UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO NATAŠA PLAVLJANIĆ PRIMERJAVA ENCIMSKOIMUNSKE IN RADIOIMUNSKE METODE ZA DOLOČANJE 1,25 (OH) 2 VITAMINA D V PLAZMI COMPARISON OF ENCIME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY AND RADIOIMMUNOASSAY FOR DETERMINATION OF 1,25 (OH) 2 VITAMIN D IN PLASMA DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana 2008
Diplomsko nalogo sem opravljala v Laboratoriju za analitiko hormonov in tumorskih markerjev Kliničnega inštituta za kemijo in biokemijo v Ljubljani pod mentorstvom doc. dr. Milana Skitka, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom dr. Aleša Jerina, univ. dipl. kem., spec. med. biokem.. Zahvaljujem se svojemu mentorju doc. dr. Milanu Skitku, mag. farm., spec. med. biokem. za presojo in pregled dela, somentorju dr. Alešu Jerinu, univ. dipl. kem., spec. med. biokem., ki mi je svetoval in me usmerjal pri izdelavi diplomske naloge. Zahvaljujem pa se tudi Stanki Cankar, dipl. inž. lab. biomed. za pomoč pri izvedbi praktičnega dela diplomske naloge. Posebna zahvala pa gre mojim staršem in domačim, ki so mi omogočili študij in me podpirali, spodbujali in mi potrpežljivo stali ob strani. IZJAVA: Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno pod vodstvom mentorja doc. dr. Milana Skitka, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorja dr. Aleša Jerina, univ. dipl. kem., spec. med. biokem.. Ljubljana, 2008 Nataša Plavljanić Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Vojko Kmetec Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak
Kazalo vsebine: SEZNAM OKRAJŠAV...- 2 - II. UVOD...- 3-1. SPLOŠNO O VITAMINU D...- 3-2. METABOLIZEM VITAMINA D...- 3-3. DNEVNE POTREBE VITAMINA D IN VSEBNOST V HRANI...- 5-4. BOLEZNI POVEZANE Z POMANJKANJEM VITAMINA D...- 7-4.2 KONGENITALNA HIPOFOSFATEMIJA...- 9-4.3 OSTEOMALACIJA...- 9-4.4 OSTEOPOROZA...- 9-4.5 HIPOPARATIROIDIZEM...- 11-4.6 HIPERPARATIROIDIZEM...- 12-4.6.2 Sekundarni hiperparatiroidizem...- 13-5.1 TOKSIČNOST VITAMINA D IN KALCIFEDIOLA...- 14-5.3.1 Granulomatozne bolezni...- 14-5.3.2 Sarkoidoza...- 15-6. FUNKCIJA VITAMINA D V LEDVICAH...- 15-6.1 BOLEZNI POVEZANE Z VITAMINOM D IN LEDVICAMI...- 15-6.1.1 Toksičen vpliv vitamina D na ledvice...- 15-6.1.2 Poškodba ledvic...- 16-6.1.3 Ostale bolezni:...- 16-7. METODE ZA DOLOČANJE VITAMINA D...- 16-7.1.2 IMUNOLOŠKE METODE, KI TEMELJIJO NA REAKCIJI ANTIGEN - PROTITELO...- 18-7.1.3 RADIOIMUNOLOŠKA METODA ( RIA )...- 18-7.1.4 ENCIMSKO IMUNSKA METODA ( ELISA )...- 19 - III. NAMEN DELA...- 25 - METODE IN MATERIALI...- 26-1. VZORCI...- 26-2.1 ELISA METODA...- 27 - NAMEN UPORABE...- 27 - PRINCIP TESTA...- 27 - ANALITČNA OBČUTLJIVOST...- 28 - NATANČNOST...- 28 - ANALITIČNA SPECIFIČNOST...- 28 - OPOZORILA IN ROKOVANJE...- 28 - VAKUUMSKA POSODA VAC ELUT SPS 24 VARIAN INC...- 30 - IZRAČUN REZULTATOV...- 33 - ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI...- 34 - OMEJITVE POSTOPKA...- 34 - KONTROLA KAKOVOSTI...- 34-2.2 RIA METODA...- 35 - NAMEN UPORABE...- 35 - PRINCIP TESTA...- 35 - ANALITIČNA OBČUTLJIVOST...- 35 - NATANČNOST...- 35 - ANALITIČNA SPECIFIČNOST...- 36-1470 WALAC WIZARD GAMA ŠTEVEC GMI INC...- 36 - POTEK ANALIZE...- 38 - IZRAČUN REZULTATOV...- 41 -
ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI...- 41 - OMEJITVE POSTOPKA...- 41 - KONTROLA KAKOVOSTI...- 42 - IV. PREGLED REZULTATOV...- 43-1. STATISTIČNO VREDNOTENJE METOD...- 43 - A.) Aritmetična sredina...- 43 - B.) Standardna deviacija...- 43 - C.) Koeficient variacije...- 43 - D.) Passing in Bablok regresija...- 43 - E.) Primerjava metod po Bland Altmanu...- 44 - F.) t test...- 45-2. IZRAČUN REZULTATOV...- 45 - ELISA METODA...- 45 - RIA METODA...- 46-3. PRIMERJAVA KONCENTRACIJ MED METODAMA...- 48 - V. RAZPRAVA...- 49 - VI. SKLEP...- 52 - VII. VIRI IN LITERATURA...- 53 - Literatura slik:...- 54 - Kazalo slik: Slika 1: Ergokalciferol - vitamin D2 in holekaciferol - vitamin D3...- 3 - Slika 2: Aktivacija vitamina D3...- 4 - Slika 3: Ukrivljene noge zaradi rahitisa...- 8 - Slika 4: prerez vretenc pri zdravem človeku in pri hudi osteoporozi...- 10 - Slika 5: Zlom na vretencih in zlom kolka pri osteoporozi...- 11 - Slika 6: Indirektna Sendvič ELISA...- 20 - Slika 7: Analizator Personal Lab...- 29 - Slika 8: Vac Elut SPS 24...- 30 - Slika 9: Walac Wizard gama števec...- 36 - Slika 10: Passing in Bablok regresijska premica...- 44 - Slika 11: Bland Altman...- 44 - Slika 12: Standardna krivulja za ELISA metodo...- 46 - Slika 13: Standardna krivulja za RIA metodo...- 47 - Kazalo tabel: Tabela 1: Viri vitamina D v hrani...- 6 - Tabela 2: Material prisoten v kompletu...- 31 - Tabela 3: Material prisoten v kompletu...- 37 -
