τα μεςαύα κϑτταρα ϋχουν διϊμεςεσ τιμϋσ και τα γιγϊντια κϑτταρα ϋχουν 42 χρωμοςϔματα. Απλοειδό κϑτταρα δεν ϋχουν αναφερθεύ. Αυτϊ τα αποτελϋςματα ϋρχονται ςε ςυμφωνύα με την παρατόρηςη ϐτι τα κϑτταρα του ςπερματοκυτταρικοϑ ςεμινϔματοσ ϋχουν χαρακτηριςτικϊ κυττϊρων που υφύςτανται μεύωςη, μια ιδιϐτητα που εύναι χρόςιμη διαγνωςτικϊ (Stoop H et al. 2001). ε ϐλεσ τισ περιπτϔςεισ, η ενύςχυςη του χρωμοςϔματοσ 9 αναγνωρύζεται ωσ ςταθερό χρωμοςωμικό ανωμαλύα (Rosenberg C et al. 1998). Η παρουςύα κοινϔν χρωμοςωμικϔν ανωμαλιϔν και ανοςοώςτοχημικϔν ευρημϊτων ςε αμφύπλευρα ςπερματοκυτταρικϊ ςεμινϔματα προτεύνουν ϐτι το αρχικϐ αύτιο πιθανϐν να υφύςταται κατϊ την ενδομότριο ανϊπτυξη (Stoop H et al. 2001). Αυτϐ ύςωσ εξηγεύ την αυξημϋνη ςυχνϐτητα αμφύπλευρων ςπερματοκυτταρικϔν ςεμινωμϊτων (5%). Μϐνο μια περύπτωςη μεταςτατικοϑ αμιγοϑσ ςπερματοκυτταρικοϑ ςεμινϔματοσ ϋχει αναφερθεύ (Matoska J et al. 1988). περματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα με ςϊρκωμα περματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα με ςϊρκωμα ορύζεται η περύπτωςη ςπερματοκυτταρικοϑ ςεμινϔματοσ με ςυνοδϐ παρουςύα αδιαφοροπούητου ό ςπανιϐτερα διαφοροποιημϋνου ςαρκϔματοσ. Περύπου δϔδεκα ανϊλογεσ περιπτϔςεισ ϋχουν αναφερθεύ και η ηλικύα των αςθενϔν κυμαύνεται μεταξϑ των ετϔν. Δεν ϋχει αναφερθεύ οικογενόσ ςυςχϋτιςη και δεν ϋχουν ταυτοποιηθεύ αιτιολογικού παρϊγοντεσ. Συπικϊ ςτουσ αςθενεύσ εμφανύζεται μια μϊζα που αρχικϊ εξελύςςεται αργϊ η οπούα ξαφνικϊ διογκϔνεται μϋςα ςε μερικοϑσ μόνεσ. Οι μιςού αςθενεύσ εμφανύζουν μεταςτϊςεισ κατϊ τη διϊγνωςη, ενϔ τα επύπεδα τησ AFP του οροϑ και τησ β-hcg εύναι φυςιολογικϊ. Σο ςτοιχεύο του ςπερματοκυτταρικοϑ ςεμινϔματοσ ςυχνϊ εμφανύζει ομϊδεσ ϋντονου πλειομορφιςμοϑ και εύναι ιςτολογικϊ ςυνεχϐμενο με το ςτοιχεύο του ςαρκϔματοσ (Eble JN 1994). Σο ςϊρκωμα μπορεύ να εμφανύζει διϊφορουσ ιςτολογικοϑσ τϑπουσ, ϐπωσ εύναι το ραβδομυοςϊρκωμα, χονδροςϊρκωμα και ϊλλοι (Burke AP & Mostofi FK 1993, Floyd C et al. 1988, Mostofi FK & Price EB 1973, Matoska J et al. 1988). Σο ςϊρκωμα μεθύςταται ςυχνϊ και οι περιςςϐτεροι αςθενεύσ καταλόγουν λϐγω μεταςτατικόσ νϐςου με μϋςο χρϐνο επιβύωςησ το ϋνα ϋτοσ. 57

58 Ειςαγωγό ΕΜΒΡΤΪΚΟ ΚΑΡΚΙΝΨΜΑ Φαρακτηρύζεται απϐ την παρουςύα αδιαφοροπούητων κυττϊρων επιθηλιακόσ μορφολογύασ με ϊφθονο διαυγϋσ ό κοκκιϔδεσ κυτταρϐπλαςμα και εμφανύζει ποικιλύα μορφϔν ανϊπτυξησ. Σο εμβρυώκϐ καρκύνωμα εμφανύζεται τϐςο ωσ μονόρησ μορφό αλλϊ ςυμμετϋχει, επύςησ ωσ ιςτολογικϐσ τϑποσ, ςε μεικτοϑσ ϐγκουσ των ϐρχεων που περιϋχουν περιςςϐτερεσ απϐ μια ιςτολογικϋσ μορφϋσ. Η αμιγόσ μορφό του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ εμφανύζεται ςτο 2-10% των περιπτϔςεων, ενϔ ςυμμετϋχει ωσ ιςτολογικϐσ τϑποσ ςτο 80% των μεικτϔν ϐγκων των ϐρχεων (Mostofi FK et al. 1988). Εμφανύζεται αρχικϊ ςτην εφηβεύα και αποκτϊ τη μϋγιςτη ςυχνϐτητϊ του ςτην ηλικύα των 30 ετϔν, η οπούα εύναι κατϊ 10 ϋτη μικρϐτερη απϐ την ηλικύα που εμφανύζεται η μϋγιςτη ςυχνϐτητα του κλαςςικοϑ ςεμινϔματοσ. Η ςυνόθησ κλινικό εμφϊνιςη τησ νϐςου εύναι η παρουςύα ανϔδυνησ οιδηματϔδουσ μϊζασ. Όμωσ, λϐγω τησ ταχϑτερησ αϑξηςησ ςε ςχϋςη με το ςεμύνωμα εμφανύζεται ςυχνϐτερα με πϐνο ςτουσ ϐρχεισ που μιμεύται ςυςτροφό. υχνϊ αναφϋρεται ιςτορικϐ τραυματιςμοϑ ςτον ϐρχι που δεν ϋχει επαρκϔσ αποδρϊμει. Η μορφολογύα ανϊπτυξησ των κυττϊρων ποικύλλει και εμφανύζεται εύτε ωσ ςυμπαγόσ ςχηματιςμϐσ ό με θηλωματϔδη ό ςυγκυτιακό μορφό, με ό χωρύσ ςτρωματικοϑσ ινωδοαγγειϔδεισ πυρόνεσ, δημιουργϔντασ ςχιςμϋσ ό δομϋσ που προςομοιϊζουν με αδϋνεσ. Σα κϑτταρα εύναι αδιαφοροπούητα με επιθηλιακό μορφολογύα και προςομοιϊζουν ςτα κϑτταρα που ςχηματύζουν την εςωτερικό κυτταρικό μϊζα κατϊ την εμβρυογϋνεςη. Εύναι μεγϊλα πολυγωνικϊ ό ςε μερικϋσ περιπτϔςεισ κυλινδρικϊ με μεγϊλο ανϔμαλο πυρόνα, ο οπούοσ ςυχνϊ εύναι κυψελιδικϐσ ό φυςςαλιδϔδησ με διϊφανη μορφολογύα ό μπορεύ να εύναι υπερχρωματικϐσ. τα κϑτταρα αναγνωρύζονται ϋνασ ό δϑο πυρηνύςκοι και οι πυρηνικϋσ μεμβρϊνεσ εύναι ευδιϊκριτεσ. Σο κυτταρϐπλαςμα εύναι ϊφθονο ςυχνϊ λεπτϐκοκκο, λιγϐτερο ό περιςςϐτερο διϊφανο και μπορεύ να εύναι βαςεϐφιλο ό/και ηωςινϐφιλο. Σα ϐρια των κυττϊρων εύναι δυςδιϊκριτα και τα κϑτταρα ςυχνϊ ςυνωςτύζονται και οι πυρόνεσ τουσ επικαλϑπτονται. Ο μιτωτικϐσ δεύκτησ εύναι αυξημϋνοσ και ςυχνϊ αναγνωρύζονται ανϔμαλεσ μιτϔςεισ. Επύςησ, μπορεύ να εμφανύζονται και ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα που διειςδϑουν μεταξϑ των κυττϊρων του ϐγκου εύτε ωσ μεμονωμϋνα κϑτταρα ό ομϊδεσ κυττϊρων. Σα κϑτταρα ςτην περιφϋρεια ενϐσ ςυμπαγοϑσ ϐγκου μπορεύ να εμφανύζονται αποδομημϋνα ό 58

59 Ειςαγωγό αποπτωτικϊ καταλόγοντασ ςε διφαςικό μορφό που μπορεύ να μιμεύται το χοριοκαρκύνωμα. Σο ςτρϔμα ποικύλλει απϐ ςπϊνιο εντϐσ του ϐγκου ϋωσ πιο ϋντονο ςτην περιφϋρεια του ϐγκου και εύναι ςυνόθωσ ινϔδεσ με ποικύλο βαθμϐ κυτταροβρύθειασ και λεμφοκυτταρικόσ διόθηςησ. πϊνια εντϐσ του ϐγκου αναγνωρύζονται ηωςινϐφιλα ό αναπτϑςςεται κοκκιωματϔδησ αντύδραςη. τον παρακεύμενο ορχικϐ ιςτϐ ςυχνϊ εμφανύζεται ενδοςωληναριακϐ εμβρυικϐ καρκύνωμα που ςυνοδεϑεται απϐ νεκρϔςεισ και μερικϋσ φορϋσ παρουςιϊζει αποτιτανϔςεισ ενϔ ςτον περιβϊλλοντα ιςτϐ εμφανύζεται ςυχνϊ αγγειακό και λεμφαγγειακό διόθηςη. Σο εμβρυώκϐ καρκύνωμα εκφρϊζει ποικύλο αριθμϐ ανοςοώςτοχημικϔν δεικτϔν που αντικατοπτρύζουν την εμβρυώκό ιςτογϋνεςη, αλλϊ οι περιςςϐτεροι δεν εμφανύζουν διαγνωςτικϐ ενδιαφϋρον. Ο CD30 εμφανύζεται ςε πολλϋσ περιπτϔςεισ ϐπωσ και διϊφορεσ κυτταροκερατύνεσ, ενϔ το επιθηλιακϐ μεμβρανικϐ αντιγϐνο (EMA), το καρκινοεμβρυώκϐ αντιγϐνο (CEA) και η βιμεντύνη δεν ανιχνεϑονται ςυχνϊ (Ro JY et al. 1997, Niehans GA et al. 1988). Η PLAP εμφανύζει εςτιακό χρϔςη και εντοπύζεται ςτη μεμβρϊνη ό ςτο κυτταρϐπλαςμα (Manivel JC et al. 1987). Πολλϊ εμβρυικϊ καρκινϔματα εύναι θετικϊ για την παρουςύα του ΣΡ53 ςε ποςοςτϐ ϊνω του 50% των κυττϊρων (Ulbright TM et al. 1994). Η AFP εντοπύζεται ςε διϊςπαρτα κϑτταρα και η β-hcg απαντϊται ςτα ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα που μπορεύ να εύναι παρϐντα ςτον ϐγκο αλλϊ ϐχι ςτα κϑτταρα του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ (Jacobsen GK et al. 1983). Ο ςημαντικϐτεροσ προγνωςτικϐσ δεύκτησ ςτο εμβρυώκϐ καρκύνωμα εύναι το ςτϊδιο του ϐγκου. Η μετϊςταςη του ϐγκου πραγματοποιεύται μϋςω των λεμφαγγεύων αρχικϊ ςτουσ οπιςθοπεριτοναώκοϑσ λεμφαδϋνεσ και ακολοϑθωσ ςτουσ μεςοθωρακικοϑσ. Αιματογενόσ διαςπορϊ ςτουσ πνεϑμονεσ μπορεύ επύςησ να παρουςιαςτεύ. Οι αςθενεύσ με αμιγϋσ εμβρυώκϐ καρκύνωμα και αγγειακό διόθηςη ϋχουν την τϊςη να εμφανύζουν υψηλϐτερο ςτϊδιο τησ νϐςου κατϊ τη διϊγνωςη (Jacobsen GK et al. 1990). Αςθενεύσ υψηλοϑ κινδϑνου, ϐπωσ υποςτηρύζεται απϐ μελϋτεσ, εύναι αυτού που πϊςχουν απϐ αμιγϋσ εμβρυώκϐ καρκύνωμα, μικτοϑσ ϐγκουσ με υπεροχό του εμβρυικοϑ καρκινϔματοσ, εμβρυώκϐ καρκύνωμα χωρύσ ςυμμετοχό τερατϔματοσ και / ό ϐγκουσ με αγγειακό ό λεμφαγγειακό διόθηςη και τοπικϊ προχωρημϋνο ςτϊδιο νϐςου (Mostofi FK & Sesterhenn IA 1985, Moul JW et al. 1994). 59

60 Ειςαγωγό ΟΓΚΟΙ ΣΟΤ ΛΕΚΙΘΙΚΟΤ ΑΚΟΤ Ο ϐγκοσ του λεκιθικοϑ αςκοϑ χαρακτηρύζεται απϐ ποικιλομορφύα και ανακεφαλαιϔνει τη μορφολογύα που ανευρύςκεται ςτο λεκιθικϐ αςκϐ, την αλλαντοϗδα και το εμβρυώκϐ μεςϋγχυμα. Εμφανύζεται ςε δϑο διακριτϋσ ηλικιακϋσ ομϊδεσ, ςτα βρϋφη και τα νεαρϊ αγϐρια και ςτη ςυνϋχεια ςτη μετεφηβικό ηλικύα. Αποτελεύ το ςυχνϐτερο ϐγκο ϐρχεων ςτα παιδιϊ και εμφανύζεται ςε ϐλεσ τισ φυλϋσ (Kaplan GW et al. 1988). Εύναι λιγϐτερο ςυχνϐσ ςτουσ ϋγχρωμουσ και τουσ γηγενεύσ Αμερικανοϑσ και εύναι ςυχνϐτεροσ ςτουσ Αςιϊτεσ ςυγκριτικϊ με τουσ Καυκϊςιουσ (Coovadia YM 1978, Li FP & Fraumeni JF 1972). τουσ ενόλικεσ εμφανύζεται ςυνόθωσ ωσ ςτοιχεύο των μικτϔν ϐγκων ϐρχεων ςε ποςοςτϐ 40% και παρατηρεύται πιο ςυχνϊ ςτουσ Καυκϊςιουσ ςε ςχϋςη με τισ υπϐλοιπεσ φυλϋσ. Η ηλικιακό ςυχνϐτητα εμφϊνιςησ ϐγκου του λεκιθικοϑ αςκοϑ αντιςτοιχεύ ςτην ηλικιακό ςυχνϐτητα εμφϊνιςησ των μικτϔν ϐγκων των ϐρχεων (Talerman A 1980). τα παιδιϊ, η μϋςη ηλικύα εμφϊνιςησ εύναι οι μόνεσ αλλϊ μπορεύ να εμφανιςτεύ και ςτην ηλικύα των 11 ετϔν, ενϔ φαύνεται να εμφανύζεται ςυχνϐτερα ςτον δεξιϐ ϐρχι (Kaplan GW et al. 1988). Σο μεγαλϑτερο ποςοςτϐ εμφανύζει μια αςυμπτωματικό μϊζα, ενϔ ϋνα μικρϐ ποςοςτϐ αςθενϔν αναφϋρει ιςτορικϐ τραϑματοσ ό οξϑ ϊλγοσ ςτον ϐρχι. Σϋλοσ, ϋνα ελϊχιςτο ποςοςτϐ παρουςιϊζει υδροκόλη. Σα επύπεδα τησ α-φετοπρωτεϗνησ εύναι αυξημϋνα ςτο 90% των περιπτϔςεων (Kaplan GW et al. 1988). Ποςοςτϐ 10-20% των παιδιϔν εμφανύζει μεταςτϊςεισ κατϊ τη διϊγνωςη (Kaplan GW et al. 1988). Η λεμφογενόσ επϋκταςη τησ νϐςου εντοπύζεται οπιςθοπεριτοναώκϊ αν και ςτα παιδιϊ εμφανύζεται προδιϊθεςη για αιματογενό διαςπορϊ τησ νϐςου και ςτο 40% των περιπτϔςεων αναπτϑςςονται αποκλειςτικϊ αιματογενεύσ μεταςτϊςεισ (Kaplan GW et al. 1988, Brosman SA 1979). το 20-26% των περιπτϔςεων, η αρχικό θϋςη μετϊςταςησ του ϐγκου εύναι οι πνεϑμονεσ (Kaplan GW et al. 1988, Brosman SA 1979). Ο τϑποσ μετϊςταςησ ςτουσ ενόλικεσ εύναι παρϐμοιοσ με αυτϐν που εμφανύζεται ςτουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Η ιςτολογικό εμφϊνιςη εύναι η ύδια ανεξϊρτητα απϐ την ηλικύα εμφϊνιςησ του ϐγκου (Kaplan GW et al. 1988, Harms D & Jänig U 1986, Talerman A 1980). υνόθωσ ανευρύςκονται διϊφορεσ δομϋσ ποικύλησ μορφολογύασ ςε παρϐμοια ποςοςτϊ, αν και ςυχνϊ μια μορφολογύα μπορεύ να υπερϋχει. Οι ϐγκοι που εμφανύζουν μϐνο μια ιςτολογικό μορφό εύναι ςπϊνιοι (Talerman A 1980). 60

61 Ειςαγωγό Ιςτολογικϋσ μορφϋσ Μικροκυςτικό μορφολογύα Αποτελεύ το ςυχνϐτερο τϑπο ϐγκου λεκιθικοϑ αςκοϑ και χαρακτηρύζεται απϐ την παρουςύα δικτϑου κενοτοπιωδϔν κυττϊρων με μορφό κυψελύδασ. Σα κϑτταρα του ϐγκου εύναι μικρϊ και αποτελοϑνται απϐ κενοτϐπια, τα οπούα μπορεύ να περιϋχουν αςθενϔσ ηωςινϐφιλο περιεχϐμενο. Ο πυρόνασ ποικύλλει ςε μϋγεθοσ, αλλϊ ςυνόθωσ εύναι μικρϐσ και η μιτωτικό δραςτηριϐτητα εύναι ϋντονη. Επύςησ, ςυχνϊ παρατηροϑνται υαλϔδη ςφαιρύδια. Μακροκυςτικό μορφολογύα Φαρακτηρύζεται απϐ την παρουςύα λεπτοτοιχωματικϔν ςυλλογϔν κυττϊρων ποικύλου μεγϋθουσ που μπορεύ να ςυνϋχονται ό να διαχωρύζονται απϐ ϊλλουσ ιςτολογικοϑσ τϑπουσ. υμπαγόσ μορφολογύα Η ςυμπαγόσ μορφό αποτελεύται απϐ οζϔδεισ ςυλλογϋσ ό ςυςςωματϔματα μϋςου μεγϋθουσ πολυγωνικϔν κϑτταρων με διϊφανο κυτταρϐπλαςμα και ϋντονο πυρόνα με αυξημϋνη μιτωτικό δραςτηριϐτητα. υχνϊ, ςτην περιφϋρεια του ϐγκου παρατηρεύται μικροκυςτικό μορφολογύα χαρακτηριςτικϐ που υποβοηθϊ τη διϊκριςη απϐ το ςεμύνωμα και το εμβρυικϐ καρκύνωμα. Μερικϋσ φορϋσ τα κϑτταρα παρουςιϊζουν ϋντονο πλειομορφιςμϐ και παρατηροϑνται γιγϊντια κϑτταρα. Αδενώδησ-κυψελιδικό μορφολογύα Αυτό η μορφό αποτελεύται απϐ ςυλλογϋσ κυττϊρων που ςχηματύζουν ανϔμαλεσ κυψελύδεσ, αδενικοϑ τϑπου ό ςωληνοειδεύσ δομϋσ ενϔ τα κϑτταρα μπορεύ να εύναι επύπεδα, κυβοειδό ό πολυγωνικϊ. Οι δομϋσ αυτϋσ δημιουργοϑν δύκτυο με κοιλϐτητεσ και κανϊλια που μερικϋσ φορϋσ διαχωρύζονται απϐ μυξοιδηματϔδη ιςτϐ. Ενδοδερματικό μορφό Η μορφό αυτό αποτελεύται απϐ δομϋσ που αποτελοϑνται απϐ ϋνα μύςχο ςυνδετικοϑ ιςτοϑ που περιϋχει λεπτϐτοιχο αιμοφϐρο αγγεύο, το οπούο καλϑπτεται απϐ χιτϔνα κυβοειδϔν κυττϊρων με διϊφανο κυτταρϐπλαςμα και ϋντονο πυρόνα. 61

62 Ειςαγωγό Αυτϋσ οι δομϋσ εύναι γνωςτϋσ ωσ Schiller-Duval ςωμϊτια και εύναι χαρακτηριςτικϊ των ϐγκων του λεκιθικοϑ αςκοϑ (Teilum G 1959). Ανευρύςκονται διϊςπαρτα μϋςα ςτον ϐγκο ςε ποικύλο βαθμϐ και παρουςιϊζουν μιτωτικό δραςτηριϐτητα, η οπούα μπορεύ να εύναι ϋντονη. Θηλώδησ μορφολογύα ε αυτό την περύπτωςη παρατηροϑνται πολυϊριθμα θηλϔματα που αποτελοϑνται ςτον πυρόνα τουσ απϐ ςυνδετικϐ ιςτϐ και περιβϊλλονται απϐ κϑτταρα με ϋντονο πυρόνα, τα οπούα εμφανύζουν υψηλό μιτωτικό δραςτηριϐτητα. Ο ςυνδετικϐσ ιςτϐσ μπορεύ να εύναι χαλαρϐσ και οιδηματϔδησ ό ινϔδησ και υαλϔδησ. Μερικϋσ φορϋσ παρατηρεύται εναπϐθεςη υαλϔδουσ υλικοϑ που καταλόγει ςτο ςχηματιςμϐ πιο ςυμπαγοϑσ και ϊμορφου θηλωματϔδουσ δικτϑου. Μυξοειδόσ μορφολογύα Αυτό η μορφό χαρακτηρύζεται απϐ την παρουςύα ςυλλογϔν μυξοειδοϑσ ιςτοϑ που περιϋχει αραιϋσ χορδϋσ, ό αλυςύδεσ ό ςυμπλϋγματα ξεχωριςτϔν κυττϊρων που ϋχουν ϋντονο πυρόνα και μιτωτικό δραςτηριϐτητα. Πολυκυςτικό λεκιθικό μορφολογύα Η μορφό αυτό χαρακτηρύζεται απϐ την παρουςύα ςυμπλεγμϊτων κυςτιδύων ό φυςαλλύδων που ποικύλλουν ςε ςχόμα και μϋγεθοσ και περιβϊλλονται απϐ ςυνδετικϐ ιςτϐ, του οπούου η ςϑςταςη μπορεύ να διαφϋρει απϐ κυτταροβριθό και οιδηματϔδη ςε πυκνό και ινϔδη. Οι κϑςτεισ καλϑπτονται απϐ κυλινδρικϊ ό επύπεδα κϑτταρα, μερικϋσ φορϋσ εύναι μικρϋσ και προςκολλοϑνται μεταξϑ τουσ ενϔ ϊλλεσ ϋχουν ςχόμα κλεψϑδρασ (Teilum G 1959). Ηπατικό μορφολογύα Αποτελεύται απϐ ςυλλογϋσ ηπατοειδϔν κυττϊρων και η εμφϊνιςό τουσ εύναι ςυχνϐτερη ςε μετεφηβικοϑσ ϐγκουσ. Ταλοειδό ςφαιρύδια εμφανύζονται ςυχνϊ (Ulbright TM et al. 1986). Μερικϋσ φορϋσ οι ςυλλογϋσ των κυττϊρων εύναι πολυϊριθμεσ και ςχετικϊ μεγϊλου μεγϋθουσ αν και ςυνόθωσ εύναι μικροϑ μεγϋθουσ. 62

63 Ειςαγωγό Εντερικό μορφολογύα Αποτελεύται απϐ μεμονωμϋνα κϑτταρα ό ςϑμπλεγμα κυττϊρων που ςχηματύζουν ανϔριμουσ αδϋνεσ (Ulbright TM et al. 1986). Οι δομϋσ αυτϋσ προςομοιϊζουν με την αλλαντοϗδα, και τουσ εντερικοϑσ ό τουσ ενδομότριουσ αδϋνεσ. Μοιϊζουν με αδϋνεσ που εμφανύζονται ςτα τερατϔματα, αλλϊ η παρουςύα τουσ ταυτϐχρονα με ϊλλεσ μορφϋσ ϐγκων του λεκιθικοϑ αςκοϑ και η απουςύα μυϔδουσ ςτοιχεύου βοηθϊ ςτο διαχωριςμϐ τουσ. Πολυϊριθμα υαλϔδη ςφαιρύδια μπορεύ να ςυνυπϊρχουν. Διαφορικό διϊγνωςη και πρϐγνωςη Η παρουςύα τησ AFP εύναι υποβοηθητικό για τη διϊγνωςη αν και η απουςύα τησ δεν αποκλεύει την παρουςύα ϐγκου του λεκιθικοϑ αςκοϑ. Οι ϐγκοι του λεκιθικοϑ αςκοϑ εμφανύζουν ϋντονη χρϔςη για τισ κυτταροκερατύνεσ μικροϑ μοριακοϑ βϊρουσ. Άλλεσ πρωτεϗνεσ που ανευρύςκονται ςτο εμβρυώκϐ όπαρ ϐπωσ η α1-αντιθρυψύνη, η αλβουμύνη και η φερριτύνη μπορεύ επύςησ να εντοπύζονται ςε αυτοϑσ τουσ ϐγκουσ. Διϊφορεσ γενετικϋσ ανωμαλύεσ ϋχουν εντοπιςθεύ ςε ϐγκουσ του λεκιθικοϑ αςκοϑ ςε νόπια, ϐπωσ η απϔλεια του βραχϋοσ ςκϋλουσ του χρωμοςϔματοσ 1, του μακροϑ ςκϋλουσ του χρωμοςϔματοσ 6 ό ενύςχυςη του μακροϑ ςκϋλουσ των χρωμοςωμϊτων 1, 20 και ολϐκληρου του χρωμοςϔματοσ 22 (Mostert M et al. 2000, Perlman EJ et al. 2000, van Echten J et al. 2002). Όμωσ δεν ϋχουν ταυτοποιηθεύ γονύδια που να εμπλϋκονται ςτην ανϊπτυξη των ϐγκων του λεκιθικοϑ αςκοϑ ςτα νεογϋννητα και ςτα νόπια. Οι αμιγεύσ ό μικτού ϐγκοι του λεκιθικοϑ αςκοϑ ςτουσ ενόλικεσ εύναι επύςησ ανευπλοειδεύσ και η απϔλεια του 6q φαύνεται ϐτι ςχετύζεται με την ιςτολογύα του ϐγκου (Looijenga LH et al. 2000). Η ηλικύα εμφϊνιςησ του ϐγκου δεν φαύνεται να ϋχει προγνωςτικό ςημαςύα, ενϔ το κλινικϐ ςτϊδιο και τα επύπεδα τησ α-φετοπρωτεϗνησ ϋχουν προγνωςτικό αξύα (Kaplan GW et al. 1988, Ross JH et al. 2002). Η παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων φαύνεται ϐτι αποτελεύ μορφολογικϐ προγνωςτικϐ κριτόριο για τη νϐςο. 63

64 Ειςαγωγό ΦΟΡΙΟΚΑΡΚΙΝΨΜΑ Σο χοριοκαρκύνωμα εύναι κακϐηθεσ νεϐπλαςμα που αποτελεύται απϐ ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ, κυτταροτροφοβλαςτικϊ και ενδιϊμεςα τροφοβλαςτικϊ κϑτταρα. Σο αμιγϋσ χοριοκαρκύνωμα αντιπροςωπεϑει λιγϐτερο απϐ 1% των περιπτϔςεων ϐγκων των ϐρχεων ενϔ ανευρύςκεται ςε ποςοςτϐ 8% ςτουσ μικτοϑσ ϐγκουσ ϐρχεων (Krag Jacobsen G et al. 1984). Οι αςθενεύσ με χοριοκαρκύνωμα εύναι νεαρόσ ηλικύασ μεταξϑ ετϔν. Οι περιςςϐτεροι προςϋρχονται με ςυμπτϔματα που οφεύλονται ςε μεταςτϊςεισ του νεοπλϊςματοσ. Η αιματογενόσ διαςπορϊ τησ νϐςου εξηγεύ τα κϑρια ςυμπτϔματα, ϐπωσ εύναι η αιμϐπτυςη, δϑςπνοια, δυςλειτουργύα του κεντρικοϑ νευρικοϑ, αιματϋμεςη, μϋλαινα, καταβολό και αναιμύα, που οδηγοϑν τον αςθενό για διερεϑνηςη. Η αιμορραγύα ςε πολλαπλϋσ ςπλαχνικϋσ θϋςεισ αντιπροςωπεϑει το χαρακτηριςτικϐ γνϔριςμα του «ςυνδρϐμου του χοριοκαρκινϔματοσ» (Logothetis CJ et al. 1986). Οι αςθενεύσ εμφανύζουν τυπικϊ αυξημϋνα επύπεδα χοριακόσ γοναδοτροπύνησ (ςυνόθωσ >100000miu/ml). Λϐγω διαςταυροϑμενησ αντύδραςησ τησ β-hcg με τη LH και τη TSH παρατηρεύται ςε μικρϐ ποςοςτϐ των αςθενϔν γυναικομαςτύα και υπερθυρεοειδιςμϐσ, αντιςτούχωσ. Η φυςικό εξϋταςη των ϐρχεων μπορεύ να μην αναδεύξει την παρουςύα παθολογικοϑ μορφϔματοσ γιατύ ο πρωτογενόσ ϐγκοσ μπορεύ να εύναι ιδιαύτερα μικροϑ μεγϋθουσ ακϐμη και ςτην περύπτωςη διϊχυτησ μεταςτατικόσ νϐςου. Σο χοριοκαρκύνωμα μεθύςταται τϐςο αιματογενϔσ ϐςο και μϋςω λεμφαγγεύων. Οι οπιςθοπεριτοναώκού λεμφαδϋνεσ ςυχνϊ παρουςιϊζουν διόθηςη απϐ τη νϐςο μολονϐτι ςε μερικοϑσ αςθενεύσ παρατηροϑνται εκτεταμϋνεσ ςπλαχνικϋσ μεταςτϊςεισ χωρύσ να ανευρύςκεται λεμφαδενικό εντϐπιςη. Η διερεϑνηςη των αςθενϔν με χοριοκαρκύνωμα ςε προχωρημϋνο ςτϊδιο αναδεικνϑει μεταςτϊςεισ ςτουσ πνεϑμονεσ (100%), το όπαρ (86%), το γαςτρεντερικϐ ςϑςτημα (71%), το ςπλόνα, τον εγκϋφαλο και τα επινεφρύδια (56%) (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Σο χοριοκαρκύνωμα αποτελεύται απϐ μικτϐ κυτταρικϐ πληθυςμϐ ςε ποικύλα ποςοςτϊ ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϔν, κυτταροτροφοβλαςτικϔν και ενδιϊμεςων τροφοβλαςτικϔν κυττϊρων. Σα κυτταρικϊ ςτοιχεύα διευθετοϑνται ςε διϊφορεσ μορφϋσ, ςυνόθωσ μϋςα ςε αιμορραγικϐ και νεκρωτικϐ υπϐςτρωμα. υνόθωσ εύναι 64

65 Ειςαγωγό κατανεμημϋνα, με λιγϐτερο ό περιςςϐτερο τυχαύο τρϐπο, ςτην περιφϋρεια ενϐσ ϐζου, ο οπούοσ ςτο κϋντρο του παρουςιϊζει αιμορραγύεσ και νεκρϔςεισ. ε κϊποιεσ περιπτϔςεισ, οι οπούεσ περιγρϊφονται ωσ μονοφαςικϋσ, τα ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα εύναι περιοριςμϋνα και κυριαρχοϑν τα κυτταροτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα και τα ενδιϊμεςα τροφοβλαςτικϊ κϑτταρα (Ulbright TM et al. 1997). Διόθηςη των αγγεύων παρατηρεύται ςτην πλεοψηφύα των περιπτϔςεων. Σα ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα εύναι ςυνόθωσ πολυπϑρηνα με ϋντονα ηωςινϐφιλο ό βαςεϐφιλο ό αμφύφιλο κυτταρϐπλαςμα. Έχουν τυπικϊ πολυϊριθμουσ, μεγϊλουσ, ακανϐνιςτουσ και υπερχρωματικοϑσ πυρόνεσ. Σα κυτταροτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα ϋχουν ελαφρϊ χρωματιςμϋνο ό διϊφανο κυτταρϐπλαςμα με ϋνα μοναδικϐ ακανϐνιςτο πυρόνα και ϋναν ό περιςςϐτερουσ πυρηνύςκουσ. Σα ενδιϊμεςα τροφοβλαςτικϊ κϑτταρα ϋχουν ηωςινϐφιλο ό διϊφανο κυτταρϐπλαςμα, μονόρη πυρόνα, εύναι μεγαλϑτερα απϐ τα κυτταροτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα, αλλϊ εύναι δϑςκολο να διακριθοϑν απϐ αυτϊ χωρύσ τη χρόςη ανοςοώςτοχημικϔν δεικτϔν. Οι ςυγκυτιοτροφοβλϊςτεσ εύναι θετικού για την β-hcg, την α-υπομονϊδα τησ inhibin και το EMA (McCluggage WG et al. 1998, Pelkey TJ et al. 1999, Niehans GA et al. 1988). Σα ενδιϊμεςα τροφοβλαςτικϊ κϑτταρα εύναι θετικϊ για την ανθρϔπινη πλακουντιακό λακτϊςη (Manivel JC et al. 1987). Όλοι οι κυτταρικού τϑποι εκφρϊζουν κυτταροκερατύνη ενϔ η PLAP, εμφανύζει εςτιακό εντϐπιςη ςτο 50% των περιπτϔςεων. υνόθωσ, το χοριοκαρκύνωμα μεθύςταται πριν τη διϊγνωςό του, πιθανϐτατα λϐγω τησ ικανϐτητϊσ του να διειςδϑει ςτα αιμοφϐρα αγγεύα. Ωσ επακϐλουθο, η πλειονϐτητα των αςθενϔν διαγιγνϔςκεται ςε προχωρημϋνο κλινικϐ ςτϊδιο, με χειρϐτερη πρϐγνωςη ςε ςχϋςη με τουσ υπϐλοιπουσ τϑπουσ των ϐγκων ϐρχεων. Επιπλϋον, υψηλϊ επύπεδα τησ β-hcg ςχετύζονται με χειρϐτερη πρϐγνωςη αφοϑ πιθανϐτατα ςυνδϋονται με μεγαλϑτερο φορτύο νϐςου (Nikzas D et al. 1990, Aass N et al. 1991, Bosl GJ et al. 1983). Σροφοβλαςτικϊ νεοπλϊςματα εκτϐσ χοριοκαρκινώματοσ Έχουν περιγραφεύ δϑο περιπτϔςεισ τροφοβλαςτικϔν ϐγκων ϐρχεων που δεν διαθϋτουν το διφαςικϐ πρϐτυπο του χοριοκαρκινϔματοσ και που αποτελοϑνται κυρύωσ απϐ κυτταροτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα (μονοφαςικϐ χοριοκαρκύνωμα) ό 65

66 Ειςαγωγό ενδιϊμεςα τροφοβλαςτικϊ κϑτταρα (παρϐμοιο με πλακουντιακοϑ τϑπου τροφοβλαςτικϐ ϐγκο). Η παρακολοϑθηςη των αςθενϔν μετϊ την ορχεκτομό όταν χωρύσ ςυμβϊματα (Ulbright TM et al. 1997). Επιπλϋον, ϋνασ υπϐτυποσ με ευνοώκό πρϐγνωςη γνωςτϐσ ωσ κυςτικϐσ τροφοβλαςτικϐσ ϐγκοσ παρατηρόθηκε ςε οπιςθοπεριτοναώκϋσ μεταςτϊςεισ δεκαοκτϔ αςθενϔν που εύχαν υποβληθεύ ςε χημειοθεραπεύα. Οι βλϊβεσ αποτελοϑνταν απϐ μικρϋσ κϑςτεισ που περιβϊλλονταν απϐ μονοπϑρηνα τροφοβλαςτικϊ κϑτταρα με πλοϑςιο ηωςινοφιλικϐ κυτταρϐπλαςμα (Cheng L et al. 2001) ΣΕΡΑΣΨΜΑ Σο τερϊτωμα εύναι ϐγκοσ που αποτελεύται απϐ διϊφορουσ ιςτοϑσ που προϋρχονται απϐ ϐλεσ τισ εμβρυώκϋσ ςτιβϊδεσ (ενδϐδερμα, μεςϐδερμα, εξϔδερμα). Μπορεύ να αποτελεύται αποκλειςτικϊ απϐ καλϊ διαφοροποιημϋνουσ, ϔριμουσ ιςτοϑσ ό απϐ ανϔριμουσ, εμβρυώκοϑ-τϑπου ιςτοϑσ. Σα τερατϔματα ςτα παιδιϊ και οι δερμοειδεύσ κϑςτεισ εύναι καλοόθεισ ϐγκοι. Οι ϐγκοι που αποτελοϑνται απϐ ςυςτατικϊ μιασ εμβρυώκόσ ςτιβϊδασ χαρακτηρύζονται ωσ μονοδερματικϊ τερατϔματα. Σο τερϊτωμα μπορεύ να περιϋχει και γιγϊντια ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα. Σο τερϊτωμα απαντϊται ςε δϑο ηλικιακϋσ ομϊδεσ. τουσ ενόλικεσ, η ςυχνϐτητα του αμιγοϑσ τερατϔματοσ κυμαύνεται μεταξϑ 2.7-7% και ςε ποςοςτϐ 47-50% αναγνωρύζεται ωσ ςυςτατικϐ των μικτϔν ϐγκων (Friedman NB & Moore RA 1946, Mostofi FK et al. 1987, Barsky SH 1987, von Hochstetter AR et al. 1982). τα παιδιϊ, η ςυχνϐτητα του κυμαύνεται μεταξϑ 24-36% (Brosman SA 1979). Διϊφορεσ ςυγγενεύσ ανωμαλύεσ, κυρύωσ ςτο ουρογεννητικϐ ςϑςτημα, ϋχουν αναφερθεύ ςε αςθενεύσ με τερϊτωμα (Gilman PA 1983, Ulbright TM et al. 1999). τα παιδιϊ, το 65% των τερατωμϊτων εμφανύζονται ςε ηλικύα 1-2 ετϔν. τουσ μετεφηβικοϑσ αςθενεύσ οι περιςςϐτερεσ περιπτϔςεισ εμφανύζονται ςε νεαροϑσ ϊνδρεσ. Η παρουςύα διϐγκωςησ ςτον ϐρχι ό εμφϊνιςη ςυμπτωμϊτων λϐγω των μεταςτϊςεων εύναι τα κϑρια ςυμπτϔματα τησ νϐςου. Περιςταςιακϊ, τα επύπεδα τησ α-φετοπρωτεϗνησ και τησ χοριακόσ γοναδοτροπύνησ μπορεύ να εύναι αυξημϋνα ςτουσ ενόλικεσ (Javadpour N 1986). Οι περιςςϐτεροι αςθενεύσ εμφανύζουν ανϔδυνο μϐρφωμα ϐρχεοσ μαλακόσ υφόσ, ακανϐνιςτησ ό οζϔδουσ μορφολογύασ. Περύπου ςτο 66

67 Ειςαγωγό 2-3% των προεφηβικϔν τερατωμϊτων τύθεται λανθαςμϋνη διϊγνωςη και χαρακτηρύζονται ωσ υδροκόλη ιδιαύτερα αν ο ϐγκοσ περιϋχει κϑςτεισ. τουσ ϐγκουσ αυτοϑσ δεν παρατηρεύται ορμονικό δραςτηριϐτητα οπϐτε δεν ςυνοδεϑονται απϐ πρϔιμη όβη. Σα επύπεδα τησ AFP εύναι υποβοηθητικϊ για τη διαφορικό διϊγνωςη του τερατϔματοσ απϐ τον ϐγκο λεκιθικοϑ αςκοϑ (Rushton HG et al. 1990). Δεν ϋχουν παρατηρηθεύ μεταςτϊςεισ των τερατωμϊτων ςτην προεφηβικό ηλικύα, αντιθϋτωσ οι ύδιοι ϐγκοι ςτη μετεφηβικό ηλικύα εύναι γνωςτϐ ϐτι εμφανύζουν μεταςτϊςεισ (Brosman SA 1979). Σα τερατϔματα εύναι καλϊ περιγεγραμμϋνοι ςϑνθετοι ϐγκοι που αποτελοϑνται κυρύωσ απϐ χϐνδρο, αποτιτανϔςεισ, ινϔδη ιςτϐ, μελαγχρωματικϋσ περιοχϋσ και κϑςτεισ. Οι καλϊ διαφοροποιημϋνοι ϔριμοι ιςτού αποτελοϑνται απϐ κερατινοποιημϋνο ό μη-κερατινοποιημϋνο πλακϔδεσ επιθόλιο, νευρικϐ και αδενικϐ ιςτϐ. χηματιςμϐσ δομόσ πλόρουσ οργϊνου ϐπωσ δϋρμα, αναπνευςτικϐ, γαςτρεντερικϐ και ουρογεννητικϐ ςϑςτημα παρατηρεύται ςυχνϊ ςε τερατϔματα παιδιϔν. Απϐ τα μεςοδερματικϊ ςτοιχεύα το πιο ςυχνϐ εύναι ο μυώκϐσ ιςτϐσ, αν και κϊθε ιςτικϐσ τϑποσ μπορεύ να παρουςιαςθεύ (Damjanov I 1997). Εμβρυώκοϑ τϑπου ιςτού προερχϐμενοι απϐ ϐλεσ τισ εμβρυώκϋσ ςτιβϊδεσ μπορεύ να ςχηματύζουν δομϋσ που μιμοϑνται πρϔιμουσ ιςτοϑσ ϐπωσ των νεφρϔν ό των πνευμϐνων. Εύναι δϑςκολη η διαφορικό διϊγνωςη μεταξϑ εμβρυώκοϑ τϑπου ιςτϔν και τερατωμϊτων με ςωματικοϑ τϑπου κακοόθειεσ. Σο τερϊτωμα μπορεύ να διηθόςει παρακεύμενουσ ιςτοϑσ και αγγεύα εντϐσ και εκτϐσ του ϐρχεοσ. Σα διαφοροποιημϋνα ςτοιχεύα εμφανύζουν φαινϐτυπο ανϊλογα με τον ειδικϐ κυτταρικϐ τϑπο. Α-φετοπρωτεϏνη εκφρϊζεται ςτο 19-36% των τερατωμϊτων με εντερικϋσ και ηπατικϋσ περιοχϋσ (Jacobsen GK et al. 1983, Mostofi FK et al. 1987). Άλλοι δεύκτεσ που ανιχνεϑονται ςτο τερϊτωμα εύναι η α1-αντιθρυψύνη, η φερριτύνη και το CEA (Jacobsen GK et al. 1981). Η β-hcg μπορεύ να εκφρϊζεται απϐ τα ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα ενϔ PLAP ϋχει βρεθεύ ςτουσ αδενικοϑσ ςχηματιςμοϑσ (Mostofi FK et al. 1987, Manivel JC et al. 1987). Σα τερατϔματα ςτα νόπια εύναι διπλοειδό (Kommoss F et al. 1990, Silver SA et al. 1994). Μετϊθεςη μεταξϑ των χρωμοςωμϊτων 12 και 15 ϋχει βρεθεύ ςε οικογϋνεια με προδιϊθεςη ςτην εμφϊνιςη τερατϔματοσ (Veltman I et al. 2002). Αντύθετα με τη διπλοειδύα που εμφανύζεται ςτα τερατϔματα των νεογϋννητων και των νηπύων, τα 67

68 Ειςαγωγό τερατϔματα των ενηλύκων εύναι υποτριπλοειδό (Molenaar WM et al. 1986, Oosterhuis JW et al. 1986, Ro JY et al. 1990). Η ςυμπεριφορϊ των τερατωμϊτων ςτισ δϑο ηλικιακϋσ ομϊδεσ διαφϋρει ςημαντικϊ. την προεφηβικό ηλικύα εύναι καλοόθησ, ενϔ ςτη μετεφηβικό παρουςιϊζει μεταςτϊςεισ ςτο 22-37% των περιπτϔςεων (Rushton HG et al. 1990). το τερϊτωμα παρατηροϑνται ςυνόθωσ ςϑγχρονεσ μεταςτϊςεισ, ενϔ ςτο 13% των περιπτϔςεων εύναι μετϊχρονεσ (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Εϊν εντϐσ του ϐγκου αναγνωρύζεται ουλό, η ςυχνϐτητα των μεταςτϊςεων ανεβαύνει ςτο 66% των περιπτϔςεων. Σο τερϊτωμα μπορεύ να μεθύςταται με τη μορφό του ιςτολογικοϑ τϑπου που διαγιγνϔςκεται ό πρϐδρομα κϑτταρα μπορεύ να διειςδϑςουν ςτα αγγεύα και να διαφοροποιηθοϑν ςτισ θϋςεισ ϐπου εγκαθύςτανται (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004, Foster RS et al. 1996, Jaeger N et al. 1994, Oosterhuis JW et al. 1983, Rabbani F et al. 1996). Η κυτταρικό ςϑςταςη ςτισ θϋςεισ των μεταςτϊςεων μπορεύ να διαφϋρει απϐ αυτό του αρχικοϑ ϐγκου ωσ αποτϋλεςμα διαφοροπούηςησ των αρχϋγονων κυττϊρων (Damjanov I 1997) ΜΙΚΣΟΙ ΟΓΚΟΙ ε αυτό την κατηγορύα περιλαμβϊνονται περιπτϔςεισ ϐγκων που αποτελοϑνται απϐ δϑο ό περιςςϐτερουσ ιςτολογικοϑσ τϑπουσ. Εξαιρϔντασ τουσ ιςτολογικοϑσ τϑπουσ που ϋχουν όδη αναφερθεύ (ςεμύνωμα με ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα και ςπερματοκυτταρικϐ ςεμύνωμα με ςϊρκωμα), η ςυχνϐτητϊ τουσ κυμαύνεται μεταξϑ 32-54% του ςυνϐλου των ϐγκων που προϋρχονται απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα (Mostofi FK et al. 1987). Η ηλικύα εμφϊνιςόσ τουσ εξαρτϊται απϐ την παρουςύα ςεμινϔματοσ. τισ περιπτϔςεισ ϐπου ανευρύςκεται ςεμινωματϔδησ ιςτϐσ, η ηλικύα εμφϊνιςησ κυμαύνεται μεταξϑ τησ ηλικύασ εμφϊνιςησ του ςεμινϔματοσ και αυτόσ ϐπου εμφανύζονται οι αμιγεύσ μηςεμινωματϔδεισ ϐγκοι. τισ περιπτϔςεισ ϐπου δεν αναγνωρύζεται ςεμινωματϔδησ ιςτολογύα, η ηλικύα εμφϊνιςησ εύναι παρϐμοια με αυτό που εμφανύζονται οι μηςεμινωματϔδεισ ϐγκοι. Μικτού ϐγκοι ϐρχεων ςπϊνια παρατηροϑνται ςτην προεφηβικό ηλικύα. Οι αςθενεύσ παρουςιϊζουν επϔδυνη ό ανϔδυνη διϐγκωςη ϐρχεοσ. Η παρουςύα ψηλαφητόσ κοιλιακόσ μϊζασ, γαςτρεντερικϔν ενοχλημϊτων και δϑςπνοιασ μπορεύ να 68

