Hlavné elučné charakteristiky

Transcript

1 7.1 Chromatografické a elektromigračné metódy Chromatografia je analytická separačná metóda, založená na transporte zmesi látok cez kolónu s vhodnou náplňou, v ktorej dochádza k postupnému, mnohokrát opakovanému vytváraniu rovnovážnych stavov separovaných látok medzi dve fázy, stacionárnu (fáza, ktorá sa nachádza v chromatografickej kolóne) a mobilnú (fáza, ktorá zabezpečuje pohyb separovaných látok). Základný predpoklad separácie zložiek zmesi v chromatografii je ich rôzna fyzikálnochemická interakcia so stacionárnou a mobilnou fázou. Táto interakcia môže byť založená na rôznych princípoch. Chromatografické metódy možno rozdeliť podľa viacerých hľadísk. Podľa skupenstva použitej mobilnej fázy sa rozdeľujú na kvapalinovú chromatografiu (mobilná fáza je v kvapalná), plynovú chromatografiu (mobilná fáza je plynná) a superkritickú fluidnú chromatografiu (mobilná fáza je tekutina v nadkritickom stave). Chromatografia sa podľa usporiadania experimentu delí na kolónovú chromatografiu a chromatografiu v plošnom usporiadaní (tenkovrstvová chromatografia, papierová chromatografia). Ďalšie delenie chromatografie je na základe separačného mechanizmu, avšak hranice nie sú jednoznačné. Preto je nasledujúce rozdelenie skôr empirické: Adsorpčná chromatografia adsorpcia látok na povrchu stacionárnej fázy; Rozdeľovacia chromatografia separácia látok na základe ich rôznej rozpustnosti v stacionárnej fáze a mobilnej fáze; Ionexová chromatografia vratná výmena iónov medzi roztokom (mobilnou fázou) a ionexom; Gélová chromatografia separácia látok na základe veľkosti molekúl; Afinitná chromatografia separácia látok na základe ich špecifických interakcií so stacionárnou fázou. Usporiadanie, pri ktorom sa roztok vzorky nadávkuje do chromatografickej kolóny a zložky zmesi silnejšie interagujú so stacionárnou fázou ako mobilná fáza, sa označuje ako elučná chromatografia. Chromatografická analýza zahrňuje dávkovanie, separáciu a detekciu zložiek zmesi vo vzorke. Po nadávkovaní zmesi látok do chromatografickej kolóny sa vytvorí zóna (alebo pás), ktorá obsahuje zmes látok. Zóna je kolónou unášaná v mobilnej fáze a na základe rozdielnych interakcií molekúl separovaných látok so stacionárnou, prípadne aj s mobilnou fázou dochádza k ich separácií. Čím silnejšia je interakcia, tým je látka dlhšie zdržiavaná v danej fáze a eluuje z kolóny neskôr. Zóny separovaných látok sa detegujú pri výstupe z kolóny v podobe elučných píkov. Zóny prislúchajúce jednotlivým rozseparovaným zložkám sú oddelené zónou mobilnej fázy. Elučné charakteristiky kvalitatívna analýza Chromatografické správanie sa látok v chromatografickej kolóne možno charakterizovať pomocou hlavných a relatívnych elučných charakteristík. Hlavné elučné charakteristiky 3

2 Elučný čas (t R ) časový interval, ktorý uplynie od nadávkovania látky do chromatografickej kolóny do okamihu detekcie signálu zodpovedajúcemu prechodu maximálnej koncentrácie látky detektorom. Závisí od rozmerov kolóny a od rýchlosti toku mobilnej fázy. Mŕtvy elučný čas (t M ) časový interval, ktorý uplynie od nadávkovania do okamihu detekcie maximálnej koncentrácie látky, ktorá sa v kolóne nezadržiava a pohybuje sa kolónou rovnakou rýchlosťou ako mobilná fáza. Elučný objem (V R ) objem mobilnej fázy pretečený kolónou od nadávkovania analytu po detekciu analytu: V R = F m t R 7.1 kde F m objemový prietok mobilnej fázy. Číselná hodnota elučného objemu závisí od rozmerov kolóny použitej na chromatografickú separáciu. Mŕtvy elučný objem (V M ) objem mobilnej fázy pretečený kolónou od nadávkovania po detekciu látky, ktorá sa v chromatografickej kolóne nesorbuje. Redukovaný elučný čas (t R) je elučný čas zmenšený o mŕtvy elučný čas: t R = t R t M 7.2 Redukovaný elučný objem (V R ) je elučný objem zmenšený o mŕtvy elučný objem: V R = V R V M 7.3 Relatívne elučné charakteristiky Na rozdiel od hlavných elučných chromatografických charakteristík, relatívne elučné charakteristiky nezávisia od niektorých experimentálnych parametrov (dĺžka kolóny, rýchlosť toku mobilnej fázy) a sú preto vhodnejšie pre kvalitatívnu analýzu. Medzi relatívne elučné charakteristiky možno zaradiť retenčný faktor (k), elučný pomer (r i,s ) a elučné indexy (I). Retenčný faktor (k) definovaný vzťahom: k = t R / t M k = n s / n m 7.4 Charakterizuje distribúciu látky medzi stacionárnu a mobilnú fázu. Je definovaný ako pomer množstva látky v stacionárnej a v mobilnej fáze. Látkové množstvo látky v stacionárnej fáze (n s ) je úmerné času, počas ktorého je analyt zadržiavaný v stacionárnej fáze a podobne, látkové množstvo látky v mobilnej fáze (n m ) je úmerné času, počas ktorého je látka zadržiavaná v mobilnej fáze. Hodnotu retenčného faktora možno ovplyvniť zmenou typu stacionárnej fázy, zmenou pomeru množstva 4

3 stacionárnej fázy voči mobilnej fáze v kolóne, a zmenou zloženia mobilnej fázy. Z praktického hľadiska je vhodné, ak sa hodnoty retenčného faktora pohybujú v rozsahu od 2 do 5. Elučný pomer (r i,s ) je definovaný vzťahom: r i,s = t R,i / t R,s 7.5 kde t R,i je redukovaný elučný čas látky a t R,s je redukovaný elučný čas referenčnej látky. Elučné indexy (I) v plynovej chromatografii sa ako základ elučných indexov (Kovatsových indexov) používa homologický rad n-alkánov. I i = 100 (log t R,i log t R,n ) / (log t R,n+1 log t R,n ) n 7.6 kde I i elučný index látky i, t R,i redukovaný elučný čas látky i, t R,n redukovaný elučný čas člena homologického radu s počtom uhlíkových atómov n, t R,n+1 redukovaný elučný čas člena homologického radu s počtom uhlíkových atómov (n+1), pričom platí: t R,n+1 > t R,i > t R,n. v kvapalinovej chromatografii sa ako základ elučných indexov používajú aromatické kondenzované uhľovodíky. Elučné indexy závisia od použitej mobilnej a stacionárnej fázy. Pri výpočte niektorých chromatografických charakteristík a v kvantitatívnej analýze je potrebné poznať nasledujúce údaje o píku: Šírka chromatografického píku odčítava sa v úrovni základnej línie (w alebo Y), v polovici výšky píku (w h/2 alebo Y h/2 ). (Najčastejšie sa uvádza v časových jednotkách). Výška píku (h) kolmá vzdialenosť medzi maximom píku a jeho nulovou líniou. Plocha píku (A) plocha vymedzená dotyčnicami v inflexnom bode vzostupnej a zostupnej línie píku a základnou líniou, zisťuje sa pomocou integrácie píku. Charakteristiky účinnosti chromatografického systému Na posúdenie účinnosti chromatografického systému sa zaviedol model teoretickej priehradky. Ten predpokladá, že chromatografická kolóna sa skladá z mnohých segmentov (teoretických priehradiek), v ktorých sa ustaľuje rovnováha rozdelenia látky medzi stacionárnu a mobilnú fázu. Účinnosť chromatografického systému možno 5