I. POVZETEK Vitamin D je antirahitični vitamin, ki ga pogosto imenujemo vitamin sonca, saj je ultravijolična svetloba odgovorna za njegovo produkcijo. Lahko nastaja v koži pod vplivom ultravijolične svetlobe ( endogeni vir vitamina D ) ali pa ga vnašamo v telo s prehrano ( eksogeni vir vitamina D ). Če je dovolj sonca, se sintetizira v koži iz provitamina D in ga v idealnih okoliščinah ni potrebno vnašati v telo s hrano. Vitamin D pa lahko vnašamo v telo tudi s prehrano, ki vsebuje naravno nizke ravni vitamina D2 ( npr.: mleko, maslo, kosmiči z dodatkom vitamina D), ali pa z prehranskimi dopolnili, ki so pripravljeni in se dobijo v trgovinah, ter s terapevtskimi formulacijami vitaminov D2. Vit. D lahko prepreči ali pa zdravi rahitis. Vit. D sam po sebi ni dejaven, ko stopi v krvni obtok. Biološko dejavnost dobi šele z kompleksnim nizom v presnovi. Skupaj z PTH regulira homeostazo kalcija v plazmi. Pospešuje absorpcijo kalcija in fosfatov in je nujno potreben za normalno rast in mineralizacijo kosti in zob. Pri tej diplomski nalogi smo določali koncentracijo 1,25-(OH) 2 D v serumu z dvema metodama; in sicer z encimskoimunsko metodo in radioimunsko metodo. Pri obeh metodah smo uporabili iste vzorce, saj smo hoteli metodi primerjati med seboj in ugotoviti katera metoda je zanesljivejša in enostavnejša za uporaba ter katera je boljša. Do sedaj se je za določanje 1,25-(OH) 2 D uporabljala radioimunska metoda, pri kateri se uporabljajo radioaktivni izotopi, ki so zdravju škodljivi in nevarni. Zato smo poizkusili ali bi encimskoimunska metoda lahko nadomestila radioimunsko metodo. Dobljeni rezultati so pokazali, da metodi ne dajeta enakih rezultatov. Da bi ugotovili, katera metoda je boljša, smo pri vrednotenju rezultatov upoštevali kontrolni karti obeh metod. Radioimunska metoda se je izkazala za bolj zanesljivo kot encimskoimunska metoda. Na podlagi eksperimentalnega dela smo zaključili, da encimskoimunska metoda ne more nadomestiti dolgoletno in preverjeno radioimunsko metodo. - 1 -
SEZNAM OKRAJŠAV VDR vitamin D receptor 1,25-(OH) 2 D 1,25-dihidroksivitamin D Vit. D vitamin D PTH paratiroidni hormon ipth imunoreaktivni paratiroidni hormon Ag antigen Ab protitelo TMB tetrametilbenzidin NSB kalij fosfatni želatinski pufer GAR precipitacijski kompleks- kozji proti kunčji precipitacijski kompleks DBP - vitamin D vezujoči protein MEN - multipla endokrina neoplazija DHH - družinska hipokalciurična hiperkalcemija µg - mikrogram µl - mikroliter - 2 -
II. UVOD 1. SPLOŠNO O VITAMINU D Vitamin D je edini vitamin, ki ga telo lahko proizvede samo, in sicer s pomočjo obsevanja kože z ultravijolično svetlobo. Človeške potrebe po vitaminu D zadovolji že 10 do 15 minutno izpostavljanje soncu 2 do 3 krat na teden. Ljudje, ki živijo bolj severno ali pa so pretežno v zaprtih prostorih, so manj izpostavljeni soncu, si lahko dovolj vitamina D zagotovijo le z ustrezno prehrano ali pa z jemanjem vitaminskih dopolnil. Vitamin D je netopen v vodi, topi pa se v maščobi, alkoholu, kloroformu,etru in rastlinskih oljih. Pospešuje absorpcijo kalcija in fosforja iz prebavnega sistema in vpliva na nalaganje in absorpcijo kalcija v kosteh. Potreben je za normalno rast in mineralizacijo kosti in zob. 1 2. METABOLIZEM VITAMINA D Vitamin D se uvršča med vitamine, čeprav gre za hormon (zaradi steroidne strukture in načina delovanja). Obravnava se kot prohormon z različnimi aktivnimi metaboliti, ki delujejo kot hormoni. Najučinkovitejši obliki, ki se uporabljata v terapevtske namene sta vitamina D2 - ergokalciferol in D3 - holekalciferol. 1 Slika 1: Ergokalciferol - vitamin D2 in holekaciferol - vitamin D3-3 -