69 Ειςαγωγό υποδηλϔνουν την παρουςύα μεταςτϊςεων, ενϔ ςυχνϊ ανευρύςκονται αυξημϋνα επύπεδα α-φετοπρωτεϗνησ και χοριακόσ γοναδοτροπύνησ ςτον ορϐ των αςθενϔν (Rustin GJ et al. 1990). Οι ϐγκοι αυτού εμφανύζουν τη ςυνόθη πορεύα μετϊςταςησ μϋςω των οπιςθοπεριτοναώκϔν λεμφαδϋνων ςτα ςπλαχνικϊ ϐργανα. τισ περιπτϔςεισ που εμφανύζονται εςτύεσ χοριοκαρκινϔματοσ ό πολλϊ ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα παρουςιϊζεται αυξημϋνη τϊςη μετϊςταςησ ςτο όπαρ ό/και ςτον εγκϋφαλο. τουσ μικτοϑσ ϐγκουσ ϐρχεων παρατηροϑνται διϊφοροι ςυνδυαςμού των ιςτολογικϔν τϑπων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων και η εμφϊνιςό τουσ εύναι ταυτϐςημη με αυτό των αμιγϔν μορφϔν. Κατϊ τη διϊγνωςη πρϋπει να καταγρϊφονται ϐλοι οι ιςτολογικού τϑποι που ςυμμετϋχουν και να εκτιμϊται η αναλογύα του καθενϐσ. Σο εμβρυώκϐ καρκύνωμα και το τερϊτωμα εμφανύζονται ςτο 47%, ϐγκοσ λεκιθικοϑ αςκοϑ ςτο 41%, ενϔ ποικύλοσ αριθμϐσ ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϔν κυττϊρων αναγνωρύζεται ςτο 40% των μικτϔν ϐγκων ϐρχεων (Mostofi FK 1980). Η ιςτολογικό εικϐνα των μεταςτϊςεων εύναι ταυτϐςημη του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου ςτο 88% των περιπτϔςεων. Αναλυτικϐτερα ςτο εμβρυικϐ καρκύνωμα, τερϊτωμα και ϐγκο λεκιθικοϑ αςκοϑ διαπιςτϔνεται αναλογύα ςτον ιςτολογικϐ τϑπο μεταξϑ μετϊςταςησ και αρχικόσ εςτύασ ςε ποςοςτϊ 95%, 90% και 83% αντύςτοιχα (Sesterhenn IA et al. 1992). Οι περιςςϐτεροι ϐγκοι εμφανύζονται θετικού για την παρουςύα τησ AFP ςτα ςτοιχεύα του ϐγκου λεκιθικοϑ αςκοϑ, ςτα ηπατοειδό κϑτταρα και ςτο αδενικϐ ςτοιχεύο των τερατωμϊτων. Αναγνωρύζεται ιςχυρό ςυςχϋτιςη μεταξϑ υψηλϔν επιπϋδων AFP και παρουςύασ ϐγκου λεκιθικοϑ αςκοϑ (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Σα ςυγκυτιοτροφοβλαςτικϊ κϑτταρα, μϐνα ό ςε ςυνδυαςμϐ με χοριοκαρκύνωμα, εύναι θετικϊ για β-hcg και ϊλλεσ πλακουντιακϋσ γλυκοπρωτεϗνεσ. Οι μικτού ϐγκοι ϐρχεων που περιϋχουν ςε μεγϊλη αναλογύα ςεμινωματϔδη ιςτϐ φαύνεται ϐτι ανταποκρύνονται καλϑτερα ςτη θεραπεύα. Η παρουςύα αγγειακόσ / λεμφαγγειακόσ διόθηςησ ςτον πρωτογενό ϐγκο ϋχει προγνωςτικό αξύα για την παρουςύα λεμφαδενικϔν μεταςτϊςεων και υποτροπόσ τησ νϐςου (Freedman LS et al. 1987, Fung CY et al. 1988, Sesterhenn IA et al. 1992). Η παρουςύα και η αναλογύα του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ ϋχει επύςησ προγνωςτικό ςημαςύα ςτην περύπτωςη ςταδύου ΙΙ τησ νϐςου (Freedman LS et al. 1987, Fung CY et al. 1988, Moul JW et al. 1994). Αντιθϋτωσ, η παρουςύα τερατϔματοσ και ϐγκου του λεκιθικοϑ αςκοϑ ςχετύζεται με μικρϐτερη ςυχνϐτητα εμφϊνιςησ μεταςτϊςεων ϋπειτα απϐ ορχεκτομό 69

70 Ειςαγωγό ςε αςθενεύσ ςταδύου Ι (Freedman LS et al. 1987, Fung CY et al. 1988, Moul JW et al. 1994) ΟΓΚΟΙ ΣΟΤ ΣΡΨΜΑΣΟ ΣΨΝ ΓΟΝΑΔΨΝ Όγκοι μποροϑν να αναπτυχθοϑν ςτουσ υποςτηρικτικοϑσ ιςτοϑσ των ϐρχεων, ςτουσ ιςτοϑσ που παρϊγουν ορμϐνεσ ό ςτο ςτρϔμα των ϐρχεων. Αυτού εύναι γνωςτού ωσ ϐγκοι του ςτρϔματοσ των γονϊδων και περιλαμβϊνουν ϐγκουσ που προϋρχονται απϐ τα κϑτταρα Leydig, κϑτταρα Sertoli, κοκκιωματϔδεισ ϐγκουσ και αυτοϑσ που ςυμπεριλαμβϊνονται ςτην κατηγορύα θόκωμα/ύνωμα. Αποτελοϑν περύπου 4-6% των ϐγκων ϐρχεων ςτουσ ενόλικεσ αλλϊ περιςςϐτερο απϐ 30% των αντύςτοιχων ϐγκων ςτα παιδιϊ. Περύπου 10% αυτϔν των ϐγκων, ςχεδϐν πϊντα ςτουσ ενόλικεσ, παρουςιϊζουν μεταςτϊςεισ. Οι δϑο κϑριεσ υποκατηγορύεσ εύναι οι ϐγκοι κυττϊρων Leydig και Sertoli ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΚΤΣΣΑΡΨΝ LEYDIG Οι ϐγκοι των κυττϊρων Leydig αποτελοϑν 1-3% των ϐγκων ϐρχεων (Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004, Ulbright TM et al. 1999). Κατϊ τη βρεφικό και παιδικό ηλικύα ςυνιςτοϑν το 3% των ϐγκων ϐρχεων και 14% των ςτρωματικϔν ϐγκων (Sesterhenn IA et al. 1986). Εμφανύζονται περιςταςιακϊ ςε αςθενεύσ με ςϑνδρομο Klinefelter, ενϔ 5-10% των αςθενϔν με ϐγκουσ απϐ κϑτταρα Leydig ϋχουν ιςτορικϐ κρυψορχύασ (FK & Sesterhenn IA 2004, Ulbright TM et al. 1999, Kim I et al. 1985). Η εμφϊνιςη του ϐγκου εύναι ςυχνϐτερη μεταξϑ δεϑτερησ και ϋκτησ δεκαετύασ ενϔ ςτα παιδιϊ μεταξϑ 3 και 9 ετϔν (Kim I et al. 1985). Η ανϔδυνη διϐγκωςη των ϐρχεων εύναι η πιο ςυχνό κλινικό εκδόλωςη. Γυναικομαςτύα αναγνωρύζεται ςτο 30% των αςθενϔν και διαπιςτϔνονται ςυχνϊ διαταραχϋσ τησ ςτυτικόσ λειτουργύασ και τησ γενετόςιασ ορμόσ (Ulbright TM et al. 1999). τα παιδιϊ παρατηρεύται ςυχνϊ πρϔιμη όβη (Wilson B et al. 1983). Οι περιςςϐτεροι ϐγκοι των κυττϊρων Leydig παρϊγουν ςτεροειδεύσ ορμϐνεσ ϐπωσ τεςτοςτερϐνη, ανδροςτενεδιϐνη και διυδροεπιανδροςτερϐνη (Wilson B et al. 1983). ε μερικϋσ περιπτϔςεισ παρατηρεύται ϊνοδοσ ςτον ορϐ των οιςτρογϐνων και των επιπϋδων οιςτραδιϐλησ που θα οδηγόςουν ςε χαμηλϊ επύπεδα τεςτοςτερϐνησ και FSH (Bercovici JP et al. 1984). Οι περιςςϐτεροι 70

71 Ειςαγωγό ϐγκοι δεν μεθύςτανται εκτϐσ των ϐρχεων και θεραπεϑονται με χειρουργικό εξαύρεςη. Ωςτϐςο, 10% των ϐγκων απϐ κϑτταρα Leydig εύναι κακοόθεισ. Σα κακοόθη χαρακτηριςτικϊ περιλαμβϊνουν το μεγϊλο μϋγεθοσ (>5εκ), κυτταρικό ατυπύα, αυξημϋνη μιτωτικό δραςτηριϐτητα, νϋκρωςη και αγγειακό διόθηςη (Cheville JC et al. 1998, Kim I et al. 1985, McCluggage WG et al. 1998). Η πλειοψηφύα των κακοόθων ϐγκων εύναι ανευπλοειδικού και παρουςιϊζουν αυξημϋνη ΜΙΒ-1 πολλαπλαςιαςτικό δραςτηριϐτητα ςε αντύθεςη με τουσ καλοόθεισ ϐγκουσ κυττϊρων Leydig που εύναι διπλοειδικού με χαμηλϐ δεύκτη πολλαπλαςιαςμοϑ ΜΙΒ-1 (Cheville JC et al. 1998, McCluggage WG et al. 1998). Η θεραπεύα εκλογόσ των κακοόθων ϐγκων απϐ κϑτταρα Leydig περιλαμβϊνει ριζικό ορχεκτομό, οπιςθοπεριτοναώκό λεμφαδενεκτομό και χημειοθεραπεύα. Η πλειοψηφύα των αςθενϔν που αναπτϑςςουν μεταςτϊςεισ ϋχουν πτωχό πρϐγνωςη και καταλόγουν ΟΓΚΟΙ ΣΨΝ ΚΤΣΣΑΡΨΝ SERTOLI Οι ϐγκοι απϐ κϑτταρα Sertoli εύναι ϐγκοι του ςτρϔματοσ των ϐρχεων και αποτελοϑνται απϐ κϑτταρα που εκφρϊζουν ςε ποικύλο βαθμϐ χαρακτηριςτικϊ εμβρυώκϔν, προεφηβικϔν και ενόλικων κυττϊρων Sertoli. Αποτελοϑν λιγϐτερο απϐ 1% των ϐγκων ϐρχεων. Συπικϊ, οι ϐγκοι απϐ κϑτταρα Sertoli εμφανύζονται ςτουσ ενόλικεσ και η μϋςη ηλικύα διϊγνωςησ εύναι τα 45 ϋτη. πϊνια παρατηροϑνται ςε ϊντρεσ κϊτω των 20 ετϔν, με εξαύρεςη ιδιαύτερουσ τϑπουσ ϐγκων που εμφανύζονται ωσ μϋροσ ποικύλων ςυνδρϐμων ςε βρϋφη και παιδιϊ (Young RH et al. 1998). Η πλειοψηφύα των ϐγκων απϐ κϑτταρα Sertoli εύναι ςποραδικού ϐμωσ μερικού ϐγκοι ςχετύζονται με γενετικϊ ςϑνδρομα ϐπωσ το ςϑνδρομο ανδρογονικόσ απευαιςθητοπούηςησ, το ςϑνδρομο Carney και το ςϑνδρομο Peutz-Jeghers (Rutgers JL & Scully RE 1991, Washecka R et al. 2002, Young RH et al. 1998). Κατϊ τη φυςικό εξϋταςη, οι αςθενεύσ εμφανύζουν βραδϋωσ αναπτυςςϐμενη διϐγκωςη ϐρχεοσ. Ορμονοεξαρτϔμενα ςυμπτϔματα δεν εύναι τυπικϊ των ϐγκων απϐ κϑτταρα Sertoli εκτϐσ απϐ τισ περιπτϔςεισ που ο ϐγκοσ αναπτϑςςεται ςτα πλαύςια γενετικϔν ςυνδρϐμων (Young RH et al. 1998). Έχουν ευνοώκό πρϐγνωςη, καθϔσ ςτην πλειοψηφύα τουσ οι ϐγκοι αυτού εύναι καλοόθεισ. τισ ςπϊνιεσ περιπτϔςεισ κακοόθουσ ϐγκου απϐ κϑτταρα Sertoli αναγνωρύζεται παρϐμοιο πρϐτυπο μεταςτατικόσ νϐςου με διαδοχικό προςβολό βουβωνικϔν, οπιςθοπεριτοναώκϔν και 71

72 Ειςαγωγό υπερκλεύδιων λεμφαδϋνων. την περύπτωςη κακοόθειασ, μακροςκοπικϊ οι ϐγκοι εύναι μεγαλϑτερου μεγϋθουσ (ςυνόθωσ >5εκ) και παρουςιϊζουν νεκρωτικϋσ και αιμορραγικϋσ περιοχϋσ (Young RH et al. 1998). Σα κϑτταρα του ϐγκου εύναι ςτρογγυλοποιημϋνα με ευδιϊκριτα κυτταροπλαςματικϊ ϐρια και μεγϊλο πυρόνα, διευθετημϋνα ςε ελϊςματα ό ςε ςωληνύςκουσ. Οι ανοςοώςτοχημικϋσ χρϔςεισ εύναι χρόςιμεσ για την ταυτοπούηςη τησ φϑςησ των κυττϊρων Sertoli, αλλϊ δεν μποροϑν να καθορύςουν το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των κυττϊρων (Henley JD et al. 2002). 4. ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΟ ΦΨΡΟ O εξωκυττϊριοσ χϔροσ απαρτύζεται απϐ το ςϑνολο των βιομορύων, που παρϊγονται και εκκρύνονται απϐ τα κϑτταρα των περιςςοτϋρων ιςτϔν, και ςυνόθωσ παραμϋνουν ςτον περιβϊλλοντα χϔρο τησ πλαςματικόσ μεμβρϊνησ ςχηματύζοντασ ϋνα τριςδιϊςτατο δύκτυο. Ο εξωκυττϊριοσ χϔροσ (ECM), μϋςω των βιολογικϊ δραςτικϔν του μορύων, ϋχει ςημαντικϐ ρϐλο ςτη ρϑθμιςη αρκετϔν κυτταρικϔν γεγονϐτων και φυςιολογικϔν λειτουργιϔν. Σα μακρομϐρια του ECM ςχηματύζουν τριςδιϊςτατο δύκτυο μϋςα ςτο οπούο μποροϑν να πολλαπλαςιϊζονται τϐςο τα φυςιολογικϊ ϐςο και τα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα, ενϔ παρϊλληλα δημιουργοϑν ϋνα φρϊγμα που εμποδύζει τη περαιτϋρω ανϊπτυξη του ϐγκου. Σο ενδιϊμεςο ςτρϔμα και η βαςικό μεμβρϊνη αποτελοϑν τισ δϑο κϑριεσ διαμορφϔςεισ του εξωκυττϊριου χϔρου. Σο ενδιϊμεςο ςτρϔμα, το οπούο απαντϊται κυρύωσ ςε μεςεγχυματικόσ προϋλευςησ ιςτοϑσ, αποτελεύται κυρύωσ απϐ ινϔδη ςυςτατικϊ (κολλαγϐνα τϑπου Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και ελαςτύνη) και πρωτεογλυκϊνεσ, γλυκοζαμινογλυκϊνεσ και γλυκοπρωτεϗνεσ (χόμα 4). Επιπλϋον, περιϋχει αιμοφϐρα αγγεύα και νεϑρα τα οπούα τροφοδοτοϑν και ελϋγχουν τα κϑτταρα των ιςτϔν. Όςον αφορϊ τη βαςικό μεμβρϊνη, αυτό αποτελεύται κυρύωσ απϐ κολλαγϐνο τϑπου IV, λαμινύνη και πρωτεογλυκϊνεσ θειώκόσ ηπαρϊνησ, ενϔ μπορεύ να ςυμμετϋχουν ςτο ςχηματιςμϐ τησ κολλαγϐνα τϑπου V, VII, XVIII και ινοςυνδετύνη. Αποτελεύται απϐ δϑο διακριτϋσ περιοχϋσ ϐπωσ αναγνωρύζονται ςτο ηλεκτρονικϐ μικροςκϐπιο, μια πυκνό περιοχό (lamina densa) και μια διαυγό περιοχό (lamina lucida), η οπούα γειτνιϊζει με τισ πλαςματικϋσ μεμβρϊνεσ των κυττϊρων. ε οριςμϋνεσ περιπτϔςεισ ςυναντϊται και τρύτη δικτυωτό περιοχό (lamina reticularis) που γειτονεϑει με το ενδιϊμεςο ςτρϔμα. 72

73 Ειςαγωγό Η βαςικό μεμβρϊνη ςτηρύζει τα κϑτταρα, και αποτελεύ φραγμϐ για τα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα εμποδύζοντασ την επϋκταςό τουσ ςτον υποκεύμενο ςυνδετικϐ ιςτϐ, την περαιτϋρω εξϊπλωςη και εύςοδϐ τουσ ςτα αγγεύα και τελικϔσ τη δημιουργύα μεταςτϊςεων. Επιπλϋον, ρυθμύζει τον πολλαπλαςιαςμϐ και τη διαφοροπούηςη των κυττϊρων με τα οπούα αλληλεπιδρϊ. χόμα 4. Δομό του εξωκυττϊριου χϔρου και αλληλεπιδρϊςεισ μεταξϑ των μορύων Ο ΡΟΛΟ ΣΟΤ ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΟΤ ΦΨΡΟΤ Ο εξωκυττϊριοσ χϔροσ υπϊρχει για να προςφϋρει ςτόριξη ςτα κϑτταρα και ςτουσ ιςτοϑσ. Η διαμϐρφωςη και η αρχιτεκτονικό των ςυςτατικϔν του, καθϔσ επύςησ ο προςανατολιςμϐσ και το φορτύο τουσ, ρυθμύζει την εκλεκτικό διαπερατϐτητα διαλυτϔν μακρομορύων διαμϋςου αυτοϑ. Επιπροςθϋτωσ, ςυμβϊλλει ςτην προςκϐλληςη των κυττϊρων, ςτον πολλαπλαςιαςμϐ και την ανϊπτυξη, ςτη μορφογϋνεςη και τη διαφοροπούηςη, ϐπωσ επύςησ ςτην κυτταρικό μετανϊςτευςη και τισ βιοχημικϋσ αποκρύςεισ των κυττϊρων. Η αποικοδϐμηςη και η αναδιοργϊνωςη του ECM πραγματοποιεύται τϐςο ςε φυςιολογικϋσ ςυνθόκεσ, πϊντα ϐμωσ μετϊ απϐ κατϊλληλο ερϋθιςμα, ϐςο και ςε παθολογικϋσ καταςτϊςεισ ϐπωσ εύναι οι φλεγμονϋσ, οι εκφυλιςτικϋσ καταςτϊςεισ, η αθηροςκλόρυνςη και η νεοπλαςύα. Για τη διεργαςύα αυτό απαιτεύται η δρϊςη περιςςϐτερων του ενϐσ ενζϑμων που αποικοδομοϑν τον ECM αλλϊ και η παραγωγό νϋων εξωκυττϊριων μακρομορύων απϐ τα κϑτταρα του ςτρϔματοσ (ινοβλϊςτεσ και 73

74 Ειςαγωγό ϊλλα κϑτταρα). Η αναδιοργϊνωςη του ECM ρυθμύζεται αυςτηρϊ με την ϋκκριςη διαφϐρων παραγϐντων απϐ τα κϑτταρα, ϐπωσ εύναι οι αυξητικού παρϊγοντεσ και οι κυτταροκύνεσ, που αςκοϑν τη δρϊςη τουσ ςτα ύδια αυτοκρινϔσ ό ςε γειτονικϊ κϑτταρα παρακρινϔσ. την παραπϊνω διαδικαςύα ςυμμετϋχουν επιπλϋον ςηματοδοτικϊ μϐρια, ϐπωσ εύναι θραϑςματα ακϋραιων μακρομορύων, που απελευθερϔνονται κατϊ την αποικοδϐμηςη του ECM ό νεοςυντιθϋμενα μϐρια που δρουν ςτα κϑτταρα και επϊγουν φαινοτυπικϋσ και λειτουργικϋσ μεταβολϋσ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ Οι πρωτεογλυκϊνεσ (PGs) εύναι μακρομϐρια, τα οπούα αποτελοϑνται απϐ ϋνα πρωτεώνικϐ κορμϐ ςτον οπούο βρύςκονται ομοιοπολικϊ ςυνδεδεμϋνεσ μύα ό περιςςϐτερεσ αλυςύδεσ γλυκοζαμινογλυκανϔν (GAGs) μϋςω του αναγωγικοϑ τουσ ϊκρου. Οι PGs εύναι ευρϋωσ κατανεμημϋνεσ ςε ϐλουσ τουσ ιςτοϑσ και φαύνεται ϐτι ςυντύθενται απϐ ϐλουσ τουσ τϑπουσ των ευκαρυωτικϔν κυττϊρων. Οι PGs εντοπύζονται κυρύωσ ςτον εξωκυττϊριο χϔρο, αλλϊ ϋχει αποδειχθεύ ϐτι εύναι παροϑςεσ ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη ϐπου επιτελοϑν ςτρατηγικοϑσ ρϐλουσ, καθϔσ και ςτον ενδοκυττϊριο χϔρο. Η κατϊταξό τουσ μπορεύ να γύνει εύτε με βϊςη το μϋγεθοσ, εύτε το εύδοσ των GAGs που περιϋχουν ό με βϊςη τον εντοπιςμϐ τουσ. Η κατϊταξό τουσ ςόμερα γύνεται κυρύωσ ςϑμφωνα με τισ ομοιϐτητεσ που εμφανύζουν ςε γενετικϐ επύπεδο, ςτισ περιπτϔςεισ ϐμωσ που αυτϊ τα δεδομϋνα δεν εύναι πλόρη, η κατϊταξη γύνεται ςϑμφωνα με τα κοινϊ δομικϊ χαρακτηριςτικϊ τουσ. Οι PGs ϋχουν ποικύλουσ βιολογικοϑσ ρϐλουσ. υμμετϋχουν με καθοριςτικϐ τρϐπο ςτην οργϊνωςη τησ δομόσ των ιςτϔν, επηρεϊζουν την ανϊπτυξη των κυττϊρων και τη διαφοροπούηςη των ιςτϔν. Δρουν ωσ βιολογικϊ φύλτρα και ρυθμύζουν τη δραςτικϐτητα αυξητικϔν παραγϐντων, ελϋγχουν το ςχηματιςμϐ των ινϔν κολλαγϐνου και ρυθμύζουν τα ιξωδοελαςτικϊ χαρακτηριςτικϊ του ECM. Επύςησ, ςυμβϊλλουν με καθοριςτικϐ τρϐπο ςτην ανϊπτυξη και μετϊςταςη των καρκινικϔν κυττϊρων (Kjellen L & Lidhahl U 1991, Iozzo RV 1998). 74

75 Ειςαγωγό ΔΟΜΗ ΣΨΝ ΓΛΤΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΤΚΑΝΨΝ Οι GAGs εύναι γραμμικϊ μϐρια που αποτελοϑνται απϐ επαναλαμβανϐμενεσ διςακχαριτικϋσ μονϊδεσ. Αυτϋσ αποτελοϑνται απϐ μια εξοζαμύνη (γλυκοζαμύνη ό γαλακτοζαμύνη) γλυκοζιτικϊ ςυνδεδεμϋνη με ϋνα ουρονικϐ οξϑ (D-γλυκουρονικϐ ό L- ιδουρονικϐ) ό με D-γαλακτϐζη. Σα εύδη των GAGs εύναι τα εξόσ: Ταλουρονικϐ οξϑ (HA) Η δομικό μονϊδα του HA εύναι ο διςακχαρύτησ: 4)-β-D-GlcA-(1 3)-β-D- GlcNAc-(1. Σο μϐριο αυτϐ, αντύθετα απϐ τισ υπϐλοιπεσ GAGs δεν περιϋχει εςτεροποιημϋνεσ θειώκϋσ ομϊδεσ και εύναι η μϐνη GAG, η οπούα δεν εύναι ομοιοπολικϊ ςυνδεδεμϋνη με πρωτεϗνη (χόμα 5). Μπορεύ ϐμωσ να αλληλεπιδρϊςει με ειδικϊ τμόματα του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ οριςμϋνων PGs και να ςχηματύςει μεγϊλου μοριακοϑ μεγϋθουσ ςυςςωματϔματα (Carney SL & Muir H 1988). Θειώκό χονδροώτύνη και θειώκό δερματϊνη (CS/DS) Η θειώκό χονδροώτύνη (CS) αποτελεύται απϐ την επαναλαμβανϐμενη διςακχαριτικό μονϊδα: 4)-β-D-GlcA-(1 3)-β-D-GalNAc-(1. Ενδοκυττϊρια, εύναι δυνατϐν μϋςω τησ δρϊςησ τησ C-5 επιμερϊςησ του D-γλυκουρονικοϑ οξϋοσ, ϋνα ποςοςτϐ μορύων του γλυκουρονικοϑ οξϋοσ (D-GlcA) να επιμεριωθοϑν ςε L- ιδουρονικϐ οξϑ (L-IdoA), οπϐτε η GAG αλυςύδα που προκϑπτει ονομϊζεται θειώκό δερματϊνη (DS) (χόμα 5). υνεπϔσ, η DS διαφϋρει απϐ την CS ςτο ϐτι ϋνα ποςοςτϐ των D-GlcA τησ γλυκοζαμινογλυκανικόσ αλυςύδασ ϋχουν επιμεριωθεύ ςε L-IdoA. Οι δϑο αυτϋσ GAGs εύναι ευρϑτερα γνωςτϋσ ωσ γαλακτοζαμινογλυκϊνεσ. Η CS και DS μποροϑν να φϋρουν εςτεροποιημϋνεσ θειώκϋσ ομϊδεσ ςτισ υδροξυλομϊδεσ των θϋςεων C-4 και C-6 ςτην Ν-ακετυλογαλακτοζαμύνη (D-GalNAc) καθϔσ και ςτισ θϋςεισ C-2 και C-3 του γλυκουρονικοϑ οξϋοσ. ε μια περύπτωςη, η DS ϋχει βρεθεύ ϐτι μπορεύ να φϋρει εςτεροποιημϋνη θειώκό ομϊδα και ςτην αμινομϊδα τησ γαλακτοζαμύνησ. Έτςι προκϑπτουν διαφορετικού ςυνδυαςμού διςακχαριτϔν που μπορεύ να εύναι μη θειωμϋνοι, μονοθειωμϋνοι, διθειωμϋνοι ό και τριθειωμϋνοι ςε διϊφορεσ θϋςεισ. 75

76 Ειςαγωγό χόμα 5. Δομό των διςακχαριτικϔν μονϊδων του υαλουρονικοϑ οξϋοσ, τησ θειώκόσ χονδροώτύνησ (I) και τησ θειώκόσ δερματϊνησ (I και ΙΙ). Θειώκό ηπαρϊνη και ηπαρύνη (HS/HP) Οι δομικϋσ μονϊδεσ τησ θειώκόσ ηπαρϊνησ (HS) και ηπαρύνησ (HP) εύναι: 4)-β- D-GlcA-(1 4)-α-D-GlcNAc-(1 και 4)-α-L-IdoA-(1 4)-α-D-GlcNAc-(1. Αυτϋσ απαντϔνται ταυτϐχρονα ςτην ύδια αλυςύδα ςε ποικύλα ποςοςτϊ (χόμα 6). Εςτεροποιημϋνεσ θειώκϋσ ομϊδεσ ςυναντϔνται τϐςο ςτισ θϋςεισ C-6 ςτην Ν- ακετυλογλυκοζαμύνη και ςτην αμινομϊδα τησ γλυκοζαμύνησ, ϐςο και ςτη θϋςη C-2 του ουρονικοϑ οξϋοσ. Οι κϑριεσ διαφορϋσ τησ HS απϐ την HP εύναι οι εξόσ: 1. Η HS αποτελεύται κυρύωσ απϐ D-GlcA, ενϔ η HP εύναι πλοϑςια ςε L-IdoA. 2. την HS το μεγαλϑτερο ποςοςτϐ των αμινομϊδων τησ γλυκοζαμύνησ εύναι ακετυλιωμϋνο, ενϔ ςτην HP εύναι μη ακετυλιωμϋνο και εςτεροποιημϋνο με θειώκό ομϊδα. 3. την HP το μεγαλϑτερο ποςϐ του L-IdoA εύναι εςτεροποιημϋνο ςτην θϋςη C-2 με θειικό ομϊδα. 76

77 Ειςαγωγό 4. Η HS περιϋχει μικρϊ ποςϊ τριθειωμϋνων και διθειωμϋνων διςακχαριτϔν, ενϔ εύναι πλοϑςια ςε μη θειωμϋνουσ διςακχαρύτεσ. Αντύθετα, η HP περιϋχει μεγϊλα ποςϊ τριθειωμϋνων και διθειωμϋνων διςακχαριτϔν, ενϔ εύναι φτωχό ςε μη θειωμϋνουσ διςακχαρύτεσ (Kjellen L & Lidhahl U 1991). χόμα 6. Δομό των διςακχαριτικϔν μονϊδων τησ θειώκόσ ηπαρϊνησ και τησ ηπαρύνησ. Θειώκό κερατϊνη (KS) Η θειώκό κερατϊνη (KS) εύναι η μϐνη GAG που η επαναλαμβανϐμενη διςακχαριτικό μονϊδα τησ: 3)-β-D-Gal-(1 4)-β-D-GlcNAc-(1 δεν περιϋχει ουρονικϐ οξϑ, αλλϊ μια εξϐζη, την D-Gal (χόμα 7). Η KS μπορεύ να περιϋχει εςτεροποιημϋνεσ θειώκϋσ ομϊδεσ ςτην θϋςη C-6 ςτην Ν-ακετυλογλυκοζαμύνη και ςτην θϋςη C-6 ςτην γαλακτϐζη (Kjellen L & Lidhahl U 1991). 77

78 Ειςαγωγό χόμα 7. Δομό τησ διςακχαριτικόσ μονϊδασ τησ θειώκόσ κερατϊνησ ΒΙΟΤΝΘΕΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ Σο πρωτεώνικϐ τμόμα των PGs εύναι προώϐν τησ ϋκφραςησ των γονιδύων που κωδικοποιοϑν αυτϊ τα μϐρια. Αρχικϊ γύνεται η μεταγραφό τησ γενετικόσ πληροφορύασ, που καθορύζει την αλληλουχύα των αμινοξϋων τησ πρωτεϗνησ και οδηγεύ ςτο ςχηματιςμϐ πρϐδρομων μορύων RNA, τα οπούα ςτη ςυνϋχεια μϋςω εξειδικευμϋνων διαδικαςιϔν, μετατρϋπονται ςε ϔριμο mrna. ε μερικϋσ περιπτϔςεισ παρατηρεύται εναλλακτικϐ splicing των εξονύων που κωδικοποιοϑν μια πρωτεϗνη με αποτϋλεςμα την παρϊλειψη κϊποιων εξονύων ςτο τελικϐ mrna τησ πρωτεϗνησ. την περύπτωςη αυτό, το αποτϋλεςμα τησ μετϊφραςησ εύναι η δημιουργύα πρωτεώνϔν απϐ τισ οπούεσ εκλεύπουν κϊποιεσ περιοχϋσ τησ αρχικόσ πρωτεϗνησ. Έχει βρεθεύ ϐτι οριςμϋνεσ PGs αποτελοϑνται απϐ διϊφορεσ ιςομορφϋσ (splice variants / isoforms) οι οπούεσ εκφρϊζονται ειδικϊ ςε ςυγκεκριμϋνουσ ιςτοϑσ. Σο mrna με τη ςυντονιςμϋνη δρϊςη διαφϐρων μεταφραςτικϔν παραγϐντων μεταφρϊζεται ςτα ριβοςϔματα, που βρύςκονται προςκολλημϋνα ςτο ενδοπλαςματικϐ δύκτυο. Οι νεοςυντιθϋμενεσ πρωτεϗνεσ ειςϋρχονται ςτο αδρϐ ενδοπλαςματικϐ δύκτυο, ϐπου υποβϊλλονται ςε διϊφορεσ μετα-μεταφραςτικϋσ τροποποιόςεισ, οι οπούεσ ολοκληρϔνονται ςτο ςϑςτημα Golgi. τη ςυνϋχεια οι PGs εύναι ϋτοιμεσ εύτε για απϋκκριςη ςτον εξωκυττϊριο χϔρο εύτε για εγκατϊςταςη ςτην πλαςματικό μεμβρϊνη ό ακϐμα και για αποθόκευςη ενδοκυττϊρια ςε εκκριτικϊ κοκκύα, ανϊλογα με τον τϑπο τουσ. 78

79 Ειςαγωγό Αρχικϊ, και ενϔ η πρωτεϗνη βρύςκεται ςτο αδρϐ ενδοπλαςματικϐ δύκτυο, αρχύζει η γλυκοζυλύωςό τησ. Οι ολιγοςακχαρύτεσ που ςυνδϋονται με Ν-γλυκοζιτικϐ δεςμϐ με την πρωτεϗνη μϋςω αςπαραγύνησ προςτύθενται ςε αυτό τη φϊςη. Αντύθετα, η ςϑνδεςη των ολιγοςακχαριτϔν που ςυνδϋονται με Ο-γλυκοζιτικϐ δεςμϐ με τον πρωτεώνικϐ κορμϐ πραγματοποιεύται ςτο ςϑςτημα Golgi. αυτϐ πραγματοποιεύται και η βιοςϑνθεςη των GAGs καθϔσ και οι τροποποιόςεισ που ςυμβαύνουν ςε αυτϋσ (επιμόκυνςη αλυςύδασ, θειϔςεισ, ακετυλιϔςεισ και φωςφορυλύωςη) (Carney SL & Muir H 1988). Οι μεμβρανικϋσ PGs δεςμεϑονται ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη ωσ εξόσ: α) ϑνδεςη του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ των PGs με τη γλυκοζυλφωςφατιδυλοώνοςιτϐλη (GPI ςϑνδεςμοσ) και «αγκυροβϐληςη» μϋςω του GPI ςυνδϋςμου ςτη μεμβρϊνη των κυττϊρων. β) ϑνδεςη μϋςω ενϐσ υδρϐφοβου διαμεμβρανικοϑ τμόματοσ του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ τησ PG. ε αυτό την περύπτωςη, ο πρωτεώνικϐσ κορμϐσ αποτελεύται απϐ ϋνα διαμεμβρανικϐ τμόμα που ϋχει μορφό α-ϋλικασ και επιπλϋον εμφανύζει ϋνα ενδοκυττϊριο και ϋνα εξωκυττϊριο τμόμα ςτο οπούο βρύςκονται ςυνδεδεμϋνεσ οι GAGs. γ) Μϋςω ςϑνδεςησ με ειδικϋσ πρωτεϗνεσ (υποδοχεύσ) τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ. δ) Μϋςω ςϑνδεςησ των πλευρικϔν αλυςύδων GAGs ΒΙΟΤΝΘΕΗ ΣΨΝ ΓΛΤΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΤΚΑΝΨΝ Βιοςϑνθεςη των CS/DS και HS/HP Η βιοςϑνθεςη των GAGs (εκτϐσ των HA και KS) αρχύζει με τη ςϑνδεςη ενϐσ μορύου ξυλϐζησ ςε μια ςερύνη του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ. Η ςϑνδεςη πραγματοποιεύται κατϊ τη μεταφορϊ τησ πρωτεϗνησ απϐ το ενδοπλαςματικϐ δύκτυο ςτο ςϑςτημα Golgi ό εντϐσ αυτοϑ και καταλϑεται απϐ ειδικό ξυλοζυλομεταφορϊςη χρηςιμοποιϔντασ ωσ δϐτη το ςακχαρονουκλεοτύδιο UDP-Xyl. Η ςϑνδεςη δεν γύνεται ςε ϐλεσ τισ ςερύνεσ του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ, αλλϊ η μεταφορϊςη δεύχνει εκλεκτικϐτητα ςε ςερύνεσ που βρύςκονται ςε περιοχϋσ τησ πρωτεϗνησ, οι οπούεσ εύναι πλοϑςιεσ ςε γλυκύνη και γλουταμικϐ οξϑ. Ακολοϑθωσ, οι 79

80 Ειςαγωγό ϊλλοι δϑο μονοςακχαρύτεσ τησ περιοχόσ ςϑνδεςησ (2 Gal και 1 GlcA) προςτύθενται, υπϐ τη δρϊςη ϊλλων ενζϑμων, ςτισ μεμβρϊνεσ του ςυςτόματοσ Golgi. Η επιμόκυνςη τησ αλυςύδασ ςυνεχύζεται με την προςθόκη του D-GlcA και τησ εξοζαμύνησ ςτην περιοχό ςϑνδεςησ. Η εςτεροπούηςη των θειώκϔν ομϊδων ςε υδροξυλομϊδεσ ό αμινομϊδεσ τησ εξοζαμύνησ και του ουρονικοϑ οξϋοσ πραγματοποιεύται μϋςω του δϐτου 3 -φωςφοαδενοςινο-5 -φωςφοθειικϐ (PAPS). Η μεταφορϊ θειώκϔν ομϊδων καταλϑεται απϐ θειονυλομεταφορϊςεσ που προςθϋτουν θειώκϋσ ομϊδεσ ςτην αλυςύδα που επιμηκϑνεται. τισ DS, HS και HP το L-IdoA δεν προςτύθεται ςτην αλυςύδα κατευθεύαν απϐ ϋνα δϐτη UDP-ιδουρονικοϑ οξϋοσ, αλλϊ προκϑπτει απϐ τη δρϊςη τησ C-5 επιμερϊςησ του D-GlcA ςτην αλυςύδα που επιμηκϑνεται. Μελϋτεσ ϋχουν δεύξει ϐτι η επιμερεύωςη ςχετύζεται ςτενϊ με τη θεύωςη. Απουςύα θειώκϔν ομϊδων ςτην αλυςύδα τησ γλυκοζαμινογλυκϊνησ δεν ευνοεύ την επιμερεύωςη του D- GlcA ςε L-IdoA. Επύςησ, ςτην αλυςύδα τησ DS φαύνεται ϐτι η επιμερεύωςη του D-GlcA ςυνδϋεται ϊμεςα με την ϑπαρξη εςτεροποιημϋνων θειώκϔν ομϊδων ςτην θϋςη C-4 τησ εξοζαμύνησ των διςακχαριτϔν. την HP αρχικϊ δημιουργεύται το μη θειωμϋνο πολυμερϋσ, ςτη ςυνϋχεια αποακετυλιϔνεται η γλυκοζαμύνη, με τη βοόθεια μιασ Ν- αποακετυλϊςησ, και ακολοϑθωσ η ελεϑθερη αμινομϊδα ςουλφονυλιϔνεται (Kjellen L & Lidhahl U 1991). Η περϊτωςη τησ επιμόκυνςησ τησ αλυςύδασ πιθανϐτατα ςυνδϋεται και ελϋγχεται απϐ το εύδοσ τησ θεύωςόσ τησ κατϊ μόκοσ τησ αναπτυςςϐμενησ αλυςύδασ. Έχει δειχθεύ ϐτι ςυχνϊ οι νεοςυντιθϋμενεσ αλυςύδεσ τερματύζουν με διθειωμϋνη εξοζαμύνη ςτισ θϋςεισ C-4 και C-6, ςε αντύθεςη με την υπϐλοιπη αλυςύδα, ϐπου δεν υπϊρχουν πολλϋσ διθειωμϋνεσ εξοζαμύνεσ. Επύςησ, ϋχει δειχθεύ ϐτι οι αλυςύδεσ που τελειϔνουν με εξοζαμύνη θειωμϋνη ςτην θϋςη C-6 εύναι δυνατϐν να δεχθοϑν ϋνα ουρονικϐ οξϑ, ϐχι ϐμωσ και οι αλυςύδεσ που τελειϔνουν με εξοζαμύνη θειωμϋνη ςτη θϋςη C-4. Πιθανϐν, κϊποια ειδικό θεύωςη ςτην εξοζαμύνη ςτο μη αναγωγικϐ ϊκρο τησ αλυςύδασ να προςφϋρει κϊποιον μηχανιςμϐ τερματιςμοϑ τησ αλυςύδασ (Carney SL & Muir H 1988). 80

81 Ειςαγωγό Βιοςϑνθεςη του ΗΑ Σο ΗΑ ςυντύθεται ςτην εςωτερικό επιφϊνεια τησ πλαςματικόσ μεμβρϊνησ χωρύσ να χρειϊζεται ϋναν πρωτεώνικϐ κορμϐ για να ςυνδεθεύ ςε αυτϐν και ςτη ςυνϋχεια εκκρύνεται απϐ το κϑτταρο. Η ςϑνθεςό του γύνεται με τη βοόθεια του ενζυμικοϑ ςυςτόματοσ των ςυνθαςϔν του ΗΑ, χρηςιμοποιϔντασ ωσ δϐτεσ ςακχϊρων τα αντύςτοιχα UDP-ςϊκχαρα. Η επιμόκυνςη γύνεται, ςε αντύθεςη με τισ ϊλλεσ GAGs, με την προςθόκη ςακχϊρων ςτο αναγωγικϐ ϊκρο του ΗΑ (Prehm P 1984). Βιοςϑνθεςη τησ KS Η KS μπορεύ να ςυνδεθεύ με τον πρωτεώνικϐ κορμϐ με Ο- ό Ν-γλυκοζιτικϐ δεςμϐ. τισ πρωτεογλυκϊνεσ μεγϊλου μοριακοϑ μεγϋθουσ (aggrecan), η KS ςυνδϋεται με τον πρωτεώνικϐ κορμϐ με Ο-γλυκοζιτικϐ δεςμϐ. την περύπτωςη αυτό, η περιοχό ςϑνδεςησ αποτελεύται απϐ ϋνα διακλαδιζϐμενο ολιγοςακχαρύτη που ξεκινϊ απϐ μια GalNAc ςυνδεϐμενη με θρεονύνη ό ςερύνη του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ. Η GalNAc διακλαδύζεται ςτο ϋνα μϋροσ με μια Gal, η οπούα μπορεύ να ςυνδϋεται με ςιαλικϐ οξϑ και ςτο ϊλλο μϋροσ ςυνδϋεται με μια δεϑτερη Gal, η οπούα αποτελεύ το πρϔτο ςϊκχαρο τησ αλυςύδασ τησ KS. H βιοςϑνθεςη τησ Ο-γλυκοζιτικϊ ςυνδεδεμϋνησ KS γύνεται ςτο ςϑςτημα Golgi (Kjellen L & Lidhahl U 1991). H Ν-γλυκοζιτικϊ ςυνδεδεμϋνη KS ςυναντϊται ςτισ μικροϑ μοριακοϑ μεγϋθουσ πρωτεογλυκϊνεσ (fibromodulin, lumican). Αρχικϊ γύνεται η ςϑνθεςη ενϐσ ολιγοςακχαρύτη που ςυνδϋεται με ϋνα λιποειδϋσ, τη φωςφορικό δολιχϐλη. Αυτϐσ μεταφϋρεται ςτη νεοςυντιθϋμενη πρωτεϗνη ϐταν αυτό εύναι ακϐμα ςτο ριβϐςωμα. Κατϐπιν, μϋροσ του ολιγοςακχαρύτη αποικοδομεύται, με τη δρϊςη α-γλυκοζιδαςϔν και αρχύζει η προςθόκη των ςακχϊρων για την επιμόκυνςη τησ αλυςύδασ. Ωσ πηγό τησ γαλακτϐζησ χρηςιμοποιεύται η UDP-Glc, η οπούα επιμερειϔνεται μϋςω τησ δρϊςησ τησ C-4 επιμερϊςησ τησ Glc (Kjellen L & Lidhahl U 1991). 81

82 Ειςαγωγό ΚΑΣΑΣΑΞΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ Οι PGs με βϊςη τον εντοπιςμϐ τουσ κατατϊςςονται ςε εξωκυττϊριεσ, ενδοκυττϊριεσ και PGs τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ. Η κϊθε κατηγορύα διαχωρύζεται ςε υποκατηγορύεσ ανϊλογα με τα κοινϊ δομικϊ χαρακτηριςτικϊ που εμφανύζουν οι PGs ϐςον αφορϊ τον πρωτεώνικϐ κορμϐ τουσ (Schaefer L & Schaefer RM 2010) ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ PGs που αλληλεπιδροϑν με το ΗΑ και προςομοιϊζουν με λεκτύνεσ (hyalectans) Η οικογϋνεια αυτό περιλαμβϊνει τισ PGs versican, aggrecan, neurocan και brevican που ϋχουν την ικανϐτητα να αλληλεπιδροϑν με το ΗΑ ςχηματύζοντασ μεγαλομοριακϊ ςυςςωματϔματα ςτον εξωκυττϊριο χϔρο (Schaefer L & Schaefer RM 2010). Μικροϑ μοριακοϑ μεγϋθουσ PGs πλοϑςιεσ ςε λευκύνη (SLRPs) Η οικογϋνεια αυτό περιλαμβϊνει τουλϊχιςτον 9 μϋλη τα οπούα διαχωρύζονται περαιτϋρω ςε 3 υποκατηγορύεσ με βϊςη την ομολογύα που εμφανύζουν. Η υποκατηγορύα Ι αποτελεύται απϐ τισ PGs: decorin και biglycan, ενϔ η υποκατηγορύα ΙΙ περιλαμβϊνει τισ fibromodulin, lumican, keratocan και PRELP. Σϋλοσ, η υποκατηγορύα ΙΙΙ αποτελεύται απϐ τισ epiphycan και osteoglycin. Οι PGs αυτϋσ ϋχουν μικρϐ μοριακϐ μϋγεθοσ και εύναι πλοϑςιεσ ςε αμινοξϋα λευκύνησ (Schaefer L & Schaefer RM 2010, Schaefer L & Iozzo RV 2008). PGs τησ βαςικόσ μεμβρϊνησ Η οικογϋνεια αυτό περιλαμβϊνει τισ PGs που βρύςκονται ςτισ βαςικϋσ μεμβρϊνεσ και αποτελεύται απϐ τισ perlecan, agrin και κολλαγϐνο ΦVIII (Iozzo RV et al. 2009). 82