4 charakterizovať buď počtom teoretických priehradiek n, výškovým ekvivalentom teoretickej priehradky H, alebo píkovou kapacitou PC. Počet teoretických priehradiek (n) možno matematicky vyjadriť vzťahom: 2 2 t t t n = = 16 = 5,54 R R R σ Y Yh / kde σ 2 je rozptyl chromatografického píku, w je šírka píku v úrovni základnej línie, w h/2 je šírka píku v polovičnej výške píku. Výškový ekvivalent teoretickej priehradky (H) definovaný vzťahom: H = L / n 7.8 Predstavuje dĺžku chromatografickej kolóny (L), na ktorej sa dosiahne rovnaká separácia zmesi látok ako v jednom stupni diskontinuálnej extrakcie. Počet teoretických priehradiek zároveň udáva počet stupňov extrakcie uskutočnených v kolóne. n tr Píková kapacita (PC) PC = 1+ ln t Hodnota píkovej kapacity vyjadruje maximálny počet píkov, ktoré môžu byť rozseparované v danom chromatografickom systéme za čas t R. M Dôležitou charakteristikou separácie dvoch látok je separačný faktor α i,j. a rozlíšenie R i,j. Separačný faktor (α i,j ) pre dvojicu separovaných látok i a j je definovaný: α i,j = t R,j / t R,i 7.10 Umožňuje číselne vyjadriť selektivitu zvoleného systému mobilnej a stacionárnej fázy vzhľadom k separovaným látkam. Rozlíšenie (R i,j ) pre prakticky výpočet definované vzťahom: 6

5 R i, j ( tr, j tri, ) ( tr, j tri, ) 2 2 = = Y + Y 1, 7 ( Y + Y ) j i h/2, j h/2, i 7.11 Hodnota rozlíšenia umožňuje číselne vyjadriť mieru separácie dvoch susedných píkov. Zložky považujeme za úplne rozseparované, ak hodnota R i,j 1,5. Rozlíšenie je veličina bezrozmerová, a preto v uvedených rovniciach sa musia použiť veličiny v rovnakých jednotkách (časové alebo dĺžkové). Väčšia hodnota rozlíšenia znamená lepšiu separáciu dvoch látok a naopak. Vyhodnotenie nameraných údajov Kvalitatívna analýza Ako dôkaz prítomnosti zložky vo vzorke sa používa zhodnosť elučných charakteristík (predovšetkým relatívnych) zložiek vzorky a referenčných látok. Aj keď merania boli uskutočnené za rovnakých experimentálnych podmienok, zhodnosť elučných údajov zložiek nie je postačujúca pre kvalitatívnu analýzu chromatografickými metódami. Spoľahlivosť identifikácie možno dosiahnuť spojením s inými metódami, napr. s hmotnostnou spektrometriou, infračervenou spektrometriou, nukleárnou magnetickou rezonanciou. Kvantitatívna analýza Pri stanovení sa využívajú rôzne metódy (pozri kapitolu 3.4): 1. metóda kalibračnej čiary, 2. metóda prídavku štandardu, a tieto metódy v kombinácii s vnútorným štandardom Plynová chromatografia V plynovej chromatografii (GC) separácia prebieha v plynnej fáze, teda aj zlúčeniny, ktoré chceme stanoviť musia byť počas separácie v plynnom skupenstve. Plynová chromatografia sa väčšinou používa na separáciu zlúčenín s teplotou varu do 400 C. Inštrumentácia Plynový chromatograf sa skladá z nasledujúcich častí: 1. Zdroj mobilnej fázy s regulátorom tlaku a prietoku; 2. Dávkovací vstup; 3. Separačný systém (chromatografická kolóna so stacionárnou fázou); 4. Detektor; 5. Zariadenie na spracovávanie signálu detektora. Mobilná fáza/zdroj mobilnej fázy 7

6 V plynovej chromatografii sa ako mobilné fázy používajú permanentné plyny, najčastejšie dusík alebo hélium. Voľba konkrétneho nosného plynu závisí aj od typu detektora a použitej kolóny. Čistota nosného plynu by mala byť lepšia ako 99,995 %. Ako zdroj mobilnej fázy sa najčastejšie používajú tlakové nádoby. Tok nosného plynu sa nastavuje regulátormi tlaku a prietoku pred prístrojom a v prístroji. Dávkovací vstup Dávkovací vstup slúži na zavedenie vzorky do plynového chromatografu. Keďže v plynovej chromatografii separácia prebieha v plynnej fáze, základnou úlohou každého dávkovacieho vstupu je splyniť kvapalnú vzorku, dokonale ju zmiešať s mobilnou fázou a potom vzorku zaviesť do chromatografickej kolóny. Najpoužívanejším dávkovacím vstupom v plynovej chromatografii je dávkovač, ktorý pracuje v dvoch módoch, s delením vzorky a bez delenia vzorky. Pri dávkovaní s delením vzorky sa zmes pár vzorky a mobilnej fázy rozdelí na dve časti v presnom pomere, pričom do chromatografickej kolóny vstupuje len jedna časť (menej ako 10 %) a druhá časť prejde cez deliaci ventil do ovzdušia. Tento typ dávkovania sa používa na separáciu zlúčenín prítomných vo vzorke vo vysokých koncentráciách. Dávkovací vstup sa zohrieva na teplotu minimálne 20 C nad teplotu varu najvyššie vriacej zložky v zmesi. Technika dávkovania mikrostriekačkou Dávkovanie do prístroja sa vykonáva mikrostriekačkou cez gumové septum, ktoré utesňuje dávkovací priestor. Zvyčajne sa dávkuje objem 1 až 2 µl roztoku. Technika dávkovania s vymytím ihly v GC je znázornená na obr Separačný systém Najdôležitejšiu časť plynového chromatografu predstavuje separačný systém, ktorý sa skladá zo stacionárnej fázy umiestnenej v kolóne. Podľa typu použitých kolón sa plynová chromatografia rozdeľuje na GC na náplňových kolónach a GC s kapilárnymi kolónami. Kapilárne kolóny sa vyrábajú z taveného kremeňa zvonka pokrytého vrstvou polyimidu s malým priemerom (komerčne dostupné sú kapiláry s priemerom 0,25 mm, 0,32 mm, alebo 0,53 mm). Používajú sa kapilárne kolóny s rôznymi dĺžkami (od 10 m až po 150 m) v závislosti od typu aplikácie, najčastejšie však kolóny s dĺžkou 25 až 30 m. Ako stacionárne fázy sa v kapilárnych kolónach používajú viskózne kvapaliny, ktoré sú zachytené na vnútornej stene kapiláry. Podľa polarity sa tieto fázy rozdeľujú do troch skupín: nepolárne (alifatické uhľovodíky, polydimetylsiloxán), stredne polárne (vyššie estery karboxylových kyselín, halogénované uhľovodíky, fenyl-vinyldimetylsiloxány) a polárne (etylénglykol, cukry, kyanopropyl-fenyl-dimetylsiloxány) stacionárne fázy. Najčastejšie sa ako stacionárne fázy používajú polyalkyl/arylsiloxány s rôznym percentuálnym zastúpením jednotlivých funkčných skupín, čím sa zabezpečuje rôzna polarita stacionárnej fázy. 8