Koža Holekalciferol (vitamin D3) jetra 25 hidroksiholekalciferol ledvice aktivacija inhibicija Paratiroidni hormon 1,25 dihidroksikalciferol Intestinalni epitelij Kalcij Kalcij stimulirajoča alkalna fosfataza vezoči ATP-aza protein Inhibicija Intestinalna apsorbcija kalcij Plazemska koncentracija kalcijevih ionov Slika 2: Aktivacija vitamina D3 Ergokalciferol oz. vitamin D2 je antirahitična substanca, ki se pridobiva z ultravijoličnim sevanjem iz ergosterola (sterol v glivicah in kvasovkah). To je glavna naravna oblika vitamina D v rastlinah. Rastlinojedci uporabljajo vitamin D2 kot glavni vir vitamina D. - 4 -
Lahko se metabolizira v različne oblike, ki predstavljajo analoge vitamina D3. ena od teh oblik je tudi hormonsko aktivna oblika vitamina D2 1,25 dihidroksivitamin D. Vitamin D3 holekalciferol nastaja v koži z fotolizo pod vplivom UV- radiacije ( β žarki) iz 7 dehidroholesterola, ki je normalno prisoten v koži. Ko je koža izpostavljena soncu, pride do razčlenitve B-obroča v steroidni strukturi, pri čemer se tvori provitamin D3, ki se spontano izomerizira v vitamin D3. Holekalciferol se v jetrih aktivira in se v procesu 25 hidroksilacije pretvori v kalcifediol oz. 25 hidroksiholekaciferol. Kalcifediol lahko s povratno zvezo inhibira reakcijo pretvorbe, ta povratna zveza pa je pomembna zaradi zelo natančnega nadziranja koncentracije kalcifediola v plazmi ter zaradi nadziranja pretvorbe vitamina D3 v kalcifediol. V taki obliki pa se v jetrih skladišči za nadaljnjo uporabo. V procesu 1α hidroksilacije se kalcifediol nadalje hidroksilira v glavno biološko aktivno obliko kalcitriol ( 1,25- dihidroksiholekalciferol). Do te hidroksilacije pride v proksimalnih tubulih ledvic. Ta oblika je najaktivnejša oblika vitamina D. Kalcitriol nekaj časa potuje po krvi vezan na DBP, nato se odcepi ter vstopi v tarčno celico z difuzijo in prid v stik z VDR. Kalcitriol se veže s transkripcijskim faktorjem, ki regulira gensko ekspresijo transportnih proteinov, ki so vključeni v absorpcijo kalcija v črevesju. Rezultat tega je vzdrževanje koncentracije kalcijevih in fosfatnih ionov v krvi in kosteh. Pri tem pa še sodelujeta paratiroidni hormon in kalcitonin. Če ledvice odstranimo, vitamin D izgubi ves svoj učinek. Če ni PTH-ja je tvorba kalcitriola popolnoma prekinjena, zato PTH močno vpliva na funkcionalne učinke vitamina D v organizmu. 2 3. DNEVNE POTREBE VITAMINA D IN VSEBNOST V HRANI Izpostavljanje kože sončni svetlobi zagotovi 80 90 % potrebne količine vitamina D. zadostuje že kratek čas na soncu, in sicer 5-10 min 2-3 krat na dan, ta pa je odvisen tudi od tipa kože, starosti in prisotnosti UVB radiacije. Izpostavljeni morajo biti roke, obraz in hrbet. Če uporabljamo kreme z visokimi zaščitnimi faktorji, ne pride do sinteze vitamina D, prav tako pa je sinteza zmanjšana ob slabem vremenu in v zimskem obdobju. - 5 -
Ko se proizvede dovolj vitamina D, se dodatni vitamin D pretvori v neaktivno obliko in se skladišči v telesu. Prekomerno izpostavljanje soncu ne poveča nivoja vitamina D, poveča pa tveganje za dolgotrajne poškodbe kože. Tabela 1: Viri vitamina D v hrani HRANA VSEBNOST VITAMINA D V µg Losos ( kuhan ) 9 Sardine v olju 6,25 Tuna v olju 5 Mleko obogateno z vitaminom D, 2,45 en kozarec Margarina ( 1 žlica) 1,5 Fruchtzwerge 2 lončka( 100 g ) 1,25 Ementalec ( 1 rezina ) 1,10 Jajce (v rumenjaku) 0,5 Mleko, 1 kozarec 023 Jogurt ( 125 g) 0,08 Ribje olje polenovke 1 žlica 0,034 Vitamin D pa se nahaja tudi v kosmičih in mleku z dodatkom vitamina D in v prehranskih dopolnilih, ki so že pripravljena ( AD3 kapljice, Alpha D3, Plivit D3, Rocatrol). Priporočene dnevne količine vnosa vitamina D v telo so: 200 600 IE na dan oz. 5 15 µg na dan Zgornja meja tolerance vitamina D pa znaša 2000 IE oz. 50 µg na dan, kar je 10 krat povečana normalna priporočena količina. Do pomanjkanja vitamina D ponavadi pride zaradi neustrezne prehrane, premalo izpostavljanja sončni svetlobi, upočasnjene absorpcije, povišanje izločanja ter ob - 6 -