83 Ειςαγωγό ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΣΗ ΚΤΣΣΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ SLIPS (Syndecan Like Integral Proteoglycans) Η οικογϋνεια αυτό περιλαμβϊνει τισ syndecans-1, -2, -3,-4. GRIPS (Glypican Related Integral Proteoglycans) ε αυτόν περιλαμβϊνονται οι PGs τησ οικογϋνειασ των glypicans (glypicans-1, - 2, -3, -4, -5, -6). Άλλεσ μεμβρανικϋσ πρωτεογλυκϊνεσ Τπϊρχουν PGs τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ που δεν ανόκουν ςτισ προαναφερθεύςεσ κϑριεσ κατηγορύεσ. Αυτϋσ εύναι οι: betaglycan, CD44 και thrombomodulin (Schaefer L & Schaefer RM 2010) ΕΝΔΟΚΤΣΣΑΡΙΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ την κατηγορύα αυτό ανόκουν PGs με μοναδικϐ χαρακτηριςμϋνο εκπρϐςωπο την serglycin. Η serglycin βρύςκεται κυρύωσ ςτα κοκκύα των ιςτιοκυττϊρων και ϊλλων κυττϊρων του αιμοποιητικοϑ ςυςτόματοσ και ο πρωτεώνικϐσ κορμϐσ τουσ περιϋχει μια περιοχό που χαρακτηρύζεται απϐ την παρουςύα επαναλαμβανϐμενων αμινοξϋων ςερύνησ και γλυκύνησ. ε αυτόν ςυνδϋονται αλυςύδεσ HS/HP/CS/DS, οι οπούεσ αλληλεπιδροϑν με κατιονικϋσ ιςταμύνεσ και πρωτεϗνεσ, ϐπωσ οι πρωτεϊςεσ των ιςτιοκυττϊρων, οι καρβoξυπεπτιδϊςεσ και οι γλυκοζαμινιδϊςεσ. Με αυτϐν τον τρϐπο, τα ϋνζυμα ςυςςωρεϑονται ςτα αποθηκευτικϊ κοκκύα, ϐπου παραμϋνουν αδρανοποιημϋνα, ϋωσ ϐτου εκκριθοϑν μϋςω τησ διαδικαςύασ ϊμυνασ του οργανιςμοϑ ςτουσ ξενιςτϋσ (Kolset SO & Tveit H 2008). 83

84 Ειςαγωγό Πύνακασ 3: Κατϊταξη των PGs ανϊλογα με τον εντοπιςμϐ και τη δομό των πρωτεώνικϔν κορμϔν τουσ και οι κϑριεσ βιολογικϋσ λειτουργύεσ τουσ. Δληνπηζκόο θαη νκάδα PGs Δίδνο PGs Υξωκ/θόο εληνπηζκόο Πξωη/θόο Κνξκόο (kda) Δίδνο θαη αξηζκόο GAGs Κύξηεο Λεηηνπξγίεο Ιδηόηεηεο Δ Ξ Ω Κ Τ Σ Σ Α Ρ Ι Δ Μεγάλες PGs ποσ αλληλ/δρούν με ηο ΖΑ Μικρού μοριακού μεγέθοσς PGs πλούζιες ζε λεσκίνη PGs ηων βαζικών μεμβρανών (ΒΜ) PGs ηεο θπηηαξηθήο κεκβξάλεο S L I P S GRIPS Δλδνθπηηάξηεο PGs Versican Aggrecan Brevican Neurocan Decorin Biglycan Fibromodulin Lumican Keratocan PRELP Epiphycan Osteoglycin Perlecan Agrin col ΧVIII Syndecan 1 Syndecan 2 Syndecan 3 Syndecan 4 Glypican Thromb/dulin CD 44 Betaglycan 5q q26 1q25-q31 19p12 12q23 Xq28 1q32 12q q32 12q21 1p36 1p32.pter 21q22.3 2p q22-q23 1pter-p q12 13q32 20p p13 1p33-p ~220 ~100 ~ / CS/DS ~100 CS/KS 1-3 CS 3-7 CS 1 CS/DS 2 CS/DS 2-3 KS 3-4 KS 3-5 KS 2-3 KS 2-3 CS/DS 2-3 KS 3 HS/CS 3 HS 3 HS CS/HS HS HS HS 1-4 HS 1 CS 1-3 CS/HS CS/HS 1. πζζωκάηωζε κε ην ΗΑ ημωδνειαζηηθόηεηα 2. Ρύζκηζε ηεο κεηαλάζηεπζεο θαη ηνπ θπη/θνύ πνι/κνύ 1. Οξγάλωζε ηωλ ηλώλ θνιιαγόλνπ 2. Γέζκεπζε απμεηηθώλ παξαγόληωλ 3. Ρύζκηζε ζεκαηνδνηηθώλ κνλνπαηηώλ, ηεο θπηηαξηθήο αλάπηπμεο θαη κεηαλάζηεπζεο 1. Οξγάλωζε ηωλ ΒΜ 2. Γέζκεπζε απμ/θώλ παξαγόληωλ ζηηο ΒΜαγγεηνγέλεζε 1. Κπηηαξηθή πξνζθόιιεζε, δηαθνξνπνίεζε θαη πνιιαπιαζηαζκόο 2. Αληηζξνκβωηηθή δξάζε 3. Κπηηαξηθή αλαγλώξηζε θαη πξνζθόιιεζε 4. Γέζκεπζε απμ/θώλ παξαγόληωλ Serglycin 10q CS/DS/HS/HP 1. Απνζήθεπζε κνξίωλ ζηα εθθξηηηθά θνθθία 84

85 Ειςαγωγό ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΣΟΤΡΓΙΚΟΣΗΣΑ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ Οι PGs κατατϊχθηκαν με βϊςη τα κοινϊ δομικϊ χαρακτηριςτικϊ των πρωτεώνικϔν κορμϔν τουσ. Η δομό των πρωτεώνικϔν κορμϔν των PGs ςε ςυνδυαςμϐ με το εύδοσ και τη δομό των GAGs που φϋρουν, εύναι υπεϑθυνεσ για τισ βιολογικϋσ λειτουργύεσ που επιτελοϑν οι PGs ςτουσ ιςτοϑσ. Η δομικό ομοιϐτητα των PGs που ςυχνϊ ςυνοδεϑεται απϐ την παρουςύα παρϐμοιων ό ύδιων GAGs ςε αυτϋσ, ϋχει ωσ αποτϋλεςμα οι PGs που ανόκουν ςτην ύδια κατηγορύα να επιτελοϑν ύδιουσ ό και παραπλόςιουσ βιολογικοϑσ ρϐλουσ (Schaefer L & Schaefer RM 2010) (χόμα 8). Παρακϊτω, θα αναφερθοϑμε ςτισ ςημαντικϐτερεσ οικογϋνειεσ των PGs και θα περιγρϊψουμε τισ δομϋσ των πρωτεώνικϔν κορμϔν τουσ και τισ λειτουργύεσ ςτισ οπούεσ ςυμμετϋχουν. χόμα 8. Κατϊταξη των PGs ςϑμφωνα με τον εντοπιςμϐ τουσ και τισ ειδικϋσ τουσ αλληλεπιδρϊςεισ (Schaefer L & Schaefer RM 2010). 85

86 Ειςαγωγό ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΠΟΤ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΤΝ ΜΕ ΣΟ ΗΑ ΚΑΙ ΠΡΟΟΜΟΙΑΖΟΤΝ ΜΕ ΛΕΚΣΙΝΕ (HYALECTANS) Αυτϋσ οι PGs μοιρϊζονται δομικϋσ και λειτουργικϋσ ομοιϐτητεσ τϐςο ςτο επύπεδο του γονιδιϔματϐσ τουσ ϐςο και ςε πρωτεώνικϐ επύπεδο. Όπωσ προαναφϋρθηκε, η οικογϋνεια αυτό, περιλαμβϊνει 4 διαφορετικϊ γονύδια που κωδικοποιοϑν τισ PGs: versican, aggrecan, neurocan και brevican (χόμα 8). Κοινϐ χαρακτηριςτικϐ, εύναι η ϑπαρξη τριϔν διαφορετικϔν περιοχϔν ςτο μϐριϐ τουσ. το Ν-τελικϐ ϊκρο εμφανύζουν μια ςφαιρικό περιοχό (G1), η οπούα δεςμεϑει το ΗΑ, ενϔ ςτο κϋντρο βρύςκεται η περιοχό, ϐπου κυρύωσ ςυνδϋονται ομοιοπολικϊ οι GAGs. Σϋλοσ, ςτο C-τελικϐ ϊκρο υπϊρχει μια ακϐμη ςφαιρικό περιοχό (G3), η οπούα εμφανύζει δομικϊ μοτύβα που προςομοιϊζουν με λεκτύνεσ. Λϐγω του εναλλακτικοϑ splicing των εξονύων των PGs, καθϔσ και τησ ποικύλησ γλυκοζυλύωςόσ τουσ εύναι δυνατό η δημιουργύα πληθϔρασ μορύων, τα οπούα μποροϑν να αποτελϋςουν μοριακϋσ γϋφυρεσ μεταξϑ τησ κυτταρικόσ επιφϊνειασ και του εξωκυττϊριου χϔρου (Schaefer L & Schaefer RM 2010) VERSICAN Η versican εκκρύνεται απϐ ινοβλϊςτεσ, λεύα μυώκϊ κϑτταρα και απαντϊται ςε διϊφορουσ ιςτοϑσ, ϐπωσ ο νευρικϐσ ιςτϐσ, μερικού τϑποι χϐνδρων, το τούχωμα των αγγεύων καθϔσ και ςτο γαςτρεντερικϐ ςϑςτημα. Η versican εντοπύζεται ςτον ϊνθρωπο ςτο χρωμϐςωμα 5q13.2. Ο πρωτεώνικϐσ κορμϐσ τησ φϋρει ποικύλο αριθμϐ αλυςύδων CS/DS και αποτελεύται απϐ 3 διακριτϋσ περιοχϋσ οι οπούεσ αναγνωρύζονται ςτο ςχόμα 9 (Wight TN 2002; Wight TN & Merrilees MJ 2004; Theocharis AD 2008). Περιοχό Ι: Σο Ν-τελικϐ ϊκρο ςχηματύζει μια ςφαιρικό περιοχό (G1) που αποτελεύται απϐ αλληλουχύα που προςομοιϊζει με ανοςοςφαιρύνη. Αυτό η αλληλουχύα ςυνδϋεται με δϑο ςυνεχϐμενεσ δομϋσ που προςομοιϊζουν με τη ςυζευκτικό πρωτεϗνη. Η περιοχό αυτό εύναι υπεϑθυνη για τη δϋςμευςη του ΗΑ με την versican. 86

87 Ειςαγωγό Περιοχό ΙΙ: Αποτελεύται απϐ δϑο μεγϊλου μεγϋθουσ υποπεριοχϋσ που ονομϊζονται GAG-α και GAG-β και κωδικοποιοϑνται απϐ δϑο εξϐνια με εναλλακτικϐ splicing (Dours-Zimmermann MT & Zimmermann DR 1994). ε αυτϋσ τισ περιοχϋσ αναγνωρύζεται ϋλλειψη αμινοξϋων κυςτεϗνησ, ενϔ αντιθϋτωσ εμφανύζονται περύπου 30 αλληλουχύεσ αμινοξϋων κατϊλληλεσ για ςϑνδεςη με αλυςύδεσ GAGs, καθϔσ και ςϑνδεςη με ολιγοςακχαρύτεσ. Τπϊρχουν τουλϊχιςτον τϋςςερισ πιθανϋσ ιςομορφϋσ τησ versican που προκϑπτουν απϐ εναλλακτικϐ splicing των εξονύων που κωδικοποιοϑν την περιοχό αυτό. Ο ιςϐτυποσ V0, που ϋχει το μεγαλϑτερο μοριακϐ μϋγεθοσ (πρωτεώνικϐσ κορμϐσ 370-kDa), περιϋχει και τισ δϑο υποπεριοχϋσ GAG-α και GAG-β. Ο ιςϐτυποσ V1 (πρωτεώνικϐσ κορμϐσ 240-kDa) περιϋχει μϐνο την υποπεριοχό GAG-β, ενϔ ο ιςϐτυποσ V2 (πρωτεώνικϐσ κορμϐσ 180-kDa) περιϋχει μϐνο την υποπεριοχό GAG-α. Σϋλοσ, ο ιςϐτυποσ V3 δεν περιϋχει καμύα απϐ τισ δϑο υποπεριοχϋσ (χόμα 9). Περιοχό ΙΙΙ: Η περιοχό ΙΙΙ ϋχει ςφαιρικϐ ςχόμα (G3) και περιϋχει μια ςειρϊ ομϐλογων δομϔν που περιλαμβϊνουν δϑο περιοχϋσ που προςομοιϊζουν ςτον επιδερμικϐ αυξητικϐ παρϊγοντα (EGF), μια περιοχό που προςομοιϊζει με C-τϑπου λεκτύνη και μια που ϋχει ομολογύα με τη ρυθμιςτικό πρωτεϗνη του ςυμπληρϔματοσ (CRP). Οι λεκτύνεσ εμπεριϋχουν μια περιοχό που αναγνωρύζει υδατϊνθρακεσ, εξαρτϊται απϐ την παρουςύα ιϐντων αςβεςτύου και εύναι ςε μεγϊλο βαθμϐ διατηρημϋνη μεταξϑ των ειδϔν (Iozzo RV & Murdoch AD 1996). Σο C-τελικϐ ϊκρο εύναι ικανϐ να δεςμεϑςει HS και HP καθϔσ και απλοϑσ υδατϊνθρακεσ, ενϔ η περιοχό τησ λεκτύνησ ςτουσ ανθρϔπουσ μπορεύ να δεςμεϑςει απλϊ ςϊκχαρα, ϐπωσ η φουκϐζη και η ακετυλογλυκοζαμύνη καθϔσ και την πρωτεϗνη tenascin-r (Aspberg A et al. 1995). Η versican εμπλϋκεται ςε διϊφορεσ λειτουργύεσ ϐπωσ εύναι ο κυτταρικϐσ πολλπλαςιαςμϐσ, η προςκϐλληςη και μετανϊςτευςη και η οργϊνωςη του ECM. ε αυτϋσ τισ λειτουργύεσ εμπλϋκονται τϐςο οι GAGs που φϋρει ϐςο και οι ςφαιρικϋσ δομϋσ G1 και G3. Οι GAGs ϐςο και οι ςφαιρικϋσ δομϋσ G1 και G3 αλληλεπιδροϑν με διϊφορα μϐρια ϐπωσ εύναι το ΗΑ, το κολλαγϐνο τϑπου Ι, η tenascin-r, η fibulin-1 / - 2, η fibrillin-1, η fibronectin, οι P-/L-selectin και διϊφορα χημειοτακτικϊ μϐρια. Η versican αλληλεπιδρϊ επύςησ με μϐρια τησ κυτταρικόσ επιφϊνειασ ϐπωσ ο CD44, η 87

88 Ειςαγωγό ιντεγκρύνη β1, ο EGFR, και ο toll-like receptor-2 (Theocharis AD 2008, Ricciardelli C et al. 2009). Θεωρεύται ϐτι η versican μπορεύ να λειτουργόςει ωσ μϐριο γϋφυρα μεταξϑ γλυκοπρωτεώνϔν του εξωκυττϊριου χϔρου και μορύων τησ κυτταρικόσ επιφϊνειασ ςυμμετϋχοντασ ςτην αλληλεπύδραςη του κυττϊρου με το περιβϊλλον του. Επύςησ, λϐγω τησ δϋςμευςησ του ΗΑ ςτην κυτταρικό επιφϊνεια μϋςω του υποδοχϋα CD44 και τησ δημιουργύασ ςυςςωματωμϊτων μεγϊλου μοριακοϑ μεγϋθουσ του ΗΑ με την versican δημιουργεύται ϋνα μεγϊλο υπερμοριακϐ ςϑμπλοκο ςε διϊφορεσ περιοχϋσ τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ. Σϋτοιου τϑπου υπερμοριακϊ ςϑμπλοκα παρατηροϑνται ςτα καρκινικϊ κϑτταρα προςτϊτη και ευνοοϑν την αποκϐλληςό τουσ απϐ τον εξωκυττϊριο χϔρο προϊγοντασ την μετακύνηςό τουσ (Ricciardelli C et al. 2007). Πεξηνρή δέζκεπζεο ηνπ ΗΑ Πεξηνρή ζύλδεζεο ηωλ γιπθνδακηλνγιπθαλώλ α Πεξηνρή ζύλδεζεο ηωλ γιπθνδακηλνγιπθαλώλ β Πεξηνρή πνπ πξνζνκνηάδεη ζηνλ EGF Πεξηνρή πνπ πξνζνκνηάδεη κε ιεθηίλεο Πεξηνρή πνπ πξνζνκνηάδεη ζηελ CRP Αιπζίδεο CS/DS χόμα 9. Δομικϐ μοντϋλο των ιςομορφϔν V 0, V 1, V 2 και V 3 τησ πρωτεογλυκϊνησ versican (Ricciardelli C et al. 2009). Οι ιςομορφϋσ τησ versican εκφρϊζονται διαφορετικϊ απϐ διϊφορουσ τϑπουσ κυττϊρων. Οι ινοβλϊςτεσ, τα χονδροκϑτταρα και τα λεύα μυώκϊ κϑτταρα ςτην αορτό 88

89 Ειςαγωγό και το μυομότριο εκφρϊζουν τισ ιςομορφϋσ V0 και V1. Αντιθϋτωσ, τα κερατινοκϑτταρα εκφρϊζουν μϐνο την ιςομορφό V1. Η ςϑνθεςη τησ versican διεγεύρεται ςε καλλιϋργειεσ λεύων μυώκϔν κυττϊρων παρουςύα του αιμοπεταλιακοϑ αυξητικοϑ παρϊγοντα (PDGF) και του αυξητικοϑ παρϊγοντα μεταςχηματιςμοϑ β (TGF-β). Η διϋγερςη μϋςω PDGF αναςτϋλλεται απϐ την genistein, ϋναν ευρϋωσ φϊςματοσ αναςτολϋα τησ δραςτικϐτητασ των κιναςϔν τυροςύνησ. Η ςϑνθεςη τησ versican διεγεύρεται με τη δρϊςη ενϐσ ό περιςςϐτερων παραγϐντων ϐπωσ εύναι οι EGF, PDGF και TGF-β, οι οπούοι φαύνεται ϐτι εμφανύζουν ςυνεργικό δρϊςη (Theocharis AD 2008, Ricciardelli C et al. 2009). το καρκινικϐ ςτρϔμα διαφϐρων τϑπων καρκύνου ϋχει παρατηρηθεύ ανϔμαλη ϋκφραςη τησ versican, ιδιαύτερα ςε περιοχϋσ πλοϑςιεσ ςε ΗΑ. Αν και κϊποια νεοπλαςματικϊ κϑτταρα ςυνθϋτουν την versican, φαύνεται ϐτι η ςϑνθεςό τησ πραγματοποιεύται κυρύωσ απϐ τα κϑτταρα του ςτρϔματοσ, ιδιαύτερα τουσ ινοβλϊςτεσ, κατϐπιν διϋγερςησ απϐ τα καρκινικϊ κϑτταρα (Theocharis AD 2008, Ricciardelli C et al. 2009, Mauri P et al. 2005). Διϊφοροι αυξητικού παρϊγοντεσ και κυτταροκύνεσ που υπερεκφρϊζονται ςτισ κακοόθειεσ ϐπωσ ο Wnt, EGF, PDGF και TGF-β, ρυθμύζουν την ϋκφραςη τησ versican (Theocharis AD 2008, Ricciardelli C et al. 2009). Επύςησ, ϋχει προταθεύ ϐτι η αυξημϋνη ςϑνθεςό τησ απϐ τα κϑτταρα του ςτρϔματοσ οφεύλεται ςτην υπομεθυλύωςη του επαγωγϋα του γονιδύου τησ (Adany R & Iozzo RV 1990, Isogai Z et al. 1996). Οι κυρύαρχεσ ιςομορφϋσ που εκφρϊζονται ςτουσ καρκινικοϑσ ιςτοϑσ εύναι οι V0 και V1 (Theocharis AD 2008, Ricciardelli C et al. 2009). Αυξημϋνη ϋκφραςη τησ versican παρατηρεύται ςε διϊφορεσ κακοόθειεσ ϐπωσ ϐγκοι εγκεφϊλου, μελανϔματα, οςτεοςαρκϔματα, λεμφϔματα, ϐγκοι γαςτρεντερικοϑ, μαςτοϑ, προςτϊτη, ενδομητρύου, ωοθηκϔν και πνεϑμονα. Σα αυξημϋνα ποςϊ τησ versican ςυςχετύζονται με επανεμφϊνιςη τησ νϐςου, κακό πρϐγνωςη και μειωμϋνη επιβύωςη (Sakko AJ et al. 2001, Ricciardelli C et al. 2002, Nikitovic D et al. 2006, Arslan F et al. 2007, Ricciardelli C et al. 1998, Touab M et al. 2002, Voutilainen K et al. 2003, Theocharis AD 2002, Pirinen R et al. 2005, Leinonen M et al. 2004, Pukkila M et al. 2007, Skandalis SS et al. 2006, Theocharis AD et al. 2003, Suwiwat S et al. 2004, Kodama J et al. 2007a, b). Μελϋτεσ ϋδειξαν ϐτι η αυξημϋνη ϋκφραςό τησ ςχετύζεται με την επϋκταςη του πρωτογενοϑσ ϐγκου, 89

90 Ειςαγωγό αυξημϋνη αγγειογϋνεςη και μετϊςταςη των καρκινικϔν κυττϊρων (Arslan F et al. 2007, Cattaruzza S et al. 2004, Zheng PS et al. 2004, Ricciardelli C et al. 2007, LaPierre DP et al. 2007, Yee AJ et al. 2007, Sakko AJ et al. 2003, Zhang Y et al. 1998, Yang BL et al. 1999). Η versican που εντοπύζεται ςτο ςτρϔμα νεοπλαςιϔν ςυχνϊ χαρακτηρύζεται απϐ ςημαντικϋσ μετα-μεταφραςτικϋσ τροποποιόςεισ ςτη δομό και τον τϑπο των γλυκοζαμινογλυκανικϔν αλυςύδων που περιϋχει, με την 6-θειωμϋνη CS να εύναι η κυρύαρχη GAG ςτη versican ςε κακοόθεισ καταςτϊςεισ (Theocharis AD 2002, Skandalis SS et al. 2006, Theocharis AD et al. 2003). Έχει προταθεύ ϐτι αυτό η GAG που εντοπύζεται επύςησ ςε ανϔριμουσ ιςτοϑσ και ςε περιοχϋσ μϋςω των οπούων μεταναςτεϑουν τα κϑτταρα τησ νευρικόσ ακρολοφύασ, επηρεϊζει διϊφορεσ ςημαντικϋσ αναπτυξιακϋσ λειτουργύεσ ϐπωσ εύναι η κυτταρικό προςκϐλληςη και η μετανϊςτευςη. Διϊφορα πειρϊματα υπερϋκφραςησ τησ versican προτεύνουν ϐτι η ιςομορφό V1 τησ versican διεγεύρει τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ, ενϔ η ιςομορφό V2 τον αναςτϋλλει (Sheng W et al. 2005). Η ιςομορφό V1 πιθανϐν ενιςχϑει τον πολλαπλαςιαςμϐ μϋςω αϑξηςησ των επιπϋδων του υποδοχϋα του EGF και ενεργοπούηςη του ERK που ςυμβαύνει ταυτϐχρονα με την απϔλεια του αναςτολϋα p27 του κυτταρικοϑ κϑκλου. Επύςησ, η ιςομορφό V1 αναςτϋλλει τον κυτταρικϐ θϊνατο και αυξϊνει την αντοχό των κυττϊρων ςτην απϐπτωςη (Sheng W et al. 2005). Διϊφορα τμόματα τησ versican ϐπωσ εύναι οι περιοχϋσ G1 και G3 προϊγουν τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ μϋςω ελϊττωςησ τησ προςκϐλληςησ των κυττϊρων ςτον ECM και τησ παρουςύασ δομϔν που προςομοιϊζουν με τον EGF, αντύςτοιχα (Cattaruzza S et al. 2004, Zheng PS et al. 2004, Yee AJ et al. 2007, Zhang Y et al. 1998, Yang BL et al. 1999). Επιπλϋον, η G3 περιοχό τησ versican, ϐπωσ και η ακϋραιη πρωτεογλυκϊνη αλληλεπιδρϊ με την ιντεγκρύνη β1 και αυξϊνει τη δραςτικϐτητα τησ κινϊςησ τησ εςτιακόσ προςκϐλληςησ (FAK), προςτατεϑοντασ τα κϑτταρα απϐ την απϐπτωςη (Wu Y et al. 2004). Αυτό η περιοχό αυξϊνει επύςησ τη μετανϊςτευςη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων αυξϊνοντασ την ϋκκριςη τησ ινωδονεκτύνησ και του αυξητικοϑ παρϊγοντα του αγγειακοϑ ενδοθηλύου (VEGF) απϐ τα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα (Zheng PS et al. 2004). Έχει δειχθεύ ϐτι η υπερϋκφραςη τησ ιςομορφόσ V3 απϐ τα κϑτταρα του μελανϔματοσ ελαττϔνει τον 90

91 Ειςαγωγό κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ, αλλϊ αυξϊνει τη μετανϊςτευςη και τη μετϊςταςη των κυττϊρων (Miquel-Serra L et al. 2006) ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΣΗ ΒΑΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Οι βαςικϋσ μεμβρϊνεσ εύναι βιοχημικϊ ςϑνθετεσ και ετερογενεύσ δομϋσ που περιϋχουν λαμινύνη, κολλαγϐνο τϑπου IV, nidogen και τουλϊχιςτον ϋνα τϑπο PG. Οι PGs perlecan, agrin και κολλαγϐνο τϑπου ΦVΙΙΙ εύναι δομικϊ ςυςτατικϊ των βαςικϔν μεμβρανϔν των αγγειακϔν και επιθηλιακϔν κυττϊρων ςτα θηλαςτικϊ και φϋρουν ςυνδεδεμϋνεσ ςτον πρωτεώνικϐ κορμϐ τουσ κυρύωσ αλυςύδεσ ΗS (Iozzo RV et al. 2009) (χόμα 10) PERLECAN Σο γονύδιο τησ perlecan εντοπύζεται ςτο βραχϑ ςκϋλοσ του χρωμοςϔματοσ 1 (1p36). Σο μϐριο τησ περιϋχει ςφαιρικϋσ περιοχϋσ που ςυνδϋονται μεταξϑ τουσ με γραμμικϊ τμόματα με αποτϋλεςμα να μοιϊζει με πϋρλεσ περαςμϋνεσ ςε κλωςτό. Οι 3 GAGs που ςυνδϋονται ςτον πρωτεώνικϐ κορμϐ τησ εντοπύζονται ςτο Ν-τελικϐ ϊκρο του μορύου τησ. Η perlecan εμφανύζει ςτο μϐριο τησ διϊφορα δομικϊ μοτύβα που ϋχουν ομολογύα με αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ και πρωτεϗνεσ που εμπλϋκονται ςτον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ, ςτο μεταβολιςμϐ των λιπιδύων, ςτην κυτταρικό προςκϐλληςη και ϊλλεσ λειτουργύεσ (Iozzo RV et al. 2009) (χόμα 10). Η perlecan αποτελεύται απϐ 5 περιοχϋσ (χόμα 10): Περιοχό Ι: Η Ν-τελικό περιοχό τησ περιϋχει 3 SGD (ςερύνη-γλυκύνηαςπαραγινικϐ) τριπεπτύδια που αποτελοϑν τη θϋςη δϋςμευςησ των αλυςύδων τησ HS. Αυτό η περιοχό εύναι πλοϑςια ςε ϐξινα αμινοξϋα που διευκολϑνουν τον πολυμεριςμϐ των αλυςύδων τησ HS. τη ςυνϋχεια τησ περιοχόσ Ι βρύςκουμε μια δομό SEA, η οπούα ονομϊςτηκε ϋτςι απϐ τισ πρωτεϗνεσ ϐπου πρωτοανακαλϑφθηκε (sperm protein-enterokinase-agrin). Αυτό η δομό ϋχει προταθεύ ϐτι ρυθμύζει τη βιοςϑνθεςη των υδατϊνθρακων πϊνω ςτην perlecan. 91

92 Ειςαγωγό Περιοχό ΙΙ: Η περιοχό αυτό περιλαμβϊνει 4 ςυνεχϐμενα τμόματα που εμφανύζουν ομολογύα με την ειδικό δομό του υποδοχϋα των λιποπρωτεώνϔν χαμηλόσ πυκνϐτητασ (LDL) και εύναι υπεϑθυνη για τη δϋςμευςη των LDL (LA δομό). Η δομό αυτό ςυμπεριλαμβϊνει 6 υψηλϊ διατηρημϋνα αμινοξϋα κυςτεϗνησ και ϋνα πενταπεπτύδιο (αςπαραγινικϐ-γλυκύνη-ςερύνη-αςπαραγινικϐ-γλουταμινικϐ), το οπούο εύναι υπεϑθυνο για τη δϋςμευςη των LDL (Iozzo RV et al. 1994). Η ικανϐτητα τησ perlecan να δεςμεϑει LDL εύναι ϊγνωςτησ ςημαςύασ. Ενδεχομϋνωσ, η περιοχό αυτό να υποβοηθϊ την τοποθϋτηςη τησ PG εντϐσ τησ βαςικόσ επιφϊνειασ των επιθηλιακϔν κυττϊρων και να διευκολϑνει τη ςϑνδεςη με τη βαςικό μεμβρϊνη. Περιοχό ΙΙΙ: Αυτό εύναι ομϐλογη με τισ υποδομϋσ IVα και IVβ του βραχϋωσ ϊκρου τησ α1 αλυςύδασ τησ λαμινύνησ-1 και περιϋχει 3 διακριτϋσ ςφαιρικϋσ δομϋσ (Lam B δομϋσ) που ςυνδϋονται με βραχϋα τμόματα πλοϑςια ςε αμινοξϋα κυςτεϗνησ και προςομοιϊζουν με τον EGF (Iozzo RV et al. 2009). Περιοχό ΙV: Η περιοχό αυτό εύναι η μεγαλϑτερη και περιλαμβϊνει 21 επαναλαμβανϐμενεσ δομϋσ που προςομοιϊζουν με τη δομό των ανοςοςφαιρινϔν του ανθρϔπου. Οι επαναλαμβανϐμενεσ υποδομϋσ εύναι παρϐμοιεσ με αυτϋσ που βρύςκονται ςε μϋλη τησ οικογϋνειασ των ανοςοςφαιρινϔν, καθϔσ και με δομϋσ που περιγρϊφονται ςτα μϐρια προςκϐλληςησ (N-CAM) των νευρικϔν κυττϊρων. Η περιοχό αυτό πιθανϐν να εμπλϋκεται ςτο διμεριςμϐ του μορύου ό ςε διαμοριακϋσ αλληλεπιδρϊςεισ. Περιοχό V: Η περιοχό V εμφανύζει ομολογύα με την G-περιοχό του μακροϑ ϊκρου τησ λαμινύνησ-1 και ϋχει 3 διακριτϋσ ςφαιρικϋσ δομϋσ (Lam G δομϋσ) που ςυνδϋονται με αλληλουχύεσ που μοιϊζουν ςτον EGF. Η περιοχό αυτό εύναι υπεϑθυνη για την αυτοοργϊνωςη του μορύου και ύςωσ εύναι ςημαντικό για τη δημιουργύα των βαςικϔν μεμβρανϔν in vivo (Yurchenko PD et al. 1987). Η perlecan ςυμμετϋχει ςτην κυτταρικό διαφοροπούηςη και τη μορφογϋνεςη των ιςτϔν ϋχοντασ ςημαντικϐ ρϐλο κατϊ την εμβρυογϋνεςη (Iozzo RV et al. 2009). Η ϋκφραςη τησ perlecan ςυνδϋεται ϊμεςα με την ωρύμανςη των ιςτϔν και ανιχνεϑεται πϊντοτε ςτη βαςικό μεμβρϊνη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων. Η perlecan, ϐπωσ και οι υπϐλοιπεσ PGs τησ βαςικόσ μεμβρϊνησ εμφανύζει διττϐ ρϐλο προϊγοντασ αλλϊ και αναςτϋλλοντασ την αγγειογϋνεςη. Εύναι γνωςτϐ ϐτι 92

93 Ειςαγωγό αλληλεπιδρϊ με διϊφορουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ που δεςμεϑονται ςτη HS ϐπωσ εύναι οι βαςικϐσ αυξητικϐσ παρϊγοντασ των ινοβλαςτϔν (bfgf), VEGF και ο PDGF (Iozzo RV et al. 2009). τη ςυνϋχεια, μπορεύ να προϊγει την αγγειογϋνεςη και την πρϐοδο του ϐγκου αφοϑ ςυγκεντρϔνει και προςτατεϑει τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ απϐ την αποικοδϐμηςη. Επιπλϋον, το ςϑμπλοκο τησ perlecan και των αυξητικϔν παραγϐντων παρουςιϊζεται καλϑτερα ςτουσ υποδοχεύσ τουσ διεγεύροντασ περιςςϐτερο τα ςηματοδοτικϊ μονοπϊτια τουσ (Zhou Z et al. 2004, Sharma B et al. 1998, Kadenhe-Chiweshe A et al. 2008, Reiland J et al. 2004, Whitelock JM et al. 1996). χόμα 10. Δομικϊ χαρακτηριςτικϊ τησ perlecan, agrin και του κολλαγϐνου τϑπου XVIII (Iozzo RV et al. 2009). 93

94 Ειςαγωγό Αντιθϋτωσ, ϐλεσ οι PGs τησ βαςικόσ μεμβρϊνησ περιϋχουν ςτο C-τελικϐ ϊκρο τουσ πρωτεώνικϊ τμόματα με ιςχυρό αντι-αγγειογενετικό δρϊςη (Bix G et al. 2006, Iozzo RV et al. 2009). Αυτϊ απελευθερϔνονται ϋπειτα απϐ πρωτεϐλυςη του ακϋραιου μορύου με τη δρϊςη διαφϐρων πρωτεαςϔν ϐπωσ εύναι οι εξωκυττϊριεσ μεταλλοπρωτεϊςεσ (MMPs), η καθεψύνη L, η ελαςτϊςη, η BMP1 και η νευροτρυψύνη (Gonzalez EM et al. 2005, Iozzo RV et al. 2009). Αυτϊ τα πρωτεώνικϊ θραϑςματα μποροϑν να δρϊςουν παρακρινϔσ ςτα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα και να αναςτεύλουν τη μετανϊςτευςό τουσ και τη δημιουργύα νϋων αγγεύων (Bix G et al. 2004, Nyström A et al. 2009) ΜΙΚΡΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ ΠΛΟΤΙΕ Ε ΛΕΤΚΙΝΗ (SLRPs) Η οικογϋνεια των μικρϔν PGs που εύναι πλοϑςιεσ ςε λευκύνη περιλαμβϊνει τουλϊχιςτον 9 διαφορετικϊ μϐρια που κωδικοποιοϑνται απϐ ξεχωριςτϊ γονύδια. Αυτϋσ αναφϋρονταν ωσ μη-ςυζεϑξιμεσ (non aggregable) ό μικρϋσ CS/DSPGs λϐγω τησ μη-δημιουργύασ ςυςςωματωμϊτων με το ΗΑ ό λϐγω του τϑπου των GAGs που φϋρουν αντύςτοιχα (Schaefer L & Schaefer RM 2010, Schaefer L & Iozzo RV 2008) (χόμα 8). Γενικϊ δομικϊ χαρακτηριςτικϊ τηριζϐμενοι ςτη δομό των πρωτεώνικϔν κορμϔν τουσ και ςτην οργϊνωςη των γονιδύων τουσ, 3 υποοικογϋνειεσ των SLRPs μποροϑν να αναγνωριςτοϑν. Η υποοικογϋνεια Ι αποτελεύται απϐ την decorin και biglycan οι οπούεσ εμφανύζουν υψηλϐτατη ομολογύα (57 %) (χόμα 11). Η υποοικογϋνεια ΙΙ περιλαμβϊνει τισ fibromodulin, lumican, keratocan, PRELP και osteoadherin. Η υποοικογϋνεια ΙΙ διαχωρύζεται επιπλϋον ςε δϑο υποκατηγορύεσ. Η fibromodulin και η lumican αποτελοϑν την πρϔτη και εμφανύζουν (48 %) ομολογύα, ενϔ οι keratocan και PRELP αποτελοϑν τη δεϑτερη και εμφανύζουν (55 %) ομολογύα. Η PRELP ςτουσ περιςςϐτερουσ ιςτοϑσ εμφανύζεται ωσ γλυκοπρωτεϗνη. Η osteoadherin εύναι υποκατεςτημϋνη με KS και περιϋχει θειωμϋνη τυροςύνη ςτο Ν-τελικϐ ϊκρο τησ. Η υποοικογϋνεια ΙΙΙ αποτελεύται απϐ τισ epiphycan και osteoglycin. Η epiphycan πόρε 94

95 Ειςαγωγό το ϐνομα τησ, λϐγω τησ εκλεκτικόσ ϋκφραςόσ τησ ςτο χϐνδρο τησ επύφυςησ (Schaefer L & Schaefer RM 2010, Schaefer L & Iozzo RV 2008) DECORIN τη θεωροϑμενη ωσ πρϐτυπη SLRP, την decorin, 4 περιοχϋσ μποροϑν να αναγνωριςτοϑν. Η περιοχό Ι, η οπούα περιϋχει το πεπτύδιο ςόμα και ϋνα προπεπτύδιο. Εύναι ενδιαφϋρον ϐτι μϐνο οι decorin και biglycan περιϋχουν προπεπτύδιο (Fisher LW et al. 1989). Δεν εύναι γνωςτό η λειτουργύα του προπεπτιδύου αφοϑ το πεπτιδικϐ ςόμα ςηματοδοτεύ το νεοςυντιθϋμενο πρωτεώνικϐ κορμϐ ςτο αδρϐ ενδοπλαςματικϐ δύκτυο. Αυτό η αλληλουχύα εύναι υψηλϊ διατηρημϋνη μεταξϑ των ειδϔν και το προπεπτύδιο εύναι πιθανϐν να δρα ωσ ςόμα αναγνϔριςησ για το πρϔτο ϋνζυμο, την ξυλοςυλμεταφορϊςη, που εμπλϋκεται ςτη βιοςϑνθεςη των GAGs (Sawhney RS et al. 1991). Η περιοχό ΙΙ περιϋχει 4 αμινοξϋα κυςτεϗνησ και τη θϋςη δϋςμευςησ των GAGs. την περιοχό ΙΙΙ περιϋχονται αλληλουχύεσ πλοϑςιεσ ςε λευκύνη, ενϔ ςτην περιοχό ΙV ςτο C-τελικϐ ϊκρο αποτελεύται απϐ περύπου 50 αμινοξϋα με αξιϐλογη ομολογύα μεταξϑ των SLRPs. Η δημιουργύα διςουλφιδικοϑ δεςμοϑ ςε αυτό την περιοχό μεταξϑ δϑο αμινοξϋων κυςτεϗνησ ςχηματύζει ϋνα βρϐγχο 34 περύπου αμινοξϋων ςτο C-τελικϐ ϊκρο των SLRPs (Neame PJ et al. 1989) (χόμα 11). Εύναι αξιοςημεύωτο ϐτι αναγωγό και αλκυλύωςη τησ decorin και τησ lumican οδηγεύ ςε απϔλεια τησ ικανϐτητϊσ τουσ να αλληλεπιδρϊςουν με το κολλαγϐνο (Rada JA et al. 1993). Έτςι, ο διςουλφιδικϐσ δεςμϐσ ςε αυτό την περιοχό πιθανϐν να εύναι κρύςιμοσ για την ικανϐτητα των SLRPs να ρυθμύζουν τη δημιουργύα των ινιδύων του κολλαγϐνου. Ρϑθμιςη του ςχηματιςμοϑ των ινιδύων του κολλαγϐνου Διϊφορα μϋλη των SLRPs (decorin, fibromodulin, lumican) αλληλεπιδροϑν ευθϋωσ με τα ινϔδη κολλαγϐνα ευνοϔντασ την κανονικό διϊταξη των ινϔν του κολλαγϐνου (Scott JE & Orford CR 1981). Η αλληλεπύδραςη τησ decorin με το κολλαγϐνο γύνεται μϋςω του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ (Vogel KG et al. 1984). Σο τριςδιϊςτατο μοντϋλο τησ decorin και η παρατόρηςη ϐτι διϊφορα μϋλη των SLRPs 95

96 Ειςαγωγό ϋχουν πεταλοειδό μορφό οδηγοϑν ςτο ςυμπϋραςμα ϐτι η decorin και το κολλαγϐνο ϋχουν ςτενό ςχϋςη που ευνοεύται απϐ τη δομό των μορύων ςτο χϔρο. χόμα 11. Γενικϊ δομικϊ χαρακτηριςτικϊ των κυριϐτερων μικρϔν πρωτεογλυκανϔν που εύναι πλοϑςιεσ ςε λευκύνη. Η ςτενό αλληλεπύδραςη βοηθϊ ςτη ςταθεροπούηςη και ςτον προςανατολιςμϐ των ινϔν του κολλαγϐνου. Σο μοντϋλο τησ decorin φανερϔνει μύα δομό αψύδασ, με την εςωτερικό επιφϊνεια τησ να ϋχει τη δομό β- ελϊςματοσ και την εξωτερικό επιφϊνεια να ϋχει την δομό α- ϋλικασ. Αυτϐ το μοντϋλο πιθανϐν να επιτρϋπει την εϑκολη πρϐςβαςη πρωτεώνϔν ςτην εςωτερικό επιφϊνεια (Schaefer L & Schaefer RM 2010, Schaefer L & Iozzo RV 2008). Ένα ϊλλο ενδιαφϋρον χαρακτηριςτικϐ αυτοϑ του μοντϋλου εύναι ϐτι οι τρεισ Ν- γλυκοζιτικϊ ςυνδεδεμϋνοι ολιγοςακχαρύτεσ και η GAG αλυςύδα τησ decorin εύναι τοποθετημϋνα ςτη μια πλευρϊ τησ αψιδωτόσ δομόσ και η GAG αλυςύδα εύναι ςχετικϊ ελεϑθερη να προβϊλλει μακριϊ απϐ τον 96

97 Ειςαγωγό πρωτεώνικϐ κορμϐ. Αυτό η διευθϋτηςη πιθανϐν να αντικατοπτρύζει την προτεινϐμενη λειτουργύα τησ GAG αλυςύδασ να διατηρεύ την απϐςταςη μεταξϑ των ινϔν κολλαγϐνου. Η εςωτερικό επιφϊνεια τησ αψιδωτόσ δομόσ του μορύου τησ decorin περιϋχει ςειρϊ αμινοξϋων φορτιςμϋνων αντύθετα και ςυμπληρωματικϊ με τα φορτύα που εμφανύζει η περιοχό τησ τριπλόσ ϋλικασ του κολλαγϐνου τϑπου Ι που προτεύνεται ωσ θϋςη δϋςμευςησ για την decorin (Schaefer L & Schaefer RM 2010, Schaefer L & Iozzo RV 2008). Ρϐλοσ τησ decorin ςτη νεοπλαςύα - Αλληλεπιδρϊςεισ με τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ Η decorin ςυχνϊ υπερεκφρϊζεται ςτουσ νεοπλαςματικοϑσ ιςτοϑσ (Goldoni S & Iozzo RV 2008). Όπωσ ϋχει δειχθεύ, αυξϊνεται ςημαντικϊ ςτον καρκύνο του παχϋοσ εντϋρου, παγκρϋατοσ, προςτϊτη, πνευμϐνων, ωοθηκϔν, μαςτοϑ και λϊρυγγα (Theocharis AD 2002, Skandalis SS et al. 2006, Theocharis AD et al. 2003, Newton TR et al. 2006, Troup S et al. 2003, Matsumine A et al. 2007, Nash MA et al. 2002, Köninger J et al. 2004). Τπερεκφρϊζεται κυρύωσ ςτο ςτρϔμα του ϐγκου λϐγω υπομεθυλύωςησ του επαγωγϋα τησ ό μϋςω επαγωγόσ τησ ςϑνθεςόσ τησ απϐ διϊφορουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ (Goldoni S & Iozzo RV 2008). Η ανϊλυςη διαφϐρων καρκινικϔν κυττϊρων ϋχει δεύξει ϐτι δεν εκφρϊζουν την decorin, ενϔ οι ινοβλϊςτεσ του ςτρϔματοσ τη ςυνθϋτουν αφειδϔσ. Η ελαττωμϋνη ϋκφραςη τησ decorin ςυνδϋεται με κακό πρϐγνωςη, ςε περιπτϔςεισ καρκύνου μαςτοϑ χωρύσ παρουςύα λεμφαδενικϔν μεταςτϊςεων που θεωρητικϊ ϋχουν ευνοώκό πρϐγνωςη (Troup S et al. 2003). Επιπλϋον, η καταςτολό τησ ϋκφραςησ του γονιδύου τησ decorin προϊγει τη δημιουργύα ϐγκων (Iozzo RV et al. 1999). Η ικανϐτητα τησ decorin να αναςτϋλλει την ανϊπτυξη των κυττϊρων ςτηρύζει περαιτϋρω την υπϐθεςη ϐτι η ανϔμαλη παραγωγό αυτόσ τησ PG γϑρω απϐ μεταςτατικοϑσ καρκύνουσ αντιπροςωπεϑει μύα εξειδικευμϋνη βιολογικό αντύδραςη του οργανιςμοϑ προκειμϋνου να αποτρϋψει την ανϊπτυξη των καρκινικϔν κυττϊρων. Αυτϐ ςυμβαύνει διϐτι η decorin αποτελεύ ϋναν ιςχυρϐ αναςτολϋα του κυτταρικοϑ πολλαπλαςιαςμοϑ και τησ μετανϊςτευςησ (Santra M et al. 2000, Csordas G et al. 2000, Santra M et al. 1997, Zhu J-X et al. 2005, Moscatello DK et al. 1998, Reed CC et 97