7 Vzorka Vzduch Vzduch Rozpúšťadlo Obr Technika dávkovania s vymytím ihly v GC Náplňové kolóny sa vyrábajú z nehrdzavejúcej ocele s vnútorným priemerom 0,2 až 1 cm a dĺžkou 2 až 5 m. Ako stacionárne fázy sa používajú rôzne tuhé adsorbenty (rôzne druhy aktívneho uhlia, silikagél, alumina), molekulové sitá a rôzne kopolymérne materiály. Teplota priestoru, v ktorom je umiestnená kolóna so stacionárnou fázou, sa musí spoľahlivo regulovať. Izotermická separácia sa používa vtedy, ak sa zložky vzorky nelíšia príliš svojimi teplotami varu. Ak je vo vzorke prítomný väčší počet zlúčenín s pomerne veľkým rozsahom teplôt varu, separácia pri jednej teplote by bola časovo náročná. Teplota kolóny sa preto môže programovo meniť počas analýzy vzorky v rozsahu približne 40 až 320 C. Detektory Detektor slúži na zisťovanie prítomnosti látok vychádzajúcich z chromatografickej kolóny. Získaný signál (najčastejšie elektrický prúd) je úmerný množstvu látky práve prechádzajúcej detektorom. Každá zlúčenina vychádzajúca z chromatografickej kolóny do detektora spôsobí nárast alebo pokles meraného signálu, ktorý sa na chromatograme prejaví ako chromatografický pík. Zaznamenaná hodnota signálu z detektora v čase sa nazýva chromatogram. Podobne ako dávkovací vstup, aj detektor je potrebné vyhrievať minimálne o 20 C vyššie ako je teplota varu najvyššie vriacej zložky v zmesi. V plynovej chromatografii sa najčastejšie používajú tieto detektory: Plameňovo-ionizačný detektor; 9

8 Detektor elektrónového záchytu; Tepelne-vodivostný detektor; Foto-ionizačný detektor; Hmotnostný spektrometer. Plameňovo-ionizačný detektor (FID): Princíp činnosti detektora je založený na spálení látky vychádzajúcej z chromatografickej kolóny v kyslíkovo-vodíkovom plameni. Pri horení zlúčenín dochádza k ich ionizácii, teda vzniku nabitých častíc. Pohyb vzniknutých nabitých častíc medzi dvoma elektródami spôsobuje nárast elektrického prúdu. FID je teda vhodný na detekciu všetkých organických zlúčenín, pričom platí, že odozva detektora je úmerná počtu uhlíkových atómov v molekule zlúčeniny. Kvantitatívna analýza V plynovej chromatografii sa často používa metóda vnútorného štandardu. Pri tejto metóde sa vyjadruje relatívna hodnota signálu analytu proti signálu vnútorného štandardu (zlúčenina s podobnými fyzikálno-chemickými a chromatografickými vlastnosťami ako stanovovaná zlúčenina). Základnou podmienkou je, že pridávaný vnútorný štandard nesmie byť prítomný v pôvodnej vzorke, nesmie reagovať so žiadnou zložkou vzorky a musí eluovať v blízkosti stanovovanej zlúčeniny, avšak ich chromatografické píky sa nesmú prekrývať. Výhodou tohto prístupu je eliminácia chýb v meraní objemu pri dávkovaní kvapalných vzoriek. Táto metóda sa môže použiť v kombinácii s metódou štandardného prídavku, alebo s metódou kalibračnej krivky. Pri metóde kalibračnej krivky s vnútorným štandardom sa pripraví séria kalibračných roztokov s rôznou koncentráciou analytu a zvyčajne rovnakou koncentráciou vnútorného štandardu. Rozsah koncentrácií analytu sa volí podľa predpokladaného rozmedzia možných koncentrácií vo vzorkách. Pripravuje sa rovnaký objem všetkých roztokov. Kalibračné roztoky sa analyzujú chromatograficky za rovnakých podmienok, zásadne sa dávkuje rovnaký objem všetkých roztokov. Z chromatogramov sa určia vzájomné pomery plôch píkov analytu a vnútorného štandardu, a zhodnotí sa závislosť pomeru plôch píkov od pomeru koncentrácií analytu a vnútorného štandardu. Ak je koncentrácia vnútorného štandardu vo všetkých roztokoch rovnaká, nezávisle premennou môže byť priamo koncentrácia analytu v kalibračných roztokoch. Kontrolné otázky 1. Nakreslite schému plynového chromatografu a opíšte funkciu jednotlivých častí. 2. Uveďte hlavné typy detektorov používaných v plynovej chromatografii. 3. Opíšte princíp činnosti plameňovoionizačného (FID) detektora. Pre aké zlúčeniny je vhodný? 4. Uveďte aké mobilné fázy sa najčastejšie používajú v plynovej chromatografii. Podľa čoho sa volí mobilná fáza v plynovej chromatografii? 5. Uveďte aké typy stacionárnych fáz sa najčastejšie používajú v plynovej chromatografii. 10

9 6. Opíšte metódu vnútorného štandardu a uveďte základné pravidlá pre výber vnútorného štandardu. 7. Uveďte parametre, ktoré sú potrebné na výpočet Kovatsových indexov. Separácia, kvalitatívna a kvantitatívna analýza alkoholov plynovou chromatografiou na náplňových kolónach ÚLOHA CH1 Princíp práce Na separáciu použijeme metódu plynovej chromatografie s polárnou stacionárnou fázou (napríklad CARBOWAX 20M). Plynový chromatograf je vybavený dávkovačom s deličom/bez deliča (split/splitless) a FID detektorom. Cieľom úlohy je kvalitatívna analýza zmesi alkoholov a stanovenie obsahu etanolu v neznámej vzorke metódami kalibračnej čiary bez a s použitím vnútorného štandardu a ich vzájomné porovnanie. Pri metóde vnútorného štandardu sa použije n-propanol ako vnútorný štandard. Vyžadované vedomosti Základy separácie látok v plynovej chromatografii, elučné charakteristiky, inštrumentácia v plynovej chromatografii, metódy kvantitatívnej analýzy. Chemikálie, roztoky a zariadenia 0,5% vodné roztoky štandardov alkoholov (metanol, etanol, propanol a butanol), 0,5% vodné roztoky štandardov 2-alkoholov (izopropanol, 2-butanol a 2-pentanol) a 0,5% vodné roztoky štandardov izoalkoholov (izopropanol, izobutanol, izopentanol), etanol, propanol, nosný plyn a pomocné plyny pre GC (vzduch, vodík, dusík), plynový chromatograf. Postup práce Chromatografické podmienky Stacionárna fáza: polárna stacionárna fáza, napr. CARBOWAX 20M Mobilná fáza: dusík Teplota dávkovača: 220 C Detektor: 250 C Teplota termostatu: 40 C Dávkovaný objem: 1 µl Príprava prístroja na meranie Príprava prístroja trvá pomerne dlho vzhľadom na rozsah laboratórneho cvičenia, preto prístroj zapne učiteľ pred začatím cvičenia. Nasledujúci postup je uvedený len pre 11