nezmožnosti pretvorbe v ledvicah. Pri dojenčkih in v otroštvu pomanjkanje vitamina D povzroča rahitis, pri odraslih pa pomanjkanje tega vitamina povzroča mehčanje kosti. Prevelika količina vitamina D pa povzroča zmanjšanje apetita, telesne teže, morsko bolezen, glavobol, depresijo in pa prenakopičenje kalcija v mladosti. 4 4. BOLEZNI POVEZANE Z POMANJKANJEM VITAMINA D Večjo možnost za razvoj pomanjkanja vitamina D imajo starejši ljudje ( nad 50 let ), saj je pri starejših zmanjšana sposobnost pretvorbe 7 dehidroholesterola v provitamin D3 v koži. Prav tako pa tudi ledvice, ki pretvarjajo kalcifediol v aktivno obliko ne delujejo brezhibno kot pri mladih ljudeh. Za pomanjkanjem vitamina D pa trpijo tudi ljudje, ki niso dovolj izpostavljeni sončni svetlobi. Tem ljudem se zato priporoča jemanje nadomestkov vitamina D kot so šumeče tablete ali pa prehranska dopolnila, ki vsebujejo vitamin D. 1 4.1 RAHITIS Ob pomanjkanju vitamina D se pojavi rahitis, saj je proces v kosteh skoraj prekinjen. Gre za nezadostno mineralizacijo kosti, ki je posledica pomanjkanje kalcijevih in fosfatnih ionov v ekstracelularni tekočini. Pojavlja se samo pri otrocih, ki jim kosti še rastejo. Zaradi vse pogostejše uporabe nadomestkov vitamina D, so problemi v povezavi z rahitisom pri otrocih vse redkejši. Rahitis se pojavlja večinoma spomladi, saj se vitamin D ustvarjen prejšnje poletje, ki se je skladiščil v jetrih, porabi preko zime. Absorpcija kalcija in fosforja iz kosti pod vplivom PTH, lahko za nekaj časa prepreči klinične znake vitamina D. Pri rahitisu se v plazmi rahlo zniža koncentracija kalcija, veliko bolj pa se zniža koncentracija fosfata. Do takšnih razlik pride, ker paratiroidne žleze preprečujejo, da bi se koncentracija kalcija znižala in ob najmanjšem znižanju koncentracije povečajo absorpcijo kalcija iz kosti. To pa ni zadosten regulacijskih sistem, ki bi preprečeval znižanje vrednosti fosfata, in zato povečano delovanje paratiroidnih žlez pravzaprav poveča izločanje fosfatov preko urina. Pri dolgotrajnem rahitisu se zaradi kompenzacijskega povečanja izločanja PTH pretirano poveča demineralizacija kosti. Posledica tega je, da kosti slabijo. Kost postaja vedno šibkejša, ker osteoblasti izgubljeno kostno maso nadomeščajo z osteidom, ki pa se zaradi - 7 -
pomanjkanja kalcija in fosfata ne more mineralizirati. To vse pa vodi v motnje razvoja in hude deformacije kosti. V zgodnjih fazah rahitisa se tetanija ne pojavi skoraj nikoli. Paratiroidne žleze konstantno stimulirajo osteoklastno absorpcijo iz kosti in s tem vzdržujejo normalno koncentracijo kalcija v ekstracelularni tekočini. Ko se zaloge kalcija v kosteh izčrpajo toliko, da vrednost kalcija v krvi pade pod 1 mmol/l se običajno razvijejo znaki tetanije. Otrok lahko umre zaradi tetaničnega krča laringealnih ( respiratornih ) mišic, zato mu je potrebno intravenozno vbrizgati kalcij, ki takoj prepreči tetanijo. Simptomi: - mišični krči - počasnejše zaraščanje lobanjskih kosti - hrbtenična krivina je pri otrocih od enega do štirih let nenormalna - noge so ukrivljene - otroci shodijo pozneje - starejše otroke in mladostnike med hojo boli - zaradi sploščitve medeničnih kosti in zoženja porodnih poti pri mladostnicah pozneje oteženo rojevanje Slika 3: Ukrivljene noge zaradi rahitisa Terapija pri rahitisu pomeni po eni strani priskrbeti zadostne količine kalcija in fosfata v prehrani, po drugi strani pa dodati zadostne količine vitamina D. Če vitamin D ni dodan, se le majhne količine kalcija in fosfata absorbirajo iz črevesja. - 8 -
4.2 KONGENITALNA HIPOFOSFATEMIJA Kongenitalna hipofosfatemija ali vitamin D rezistenten rahitis je vrsta ledvične bolezni, ki izzove rahitis in osteomalacijo. Nastane kadar je absorpcija fosfata v ledvičnih tubulih zmanjšana. Pri ljudeh, ki so jim odstranili ledvico ali je bila ta poškodovana in se zdravijo s hemodializo, lahko izzove hude zaplete. To obliko rahitisa zdravimo z fosfatnimi substancami in ne s kalcijem in vitaminom D. 4.3 OSTEOMALACIJA Osteomalacija je rahitis odraslih. Tu gre za mehčanje, slabljenje in demineralizacijo kosti zaradi pomanjkanja vitamina D. Ker imajo odrasli že zgrajen skelet, ne potrebujejo toliko kalcija in vitamina D kot otroci. Osteomalacija tako nastopi le, če je resno motena absorpcija maščob ( steatoreja ). Občasno je absorpcija kalcija in fosfata pri odraslih tako slaba, da se lahko pojavi rahitis. Ta praktično nikoli ne napreduje do tetanije, vseeno pa težko poškoduje kosti. Klinični znaki osteomalacije so oslabelost kosti ( gumijasta konsistenca ), zelo redko pa pride do tetanije. Najpogostejši vzrok za slabšo absorpcijo vitamina D so nekatera zdravila ( antikonvulzivi, holestiramin), za moteno črevesno absorpcijo fosfatov ali ledvično reasorpcijo pa toksične snovi ( aluminij, kadmij, fluoridi). Poznamo še ledvični rahitis, ki je tip osteomalacije, ki nastane kot posledica dolgotrajnega obolenja ledvic ( ledvična insuficienca, ledvična odpoved ). Glavni vzrok tega stanja je predvsem nezmožnost ledvic, da tvori 1,25 dihidroksiholekalciferol. Pri ljudeh, ki so jim odstranili ledvico ali pa je ta bila poškodovana in se zdravijo z hemodializo, pojav ledvičnega rahitisa predstavlja hud zaplet. Pojavi se lahko tudi hipokalcemija. 