98 Ειςαγωγό al. 2005). Δεςμεϑεται ϊμεςα ςτουσ υποδοχεύσ με δρϊςη κινϊςησ τυροςύνησ τησ οικογϋνειασ των ErbB (Santra M et al. 2000, Csordas G et al. 2000, Santra M et al. 1997, Zhu J-X et al. 2005, Moscatello DK et al. 1998, Reed CC et al. 2005) και του Met (Goldoni S et al. 2009), του υποδοχϋα του ηπατοκυτταρικοϑ αυξητικοϑ παρϊγοντα (HGF), και καταςτϋλλει τη ςηματοδϐτηςό τουσ (χόμα 12). Αυτού οι υποδοχεύσ υπερεκφρϊζονται ςε διϊφορουσ τϑπουσ κακοηθειϔν και προϊγουν την καρκινογϋνεςη. Η δρϊςη τησ ςυνδϋεται με την επαγωγό τησ πρωτεϗνησ p21cip WAF-1 που εύναι αναςτολϋασ του κυτταρικοϑ κϑκλου. Η decorin προκαλεύ ταχεύα φωςφορυλύωςη του EGFR και ταυτϐχρονη ενεργοπούηςη του μονοπατιοϑ μετϊδοςησ μηνϑματοσ των πρωτεώνικϔν κιναςϔν που ενεργοποιοϑνται απϐ μιτογϐνα (MAPKs). Αυτϐ οδηγεύ ςε επαγωγό του p21 και τελικϊ ςε καθόλωςη του κυττϊρου ςτην G1 φϊςη (Santra M et al. 2000, Csordas G et al. 2000, Santra M et al. 1997, Zhu J-X et al. 2005, Moscatello DK et al. 1998, Reed CC et al. 2005). Επιπλϋον, φαύνεται ϐτι η decorin επιδρϔντασ ςτον υποδοχϋα του EGF, προκαλεύ κινητοπούηςη του ενδοκυττϊριου αςβεςτύου και καταςτολό του κυτταρικοϑ κϑκλου (Patel S et al. 1998) (χόμα 12). Η ςηματοδϐτηςη τησ decorin ςτο μονοπϊτι του EGFR εύναι τελεύωσ διαφορετικό απϐ αυτό του EGF πιθανϐτατα διϐτι προκαλεύ διμεριςμϐ του υποδοχϋα και δομικϋσ μεταβολϋσ τελεύωσ διαφορετικϋσ απϐ αυτϋσ που προκαλεύ ο φυςιολογικϐσ του προςδϋτησ EGF. Επιπλϋον, η decorin αλληλεπιδρϊ με τον EGFR με αποτϋλεςμα την ενδοκυττϊρωςη του υποδοχϋα και την αποικοδϐμηςό του ςτα λυοςϔματα (χόμα 12). Η αλληλεπύδραςη τησ decorin με τον Met επϊγει την παροδικό ενεργοπούηςη και αλληλεπύδραςό του με την Ε3 λιγϊςη τησ ουβικουιτύνησ c-cbl και ςτη ςυνϋχεια την ενδοκυττϊρια αποικοδϐμηςη του υποδοχϋα. Αυτό η ρϑθμιςη ϋχει ωσ αποτϋλεςμα την αναςτολό τησ ανϊπτυξησ και τησ μετανϊςτευςησ των κυττϊρων ϐταν διεγεύρονται με τον HGF παρουςύα τησ decorin (Goldoni S et al. 2009). Μια ϊλλη ςημαντικό λειτουργύα τησ decorin εύναι η υψηλό τησ ςυγγϋνεια για τον TGF-β (Hildebrand A et al. 1994). Οι ιςομορφϋσ του TGF-β δεςμεϑονται ϐλεσ ςτον πρωτεώνικϐ κορμϐ τησ decorin οπϐτε αυτό μπορεύ να λειτουργεύ ωσ αποθόκη για αυτϐν τον αυξητικϐ παρϊγοντα ςτον εξωκυττϊριο χϔρο. Η δϋςμευςη του TGF-β 98

99 Ειςαγωγό απϐ την decorin ϐμωσ ϋχει ωσ αποτϋλεςμα την αναςτολό τησ ανϊπτυξησ των κυττϊρων τα οπούα απαιτοϑν την παρουςύα αυτοϑ του παρϊγοντα. χόμα 12. Η decorin αλληλεπιδρϊ με τον EGFR και ενεργοποιεύ ϋνα διακριτϐ ςηματοδοτικϐ μονοπϊτι. Προκαλεύται διμεριςμϐσ του υποδοχϋα και ενδοκυττϊρωςό του μϋςω κυςτιδύων που περιϋχουν καβεολύνη και ςτη ςυνϋχεια ο υποδοχϋασ αποικοδομεύται ςτα λυοςϔματα. Η δϋςμευςη τησ decorin ςτον υποδοχϋα προκαλεύ φωςφορυλύωςη του υποδοχϋα και ενεργοπούηςη των Erk1/2 που οδηγεύ ςτην αϑξηςη τησ ϋκφραςησ τησ p21. Επιπλϋον, ενεργοποιεύται η προ-καςπϊςη 3 που προκαλεύ αποικοδϐμηςη του ενδοκυττϊριου C-τελικοϑ ϊκρου του EGFR με αποτϋλεςμα την ϋναρξη τησ απϐπτωςησ (Goldoni S & Iozzo RV 2008) ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΕ Η οικογϋνεια αυτό των PGs αποτελεύται απϐ δϑο κϑριεσ υποκατηγορύεσ αλλϊ περιλαμβϊνει και 3 μϋλη που δεν εμφανύζουν δομικϋσ ομοιϐτητεσ. Οι περιςςϐτερεσ απϐ αυτϋσ τισ PGs φϋρουν κυρύωσ αλυςύδεσ HS, αλλϊ κϊποιεσ απϐ αυτϋσ μποροϑν να φϋρουν και αλυςύδεσ CS. Η HS μπορεύ να αποτελεύται απϐ μεγϊλη ποικιλύα φορτιςμϋνων διςακχαριτϔν προςδύδοντασ ςτο μϐριο πολϑπλοκη δομό. Η 99

100 Ειςαγωγό πολυπλοκϐτητα τησ δομόσ τησ HS εύναι η αιτύα για το μεγϊλο αριθμϐ αλληλεπιδρϊςεων τησ με ϊλλα δραςτικϊ βιολογικϊ μϐρια (David G 1993). Η μεγαλϑτερη υποκατηγορύα των μεμβρανικϔν PGs εύναι οι SLIPS (Syndecan Like Integral Proteoglycans) και απαρτύζεται απϐ 4 μϋλη (David G 1993, Fears CY & Woods A 2006). Οι πρωτεώνικού κορμού αυτϔν των PGs διαπερνοϑν την κυτταρικό μεμβρϊνη και φϋρουν αλυςύδεσ HS ςτο εξωκυττϊριο τμόμα τουσ. Η ϊλλη οικογϋνεια των μεμβρανικϔν PGs εύναι η GRIPS (Glypican Related Integral Proteoglycans) και μϋχρι ςόμερα ϋχουν αναγνωριςτεύ 6 μϋλη (glypican 1-6) (David G et al. 1990, Veugelers M et al. 1999, Filmus J et al. 2008). Οι glypicans φϋρουν αλυςύδεσ HS και ονομϊζονται ϋτςι λϐγω του χαρακτηριςτικοϑ τρϐπου ςϑνδεςόσ τουσ με την κυτταρικό μεμβρϊνη. Ο πρωτεώνικϐσ κορμϐσ τουσ ςυνδϋεται με την κυτταρικό μεμβρϊνη «αγκυροβολϔντασ» ςε αυτόν μϋςω GPI ςυνδϋςμου. Άλλεσ μεμβρανικϋσ PGs εύναι οι betaglycan, CD44 και η thrombomodulin και μποροϑν εύτε να φϋρουν αλυςύδεσ GAG ό να εύναι μη γλυκοζυλιωμϋνεσ. Οι PGs αυτϋσ διαπερνοϑν την κυτταρικό μεμβρϊνη και φϋρουν αλυςύδεσ CS/HS (betaglycan, CD 44) ό αλυςύδεσ CS (thrombomodulin) (Hardingham TE & Fosang AJ 1992). Η betaglycan εύναι βοηθητικϐσ υποδοχϋασ του TGF-β, ενϔ η thrombomodulin ςυμμετϋχει ςτον αντιπηκτικϐ μηχανιςμϐ του οργανιςμοϑ μϋςω τησ αναςτολόσ του ςχηματιςμοϑ ινωδογϐνου εύτε αδρανοποιϔντασ τη θρομβύνη μϋςω τησ αντιθρομβύνησ ΙΙΙ ό ενεργοποιϔντασ τη ζυμογϐνο μορφό τησ αντιπηκτικόσ πρωτεϗνησ C (Esmon CT 1989) Ο ΤΠΟΔΟΦΕΑ CD44 Ο CD44 εύναι υποδοχϋασ για το ΗΑ, βρύςκεται ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη και εύναι γλυκοζυλιωμϋνοσ ό μπορεύ να φϋρει και γλυκοζαμινογλυκανικϋσ αλυςύδεσ. Ο υποδοχϋασ CD44 αλληλεπιδρϊ με το ΗΑ με την εξωκυττϊρια αμινο-τελικό περιοχό του (Heldin P et al. 2008). Διϊφορεσ ιςομορφϋσ του CD44 ϋχουν ταυτοποιηθεύ, που οφεύλονται ςτο εναλλακτικϐ splicing εξονύων που κωδικοποιοϑν την εξωκυττϊρια αμινο-τελικό περιοχό του και ςε ςυνδυαςμϐ με την διαφορετικό γλυκοζυλύωςό τησ δημιουργοϑν μια δομικό ετερογϋνεια ςτον υποδοχϋα καθιςτϔντασ τον ικανϐ να 100

101 Ειςαγωγό αλληλεπιδρϊ με ϊλλα μϐρια ϐπωσ την οςτεοποντύνη και τον FGF (Iida N & Bourguignon LY 1995). Η ςηματοδοτικό δρϊςη του ΗΑ ςτα καρκινικϊ κϑτταρα μϋςω του υποδοχϋα CD44 ϋχει προταθεύ ωσ βαςικϐ βόμα για την ανϊπτυξη και πρϐοδο τησ νϐςου (Bourguignon LY 2008). Η ενδοκυττϊρια καρβοξυ-τελικό περιοχό του υποδοχϋα αλληλεπιδρϊ με πλόθοσ πρωτεώνϔν ϐπωσ εύναι η ankyrin, η ezrin, η GAB1, οι src κινϊςεσ, οι Rho-GTPases και διϊφορεσ ϊλλεσ. Έτςι μϋςω τησ αλληλεπύδραςόσ του με αυτϋσ τισ πρωτεϗνεσ ςυζεϑγνυται με πλόθοσ διαφορετικϔν ςηματοδοτικϔν μονοπατιϔν. Αυτϐ ϋχει ωσ αποτϋλεςμα την ενεργοπούηςη του υποδοχϋα απϐ το υαλουρονικϐ και ςτη ςυνϋχεια τη ρϑθμιςη διαφϐρων κυτταρικϔν λειτουργιϔν ϐπωσ εύναι η κυτταρικό προςκϐλληςη, η μετανϊςτευςη, ο πολλαπλαςιαςμϐσ, η χημειοανθεκτικϐτητα και η μετϊςταςη των καρκινικϔν κυττϊρων (χόμα 13). Επιπλϋον, ο υποδοχϋασ CD44 εκφρϊζεται απϐ διϊφορα κϑτταρα του μικροπεριβϊλλοντοσ των καρκινικϔν κυττϊρων ϐπωσ εύναι τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, οι οςτεοκλϊςτεσ και ϊλλα (Toole BP et al. 2002). Σα καρκινικϊ κϑτταρα υπερεκφρϊζουν ΗΑ, ενεργοποιοϑν τον υποδοχϋα των κυττϊρων του ςτρϔματοσ και επϊγουν διϊφορεσ λειτουργύεσ, ϐπωσ τη χημειοταξύα των ινοβλαςτϔν και την ενεργοπούηςό τουσ. Σα τελευταύα χρϐνια, ϋχει αναδειχθεύ η ςπουδαιϐτητα του υποδοχϋα CD44 ςε ςχϋςη με την πρϐοδο των νεοπλαςιϔν, ιδιαύτερα μετϊ την ανακϊλυψη ϐτι ο υποδοχϋασ αποτελεύ αξιϐπιςτο δεύκτη των πολυδϑναμων καρκινικϔν κυττϊρων (cancer stem cells) (Al-Hajj M et al. 2003). Σα κϑτταρα αυτϊ, ϋχει δειχθεύ ϐτι ϋχουν αυξημϋνη ικανϐτητα μετανϊςτευςησ και δημιουργύασ μεταςτϊςεων ςε απομακρυςμϋνα ϐργανα κατϊ την πρϔιμη φϊςη τησ ανϊπτυξησ του ϐγκου και επιπλϋον εύναι υπεϑθυνα για την εμφϊνιςη δευτερογενϔν εντοπύςεων κατϊ τη φϊςη υποτροπόσ τησ νϐςου. τισ νεοπλαςύεσ μαςτοϑ που παρουςιϊζουν υψηλϐ δυναμικϐ μετϊςταςησ αναγνωρύζεται η χαρακτηριςτικό ταυτϐτητα των πολυδϑναμων καρκινικϔν κυττϊρων με υψηλό ϋκφραςη του υποδοχϋα CD44 και χαμηλό ϋκφραςη του υποδοχϋα CD24. Η λειτουργύα του υποδοχϋα φαύνεται να κατευθϑνει και να ρυθμύζει την αλληλεπύδραςη κυττϊρου κυττϊρου και κυττϊρου ECM ςτο μικροπεριβϊλλον του ϐγκου. Αυτϐ ϋχει ωσ αποτϋλεςμα τη διευκϐλυνςη των κακοόθων κυττϊρων να διϋρχονται μϋςω του ECM απϐ τη θϋςη του πρωτογενοϑσ ϐγκου ςε απομακρυςμϋνεσ θϋςεισ ϐπου 101

102 Ειςαγωγό εγκαθύςτανται και πολλαπλαςιϊζονται αποικοδομϔντασ τον ECM ϔςτε να δϔςουν δευτερογενεύσ μεταςτϊςεισ. χόμα 13. υνολικϐ μοντϋλο των ςηματοδοτικϔν μονοπατιϔν που ενεργοποιοϑνται απϐ το ΗΑ και τον υποδοχϋα του CD44 κατϊ την ογκογϋνεςη και την πρϐοδο του ϐγκου (Bourguignon LY 2008). Η απϔλεια τησ ϋκφραςησ τησ Ε-καντχερύνησ ϋχει δειχθεύ ϐτι ςυμβαύνει ςε πρϔιμα ςτϊδια τησ διαδικαςύασ διόθηςησ των επιθηλιακϔν κυττϊρων. Η ελαττωμϋνη ϋκφραςη τησ Ε-καντχερύνησ διευκολϑνει την αποδιοργϊνωςη των ςυνδϋςμων προςκϐλληςησ μεταξϑ των επιθηλιακϔν κυττϊρων, αλλϊ επύςησ οδηγεύ ςε ενεργοπούηςη του μεταγραφικοϑ παρϊγοντα β-κατενύνη με αποτϋλεςμα την αυξημϋνη μεταγραφό γονιδύων που οδηγοϑν ςε κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ, επιβύωςη και διόθηςη των κυττϊρων (Mani SA et al. 2008). Μελϋτεσ ϋχουν δεύξει ϐτι η ϋκφραςη του υποδοχϋα CD44 ρυθμύζεται απϐ αυτϐν το μεταγραφικϐ παρϊγοντα. 102

103 Ειςαγωγό Σα μονοπϊτια μεταγωγόσ μηνϑματοσ ϐπου ςυμμετϋχει ο υποδοχϋασ CD44 προκαλοϑν ενεργοπούηςη του μεταγραφικοϑ παρϊγοντα β-κατενύνη ενϔ προτεύνεται ϐτι η ενεργοπούηςη του μεταγραφικοϑ παρϊγοντα θα οδηγόςει ςε υπερϋκφραςη του υποδοχϋα και προαγωγό τησ διηθητικόσ ικανϐτητασ των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων (Bourguignon LY et al. 2007, Mani SA et al. 2008, Bourguignon LY et al. 2009). Επύςησ, ο υποδοχϋασ CD44 φαύνεται ϐτι ρυθμύζει την ϋκφραςη διαφϐρων πρωτεαςϔν του εξωκυττϊριου χϔρου. Αλληλεπιδρϊ και εντοπύζει την μεμβρανικοϑ τϑπου MMP (ΜΣ1-ΜΜΡ) ςε ςυγκεκριμϋνεσ περιοχϋσ τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ. Παραλλόλωσ, αυξϊνει την ϋκφραςη τησ πρωτεϗνησ contractin ςτο εμπρϐςθιο μϋροσ των κυττϊρων κατϊ τη διαδικαςύα διόθηςησ, επιτρϋποντασ το ςχηματιςμϐ προεκτϊςεων τησ μεμβρϊνησ απαραύτητων για τη διόθηςη των κυττϊρων (Mori H et al. 2002). Κατϊ τη διαδικαςύα διόθηςησ, η αλληλεπύδραςη του υποδοχϋα CD44 με τισ ΜΣ1-ΜΜΡ και ΜΜΡ-9 (Desai B et al. 2009) ςυγκεντρϔνει την πρωτεολυτικό δραςτικϐτητα ςτο εμπρϐςθιο μϋροσ των κυττϊρων εφοδιϊζοντασ τα κϑτταρα με πρωτεολυτικό δραςτικϐτητα απαραύτητη για την αποικοδϐμηςη του ECM ςτο μικροπεριβϊλλον τουσ και τη μετανϊςτευςό τουσ Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΣΨΝ SYNDECANS Η οικογϋνεια αυτό αποτελεύται απϐ τισ syndecans-1, -2, -3 και -4. Η syndecan-1 εκφρϊζεται ςτα πρϔιμα ςτϊδια τησ ανϊπτυξησ και ςτη ςυνϋχεια ςτα φυςιολογικϊ επιθηλιακϊ και καρκινικϊ κϑτταρα. Αντιθϋτωσ, η syndecan-2 εκφρϊζεται ςε μεςεγχυματικοϑσ ιςτοϑσ ςτο όπαρ, ςτουσ νευρϔνεσ, ςτουσ ινοβλϊςτεσ και τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, ενϔ η syndecan-3 εκφρϊζεται κυρύωσ ςτο νευρικϐ ιςτϐ. Η syndecan-4 εμφανύζει την πιο ευρεύα κατανομό ςε πολλοϑσ ιςτοϑσ και κϑτταρα (Schaefer L & Schaefer RM 2010, Fears CY & Woods A 2006, Alexopoulou AN et al. 2007). Όλεσ εύναι μικρϋσ μεμβρανικϋσ πρωτεϗνεσ που εμφανύζουν περιοριςμϋνεσ, αλλϊ ϐμωσ ςημαντικϋσ δομικϋσ ομοιϐτητεσ. Οι δομικϋσ ομοιϐτητεσ ςτο εξωκυττϊριο τμόμα τουσ απαντϔνται ςτισ αλληλουχύεσ ϐπου γύνεται η ϋναρξη τησ γλυκοζυλύωςόσ τουσ με HS και ςτην περιοχό που γειτνιϊζει με το διαμεμβρανικϐ 103

104 Ειςαγωγό τουσ τμόμα (χόμα 14). Η ομοιϐτητα τουσ εκεύ αφορϊ ϐλα τα χαρακτηριςτικϊ βαςικϊ αμινοξϋα τα οπούα πιθανϔσ ςηματοδοτοϑν θϋςεισ, ϐπου μποροϑν να δρϊςουν πρωτεϊςεσ και να αποκϐψουν τισ PGs απϐ την κυτταρικό επιφϊνεια. υνολικϊ, τα εξωκυττϊρια τμόματα των syndecans δεν εμφανύζουν μεγαλϑτερη απϐ 10-20% ομολογύα. Αντιθϋτωσ, η διαμεμβρανικό και η μικρό ενδοκυττϊρια περιοχό τουσ εμφανύζει % ομολογύα. Οι ενδοκυττϊριεσ περιοχϋσ τουσ εμφανύζουν υψηλό διατόρηςη ςε 4 αμινοξϋα τυροςύνησ κοντϊ ςτην περιοχό ϐπου ςυνδϋονται με την ενδομεμβρανικό τουσ περιοχό και ςε ϊλλα 3 αμινοξϋα τυροςύνησ που βρύςκονται μακριϊ απϐ αυτόν. Σο ενδοκυττϊριο τμόμα τουσ ϋχει διατηρηθεύ αυςτηρϊ κατϊ την εξϋλιξη και εμφανύζει 70 % ομολογύα μεταξϑ των ειδϔν (Fears CY & Woods A 2006, Alexopoulou AN et al. 2007). Υαύνεται ϐτι οι αλυςύδεσ τησ HS, το ενδοκυττϊριο τμόμα, καθϔσ και οι θϋςεισ δρϊςησ των πρωτεαςϔν εύναι απαραύτητεσ για τισ βιολογικϋσ λειτουργύεσ που επιτελοϑν οι syndecans. Σο κυτταροπλαςματικϐ τμόμα περιϋχει δϑο διατηρημϋνεσ περιοχϋσ C1 και C2 που εντοπύζονται κοντϊ και μακριϊ απϐ τη διαμεμβρανικό περιοχό αντύςτοιχα. Οι περιοχϋσ C1 και C2 εμπλϋκονται ςτην αλληλεπύδραςη των syndecans με τισ πρωτεϗνεσ του κυτταροςκελετοϑ και πρωτεϗνεσ που περιϋχουν αλληλουχύεσ PDZ, αντύςτοιχα (χόμα 14). Ενδιϊμεςα των περιοχϔν αυτϔν εντοπύζεται μια μεταβλητό περιοχό V, η οπούα εύναι μοναδικό για κϊθε syndecan και ρυθμύζει την ικανϐτητα μετακύνηςησ των κυττϊρων μϋςω αλληλεπύδραςόσ τουσ με την ακτύνη και την fascin (Fears CY & Woods A 2006, Alexopoulou AN et al. 2007) (χόμα 14). Η μεταβλητό περιοχό τησ syndecan-4 αλληλεπιδρϊ με την 4,5, διφωςφορικό φωςφατιδυλοώνοςιτϐλη, προκαλεύ ολιγομεριςμϐ τησ syndecan-4 και ενεργοποιεύ την πρωτεώνικό κινϊςη Cα (PKCα) (Horowith et al., 2002, Lim et al. 2002, Oh et al. 1997a,b, 1998). Οι syndecans ςυμμετϋχουν ςε πολλϋσ και ςημαντικϋσ βιολογικϋσ λειτουργύεσ, ϐπωσ εύναι η ςϑνδεςη των κυττϊρων με τον εξωκυττϊριο χϔρο, ο κυτταρικϐσ πολλαπλαςιαςμϐσ, η διαφοροπούηςη των κυττϊρων, η δϋςμευςη βιοδραςτικϔν μορύων και η αποφυγό των θρομβϔςεων. 104

105 Ειςαγωγό χόμα 14. Δομό των syndecans και οι αλληλεπιδρϊςεισ τουσ με ϊλλα βιολογικϊ δραςτικϊ μϐρια. Οι syndecans δεςμεϑουν μϋςω των αλυςύδων τησ HS πολλϊ μϐρια του εξωκυττϊριου χϔρου, ϐπωσ εύναι τα κολλαγϐνα τϑπου Ι, ΙΙ V, η fibronectin, η thrombospondin, και η tenascin, ςυμμετϋχοντασ ϋτςι ςτη ςϑνδεςη των κυττϊρων με τον περικυττϊριο χϔρο (Xianet X al., 2010). Επιπλϋον εύναι μϐρια που ςυμμετϋχουν ςτην κυτταρικό ςηματοδϐτηςη αφοϑ δεςμεϑουν τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ (bfgf, VEGF) και τουσ παρουςιϊζουν ςτουσ υποδοχεύσ τουσ ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη. Η δϋςμευςη των αυξητικϔν παραγϐντων ςτισ syndecans τουσ προςτατεϑει απϐ την αποικοδϐμηςό τουσ απϐ διϊφορεσ πρωτεϊςεσ και εμποδύζει την απενεργοπούηςό τουσ (Chang Z et al. 2000, Gospodarowicz D & Cheng J 1986) Με αυτϐν τον τρϐπο οι syndecans προϊγουν τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ και την αγγειογϋνεςη. Κατϊ τη διϊρκεια τησ μορφογϋνεςησ καθϔσ και κατϊ τη διϊρκεια τησ επιδιϐρθωςησ των ιςτϔν ϐπου απαιτεύται η μετακύνηςη και η διαφοροπούηςη των κυττϊρων παρατηρεύται αποκοπό των syndecans απϐ την κυτταρικό επιφϊνεια (χόμα 15). Διϊφοροι προ-αγγειογενετικού αυξητικού παρϊγοντεσ και ϋνζυμα που υπερεκφρϊζονται επύςησ ςτισ νεοπλαςύεσ επιταχϑνουν την αποκοπό των ςυνδεκανϔν απϐ την κυτταρικό μεμβρϊνη κυρύωσ μϋςω πρωτεϐλυςησ τησ εξωκυττϊριασ περιοχόσ μεταξϑ των αμινοξϋων αλανύνησ και ςερύνησ που 105

106 Ειςαγωγό βρύςκονται πολϑ κοντϊ ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη (Ding K et al. 2005, Fitzgerald ML et al. 2000, Wang Z et al. 2005). χόμα 15. Η ρϑθμιςη των syndecans ςτην αγγειογϋνεςη και ογκογϋνεςη. Α) Η υπερϋκφραςη των syndecans επϊγει την ιςχυρό αλληλεπύδραςη του κυττϊρου με τον εξωκυττϊριο χϔρο με αποτϋλεςμα την ακινητοπούηςη του κυττϊρου. Β) Οι syndecans δεςμεϑουν τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ και τουσ παρουςιϊζουν ςτουσ υποδοχεύσ ενεργοποιϔντασ τα ςηματοδοτικϊ μονοπϊτια που εμπλϋκονται ςτον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ και τη μετακύνηςη. C) Οι διαλυτϋσ εξωκυττϊριεσ περιοχϋσ των syndecans αλληλεπιδροϑν με τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ λειτουργϔντασ ωσ αποθόκεσ για αυτοϑσ, ό δημιουργοϑν μια βαθμύδωςη χημειοτακτικϔν παραγϐντων ςτον ECM. D) Οι διαλυτϋσ εξωκυττϊριεσ περιοχϋσ των syndecans ςυναγωνύζονται με τισ syndecans ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη για τη δϋςμευςη των μορύων του ECM με αποτϋλεςμα την ελϊττωςη τησ προςκϐληςησ των κυττϊρων και την αϑξηςη τησ μετακύνηςησ τουσ. E) Ελαττωμϋνη ϋκφραςη των syndecans ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη ελαττϔνει δραματικϊ την αλληλεπύδραςη των κυττϊρων με τον ECM με αποτϋλεςμα την ακινηςύα των κυττϊρων (Fears CY & Woods A 2006). 106

107 Ειςαγωγό Οι διαλυτϋσ μορφϋσ των syndecans επιταχϑνουν την ανϊπτυξη των ϐγκων in vivo και τη διόθηςη των καρκινικϔν κυττϊρων (Yang Y et al. 2002). Πιςτεϑεται ϐτι οι διαλυτϋσ μορφϋσ δεςμεϑουν τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ ςτον εξωκυττϊριο χϔρο δημιουργϔντασ βαθμύδωςη χημειοτακτικϔν παραγϐντων που κατευθϑνουν τη μετακύνηςη καρκινικϔν και ενδοθηλιακϔν κυττϊρων (χόμα 15). Επιπλϋον, προςτατεϑουν τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ και διευκολϑνουν τη ςϑνδεςό τουσ με τουσ υποδοχεύσ τουσ (Kato M et al. 1998, Marshall LJ et al. 2003). Η syndecan-4 αλληλεπιδρϊ με τον bfgf και τον FGFR προϊγοντασ τη ςηματοδϐτηςό του (Mundhenke C et al. 2002). Επύςησ, ρυθμύζει την προςκϐλληςη και τη μετανϊςτευςη των καρκινικϔν κυττϊρων (Beauvais DM & Rapraeger AC 2003). Η syndecan-4 εντοπύζεται ςε περιοχϋσ ιςχυρόσ προςκϐλληςησ των κυττϊρων ςτον εξωκυττϊριο χϔρο, ςε περιοχϋσ εςτιακόσ προςκϐλληςησ ςτουσ ινοβλϊςτεσ και ςυνδϋεται με την ενδοκυττϊρια πρωτεϗνη α-ακτινύνη (Woods A et al., 2000). Η υπερϋκφραςη τησ syndecan-4 ευοδϔνει τη δημιουργύα εςτιϔν προςκϐλληςησ και ελαττϔνει την κινητικϐτητα των κυττϊρων. Ο ολιγομεριςμϐσ τησ syndecan-4 παρουςύα τησ 4,5, διφωςφορικόσ φωςφατιδυλοώνοςιτϐλησ, ενεργοποιεύ την PKCα και υποκεύμενα ςηματοδοτικϊ μονοπϊτια και προϊγει τη δημιουργύα εςτιακϔν προςκολλόςεων και ινιδύων τϊςησ του κυτταροςκελετοϑ. Όμωσ, αυτό η λειτουργύα αναςτϋλλεται απϐ την πρωτεώνικό κινϊςη Cδ (PKCδ) που προκαλεύ φωςφορυλύωςη ςτη ςερύνη 183 τησ περιοχόσ C1, υποδεικνϑοντασ μύα αλληλεπύδραςη μεταξϑ τησ κυτταρικόσ προςκϐλληςησ και του πολλαπλαςιαςμοϑ (Chalkiadaki G et al. 2009, Longley RL et al. 1999, Midwood KS et al. 2006). Επύςησ, η syndecan-4 υπερεκφρϊζεται κατϊ τη δημιουργύα αγγεύων, κατϊ την εποϑλωςη πληγϔν και την αποκατϊςταςό τουσ. Η ικανϐτητα των syndecans να αλληλεπιδροϑν με προ-αγγειογενετικοϑσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ και κυτταροκύνεσ και να προϊγουν την αλληλεπύδραςη με τουσ αντύςτοιχουσ υποδοχεύσ τουσ επϊγει την αγγειογϋνεςη (Clasper S et al. 1999, Mundhenke C et al. 2002). Έτςι, η υπερϋκφραςη τησ syndecan-4 απϐ τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα οδηγεύ ςε αυξημϋνη δϋςμευςη του bfgf και αϑξηςη του πολλαπλαςιαςμοϑ και τησ μετανϊςτευςόσ τουσ. Η δημιουργύα μεταλλϊξεων ςτισ θϋςεισ γλυκοζυλύωςησ τησ syndecan-4 με τισ αλυςύδεσ τησ HS ελαττϔνει την απϐκριςη των κυττϊρων ςτον αυξητικϐ παρϊγοντα 107

108 Ειςαγωγό (Volk R et al. 1999). Παρομούωσ, ελαττωμϋνη δραςτικϐτητϊ του παρατηρεύται ϐταν μεταλλαχθοϑν θϋςεισ εύτε ςτην κυτταροπλαςματικό περιοχό τησ syndecan-4 ϐπου αλληλεπιδρϊ με την 4,5, διφωςφορικό φωςφατιδυλοώνοςιτϐλη ό ςτην περιοχό που αλληλεπιδρϊ με πρωτεϗνεσ που περιϋχουν PDZ αλληλουχύεσ (Horowith et al. 2002). Η υπερϋκφραςό τησ απϐ τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα αυξϊνει τη δραςτικϐτητα τησ PKCα που επϊγεται απϐ τον bfgf. Όμωσ, η δραςτικϐτητα αυτό ελαττϔνεται δραματικϊ ϐταν ςυνυπϊρχουν οι παραπϊνω μεταλλϊξεισ. Έχει προταθεύ ϐτι η PKCδ φωςφορυλιϔνει τη ςερύνη 183 ςτην κυτταροπλαςματικό περιοχό τησ syndecan-4. Ο αυξητικϐσ παρϊγοντασ bfgf δεςμεϑεται ςτον υποδοχϋα του, ο οπούοσ ενεργοποιεύ μια φωςφατϊςη ςερύνησ / θρεονύνησ, η οπούα αποφωςφορυλιϔνει τη ςερύνη 183 (Murakami M et al. 2002). Σα αποφωςφορυλιωμϋνα μονομερό τησ syndecan-4 μποροϑν να αλληλεπιδρϊςουν με την 4,5, διφωςφορικό φωςφατιδυλοώνοςιτϐλη προκαλϔντασ ολιγομεριςμϐ τησ syndecan-4, η οπούα μπορεύ να αλληλεπιδρϊςει και να ενεργοποιόςει την PKCα (Horowith et al. 2002, Lim et al. 2002, Oh et al. 1997a,b, 1998) Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΣΨΝ GLYPICANS Οι glypicans (glypicans-1, -6) ςυνδϋονται ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη μϋςω ομοιοπολικόσ ςϑνδεςησ με τη GPI. Ο πρωτεώνικϐσ κορμϐσ τουσ ςυντύθεται αρχικϊ με ϋνα υδρϐφοβο πεπτύδιο ςόμα ςτο C-τελικϐ ϊκρο του. Σο πεπτύδιο-ςόμα αγκυροβολεύ προςωρινϊ τον πρωτεώνικϐ κορμϐ ςτη μεμβρϊνη του ενδοπλαςματικοϑ δικτϑου. Εκεύ αποκϐπτεται και το νϋο C-τελικϐ ϊκρο του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ μεταφϋρεται ςτο μϐριο τησ GPI με το οπούο ςυνδϋεται ομοιοπολικϊ και τα μϐρια αυτϊ τελικϊ τοποθετοϑνται ςτην εξωτερικό επιφϊνεια τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ (Filmus J et al. 2008). Οι glypicans ϋχουν ϋνα μικρϐ πρωτεώνικϐ κορμϐ ~ 62-kDa που εύναι πλοϑςιοσ ςε αμινοξϋα κυςτεϗνησ και εμφανύζει αλληλουχύεσ αμινοξϋων ςερύνησ-γλυκύνησ ςτο C- τελικϐ ϊκρο του με το οπούο ςυνδϋεται με την GPI, διαθϋτει δε μϐνο μια θϋςη γλυκοζυλύωςησ ςτο Ν- τελικϐ ϊκρο του. Έτςι, ςε αντύθεςη με τισ syndecans, οι glypicans ςυγκεντρϔνουν τισ περιςςϐτερεσ HS αλυςύδεσ τουσ κοντϊ ςτην 108

109 Ειςαγωγό κυτταρικό επιφϊνεια (Filmus J et al. 2008). Η glypican-1 εκφρϊζεται ςε πολλοϑσ ιςτοϑσ και κϑτταρα, ενϔ η glypican-6 κυρύωσ ςτην καρδιϊ, τουσ νεφροϑσ, το όπαρ και τισ ωοθόκεσ. Αντιθϋτωσ οι glypicans-2, -3, -4 και -5 εκφρϊζονται αποκλειςτικϊ ςτο κεντρικϐ νευρικϐ ςϑςτημα (Schaefer L & Schaefer RM 2010). Οι glypicans μϋςω των αλυςύδων τησ HS μποροϑν να δεςμεϑςουν τουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ bfgf, VEGF, Wnt, hedgehog προϊγοντασ ό και αναςτϋλλοντασ τα ςηματοδοτικϊ μονοπϊτια τουσ (Capurro M et al. 2005, Capurro MI et al. 2008, Song HH et al. 2005, Kirkpatrick CA et al. 2006, Kleeff J et al. 1998, Matsuda K et al. 2001). Επύςησ, αλληλεπιδροϑν με εξωκυττϊρια μϐρια ςυμμετϋχοντασ ςτην «αγκυροβολύα» των κυττϊρων ςτον ECM. Αυτϋσ οι ιδιϐτητεσ ρυθμύζουν ςημαντικϋσ κυτταρικϋσ λειτουργύεσ ϐπωσ ο πολλαπλαςιαςμϐσ, η προςκϐλληςη και η κυτταρικό διαφοροπούηςη (Pilia G et al. 1996, Gonzalez AD et al. 1998, Kim H et al. 2003, Zhu Z et al. 2002, Lin H et al. 1999, Murthy SS et al. 2000). 109

110 110

111 111 ΚΟΠΟ

112 112

113 κοπϐσ Οι κακοόθεισ ϐγκοι ϐρχεων εμφανύζονται κυρύωσ ςε ϊνδρεσ ηλικύασ ετϔν και παρουςιϊζουν αυξητικό τϊςη τα τελευταύα 40 χρϐνια. Ο ςυγκεκριμϋνοσ τϑποσ κακοόθειασ φαύνεται να εμφανύζεται ςυχνϐτερα ςτουσ πληθυςμοϑσ τησ βϐρειασ Ευρϔπησ. Σα ποςοςτϊ επιβύωςησ των αςθενϔν ϋχουν βελτιωθεύ εντυπωςιακϊ κατϊ τα τελευταύα 30 χρϐνια υπερβαύνοντασ το 90% των περιπτϔςεων. Σα ακριβό αύτια των ϐγκων ϐρχεων δεν ϋχουν διευκρινιςτεύ πλόρωσ. Περύπου 95% των νεοπλαςιϔν προϋρχονται απϐ τα βλαςτικϊ κϑτταρα και οι περιςςϐτεροι απϐ τουσ ϐγκουσ ϐρχεων εύναι επιθετικού και ικανού για γρόγορη και ευρεύα διαςπορϊ τησ νϐςου. Παρϐλα αυτϊ, λϐγω τησ αποτελεςματικϐτητασ τησ χημειοθεραπεύασ που περιλαμβϊνει cisplatin, η θνηςιμϐτητα των αςθενϔν με κακοόθεισ ϐγκουσ ϐρχεων ϋχει μειωθεύ εντυπωςιακϊ. Η πρϐγνωςη τησ προϐδου τησ νϐςου αποτελεύ πρϐκληςη και ο ρϐλοσ διαφϐρων βιολογικϔν δεικτϔν ϋχει μελετηθεύ. Εύναι γνωςτϐ ϐτι αςθενεύσ ςταδύου Ι με μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ αναπτϑςςουν μικρομεταςτϊςεισ με ςυχνϐτητα 20-33% (Freedman LS et al. 1987, Sogani PC et al. 1984, Thompson PI et al. 1988, Foster RS & Roth BJ 1998). ε αυτοϑσ τουσ αςθενεύσ, η προγνωςτικό ικανϐτητα διαφϐρων ιςτοπαθολογικϔν μεταβλητϔν-παραμϋτρων ϋχει διερευνηθεύ και ςε κϊποιεσ περιπτϔςεισ η διόθηςη αγγεύων ό λεμφαγγεύων ό / και το ποςοςτϐ του εμβρυώκοϑ καρκινϔματοσ που περιϋχεται ςε μικτοϑσ ϐγκουσ ϋχουν προγνωςτικό αξύα για τον καθοριςμϐ των ατϐμων υψηλοϑ κινδϑνου να αναπτϑξουν τϋτοιεσ μεταςτϊςεισ (Read G et al. 1992, Fung et al. 1988, Heidenreich A et al. 1998). Η μελϋτη διαφϐρων βιολογικϔν δεικτϔν (p53, Bcl-2, καθεψύνη D, καντχερύνη E κτλ) δεν ϋχει δϔςει αξιϐλογα αποτελϋςματα. Η μελϋτη βιοδραςτικϔν μορύων που εμπλϋκονται ςτην ογκογϋνεςη, ςτην ανϊπτυξη και εξϋλιξη των ϐγκων ϐρχεων θα βοηθόςει ςτην κατανϐηςη του ρϐλου τουσ ςτην πορεύα τησ νϐςου και πιθανϐν να αποκαλϑψει νϋουσ ςτϐχουσ ςε ςχϋςη με την πρϐγνωςη, εξϋλιξη και θεραπεύα. Κατϊ την πορεύα τησ ογκογϋνεςησ, τα κακοόθη κϑτταρα εκκρύνουν διϊφορουσ διαλυτοϑσ παρϊγοντεσ που διεγεύρουν την ανϊπτυξό τουσ και ενεργοποιοϑν τα κϑτταρα του ςτρϔματοσ. Σα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ςυνθϋτουν ποικύλα βιοδραςτικϊ μϐρια που με την ςειρϊ τουσ διεγεύρουν περαιτϋρω την 113

114 κοπϐσ ανϊπτυξη του ϐγκου. Σϐςο τα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ϐςο και τα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα εμπλϋκονται ςτην αναδιοργϊνωςη του ECM ϋτςι ϔςτε να διευκολυνθεύ η ανϊπτυξη, μετακύνηςη και διόθηςη των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων. Οι PGs εύναι βιοδραςτικϊ μϐρια του ECM και η ϋκφραςό τουσ τροποποιεύται ςημαντικϊ ςτο μικροπεριβϊλλον του ϐγκου. Μεταβολϋσ τησ ϋκφραςησ των PGs απϐ τα κϑτταρα του ϐγκου και τα ςτρωματικϊ κϑτταρα επηρεϊζουν τα ςηματοδοτικϊ μονοπϊτια των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων, την ανϊπτυξη και επιβύωςό τουσ, την προςκϐλληςη και μετανϊςτευςό τουσ καθϔσ και τη δημιουργύα νεοαγγεύωςησ ςτον ϐγκο. Πολλϋσ μελϋτεσ ϋχουν δεύξει ϐτι PGs που εκκρύνονται ςτον ECM, ϐπωσ εύναι η versican και η decorin, ςυςςωρεϑονται ςτο ςτρϔμα διαφϐρων νεοπλαςιϔν. Η ςυςςϔρευςό τουσ ςχετύζεται με την πρϐοδο τησ νϐςου και επηρεϊζει την πρϐγνωςη των αςθενϔν αφοϑ οι αλληλεπιδρϊςεισ των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων με αυτϋσ τισ PGs ρυθμύζουν ςημαντικϋσ κυτταρικϋσ λειτουργύεσ (Sakko AJ et al. 2001, Ricciardelli C et al. 2002, Nikitovic D et al. 2006, Arslan F et al. 2007, Ricciardelli C et al. 1998, Touab M et al. 2002, Voutilainen K et al. 2003, Theocharis AD 2002, Pirinen R et al. 2005, Leivonen M et al. 2004; Pukkila M et al. 2007, Skandalis SS et al. 2006, Theocharis AD et al. 2003, Suwiwat S et al. 2004, Kodama J et al. 2007a, b, Newton TR et al. 2006, Troup S et al. 2003, Matsumine A et al. 2007, Nash MA et al. 2002, Köninger J et al. 2004). Η versican ςυντύθεται κυρύωσ απϐ τουσ διεγερμϋνουσ ινοβλϊςτεσ του ςτρϔματοσ του ϐγκου και εύναι αντι-προςκολλητικϐ μϐριο. Πιςτεϑεται ϐτι διευκολϑνει την τοπικό επϋκταςη των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων και ακολοϑθωσ τη διόθηςη και μετϊςταςό τουσ αφοϑ ελαττϔνει την ιςχυρό προςκϐλληςό τουσ ςτον ECM προϊγοντασ τη μετακύνηςό τουσ. Επιπλϋον, ςυγκεκριμϋνεσ περιοχϋσ του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ τησ διεγεύρουν τον πολλαπλαςιαςμϐ και μετανϊςτευςη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων προϊγοντασ την αγγειογϋνεςη. Αντιθϋτωσ η decorin, αν και υπερεκφρϊζεται ςε διϊφορεσ κακοόθειεσ, θεωρεύται ϐτι αποτελεύ ϋνα ογκο-καταςταλτικϐ μϐριο, αφοϑ αλληλεπιδρϊ με διϊφορουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ και τουσ υποδοχεύσ τουσ, καταςτϋλλοντασ τα ςηματοδοτικϊ μονοπϊτια τουσ (Goldoni S & Iozzo RV 2008). 114