10 informáciu. Pri ovládaní plynového chromatografu treba vždy postupovať podľa návodu od výrobcu, ktorý obsahuje potrebné parametre a postupnosti práce. Otvoríme ventily na tlakových fľašiach s dusíkom, vodíkom a vzduchom (plyny do plameňovoionizačného detektora). Ihlovým ventilom, resp. regulátorom tlaku v prístroji nastavíme hodnotu, ktorá zodpovedá optimálnemu prietoku nosného plynu (mobilnej fázy) v chromatografickej kolóne. Po zapnutí prístroja (a počítača) a nastavení teploty sa vyhrejú príslušné časti plynového chromatografu: termostat, dávkovač, detektor. Prístroj je vybavený regulátorom teploty, ktorý umožňuje prácu v izotermickom režime aj v režime s programovaním teploty počas analýzy. Regulátormi na prístroji nastavíme prietoky vodíka, vzduchu a prídavného plynu do detektora (návod k prístroju vždy obsahuje závislosti signálu detektora od prietoku pracovných plynov). Po vyhriatí detektora na teplotu aspoň 150 C zapálime plamienok v detektore, prietok vodíka nastavíme na optimálnu hodnotu. Po ustálení teplôt a výstupného signálu môžeme začať meranie. Na záznam signálu používame pripojený integrátor alebo počítač. Meranie Kvalitatívnu analýzu alkoholov vykonáme porovnaním základných a relatívnych elučných charakteristík zložiek vo vzorke s charakteristikami porovnávacích látok. Zo zásobnej fľaše odlejeme do príslušnej vzorkovacej nádobky malý objem roztoku porovnávacej látky (alkoholy, izoalkoholy a sekundárne alkoholy). Pred dávkovaním každého roztoku striekačku najskôr prepláchneme rozpúšťadlom (vodou) a potom naberieme zvolený objem 1 µl roztoku (pre každé dávkovanie rovnaký), ktorý sa má dávkovať, a zároveň naberieme metán z prívodu pre plyn. Pomocou metánu v každej analýze zistíme mŕtvy čas. Postupne dávkujeme roztoky všetkých porovnávacích látok (jednotlivo alebo v zmesiach homológov) a jednu vzorku A. Zároveň s dávkovaním okamžite stlačíme tlačidlo ŠTART na integrátore. Po vyeluovaní všetkých látok z kolóny stlačíme na integrátore tlačidlo STOP. Potom je možné dávkovať ďalší roztok. Každý roztok dávkujeme dvakrát (v prípade, že sa dvojica chromatogramov výraznejšie odlišuje, aj viackrát). Z chromatogramov homologických radov alkoholov zistíme elučné časy jednotlivých štandardov alkoholov, vypočítame ich retenčné faktory. Z chromatogramov vzorky zistíme elučné časy zložiek vzorky, vypočítame retenčné faktory a porovnaním s údajmi štandardov zistíme prítomnosť alkoholov vo vzorke. Kvantitatívnu analýzu etanolu vo vzorke vykonáme metódou kalibračnej čiary s vnútorným štandardom. Pripravíme kalibračné roztoky s koncentráciou etanolu v intervale 0,2 až 1 % (podľa pokynov vyučujúceho), do ktorých zároveň pridáme n-propanol na výslednú koncentráciu 0,4 % (ako vnútorný štandard s rovnakou koncentráciou vo všetkých roztokoch). Každý roztok nadávkujeme do plynového chromatografu. Potom nadávkujeme roztok vzorky B. Vzorky už obsahujú propanol ako vnútorný štandard s rovnakou koncentráciou ako v kalibračných roztokoch (0,4 %). Každý roztok dávkujeme trikrát. Výsledok 12

11 Kvalitatívna analýza 1. Z chromatogramov jednotlivých roztokov zistite elučné časy pre zaznamenané píky a vypočítajte retenčný faktor. 2. Porovnaním elučných charakteristík zistite prítomnosť zložiek v neznámej vzorke A (prístroj č. 1), alebo C (prístroj č. 2). 3. Nakreslite závislosti logaritmov retenčných faktorov od počtu uhlíkových atómov pre homologický rad alkoholov, 2-alkoholov a izoalkoholov (do jedného grafu). Zhodnoťte získaný graf, využite ho pre kvalitatívnu analýzu. Kvantitatívna analýza 1. Na základe plôch píkov s použitím metódy vnútorného štandardu kombinovanej s metódou kalibračnej čiary zistite množstvo etanolu v neznámej vzorke A (prístroj č. 1), alebo B (prístroj č. 2). 2. Nakreslite a vyhodnoťte aj kalibračnú čiaru bez použitia vnútorného štandardu. Porovnajte odchýlky kalibrácie oboma metódami. Identifikácia neznámych zlúčenín vo vzorke plynovou chromatografiou pomocou Kovatsových indexov ÚLOHA CH2 Princíp práce Princípom úlohy je využitie Kovatsových indexov na identifikáciu neznámych látok metódou plynovej chromatografie na nepolárnej stacionárnej fáze (100% polydimetylsiloxán). Plynový chromatograf je vybavený dávkovacím vstupom s delením vzorky a FID detektorom. Vyžadované vedomosti Základy separácie látok v plynovej chromatografii, elučné charakteristiky, inštrumentácia v plynovej chromatografii, metóda kalibračnej čiary, metóda vnútorného štandardu. Chemikálie, roztoky a zariadenia Roztok nonánu, roztok alkánov C7 až C10, roztok vzorky v hexáne, stlačený vzduch, stlačený vodík, stlačený dusík. Plynový chromatograf. Postup práce Chromatografické podmienky Stacionárna fáza: Mobilná fáza: DB-1 (100% polydimetylsiloxán) Dusík (p = 20 kpa) 13

12 Teplota dávkovača: 250 C Detektor: 250 C Teplota termostatu: 60 C, 70 C Dávkovaný objem: 1 µl Príprava prístroja na meranie: Príprava prístroja trvá pomerne dlho vzhľadom na rozsah laboratórneho cvičenia, preto prístroj zapne učiteľ pred začatím cvičenia. Nasledujúci postup je uvedený len pre informáciu. Pri ovládaní plynového chromatografu treba vždy postupovať podľa návodu od výrobcu, ktorý obsahuje potrebné parametre a postupnosti práce. Otvoríme ventily na tlakových fľašiach s dusíkom, vodíkom a vzduchom (plyny do plameňovoionizačného detektora). Ihlovým ventilom, resp. regulátorom tlaku v prístroji nastavíme hodnotu, ktorá zodpovedá optimálnemu prietoku nosného plynu (mobilnej fázy) v chromatografickej kolóne. Po zapnutí prístroja (a počítača) a nastavení teploty sa vyhrejú príslušné časti plynového chromatografu: termostat, dávkovač, detektor. Prístroj je vybavený regulátorom teploty, ktorý umožňuje prácu v izotermickom režime aj v režime s programovaním teploty počas analýzy. Regulátormi na prístroji nastavíme prietoky vodíka, vzduchu a prídavného plynu do detektora (návod k prístroju vždy obsahuje závislosti signálu detektora od prietoku pracovných plynov). Po vyhriatí detektora na teplotu aspoň 150 C zapálime plamienok v detektore, prietok vodíka nastavíme na optimálnu hodnotu. Po ustálení teplôt a výstupného signálu môžeme začať meranie. Na záznam signálu používame pripojený integrátor alebo počítač. Meranie Kvalitatívna analýza neznámej vzorky je založená na porovnaní relatívnych elučných charakteristík Kovatsových indexov zložiek vo vzorke s hodnotami uvedenými v tabuľkách. Pred dávkovaním každého roztoku striekačku najskôr prepláchneme rozpúšťadlom v tejto úlohe n-hexánom. Do striekačky naberieme približne 5 µl plynu obsahujúceho metán a z nádobky s príslušným roztokom následne do striekačky naberieme 1 µl roztoku. Metán použijeme na určenie mŕtveho času v každej analýze. Postupne do plynového chromatografu nadávkujeme roztok alkánu C 9, roztok zmesi alkánov C 7 až C 10, roztok vzorky a roztok vzorky spoločne s roztokom zmesi alkánov C 7 až C 10 pri 60 C. Po nadávkovaní hneď stlačíme tlačidlo ŠTART na integrátore. Po vyeluovaní všetkých látok z kolóny stlačíme na integrátore tlačidlo STOP. Až potom je možné dávkovať ďalší roztok. Po ukončení merania pri 60 C, nastavíme termostat na 70 C. Celý postup dávkovania zopakujeme pri 70 C. Výsledok 1. Z chromatogramov jednotlivých referenčných látok a zmesi neznámej vzorky s alkánmi zistite elučné časy pre zaznamenané píky a vypočítajte redukované elučné časy. 14

13 2. Zistite prítomnosť alkánov v chromatograme získanom pre zmes neznámej vzorky s alkánmi porovnaním s redukovanými elučnými časmi referenčných látok. 3. Pre ostatné píky prítomné na chromatograme vypočítajte Kovatsove indexy pri 60 C a 70 C. Vypočítajte hodnotu inkrementu Kovatsových indexov na 10 C. 4. Vypočítané Kovatsove indexy a ich inkrementy porovnajte s tabelovanými hodnotami (tabuľka 7.1) a identifikujte prítomné zlúčeniny. 15