4 4.4 OSTEOPOROZA Je najpogostejše obolenje kosti pri odraslih, še posebej pogosta pa je v visoki starosti. Definirana je kot zmanjšanje kostne mase na volumsko enoto kosti. Tej definicij ustreza širok spekter motenj z različnimi vzroki, v ožjem smislu pa osteoporozo pojmujemo kot bolezen, kjer je primarno moteno nastajanje organskega matriksa kosti. - 9 -
Slika 4: prerez vretenc pri zdravem človeku in pri hudi osteoporozi Od osteomalacije in rahitisa se razlikuje prav po tem, da je primarno prizadeto nastajanje organskega matriksa kosti, kot sekundarni učinek pa je zmanjšana mineralizacija kosti, saj se ob izgubi kostnega matriksa kristali kalcijevega hidroksiapatita nimajo kam vezati. Pri osteoporozi se aktivnost osteoblastov v kosteh običajno zniža, posledično pa je zmanjšano tudi odlaganje osteoida. Včasih pa je vzrok za zmanjšanje kostnega tkiva tudi prekomerna aktivnost osteoklastov. Osteoporoza je pogosta pri ženskah v postmenopavzalnem obdobju, ker pomanjkanje estrogena pospeši kostno resorpcijo in zavre nalaganje osteoida, s tem pa je onemogočeno nalaganje mineralov na organski kostni matriks. Vzroki za osteoporozo so lahko dedni ali pa pridobljeni, pogosto pa so kombinirani. Pridobljeni vzroki: - fizična neaktivnost - pomanjkanje vitamina C, ki nujen za nemoteno sintezo kolagena, ki je osnovna sestavina organskega matriksa - podhranjenost ( ne more se tvoriti zadosten proteinski matriks) - zmanjšana sekrecija estrogena po menopavzi - starost ( zmanjšana koncentracija rastnega hormona ) - Cushingov sindrom - hipogonadizem pri moških - alkohol - 10 -
Pri osteoporozi se pojavijo pogostejše frakture in deformacije, najhujša komplikacija pa je zlom kolka. Slika 5: Zlom na vretencih in zlom kolka pri osteoporozi Diagnostika temelji na merjenju gostote kostne mase, kar naredimo z denziometrom, ki deluje na osnovi rentgenskih žarkov. Merjenje je neboleče, sevanje pa je zanemarljivo majhno. Osteoporozo lahko preprečimo z ustrezno zdravo prehrano, ki vsebuje veliko kalcija, z redno telesno aktivnostjo oz. vadbo, na razpolago pa imamo tudi zdravila, kot so hormoni, bifosfonati, kalcitonin, kalcij, vitamin D. Preprečimo pa jo tudi tako, da prenehamo kaditi in z zmernim uživanjem alkohola. 4 4.5 HIPOPARATIROIDIZEM Hipoparatiroidizem je stanje zmanjšanega izločanja obščitničnega hormona PTH, ki je odgovoren za uravnavanje aktivnosti osteoklastov. Lahko je posledica kirurške odstranitve obščitnice, genetske motnje, avtoimunske bolezni, Wilsonove bolezni ali zmanjšanega odzivanja tarčnih celic na PTH. V primeru premajhnega izločanja postanejo osteoklasti skoraj popolnoma neaktivni, kar privede do zmanjšane reabsorpcije kalcija iz kosti in posledično do hipokalcemije. Izmed vseh mišic so na tetanični spazem najbolj občutljive mišice grla. Za zdravljenje hipoparatiroidizma se zelo redko uporablja PTH, ker je ta hormon zelo drag, in deluje le nekaj ur, prav tako pa organizem zanj ustvarja protitelesa. Večinoma se za zdravljenje uporablja vitamin D v velikih količinah ( 100000 IE na dan ) skupaj z kalcijem v obliki kalcijevega glukonata ( 25 do 50 mmol), saj skupaj vzdržujeta koncentracijo kalcija v telesnih tekočinah v normalni ravni. Včasih pa se namesto - 11 -
inaktivnega vitamina D dodaja kalcitriol, saj je močnejši in deluje hitreje, vendar pa ta povzroča tudi stranske učinke. 4.6 HIPERPARATIROIDIZEM 4.6.1 Primarni hiperparatiroidizem Primarni hiperparatiroidizem nastane zaradi prekomerne produkcije in sproščanja PTH-ja iz obščitnic. Pogostejši je pri ženskah, ker nosečnost in laktacija dražita paratiroidne žleze in ustvarjata predispozicijo za razvoj tovrstnih tumorjev. Povzročijo ga lahko adenom, karcinom ali pa difuzna hiperplazija. 1. Adenom Je najpogostejši vzrok za nastanek primarnega hiperparatiroidizma. Večina paratiroidnih adenomov prizadene posamezno žlezo. Tumorske celice obščitnic izločajo prevelike količine PTH-ja, saj se na spremenjeno koncentracijo kalcija v krvi odzivajo slabše ali pa se sploh ne odzivajo. 