115 κοπϐσ Εύναι γνωςτϐ, ϐτι η διαταραχό των ςηματοδοτικϔν μονοπατιϔν αποτελεύ χαρακτηριςτικϐ γνϔριςμα ςτη νεοπλαςύα, οπϐτε η ικανϐτητα τησ decorin να ελϋγχει και να καταςτϋλλει την ενεργοπούηςό τουσ ϋχει δειχθεύ ϐτι δρα προςτατευτικϊ ςτην ανϊπτυξη των ϐγκων. Η παρουςύα τησ versican και τησ decorin και η εμπλοκό τουσ ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων δεν ϋχει μελετηθεύ, οπϐτε ϋνασ απϐ τουσ ςτϐχουσ τησ διδακτορικόσ διατριβόσ όταν να μελετηθεύ η παρουςύα τουσ και να διερευνηθεύ η πιθανό ςυςχϋτιςη τησ ϋκφραςόσ τουσ με τη βιολογικό ςυμπεριφορϊ των ϐγκων των ϐρχεων. Αρχικϔσ, η ϋκφραςη των versican και decorin μελετόθηκε με ανοςοώςτοχημεύα ςε αρχειακϐ υλικϐ και τα αποτελϋςματα επιβεβαιϔθηκαν με ανοςοεντοπιςμϐ ςε περιοριςμϋνο αριθμϐ δειγμϊτων. τη ςυνϋχεια, η ϋκφραςό τουσ ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν και τη νεοαγγειογϋνεςη που παρατηρεύται ςτουσ ϐγκουσ. Οι PGs που εντοπύζονται ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη αποτελοϑν μια επιπλϋον ομϊδα μορύων που ϋχει δειχθεύ ϐτι ςυμμετϋχουν ςτην αλληλεπύδραςη των κυττϊρων μεταξϑ τουσ αλλϊ και ςτην αλληλεπύδραςό τουσ με τον ECM ρυθμύζοντασ ςημαντικϋσ κυτταρικϋσ λειτουργύεσ ϐπωσ εύναι ο κυτταρικϐσ πολλαπλαςιαςμϐσ, η προςκϐλληςη, μετανϊςτευςη και η κυτταρικό διαφοροπούηςη (Fears CY & Woods A 2006). Η syndecan-4 αλληλεπιδρϊ με διϊφορουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ και υποβοηθϊ την πρϐςδεςό τουσ με ειδικοϑσ υποδοχεύσ ςτη μεμβρϊνη προϊγοντασ την ενεργοπούηςη των ςηματοδοτικϔν μονοπατιϔν τουσ. Πολλϋσ μελϋτεσ ϋχουν δεύξει, ϐτι η ϋκφραςη κϊποιων μελϔν τησ οικογϋνειασ των syndecans (ιδιαύτερα η syndecan-1) επηρεϊζεται κατϊ την πορεύα τησ ογκογϋνεςησ ςε πολλοϑσ τϑπουσ νεοπλαςιϔν. Η syndecan-4 εύναι μϋλοσ τησ οικογϋνειασ των syndecans που δεν ϋχει μελετηθεύ επαρκϔσ. κοπϐσ τησ διδακτορικόσ διατριβόσ όταν να μελετηθεύ η ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων και η ςυςχϋτιςό τησ με το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των ϐγκων. Η ϋκφραςό τησ μελετόθηκε με τη χρόςη ανοςοώςτοχημεύασ ςε αρχειακϐ υλικϐ ενϔ η ϋκφραςη του γονιδύου τησ syndecan-4 μελετόθηκε με RT-PCR ςε περιοριςμϋνο αριθμϐ ιςτολογικϔν παραςκευαςμϊτων. Ο CD44, μια επιπλϋον μεμβρανικό PG, εύναι ϋνασ απϐ τουσ υποδοχεύσ του ΗΑ. Η αλληλεπύδραςό του με το ΗΑ ελϋγχει τη λειτουργύα του καρκινικοϑ κυττϊρου, 115

116 κοπϐσ μϋςω ενεργοπούηςησ διαφϐρων μονοπατιϔν. Ρυθμύζει την κυτταρικό προςκϐλληςη, τη μετανϊςτευςη, τον πολλαπλαςιαςμϐ, τη χημειοανθεκτικϐτητα και τη μετϊςταςη των καρκινικϔν κυττϊρων (Bourguignon LY 2008) (χόμα 13). Επιπλϋον, ο υποδοχϋασ CD44 εκφρϊζεται απϐ διϊφορα κϑτταρα του μικροπεριβϊλλοντοσ των καρκινικϔν κυττϊρων ϐπωσ εύναι τα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα, οι οςτεοκλϊςτεσ και ϊλλα (Toole BP et al. 2002). Σα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα υπερεκφρϊζουν υαλουρονικϐ οξϑ, ενεργοποιοϑν τον υποδοχϋα των κυττϊρων του ςτρϔματοσ και επϊγουν την ενεργοπούηςη και τη χημειοταξύα των ινοβλαςτϔν. Ο CD44 υπερεκφρϊζεται ςτα καρκινικϊ κϑτταρα που εμφανύζουν υψηλϐ μεταςτατικϐ δυναμικϐ και αποτελεύ ϋναν αξιϐπιςτο δεύκτη των πολυδϑναμων καρκινικϔν κυττϊρων (Al-Hajj M et al. 2003). Σα πολυδϑναμα καρκινικϊ κϑτταρα ϋχει δειχθεύ ϐτι διαθϋτουν αυξημϋνη ικανϐτητα μετανϊςτευςησ και δημιουργύασ μεταςτϊςεων ςε απομακρυςμϋνα ϐργανα κατϊ την πρϔιμη φϊςη τησ ανϊπτυξησ του ϐγκου και επιπλϋον εύναι υπεϑθυνα για την εμφϊνιςη δευτερογενϔν εντοπύςεων κατϊ τη φϊςη υποτροπόσ τησ νϐςου. Η ϋκφραςη του CD44 ϋχει μελετηθεύ μερικϔσ ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων και ϋχουν δημοςιευθεύ αντικρουϐμενα ευρόματα. τϐχοσ τησ διδακτορικόσ διατριβόσ όταν να διερευνηθεύ η ϋκφραςη και ο ρϐλοσ του CD44 ςε ςχϋςη με το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των ϐγκων ϐρχεων. Η ϋκφραςό του μελετόθηκε με τη χρόςη ανοςοώςτοχημεύασ ςε αρχειακϐ υλικϐ και ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. υμπεραςματικϊ, ςκοπϐσ τησ διδακτορικόσ διατριβόσ όταν να μελετηθεύ η παρουςύα των εξωκυττϊριων PGs, versican και decorin καθϔσ και των μεμβρανικϔν PGs, syndecan-4 και CD44 (standard isoform) και να διερευνηθεύ η πιθανό ςυςχϋτιςη τησ ϋκφραςόσ τουσ με τη βιολογικό ςυμπεριφορϊ των ϐγκων ϐρχεων που προϋρχονται απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα. Αρχικϔσ, η ϋκφραςη και ο εντοπιςμϐσ τουσ μελετόθηκε με ανοςοώςτοχημεύα ςε αρχειακϐ υλικϐ 71 αςθενϔν με ςεμινωματϔδεισ και μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ και τα αποτελϋςματα επιβεβαιϔθηκαν με ανοςοεντοπιςμϐ ό με μελϋτη τησ γονιδιακόσ ϋκφραςησ μϋςω RT-PCR ςε περιοριςμϋνο αριθμϐ δειγμϊτων. τη ςυνϋχεια, η παρουςύα των PGs 116

117 κοπϐσ ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν και τη νεοαγγειογϋνεςη που παρατηρεύται ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων. 117

118 118

119 119 ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΟ

120 120

121 Πειραματικϐ 1. ΑΠΟΜΟΝΨΗ ΚΑΙ ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΣΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΛΙΚΟ ΚΑΙ Η ΚΑΣΕΡΓΑΙΑ ΣΟΤ Οι ιςτού απϐ ϐγκουσ των ϐρχεων (n=7, τϋςςερισ αςθενεύσ με ςεμύνωμα και τρεισ αςθενεύσ με μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ) που μελετόθηκαν προόλθαν απϐ αςθενεύσ που χειρουργόθηκαν ςτην Ουρολογικό Κλινικό του Πανεπιςτημιακοϑ Γενικοϑ Νοςοκομεύου Πατρϔν. Οι αςθενεύσ όταν ϊνδρεσ ηλικύασ ετϔν. Οι ιςτού παρελόφθηςαν αμϋςωσ μετϊ την αφαύρεςη, εκπλϑθηκαν με φυςιολογικϐ ορϐ και τοποθετόθηκαν ςτουσ - 70 ο C. Οι φυςιολογικού ιςτού (n=6) που χρηςιμοποιόθηκαν ωσ πρϐτυπα αναφορϊσ ςτη μελϋτη ςυλλϋχθηκαν απϐ νεκροτομικϐ υλικϐ. Όλοι οι φυςιολογικού ιςτού προόλθαν απϐ ϊνδρεσ ηλικύασ ετϔν, εκπλϑθηκαν με φυςιολογικϐ ορϐ, ελϋχθηςαν μακροςκοπικϊ και τοποθετόθηκαν ςτουσ -70 ο C. Οι ιςτού κονιοποιόθηκαν ςε υγρϐ ϊζωτο και τμόματα τουσ χρηςιμοποιόθηκαν για την εκχϑλιςη των PGs, ενϔ μϋροσ των ιςτϔν χρηςιμοποιόθηκε για εκχϑλιςη RNA. Εβδομόντα ϋνα δεύγματα ιςτϔν απϐ αςθενεύσ με ϐγκουσ ϐρχεων που υπεβλόθηςαν ςε ορχεκτομό ςτο Πανεπιςτημιακϐ Γενικϐ Νοςοκομεύο Πατρϔν ςυμπεριλόφθηςαν ςτην αναδρομικό μελϋτη με τη χρόςη ανοςοώςτοχημεύασ. Σα δεύγματα των ιςτϔν επιλϋχθηκαν απϐ το αρχεύο του Εργαςτηρύου Παθολογικόσ Ανατομύασ του Πανεπιςτημιακοϑ Γενικοϑ Νοςοκομεύου Πατρϔν. Κανϋνασ απϐ τουσ αςθενεύσ δεν εύχε υποβληθεύ ςε χημειοθεραπεύα ό ακτινοθεραπεύα πριν τη χειρουργικό επϋμβαςη. Η μϋςη ηλικύα των αςθενϔν όταν 30 ετϔν (διακϑμανςη ετϔν). Η μελϋτη πραγματοποιόθηκε με τη ςϑμφωνη γνϔμη των αςθενϔν και ςϑμφωνα με τουσ κανϐνεσ του Νοςοκομεύου (Επιςτημονικό Επιτροπό, Επιτροπό Ηθικόσ και Δεοντολογύασ) και την ϋγκριςη του Σμόματοσ Ιατρικόσ του Πανεπιςτημύου Πατρϔν. Η ςταδιοπούηςη των ϐγκων και τα ιςτοπαθολογικϊ ευρόματα αξιολογόθηκαν με βϊςη την ταξινϐμηςη των ϐγκων ϐρχεων του Παγκϐςμιου Οργανιςμοϑ Τγεύασ (WHO). Έπειτα απϐ επιςκϐπηςη ϐλων των διαθϋςιμων ιςτολογικϔν τεμαχύων μετϊ απϐ χρϔςη με ηωςύνη αιματοξυλύνη, 121

122 Πειραματικϐ επιλϋχθηκαν αντιπροςωπευτικϊ ιςτοτεμϊχια και ελόφθηςαν διαδοχικϋσ τομϋσ για την πραγματοπούηςη τησ ϋρευνασ ςτα πλαύςια τησ διδακτορικόσ διατριβόσ ΕΚΦΤΛΙΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ Οι ιςτού απϐ επτϊ αςθενεύσ με ϐγκουσ ϐρχεων και απϐ ϋξι φυςιολογικοϑσ ϐρχεισ, που ελόφθηςαν απϐ νεκροτομικϐ υλικϐ, εκχυλύςτηκαν με ρυθμιςτικϐ διϊλυμα 4 M GdnHCl, 50 mm AcONa, ph 5.8, που περιεύχε 1 % Triton X-100 και αναςτολεύσ πρωτεαςϔν (0.1 M αμινοκαπροώκϐ οξϑ, 10 mm EDTANa2, 5 mm υδροχλωρικό βενζαμιδύνη, 1 mm PMSF και 10 mm N-αιθυλ-μηλεώνιμύδιο). Η εκχϑλιςη πραγματοποιόθηκε για 24 ϔρεσ ςτουσ 4 ο C με όπια ανακύνηςη χρηςιμοποιϔντασ 10 ml εκχυλιςτικοϑ μϋςου ανϊ γραμμϊριο ιςτοϑ. Σα εκχυλύςματα μετρόθηκαν για το περιεχϐμενϐ τουσ ςε πρωτεϗνη και ύςεσ ποςϐτητεσ πρωτεϗνησ (30 g) κατακρημνύςτηκαν με την προςθόκη 4 ϐγκων αιθανϐλησ ςτουσ 4 ο C για 2 ϔρεσ. τη ςυνϋχεια, τα δεύγματα φυγοκεντρόθηκαν ςτισ g για 5 λεπτϊ και τα ιζόματα διαλυτοποιόθηκαν ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα 0.1 Μ Tris-οξικϐ ph 7.3 και υποβλόθηκαν ςε πϋψη με χονδροώτινϊςη ABC ΕΝΖΤΜΙΚΗ ΚΑΣΕΡΓΑΙΑ ΜΕ ΦΟΝΔΡΟΪΣΙΝΑΗ ABC Η χονδροώτινϊςη ABC (EC ) εύναι λυϊςη, η οπούα αποικοδομεύ την CS, την DS και το ΗΑ. Η δρϊςη τησ οδηγεύ ςτη δημιουργύα ακϐρεςτων διςακχαριτϔν ςτη θϋςη C-4 του ουρονικοϑ οξϋοσ με μϋγιςτο απορρϐφηςησ ςτα 231 nm λϐγω τησ ϑπαρξησ ςυζυγύασ του διπλοϑ δεςμοϑ τουσ με την καρβοξυλικό ομϊδα του C-5 του ουρονικοϑ οξϋοσ. Η ενζυμικό κατεργαςύα πραγματοποιόθηκε ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα 0.1 M AcONa M Tris, ph 7.3, ςτουσ 37 ο C για 12 ϔρεσ. Η ποςϐτητα των ενζϑμων που χρηςιμοποιόθηκαν όταν 0.01 units ανϊ 10 μg ουρονικοϑ οξϋοσ. Κατϊ την πϋψη των PGs και προκειμϋνου να μην υπϊρξει αποικοδϐμηςη των πρωτεώνικϔν κορμϔν των PGs απϐ πιθανϋσ προςμεύξεισ των ενζϑμων απϐ 122

123 Πειραματικϐ πρωτεϊςεσ ςτο ρυθμιςτικϐ διϊλυμα προςτϋθηκε το μεύγμα των αναςτολϋων πρωτεαςϔν που προαναφϋρθηκε ΑΝΑΛΤΣΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΦΡΨΜΑΣΟΜΕΣΡΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ Προςδιοριςμϐσ πρωτεϗνησ Ο προςδιοριςμϐσ των πρωτεώνϔν ϋγινε ςϑμφωνα με τη μϋθοδο Bradford (Bradford MM 1976). Οι πρωτεϗνεσ ςε ϐξινο περιβϊλλον ςχηματύζουν με τη χρωςτικό Coomassie Brilliant Blue G-250 ϋγχρωμα ςϑμπλοκα με μϋγιςτο απορρϐφηςησ ςτα 595 nm. Για την καταςκευό πρϐτυπων καμπυλϔν χρηςιμοποιόθηκαν διαλϑματα βϐειασ αλβουμύνησ. Η ευαιςθηςύα και η γραμμικϐτητα τησ μεθϐδου περιλαμβϊνει ποςϊ πρωτεϗνησ εϑρουσ μg / ml ΗΛΕΚΣΡΟΥΟΡΗΣΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ Ο ηλεκτροφορητικϐσ διαχωριςμϐσ των μορύων βαςύζεται ςτην αρχό τησ κύνηςησ φορτιςμϋνων μορύων μϋςα ςε πόκτωμα ό ςτην επιφϊνεια υλικοϑ (μεμβρϊνεσ οξικόσ κυτταρύνησ) υπϐ την επύδραςη ενϐσ εξωτερικϊ εφαρμοζϐμενου ηλεκτρικοϑ πεδύου. Σα φορτιςμϋνα μϐρια υπϐ την επύδραςη του ηλεκτρικοϑ πεδύου αναγκϊζονται να κινηθοϑν προσ τον αντύθετα φορτιςμϋνο πϐλο. Σαυτϐχρονα, το πόκτωμα, αναλϐγωσ τησ πυκνϐτητϊσ του, δρα ωσ μοριακϐσ ηθμϐσ, επιτρϋποντασ τη διϋλευςη μορύων μικροϑ μεγϋθουσ ό ςυγκρατϔντασ κϊποια ϊλλα μϐρια που ϋχουν ςυγκριτικϊ μεγαλϑτερο μϋγεθοσ. Έτςι, ϐταν τα μϐρια εμφανύζουν το ύδιο φορτύο, αυτϊ διαχωρύζονται ανϊλογα με το μϋγεθϐσ τουσ. Αντιθϋτωσ, ϐταν η ηλεκτροφϐρηςη των μορύων γύνεται ςτην επιφϊνεια μεμβρανϔν οξικόσ κυτταρύνησ, ϐλα τα μϐρια ϋχουν την ύδια δυνατϐτητα να κινηθοϑν προσ τον αντύθετα φορτιςμϋνο πϐλο. Έτςι, τα μϐρια που εμφανύζουν τη μεγαλϑτερη πυκνϐτητα φορτύου κινοϑνται ταχϑτερα προσ τον αντύθετα φορτιςμϋνο πϐλο και με αυτϐν τον τρϐπο διαχωρύζονται ανϊλογα με την πυκνϐτητα 123

124 Πειραματικϐ φορτύου τουσ. ημαντικϐ ρϐλο ςτην ηλεκτροφορητικό κινητικϐτητα των μορύων ϋχουν τα χαρακτηριςτικϊ του ρυθμιςτικοϑ διαλϑματοσ που χρηςιμοποιεύται (ph και ιοντικό ιςχϑσ του ρυθμιςτικοϑ διαλϑματοσ), καθϔσ μποροϑν να επηρεϊςουν τον διαχωριςμϐ των μορύων. Ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα πολυακρυλαμιδύου παρουςύα SDS (SDS-PAGE) ε αυτϐ το εύδοσ τησ ηλεκτροφϐρηςησ το πόκτωμα του πολυακρυλαμιδύου δημιουργεύται απϐ τον πολυμεριςμϐ του ακρυλαμιδύου διαςταυροϑμενο απϐ Ν,Ν μεθυλενο-δισ-ακρυλαμύδιο παρουςύα του απορρυπαντικοϑ θειώκοϑ δωδεκυλικοϑ νατρύου (SDS). Σο πόκτωμα μπορεύ να εύναι τησ ύδιασ πυκνϐτητασ ςε πολυακρυλαμύδιο ςε ϐλο το μόκοσ του (ςυνεχϋσ) ό να εύναι διαβαθμιςμϋνησ πυκνϐτητασ (αςυνεχϋσ). Σα πηκτϔματα που χρηςιμοποιόθηκαν όταν πυκνϐτητασ πολυακρυλαμιδύου 10%, με πόκτωμα επιςτούβαξησ πυκνϐτητασ πολυακρυλαμιδύου 4%. Η λεπτό ςτοιβϊδα πηκτϔματοσ μικρόσ περιεκτικϐτητασ ςε πολυακρυλαμύδιο ςτην κορυφό του πηκτϔματοσ, ϐπου προςτύθεται το δεύγμα, ςυγκεντρϔνει και διευκολϑνει τα μϐρια να ειςϋλθουν ςτο κυρύωσ πόκτωμα για να διαχωριςτοϑν. Σο απορρυπαντικϐ SDS δεςμεϑεται ςτισ πρωτεϗνεσ ςε αναλογύα 1.4 g SDS / g πρωτεϗνησ προςδύδοντασ ςε ϐλεσ τισ πρωτεϗνεσ την ύδια πυκνϐτητα φορτύου. Αυτϐ ϋχει ωσ αποτϋλεςμα ο διαχωριςμϐσ των μορύων να γύνεται αυςτηρϊ μϐνο με βϊςη το μοριακϐ τουσ μϋγεθοσ. την SDS-PAGE τα δεύγματα μπορεύ να υποςτοϑν κατεργαςύα με αναγωγικϊ αντιδραςτόρια, ϐπωσ η 2-μερκαπτο αιθανϐλη. Αυτϐ ϋχει ωσ αποτϋλεςμα την αναγωγό των διςουλφιδικϔν δεςμϔν και την αποδιϊταξη των μορύων, ϋτςι ϔςτε ϐλεσ οι πρωτεϗνεσ, ανεξϊρτητα απϐ το φυςικϐ τουσ ςχόμα, να αποκτόςουν γραμμικό δομό και να κινηθοϑν ςτο πόκτωμα ςϑμφωνα με το μοριακϐ μϋγεθϐσ τουσ (Laemmli UK 1970). Σα δεύγματα τοποθετοϑνται ςτο πόκτωμα αφοϑ πρϔτα διαλυτοποιηθοϑν ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα Μ Tris-HCl, ph 6.8 που περιϋχει 2 mm EDTANa2, 5% (w/v) SDS, 20% (v/v) γλυκερϐλη και 0.04% (w/v) μπλε τησ βρωμοφαινϐλησ ωσ δεύκτη. Η ϊνοδοσ τησ ςυςκευόσ εύναι βυθιςμϋνη ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα M Tris-HCl, ph 8.7, που περιϋχει 0.05 mm EDTANa2, 0.1% (w/v) SDS, και Μ γλυκύνη. Σο ρυθμιςτικϐ διϊλυμα τησ καθϐδου προκϑπτει απϐ το ρυθμιςτικϐ 124

125 Πειραματικϐ διϊλυμα τησ ανϐδου αν αυτϐ αραιωθεύ ςε αναλογύα 1:2. Ακολοϑθωσ εφαρμϐζουμε ηλεκτρικϐ πεδύο 150 V για λεπτϊ οπϐτε τα ςϑμπλοκα πρωτεϗνησαπορρυπαντικοϑ κινοϑνται προσ την κϊθοδο και διαχωρύζονται ανϊλογα με το μοριακϐ τουσ μϋγεθοσ. Ο προςδιοριςμϐσ του μοριακοϑ μεγϋθουσ γύνεται ϋπειτα απϐ ςϑγκριςη με το μοριακϐ μϋγεθοσ προτϑπων δειγμϊτων πρωτεώνϔν που ηλεκτροφοροϑνται παρϊλληλα με τα δεύγματα ΑΝΟΟΛΟΓΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ Ανοςολογικό ταυτοπούηςη PGs με Western blotting Μετϊ την ηλεκτροφϐρηςη των PGs ςε πόκτωμα πολυακρυλαμιδύου, το πόκτωμα μεταφϋρονταν πϊνω ςε μεμβρϊνη Immobilon P που εύχε προηγουμϋνωσ διαβραχεύ με μεθανϐλη και ςτη ςυνϋχεια με ρυθμιςτικϐ διϊλυμα 0.05 M Tris-HCl, ph 8.3. Οι PGs μεταφϋρονταν απϐ το πόκτωμα ςτη μεμβρϊνη υπϐ την επύδραςη ρεϑματοσ εντϊςεωσ 80 ma για 20 ϔρεσ ςτουσ 4 ο C. Ο ϋλεγχοσ για τη μεταφορϊ των PGs ςτη μεμβρϊνη πραγματοποιόθηκε με χρϔςη τησ μεμβρϊνησ με 0.5% (w/v) Ponceau-S ςε 1% (w/v) AcONa για 3 λεπτϊ και ακολοϑθωσ ϋκπλυςη τησ μεμβρϊνησ με 5% (w/v) AcONa και με ρυθμιςτικϐ διϊλυμα φωςφωρικϔν (PBS) παρουςύα 0.1% (v/v) Tween 20 (PBS-T) ϔςτε να απομακρυνθεύ πλόρωσ η χρωςτικό. Επύςησ, ο ϋλεγχοσ τησ ηλεκτρομεταφορϊσ ϋγινε και με τη χρόςη προχρωματιςμϋνων πρϐτυπων δειγμϊτων. Μετϊ την ηλεκτρομεταφορϊ των PGs, η μεμβρϊνη εμβαπτύςτηκε ςε διϊλυμα 5% (w/v) ςκϐνησ γϊλακτοσ ελεϑθερησ λιπαρϔν, ςε PBS-T για 1 ϔρα ςε θερμοκραςύα δωματύου υπϐ ανϊδευςη, με ςκοπϐ να επικαλυφθεύ η ελεϑθερη επιφϊνεια τησ μεμβρϊνησ απϐ την καζεϗνη του γϊλακτοσ και να αποφευχθεύ ϋτςι η μη ειδικό δϋςμευςη των αντιςωμϊτων ς αυτό. Η μεμβρϊνη εκπλϑθηκε (4x10 λεπτϊ) με διϊλυμα PBS-T ϔςτε να απομακρυνθεύ η περύςςεια τησ πρωτεϗνησ του γϊλακτοσ. Ακολοϑθωσ, η μεμβρϊνη επωϊςτηκε με διϊλυμα 1% (w/v) ςκϐνησ γϊλακτοσ ςε PBS-T, το οπούο περιεύχε το αντύςωμα ϋναντι τησ υπϐ ανύχνευςη PGs (αραύωςη 1: 2000, μονοκλωνικϊ 2-Β-1 ϋναντι τησ versican και 6-Β-6 ϋναντι τησ decorin, προερχϐμενα απϐ την εταιρύα Seikagaku, Co.), για 1 ϔρα ςε θερμοκραςύα δωματύου υπϐ ανϊδευςη. Η μεμβρϊνη εκπλϑθηκε (4x10 125

126 Πειραματικϐ λεπτϊ) με PBS-T για την απομϊκρυνςη τησ περύςςειασ του αντιςϔματοσ και ςτη ςυνϋχεια επωϊςτηκε για 1 ϔρα ςτην ύδια θερμοκραςύα με ειδικϐ αντύςωμα αύγασ ϋναντι επύμυοσ, ςυνδεδεμϋνο με υπεροξειδϊςη (αραύωςη 1:5000 ςε PBS-T) ϋναντι του αντιςϔματοσ που χρηςιμοποιόθηκε ςτο προηγοϑμενο ςτϊδιο. Ακολοϑθηςαν εκπλϑςεισ (4x10 λεπτϊ) τησ μεμβρϊνησ με PBS-T. Η εμφϊνιςη των PGs που αντιδροϑν με τα αντιςϔματα επιτεϑχθηκε με την τεχνικό τησ χημειοφωταϑγειασ (ECL απϐ την εταιρύα Amersham). Η υπεροξειδϊςη του δεϑτερου αντιςϔματοσ καταλϑει την οξεύδωςη του υποςτρϔματοσ luminol ςε αλκαλικϋσ ςυνθόκεσ. Η διεγερμϋνη luminol μεταπύπτει ςτη ςταθερό τησ κατϊςταςη μετϊ την εκπομπό φωτϐσ. Η ενύςχυςη του φωτϐσ επιτυγχϊνεται με την παρουςύα χημικϔν ενιςχυτϔν, ϐπωσ εύναι οι φαινϐλεσ. Έτςι, οι PGs αποτυπϔνονται ςε φωτογραφικϐ φύλμ, το οπούο εμφανύζει αμαϑρωςη ςτα ςημεύα ϐπου οι PGs αντιδροϑν με τα χρηςιμοποιοϑμενα αντιςϔματα. 2. ΑΠΟΜΟΝΨΗ ΣΟΤ RNA ΚΑΙ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ ΜΕ RT-PCR 2.1. ΕΚΦΤΛΙΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΨΗ ΣΟΤ RNA Σο RNA βρύςκεται ςτον πυρόνα, το κυτταρϐπλαςμα και ςτα μιτοχϐνδρια των ευκαρυωτικϔν κυττϊρων. Σο κυτταροπλαςματικϐ RNA αποτελεύται απϐ ριβοςωμικϐ RNA (rrna), μεταφορικϐ RNA (trna), αγγελιοφϐρο RNA (mrna) και ϊλλα μικρϊ τμόματα RNA. τον πυρόνα βρύςκεται το ετεροπυρηνικϐ RNA (hnrna), πρϐδρομοσ μορφό RNA. Μϐνο το 1-2% του ολικοϑ RNA ςτα ευκαρυωτικϊ κϑτταρα εύναι mrna, ενϔ η πλειοψηφύα του εύναι rrna. Η επιτυχόσ απομϐνωςη ακϋραιου RNA απαιτεύ την πραγματοπούηςη τεςςϊρων βημϊτων που περιλαμβϊνουν την επιτυχό διϊςπαςη των κυττϊρων, τη μετουςύωςη των ςυμπλϐκων νουκλεοπρωτεώνϔν, την απενεργοπούηςη τησ δρϊςησ των ενδογενϔν ριβονουκλεαςϔν (RNase), και τον καθαριςμϐ του RNA απϐ DNA και πρωτεϗνεσ. Σο ςημαντικϐτερο βόμα εύναι η απενεργοπούηςη τησ δρϊςησ των ενδογενϔν 126

127 Πειραματικϐ ριβονουκλεαςϔν, που απελευθερϔνονται απϐ οργανύδια τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ κατϊ τη διϊςπαςη του κυττϊρου. Η επιλογό τησ μεθϐδου απομϐνωςησ του RNA εξαρτϊται απϐ την προϋλευςη, το εύδοσ, τη διαθεςιμϐτητϊ του και την ποςϐτητα του αρχικοϑ δεύγματοσ. Σο RNA εύναι επιρρεπϋσ ςτην αποικοδϐμηςη και πρϋπει να λαμβϊνονται πολλϋσ προφυλϊξεισ κατϊ την απομϐνωςό του. Όλεσ οι μϋθοδοι απομϐνωςησ του RNA χρηςιμοποιοϑν ιςχυρϊ μετουςιωτικϊ για να παρεμποδύςουν τισ ενδογενεύσ RNases και να ληφθεύ ανϋπαφο το RNA. Οι πιο κοινϋσ μϋθοδοι απομϐνωςησ του RNA διακρύνονται ςε δϑο κατηγορύεσ: ςε αυτϋσ που χρηςιμοποιοϑν 4Μ θειοκυανικό γουανιδύνη και ςε αυτϋσ που χρηςιμοποιοϑν φαινϐλη και SDS. Η πορεύα τησ απομϐνωςησ του RNA ϋγινε με τη μϋθοδο τησ θειοκυανικόσ γουανιδύνησ και τησ -μερκαπτοαιθανϐλησ (Nucleospin RNA II, Macherey-Nagel, Germany) και περιλαμβϊνει τα παρακϊτω ςτϊδια: 1. Δεύγματα φυςιολογικϔν και παθολογικϔν ιςτϔν ομογενοποιόθηκαν, αφοϑ τοποθετόθηκαν ςε πλαςτικοϑσ δοκιμαςτικοϑσ ςωλόνεσ, χρηςιμοποιϔντασ ωσ αποδιατακτικϐ μϋςο θειοκυανικό γουανιδύνη για τη διϊςπαςη των νουκλεοπρωτεώνικϔν ςυμπλϐκων, το οπούο περιεύχε -μερκαπτοαιθανϐλη για την απενεργοπούηςη των ριβονουκλεαςϔν. Ακολοϑθηςε φυγοκϋντρηςη ςτισ g για 10 λεπτϊ και το RNA παραμϋνει ςτο υπερκεύμενο. 2. Κατακρόμνιςη του RNA με την προςθόκη ύςου ϐγκου αιθανϐλησ 70%, προςθόκη ςτο ϊνω μϋροσ ειδικόσ ςτόλησ και φυγοκϋντρηςη ςτισ g για 1 λεπτϐ. Έκπλυςη του κατακρημνιςμϋνου RNA και φυγοκϋντρηςη ςτισ g για 1 λεπτϐ. 3. Προςθόκη ςτην κορυφό τησ ςτόλησ δεοξυριβονουκλεϊςησ (DNase I) για την πϋψη του DNA παρουςύα MnCl2 για την απομϊκρυνςη υπολειμμϊτων DNA. Επϔαςη για 15 λεπτϊ ςε θερμοκραςύα δωματύου. 4. Προςθόκη διαλϑματοσ που περιϋχει 2 Μ ιςοθειοκυανικό γουανιδύνη, 4 mm Tris-HCl, ph 7.5, που περιϋχει 25% (v/v) αιθανϐλη για την αναςτολό τησ DNase I. Υυγοκϋντρηςη ςτισ g για 1 λεπτϐ. 127

128 Πειραματικϐ 5. Περαιτϋρω καθαριςμϐσ γύνεται με διϊλυμα ϋκπλυςησ τησ ςτόλησ που περιϋχει 60 mm οξικοϑ καλύου, 10 mm Tris-HCl, ph 7.5 και 60% (v/v) αιθανϐλη για την απομϊκρυνςη αλϊτων, πρωτεώνϔν και διαφϐρων κυτταρικϔν υπολειμμϊτων, τρεισ φορϋσ και κϊθε φορϊ ακολουθεύ φυγοκϋντρηςη ςτισ g για 1 λεπτϐ. 6. Έκλουςη του RNA απϐ τη ςτόλη με νερϐ ελεϑθερο νουκλεαςϔν για την παραλαβό του RNA με φυγοκϋντρηςη ςτισ g για 1 λεπτϐ. 7. Σα δεύγματα που περιεύχαν το RNA τοποθετόθηκαν ςτουσ - 70 o C. Σα ποςϊ και η καθαρϐτητα του απομονωμϋνου RNA προςδιορύςτηκαν φωτομετρϔντασ τα δεύγματα ςτα 260 nm, 280 nm και υπολογύζοντασ τον λϐγο A260nm / A280nm αντύςτοιχα (A260nm= 1 αντιςτοιχεύ ςε ςυγκϋντρωςη 40 μg RNA / ml και ϐταν ο λϐγοσ A260nm / A280nm εύναι μεταξϑ 1.7 και 2.0 τϐτε η καθαρϐτητα του RNA θεωρεύται ικανοποιητικοϑ βαθμοϑ) ΠΑΡΑΚΕΤΗ cdna Η παραςκευό ςυμπληρωματικοϑ cdna των ςυνολικϔν αγγελιοφϐρων RNA (mrna), τα οπούα περιϋχονται ςτο ςυνολικϐ RNA που απομονϔθηκε απϐ τουσ ιςτοϑσ, εύναι το πρϔτο βόμα τησ ανϊλυςησ RT-PCR και πραγματοποιόθηκε ςϑμφωνα με το πρωτϐκολλο που προτεύνεται απϐ τον προμηθευτό των αντιδραςτηρύων (Takara). Για την παραςκευό του cdna χρηςιμοποιόθηκε 1 μg ςυνολικοϑ RNA απϐ κϊθε δεύγμα ςτο οπούο προςτϋθηκε 1 μl random 6mers εκκινητϋσ αρχικόσ ςυγκϋντρωςησ 50 μμ και 1 μl μεύγματοσ dntps αρχικόσ ςυγκϋντρωςησ 10 μμ το καθϋνα και νερϐ ελεϑθερο νουκλεαςϔν ϔςτε ο ςυνολικϐσ ϐγκοσ να εύναι 10 μl. Σα δεύγματα μετουςιϔθηκαν ςτουσ 65 o C για 5 λεπτϊ και τοποθετόθηκαν ςε πϊγο. τη ςυνϋχεια προςτϋθηκαν 4 μl Prime Script Buffer, 0.5 μl αναςτολϋα των ριβονουκλεαςϔν (40U/μl) και 1 μl Prime Script αντύςτροφη μεταγραφϊςη (200U/μl) και νερϐ ελεϑθερο νουκλεαςϔν ϔςτε ο ςυνολικϐσ ϐγκοσ να εύναι 20 μl. Σα δεύγματα επωϊςτηκαν ςτουσ 30 o C για 10 λεπτϊ και ςτη ςυνϋχεια ςτουσ 42 o C για 60 λεπτϊ. Σελικϊ, τα ϋνζυμα απενεργοποιόθηκαν με θϋρμανςη ςτουσ 95 o C για 5 λεπτϊ. Σα 128

129 Πειραματικϐ μϐρια του cdna που παραςκευϊςτηκαν χρηςιμοποιοϑνται ωσ εκμαγεύα για την ενύςχυςη των μορύων cdna που αντιςτοιχοϑν ςτα μϐρια mrna των πρωτεογλυκανϔν που μασ ενδιαφϋρει να μελετόςουμε την ϋκφραςό τουσ ΑΛΤΙΔΨΣΗ ΑΝΣΙΔΡΑΗ ΠΟΛΤΜΕΡΑΗ Η αλυςιδωτό αντύδραςη πολυμερϊςησ ϋχει ωσ ςκοπϐ τον πολλαπλαςιαςμϐ των μορύων του cdna που αντιςτοιχοϑν ςε αρχικϊ μϐρια mrna και τα οπούα κωδικοποιοϑν τουσ ιςϐτυπουσ των πρωτεογλυκανϔν που μελετϔνται. την αντύδραςη αυτό χρηςιμοποιοϑνται ολιγονουκλεοτύδια εκκινητϋσ (16-24 νουκλεοτύδια) ςυμπληρωματικϊ για το 3 ϊκρο (upstream primer) και το 5 ϊκρο (downstream primer) των μορύων cdna που μασ ενδιαφϋρουν. Οι εκκινητϋσ δεςμεϑονται ςτουσ κλϔνουσ του cdna (οι κλϔνοι αρχικϊ αποκολλοϑνται απϐ τουσ ςυμπληρωματικοϑσ κλϔνουσ του mrna που χρηςιμοποιόθηκαν για την παραςκευό τουσ) και με τη δρϊςη τησ DNA εξαρτϔμενησ DNA πολυμερϊςησ ςυντύθενται κλϔνοι DNA ςυμπληρωματικού του cdna των μορύων που μασ ενδιαφϋρουν και παρουςιϊζουν την ύδια αλληλουχύα με το mrna των μορύων αλλϊ αποτελοϑνται απϐ τα αντύςτοιχα δεοξυ-ριβονουκλεοτύδια. Η διαδικαςύα επαναλαμβϊνεται πολλϋσ φορϋσ (20-50 κϑκλουσ) με αποτϋλεςμα την ενύςχυςη του cdna εκατομμϑρια φορϋσ. Σο μεύγμα τησ αντύδραςησ αποτελεύται απϐ 10 ng cdna, 5 μl 10 Φ Optimized DyNAzyme buffer, 1 μl dntps αρχικόσ ςυγκϋντρωςησ 10 mm, 0.5 μμ εκκινητϔν, 1 μl DyNAzyme II DNA polymerase τελικόσ ςυγκϋντρωςησ 0.04 U/μl του μεύγματοσ και νερϐ ελεϑθερο νουκλεαςϔν ϔςτε ο ςυνολικϐσ ϐγκοσ να εύναι 50 μl. την ςυνϋχεια πραγματοποιόθηκαν 35 κϑκλοι τησ αντύδραςησ για το γονύδιο τησ Syndecan-4 και 30 κϑκλοι για το γονύδιο αναφορϊσ αφυδρογονϊςη τησ 3 φωςφορικόσ γλυκεραλδεϑδησ (GAPDH). Κϊθε κϑκλοσ τησ PCR αποτελεύται απϐ τα εξόσ βόματα: 1. Αρχικϊ μετουςιϔνονται τα δύκλωνα μϐρια cdna-mrna (κατϊ την ϋναρξη τησ αντύδραςησ) ό DNA-DNA (που δημιουργοϑνται κατϊ την εξϋλιξη τησ αντύδραςησ), 129

130 Πειραματικϐ με θϋρμανςη ςτουσ 94 o C για 1 λεπτϐ, οπϐτε οι δϑο κλϔνοι αποχωρύζονται ο ϋνασ απϐ τον ϊλλο. 2. Ακολοϑθωσ, ελαττϔνεται η θερμοκραςύα ςτουσ 60 o C και το μεύγμα παραμϋνει ς αυτό τη θερμοκραςύα για 1 λεπτϐ, ϋτςι ϔςτε να προςδεθοϑν οι εκκινητϋσ (Syndecan-4, upstream: CTCCTAGAAGGCCGATACTTCT, downstream: GGACCTCCGTTCTCCAAAGAT; GAPDH, upstream: ACATCATCCCTGCCTCTACTGG, downstream: AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC), με απϐλυτη ειδικϐτητα με τουσ κλϔνουσ DNA-ςτϐχουσ. 3. τη ςυνϋχεια ξεκινϊ η ςϑνθεςη του νϋου κλϔνου DNA με την προςθόκη νουκλεοτιδύων απϐ την πολυμερϊςη ςτουσ εκκινητϋσ. Η διαδικαςύα τησ επιμόκυνςησ διαρκεύ 1 λεπτϐ και πραγματοποιεύται ςτουσ 72 o C. Μετϊ το τϋλοσ τησ επιμόκυνςησ, η αντύδραςη ξεκινϊ πϊλι απϐ το ςτϊδιο 1, ϐπου μετουςιϔνονται τα μϐρια DNA που δημιουργόθηκαν και ακολοϑθωσ ςυντύθενται νϋα μϐρια. Εύναι φανερϐ ϐτι με κϊθε νϋο κϑκλο ϋχουμε διπλαςιαςμϐ των μορύων DNA που ςυντύθενται, επομϋνωσ ςτο τϋλοσ των 35 κϑκλων το αρχικϐ cdna-ςτϐχοσ ϋχει ενιςχυθεύ ςημαντικϊ ΗΛΕΚΣΡΟΥΟΡΗΗ ΚΑΙ ΠΟΟΣΙΚΗ ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΨΝ ΠΡΟΪΟΝΣΨΝ ΣΗ PCR Ε ΠΗΚΣΨΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗ Σα προώϐντα τησ RT-PCR ανϊλυςησ ηλεκτροφορόθηκαν ςε πηκτϔματα 2% (w/v) αγαρϐζησ ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα Tris-Βορικϐ νϊτριο-edta, ph 8.3 (TBE) που περιεύχε 1 μg / ml βρωμιοϑχο αιθύδιο (EtBr) ό Gelstar Stain (5 l χρωςτικόσ / 50 ml TBE). Κϊθε δεύγμα (16 μl) αναμεύχθηκε με 3 μl διαλϑματοσ 10 mm Tris-HCl, ph 7.5, 50 mm EDTANa2, 10% (v/v) Ficoll και 0.25% (w/v) μπλϋ τησ βρωμοφαινϐλησ και τοποθετόθηκε ςτο πόκτωμα. Η ηλεκτροφϐρηςη πραγματοποιόθηκε εφαρμϐζοντασ ηλεκτρικϐ πεδύο 75 V για 75 λεπτϊ, ενϔ τϐςο η ϊνοδοσ ϐςο και η κϊθοδοσ όταν βυθιςμϋνεσ ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα 0.5 Μ TBE. Η ανύχνευςη των προώϐντων τησ αντύδραςησ PCR ϋγινε με τοποθϋτηςη των πηκτωμϊτων πϊνω ςε λϊμπα υπεριϔδουσ ακτινοβολύασ, αφοϑ οι φθορύζουςεσ ενϔςεισ ειςϋρχονται μεταξϑ 130

131 Πειραματικϐ των κλϔνων του δύκλωνου DNA προςδύδοντασ ς αυτϐ την ιδιϐτητα του φθοριςμοϑ. Σα πηκτϔματα φωτογραφόθηκαν χρηςιμοποιϔντασ CCD κϊμερα και η φωτογραφύα αναλϑθηκε με ϋνα πρϐγραμμα ανϊλυςησ εικϐνασ (UNIDocMv version 99.03, UVI Tech, Cambridge, UK). Ποςοτικό εκτύμηςη των προώϐντων τησ ανϊλυςησ προϋκυψε ϋπειτα απϐ μϋτρηςη και ολοκλόρωςη του εκπεμπϐμενου φθοριςμοϑ των ζωνϔν των πηκτωμϊτων αγαρϐζησ χρηςιμοποιϔντασ το πρϐγραμμα ανϊλυςησ εικϐνασ που προαναφϋρθηκε. Ο λϐγοσ των τιμϔν του φθοριςμοϑ για κϊθε μϐριο που αναλϑθηκε προϋκυψε με διαύρεςη τησ τιμόσ που υπολογύςτηκε για την syndecan-4 με την τιμό του φθοριςμοϑ του εςωτερικοϑ πρϐτυπου αναφορϊσ GAPDH που χρηςιμοποιόθηκε. 3. ΑΝΟOΪΣΟΦΗΜΙΚΕ ΦΡΨΕΙ ΣΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ Η ανοςοώςτοχημεύα περιλαμβϊνει τη χρόςη πολυκλωνικϔν ό μονοκλωνικϔν αντιςωμϊτων για τον εντοπιςμϐ αντιγϐνων ςε τομϋσ ιςτοϑ. Σα μονοκλωνικϊ αντιςϔματα γενικϊ πλεονεκτοϑν ϋναντι των πολυκλωνικϔν επειδό ϋχουν μεγαλϑτερη ειδικϐτητα για μύα απλό αλληλουχύα ό επύτοπο του αντιγϐνου. ε οριςμϋνεσ περιπτϔςεισ, το ςυγκεκριμϋνο πλεονϋκτημα μετατρϋπεται ςε μειονϋκτημα, καθϔσ μύα πιθανό μετατροπό του ςυγκεκριμϋνου αντιγϐνου κατϊ τη μονιμοπούηςη του ιςτοϑ μπορεύ να επηρεϊςει την ικανϐτητα ανύχνευςησ του υπϐ εξϋταςη μορύου. Η ιδιϐτητα του μονοκλωνικοϑ αντιςϔματοσ να αντιδρϊ με μύα μϐνο θϋςη ςϑνδεςησ του αντιγϐνου ϋχει ωσ αποτϋλεςμα λιγϐτερα μϐρια αντιςϔματοσ να ςυνδϋονται με το αντιγϐνο και τελικϊ η χρϔςη να εύναι αςθενόσ. Σο κυριϐτερο ϋνζυμο που χρηςιμοποιεύται για τη ςόμανςη των αντιςωμϊτων ςτην ανοςοώςτοχημεύα εύναι η υπεροξειδϊςη. Η χρϔςη επιτυγχϊνεται λϐγω τησ ικανϐτητασ τησ υπεροξειδϊςησ να μετατρϋπει το υπεροξεύδιο του υδρογϐνου ςε νερϐ (Η2Ο2 Η2Ο), παρουςύα δϐτη ηλεκτρονύων και να οξειδϔνει το χρωμογϐνο διαμινοβενζιδύνη (DAB) ςε μύα χρωματιςμϋνη μορφό. Οι κυριϐτερεσ μϋθοδοι τησ ανοςοώςτοχημεύασ με χρόςη υπεροξειδϊςησ εύναι: Άμεςη μϋθοδοσ Έμμεςη μϋθοδοσ 131