14 Tabuľka 7.1a. Kovatsove indexy alkánov namerané na stacionárnej fáze DB-1 pri 60 C Zlúčenina Index I/10 C Zlúčenina Index I/10 C 2,2-dimetylbután 538,0 0,70 2,5-dimetylheptán 836,9 0,34 2,3-dimetylbután 567,3 0,73 3,5-dimetylheptán* 837,4 0,80 2-metylpentán 569,8 0,20 3,5-dimetylheptán* 838,1 0,60 3-metylpentán 584,4 0,48 2,4-dimetyl-3-etylpentán 838,2 1,85 2,2-dimetylpentán 625,7 0,64 2,3,3-trimetylhexán 838,9 1,90 2,4-dimetylpentán 631,0 0,26 3,3-dimetylheptán 839,1 1,13 2,2,3-trimetylbután 639,0 1,43 2,2,3,3-tetrametylpentán 847,7 2,85 3,3-dimetylpentán 658,1 1,30 2,3,4-trimetylhexán* 848,3 1,67 2-metylhexán 667,8 0,13 2,3,4-trimetylhexán* 849,9 1,63 2,3-dimetylpentán 671,1 0,88 3,3,4-trimetylhexán 850,8 2,23 3-metylhexán 676,8 0,38 2,3,3,4-tetrametylpentán 854,5 2,78 3-etylpentán 687,0 0,53 2,3-dimetylheptán 857,3 0,63 2,2,4-trimetylpentán 691,4 1,13 3,4-dimetylheptán* 859,2 0,90 2,2-dimetylhexán 722,9 0,45 3,4-dimetylheptán* 859,9 0,83 2,2,3,3-tetrametylbután 723,7 2,29 4-etylheptán 861,8 0,35 2,5-dimetylhexán 732,5 0,18 4-metyloktán 864,6 0,20 2,4-dimetylhexán 734,9 0,46 2-metyloktán 865,7 0,09 2,2,3-trimetylpentán 736,0 1,60 3-etylheptán 871,1 0,38 3,3-dimetylhexán 742,9 1,25 3-metyloktán 872,2 0,28 2,3,4-trimetylpentán 751,9 1,46 3,3-dietylpentán 875,3 2,76 2,3,3-trimetylpentán 756,9 2,08 2,2-dimetyloktán 918,7 0,33 2,3-dimetylhexán 761,4 0,75 4,4-dimetyloktán 921,0 0,88 2-metyl-3-etylpentán 763,2 1,06 3,5-dimetyloktán* 924,6 0,53 2-metylheptán 766,5 0,10 3,5-dimetyloktán* 926,7 0,43 4-metylheptán 768,1 0,17 2,7-dimetyloktán 930,4 0,13 3,4-dimetylhexán* 770,5 1,08 2,6-dimetyloktán 934,9 0,30 3,4-dimetylhexán* 770,5 0,95 3,3-dimetyloktán 935,5 1,03 3-metyl-3-etylpentán 772,0 1,93 3,4-dimetylhexán 938,9 1,65 2,2,4,4-tetrametylpentán 774,0 1,93 3,6-dimetyloktán* 940,0 0,65 3-metylheptán 774,2 0,29 3,6-dimetyloktán* 940,6 0,55 3-etylhexán 775,3 0,42 2-metyl-3-etylheptán 941,7 0,85 2,2,5-trimetylhexán 785,1 0,45 3,4,5-trimetylheptán* 945,9 1,70 2,2,4-trimetylhexán 792,8 1,33 4-propylheptán 946,2 0,20 2,4,4-trimetylhexán 808,7 1,65 3,4,5-trimetylheptán* 946,8 1,60 2,3,5-trimetylhexán 817,0 0,85 3-metyl-3-etylheptán 947,8 1,70 2,2,3,4-tetrametylpentán 819,9 2,35 2,3-dimetyloktán 954,6 0,57 2,2-dimetylheptán 820,0 0,38 4-etyloktán 956,1 0,25 2,4-dimetylheptán 824,0 0,26 5-metylnonán 960,8 0,05 2,2,3-trimetylhexán 824,7 1,40 4-metylnonán 962,5 0,13 4,4-dimetylheptán 826,5 1,06 2-metylnonán 965,2 0,05 2,6-dimetylheptán 830,3 0,12 3-etyloktán 967,9 0,38 3-metylnonán 971,2 0,28 16

15 Tabuľka 7.1b. Kovatsove indexy cyklické uhľovodíky namerané na stacionárnej fáze DB-1 pri 60 C Zlúčenina Index I/10 C cyklopentán 567,8 1,50 metylcyklopentán 630,4 1,63 cyklohexán 663,7 2,33 1,1-dimetylcyklopentán 675,9 1,80 1,cis-3-dimetylcyklopentán 685,5 1,55 1,trans-3-dimetylcyklopentán 688,3 1,58 1,trans-2-dimetylcyklopentán 690,9 1,61 1,cis-dimetylcyklopentán 722,6 2,16 metylcyklohexán 724,0 2,49 1,1,3-trimetylcyklopentán 726,0 1,84 etylcyklopentán 734,3 1,94 1,trans-2,cis-4-trimetylcyklopentán 742,3 1,59 1,trans-2,cis-3-trimetylcyklopentán 749,4 1,60 1,1,2-trimetylcyklopentán 764,4 2,39 1,cis-2,trans-4-trimetylcyklopentán 775,0 2,09 1,cis-3-dimetylcyklohexán 778,4 2,33 1,cis-2,trans-3-trimetylcyklopentán 779,0 2,21 1,trans-4-dimetylcyklohexán 780,2 2,31 1,1-dimetylcyklohexán 786,1 2,80 1-metyl-trans-3-etylcyklopentán 788,3 1,85 1-metyl-cis-3-etylcyklopentán 790,4 1,91 1-metyl-trans-2-etylcyklopentán 791,8 1,92 1-metyl-1-etylcyklopentán 794,3 2,40 1,trans-2-dimetylcyklohexán 797,4 2,80 1,cis-2,cis-3-trimetylcyklopentán 802,7 2,67 1,trans-3-dimetylcyklohexán 803,9 2,48 1,cis-4-dimetylcyklohexán 804,1 2,64 izopropylcyklopentán 810,4 2,65 1-metyl-cis-2-etylcyklopentán 820,3 2,37 1,cis-2-dimetylcyklohexán 826,6 3,13 n-propylcyklopentán 830,1 2,00 etylcyklohexán 831,3 2,68 1,1,3-trimetylcyklohexán 836,5 2,75 1,1,4-trimetylcyklohexán 838,9 2,90 1,1,2-trimetylcyklohexán 878,7 3,67 n-butylcyklopentán 929,4 2,00 17

16 Tabuľka 7.1c. Kovatsove indexy aromáty namerané na stacionárnej fáze DB-1 pri 60 C Zlúčenina Index I/10 C benzén 653,8 1,88 toluén 756,2 2,05 etylbenzén 847,8 2,38 m-xylén 856,1 2,27 p-xylén 857,1 2,24 o-xylén 877,6 2,75 kumén 909,3 2,48 n-propylbenzén 937,7 2,50 3-etyltoluén 945,0 2,38 4-etyltoluén 947,1 2,50 1,3,5-trimetylbenzén 952,7 2,43 2-etyltoluén 961,1 2,85 terc-butylbenzén 974,9 2,80 1,2,4-trimetylbenzén 975,6 2,88 izobutylbenzén 990,5 2,80 sek-butylbenzén 992,8 2,95 1,2,3-trimetylbenzén 999,9 3, Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia V súčasnosti sa používa v praxi prevažne vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). HPLC na rozdiel od kvapalinovej chromatografie (LC) pracuje pri vysokých tlakoch (približne 60 MPa) a používa náplne s nízkou zrnitosťou a pórovitosťou, čo prispieva k zvýšeniu separačnej účinnosti. Inštrumentácia Základné zariadenie pre kvapalinovú chromatografiu sa skladá z nasledujúcich častí: 1. Zásobníky mobilnej fázy s mobilnou fázou; 2. Vysokotlakové čerpadlo; 3. Dávkovacie zariadenie; 4. Kolóna so stacionárnou fázou (môže byť doplnená predkolónou); 5. Detektor; 6. Zariadenie na spracovávanie signálu detektora. 18