2. Karcinom obščitnic Je zelo redek. Vaskularna ali kapsularna invazija s tumorskimi celicami je zelo dober indikator malignosti, vendar ta karakteristika ni vedno prisotna. V večini primerov podpirajo diagnozo lokalne ponovitve ali metastaze v jetrih, pljučih ali kosteh. 3. Paratiroidna hiperplazija Ponavadi se nanaša na povečanja ali abnormalnosti vseh štirih žlez. Lahko je del sindroma avtosomne dominantne multiple endokrine neoplazije ( MEN ) oz. družinske hipokalciurične hiperkalcemije (DHH ). Gre za bolezen, kjer je gen za receptor. Ki je občutljiv za kalcijeve ione mutiran. Ta receptor je izražen v različnih tkivih. V obščitnicah zazna plazemsko koncentracijo kalcijevih ionov in določi koliko PTH-ja se izloči. V ledvicah pa določa nivo ekskrecije kalcijevih ionov z urinom. Pri DHH je okvarjena zmožnost receptorja za zaznavanje kalcijevih ionov v serumu, zato se kljub normalni serumski koncentraciji kalcijevih ionov iz obščitnic izloča PTH, izločanje kalcijevih ionov z urinom pa se zmanjša. Posledica tega je koncentracija kalcijevih ionov v serumu - 12 -
povišana v urina pa znižana. DHH zajame vse štiri žleze, zato je v takih družinah povečana možnost za nastanek raka na obščitnicah. Obščitnice takih pacientov so tipično povečane. Prekomerno izločanje PTH-ja poveča aktivnost osteoklastov, ki razgrajujejo kostnino. Posledično se koncentracija kalcijevih ionov v ekstracelularni tekočini poveča, koncentracija fosfatnih ionov za zmanjša. PTH zmanjša tudi reabsorpcijo bikarbonatnega iona v ledvicah, zato se njegova koncentracija v ekstracelularni tekočini zniža in pride do metabolne acidoze. Klinični znaki so pri večini bolnikov asimptomatski, pri nekaterih pa je klinična slika zelo raznolika: - težave s skeletom ( zlomi, kostne ciste ) - hiperkalcemija - ledvični kamni - metastatične kalcifikacije - znaki depresije živčevja - bruhanje - poliurija 4.6.2 Sekundarni hiperparatiroidizem Pojavlja se visoka vrednost PTH-ja, in sicer kot kompenzacijska reakcija na hipokalcemijo, in ne nastaja zaradi primarne spremembe v obščitničnih žlezah. Pri pacientih s kronično renalno okvaro se pojavlja veliko dejavnikov, ki prispevajo k povečanju obščitnic. To pa vključuje zmanjšano produkcijo 1,25-dihidroksivitamina D, zmanjšano absorpcijo kalcija v črevesju, odpornost na PTH in zadrževanje fosfata v ledvicah. Če pa ne gre za renalno okvaro pa se sekundarni hiperparatiroidizem lahko razvije zaradi pomanjkanja vitamina D ali kalcija. Klinični znaki: - pomanjkanje vitamina D to vodi do osteomalacije - velike količine izločenega PTH to povzroča absorpcijo kostnine Diagnostika hiperparatiroidizma temelji na merjenju koncentracije kalcijevih ionov v serumu in na merjenju imunoreaktivnega PTH ( ipth ). 1-13 -
5. BOLEZNI POVEZANE Z PREKOMERNO KOLIČINO VITAMINA D Vitamin D ima v človeškem telesu dolgo razpolovno dobo in širok razpon distribucije. Hrana in vitaminske tablete vsebujejo zelo majhne koncentracije vitamina D, da je prekomeren odmerek v normalnih pogojih skoraj nemogoča. Prekomerni vnos pa lahko vodi do hiperkalcemije in ateroskleroze. 1 5.1 TOKSIČNOST VITAMINA D IN KALCIFEDIOLA Običajen vzrok, da pride do te toksičnosti je nepravilna uporaba farmakoloških sredstev, zlasti kadar je vitamin D predpisan kot terapija, in sicer pri hipoparatiroidizmu, renalnih motnjah, osteoporozi, osteomalaciji, Lahko pa se pojavi tudi pri pretiranem jemanju vitaminskih nadomestkov. Prevelika izpostavljenost soncu pa ne vpliva preveč na toksičnost vitamina D. Drugi dejavniki, ki še vplivajo na to toksičnost so povečan vnos kalcija s hrano, zmanjšana ledvična funkcija, dodajanje vitamina A in pa granulomatozne motnje. 1 5.2 TOKSIČNOST KALCITRIOLA Kalcitriol se uporablja za zdravljenje številnih metabolnih kostnih bolezni, saj ima sposobnost zaviranja sinteze PTH. Tudi v tem primeru pride do toksičnosti zaradi nepravilne uporaba farmakoloških sredstev. Dnevne doze nad 0,75 µg so lahko že toksične. 1 5.3 OBLIKE ENDOGENE TOKSIČNOSTI VITAMINA D 5.3.1 Granulomatozne bolezni Bolniki z granulomatoznimi obolenji so preobčutljivi na vitamin D, zato se pri njih razvije hiperkalcemija tudi brez pretiranega vnosa vitamina D. Ta sindrom je povzročen z ektopično produkcijo 1,25-(OH)2 D toksičnosti. To toksičnost povzroča samo granulomatozno tkivo. 1-14 -