132 Πειραματικϐ Έμμεςη μϋθοδοσ τριϔν βημϊτων, που αποτελεύται απϐ τισ ακϐλουθεσ μεθϐδουσ: 1. Μϋθοδοσ υπεροξειδϊςησ-αντιυπεροξειδϊςησ (PAP) 2. Μϋθοδοσ αβιδύνησ-βιοτύνησ (ABC) 3. Μϋθοδοσ βιοτύνησ-ςτρεπταβιδύνησ (B-SA) ϑνηθεσ πρϐβλημα των ανοςοώςτοχημικϔν μελετϔν εύναι ϐτι η διαδικαςύα τησ μονιμοπούηςησ του ιςτοϑ επϊγει πολλϋσ φορϋσ την «επικϊλυψη» των υπϐ εξϋταςη αντιγϐνων, με αποτϋλεςμα να μην εύναι δυνατό η ανύχνευςό τουσ. Η προςπϊθεια αποκϊλυψησ των αντιγϐνων γύνεται εύτε με χρόςη πρωτεολυτικϔν ενζϑμων, εύτε με χρόςη μη-ενζυματικϔν χημικϔν μϋςων. Μύα νεϐτερη μϋθοδοσ εύναι η χρόςη του φοϑρνου μικροκυμϊτων. Η διαδικαςύα αυτό αποκϊλυψησ των αντιγϐνων χρηςιμοποιεύται ςε αςθενϔσ μονιμοποιημϋνουσ ό υπερμονιμοποιημϋνουσ ιςτοϑσ. Εύναι ιδιαύτερα χρόςιμη μϋθοδοσ για ιςτοϑσ μονιμοποιημϋνουσ ςε παραφύνη. Η παραφύνη μονιμοποιεύ τουσ ιςτοϑσ «μπλοκϊροντασ» τισ ϊμινο-ομϊδεσ και ςχηματύζοντασ γϋφυρεσ ανϊμεςα ςτα διϊφορα αμινοξϋα των πολυπεπτιδύων. Με αυτϐ το μηχανιςμϐ, η παραφύνη δημιουργεύ ποικύλουσ δεςμοϑσ ϐχι μϐνο μϋςα ςε ϋνα πρωτεώνικϐ μϐριο, αλλϊ και μεταξϑ γειτονικϔν πρωτεώνϔν. Αυτού οι δεςμού φαύνεται ϐτι ευθϑνονται ςυχνϊ για την αδυναμύα ςϑνδεςησ των αντιςωμϊτων με τα υπϐ εξϋταςη αντιγϐνα. Αν και ο ακριβόσ μηχανιςμϐσ με τον οπούο η χρόςη του φοϑρνου μικροκυμϊτων βοηθϊ ςτην αποκϊλυψη των αντιγονικϔν επιτϐπων δεν εύναι γνωςτϐσ, πολλϋσ μελϋτεσ ϋδειξαν αυξημϋνη ανοςοδραςτικϐτητα ιςτικϔν τομϔν μετϊ απϐ τη χρόςη φοϑρνου μικροκυμϊτων. Μύα μεγϊλη ποικιλύα ρυθμιςτικϔν διαλυμϊτων και ςυνθηκϔν ϋχουν χρηςιμοποιηθεύ κατϊ τη χρόςη του φοϑρνου μικροκυμϊτων. Σα πλϋον διαδεδομϋνο διϊλυμα εύναι το 0.01Μ κιτρικϐ νϊτριο, ph 6.0. την παροϑςα μελϋτη, χρηςιμοποιόθηκε η μϋθοδοσ αποκϊλυψησ αντιγϐνων με φοϑρνο μικροκυμϊτων με τη χρόςη ρυθμιςτικοϑ διαλϑματοσ κιτρικοϑ νατρύου ςε κϊποιεσ περιπτϔςεισ (Πύνακασ 4). Όλα τα παραςκεϑςματα που χρηςιμοποιόθηκαν εύχαν μονιμοποιηθεύ ςε διϊλυμα φορμϐλησ 10% και εγκλειςτεύ ςε παραφύνη. Απϐ κϊθε περιςτατικϐ που μελετόθηκε, χρηςιμοποιόθηκαν ϋνασ ό περιςςϐτεροι αντιπροςωπευτικού κϑβοι παραφύνησ, απϐ τουσ οπούουσ ελόφθηςαν 132

133 Πειραματικϐ ςυνεχϐμενεσ τομϋσ πϊχουσ 4μm, οι οπούεσ τοποθετόθηκαν ςε αντικειμενοφϐρεσ πλϊκεσ που εύχαν προηγουμϋνωσ επικαλυφθεύ με λεπτϐ ςτρϔμα πολϑ-l-λυςύνησ, ϔςτε να μην αποκολληθοϑν. Σα αντιςϔματα και οι ςυνθόκεσ που χρηςιμοποιόθηκαν ςτην παροϑςα μελϋτη αναφϋρονται ςτον παρακϊτω Πύνακα 4. Για τον καλϑτερο ϋλεγχο τησ διαδικαςύασ χρηςιμοποιόθηκαν και αντύςτοιχεσ τομϋσ που επωϊςτηκαν με τη ςυνόθη μϋθοδο, χωρύσ την προςθόκη του πρωτογενοϑσ αντιςϔματοσ (negative control). Πύνακασ 4: Αντιςϔματα και ςυνθόκεσ που χρηςιμοποιόθηκαν για την ανοςοώςτοχημικό μελϋτη. Versican Decorin CD44 Syndecan-4 Παράγοντασ von Willebrand Αντύςωμα / Εταιρεύα Mouse (2-B-1) Seikagaku Mouse (6-B-6) Seikagaku Rabbit (H-300) Santa Cruz Goat (D-16) Santa Cruz Rabbit (A-0082) DakoCytomation Αραύωςη 1:1000 1:1000 Μϋθοδοσ αποκϊλυψησ αντιγόνου Ρυθμιςτικό διϊλυμα 1:150 Υοϑρνοσ Κιτρικϐ 1:150 Υοϑρνοσ Κιτρικϐ 1:200 Υοϑρνοσ Κιτρικϐ Η ανοςοώςτοχημικό μϋθοδοσ που εφαρμϐςθηκε όταν η μϋθοδοσ αβιδύνησ βιοτύνησ ABC και χρηςιμοποιόθηκε το Kit DakoCytomation. Η αραύωςη που τελικϊ χρηςιμοποιόθηκε για το πρωτογενϋσ αντύςωμα καθορύςθηκε μετϊ απϐ δοκιμαςτικϋσ χρϔςεισ ςτισ οπούεσ εκτιμόθηκαν τα ποιοτικϊ αποτελϋςματα ποικύλων αραιϔςεων. Οι αραιϔςεισ, οι χρϐνοι επϔαςησ, η θερμοκραςύα επϔαςησ και οι μϋθοδοι αποκϊλυψησ των αντιγονικϔν επιτϐπων επιλϋχθηκαν ϋτςι ϔςτε να 133

134 Πειραματικϐ υπϊρχει η βϋλτιςτη ϋνταςη χρϔςησ με το μικρϐτερο δυνατϐ βαθμϐ μη-ειδικόσ χρϔςησ του υποςτρϔματοσ (background) ΠΕΡΙΓΡΑΥΗ ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΤ Πραγματοποιόθηκε αποπαραφύνωςη των τομϔν ςτουσ 56 0 C επύ 20 λεπτϊ και εμβϊπτιςη ςε ξυλϐλη (2 φορϋσ) επύ 15 λεπτϊ κϊθε φορϊ. Ενυδϊτωςη των ιςτϔν ςε κατιοϑςα αλκοολϔν (100%, 96%, 80%, 70%) επύ 5 λεπτϊ κϊθε φορϊ. Έκπλυςη με αποςταγμϋνο νερϐ επύ 5 λεπτϊ. Σοποθϋτηςη των τομϔν ςε διϊλυμα κιτρικοϑ νατρύου και θϋρμανςό τουσ 3 φορϋσ επύ 5 λεπτϊ ςτην ϋνδειξη 700W ςτο φοϑρνο μικροκυμϊτων. Μετϊ το πϋρασ κϊθε πεντϊλεπτου κϑκλου οι τομϋσ παραμϋνουν ςτο φοϑρνο μικροκυμϊτων και εϊν χρειϊζεται προςτύθεται ρυθμιςτικϐ διϊλυμα κιτρικοϑ νατρύου, για την αντιςτϊθμιςη των απωλειϔν λϐγω εξϊτμιςησ. Σο βόμα αυτϐ πραγματοποιόθηκε ςτισ περιπτϔςεισ που αναφϋρονται παρακϊτω. Μετϊ την ολοκλόρωςη των τριϔν κϑκλων οι τομϋσ αφόνονται ςε θερμοκραςύα δωματύου επύ 20 λεπτϊ πριν τη ςυνϋχεια τησ διαδικαςύασ. Ακολουθεύ ϋκπλυςη των τομϔν ςε TBS επύ 5 λεπτϊ δϑο φορϋσ. Οι τομϋσ που μελετόθηκαν για την παρουςύα των versican και decorin κατεργϊςτηκαν με 1U/mL χονδροώτινϊςη ABC για 15 λεπτϊ ςτουσ 37 ο C. τη ςυνϋχεια ακολοϑθηςε ϋκπλυςη με PBS. Οι τομϋσ επωϊζονται με διϊλυμα 3 % (v/v) Η2Ο2 ςε μεθανϐλη για 5 λεπτϊ ςε θερμοκραςύα δωματύου, ϋτςι ϔςτε να αναςταλεύ η δρϊςη των υπεροξειδαςϔν του ιςτοϑ. Ακολοϑθωσ, οι τομϋσ επωϊζονται ςτην ύδια θερμοκραςύα για 20 λεπτϊ με 3 % ορϐ κουνελιοϑ ό χούρου ςε PBS με ςκοπϐ να κορεςτοϑν οι τομϋσ με αντιςϔματα και να αποφευχθεύ η τυχαύα δϋςμευςη του ειδικοϑ αντιςϔματοσ που θα χρηςιμοποιηθεύ. τη ςυνϋχεια, οι τομϋσ επωϊζονται με τα ειδικϊ αντιςϔματα αραιωμϋνα ςε 1 % ορϐ κουνελιοϑ ό χούρου ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα PBS [2-Β-1 για την versican ςε αραύωςη 1:1000, 6-Β-6 για την decorin ςε αραύωςη 1:1000, 1:150 για τον υποδοχϋα CD44 (standard isoform, CD44s) και την Syndecan-4 και 1:200 πολυκλωνικϐ αντύςωμα ϋναντι του παρϊγοντα von Willebrand] για 1 ϔρα ςε θερμοκραςύα δωματύου. τη ςυνϋχεια οι τομϋσ επωϊζονται με βιοτινυλιωμϋνο δεϑτερο αντύςωμα (αραύωςη 1:200 ςε PBS), το οπούο εύναι ειδικϐ για το πρϔτο αντύςωμα, για 30 λεπτϊ ςε θερμοκραςύα 134

135 Πειραματικϐ δωματύου. Σα ςϑμπλοκα των αντιςωμϊτων ανιχνεϑονται με την επϔαςό τουσ για 30 λεπτϊ ςτην ύδια θερμοκραςύα με ςϑμπλοκα αβιδύνησ-βιοτύνησ ςτα οπούα ϋχει προςδεθεύ το ϋνζυμο υπεροξειδϊςη. Η ανϊπτυξη του χρϔματοσ ϋγινε χρηςιμοποιϔντασ ωσ χρωμοφϐρο την 3,3 διαμινο-βενζιδύνη παρουςύα % (v/v) Η2Ο2 για 5 λεπτϊ ςε θερμοκραςύα δωματύου. Έκπλυςη των τομϔν με τρεχοϑμενο νερϐ βρϑςησ και χρϔςη αντύθεςησ των πυρόνων (counterstaining) με αιματοξυλύνη Harris, ςτιγμιαύα εμβϊπτιςη των τομϔν ςε οξυνιςμϋνη αλκοϐλη για την αφαύρεςη περύςςειασ αιματοξυλύνησ και αφυδϊτωςό τουσ ςε ανιοϑςα αλκοολϔν. Εμβϊπτιςη ςε ξυλϐλη (2 φορϋσ) και επικϐλληςη των καλυπτρύδων με τη χρόςη διαλυτοϑ ςτη ξυλϐλη μϋςου. Κατϊ την ανοςοώςτοχημικό ανύχνευςη του CD44, τησ syndecan-4 και του παρϊγοντα von Willebrand πριν την αναςτολό τησ δρϊςησ των υπεροξειδαςϔν του ιςτοϑ, οι τομϋσ εμβαπτύςτηκαν ςε 10 mm ρυθμιςτικοϑ διαλϑματοσ κιτρικοϑ νατρύου, ph 6.0, και θερμϊνθηκαν ςε φοϑρνο μικροκυμϊτων ϐπωσ περιγρϊφεται πιο πϊνω. Mε τη χρόςη φωτονικοϑ μικροςκοπύου μελετόθηκαν οι τομϋσ ωσ προσ την ϑπαρξη εξωκυττϊριασ, μεμβρανικόσ, κυτταροπλαςματικόσ ό πυρηνικόσ χρϔςησ. H ϑπαρξη θετικϐτητασ ςε τουλϊχιςτον 10% των κυττϊρων του εκϊςτοτε παραςκευϊςματοσ όταν το ϐριο (cut-off point value) για να θεωρηθεύ το δεύγμα θετικϐ ωσ προσ κϊποια απϐ τισ υπϐ μελϋτη πρωτεογλυκϊνεσ. Η ποςοτικοπούηςη των versican και decorin ςτα δεύγματα ϋγινε με βϊςη την ημιποςοτικό εκτύμηςη που περιϋχει α) το ςυνολικϐ ποςοςτϐ τησ τομόσ που εύναι θετικϐ για κϊθε χρϔςη, β) την ϋνταςη τησ χρϔςησ για κϊθε πρωτεογλυκϊνη (χρηςιμοποιϔντασ μια κλύμακα τεςςϊρων ςημεύων). Η κατϊταξη ςε αυτόν την κλύμακα ϋχει ωσ εξόσ: 1, για δεύγματα αρνητικϊ ό πολϑ ελαφρϊ χρωματιςμϋνα, 2, ελαφρϊ θετικό χρϔςη, 3, μϋςη χρϔςη και 4, πολϑ ϋντονα θετικό χρϔςη. Η ημιποςοτικό ανοςοώςτοχημικό εκτύμηςη (IHC) προκϑπτει απϐ τον πολλαπλαςιαςμϐ των ποςοςτϔν (0-100%) του ιςτοϑ που εύναι θετικϐσ για κϊθε πρωτεογλυκϊνη με τον παρϊγοντα (1-4) που αντιςτοιχεύ ςτην ϋνταςη χρϔςησ του κϊθε ιςτοϑ. Η εξϋταςη των δειγμϊτων ϋγινε απϐ τρεισ ανεξϊρτητουσ εκτιμητϋσ. 135

136 Πειραματικϐ Σα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα ςτουσ ιςτοϑσ των ϐγκων χρωματύςτηκαν με τη χρόςη πολυκλωνικοϑ αντιςϔματοσ ϋναντι του παρϊγοντα von Willebrand. Έπειτα απϐ την εξϋταςη των δειγμϊτων ϋξι τυχαύα ςημεύα ςε μεγϊλη μεγϋθυνςη επιλϋχθηκαν και ο αριθμϐσ των αγγεύων μετρόθηκε. Ο αριθμϐσ των αγγεύων ςε κϊθε δεύγμα αντιπροςωπεϑει την μϋςη τιμό απϐ ϋξι ανεξϊρτητεσ μετρόςεισ. Η εξϋταςη των δειγμϊτων ϋγινε απϐ τρεισ ανεξϊρτητουσ εκτιμητϋσ. 4. ΣΑΣΙΣΙΚΗ ΑΝΑΛΤΗ Οι ςτατιςτικού ϋλεγχοι που χρηςιμοποιόθηκαν για τον ϋλεγχο των διαφορϔν μεταξϑ των εξεταζομϋνων παραμϋτρων όταν x 2 -test (Chi-square test με ό χωρύσ το διορθωτικϐ παρϊγοντα κατϊ Yates), Mann-Whitney U-test, Kruskal-Wallis ANOVA by ranks και ανϊλυςη γραμμικόσ παλινδρϐμηςησ με τη χρόςη του λογιςμικοϑ GraphPad Prism (version 3.0: GraphPad Software Inc. San Diego, CA, USA) Για την αξιοπιςτύα τησ εκτύμηςησ τησ ϋνταςησ τησ θετικϐτητασ κϊθε πρωτεογλυκϊνησ επιλϋχθηκε τυχαύο δεύγμα 20 περιςτατικϔν (απϐ το ςϑνολο των περιςτατικϔν τησ μελϋτησ). Σα ςυγκεκριμϋνα περιςτατικϊ αξιολϐγηςαν δϑο ιατρού. Ο κϊθε ιατρϐσ (βαθμολογητόσ-rater) εκτύμηςε το δεύγμα και ςτη ςυνϋχεια ελϋγχθηκε η ςυμφωνύα τησ βαθμολϐγηςησ μεταξϑ τουσ, με τη βοόθεια του ςυντελεςτό ςυμφωνύασ μεταξϑ εκτιμητϔν k (Cohen s coefficient of agreement). Η τιμό του ςυντελεςτό ςυμφωνύασ των εκτιμητϔν κυμϊνθηκε απϐ κ=0.88 ϋωσ κ=0.94 αποδεικνϑοντασ πωσ υπϊρχει πολϑ ιςχυρό και ςτατιςτικϊ ςημαντικό ςυμφωνύα μεταξϑ των εκτιμητϔν για ϐλεσ τισ πρωτεογλυκϊνεσ. Κατϊ τη ςτατιςτικό ανϊλυςη και επεξεργαςύα των δεδομϋνων οι διαφορϋσ και ςυςχετύςεισ που προκϑπτουν θεωροϑνται ςτατιςτικϊ ςημαντικϋσ αν και μϐνο αν αντιςτοιχοϑν ςε πιθανϐτητα p<0.05 (επύπεδο ςημαντικϐτητασ) ϐπωσ αυτό προκϑπτει απϐ τον αντύςτοιχο κϊθε φορϊ ςτατιςτικϐ ϋλεγχο, διαφορετικϊ θεωροϑνται ςτατιςτικϊ μη ςημαντικϋσ (NS-p>0.05). 136

137 137 ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ

138 138

139 Αποτελϋςματα 1. ΕΠΙΚΟΠΙΗ ΣΨΝ ΔΕΙΓΜΑΣΨΝ Οι ιςτού απϐ ϐγκουσ ϐρχεων που μελετόθηκαν (n=7, τϋςςερισ αςθενεύσ με ςεμύνωμα και τρεισ αςθενεύσ με μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ), προόλθαν απϐ αςθενεύσ που υποβλόθηςαν ςε ορχεκτομό ςτην Ουρολογικό Κλινικό του Πανεπιςτημιακοϑ Γενικοϑ Νοςοκομεύου Πατρϔν. Οι αςθενεύσ όταν ϊνδρεσ ηλικύασ ετϔν. Οι φυςιολογικού ιςτού (n=6) που χρηςιμοποιόθηκαν ςαν πρϐτυπα αναφορϊσ ςτην μελϋτη ςυλλϋχθηκαν απϐ νεκροτομικϐ υλικϐ ανδρϔν ηλικύασ ετϔν. Επύςησ, 71 δεύγματα αςθενϔν με ϐγκουσ ϐρχεων που υπεβλόθηςαν ςε ορχεκτομό ςτο Πανεπιςτημιακϐ Νοςοκομεύο Πατρϔν ςυμπεριλόφθηςαν ςε αναδρομικό μελϋτη με τη χρόςη ανοςοώςτοχημεύασ. Σα δεύγματα των αςθενϔν επιλϋχθηκαν απϐ το αρχεύο του Εργαςτηρύου Παθολογικόσ Ανατομύασ του Πανεπιςτημιακοϑ Νοςοκομεύου Πατρϔν. Κανϋνασ απϐ τουσ αςθενεύσ δεν εύχε υποβληθεύ ςε χημειοθεραπεύα ό ακτινοβολύα πριν τη χειρουργικό επϋμβαςη. Η μϋςη ηλικύα των αςθενϔν όταν 30 ετϔν (διακϑμανςη απϐ 17 ϋωσ 78 ετϔν). Η ιςτολογικό εξϋταςη των δειγμϊτων ανϋδειξε 33 αςθενεύσ (46.5%) με ςεμύνωμα και 38 αςθενεύσ (53.5%) με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (Πύνακασ 5). Οι αςθενεύσ με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ κατατϊςςονται ςε τρεισ κατηγορύεσ: 8 αςθενεύσ (11.3%) με εμβρυικϐ καρκύνωμα, πϋντε αςθενεύσ (7%) με τερϊτωμα και 25 αςθενεύσ (35.2%) με μεικτοϑσ ϐγκουσ (Πύνακασ 5). Εύκοςι ϋξι απϐ τουσ αςθενεύσ παρουςύαζαν πρωτοπαθό ϐγκο εντοπιςμϋνο ςτον ϐρχι χωρύσ αγγειακό/λεμφαγγειακό διόθηςη (Σ1), ςαρϊντα ϋνασ αςθενεύσ παρουςύαζαν νϐςο εντοπιςμϋνη ςτον ϐρχι με αγγειακό/λεμφαγγειακό διόθηςη ό με διόθηςη του ελυτροειδοϑσ χιτϔνα (Σ2) και τϋςςερισ αςθενεύσ εμφϊνιζαν διόθηςη του ςπερματικοϑ τϐνου (Σ3) (Πύνακασ 5). Σριϊντα εννϋα αςθενεύσ (54.9%) εμφϊνιζαν αγγειακϋσ ό λεμφαγγειακϋσ διηθόςεισ ενϔ τριϊντα πϋντε αςθενεύσ (49.3%) παρουςύαζαν μεταςτϊςεισ ςε λεμφαδϋνεσ (Πύνακασ 5). Μϐνο οκτϔ αςθενεύσ (11.3%) εμφϊνιζαν απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ (Μ1a και Μ1b). 139

140 Αποτελϋςματα Πύνακασ 5. Κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 71 αςθενϔν με ϐγκουσ ϐρχεων Αριθμόσ (n) % Ιςτολογικόσ τύποσ εμινϔματα (Seminoma) Μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι (NSGCTs) Δμβρσικό καρκίνωμα Σερϊτωμα Μεικτοϑ τϑπου Μϋγεθοσ όγκου (T) T T T Παρουςύα αγγειακόσ-λεμφαγγειακόσ διόθηςησ (Vascular-lymphatic invasion) Negative Positive Προςβολό λεμφαδϋνων (N) N N N N Παρουςύα απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων (M) M M1a M1b τϊδιο (Stage) I II III

141 Αποτελϋςματα Η ςταδιοπούηςη των αςθενϔν ανϋδειξε ϐτι τριϊντα ϋξι αςθενεύσ (50.7%) όταν ςταδύου Ι, ενϔ εύκοςι επτϊ (38%) και οκτϔ (11.3%) αςθενεύσ όταν ςταδύου ΙΙ και ΙΙΙ, αντύςτοιχα (Πύνακασ 5). 2. ΜΕΛΕΣΗ ΣΨΝ ΕΞΨΚΤΣΣΑΡΙΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ 2.1. ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ VERSICAN ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ VERSICAN Ε ΥΤΙΟΛΟΓΙΚΟΤ ΙΣΟΤ ΚΑΙ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΨΗ Η παρουςύα τησ versican μελετόθηκε ςτουσ ιςτοϑσ των αςθενϔν με ϐγκουσ ϐρχεων και ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ ϐρχεων με ανοςοαποτϑπωςη. Οι ιςτού εκχυλύςτηκαν με το χαοτροπικϐ διϊλυμα 4 M GdnHCl, 50 mm AcONa, ph 5.8, που περιεύχε 1 % Triton X-100 και αναςτολεύσ πρωτεαςϔν. Σα εκχυλύςματα μετρόθηκαν για το περιεχϐμενϐ τουσ ςε πρωτεϗνη και ύςεσ ποςϐτητεσ πρωτεϗνησ (30 g) κατακρημνύςτηκαν με την προςθόκη 4 ϐγκων αιθανϐλησ. Σα ιζόματα διαλυτοποιόθηκαν ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα 0.1 Μ Tris-οξικϐ ph 7.3 και υποβλόθηκαν ςε πϋψη με χονδροώτινϊςη ABC για να απομακρυνθοϑν οι GAG αλυςύδεσ των PGs. Οι πρωτεώνικού κορμού τουσ ηλεκτροφορόθηκαν ςε πηκτϔματα πολυακρυλαμιδύου και ςτη ςυνϋχεια ϋγινε ηλεκτρομεταφορϊ ςε μεμβρϊνεσ Immobilon P. Η ταυτοπούηςη των πρωτεώνικϔν κορμϔν ϋγινε με τη χρόςη ειδικϔν μονοκλωνικϔν αντιςωμϊτων. Όπωσ φαύνεται ςτο ςχόμα 16 πρωτεώνικού κορμού τησ versican με ποικύλο μοριακϐ μϋγεθοσ ταυτοποιόθηκαν τϐςο ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ ϐςο και ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων και πιθανϐν αντιςτοιχοϑν ςε ιςομορφϋσ τησ versican. Οι πρωτεώνικϋσ ζϔνεσ μικρϐτερου μοριακοϑ μεγϋθουσ, που παρατηρόθηκαν κυρύωσ ςτα δεύγματα των αςθενϔν, πιθανϐν αντιπροςωπεϑουν προώϐντα πρωτεολυτικόσ αποικοδϐμηςησ των μεγϊλου μοριακοϑ μεγϋθουσ ιςομορφϔν τησ versican (χόμα 16). Σϐςο οι ςεμινωματϔδεισ ϐςο και οι μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι χαρακτηρύζονται απϐ αυξημϋνη ϋκφραςη τησ versican ςε ςχϋςη με τουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ, γεγονϐσ 141

142 Αποτελϋςματα που τεκμηριϔνει την αυξημϋνη ςϑνθεςη και εναπϐθεςη τησ versican ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων (χόμα 16). χόμα 16. Αντιπροςωπευτικό εικϐνα ανοςοαποτϑπωςησ τησ versican ςε φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ (γραμμϋσ 1-3) και ςε ϐγκουσ των ϐρχεων (γραμμϋσ 4-7) ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ VERSICAN ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ Αρχικϔσ, πραγματοποιόθηκε ανοςοώςτοχημικό μελϋτη τησ versican ςτα ςεμινϔματα και ςτουσ φυςιολογικοϑσ ορχικοϑσ ιςτοϑσ. Όπωσ φαύνεται ςτο ςχόμα 17, ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ η ϋκφραςη τησ versican εύναι πολϑ αςθενόσ και εντοπύζεται ςτον διϊμεςο ςυνδετικϐ ιςτϐ, ςτα μεςολοβιϔδη διαφρϊγματα που περιβϊλλουν τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια των ϐρχεων. την πλειονϐτητα των αςθενϔν με ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (n=22, 66.7%) παρατηρόθηκε αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ versican κυρύωσ ςτο ςτρϔμα που περιβϊλλει τον ϐγκο ενϔ ςε οριςμϋνεσ περιπτϔςεισ εντοπύςθηκε και ςτο ςτρϔμα που βρύςκεται εντϐσ του ϐγκου (χόμα 17). Επιπλϋον, περιςταςιακϊ αναγνωρύςτηκε ενδοκυττϊρια εντϐπιςη 142

143 Αποτελϋςματα τησ versican ςτα κακοόθη κϑτταρα, παρατόρηςη που υποςτηρύζει την υπϐθεςη για πιθανό ενδογενό ςϑνθεςη ό ενδοκυττϊρωςη τησ versican απϐ τα κϑτταρα του ϐγκου. χόμα 17. Ανοςοώςτοχημικϐσ εντοπιςμϐσ τησ versican ςτο φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ (Α) και ςε ςεμινϔματα ςταδύου Ι (Β) και ςταδύου ΙΙ (Γ). τα ϋνθετα απεικονύζεται η ϋνταςη τησ χρϔςησ για την versican ςτο ςϑνολο του δεύγματοσ. Όπωσ διαφαύνεται απϐ το ςχόμα 18 και ςε ςυνδυαςμϐ με την ποςοτικό ανϊλυςη τησ versican, η εναπϐθεςό τησ αυξϊνει ανϊλογα με το μϋγεθοσ του ϐγκου, την παρουςύα μεταςτϊςεων ςτουσ λεμφαδϋνεσ, την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων και το ςτϊδιο τησ νϐςου (χόμα 18). Η ςτατιςτικό ανϊλυςη ανϋδειξε ϐτι η εναπϐθεςη τησ versican ςτο ςτρϔμα των ςεμινωμϊτων παρουςιϊζει ςτατιςτικϊ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με την παρουςύα διηθόςεων ςτουσ 143

144 Versican IHC score Versican IHC score Versican IHC score Versican IHC score Αποτελϋςματα λεμφαδϋνεσ (Ν) (Ρ=0.022), την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων (Ρ=0.023) και το ςτϊδιο τησ νϐςου (Ρ=0.022) (χόμα 18). seminoma versican - n seminoma versican-t new 300 P= T 1 P=0.022 T 2 +T 3 N 0 N 1 +N seminoma versican - vasc-lymph invasion T 1 T 2 +T 3 P=0.023 seminoma versican - stage 0 N 0 N 1 +N Non-invasion P=0.022 Invasion Stage I Stage II Non-invasion Invasion 0 Stage I Stage II χόμα 18. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ τησ versican και των κλινικοπαθολογικϔν χαρακτηριςτικϔν των αςθενϔν με ςεμινϔματα. Οι διαφορϋσ μεταξϑ των υποομϊδων αναλϑθηκαν με Mann-Whitney s U-test και one-way ANOVA (Kruskal- Wallis ANOVA) ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ VERSICAN ΣΟΤ ΜΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ. Παραλλόλωσ, πραγματοποιόθηκε ανοςοώςτοχημικό μελϋτη τησ versican ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Σο ποςοςτϐ των αςθενϔν που παρατηρόθηκε αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ versican (n=33, 86.8%) αυξόθηκε ςε ςχϋςη με το αντύςτοιχο ποςοςτϐ ςτα ςεμινϔματα. Επιπλϋον, ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ παρατηρόθηκε αυξημϋνη ϋνταςη χρϔςησ για την versican ςε ςχϋςη με τα ςεμινϔματα. Αυτϐ οφεύλεται ςτην πολϑ ϋντονη εναπϐθεςη τησ versican ςτουσ μη 144

145 Αποτελϋςματα ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (χοριοκαρκύνωμα, τερϊτωμα, εμβρυώκϐ καρκύνωμα, ϐγκοι του λεκιθικοϑ αςκοϑ και μικτού ϐγκοι). Αξιοςημεύωτη εύναι η παρατόρηςη, ϐτι ςτουσ μικτοϑσ ϐγκουσ η ϋνταςη τησ χρϔςησ για την versican εύναι εντονϐτερη ςτο τμόμα των μη ςεμινωματωδϔν ςτοιχεύων ςε ςχϋςη με το τμόμα του ςεμινϔματοσ που ςυνυπϊρχει ςτον ύδιο ϐγκο (χόμα 19). Η εναπϐθεςη τησ versican παρατηρεύται κυρύωσ ςτο ςτρϔμα που περιβϊλλει τον ϐγκο ενϔ ςπανιϐτερα αναγνωρύζεται ςτο ςτρϔμα που βρύςκεται εντϐσ του ϐγκου (χόμα 19). χόμα 19. Ανοςοώςτοχημικϐσ εντοπιςμϐσ τησ versican ςε μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ςταδύου Ι (Α, ςεμύνωμα και εμβρυώκϐ καρκύνωμα), ςταδύου ΙΙ (Β, ςεμύνωμα και εμβρυώκϐ καρκύνωμα) και ςταδύου ΙΙΙ (Γ, ςεμύνωμα και εμβρυώκϐ καρκύνωμα). τα ϋνθετα απεικονύζεται η ϋνταςη τησ χρϔςησ για την versican ςτο ςϑνολο του δεύγματοσ. Όπωσ αναγνωρύζεται ςτο ςχόμα 20 και ςε ςυνδυαςμϐ με τη ποςοτικοπούηςη που πραγματοποιόθηκε για την versican, η εναπϐθεςό τησ αυξϊνει ανϊλογα με το 145

146 Versican IHC score Versican IHC score Versican IHC score Versican IHC score Versican IHC score Αποτελϋςματα μϋγεθοσ του ϐγκου, την παρουςύα μεταςτϊςεων ςτουσ λεμφαδϋνεσ, την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων, την παρουςύα απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων αλλϊ και το ςτϊδιο τησ νϐςου (χόμα 20). non-seminoma versican - n non-seminoma versican - T P= T 1 T 2 P=0.025 N 0 N 1 +N non-seminoma versican - m T 1 T 2 T 3 0 non-seminoma versican - Nvasc-lymph 0 N 1 +Ninvasion 2 N P= M 0 M 1 +M 2 P= Non-invasion Invasion non-seminoma versican - stage M 0 M 1 +M 1a + M 2 1b P= Stage I Stage II Non-invasion Invasion Stage I Stage II Stage III χόμα 20. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ τησ versican ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐρχεων και των κλινικοπαθολογικϔν χαρακτηριςτικϔν των αςθενϔν. Οι διαφορϋσ μεταξϑ των υποομϊδων αναλϑθηκαν με Mann-Whitney s U-test και one-way ANOVA (Kruskal-Wallis ANOVA). Η ςτατιςτικό ανϊλυςη ϋδειξε ϐτι η εναπϐθεςη τησ versican ςτο ςτρϔμα των μη ςεμινωματωδϔν ϐγκων παρουςιϊζει ςτατιςτικϊ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με το 146

147 Versican IHC score Αποτελϋςματα μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου (Σ) (Ρ=0.032), την παρουςύα μεταςτϊςεων ςτουσ λεμφαδϋνεσ (Ν) (Ρ=0.025), την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων (Ρ=0.006), την παρουςύα απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων (Μ) (Ρ=0.034) και το ςτϊδιο τησ νϐςου (Ρ=0.012) (χόμα 20) ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ VERSICAN ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ Η ϋκφραςη τησ versican ςυςχετύςτηκε με τον αριθμϐ των αγγεύων ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ϐρχεων. Διαπιςτϔθηκε ϐτι η εναπϐθεςη τησ versican (ςτο ςτρϔμα) εμφανύζει ςτατιςτικϊ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με τον αριθμϐ αγγεύων ςτο ςτρϔμα των ϐγκων (χόμα 21). Η παρατόρηςη αυτό ενιςχϑει την υπϐθεςη ϐτι η εναπϐθεςη τησ versican ςχετύζεται με επιθετικϐτερη βιολογικό ςυμπεριφορϊ των ϐγκων ϐρχεων. 200 Data Table-1 Y= X R=0.4 P=0.024 versican Microvessel Αξηζκόο Αγγείωλ number χόμα 21. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ τησ versican και του αριθμοϑ των αγγεύων ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ϐρχεων. 147

148 Αποτελϋςματα 2.2. ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ DECORIN ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ DECORIN Ε ΥΤΙΟΛΟΓΙΚΟΤ ΙΣΟΤ ΚΑΙ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΨΗ Η ϋκφραςη τησ decorin ςτουσ ιςτοϑσ των αςθενϔν με ϐγκουσ ϐρχεων και ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ ϐρχεων μελετόθηκε με τη μϋθοδο τησ ανοςοαποτϑπωςησ. Οι ιςτού εκχυλύςτηκαν με το χαοτροπικϐ διϊλυμα 4 M GdnHCl, 50 mm AcONa, ph 5.8, που περιεύχε 1 % Triton X-100 και αναςτολεύσ πρωτεαςϔν. Σα εκχυλύςματα μετρόθηκαν για το περιεχϐμενϐ τουσ ςε πρωτεϗνη και ύςεσ ποςϐτητεσ πρωτεϗνησ (30 g) κατακρημνύςτηκαν με την προςθόκη 4 ϐγκων αιθανϐλησ. Σα ιζόματα διαλυτοποιόθηκαν ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα 0.1 Μ Tris-οξικϐ ph 7.3 και υποβλόθηκαν ςε πϋψη με χονδροιτινϊςη ABC. Οι πρωτεώνικού κορμού τουσ ηλεκτροφορόθηκαν ςε πηκτϔματα πολυακρυλαμιδύου και ςτην ςυνϋχεια ϋγινε ηλεκτρομεταφορϊ ςε μεμβρϊνεσ Immobilon P. Τγηείο 45 kda Decorin χόμα 22. Αντιπροςωπευτικό εικϐνα ανοςοαποτϑπωςησ τησ decorin ςε φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ (γραμμϋσ 1-3) και ςε ϐγκουσ ϐρχεων (γραμμϋσ 4-7). 148

149 Αποτελϋςματα Η ταυτοπούηςη των πρωτεώνικϔν κορμϔν ϋγινε με την χρόςη ειδικϔν μονοκλωνικϔν αντιςωμϊτων. Ο πρωτεώνικϐσ κορμϐσ τησ decorin, με μοριακϐ μϋγεθοσ 45 kda, ταυτοποιόθηκε τϐςο ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ ϐςο και ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων (χόμα 22). Σϐςο οι ςεμινωματϔδεισ ϐςο και οι μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι χαρακτηρύζονται απϐ αυξημϋνη ϋκφραςη τησ decorin ςε ςχϋςη με τουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ, εϑρημα που τεκμηριϔνει την αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ decorin ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ DECORIN ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ Αρχικϔσ, πραγματοποιόθηκε ανοςοώςτοχημικό μελϋτη τησ decorin ςτουσ ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ και ςε φυςιολογικοϑσ ορχικοϑσ ιςτοϑσ. Όπωσ αναγνωρύζεται ςτο ςχόμα 23, ςτο φυςιολογικϐ ιςτϐ η ϋκφραςη τησ decorin εύναι αςθενόσ και εντοπύζεται ςτο διϊμεςο ςυνδετικϐ ιςτϐ, ςτα μεςολοβιϔδη διαφρϊγματα που περιβϊλλουν τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια των ϐρχεων. το φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ η ϋνταςη τησ χρϔςησ για την decorin όταν εντονϐτερη ςε ςχϋςη με την αντύςτοιχη χρϔςη τησ versican. την πλειονϐτητα των αςθενϔν με ςεμινϔματα (n=28, 84.8%) παρατηρόθηκε αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ decorin κυρύωσ ςτο ςτρϔμα που περιβϊλλει τον ϐγκο ενϔ ςε οριςμϋνεσ περιπτϔςεισ εντοπύςθηκε και ςτο ςτρϔμα που βρύςκεται εντϐσ του ϐγκου (χόμα 23). Επιπλϋον, περιςταςιακϊ αναγνωρύςτηκε ενδοκυττϊρια εντϐπιςη τησ decorin ςτα κακοόθη κϑτταρα, παρατόρηςη που υποςτηρύζει την υπϐθεςη για πιθανό ενδογενό ςϑνθεςη ό ενδοκυττϊρωςη τησ decorin απϐ τα κϑτταρα του ϐγκου. τουσ ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ η ϋνταςη τησ χρϔςησ για την decorin όταν εντονϐτερη ςε ςχϋςη με την αντύςτοιχη τησ versican. 149

150 Αποτελϋςματα A B Γ χόμα 23. Ανοςοώςτοχημικϐσ εντοπιςμϐσ τησ decorin ςτον φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ (Α) και ςε ςεμινϔματα ςταδύου Ι (Β) και ςταδύου ΙΙ (Γ). τα ϋνθετα απεικονύζεται η χρϔςη για την decorin ςτο ςϑνολο του δεύγματοσ. Όπωσ διαφαύνεται απϐ το ςχόμα 23 και ςε ςυνδυαςμϐ με τη ποςοτικό ανϊλυςη τησ decorin (χόμα 24), η εναπϐθεςό τησ παρουςιϊζει αυξητικό τϊςη ανϊλογα με το μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου, την παρουςύα μεταςτϊςεων ςτουσ λεμφαδϋνεσ, την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων αλλϊ και το ςτϊδιο τησ νϐςου. Όμωσ, η ανϊλυςη των αποτελεςμϊτων ανϋδειξε ϐτι η εναπϐθεςη τησ decorin ςτο ςτρϔμα του ϐγκου δεν παρουςιϊζει ςτατιςτικϔσ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με τισ κλινικοπαθολογικϋσ μεταβλητϋσ των αςθενϔν με ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (χόμα 24). 150

151 Decorin IHC score Decorin IHC score Decorin IHC score Decorin IHC score Αποτελϋςματα seminoma decorin - T seminoma decorin - N NEW P= T 1 T 2 +T P=0.57 N 0 N 1 +N seminoma decorin - vasc-lymp T 1 invasion T 2 +T 3 0 seminoma N 0 decorin N 1 +N- 2 n P= Non-invasion Invasion 300 P=0.57 Stage I Stage II Non-invasion Invasion 0 Stage I Stage II χόμα 24. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ τησ decorin και των κλινικοπαθολογικϔν χαρακτηριςτικϔν των αςθενϔν με ςεμινϔματα. Οι διαφορϋσ μεταξϑ των υποομϊδων αναλϑθηκαν με Mann-Whitney s U-test και one-way ANOVA (Kruskal- Wallis ANOVA). 151

152 Αποτελϋςματα ΑΝΟ ΟΪ ΣΟΦΗΜΙΚΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΜΕΛΕΣΗ ΚΑΙ ΣΗ DECORIN Τ ΦΕΣΙ Η ΣΗ ΣΟΤ ΜΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙ ΣΙΚΑ ΣΨΝ Α ΘΕΝΨΝ Παραλλόλωσ, πραγματοποιόθηκε ανοςοώςτοχημικό μελϋτη τησ decorin ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Αυξημϋνη χρϔςη τησ decorin παρατηρόθηκε ςε 37 αςθενεύσ (97.3%) με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Η ϋνταςη χρϔςησ για την decorin ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ όταν παρϐμοια με την αντύςτοιχη χρϔςη ςτα ςεμινϔματα. Η εναπϐθεςη τησ decorin παρατηρεύται κυρύωσ ςτο ςτρϔμα που περιβϊλλει τον ϐγκο ενϔ ςπανιϐτερα αναγνωρύζεται ςτο ςτρϔμα που βρύςκεται εντϐσ του ϐγκου ( χόμα 25). A Β embryonal seminoma seminoma embryonal Γ embryonal seminoma χόμα 25. Ανοςοώςτοχημικϐσ εντοπιςμϐσ τησ decorin ςε μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ςταδύου Ι (Α), ςταδύου ΙΙ (Β) και ςταδύου ΙΙΙ (Γ). τα ϋνθετα απεικονύζεται η ϋνταςη τησ χρϔςησ για την decorin ςτο ςϑνολο του δεύγματοσ. 152

153 Decorin IHC score Decorin IHC score Decorin IHC score Decorin IHC score Decorin IHC score Αποτελϋςματα Όπωσ αναγνωρύζεται ςτο ςχόμα 26 και ςε ςυνδυαςμϐ με τη ποςοτικοπούηςη που πραγματοποιόθηκε για την decorin, η εναπϐθεςό τησ παρουςιϊζει όπια ελϊττωςη ανϊλογα με το μϋγεθοσ του ϐγκου, την παρουςύα μεταςτϊςεων ςτουσ λεμφαδϋνεσ, την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων, την παρουςύα απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων αλλϊ και το ςτϊδιο τησ νϐςου (χόμα 26). non-seminoma decorin - T seminoma decorin - n P= T 1 T 2 P=0.52 N 0 N 1 +N Tseminoma 1 Tdecorin 2 - mt 3 0 non-seminoma decorin - Nvasc-lymp 0 N 1 +Ninvasion 2 N P= M 0 M 1 +M P=0.22 Non-invasion Invasion seminoma M 0 decorin M 1 +M 1a + - Mn 21b 0 Non-invasion Invasion P=0.54 Stage I Stage II Stage I Stage II Stage III χόμα 26. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ τησ decorin και των κλινικοπαθολογικϔν χαρακτηριςτικϔν των αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Οι διαφορϋσ μεταξϑ των υποομϊδων αναλϑθηκαν με Mann-Whitney s U-test και one-way ANOVA (Kruskal-Wallis ANOVA). 153

154 Decorin IHC score Αποτελϋςματα Όμωσ, η ανϊλυςη των αποτελεςμϊτων ανϋδειξε, ϐτι η τϊςη για μειοϑμενη εναπϐθεςη τησ decorin ςτο ςτρϔμα του ϐγκου δεν παρουςιϊζει ςτατιςτικϔσ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με τισ κλινικοπαθολογικϋσ μεταβλητϋσ των αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐρχεων (χόμα 26) ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ DECORIN ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ Η ϋκφραςη τησ decorin ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ςυςχετύςτηκε με τον αριθμϐ των αγγεύων. Αντύθετα με τα ευρόματα για τη ςυςχϋτιςη τησ versican με την αγγειογϋνεςη που προαναφϋρθηκαν, διαπιςτϔθηκε ϐτι η αυξημϋνη παρουςύα τησ decorin δεν εμφανύζει ςτατιςτικϊ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με τον αυξημϋνο αριθμϐ αγγεύων ςτο ςτρϔμα των ϐγκων (χόμα 27). Σο αποτϋλεςμα ϋρχεται ςε ςυμφωνύα με τισ προηγηθεύςεσ παρατηρόςεισ ϐτι η εναπϐθεςη τησ decorin ςτο ςτρϔμα του ϐγκου δεν ςχετύζεται με το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των ϐγκων. υνεπϔσ, διαπιςτϔνεται ϐτι η αϑξηςη τησ decorin δεν ευνοεύ την αγγειογϋνεςη και δεν φαύνεται να προϊγει την ανϊπτυξη και μετϊςταςη των ϐγκων. Data Table Y= X R=0.016 P=0.93 decorin Microvessel Αξηζκόο Αγγείωλ number χόμα 27. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ τησ decorin και του αριθμοϑ αγγεύων ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ϐρχεων. 154

155 Αποτελϋςματα 3. ΜΕΛΕΣΗ ΣΨΝ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΨΝ ΠΡΨΣΕΟΓΛΤΚΑΝΨΝ 3.1. ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ SYNDECAN ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΚΑΙ ΗΜΙΠΟΟΣΙΚΗ ΑΝΑΛΤΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ Ε ΥΤΙΟΛΟΓΙΚΟΤ ΙΣΟΤ ΚΑΙ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ ΜΕ RT- PCR Η παρουςύα τησ syndecan-4 μελετόθηκε ςτουσ ιςτοϑσ των αςθενϔν με ϐγκουσ ϐρχεων και ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ με RT-PCR. Ολικϐ RNA απομονϔθηκε απϐ τουσ ιςτοϑσ και παραςκευϊςτηκε cdna ϐπωσ περιγρϊφεται ςτο πειραματικϐ μϋροσ. την ςυνϋχεια, πραγματοποιόθηκε αλυςιδωτό αντύδραςη πολυμερϊςησ (PCR) χρηςιμοποιϔντασ 10 ng cdna και ειδικοϑσ εκκινητϋσ για τα γονύδια τησ syndecan-4 και τησ GAPDH. Μετϊ το τϋλοσ τησ αντύδραςησ, μϋροσ των δειγμϊτων ηλεκτροφορόθηκαν ςε πόκτωμα αγαρϐζησ και ο εκπεμπϐμενοσ φθοριςμϐσ απϐ τισ ζϔνεσ των προώϐντων ποςοτικοποιόθηκε χρηςιμοποιϔντασ ειδικϐ πρϐγραμμα ανϊλυςησ εικϐνασ. Ο λϐγοσ των τιμϔν του φθοριςμοϑ, για κϊθε μϐριο που αναλϑθηκε, προϋκυψε με διαύρεςη τησ τιμόσ που υπολογύςτηκε για την syndecan-4 με την τιμό του φθοριςμοϑ του εςωτερικοϑ πρϐτυπου αναφορϊσ GAPDH που χρηςιμοποιόθηκε. Όπωσ διαφαύνεται ςτο ςχόμα 28, το γονύδιο τησ syndecan-4 εκφρϊζεται τϐςο ςτο φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ ϐςο και ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων. Διαπιςτϔθηκε ϐτι το γονύδιο τησ syndecan-4 εκφρϊζεται ςε μικρϐ βαθμϐ ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ (0.3 ± 0.06), ενϔ παρουςιϊζει ςημαντικϊ μεγαλϑτερη ϋκφραςη ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (0.64 ± 0.11) και ακϐμα μεγαλϑτερη ςτα ςεμινϔματα (0.79 ± 0.14) (χόμα 28). 155