17 Zásobníky mobilnej fázy Zásobník mobilnej fázy môže byť tvorený uzavretou sklenou nádobou, ktorá je spojená pružnou trubicou s vysokotlakovým čerpadlom. Pružná trubica je v zásobníku ukončená fritou, ktorá bráni vstupu tuhých častíc do vysokotlakového čerpadla. Mobilné fázy Ako mobilné fázy sa v kvapalinovej chromatografii používajú organické rozpúšťadlá rôznej polarity, ich vzájomné zmesi, prípadne v zmesi s vodou, alebo tlmivými roztokmi. Rozpúšťadlá používané v kvapalinovej chromatografii by mali spĺňať nasledujúce požiadavky: maximálna možná chemická čistota, kompatibilita so zvoleným typom detekcie, nízka viskozita, chemická stálosť, schopnosť rozpúšťať separované látky a kompatibilita so stacionárnou fázou. Rozpúšťadlá možno charakterizovať polaritou a selektivitou. Polarita ovplyvňuje schopnosť rozpúšťadla podieľať sa na intermolekulových interakciách. Selektivita súvisí so schopnosťou rozpúšťadla podieľať sa na špecifických interakciách. Medzi faktory ovplyvňujúce selektivitu separácie patrí ph mobilnej fázy. Vplyv ph sa uplatňuje v prípadoch separácie látok, ktorých štruktúra závisí od ph a môžu existovať v disociovanej aj nedisociovanej forme. Popri polarite a selektivite pri výbere vhodného rozpúšťadla pre kvapalinovú chromatografiu je potrebné zohľadňovať aj viacero ďalších vlastností rozpúšťadiel. Viskozita rozpúšťadla ovplyvňuje spätný tlak pre danú dĺžku kolóny, prietok mobilnej fázy a výber priemeru častíc stacionárnej fázy. UV-priepustnosť. Najčastejšie používaný spôsob detekcie v kvapalinovej chromatografii je spektrofotometrická detekcia v UV oblasti. Mnohé rozpúšťadlá používané na prípravu mobilných fáz absorbujú žiarenie v určitej oblasti UV spektra. Pri voľbe rozpúšťadiel treba vybrať také, ktorého absorpčná oblasť neinterferuje s oblasťou absorpcie separovanými látkami. Ak HPLC zariadenie neobsahuje časť na odplyňovanie mobilnej fázy, je potrebné pred použitím mobilnú fázu odplyniť buď prebublávaním héliom, vákuom, alebo v ultrazvukovom kúpeli. Vysokotlakové čerpadlo Patri medzi dôležité časti kvapalinového chromatografu, pretože jeho správna činnosť má vplyv na opakovateľnosť elučných časov a stabilitu nulovej línie detektora. Vysokotlakové čerpadlo zabezpečuje definované prúdenie mobilnej fázy. Podľa spôsobu zabezpečenia toku mobilnej fázy rozlišujeme viacero typov vysokotlakových čerpadiel. Piestové čerpadlá využívajú na tvorbu toku mobilnej fázy piest pohybujúci sa buď v jednom smere, alebo jeho pohyb je vratný. Lineárny dávkovač pracuje na princípe veľkoobjemovej striekačky s lineárnym posunom piestu. Výhodou je konštantný prietok a bezpulzový tok mobilnej fázy. V súčasnosti sa najčastejšie používajú čerpadlá s vratným piestom s jednou, alebo viacerými hlavami, ktoré majú vstupný a výstupný ventil a každý pohyb piesta pretlačí malý objem mobilnej fázy. 19

18 Dávkovanie vzoriek Dávkovače slúžia na opakovateľné dávkovanie vzorky do chromatografického systému bez prerušenia toku mobilnej fázy. Používajú sa väčšinou 6-vstupové dávkovacie ventily s vymeniteľnou vonkajšou slučkou objemu 5 až µl. Po naplnení slučky vzorkou sa otočením rotora prepojí slučka s čerpadlom a mobilná fáza vytlačí jej obsah do chromatografickej kolóny. Technika dávkovania (obr. 7.2): Dávkovací ventil sa nastaví do polohy na plnenie slučky LOAD. Striekačkou sa slučka prepláchne roztokom dávkovanej látky a po naplnení slučky sa ventil prepne plynulým pohybom do druhej krajnej polohy na dávkovanie INJECT (dávkovací ventil má len dve krajné polohy, nesmie sa nachádzať v priestore medzi nimi). Od okamihu nadávkovania analytu do analytickej kolóny sa zaznamenáva chromatografický záznam a meria čas. slučka slučka odpad striekačka odpad striekačka čerpadlo kolóna čerpadlo kolóna Plnenie slučky Dávkovanie a analýza Obr Technika dávkovania v HPLC Chromatografické kolóny a stacionárne fázy Kolóny pre HPLC sú rovné trubice s hladkým vnútorným povrchom zhotovené z materiálov, ktoré by mali byť odolné voči vysokým pracovným tlakom (až 60 MPa), ako aj chemickým vplyvom mobilných fáz a separovaných látok, na ktoré by nemali pôsobiť katalyticky, spôsobovať degradáciu analyzovaných látok počas analýzy. Vhodnými materiálmi sú nehrdzavejúca oceľ a špeciálne tvrdené bórosilikátové sklo. Rozmery kolón závisia od aplikácie a od veľkosti častíc náplne. V súčasnosti sa pre analytické aplikácie používajú kolóny plnené pórovitými materiálmi s časticami veľkosti 3 až 10 µm. Dĺžka kolón sa pohybuje v rozsahu 3 až 30 cm a vnútorný priemer najčastejšie medzi 2 až 4 mm. Materiál náplne chromatografickej kolóny (stacionárnej fázy) pre HPLC by mal mať definovaný priemer častíc s malým intervalom v distribúcií rozmerov častíc, dobrú mechanickú odolnosť, aby nedochádzalo k mechanickému poškodeniu častíc náplne počas plnenia a manipulácie s kolónou, a tiež vysokú chemickú stabilitu, t.j. hlavne odolnosť proti chemickým vplyvom mobilnej fázy. 20

19 Materiály stacionárnych fáz možno rozdeliť do dvoch skupín: anorganické a organické. Anorganické náplne zahrňujú silikagél, oxid hlinitý (alumina), fluorisil (MgSiO 3 ) a iné oxidy kovov (oxidy zirkónia a titánu), uhlík. K organickým možno zaradiť polystyrény a iné organické polyméry, a sorbenty na báze agarózy. Podľa polarity stacionárnej a mobilnej fázy rozlišujeme pri separácií dva chromatografické módy: 1. Separácia v systéme s konvenčným usporiadaním fáz (NP, normal phase) stacionárna fáza je polárnejšia ako mobilná fáza. Niektoré NP stacionárne fázy sú uvedené v tabuľke 7.2. Mobilnou fázou sú nepolárne organické rozpúšťadlá a ich zmesi s alkoholmi (napr. hexán, chloroform). 2. Separácia v systéme s obráteným usporiadaním fáz (RP, reverse phase) stacionárna fáza je menej polárna ako mobilná fáza. Niektoré RP stacionárne fázy sú uvedené v tabuľke 7.2. Mobilnou fázou sú zmesi polárnych organických rozpúšťadiel s vodou prípadne s tlmivými roztokmi (metanol, acetonitril, tetrahydrofurán). Tabuľka 7.2. Základné typy chemicky viazaných stacionárnych fáz pre kvapalinovú chromatografiu. Funkčná skupina Štruktúra Použitie ako stacionárna fáza Alkyl C 18 H 37, C 8 H 17, C 4 H 9, CH 3 obrátené fázy Fenyl C 6 H 5 obrátené fázy Kyano C 3 H 6 CN obrátené a konvenčné fázy Amino C 3 H 6 NH 2 obrátené a konvenčné fázy, slabý anex Diol (CH 2 ) 3 OCH 2 CH(OH)CH 2 (OH) konvenčné fázy, molekulové sito Amid (CH 2 ) 3 CONCH 3 molekulové sito Kyselina (CH 2 ) 3 SO 3 H silný katex sulfónová (CH 2 ) 3 C 6 H 4 SO 3 H Karboxylová (CH 2 ) 3 COOH, silný katex kyselina (CH 2 ) 3 OCH 2 COOH Dimetylamín (CH 2 ) 3 N(CH 3 ) 2 slabý katex Kvartérny amín (CH 2 ) 3 N + (CH 3 ) 3 silný anex Silikagél, (SiO 2 xh 2 O), patrí medzi najčastejšie používané adsorbenty v adsorpčnej chromatografii. Silikagél je xerogél kyseliny kremičitej a má amfotérnu štruktúru. Na povrchu silikagélu sa nachádzajú rôzne druhy silanolových skupín a siloxánové skupiny. Zloženie povrchu silikagélu závisí od metódy použitej na prípravu a hlavne od jeho teplotného spracovania. Reaktivita silanolových skupín tvorí základ pre 21