5.3.2 Sarkoidoza Je najbolj pogosta granulomatozna bolezen, ki je povezana s hiperkalcemijo. Pri tem nastanejo v mnogih organih granulomi. Sarkoidni granulomi ustvarjajo aktivirani vitamin D, ki stopnjuje vsrkavanje kalcija iz črevesa. Visoka koncentracija kalcija v krvi povzroči izgubo apetita, slabost, bruhanje, žejo in čezmerno nastajanje seča. Pogosto se razvije tudi hiperkalciurija. Če visoka koncentracija kalcija v krvi traja predolgo, povzroči nastanek ledvičnih kamnov in posledično lahko tudi odpoved ledvic. 1 6. FUNKCIJA VITAMINA D V LEDVICAH Ledvice imajo življenjsko pomembno funkcijo pri nadzoru kalcija in fosforja v plazmi. V času 24-ih ur se 8g kalcija filtrira skozi glomerule, okoli 7,8g pa se ga reabsorbira v proksimalnih in distalnih tubulih ter v Henleyjevi zanki. Koncentracija kalcija v urinu se mora izenačiti s koncentracijo kalcija, ki se je absorbiral v tankem črevesju. Reabsorpcijo kalcija v ledvicah kontrolirajo številni faktorji: celotna filtracija natrija, aktivnost številnih hormonov, tok urina Ledvice predstavljajo mesto sinteze kalcitriola, ter izražajo številne proteine, ki so odvisni od vitamina D kot so: Ca črpalka, natrij/kalcijev izmenjevalec in kalbindin-d, izražajo pa tudi VDR, poleg tega pa še kalcifediol in kalcitriol. 1 6.1 BOLEZNI POVEZANE Z VITAMINOM D IN LEDVICAMI 6.1.1 Toksičen vpliv vitamina D na ledvice Sposobnost koncentriranja urina je lahko zmanjšana, saj visoka koncentracija kalcija spremeni delovanje vazopresina na ledvične tubule. Pojavi se lahko poliurija in posledično tudi polidipsija. Prvi znak pojava toksičnosti vitamina D je hiperkalciurija, ki se pojavi pred hiperkaclemijo. - 15 -
6.1.2 Poškodba ledvic Ledvice so tiste, ki vitamin D preoblikujejo v aktivno obliko kalcitriol. Če pride do oslabitve ledvic, kosti ne dobijo dovolj kalcija, ker ledvice ne pretvarjajo zadostno količino vitamina D v kalcitriol in pa ker se v krvi nabira preveč fosforja. Zato morajo bolniki s poškodovanimi ledvicami jemati sintetični kalcitriol ali sintetični vitamin D. 6.1.3 Ostale bolezni: - osteomalacija pri kronični napaki ledvic, povzročena z zmanjšano produkcijo vitamina D in z zadrževanjem fosforja v ledvicah - zastrupitev s PTH-jem in metastazne kalcifikacije - tvorba ledvičnih kamnov pri hiperparatireoidizmu 7. METODE ZA DOLOČANJE VITAMINA D 7.1 IMUNOKEMIJSKE TEHNIKE Odkar se je imunologija pojavila kot veja medicine pred več kot dvema stoletjema, obravnava nove pristope k nadzorovanju nalezljivih bolezni pri človeku in živalih. Že od začetka je bila obravnavana kot znanost, ki je tesno povezana z mikrobiologijo. Zdaj se je imunologija razvila v eno od najbolj kreativnih vej medicine. Razumevanje mehanizma imunskega sistema in imunoloških lastnosti patogenov je tlakovana pot za razvoj različnih pristopov za izdelavo učinkovitih cepiv proti različnim človeškim in živalskim boleznim. Prav tako pa razumevanje in znanje interakcij antigen protitelo v in vitro pogojih omogoča razvoj različnih imunoloških testov, ki se uporabljajo za diagnostiko nalezljivih in tudi nenalezljivih bolezni. Zelo velika natančnost interakcij antigen protitelo je vodila do razvitja različnih, ekstremno uporabnih in visoko občutljivih imunokemijskih tehnik. 5-16 -
7.1.1 IMUNSKI SISTEM V obrambo proti mikroorganizmom so večceličarji razvili specializirana, po telesu razporejena obrambna tkiva, v katerih imunske celice prepoznavajo, uničujejo in odstranjujejo te mikroorganizme. Med evolucijo so se razvile različne imunske celice, ki se razlikujejo glede na mehanizem delovanja. - fagocitne celice: najpreprostejše, fagocitoza - limfociti: natančno prepoznajo tujke in ustrezno ukrepajo - limfociti B - limfociti T - monociti Antigen ( Ag ) Antigen je snov, ki v telesu oz. organizmu povzroči imunski odziv. Nanje se specifično vežejo protitelesa, ki imajo specifična mesta epitop, na katera se antigeni vežejo. Protitelo (Ab ) Protitelo je topna glikoproteinska molekula, ki spada v skupino imunoglobulinov. Sposobna je prepoznati tujek in se nanj vezati, ter s tem prepreči, da bi tujki škodovali organizmu. Protitelesa razvrščamo v več razredov: - IgG - IgM - IgA - IgD - IgE Med seboj se razlikujejo po velikosti in po vlogi, ki jo imajo. Sestavljena so iz dveh lahkih in dveh težkih verig. 11-17 -