156 Αποτελϋςματα χόμα 28. (A) Ενδεικτικό RT-PCR ανϊλυςη τησ ϋκφραςησ τησ syndecan-4 ςε ςχϋςη με το γονύδιο αναφορϊσ (GAPDH) ςε δϑο φυςιολογικοϑσ ορχικοϑσ ιςτοϑσ (γραμμϋσ 1 και 2), τρεισ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (γραμμϋσ 3, 4 και 5) και ςε τρύα ςεμινϔματα (γραμμϋσ 6, 7 και 8). (B) Ημιποςοτικό ανϊλυςη τησ ϋκφραςησ τησ syndecan-4 με RT-PCR ςε φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ (n=6), μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (n=3) και ςεμινϔματα (n=4). Οι τιμϋσ εκφρϊζουν τισ μϋςεσ τιμϋσ ± SE. P=0.01, Mann-Whitney test ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ Αρχικϔσ, πραγματοποιόθηκε ανοςοώςτοχημικό μελϋτη τησ syndecan-4 ςτα ςεμινϔματα και ςε φυςιολογικοϑσ ορχικοϑσ ιςτοϑσ. το φυςιολογικϐ ιςτϐ, η χρϔςη 156

157 Αποτελϋςματα για την syndecan-4 εύναι όπια και εντοπύζεται ςτα ςπερματικϊ κϑτταρα των ςπερματικϔν ςωληναρύων των ϐρχεων, κυρύωσ πληςύον του βαςικοϑ υμϋνα (ςχόμα 29). Η syndecan-4 εμφανύζει κυτταροπλαςματικϐ και μεμβρανικϐ εντοπιςμϐ ςε αυτϊ τα κϑτταρα. Αντιθϋτωσ, δεν παρατηρόθηκε εναπϐθεςη τησ syndecan-4 ςτον διϊμεςο ςυνδετικϐ ιςτϐ, ςτα μεςολοβιϔδη διαφρϊγματα που περιβϊλλουν τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια των ϐρχεων (ςχόμα 29). χεδϐν ϐλοι οι αςθενεύσ με ςεμινϔματα (n=32, 97%) παρουςύαζαν αυξημϋνη ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτο κυτταρϐπλαςμα και τη μεμβρϊνη των κϑτταρων του ϐγκου (Πύνακασ 5). Πύνακασ 5. Έκφραςη τησ syndecan-4 ςε 33 αςθενεύσ με ςεμινϔματα. Εντόπιςη τησ Syndecan-4 ςτα κύτταρα του όγκου Εντόπιςη τησ Syndecan-4 ςτο ςτρώμα του όγκου <10% 10-30% >30% Αρνητικό Θετικό εμινώματα Επιπλϋον, ςε ςημαντικϐ ποςοςτϐ αςθενϔν με ςεμινϔματα (n=15, 45.5%) διαπιςτϔθηκε εναπϐθεςη τησ syndecan-4 τϐςο ςτα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ϐςο και ςτο ινϔδεσ ςτρϔμα του ϐγκου (Πύνακασ 5). Η εντϐπιςη τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου διαπιςτϔνεται για πρϔτη φορϊ ςτη βιβλιογραφύα και εύναι πιθανϐ ϐτι αποτελεύ ιδιαύτερο χαρακτηριςτικϐ του ςτρϔματοσ καθϔσ αυτϐ ενεργοποιεύται απϐ τη γειτνύαςη με τα κακοόθη κϑτταρα (αντιδραςτικϐ ςτρϔμα), αφοϑ ςε καμύα περύπτωςη δεν διαπιςτϔθηκε ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα των φυςιολογικϔν ιςτϔν (χόμα 29). 157

158 Αποτελϋςματα χόμα 29. Ανοςοώςτοχημικό χρϔςη για την syndecan-4 ςτα ςπερματικϊ ςωληνϊρια ςτον φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ (A και B) και ςε ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐρχεων (Γ και Δ). Εντϐπιςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςε ςεμινϔματα ςταδύου Ι (Γ) και εντϐπιςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα και ςτο ςτρϔμα του ϐγκου ςε ςεμινϔματα ςταδύου ΙΙ (Δ). χεδϐν ςτο ςϑνολο των αςθενϔν, διαπιςτϔθηκε ϋντονη εναπϐθεςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα των ςεμινωμϊτων και δεν πραγματοποιόθηκε ςυςχϋτιςη τησ παρουςύασ τησ ςτα κϑτταρα των ϐγκων με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Αντιθϋτωσ, μελετόθηκε η εναπϐθεςη τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα των ϐγκων και ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Διαπιςτϔθηκε ϐτι η ϋκφραςη τησ syndecan-4 παρουςιϊζει ςτατιςτικϔσ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με την λεμφαδενικό προςβολό (Ρ=0.04), την παρουςύα διηθόςεων ςε αγγεύα και λεμφαγγεύα (Ρ=0.01) και το ςτϊδιο τησ νϐςου (Ρ=0.04) (Πύνακασ 6). 158

159 Αποτελϋςματα Πύνακασ 6. υςχϋτιςη τησ παρουςύασ τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 33 αςθενϔν με ςεμινϔματα. Syndecan-4 ςτο ςτρώμα τατιςτικό Αρνητικό Θετικό Μϋγεθοσ όγκου T1 9 6 T2 +T3 9 9 P=0.73 Προςβολό λεμφαδϋνων N N1+N2 4 9 P=0.04 Παρουςύα αγγειακόσλεμφαγγειακόσ διόθηςησ Αρνητικό 15 6 Θετικό 3 9 P=0.01 τϊδιο I 14 6 II 4 9 P=0.04 Fisher s exact test (two-tailed) ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΣΟΤ ΜΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ Παραλλόλωσ, πραγματοποιόθηκε ανοςοώςτοχημικό μελϋτη τησ syndecan-4 ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. χεδϐν οι μιςού αςθενεύσ με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (n=21, 55.2%) παρουςύαζαν αυξημϋνη χρϔςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου, ενϔ οι υπϐλοιποι αςθενεύσ εμφϊνιζαν μϋτρια ό αςθενό χρϔςη (Πύνακασ 7). Η syndecan-4 παρουςιϊζει κυτταροπλαςματικό ό/και μεμβρανικό εντϐπιςη ςτα κϑτταρα του ϐγκου. 159

160 Αποτελϋςματα Πύνακασ 7. Έκφραςη τησ syndecan-4 ςε 38 αςθενεύσ με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Εντόπιςη τησ Syndecan-4 ςτα κύτταρα του όγκου Εντόπιςη τησ Syndecan-4 ςτο ςτρώμα του όγκου <10% 10-30% >30% Αρνητικό Θετικό Μη ςεμινώματα Επύςησ, ςε μεγϊλο ποςοςτϐ αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (n=22, 57.9%) παρατηρόθηκε εναπϐθεςη τησ syndecan-4 τϐςο ςτα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ϐςο και ςτο ινϔδεσ ςτρϔμα του ϐγκου (χόμα 30, Πύνακασ 7). χόμα 30. Ανοςοώςτοχημικό χρϔςη τησ syndecan-4 ςε μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ των ϐρχεων. Έντονη χρϔςη για την syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςε μεικτοϑσ ϐγκουσ ςταδύου Ι (Α, τερϊτωμα / ςεμύνωμα και Β, εμβρυικϐ / ςεμύνωμα). Ελαττωμϋνη χρϔςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςε μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ςταδύου ΙΙ (Γ, εμβρυικϐ / λεκιθικοϑ αςκοϑ και Δ, εμβρυικϐ). 160

161 Αποτελϋςματα ε καμύα περύπτωςη απϐ τισ εξεταςθεύςεσ δεν παρατηρόθηκε ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα του φυςιολογικοϑ ιςτοϑ (χόμα 29). Η παρουςύα τησ syndecan-4 ςτα κακοόθη κϑτταρα ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Πύνακασ 8. υςχϋτιςη τησ παρουςύασ τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 38 αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Syndecan-4 θετικϊ κύτταρα όγκου τατιςτικό 30% >30% Μϋγεθοσ όγκου T1 2 8 T2 +T P=0.14 Προςβολό λεμφαδϋνων N N1+N2+N P=0.01 Απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ M M1a+M1b 6 2 P=0.11 Διόθηςη αγγεύωνλεμφαγγεύων Αρνητικό 1 10 Θετικό P=0.01 τϊδιο I 3 13 II+III 14 8 P=0.01 Fisher s exact test (two-tailed) Βρϋθηκε ϐτι η παρουςύα μϋτριασ ό αςθενοϑσ ϋκφραςησ τησ syndecan-4 απϐ τα κϑτταρα του ϐγκου ςχετύζεται με την παρουςύα λεμφαδενικϔν εναποθϋςεων τησ 161

162 Αποτελϋςματα νϐςου (Ρ=0.01), την παρουςύα διηθόςεων ςε αγγεύα και λεμφαγγεύα (Ρ=0.01) και το ςτϊδιο τησ νϐςου (Ρ=0.01) (Πύνακασ 8). Πύνακασ 9. υςχϋτιςη τησ παρουςύασ τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 38 αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Syndecan-4 ςτο ςτρώμα τατιςτικό Αρνητικό Θετικό Μϋγεθοσ όγκου T1 6 4 T2 +T P=0.27 Προςβολό λεμφαδϋνων N0 8 8 N1+N2+N P=0.51 Απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ M M1a+M1b 2 6 P=0.43 Διόθηςη αγγεύωνλεμφαγγεύων Αρνητικό 6 5 Θετικό P=0.47 τϊδιο I 8 8 II+III 8 14 P=0.51 Fisher s exact test (two-tailed) Επύςησ, διαπιςτϔθηκε μια ςαφόσ τϊςη ςυςχϋτιςησ τησ μειοϑμενησ παρουςύασ τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου με το μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου (Ρ=0.14) και την παρουςύα απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων (Ρ=0.11) χωρύσ ϐμωσ να παρατηρεύται ςτατιςτικό ςημαντικϐτητα. Η ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα των μη ςεμινωματωδϔν ϐγκων παρουςύαζε όπια αϑξηςη ανϊλογα με το 162

163 Αξηζκόο αγγείωλ Αποτελϋςματα μϋγεθοσ του ϐγκου, την παρουςύα μεταςτϊςεων ςτουσ λεμφαδϋνεσ, την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων, την παρουςύα απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων αλλϊ και το ςτϊδιο τησ νϐςου. Όμωσ, η ανϊλυςη των αποτελεςμϊτων ανϋδειξε ϐτι η τϊςη για αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου δεν παρουςιϊζει ςτατιςτικϔσ ςημαντικό ςυςχϋτιςη με τισ κλινικοπαθολογικϋσ μεταβλητϋσ των αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (Πύνακασ 9) ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΗ SYNDECAN-4 ΣΟ ΣΡΨΜΑ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΟΡΦΕΨΝ Η ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου ςυςχετύςτηκε με τον αριθμϐ των αγγεύων. Διαπιςτϔθηκε ϐτι ϐταν εκφρϊζεται η syndecan-4 ςτο ςτρϔμα παρατηρεύται ςτατιςτικϊ ςημαντικό αϑξηςη του αριθμοϑ των αγγεύων (15.0 ± 1.8, n= 12) ςε ςχϋςη με τον αριθμϐ των αγγεύων που αναγνωρύζονται ϐταν η syndecan-4 απουςιϊζει (10.5 ± 1.0, n= 16) (χόμα 31). P=0.03 * _ + Syndecan-4 (ηξώκα) χόμα 31. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα και του αριθμοϑ αγγεύων ςτουσ ϐγκουσ των ϐρχεων (Student s t-test, two-tailed). 163

164 Αποτελϋςματα Η παρατόρηςη αυτό υποδηλϔνει την εμπλοκό τησ syndecan-4 ςτην πρϐοδο τησ νεοπλαςύασ μϋςω τησ ςυμμετοχόσ τησ ςτην ανϊπτυξη νϋων αγγεύων τα οπούα εύναι απαραύτητα για την τροφοδοςύα του ϐγκου με θρεπτικϊ ςυςτατικϊ. 164

165 Αποτελϋςματα 3.2. ΜΕΛΕΣΗ ΣΟΤ CD44 (standard isoform, CD44s) ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΟΤ CD44 ΣΑ ΕΜΙΝΨΜΑΣΑ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΟΤ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ Η ϋκφραςη του CD44 μελετόθηκε με ανοςοώςτοχημεύα ςτα ςεμινϔματα και ςε φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ. Η ανοςοώςτοχημικό χρϔςη του φυςιολογικοϑ ιςτοϑ ανϋδειξε ϐτι ο CD44 δεν εκφρϊζεται απϐ τα φυςιολογικϊ ςπερματικϊ κϑτταρα των ςπερματικϔν ςωληναρύων των ϐρχεων (χόμα 32). Επιπλϋον, δεν εκφρϊζεται CD44 ςτο διϊμεςο ςυνδετικϐ ιςτϐ, ςτα μεςολοβιϔδη διαφρϊγματα που περιβϊλλουν τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια των ϐρχεων (χόμα 32). Αντιθϋτωσ, ςε κϊποιουσ αςθενεύσ με ςεμινϔματα (n=9, 27%) διαπιςτϔθηκε ϋκφραςη του CD44 απϐ τα κϑτταρα του ϐγκου (Πύνακασ 10) τϐςο κυτταροπλαςματικό ϐςο και μεμβρανικό (χόμα 32). Επύςησ, ςε ςημαντικϐ ποςοςτϐ αςθενϔν με ςεμινϔματα (n=16, 48.5%) διαπιςτϔθηκε παρουςύα του CD44 τϐςο ςτα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ϐςο και ςτο ινϔδεσ ςτρϔμα του ϐγκου (Πύνακασ 10 και χόμα 32). Πύνακασ 10. Έκφραςη του CD44 ςε 33 αςθενεύσ με ςεμινϔματα. Εντόπιςη του CD44 ςτα κύτταρα όγκου Εντόπιςη του CD44 ςτο ςτρώμα του όγκου 10% 10-30% >30% Αρνητικό Θετικό εμινώματα Η εντϐπιςη του CD44 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου αποτελεύ ιδιαύτερο χαρακτηριςτικϐ του ςτρϔματοσ καθϔσ αυτϐ ενεργοποιεύται απϐ τη γειτνύαςη με τα κακοόθη κϑτταρα (αντιδραςτικϐ ςτρϔμα), αφοϑ ςε καμύα περύπτωςη δεν διαπιςτϔθηκε ϋκφραςη του CD44 ςτο ςτρϔμα των φυςιολογικϔν ιςτϔν (χόμα 32). 165

166 Αποτελϋςματα (Α) (Β) (Γ) (Γ) (Δ) (Ε) χόμα 32. Ανοςοώςτοχημικό χρϔςη για τον CD44 ςτα ςπερματικϊ ςωληνϊρια ςτον φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ (A και B), ςε ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐρχεων ςταδύου Ι (Γ και Δ) και ςταδύου ΙΙ (Ε και Ζ). Ο υποδοχϋασ CD44 εντοπύζεται ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςε ςεμινϔματα ςταδύου ΙΙ (Ε) και ςτο ςτρϔμα του ϐγκου (Ζ). Η ϋκφραςη του CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςτα ςεμινϔματα ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Διαπιςτϔθηκε ϐτι η παρουςύα του CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςχετύζεται με το μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ 166

167 Αποτελϋςματα ϐγκου (Ρ=0.02), τη λεμφαδενικό προςβολό (Ρ=0.01), την παρουςύα διηθόςεων ςε αγγεύα και λεμφαγγεύα (Ρ=0.04) και το ςτϊδιο τησ νϐςου (Ρ=0.01) (Πύνακασ 11). Πύνακασ 11. υςχϋτιςη τησ παρουςύασ του CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 33 αςθενϔν με ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. CD44 θετικϊ κύτταρα όγκου τατιςτικό 10% >10% Μϋγεθοσ όγκου T T2 +T P=0.02 Προςβολό λεμφαδϋνων N N1+N2 6 7 P=0.01 Διόθηςη αγγεύωνλεμφαγγεύων Αρνητικό 18 3 Θετικό 6 6 P=0.04 τϊδιο I 18 2 II 6 7 P=0.01 Fisher s exact test (two-tailed) τη ςυνϋχεια, μελετόθηκε η παρουςύα του CD44 ςτο ςτρϔμα των ςεμινωμϊτων και ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Διαπιςτϔθηκε ϐτι η ϋκφραςη του CD44 ςτο ςτρϔμα των ςεμινωμϊτων ςχετύζεται με το μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου (Ρ=0.04), τη λεμφαδενικό μετϊςταςη (Ρ=0.01), την παρουςύα διηθόςεων ςε αγγεύα και λεμφαγγεύα (Ρ=0.03) και το ςτϊδιο τησ νϐςου (Ρ=0.01) (Πύνακασ 12). 167

168 Αποτελϋςματα Πύνακασ 12. υςχϋτιςη τησ παρουςύασ του CD44 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 33 αςθενϔν με ςεμινϔματα. CD44 ςτο ςτρώμα τατιςτικό Αρνητικό Θετικό Μϋγεθοσ όγκου T T2 +T P=0.04 Προςβολό λεμφαδϋνων N N1+N P=0.01 Παρουςύα αγγειακόσλεμφαγγειακόσ διόθηςησ Αρνητικό 14 7 Θετικό 3 9 P=0.03 τϊδιο I 14 6 II 3 10 P=0.01 Fisher s exact test (two-tailed) ΑΝΟΟΪΣΟΦΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΟΤ CD44 ΣΟΤ ΜΗ ΕΜΙΝΨΜΑΣΨΔΕΙ ΟΓΚΟΤ ΚΑΙ ΤΦΕΣΙΗ ΣΟΤ ΜΕ ΣΑ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ ΦΑΡΑΚΣΗΡΙΣΙΚΑ ΣΨΝ ΑΘΕΝΨΝ Παραλλόλωσ, πραγματοποιόθηκε ανοςοώςτοχημικό μελϋτη του CD44 ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Μερικού αςθενεύσ με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (n=14, 36.8%) παρουςύαζαν εντϐπιςη του CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου, ενϔ οι υπϐλοιποι αςθενεύσ όταν αρνητικού ωσ προσ την ϋκφραςη του CD44 (χόμα 33, Πύνακασ 13). Ο CD44 παρουςιϊζει κυτταροπλαςματικό ό μεμβρανικό εντϐπιςη ςτα κϑτταρα του ϐγκου. 168

169 Αποτελϋςματα Πύνακασ 13. Έκφραςη του CD44 ςε 38 αςθενεύσ με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. CD44 θετικϊ κύτταρα όγκου CD44 ςτο ςτρώμα 10% 10-30% >30% Αρνητικό Θετικό Μη ςεμινώματα Επύςησ, ςε μικρϐ ποςοςτϐ των αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ (n=10, 26.3%) παρατηρόθηκε εναπϐθεςη του CD44 τϐςο ςτα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ϐςο και ςτο ινϔδεσ ςτρϔμα του ϐγκου (χόμα 33, Πύνακασ 13). Όπωσ ϋχει αναφερθεύ, δε διαπιςτϔθηκε ϋκφραςη του CD44 ςτο φυςιολογικϐ ιςτϐ (χόμα 32). (Α) (Β) (Γ) (Γ) χόμα 33. Ανοςοώςτοχημικό χρϔςη του CD44 ςε μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ των ϐρχεων. Φρϔςη για τον CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου και ςτο ςτρϔμα ςε εμβρυώκϐ καρκύνωμα ςταδύου ΙΙ (Α) και ςε μικτϐ ϐγκο (εμβρυώκϐ καρκύνωμα και ϐγκοσ του λεκιθικοϑ αςκοϑ) ςταδύου ΙΙ (Β). Απουςύα χρϔςησ για τον CD44 ςε τερατϔματα ςταδύου Ι (Γ) και ςταδύου ΙΙΙ (Δ). 169

170 Αποτελϋςματα Η παρουςύα του CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Διαπιςτϔθηκε ϐτι η ϋκφραςη του CD44 απϐ τα κϑτταρα του ϐγκου δεν ςχετύζεται με καμύα κλινικοπαθολογικό μεταβλητό που μελετόθηκε. (Πύνακασ 14). Πύνακασ 14. υςχϋτιςη τησ ϋκφραςησ του CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 38 αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. CD44 θετικϊ κύτταρα όγκου τατιςτικό 10% >10% Μϋγεθοσ όγκου T1 9 1 T2 +T P=0.06 Προςβολό λεμφαδϋνων N N1+N2+N P=1.0 Απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ M M1a+M1b 4 4 P=0.43 Διόθηςη αγγεύωνλεμφαγγεύων Αρνητικό 8 3 Θετικό P=0.49 τϊδιο I 10 6 II+III 14 8 P=1.0 Fisher s exact test (two-tailed) τη ςυνϋχεια μελετόθηκε η παρουςύα του CD44 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ςε ςχϋςη με τα κλινικοπαθολογικϊ 170

171 Αποτελϋςματα χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Δεν παρατηρόθηκε καμύα ςυςχϋτιςη τησ παρουςύασ του CD44 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου με τισ κλινικοπαθολογικϋσ μεταβλητϋσ των αςθενϔν (Πύνακασ 15). Πύνακασ 15. υςχϋτιςη τησ παρουςύασ του CD44 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ 38 αςθενϔν με μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. CD44 ςτο ςτρώμα τατιςτικό Αρνητικό Θετικό Μϋγεθοσ όγκου T1 7 3 T2 +T P=1.0 Προςβολό λεμφαδϋνων N N1+N2+N P=0.46 Απομακρυςμϋνεσ μεταςτϊςεισ M M1a+M1b 4 4 P=0.17 Διόθηςη αγγεύωνλεμφαγγεύων Αρνητικό 8 3 Θετικό 20 7 P=1.0 τϊδιο I 13 3 II+III 15 7 P=0.46 Fisher s exact test (two-tailed) 171

172 Microvessel Αξηζκόο αγγείωλ number Αποτελϋςματα ΤΦΕΣΙΗ ΣΗ ΕΚΥΡΑΗ ΣΟΤ CD44 ΣΟ ΣΡΨΜΑ ΣΟΤ ΟΓΚΟΤ ΜΕ ΣΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΗ Η ϋκφραςη του CD44 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου ςυςχετύςτηκε με τον αριθμϐ των αγγεύων. Διαπιςτϔθηκε ϐτι ϐταν εκφρϊζεται CD44 ςτο ςτρϔμα παρατηρεύται ςτατιςτικϊ ςημαντικό αϑξηςη του αριθμοϑ των αγγεύων (16.8 ± 2.2, n= 8) ςε ςχϋςη με τον αριθμϐ των αγγεύων που μετροϑνται ϐταν o CD44 απουςιϊζει (10.8 ± 1.0, n= 20) (χόμα 34). Η παρατόρηςη υποδηλϔνει το θετικϐ ρϐλο τησ ϋκφραςησ του CD44 ςτο ςτρϔμα του ϐγκου για την ανϊπτυξη νϋων αγγεύων τα οπούα εύναι απαραύτητα για την τροφοδοςύα του ϐγκου και την μετϊςταςη των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων. P=0.01 * _ + Stromal CD44 (ηξώκα) CD44 χόμα 34. υςχϋτιςη τησ ανοςοώςτοχημικόσ χρϔςησ του CD44 ςτο ςτρϔμα και του αριθμοϑ αγγεύων ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων (Student s t-test, two-tailed). 172

173 ΤΖΗΣΗΗ ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ 173

174 174

175 υζότηςη - υμπερϊςματα Οι versican και decorin εύναι PGs που εκκρύνονται ςτον ECM και εμφανύζουν ευρεύα κατανομό ςτουσ ιςτοϑσ. ε πολλϋσ μελϋτεσ ϋχει αποδειχθεύ ϐτι και οι δϑο PGs ανευρύςκονται ςε αυξημϋνα ποςϊ ςε διϊφορουσ ϐγκουσ ςε ςχϋςη με τουσ αντύςτοιχουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ (Theocharis AD 2008, Goldoni S & Iozzo RV 2008, Timar J et al. 2002). κοπϐσ τησ διδακτορικόσ διατριβόσ όταν να μελετηθεύ η ϋκφραςό τουσ ςτα ςεμινϔματα και τουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐρχεων και να διερευνηθεύ η πιθανό ςυςχϋτιςη τησ ϋκφραςόσ τουσ με τη βιολογικό ςυμπεριφορϊ των ϐγκων. Διαπιςτϔθηκε ςημαντικό αϑξηςη των ποςϔν και των δϑο PGs κυρύωσ ςτο ςτρϔμα που περιβϊλλει τϐςο τουσ ςεμινωματϔδεισ ϐςο και τουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Οι μηςεμινωματϔδεισ ϐγκοι χαρακτηρύζονται απϐ μεγαλϑτερη αϑξηςη ςτην ϋκφραςη τησ versican ςε ςχϋςη με τουσ ςεμινωματϔδεισ. Η decorin παρουςιϊζει ςχεδϐν παρϐμοια επύπεδα ϋκφραςησ και ςτισ δϑο κατηγορύεσ ϐγκων ϐρχεων. Η αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ decorin ςτο ςτρϔμα των ϐγκων δεν ςυςχετύζεται ςτατιςτικϊ με καμύα απϐ τισ κλινικοπαθολογικϋσ μεταβλητϋσ που μελετόθηκαν. Αντιθϋτωσ, η αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ versican τϐςο ςτα ςεμινϔματα ϐςο και ςτουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ςυςχετύζεται ςτατιςτικϊ με την παρουςύα αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων, το μϋγεθοσ του πρωτοπαθοϑσ ϐγκου (ςτατιςτικϊ ςημαντικό ςυςχϋτιςη παρατηρόθηκε μϐνο ςτουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ), την παρουςύα λεμφαδενικόσ προςβολόσ, την ϑπαρξη απομακρυςμϋνων μεταςτϊςεων (αξιολογόθηκε μϐνο ςτουσ μηςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ) και το ςτϊδιο τησ νϐςου. Σα ςεμινϔματα και οι μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι εμφανύζουν διακριτϊ ιςτοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ και διαφϋρουν ςε ςχϋςη με την πρϐγνωςό τουσ. Οι μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι ϋχουν πιο επιθετικό ςυμπεριφορϊ και γενικϊ χαρακτηρύζονται απϐ πιο δυςμενό πρϐγνωςη. Η παρατόρηςη ϐτι η versican παρουςιϊζει υψηλϐτερη ϋκφραςη ςε αυτοϑσ τουσ ϐγκουσ ςε ςχϋςη με τα ςεμινϔματα και ςυςχετύζεται με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν που ςυνδϋονται με τη διαςπορϊ και την πρϐοδο του ϐγκου ϋρχεται ςε ςυμφωνύα με τα ευρόματα ϊλλων μελετϔν που καταδεικνϑουν την versican ωσ μια PG που προϊγει την ογκογϋνεςη. Σα ευρόματα εύναι ςε αναλογύα με την παρατόρηςη ϐτι η υποτροπό τησ νϐςου ςε γυναύκεσ με καρκύνο μαςτοϑ που δεν εμφϊνιζαν αρχικϊ λεμφαδενικϋσ μεταςτϊςεισ, ςυςχετύζεται με την αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ versican ςτον ECM που 175

176 υζότηςη - υμπερϊςματα περιβϊλλει τον αρχικϐ ϐγκο και οφεύλεται ςτην αυξημϋνη βιοςϑνθεςό τησ απϐ τουσ διεγερμϋνουσ ινοβλϊςτεσ του ςτρϔματοσ (Theocharis AD 2008)). Επιπροςθϋτωσ, μελϋτεσ που πραγματοποιόθηκαν ςε αςθενεύσ με καρκύνο προςτϊτη πρϔιμου ςταδύου (Ricciardelli C et al. 1998) και ςε αςθενεύσ με καρκύνο ωοθηκϔν (Voutilainen K et al. 2003) ανϋδειξαν ϐτι η αυξημϋνη ϋκφραςη τησ versican ςυνδϋεται με την πρϐοδο τησ νϐςου, ςτηρύζοντασ την ϊποψη ϐτι η παρουςύα τησ ςτο ςτρϔμα του ϐγκου ςυνδϋεται με επιθετικϐτερη βιολογικό ςυμπεριφορϊ. Η versican εκκρύνεται κυρύωσ απϐ τουσ διεγερμϋνουσ ινοβλϊςτεσ του ςτρϔματοσ αν και κϊποιεσ μελϋτεσ υποςτηρύζουν ϐτι τα κακοόθη κϑτταρα μποροϑν να ςυνθϋςουν και να εκκρύνουν PGs (Theocharis AD 2008, Dobra K et al. 2000). Πιςτεϑεται ϐτι η versican εύναι προώϐν παρακρινοϑσ δρϊςησ και εκκρύνεται ςτο ςτρϔμα του ϐγκου απϐ ινοβλϊςτεσ που διεγεύρονται μϋςω κυττοκινϔν που προϋρχονται απϐ καρκινικϊ κϑτταρα, ϐπωσ εύναι ο TGFβ και ο PDGF, για να την βιοςυνθϋςουν ςε υψηλϐτερα ποςϊ (Sakko AJ et al. 2001, Wight TN 2002, Schonherr E et al. 1997, Syrokou A et al. 1999). Πρϐςφατα αποδεύχθηκε ϐτι η βιοςϑνθεςη τησ versican ρυθμύζεται απϐ μικροrnas (mirna) (Lee DY et al. 2009). Σο mir-199a* αποτελεύ ρυθμιςτικϐ μϐριο για τη μετα-μεταγραφικό αποςιϔπηςη του γονιδύου τησ versican δεςμευϐμενο ςτο 3 -ϊκρο (3 -UTR) του mrna τησ versican προκαλϔντασ καταςτολό τησ μετϊφραςόσ του. Εύναι πολϑ ενδιαφϋρον ϐτι το mir-199a* θεωρεύται ογκο-καταςταλτικϐ mirna αφοϑ αναςτϋλλει την βιοςϑνθεςη μορύων που εμπλϋκονται ςτην ανϊπτυξη των ϐγκων ενϔ επιπλϋον ςυχνϊ διαπιςτϔνεται καταςτολό τησ ϋκφραςόσ του ςτισ κακοόθειεσ (Migliore C et al. 2008). Η versican εύναι ϋνα μακρομϐριο του ECM που εμποδύζει την ιςχυρό προςκϐλληςη των κυττϊρων ςτον ECM και ευνοεύ την αποκϐλληςό τουσ κατϊ τη μετακύνηςη (Theocharis AD 2008, Ricciardelli C et al. 2007). Αυτό η ιδιϐτητα εδρϊζεται ςτην G1 ςφαιρικό περιοχό του μορύου (Ricciardelli C et al. 2007, Ang LC et al. 1999, Yang BL et al. 1999), η οπούα ϋχει την ικανϐτητα να αλληλεπιδρϊ με το ςϑμπλοκο του ΗΑ με τον υποδοχϋα του CD44 και να ςχηματύζει υπερμοριακϊ ςϑμπλοκα ςτη μεμβρϊνη των κυττϊρων. Έτςι, προκαλεύται διϐγκωςη και αυξϊνεται η ιξωδοελαςτικό φϑςη του περικυττϊριου χϔρου δημιουργϔντασ ϋνα κατϊλληλο εξωκυττϊριο μικροπεριβϊλλον που επιτρϋπει απαραύτητεσ μεταβολϋσ του ςχόματοσ των κυττϊρων οι οπούεσ θεωροϑνται αναγκαύεσ τϐςο για τον πολλαπλαςιαςμϐ τουσ ϐςο και τη 176

177 υζότηςη - υμπερϊςματα μετακύνηςό τουσ (Wight TN 2002). Η χορόγηςη μικροϑ μοριακοϑ μεγϋθουσ ολιγομερϔν του ΗΑ, τα οπούα εύναι ικανϊ να αλληλεπιδρϊςουν τϐςο με ϋνα μϐριο υποδοχϋα CD44 ϐςο και με ϋνα μϐριο τησ versican, αλλϊ δεν μποροϑν να ςχηματύςουν μεγϊλου μοριακοϑ μεγϋθουσ ςϑμπλοκα αποτελοϑμενα απϐ μεγϊλο αριθμϐ μορύων ΗΑ-CD44- versican, αναςτϋλλει τη δημιουργύα υπερμοριακϔν ςυμπλϐκων ςτη μεμβρϊνη και καταςτϋλλει τον πολλαπλαςιαςμϐ και τη μετακύνηςη των καρκινικϔν κυττϊρων. Επιπλϋον, η χορόγηςη ολιγομερϔν του ΗΑ αναςτϋλλει τη δημιουργύα ςυμπλϐκων του CD44 με διϊφορουσ υποδοχεύσ με δρϊςη κινϊςησ τυροςύνησ και τη μετϊδοςη ςόματοσ μϋςω των αντύςτοιχων μονοπατιϔν (Misra S et al. 2006). Η χρόςη ολιγομερϔν του ΗΑ μπορεύ να ϋχει θεραπευτικό χρηςιμϐτητα αφοϑ εμποδύζει την αλληλεπύδραςη του ακϋραιου, μεγϊλου μοριακοϑ μεγϋθουσ ΗΑ με την versican και τον υποδοχϋα CD44 με αποτϋλεςμα την επιβρϊδυνςη τησ επϋκταςησ των κυττϊρων του ϐγκου αλλϊ και την καταςτολό των ςηματοδοτικϔν μονοπατιϔν τουσ. Όπωσ προαναφϋρθηκε, η G1 ςφαιρικό περιοχό τησ versican ελαττϔνει την προςκϐλληςη των κυττϊρων ςτον ECM και μϋςω αυτόσ τησ ιδιϐτητϊσ τησ προϊγει τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ. Η G3 ςφαιρικό περιοχό τησ versican μπορεύ επύςησ να επϊγει τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ, μϋςω δομικϔν μοτύβων που προςομοιϊζουν ςτον EGF και εντοπύζονται ςε αυτόν την περιοχό. Σα μοτύβα αλληλεπιδροϑν και διεγεύρουν τον EGFR, μιμοϑμενα τη δρϊςη του αντύςτοιχου αυξητικοϑ παρϊγοντα (Zhang Y et al. 1998). Μελϋτεσ ςε κϑτταρα αςτροκυττϔματοσ ϋχουν δεύξει ϐτι μϐνο η υπερϋκφραςη τησ G1 ςφαιρικόσ περιοχόσ τησ versican διεγεύρει τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ ενϔ η υπερϋκφραςη τησ G3 ςφαιρικόσ περιοχόσ τησ versican αυξϊνει την ανϊπτυξη του ϐγκου και την αγγειογϋνεςη ςε ζωικϊ μοντϋλα (Zheng PS et al. 2004). Πιςτεϑεται, ϐτι οι ςφαιρικϋσ περιοχϋσ τησ versican ελϋγχουν με διαφορετικϐ μηχανιςμϐ την ανϊπτυξη του ϐγκου και ϋχουν ςυνεργατικοϑσ ρϐλουσ ςτην πρϐοδο και μετϊςταςη των καρκινικϔν κυττϊρων. Διϊφορεσ πρωτεϊςεσ (ADAMTS, MMPs και η πλαςμύνη) μποροϑν να αποικοδομόςουν την versican και να απελευθερωθοϑν θραϑςματα που περιϋχουν ακϋραιεσ τισ ςφαιρικϋσ περιοχϋσ G1 και G3 (Sandy JD et al. 2001, Kern CB et al. 2006). Σϋτοια θραϑςματα ανευρύςκονται ςε καρκινικοϑσ ιςτοϑσ και πιςτεϑεται ϐτι επηρεϊζουν τη μετακύνηςη και μετϊςταςη των καρκινικϔν κυττϊρων (Zheng PS et al. 2004). Πρϐςφατα, αναδεύχθηκε ϐτι θραϑςματα τησ versican ςυναντϔνται ςτο ςτρϔμα 177

178 υζότηςη - υμπερϊςματα που περιβϊλλει καρκινικϊ κϑτταρα προςτϊτη, ςε περιοχϋσ ϐπου υπερεκφρϊζονται οι ADAMTS-1 και ADAMTS-4 (Ricciardelli C et al. 2009). Η χορόγηςη μονοκλωνικοϑ αντιςϔματοσ, που αναγνωρύζει την περιοχό ϐπου αποικοδομεύται η versican απϐ τισ ADAMTS, ανϋςτειλε τη μετανϊςτευςη των κυττϊρων γλοιϔματοσ με δοςοεξαρτϔμενο τρϐπο, ενιςχϑοντασ την ϊποψη ϐτι η τοπικό ςυςςϔρευςη θραυςμϊτων τησ versican προϊγει την κινητικϐτητα και μετϊςταςη των κακοόθων κυττϊρων (Arslan F et al. 2007). Παρϐμοια θραϑςματα τησ versican ανιχνεϑτηκαν ςε αυξημϋνα ποςϊ ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων που μελετόςαμε και πιθανϐτατα προϋρχονται απϐ την εξωκυττϊρια αποικοδϐμηςη τησ versican απϐ ϊγνωςτεσ πρωτεϊςεσ (χόμα 16). Η ταυτοπούηςη των θραυςμϊτων τησ versican ςε ςυνδυαςμϐ με την παρατόρηςη ϐτι η αυξημϋνη ϋκφραςό τησ ςχετύζεται τϐςο με το μεταςτατικϐ δυναμικϐ ϐςο και την αγγειογϋνεςη ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων ενιςχϑουν την ϊποψη ϐτι το ακϋραιο μϐριο και τα πρωτεολυτικϊ θραϑςματα τησ versican ςυμμετϋχουν ενεργϊ ςτην ογκογϋνεςη. Ο ρϐλοσ τησ versican ςτην κυτταρικό μετανϊςτευςη ϋχει μελετηθεύ ςε κϑτταρα τησ νευρικόσ ακρολοφύασ (Perissinotto D et al. 2000). Έχει δειχθεύ ϐτι η versican ςηματοδοτεύ τισ οδοϑσ μετανϊςτευςησ των κυττϊρων τησ νευρικόσ ακρολοφύασ και αυτό η λειτουργύα τησ ρυθμύζεται τϐςο απϐ τον πρωτεώνικϐ κορμϐ τησ ϐςο και απϐ τισ GAG αλυςύδεσ που περιϋχει. Η versican που απομονϔθηκε απϐ τισ μεταναςτευτικϋσ οδοϑσ περιϋχει κυρύωσ CS που εύναι θειωμϋνη ςτον C-6 τησ εξοζαμύνησ, ενϔ η παρουςύα αλυςύδων DS ςτην versican πιςτεϑεται ϐτι απωθεύ τα κϑτταρα τησ νευρικόσ ακρολοφύασ καταςτϋλλοντασ τη μετανϊςτευςό τουσ ςε αυτϋσ τισ περιοχϋσ (Perissinotto D et al. 2000). Επιπλϋον, αξιοςημεύωτη εύναι η παρατόρηςη ϐτι η versican που απομονϔθηκε ςε διϊφορουσ τϑπουσ καρκύνου εμφανύζει ςημαντικϋσ μεταμεταφραςτικϋσ τροποποιόςεισ ςτην δομό τησ ςε ςχϋςη με αυτό που ςυναντϊται ςτουσ αντύςτοιχουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ και περιϋχει κυρύωσ CS που εύναι θειωμϋνη ςτον C- 6 τησ εξοζαμύνησ (Theocharis AD et al. 2003, Tsara M et al. 2002, Theocharis AD 2002). Πιςτεϑεται ϐτι η τροποποιημϋνη γλυκοζυλύωςη τησ versican επηρεϊζει τη μετανϊςτευςη των καρκινικϔν κυττϊρων μϋςω ενϐσ αντύςτοιχου μηχανιςμοϑ με αυτϐν που ςυναντϊται ςτα κϑτταρα τησ νευρικόσ ακρολοφύασ. Αυτϋσ οι παρατηρόςεισ υποςτηρύζουν την ϊποψη ϐτι η versican ϋχει ευοδοτικό δρϊςη ςτην ανϊπτυξη και πρϐοδο των ϐγκων ϐρχεων. Επιπλϋον, ςτην παροϑςα μελϋτη 178

179 υζότηςη - υμπερϊςματα βρϋθηκε ϐτι η ςυςςϔρευςη τησ versican ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ϐρχεων ςχετύζεται με την παρουςύα μεγαλϑτερου αριθμοϑ νϋων αγγεύων. Η αγγειογϋνεςη αποτελεύ απαραύτητη προϒπϐθεςη για την πρϐοδο τησ νϐςου και ύςωσ διευκολϑνεται απϐ την ικανϐτητα τησ versican να δημιουργεύ ϋνα υψηλϊ ενυδατωμϋνο αντιπροςκολλητικϐ μικροπεριβϊλλον που προϊγει τη μετανϊςτευςη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων και τη δημιουργύα νϋων αγγεύων. Κατϊ τη δημιουργύα νϋων αγγεύων, τα διεγερμϋνα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα εμφανύζουν ςημαντικϊ αυξημϋνη ςϑνθεςη και ςυςςϔρευςη τησ versican ςτον ECM (Cattaruzza S et al. 2002) και πιθανϐν εύναι ςυνυπεϑθυνα μαζύ με τουσ ινοβλϊςτεσ του ςτρϔματοσ και τα καρκινικϊ κϑτταρα για τη ςυςςϔρευςό τησ ςτο ςτρϔμα. Όπωσ προαναφϋρθηκε, η versican ιδιαύτερα μϋςω τησ G3 ςφαιρικόσ περιοχόσ τησ, διεγεύρει τον πολλαπλαςιαςμϐ και τη μετανϊςτευςη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων (Zheng PS et al. 2004) και λϐγω τησ μεγϊλησ ςυςςϔρευςόσ τησ ςτο ςτρϔμα των περιςςοτϋρων τϑπων καρκύνου, θεωρεύται ϐτι αποτελεύ ϋνα καθοριςτικϐ μϐριο για την ανϊπτυξη του ϐγκου και τη νεοαγγειογϋνεςη. Αντιθϋτωσ, η decorin εύναι ιςχυρϐσ αναςτολϋασ τησ ανϊπτυξησ των κακοόθων κυττϊρων τροποποιϔντασ την ενεργοπούηςη ςημαντικϔν ςηματοδοτικϔν μονοπατιϔν. Αλληλεπιδρϊ ϊμεςα με τον EGFR και καταςτϋλλει την ενεργϐτητϊ του καθϔσ επύςησ και την ενεργϐτητα ϊλλων υποδοχϋων τησ οικογϋνειασ ErbB, ϐπωσ εύναι ο ErbB2 και ο ErbB4 (Santra M et al. 2000, Csordas G et al. 2000). Οι υποδοχεύσ υπερεκφρϊζονται και / ό μεταλλϊςονται ςε πολλϋσ κακοόθειεσ ςυνειςφϋροντασ ςτην πρϐοδο τησ νϐςου. Η decorin προκαλεύ αναςτολό τησ ανϊπτυξησ ςε πολλϋσ νεοπλαςματικϋσ κυτταρικϋσ ςειρϋσ επϊγοντασ την ϋκφραςη αναςτολϋων του κυτταρικοϑ κϑκλου ϐπωσ εύναι η p21 (Csordas G et al. 2000, Santra M et al. 1997). Η decorin ενεργοποιεύ ϋνα ςηματοδοτικϐ μονοπϊτι διαφορετικϐ απϐ αυτϐ που ενεργοποιεύται απϐ τη δϋςμευςη του EGF, πιθανϐν επϊγοντασ μια διαφορετικό διαμϐρφωςη ςτον EGFR, η οπούα προκαλεύ την αυτοφωςφορυλύωςη ειδικϔν τυροςινϔν (χόμα 12). Επιπλϋον, η decorin ςυναγωνύζεται με τον EGF για τη δϋςμευςη ςτον EGFR ςτην επιφϊνεια των καρκινικϔν κυττϊρων. Έπειτα απϐ τη δϋςμευςό τησ με αυτϐν, προκαλεύται διμεριςμϐσ του υποδοχϋα και ακολοϑθωσ το ςϑμπλοκο ενδοκυτταρϔνεται και αποικοδομεύται ςτα λυοςϔματα (χόμα 12) (Zhu J-X et al. 2005). Η επϔαςη των κυττϊρων με την decorin ό η de novo ϋκφραςό τησ απϐ τα 179