20 chemickú modifikáciu povrchu silikagélu, čím možno ovplyvniť vlastnosti silikagélu, a tým aj jeho použiteľnosť v kvapalinovej chromatografii. Silikagél sa používa aj na prípravu chemicky viazaných stacionárnych fáz. Silikagél v tomto prípade tvorí nosič, na ktorý sa chemickou väzbou naviaže stacionárna fáza (napr. alkyl C 18, C 8, fenyl a iné). V tabuľke 7.2 sú zhrnuté základné typy chemicky modifikovaných stacionárnych fáz na báze silikagélu a ich použiteľnosť v jednotlivých chromatografických technikách. V systéme s obrátenými fázami najčastejšie využívané sú C 18 a C 8 chemicky viazané stacionárne fázy. V ionexovej chromatografii sa najčastejšie využívajú ako stacionárne fázy silne katexy. Mobilnú fázu tvorí deionizovaná voda, tlmivý roztok, alebo ich zmes s organickým modifikátorom, napr. metanol. Selektivitu separácie možno ovplyvniť zmenou ph, zmenou typu tlmivého roztoku a zmenou iónovej sily. Detektor Detektor používaný v kvapalinovej chromatografii musí byť citlivý na analyzované látky, musí mať malý vnútorný objem a rýchlu odozvu vzhľadom na zmeny koncentrácie analytov. V HPLC sa najčastejšie používajú detektory týchto typov: refraktometrický, vodivostný, spektrofotometrický pracujúci v UV až VIS oblasti, fluorescenčný, hmotnostný spektrometrický a elektrochemický. Medzi špeciálne typy detektorov patria napr. polarimetrický detektor, fototermický detektor, detektor merajúci na základe kruhového dichroizmu, detektor rozptylu svetla a iné. Refraktometrický detektor (RI) Refraktometrický detektor je univerzálny typ detektora v kvapalinovej chromatografii. Princíp detekcie je založený na meraní rozdielu indexu lomu mobilnej fázy a indexu lomu eluenta z chromatografickej kolóny a odozva je tým intenzívnejšia, čím väčší je rozdiel medzi indexom lomu analytu a rozpúšťadla. Odozva detektora je ovplyvnená teplotnými zmenami, zložením a stabilitou prietoku mobilnej fázy. Podľa konštrukčného prevedenia rozlišujeme tri druhy RI detektorov: refrakčný, difrakčný (používaný v laboratórnom cvičení) a interferenčný. V difrakčnom detektore svetlo prechádza cez dve cely v tvare hranolov, pričom jedna je naplnená čistou mobilnou fázou a cez druhú preteká eluent z kolóny. Lúč sa láme na stene medzi oboma hranolmi pod uhlom závislým od indexu lomu a dopadá na fotočlánok. Detektor nie je vhodný na stopovú analýzu. Spektrofotometrické detektory Spektrofotometrické detektory sú najčastejšie používané detektory v kvapalinovej chromatografii. Podmienkou použitia týchto detektorov je, aby analyt absorboval žiarenie určitej vlnovej dĺžky. Sú založené na meraní žiarivého toku v UV a VIS oblasti po prechode roztokom eluentu v prietokovej kyvete. Pri konštrukcii prietokových kyviet sa prihliada na to, aby dĺžka absorbujúceho prostredia (kyvety) bola dostatočne veľká (5 až 10 mm), objem kyvety však musí byť veľmi malý. Spektrofotometrické detektory možno rozdeliť na detektory pracujúce pri jednej vlnovej dĺžke, detektory pracujúce pri viacerých vlnových dĺžkach, detektory 22

21 s diódovým poľom (DAD). DAD pracuje na princípe paralelnej detekcie. Žiarenie zo zdroja prechádza cez prietokovú celu, potom sa rozkladá na mriežke a simultánne meria sústavou diód. Medzi hlavné výhody tohto detektora patri možnosť zaznamenávať chromatogramy pri viacerých, vopred zvolených vlnových dĺžkach; meranie UV/VIS spektier v zvolenej oblasti vlnových dĺžok; a možnosť zistiť spoločnú elúciu látok. Úprava vzorky pred HPLC analýzou Cieľom úpravy vzorky pred analýzou je: uvoľniť látky z matrice vzorky, odstrániť zložky matrice, ktoré môžu interferovať s látkami, odstrániť zložky matrice, ktoré môžu znížiť separačnú účinnosť chromatografickej kolóny, alebo znečistiť niektorú časť chromatografu (dávkovač, kolóna, detektor), znížiť medzu stanovenia, zabezpečiť kompatibilitu vzorky s mobilnou fázou, stabilizovať látky proti termickej, chemickej a enzýmovej degradácii, zvýšiť selektivitu a iné. Medzi často používané predseparačné techniky na úpravu vzorky patria extrakčné techniky, ako sú extrakcia v systéme kvapalina kvapalina, extrakcia na tuhej fáze, mikroextrakcia tuhou fázou, filtrácia, ultrafiltrácia, dialýza, membránové techniky a iné. Extrakcia na tuhej fáze (SPE) Extrakčný proces pri extrakcii na tuhej fáze je založený na interakciách sorbentu s molekulami látok. Interakcie závisia od matrice vzorky, polarity látky, ph a typu sorbentu. SPE metóda sa využíva aj na prečistenie kvapalného extraktu vzorky a prípadné zakoncentrovanie látok, ktoré sú prítomné vo vzorkách na veľmi nízkych koncentračných úrovniach. SPE pozostáva z nasledujúcich krokov: Kondicionovanie účelom je odstrániť prípadné nečistoty vzniknuté pri príprave sorbentu, umožniť analytu optimálny kontakt so sorbentom a zväčšiť pravdepodobnosť sorpcie analytu. V tomto kroku sa používajú rozpúšťadlá, ktoré dokonale zmáčajú sorbent a majú vysokú afinitu k extrahovaným látkam. Aplikácia vzorky na sorbent sa nadávkuje známe množstvo vzorky. Premývanie úlohou je vymyť zo sorbentu (po aplikácii vzorky) čo možno najviac interferujúcich látok pri zachovaní sorpcie látok a preto sa používa rozpúšťadlo s malou afinitou k extrahovaným látkam. Elúcia úlohou je vymyť zo sorbentu extrahované látky v čo najmenšom objeme rozpúšťadla. V tomto prípade je výhodné použiť rozpúšťadlo s veľkou elučnou silou (afinitou) k extrahovaným látkam. Kontrolné otázky 1. Vysvetlite základné separačné princípy využívané v kvapalinovej chromatografii. 23

22 2. Nakreslite schému kvapalinového chromatografu a opíšte funkciu jednotlivých častí. 3. Uveďte hlavné typy detektorov používaných v kvapalinovej chromatografii. Uveďte princíp ich funkcie 4. Uveďte sorbenty, ktoré sa najčastejšie používajú v kvapalinovej chromatografii. 5. Zdôvodnite význam používania chemicky viazaných stacionárnych fáz a uveďte príklady. 6. Vysvetlite rozdiely medzi HPLC s obrátenými a konvenčnými fázami. 7. Vysvetlite princípy chromatografickej separácie látok na ionexoch. 8. Uveďte, ktoré typy detektorov sa používajú v ionexovej chromatografii. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia na obrátených fázach Stanovenie aromatických uhľovodíkov vo vzorkách vôd po predseparačnej úprave extrakciou na tuhej fáze ÚLOHA CH3 Významnými zdrojmi znečistenia životného prostredia (vody, pôdy, ovzdušie) aromatickými uhľovodíkmi sú chemické podniky, elektrárne, spaľovne, petrochemický priemysel a iné. Ich zvýšená koncentrácia v životnom prostredí môže mať negatívny vplyv na živé organizmy. Princíp práce Cieľom úlohy je separácia a stanovenie aromatických uhľovodíkov vo vzorkách vôd. Na predseparačnú úpravu vzoriek vôd a zakoncentrovanie analytov sa využije extrakcia na tuhej fáze (SPE). Na separáciu zložiek sa použije metóda HPLC na obrátených fázach s mobilnou fázou acetonitril-voda. Prítomnosť aromatických uhľovodíkov bude detegovaná spektrofotometrickým detektorom pri vlnovej dĺžke 254 nm. Vyžadované vedomosti Princíp separácie látok chromatografickými metódami, stacionárna fáza, chemicky viazaná stacionárna fáza, mobilná fáza, rozdeľovacia chromatografia, chromatografia na obrátených fázach, inštrumentácia vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii, vyhodnocovanie chromatografických záznamov, kvalitatívna a kvantitatívna analýza, extrakcia na tuhej fáze. Chemikálie, roztoky a zariadenia Roztoky referenčných látok pripravené v mobilnej fáze so známou koncentráciou (naftol, anilín, benzén, toluén, naftalén, p-xylén, antracén, fenantrén, pyrén). Roztok látky na určenie mŕtveho elučného času (NaNO 2 ) pripravený v mobilnej fáze. 24

23 Chemikálie na prípravu mobilnej fázy a extrakciu (metanol pre HPLC, acetonitril pre HPLC, deionizovaná voda). Vzorka odpadovej vody stabilizovaná prídavkom siričitanu sodného (40 až 50 mg na 1 l vody) a s upraveným ph na hodnotu 2 prídavkom HCl (1 mol l 1 ), HPLC zariadenie, zariadenie na extrakciu na tuhej fáze, laboratórne sklo. Chromatografické podmienky Stacionárna fáza: silikagél s chemicky viazaným oktadecylsilánom Separon SGX C18 (150 x 3 mm, 5 µm) Mobilná fáza: acetonitril:voda v pomere 60 : 40 (objemovo) Detekcia: spektrofotometrická pri vlnovej dĺžke 254 nm Dávkovaný objem: 20 µl Prietok mobilnej fázy: 0,5 ml min 1 Teplota kolóny: laboratórna Postup práce Príprava prístroja na meranie (pripraví učiteľ pred začiatkom cvičenia ) Do zásobníka mobilnej fázy nalejeme pripravenú mobilnú fázu (ak HPLC zariadenie neobsahuje odplyňovač mobilnej fázy, na odstránenie vzduchových bublín z mobilnej fázy použijeme ultrazvukový kúpeľ). Kolónu aj detektor necháme premývať zvolenou mobilnou fázou a prietokom kým nedôjde k ustáleniu nulovej línie pozorovanej na zázname. Predseparačná úprava vzorky vody extrakciou na tuhej fáze (SPE) Predseparáciu a predkoncentráciu uskutočníme pretlačením vzorky vody cez sorpčnú kolónu, na ktorej zachytíme analyty zo vzorky (sorbent kolóny je chemicky viazaný oktadecylsilán, SEP PAK): (i) Príprava kolóny na extrakciu: kondicionovanie premytím 2 ml metanolu a potom 2 ml deionizovanej vody a pokračujeme podľa bodu (ii). (ii) Predseparácia vzorky na kolóne: prietokom asi 1 ml min 1 presajeme zvolené množstvo vzorky (10 ml) cez kolónu a hneď pokračujeme podľa bodu (iii). (iii) Premytie kolóny: kolónu premyjeme 2 ml deionizovanej vody a následne vysušíme vákuom po dobu 10 minút. (iiii) Elúcia analytov z kolóny: látky eluujeme z kolóny 1 ml acetonitrilu a extrakt zachytávame do pripravenej nádobky. Výťažnosť predseparačného postupu zistená analyzovaním roztokov referenčných látok so známou koncentráciou je pre naftol 75 %, pre anilín 25

24 73 %, pre benzén 85 %, pre toluén 86 %, pre naftalén 86 %, pre p-xylén 85 %, pre antracén 85 %, pre fenantrén 80 % a pre pyrén 80 %. Výsledný roztok (extrakt) analyzujeme vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou. Analýza referenčných látok a extraktu vzorky 1. Na dávkovanie roztokov do dávkovacej slučky použijeme striekačku, ktorú je potrebné pred použitím dôkladne prepláchnuť premývacím roztokom (metanol : voda, 50 : 50, objemovo) a dávkovaným roztokom. 2. Na určenie mŕtveho elučného času nadávkujeme do HPLC roztok NaNO 2 pripravený v metanole (koncentrácia 0,1 mg ml 1 ). 3. Za rovnakých podmienok postupne dávkujeme do HPLC zariadenia roztoky všetkých referenčných látok, a extraktu vzorky. Analýzu jednotlivých roztokov zopakujeme trikrát. Technika dávkovania je uvedená v časti Inštrumentácia. 4. Z chromatografických záznamov referenčných látok odčítame základné elučné charakteristiky (elučný čas, mŕtvy elučný čas) a vypočítame hodnoty retenčných faktorov. Z chromatografických záznamov extraktu vzorky odčítame základné elučné charakteristiky (elučný čas) a vypočítame hodnoty retenčných faktorov pre zložky vzorky. Porovnáme hodnoty retenčných faktorov referenčných látok a retenčných faktorov zložiek vzorky. Na základe zhodnosti môžeme predpokladať prítomnosť látky zo skupiny aromatických uhľovodíkov v extrakte vzorky. 5. Z chromatografických záznamov referenčných látok (predpokladaná prítomnosť vo vzorke, podľa bodu 4) a extraktu vzorky odčítame výšky píkov (alebo plochy píkov). Metódou štandardnej vzorky a po zohľadnení výťažnosti predkoncentrácie vypočítame koncentráciu látok vo vzorke. Doplňujúce časti praktickej úlohy: 1. Prešetrenie vplyvu zloženia mobilnej fázy na separáciu vybraných aromatických uhľovodíkov: Pre zloženie mobilnej fázy acetonitril : voda a/alebo metanol : voda v pomere od 100 : 0 do 10 : 90 (objemovo) sa zistia hodnoty elučných charakteristík, rozlíšenia a charakteristík účinnosti. Zvolí sa vhodná mobilná fáza pre separáciu zmesi látok. 2. Prešetrenie vplyvu zloženia stacionárnej fázy na separáciu vybraných aromatických uhľovodíkov: Pre stacionárnu fázu typu C 18, C8 prip. Fenyl- a pre vhodné zloženie mobilnej fázy sa zistia hodnoty elučných charakteristík, rozlíšenia a charakteristík účinnosti. Zvolí sa vhodná stacionárna fáza pre separáciu zmesi látok. 3. Prešetrenie vplyvu prietoku mobilnej fázy na separáciu vybraných aromatických uhľovodíkov: Pre zvolenú stacionárnu a mobilnú fázu sa zistia hodnoty elučných charakteristík, rozlíšenia a charakteristík účinnosti v závislosti od zmeny 26