180 υζότηςη - υμπερϊςματα κϑτταρα προκαλεύ παρατεταμϋνη ενεργοπούηςη των MAPKs που οδηγεύ ςτην αναςτολό τησ κυτταρικόσ ανϊπτυξησ και ςε ελϊττωςη των επιπϋδων του EGFR (Csordas G et al. 2000, Moscatello DK et al. 1998). Επύςησ, η decorin προκαλεύ αναςτολό τησ ενεργοπούηςησ των ErbB2 και ErbB4 αφοϑ επϊγει την αποικοδϐμηςό τουσ (Santra M et al. 2000, Reed CC et al. 2005). Πρϐςφατη μελϋτη ανϋδειξε ϐτι η decorin αλληλεπιδρϊ με τον Met, τον υποδοχϋα του HGF, προκαλϔντασ παροδικό ενεργοπούηςό του και αλληλεπύδραςό του με την Ε3 λιγϊςη ουβικουιτύνησ c-cbl με αποτϋλεςμα την ταχεύα ενδοκυττϊρια αποικοδϐμηςό του (Goldoni S et al. 2009). Επιπλϋον, ελαττωμϋνη ϋκφραςη τησ decorin ςχετύζεται με κακό πρϐγνωςη ςε περιπτϔςεισ αςθενϔν με καρκύνο μαςτοϑ χωρύσ παρουςύα λεμφαδενικϔν μεταςτϊςεων, που θεωρητικϊ ϋχουν ευνοώκό πρϐγνωςη (Troup S et al. 2003) καθϔσ και ςε ϊλλουσ τϑπουσ κακοηθειϔν (Matsumine A et al. 2007). Σα παραπϊνω ευρόματα εύναι ςε ςυμφωνύα με την παρατόρηςη ϐτι η αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ decorin ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ϐρχεων δεν ςχετύζεται με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν που εύναι ενδεικτικϊ για επιθετικό ςυμπεριφορϊ τησ νϐςου. Επιπλϋον, η ϋκφραςη τησ decorin ςτο ςτρϔμα δεν ςυςχετύςτηκε με αυξημϋνο αριθμϐ αγγεύων ςτουσ ϐγκουσ των ϐρχεων. Η decorin πιθανϐν αναςτϋλλει την αγγειογϋνεςη αφοϑ ϋχει προταθεύ ϐτι προκαλεύ καταςτολό τησ βιοςϑνθεςησ του VEGF απϐ τα κϑτταρα του ϐγκου (Grant DS et al. 2002). Σα χαμηλϊ επύπεδα του VEGF, που εύναι ιςχυρϐσ επαγωγϋασ τησ αγγειογϋνεςησ, ςτο μικροπεριβϊλλον του ϐγκου ςυνδϋονται με ελαττωμϋνη δημιουργύα νϋων αγγεύων ςτο ςτρϔμα του ϐγκου. Επιπλϋον, η decorin μϐνη ό ςε ςυνδυαςμϐ με τη θρομβοςπονδύνη-1 παρεμποδύζει την ενεργοπούηςη των υποδοχϋων των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων που προκαλεύται απϐ την αλληλεπύδραςό τουσ με μϐρια του ECM. Με αυτϐ τον τρϐπο, αναςτϋλλεται η ςηματοδϐτηςη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων απϐ μϐρια του ECM που φυςιολογικϊ προκαλεύ αναδιοργϊνωςη του κυτταροςκελετοϑ, μετανϊςτευςη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων και δημιουργύα δομϔν που προςομοιϊζουν με αγγεύα in vitro (Davies CL et al. 2001). Σα ευρόματα τησ διδακτορικόσ διατριβόσ ςε ςχϋςη με την ϋκφραςη και το ρϐλο των εξωκυττϊριων PGs, versican και decorin εύναι ςε ςυμφωνύα με προηγοϑμενεσ μελϋτεσ και υποςτηρύζουν την υπϐθεςη ϐτι εύναι ςημαντικϊ βιολογικϊ μϐρια που εμπλϋκονται ςτην ανϊπτυξη και μετϊςταςη των κυττϊρων του ϐγκου. Η ϋκφραςη τησ 180

181 υζότηςη - υμπερϊςματα versican αποτελεύ βιολογικϐ δεύκτη ςτουσ αςθενεύσ με ϐγκουσ ϐρχεων και ςχετύζεται με το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των κυττϊρων του ϐγκου. Προτεύνεται η ενδελεχόσ μελϋτη του ρϐλου τησ versican με ςκοπϐ να προςδιοριςτεύ η κλινικό ςημαςύα τησ ϋκφραςόσ τησ και η προγνωςτικό αξύα τησ, ϐπωσ ςτην πρϐγνωςη αςθενϔν ςταδύου Ι με μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ που μπορεύ να αναπτϑξουν μικρομεταςτϊςεισ. Η αναγνϔριςη αξιϐπιςτων προγνωςτικϔν δεικτϔν ςε αυτοϑσ τουσ αςθενεύσ αποτελεύ ςημαντικό πρϐκληςη και ϋχει ωσ ςκοπϐ την καλϑτερη θεραπευτικό αντιμετϔπιςη ςϑμφωνα με τον εξατομικευμϋνο κύνδυνο που εμφανύζει κϊθε αςθενόσ να αναπτϑξει μεταςτϊςεισ. Μια ϊλλη βιολογικϊ ςημαντικό οικογϋνεια PGs που βρύςκονται ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη εύναι οι syndecans. Αυτϋσ ςυμμετϋχουν ενεργϊ ςτην αλληλεπύδραςη μεταξϑ των κυττϊρων αλλϊ και ςτην αλληλεπύδραςη των κυττϊρων με τον ECM. Οι syndecans εύναι διαμεμβρανικϋσ PGs που ϋχουν μια μικρό κυτταροπλαςματικό περιοχό και μια εξωκυττϊρια που φϋρει τισ αλυςύδεσ των GAGs. Μϋςω των αλυςύδων των GAGs αλλϊ και με τον πρωτεώνικϐ κορμϐ τουσ αλληλεπιδροϑν με μϐρια του ECM και ρυθμύζουν διϊφορεσ κυτταρικϋσ λειτουργύεσ ϐπωσ εύναι ο κυτταρικϐσ πολλαπλαςιαςμϐσ και η διαφοροπούηςη, η κυτταρικό προςκϐλληςη και μετανϊςτευςη (Fears CY & Woods A 2006). Σο μϋλοσ τησ οικογϋνειασ των syndecans που ϋχει μελετηθεύ περιςςϐτερο εύναι η syndecan-1. Η ελαττωμϋνη παρουςύα τησ syndecan-1 ςτη μεμβρϊνη των κυττϊρων θεωρεύται ϐτι αποτελεύ πρωταρχικϐ βόμα ςτη διαδικαςύα τησ κακοόθουσ εξαλλαγόσ των κυττϊρων ςε διϊφορεσ νεοπλαςύεσ (Fears CY & Woods A 2006). Η ελαττωμϋνη παρουςύα τησ syndecan-1 ςτη μεμβρϊνη των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων ςχετύζεται με πτωχό πρϐγνωςη ςε ϐγκουσ γαςτρεντερικοϑ, κεφαλόσ, τραχόλου και λϊρυγγα, μημικροκυτταρικϐ καρκύνωμα πνευμϐνων, χολαγγειοκαρκύνωμα και ςτο κακϐηθεσ μεςοθηλύωμα (Fujita M et al. 2001, Klatka J 2002, Harada K et al. 2003, Kumar-Singh S et al. 1998, Matsumoto A et al. 1997, Stah L et al. 2004). Επιπρϐςθετα, πολλϋσ μελϋτεσ ϋχουν αποδεύξει ϐτι η syndecan-1 εκφρϊζεται απϐ τα κϑτταρα του ςτρϔματοσ του ϐγκου (Wiksten JP et al. 2001, Larrain J et al. 1997, Boutin EL et al. 1991, Stanley MJ et al. 1999, Ito Y et al. 2003, Davies EJ et al. 2004, Maeda T et al. 2004, Mennerich D et al. 2004). Η επαγϐμενη ϋκφραςη τησ syndecan-1 ςτα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ςχετύζεται με πτωχό πρϐγνωςη ςτον καρκύνο μαςτοϑ, ςτομϊχου, ωοθηκϔν και ςτοματικόσ 181

182 υζότηςη - υμπερϊςματα κοιλϐτητασ (Wiksten JP et al. 2001, Davies EJ et al. 2004, Leivonen M et al. 2004, Mathe M et al. 2006). ε αντύθεςη με τισ πολλϋσ μελϋτεσ που καταδεικνϑουν το ρϐλο τησ syndecan-1 ςτισ κακοόθειεσ, πολϑ λύγα εύναι γνωςτϊ για τον ρϐλο τησ syndecan-4. υνεκτιμϔντασ την εμπλοκό των syndecans ςτην ογκογϋνεςη και τισ δομικϋσ και λειτουργικϋσ ομοιϐτητεσ που εμφανύζουν τα μϋλη τησ οικογϋνειασ των syndecans μελετόθηκε η ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων και ςυςχετύςτηκε με το μεταςτατικϐ δυναμικϐ τουσ. Βρϋθηκε ϐτι ςτουσ φυςιολογικοϑσ ιςτοϑσ, η syndecan-4 εκφρϊζεται ςτα ςπερματικϊ κϑτταρα των ςπερματικϔν ςωληναρύων των ϐρχεων κυρύωσ πληςύον του βαςικοϑ υμϋνα (χόμα 29). Η syndecan-4 εντοπύζεται τϐςο ςτο κυτταρϐπλαςμα ϐςο και ςτη μεμβρϊνη των φυςιολογικϔν κυττϊρων. Αντιθϋτωσ, δεν διαπιςτϔθηκε εναπϐθεςη τησ syndecan-4 ςτο διϊμεςο ςυνδετικϐ ιςτϐ, ςτα μεςολοβιϔδη διαφρϊγματα που περιβϊλλουν τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια των ϐρχεων (χόμα 29). Σϐςο οι ςεμινωματϔδεισ ϐςο και οι μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι ϐρχεων εμφανύζουν αυξημϋνη ϋκφραςη του γονιδύου τησ syndecan-4. Οι ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι χαρακτηρύζονται απϐ ςημαντικϊ πιο αυξημϋνη ϋκφραςη του γονιδύου τησ syndecan-4 ςε ςχϋςη με τουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Η υψηλό ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςτα ςεμινϔματα επιβεβαιϔθηκε με ανοςοώςτοχημικό χρϔςη των ιςτϔν, ενϔ η ϋκφραςό τησ παρουςύαζε διακυμϊνςεισ ςτα κϑτταρα των μηςεμινωματωδϔν ϐγκων. Μελϋτεσ υποςτηρύζουν ϐτι η αυξημϋνη ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςυνδϋεται με αυξημϋνο πολλαπλαςιαςμϐ των καρκινικϔν κυττϊρων μαςτοϑ (Baba F et al. 2006). τουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ αναγνωρύςτηκαν περιπτϔςεισ αςθενϔν με πιο αςθενό ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου. Η ελαττωμϋνη παρουςύα τησ syndecan-4 ςυςχετύςτηκε με την παρουςύα λεμφαδενικϔν μεταςτϊςεων, αγγειακόσ και λεμφαγγειακόσ διόθηςησ και με το ςτϊδιο τησ νϐςου ςε αυτοϑσ τουσ αςθενεύσ. Έχει δειχθεύ ϐτι η ελαττωμϋνη παρουςύα τησ syndecan-1 ςχετύζεται επύςησ με δυςμενό πρϐγνωςη ςε διϊφορεσ νεοπλαςύεσ αλλϊ και με την παρουςύα πτωχϊ διαφοροποιημϋνων καρκινικϔν κυττϊρων με υψηλϐ μεταςτατικϐ δυναμικϐ (Fujita M et al. 2001, Klatka J 2002, Harada K et al. 2003, Kumar-Singh S et al. 1998, Matsumoto A et al. 1997, Stah L et al. 2004). Η ελαττωμϋνη παρουςύα των syndecans ςτη μεμβρϊνη των κυττϊρων του ϐγκου ςυνδϋεται με 182

183 υζότηςη - υμπερϊςματα φαινοτυπικϋσ μεταβολϋσ ϐπωσ εύναι η μετϊπτωςη των επιθηλιακϔν καρκινικϔν κυττϊρων ςε ϋνα μεςεγχυματικϐ φαινϐτυπο (Epithelial to Mesenchymal Transition, ΕΜΣ). Σα κϑτταρα που εμφανύζουν τη ςυγκεκριμϋνη φαινοτυπικό μεταβολό χαρακτηρύζονται απϐ ελαττωμϋνη παρουςύα τησ Ε-καντχερύνησ και των syndecans ςτην κυτταρικό μεμβρϊνη, αλλαγϋσ ςτη γονιδιακό ϋκφραςη και την κυτταρικό ςηματοδϐτηςη με αποτϋλεςμα την αϑξηςη του μεταςτατικοϑ δυναμικοϑ τουσ (Larue L & Bellacosa A 2005, Kato M et al. 1995, Leppa S et al. 1996). Η syndecan-4 εντοπύζεται ςτισ περιοχϋσ εςτιακόσ προςκϐλληςησ των κυττϊρων και αλληλεπιδρϊ με διϊφορα μϐρια του ECM ϐπωσ εύναι η ινωδονεκτύνη (Woods A & Couchman JR 1994, Woods A & Couchman JR 2001). Η προςκϐλληςη μορύων τησ syndecan-4 ςτην περιοχό δϋςμευςησ τησ ΗΡ ςτο μϐριο τησ ινωδονεκτύνησ οδηγεύ ςτη ςυςςϔρευςό τουσ ςε περιοχϋσ τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ και την ϋναρξη ενδοκυττϊριων ςηματοδοτικϔν γεγονϐτων που ενεργοποιοϑν την PKCα και την κινϊςη εςτιακόσ προςκϐλληςησ (FAK) με αποτϋλεςμα την δημιουργύα εςτιϔν προςκϐλληςησ (Rapraeger AC 2000, Woods A et al. 2000). Έχει δειχθεύ ϐτι η syndecan- 4 ρυθμύζει τη φωςφορυλύωςη τησ FAK κατϊ την προςκϐλληςη των κυττϊρων ςτην ινωδονεκτύνη (Wilcox-Adelman SA et al. 2002). Η φωςφορυλύωςη τησ FAK ςτην τυροςύνη 397 εύναι απαραύτητη για την προςκϐλληςη των κυττϊρων και απαιτεύ την αλληλεπύδραςη των μικρϔν Rho GTPαςων και τησ syndecan-4 (Saoncella S et al. 1999). Αποτελϋςματα ϊλλησ μελϋτησ υποςτηρύζουν ϐτι κατϊ την κατεργαςύα κυττϊρων μελανϔματοσ, που καλλιεργοϑνται παρουςύα ινωδονεκτύνησ, με τον bfgf προκαλεύται ελϊττωςη τησ ςυγκϋντρωςησ τησ syndecan-4, ελαττωμϋνη φωςφορυλύωςη τησ FAK ςτην τυροςύνη 397, ελϊττωςη τησ προςκϐλληςόσ τουσ και αϑξηςη τησ μετακύνηςόσ τουσ (Chalkiadaki G et al. 2009). Η syndecan-4 ςυμμετϋχει επύςησ ςτη δημιουργύα εςτιϔν προςκϐλληςησ και τη μετακύνηςη των κυττϊρων μϋςω ενϐσ μηχανιςμοϑ που εμπλϋκει την ενεργοπούηςη τησ PKCα (Fears CY & Woods A 2006). Η κυτταροπλαςματικό περιοχό τησ syndecan-4 αλληλεπιδρϊ απευθεύασ και μερικϔσ ενεργοποιεύ την καταλυτικό περιοχό τησ PKCα (Lim ST et al. 2003). Εναλλακτικϊ, η κυτταροπλαςματικό περιοχό V τησ syndecan-4 αλληλεπιδρϊ με την ΡΙΡ2 και ευνοεύ την αλληλεπύδραςό τησ με την PKCα οδηγϔντασ ςτην ενεργοπούηςό τησ (Oh ES et al. 1997). Η syndecan-4, μϋςω τησ ενεργοπούηςησ τησ 183

184 υζότηςη - υμπερϊςματα PKCα, φαύνεται ϐτι εύναι απαραύτητη για την κυτταρικό μετακύνηςη που επϊγεται απϐ τον bfgf (Horowitz A et al. 2002). Ο bfgf οδηγεύ ςε αποφωςφορυλύωςη τησ κυτταροπλαςματικόσ περιοχόσ τησ syndecan-4 με αποτϋλεςμα την αϑξηςη τησ ςυγγϋνειασ και ςτην ςυνϋχεια την ενεργοπούηςη τησ PKCα (Horowitz A et al. 2002). Η δρϊςη του bfgf φαύνεται ϐτι εύναι ανεξϊρτητη απϐ τη ςηματοδϐτηςη που προκαλεύται απϐ την FAK. Ο ρϐλοσ τησ syndecan-4 ςτην προςκϐλληςη αλλϊ και τη μετακύνηςη των κυττϊρων ενιςχϑεται απϐ την παρατόρηςη ϐτι τα κϑτταρα που υπερεκφρϊζουν την syndecan-4 ςχηματύζουν μεγαλϑτερεσ και πυκνϐτερεσ εςτύεσ προςκϐλληςησ που ϋχουν ωσ αποτϋλεςμα την ιςχυρϐτερη προςκϐλληςη και την ελαττωμϋνη κινητικϐτητϊ τουσ (Longley RL et al. 1999). Η πλόρησ απουςύα τησ syndecan-4 προκαλεύ ςτουσ ινοβλϊςτεσ αδυναμύα να μετακινηθοϑν και καταςτϋλλει τη ςηματοδϐτηςη τησ FAK και των Rho GTPαςων. Σα παραπϊνω δεδομϋνα προτεύνουν ϐτι η ελεγχϐμενη ϋκφραςη και παρουςύα τησ syndecan-4 ςτη μεμβρϊνη των κυττϊρων εύναι απαραύτητη για τη ρϑθμιςη τησ κινητικϐτητασ των κυττϊρων. υνεπϔσ, η αυξημϋνη παρουςύα τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα των ςεμινωματωδϔν ϐγκων πιθανϐν να υποβοηθϊ τη δϋςμευςη αυξητικϔν παραγϐντων, την παρουςύαςό τουσ ςτουσ αντύςτοιχουσ υποδοχεύσ με αποτϋλεςμα την προαγωγό του πολλαπλαςιαςμοϑ τουσ. Όμωσ, η ςταθερϊ αυξημϋνη παρουςύα τησ syndecan-4 ςτα ςεμινϔματα πιθανϐν να μην ευννοεύ την κινητικϐτητα των κυττϊρων του ϐγκου και να ςχετύζεται με το χαμηλϐ μεταςτατικϐ δυναμικϐ που εμφανύζει αυτό η κατηγορύα των ϐγκων ϐρχεων. Αντιθϋτωσ, ςτουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ η αςθενϋςτερη, ςε ςχϋςη με τα ςεμινϔματα, ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα του ϐγκου (που ϐμωσ εύναι αρκετϊ εντονϐτερη ςε ςχϋςη με τα φυςιολογικϊ κϑτταρα) πιθανϐν να ευνοεύ τϐςο τη δϋςμευςη και ςηματοδϐτηςη των αυξητικϔν παραγϐντων που προϊγουν τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ αλλϊ και τη βϋλτιςτη αλληλεπύδραςη των κυττϊρων με τον ECM με αποτϋλεςμα την αυξημϋνη ικανϐτητα μετακύνηςησ των κυττϊρων του ϐγκου. Αυτό η υπϐθεςη μπορεύ να ςτηριχθεύ ςτην παρατόρηςη ϐτι η αςθενϋςτερη, ςε ςχϋςη με τα ςεμινϔματα, παρουςύα τησ syndecan-4 ςτα κϑτταρα των μηςεμινωματωδϔν ϐγκων ςχετύζεται με την παρουςύα λεμφαδενικϔν μεταςτϊςεων, τη διόθηςη αγγεύων και λεμφαγγεύων και το προχωρημϋνο ςτϊδιο τησ νϐςου. 184

185 υζότηςη - υμπερϊςματα Επιπλϋον, η syndecan-4 εντοπύςτηκε ςτο ινϔδεσ ςτρϔμα και ςτα ςτρωματικϊ κϑτταρα ςτουσ ςεμινωματϔδεισ και μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Η παρουςύα τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα ςυςχετύςτηκε με την παρουςύα λεμφαδενικϔν μεταςτϊςεων, αγγειακϔν και λεμφαγγειακϔν διηθόςεων και το ςτϊδιο τησ νϐςου μϐνο ςτα ςεμινϔματα. Μελϋτεσ υποςτηρύζουν ϐτι η παρουςύα τησ syndecan-1 ςτο αντιδραςτικϐ ςτρϔμα εύναι χαρακτηριςτικϐ των διηθητικϔν καρκινωμϊτων (Mennerich D et al. 2004). Η παρουςύα τησ syndecan-1 οφεύλεται ςτην επαγωγό τησ ϋκφραςόσ τησ απϐ τα κϑτταρα του ςτρϔματοσ ϐπωσ υποςτηρύζεται απϐ πολλϋσ μελϋτεσ (Wiksten JP et al. 2001, Stanley MJ et al. 1999, Mennerich D et al. 2004). Δεδομϋνου ϐτι οι GAG αλυςύδεσ των syndecans δεςμεϑουν διϊφορουσ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ, πιςτεϑεται ϐτι η παρουςύα τουσ ςτο ςτρϔμα του ϐγκου υποςτηρύζει τη δρϊςη των αυξητικϔν παραγϐντων ςτα κϑτταρα του ςτρϔματοσ και την ενεργοπούηςό τουσ (αϑξηςη του πολλαπλαςιαςμοϑ, επαγωγό τησ βιοςϑνθεςησ διαφϐρων μορύων, επαγωγό μεταναςτευτικοϑ φαινοτϑπου κτλ), που αποτελεύ χαρακτηριςτικϐ του αντιδραςτικοϑ ςτρϔματοσ ςτο μικροπεριβϊλλον του ϐγκου. Επιπλϋον, η δϋςμευςη των αυξητικϔν παραγϐντων ςτισ syndecans του ςτρϔματοσ οδηγεύ ςτην αποθόκευςό τουσ ςτο ςτρϔμα ϐπου δημιουργεύται μια χημειοτακτικό βαθμύδωςη αυτϔν των βιοδραςτικϔν μορύων που ευνοεύ τη μετανϊςτευςη των κυττϊρων του ϐγκου και την αγγειογϋνεςη (Kato M et al. 1998, Marshall LJ et al. 2003). Πειραματικϊ και κλινικϊ ευρόματα υποςτηρύζουν ϐτι η ϋκφραςη τησ syndecan-1 απϐ τουσ ινοβλϊςτεσ του ςτρϔματοσ προϊγει την ανϊπτυξη του καρκύνου του μαςτοϑ in vivo και διεγεύρει την αγγειογϋνεςη (Maeda T et al. 2004, Maeda T et al. 2006). Η ϋκφραςη τησ syndecan-4, ςτο ςτρϔμα κακοόθων ϐγκων, αναδεικνϑεται για πρϔτη φορϊ ςε αυτό τη μελϋτη και ςυςχετύζεται με τον αυξημϋνο αριθμϐ αγγεύων ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ϐρχεων. Πιθανολογεύται ϐτι η παρουςύα τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ευνοεύ την αγγειογϋνεςη με παρϐμοιο τρϐπο ϐπωσ και η ομϐλογη τησ syndecan-1. Υαύνεται ϐτι οι ςεμινωματϔδεισ και οι μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκοι των ϐρχεων αποτελοϑν δϑο ξεχωριςτϋσ κατηγορύεσ ϐγκων που διαφϋρουν ςτην εικϐνα ϋκφραςησ τησ syndecan-4 καθϔσ και ςτουσ βιολογικοϑσ ρϐλουσ που επιτελεύ. Η syndecan-4 εκφρϊζεται ςτα κϑτταρα του ςτρϔματοσ και ςτον ECM και προϊγει την αγγειογϋνεςη ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων αλλϊ η παρουςύα τησ ςτο ςτρϔμα ςχετύζεται με το μεταςτατικϐ 185

186 υζότηςη - υμπερϊςματα δυναμικϐ των ϐγκων μϐνο ςτα ςεμινϔματα. Αντιθϋτωσ, η παρουςύα τησ syndecan-4 ςτο ςτρϔμα των ϐγκων δεν ςχετύζεται με το μεταςτατικϐ δυναμικϐ ςτουσ μηςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ που γενικϊ χαρακτηρύζονται απϐ πιο επιθετικό ςυμπεριφορϊ. Σο μεταςτατικϐ δυναμικϐ των κυττϊρων του ϐγκου αυτόσ τησ κατηγορύασ φαύνεται ϐτι ρυθμύζεται μϐνο απϐ την αςθενϋςτερη ϋκφραςη τησ syndecan-4 ςτη μεμβρϊνη των μη-ςεμινωματωδϔν κυττϊρων, γεγονϐσ που πιθανϐν να επιδρϊ ϊμεςα ςτην ικανϐτητα μετακύνηςόσ τουσ. Σα ευρόματα τησ διδακτορικόσ διατριβόσ προτεύνουν ϐτι η syndecan-4 αποτελεύ βιολογικϐ μϐριο που εμπλϋκεται ςτην εξϋλιξη των ϐγκων ϐρχεων και μπορεύ να αποτελϋςει προγνωςτικϐ δεύκτη. Για να τεκμηριωθεύ η κλινικό χρηςιμϐτητα τησ ϋκφραςησ τησ syndecan-4 ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων απαιτεύται περαιτϋρω ϋρευνα ςε μεγαλϑτερο αριθμϐ δειγμϊτων. Πληθϔρα μελετϔν υποςτηρύζει ϐτι ο μεμβρανικϐσ υποδοχϋασ CD44 και το ΗΑ υπερεκφρϊζονται ςε πολλϋσ κακοόθειεσ και η αλληλεπύδραςό τουσ διεγεύρει ςειρϊ λειτουργιϔν ςτα κϑτταρα του ϐγκου που ςυντελοϑν ςτην πρϐοδο τησ νϐςου (Bourguignon LY 2008, Bourguignon LY et al. 1997, Iida N & Bourguignon LY 1995, Iida N & Bourguignon LY 1997, Gunthert U et al. 1991, Auvinen P et al. 2005, Legras S et al. 1998, Lim SD et al. 2008, Ghaffarzadehgan K et al. 2008, Gotte M & Yip GW 2006, Zlobec I et al. 2009). Η κϑρια ιςομορφό CD44s εκφρϊζεται ευρϋωσ ςτουσ ιςτοϑσ και υπερεκφρϊζεται ςε διϊφορουσ τϑπουσ καρκύνου ϐπου και ςυνυπϊρχει με το ΗΑ. Σα νεοπλαςματικϊ κϑτταρα ςυχνϊ υπερεκφρϊζουν CD44 ςτη μεμβρϊνη τουσ, ωσ απϐκριςη ςε διϊφορα διεγερτικϊ ςόματα μεταξϑ των οπούων εύναι και η εναπϐθεςη του ΗΑ ςτο ςτρϔμα του ϐγκου. Όλεσ οι ιςομορφϋσ του CD44 αλληλεπιδροϑν με το ΗΑ ςτο εξωκυττϊριο μϋροσ τουσ και η υπερϋκφραςό τουσ ςχετύζεται με την πρϐοδο των νεοπλαςμϊτων αφοϑ ρυθμύζει τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ, την προςκϐλληςη και μετανϊςτευςη (Bourguignon LY 2008). Έχει δειχθεύ ϐτι το ΗΑ βρύςκεται ςε αφθονύα ςτο μικροπεριβϊλλον των πολυδϑναμων κυττϊρων. Ο υποδοχϋασ του, CD44 εκφρϊζεται τϐςο ςτα φυςιολογικϊ ϐςο και ςτα καρκινικϊ πολυδϑναμα κϑτταρα και πιςτεϑεται ϐτι η αλληλεπύδραςό τουσ προϊγει βιολογικϊ ςημαντικϋσ φυςιολογικϋσ και παθολογικϋσ λειτουργύεσ (Bourguignon LY 2008, Al-Hajj M et al. 2003). Σα πολυδϑναμα καρκινικϊ κϑτταρα ϋχουν αυξημϋνη ικανϐτητα μετανϊςτευςησ και δημιουργύασ μεταςτϊςεων ςε απομακρυςμϋνα ϐργανα κατϊ την πρϔιμη φϊςη τησ ανϊπτυξησ του 186

187 υζότηςη - υμπερϊςματα ϐγκου και επιπλϋον εύναι υπεϑθυνα για την εμφϊνιςη δευτερογενϔν εντοπύςεων κατϊ τη φϊςη υποτροπόσ τησ νϐςου. τισ νεοπλαςύεσ μαςτοϑ που παρουςιϊζουν υψηλϐ δυναμικϐ μετϊςταςησ αναγνωρύζεται η χαρακτηριςτικό ταυτϐτητα των πολυδϑναμων καρκινικϔν κυττϊρων με υψηλό ϋκφραςη του υποδοχϋα CD44 και χαμηλό ϋκφραςη του υποδοχϋα CD24. Λϐγω του καθοριςτικοϑ ρϐλου του CD44 ςτην ογκογϋνεςη μελετόθηκε η ϋκφραςό του ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων και ςυςχετύςτηκε με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Προηγοϑμενεσ μελϋτεσ ςε μικρϐ αριθμϐ δειγμϊτων ϐγκων ϐρχεων ϋχουν δϔςει αντικρουϐμενα αποτελϋςματα ϐςον αφορϊ την ϋκφραςη του CD44 (Miyake H et al. 1998, Hadziselimovic F et al. 1996, Rajpert-De Mayts E et al. 1996). Αρχικϊ, ανοςοώςτοχημικϋσ μελϋτεσ υποςτόριξαν ϐτι ο CD44 εκφρϊζεται απϐ τα κϑτταρα του ςεμινϔματοσ και προτϊθηκε ωσ ϋνασ πρϔιμοσ δεύκτησ για την παρουςύα ςεμινϔματοσ (Hadziselimovic F et al. 1996). Σα παραπϊνω ευρόματα δεν επιβεβαιϔθηκαν απϐ επϐμενεσ ανοςοώςτοχημικϋσ μελϋτεσ που υποςτόριξαν ϐτι ο CD44 δεν εκφρϊζεται ςτουσ ϐγκουσ των ϐρχεων (Rajpert-De Mayts E et al. 1996). ε νεϐτερη μελϋτη με τη χρόςη πιο ευαύςθητων τεχνικϔν (RT-PCR, ανϊλυςη Western) βρϋθηκε ϐτι το γονύδιο του CD44 εκφρϊζεται ςτο φυςιολογικϐ ορχικϐ ιςτϐ και ςτουσ ϐγκουσ ϐρχεων, ενϔ η πρωτεϗνη του CD44 ανιχνεϑτηκε μϐνο ςε ϐγκουσ ϐρχεων ςτουσ οπούουσ φαύνεται ϐτι εκτϐσ τησ ιςομορφόσ CD44s εκφρϊζονται και ϊλλεσ ιςομορφϋσ του υποδοχϋα (Miyake H et al. 1998). Η μελϋτη του υποδοχϋα CD44 ςτην παροϑςα διδακτορικό διατριβό πραγματοποιόθηκε με ανοςοώςτοχημεύα χρηςιμοποιϔντασ το πολυκλωνικϐ αντύςωμα Η-300 που αναγνωρύζει την κϑρια ιςομορφό CD44s. Διαπιςτϔθηκε ϐτι η πρωτεϗνη του CD44 δεν εκφρϊζεται απϐ τα φυςιολογικϊ κϑτταρα των ςπερματικϔν ςωληναρύων των ϐρχεων. Επύςησ, δεν παρατηρόθηκε χρϔςη για τον CD44 ςτο διϊμεςο ςυνδετικϐ ιςτϐ, ςτα μεςολοβιϔδη διαφρϊγματα που περιβϊλλουν τα ςπερματικϊ ςωληνϊρια των ϐρχεων. Ο CD44 βρϋθηκε ϐτι εκφρϊζεται ςτα κϑτταρα του ϐγκου ςτο 27% των αςθενϔν με ςεμινϔματα και ςτο 36.8% των αςθενϔν με μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Επύςησ, βρϋθηκε ϐτι ο CD44 εκφρϊζεται ςτο ςτρϔμα του ϐγκου ςτο 48.5% των αςθενϔν με ςεμινϔματα και ςτο 26.3% των αςθενϔν με μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ. Η ϋκφραςη του CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου και ςτο ςτρϔμα ςυςχετύςτηκε με το 187

188 υζότηςη - υμπερϊςματα μϋγεθοσ του ϐγκου, την παρουςύα μεταςτϊςεων ςε λεμφαδϋνεσ, τη διόθηςη αγγεύων και λεμφαγγεύων και το προχωρημϋνο ςτϊδιο τησ νϐςου μϐνο ςτουσ αςθενεύσ με ςεμινϔματα. Δεν παρατηρόθηκε καμύα ςυςχϋτιςη τησ παρουςύασ του CD44 ςτουσ μηςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ με τα κλινικοπαθολογικϊ χαρακτηριςτικϊ των αςθενϔν. Ο υποδοχϋασ CD44 δημιουργεύ ςϑμπλοκα με διϊφορουσ υποδοχεύσ με δρϊςη κινϊςησ τυροςύνησ και φαύνεται ϐτι εύναι απαραύτητοσ για τη μετϊδοςη ςόματοσ μϋςω των αντύςτοιχων μονοπατιϔν (Misra S et al. 2006). Έχει δειχθεύ ϐτι η αλληλεπύδραςη του ΗΑ με τον CD44 ρυθμύζει πολλϋσ κυτταρικϋσ λειτουργύεσ ςτισ οπούεσ εμπλϋκονται πλόθοσ πρωτεώνϔν του κυτταροςκελετοϑ (ankyrin, ezrin κτλ) αλλϊ και ϊλλεσ ϐπωσ εύναι οι Rho-GTPases. Η ενεργοπούηςη τησ ankyrin και των Rho-GTPαςϔν (RhoA, Rac1 και Cdc42) προκαλεύ μεταβολϋσ ςτην οργϊνωςη των ινιδύων τησ ακτύνησ, αναδιοργϊνωςη του κυτταροςκελετοϑ, ενεργοπούηςη τησ μεταγραφόσ, ανϊπτυξη και επιβύωςη των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων, διόθηςη και μετανϊςτευςό τουσ (χόμα 13). Η δϋςμευςη του ΗΑ με τον CD44 διεγεύρει μϋςω τησ αλληλεπύδραςησ του ενδοκυττϊριου μϋρουσ του CD44 με την ankyrin την αναδιοργϊνωςη του κυτταροςκελετοϑ και ευνοεύ την κυτταρικό προςκϐλληςη. Επύςησ, προϊγει την αλληλεπύδραςη του CD44 με την ΙΡ3 ςε ειδικϋσ περιοχϋσ τησ μεμβρϊνησ που ονομϊζονται lipid rafts. Έτςι, επϊγεται η απελευθϋρωςη ςημαντικϔν ποςοτότων ιϐντων αςβεςτύου ςτο κυτταρϐπλαςμα απϐ τισ αποθόκεσ ιϐντων αςβεςτύου με αποτϋλεςμα την ενεργοπούηςη τησ αςβϋςτιο / καλμοντουλύνη εξαρτϔμενησ κινϊςησ ΙΙ (CaMKII), την φωςφορυλύωςη τησ φιλαμύνησ και την προαγωγό τησ μετακύνηςησ των καρκινικϔν κυττϊρων. Η αλληλεπύδραςη του ΗΑ με τον CD44 προϊγει την αλληλεπύδραςό του με την πρωτεϗνη LARG που με τη ςειρϊ τησ μπορεύ να ενεργοποιόςει την πρωτεϗνη RhoA και να οδηγόςει ςε παραγωγό ΙΡ3 και πρϐοδο τησ κυτταρικόσ μετακύνηςησ με το μηχανιςμϐ που αναφϋρθηκε προηγουμϋνωσ. Επιπλϋον, μπορεύ να οδηγόςει ςε ενεργοπούηςη τησ πρωτεϗνησ ROK που με τη ςειρϊ τησ μπορεύ εύτε να φωςφορυλιϔςει τη φωςφατϊςη τησ μυοςύνησ και να προϊγει την κυτταρικό μετανϊςτευςη μϋςω τησ αϑξηςησ τησ ςυςταλτϐτητασ τησ ακτινομυοςύνησ, ό να φωςφορυλιϔςει την πρωτεϗνη ΝΗΕ-1 με αποτϋλεςμα τη δημιουργύα ϐξινου ph ςτον ECM ςτο μικροπεριβϊλλον του καρκινικοϑ κυττϊρου και τελικϐ αποτϋλεςμα την ενεργοπούηςη πρωτεολυτικϔν ενζϑμων που δρουν ςε ϐξινο περιβϊλλον. Η 188

189 υζότηςη - υμπερϊςματα ενεργοποιημϋνη πρωτεϗνη ROK μπορεύ να φωςφορυλιϔςει πολλϋσ πρωτεϗνεσ μεταξϑ των οπούων εύναι και η Gab-1 με αποτϋλεςμα την ενεργοπούηςη τησ ΡΙ3Κ και την ενδοκυττϊρια ςηματοδϐτηςη που προϊγει την επιβύωςη και την ανϊπτυξη των καρκινικϔν κυττϊρων (χόμα 13). Η ςηματοδϐτηςη του ΗΑ μϋςω του CD44 οδηγεύ ςτη δημιουργύα ςυμπλϐκου του CD44 με την πρωτεϗνη Cdc42 και την ενεργοπούηςη τησ πρωτεϗνησ ΡΑΚ-1 που δημιουργεύ ςϑμπλοκο με τη φιλαμύνη και προκαλεύ αναδιοργϊνωςη του κυτταροςκελετοϑ και κυτταρικό μετακύνηςη. Επύςησ, δημιουργεύται ϋνα ςϑμπλοκο που αποτελεύται απϐ τον CD44, την πρωτεϗνη Cdc42 και την πρωτεϗνη IQGAP-1 το οπούο μπορεύ εύτε να αλληλεπιδρϊςει με την ακτύνη και να προκαλϋςει αναδιοργϊνωςη του κυτταροςκελετοϑ εύτε να φωςφορυλιϔςει την πρωτεϗνη Erk2 που με τη ςειρϊ τησ φωςφορυλιϔνει ϊλλα μϐρια που εμπλϋκονται ςτη γονιδιακό ϋκφραςη, ϐπωσ εύναι ο οιςτρογονικϐσ υποδοχϋασ α. Επύςησ, ο υποδοχϋασ CD44 αλληλεπιδρϊ και εντοπύζει τη μεμβρανικοϑ τϑπου-1 ΜΜΡ (ΜΣ1-ΜΜΡ) και την ΜΜΡ-9 ςτο εμπρϐςθιο μϋροσ των κυττϊρων ςυγκεντρϔνοντασ την πρωτεολυτικό δραςτικϐτητα ςε αυτό την κυτταρικό περιοχό ϐπου απαιτεύται για την αποικοδϐμηςη του εξωκυττϊριου χϔρου και τη μετανϊςτευςό τουσ (Mori H et al. 2002, Desai B et al. 2009). Επιπλϋον, το ςϑμπλοκο του ΗΑ με τον υποδοχϋα του CD44 και την versican που υπερεκφρϊζεται ςτουσ ϐγκουσ των ϐρχεων δημιουργεύ υπερμοριακϊ ςϑμπλοκα ςτη μεμβρϊνη των κυττϊρων. Έτςι προκαλεύται διϐγκωςη και αυξϊνεται η ιξωδοελαςτικό φϑςη του περικυττϊριου χϔρου δημιουργϔντασ ϋνα κατϊλληλο εξωκυττϊριο μικροπεριβϊλλον που επιτρϋπει απαραύτητεσ μεταβολϋσ του ςχόματοσ των κυττϊρων οι οπούεσ εύναι αναγκαύεσ τϐςο για τον πολλαπλαςιαςμϐ τουσ ϐςο και για τη μετακύνηςό τουσ (Wight TN 2002). Πρϐςφατα, διαπιςτϔθηκε ϐτι η ιςομορφό CD44v4 του CD44 αλληλεπιδρϊ με την E-selectin ςτη μεμβρϊνη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων. Σα καρκινικϊ κϑτταρα, που εκφρϊζουν αυτό την ιςομορφό ςτη μεμβρϊνη τουσ, προςκολλϔνται ςτα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα και διευκολϑνεται η μετανϊςτευςό τουσ διαμϋςου του ενδοθηλύου (Zen K et al. 2008). Πιθανολογεύται ϐτι η ϋκφραςη του CD44 ςτα κϑτταρα του ςεμινϔματοσ ευνοεύ την πρϐοδο τησ ογκογϋνεςησ μϋςω των μηχανιςμϔν που περιγρϊφηκαν πιο πϊνω, αφοϑ προϊγει τον πολλαπλαςιαςμϐ και την επιβύωςη, την προςκϐλληςη, τη μετανϊςτευςη και τη μετϊςταςη των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων. Αντύθετα, η 189

190 υζότηςη - υμπερϊςματα επϋκταςη των μη-ςεμινωματωδϔν ϐγκων δεν φαύνεται να εξαρτϊται απϐ την παρουςύα του CD44, αναδεικνϑοντασ ϐπωσ και ςτην περύπτωςη τησ syndecan-4 τη διαφορετικό βιολογικό ςυμπεριφορϊ των δϑο κατηγοριϔν των ϐγκων ϐρχεων. Η παρουςύα του CD44 ςτο ςτρϔμα των ϐγκων ςυςχετύςτηκε με αυξημϋνο αριθμϐ αγγεύων, εϑρημα που προτεύνει ϐτι ο υποδοχϋασ εμπλϋκεται ςτη δημιουργύα νϋων αγγεύων. Αυτϐ το εϑρημα εύναι ςε ςυμφωνύα με προηγοϑμενεσ μελϋτεσ αφοϑ ϋχει δειχθεύ ϐτι η ϋκφραςη του ΗΑ και του CD44 αυξϊνει ςτα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα κατϊ τη νεοαγγειογϋνεςη. Θραϑςματα ολιγομερϔν του ΗΑ μποροϑν να αλληλεπιδρϊςουν με τον CD44 ςτη μεμβρϊνη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων και να διεγεύρουν την αγγειογϋνεςη in vivo (Bourguignon LY 2008). Πρϐςφατα, διαςαφηνύςτηκε ϋνασ ϊλλοσ μηχανιςμϐσ μϋςω του οπούου ο CD44 προϊγει την αγγειογϋνεςη. Η ιςομορφό v6 του CD44 δρα ωσ ςυνυποδοχϋασ του c-met και του VEGFR-2 ςτα ενδοθηλιακϊ κϑτταρα και ρυθμύζει τη ςηματοδϐτηςό τουσ. Σο εξωκυττϊριο τμόμα εύναι υπεϑθυνο για την αλληλεπύδραςη με τουσ c-met και VEGFR-2, ενϔ ενδοκυττϊρια η ςηματοδϐτηςη που προκαλεύται απϐ τουσ υποδοχεύσ απαιτεύ την παρουςύα του C-τελικοϑ ϊκρου του CD44v6 που αλληλεπιδρϊ με την ezrin και βοηθϊ ϐλο το ςηματοδοτικϐ ςϑμπλοκο να αλληλεπιδρϊςει με τον κυτταροςκελετϐ. Με αυτϐ τον τρϐπο, η ςηματοδϐτηςη των HGF και του VEGF-A ϋχει ωσ αποτϋλεςμα την αναδιοργϊνωςη του κυτταροςκελετοϑ, τη μετανϊςτευςη των ενδοθηλιακϔν κυττϊρων και τη δημιουργύα νϋων αγγεύων (Tremmel M et al. 2009). Σα ευρόματα τησ διδακτορικόσ διατριβόσ προτεύνουν ϐτι ο CD44 αποτελεύ ϋνα μϐριο που εμπλϋκεται και μπορεύ να αποτελϋςει βιολογικϐ δεύκτη ςτην πορεύα των ϐγκων ϐρχεων. Απαιτεύται περαιτϋρω ϋρευνα ςε μεγαλϑτερο αριθμϐ δειγμϊτων για να διερευνηθεύ η εικϐνα ϋκφραςησ των διϊφορων ιςομορφϔν του και η κλινικό χρηςιμϐτητα τουσ. υμπεραςματικϊ, ςτουσ ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ διαπιςτϔθηκε ϐτι η ϋκφραςη του υποδοχϋα CD44 ςτα κϑτταρα του ϐγκου αυξϊνει το μεταςτατικϐ δυναμικϐ τουσ και προϊγει την επϋκταςη του ϐγκου (χόμα 35). Επιπλϋον, η αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ versican ςτο ςτρϔμα των ςεμινωματωδϔν ϐγκων και η ϋκφραςη τησ syndecan-4 και του CD44 απϐ τα ςτρωματικϊ κϑτταρα καθϔσ και η παρουςύα τουσ ςτον ECM ευνοοϑν 190

191 υζότηςη - υμπερϊςματα τη δημιουργύα νϋων αγγεύων και αυξϊνουν το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των ϐγκων (χόμα 35). χόμα 35. υνοπτικό απεικϐνιςη του ρϐλου των εξωκυττϊριων και μεμβρανικϔν PGs ςτουσ ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐρχεων. τουσ μη-ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ διαπιςτϔθηκε ϐτι το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των νεοπλαςματικϔν κυττϊρων αυξϊνει ϐςο ελαττϔνεται η ϋκφραςη τησ syndecan-4, ςε ςχϋςη με τα κϑτταρα του ςεμινϔματοσ που εμφανύζουν ςταθερϊ υψηλό ϋκφραςη τησ syndecan-4 (χόμα 36). Επιπλϋον, η αυξημϋνη εναπϐθεςη τησ versican ςτο ςτρϔμα των μη-ςεμινωματωδϔν ϐγκων ευνοεύ τη δημιουργύα νϋων αγγεύων και αυξϊνει το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των ϐγκων ενϔ η ϋκφραςη τησ syndecan-4 και του CD44 απϐ τα ςτρωματικϊ κϑτταρα καθϔσ και η παρουςύα τουσ ςτον ECM ευνοοϑν μϐνο τη δημιουργύα νϋων αγγεύων ςτο ςτρϔμα των ϐγκων (χόμα 36). 191

192 υζότηςη - υμπερϊςματα χόμα 36. υνοπτικό απεικϐνιςη του ρϐλου των εξωκυττϊριων και μεμβρανικϔν PGs ςτουσ μη ςεμινωματϔδεισ ϐγκουσ ϐρχεων. Σα ευρόματα τησ διδακτορικόσ διατριβόσ προτεύνουν ϐτι βιοδραςτικϊ μϐρια ϐπωσ η PG του εξωκυττϊριου χϔρου versican και οι διαμεμβρανικϋσ PGs syndecan-4 και CD44 ςυςχετύζονται με τισ κλινικοπαθολογικϋσ παραμϋτρουσ που καθορύζουν το μεταςτατικϐ δυναμικϐ των ϐγκων ϐρχεων εκ βλαςτικϔν κυττϊρων. Επιπλϋον, η ϋκφραςη των versican, syndecan-4 και CD44 ςυςχετύςτηκε με τη νεοαγγειογϋνεςη ςτο ςτρϔμα των ϐγκων προτεύνοντασ ϐτι οι ςυγκεκριμϋνεσ PGs μποροϑν να αποτελϋςουν προγνωςτικοϑσ δεύκτεσ για την κλινικό εξϋλιξη τησ νϐςου. Για να τεκμηριωθεύ η κλινικό χρηςιμϐτητα τησ ϋκφραςόσ τουσ ςε ϐγκουσ ϐρχεων απϐ βλαςτικϊ κϑτταρα απαιτεύται περαιτϋρω ϋρευνα ςε μεγαλϑτερο αριθμϐ δειγμϊτων. 192