7.1.2 IMUNOLOŠKE METODE, KI TEMELJIJO NA REAKCIJI ANTIGEN - PROTITELO precipitacijske tehnike aglutinacijski test radioimunološka metoda (RIA) encimsko imunska metoda (ELISA) encimsko oligonukleotidna metoda (ELOSA) imunoblotting fluorescenčna metoda 7.1.3 RADIOIMUNOLOŠKA METODA ( RIA ) RIA se uporablja v biomedicinskem področju za raziskovanje in diagnostiko človeških in živalskih bolezni. Ta tehnika omogoča hitro meritev antigena v pikogramih ter omogoča relativno natančnost z uporabo radioaktivno označenih antigenov. RIA vključuje reakcijo specifičnih protiteles z mešanico radioaktivno označenih in neoznačenih antigenov. Označeni in neoznačeni antigeni med seboj tekmujejo za vezavo na protitelo. Po koncu reakcije ločimo vezane in nevezane antigene, ter kvantitativno merimo radioaktivnost z uporabo primernih standardov. Na ta način lahko ocenimo količino inhibicije od radioaktivno označenega in neoznačenega antigena. Ker je test zelo občutljiv ga lahko uporabljamo za kvantitativno določanje določenih proteinov, kot so encimi, imunoglobulini, virusni proteini, hormoni, antibiotiki, steroidi, id Pri tej metodi se največ uporabljajo reagenti označeni z I 125 ali I 131. Oba izotopa emitirata energijo, ki jo lahko detektiramo z scintilacijskim spektrofotometrom, ki je opremljen z detektorjem. Direktna RIA Če določamo antigen je protitelo označeno z radioizotopom in se inkubira in redči z različnimi razredčitvami pripravkov, ki vsebujejo antigen. Če pa določamo protitelo pa inkubiramo označen antigen z raztopinami, ki vsebujejo protitelo. - 18 -
Indirektna RIA Pri tej metodi nista radioaktivno označena niti protitelo niti antigen. Označen pa je antiglobulin oz. sekundarno protitelo, ki ga pripravimo z vbrizgavanjem Ig. Tako je posredno primarna reakcija merjena s sekundarno imunološko reakcijo. Kompetetivna RIA Med reakcijo Ag-Ab nastane kompleks, ki je premo sorazmeren s koncentracijo Ag v vzorcu. Nato dodamo standardno količino označenega Ag v reakcijsko zmes in re inkubiramo. Označen Ag reagira samo z preostalimi mesti na Ab, ki niso zasedena. Količina označenih Ag povezanih z Ab so zato obratno sorazmerna količini Ag v vzorcu. Najbolj pogosto za ločevanje označenih in neoznačenih reagentov uporabljamo centrifugo. 7.1.4 ENCIMSKO IMUNSKA METODA ( ELISA ) ELISA je eden od najbolj občutljivih in specifičnih imunskih metod za kvantitativno določanje Ag in Ab. Princip metode je podoben RIA metodi, vendar tu namesto radioaktivnega izotopa za označevanje imunskega kompleksa uporabimo encim. Za določanje protiteles se uporablja indirektna ELISA, za določanje antigenov pa se uporablja direktna ELISA. Direktna ELISA Pri direktni ELISI je označen encim konjugiran z bodisi Ag ali Ab specifičnim za Ag. Mikrotitrsko ploščo je obloženo z antigenom inkubiramo z primarnimi protitelesi za Ag, ki ga določamo. Prisotnost kompleks Ag Ab detektiramo s pomočjo encima, in sicer prvo kompleks speremo, da odstranimo nevezane Ag, dodamo substrat, ki ob prisotnosti encima spremeni barvo, katere intenzivnost merimo. Koncentracija Ag in prisotnost encima sta obratno sorazmerni. Največkrat se uporabljata encima peroksidaza in alkalna fosfataza. - 19 -
Indirektna ELISA Pri indirektni ELISI pa je encim pritrjen na Ab. Na nosilcu imamo vezan znan Ag. Dodamo vzorec s Ab in speremo nevezana Ab. Nato dodamo še Ab, ki so označena z encimom, ki se vežejo na že vezana Ab, in spet speremo, da odstranimo še nevezana označena Ab. Na koncu dodamo substrat, ki ob prisotnosti encima spremeni barvo, katere intenzivnost merimo. 1. vezano Ab na plošči 2. preiskovani Ag vezan na Ab 3. detekcijsko Ab vezano na kompleks Ag Ab 4. Ab označeno z encimom vezano na detekcijsko Ab 5. sprememba barve zaradi prisotnosti encima Slika 6: Indirektna Sendvič ELISA Kompetitivna ELISA Kompetitivna ELISA se uporablja za določanje Ag. Prosti Ag in Ab se inkubirajo, da nastane kompleks Ag Ab. Ta kompleks vežemo na Ag, ki je vezan na nosilno ploščo. S spiranjem odstranimo vse snovi, ki niso reagirale. Dodamo sekundarna Ab, ki so označena z encimom. Na koncu pa spet dodamo substrat, da pride do barvne spremembe. Koncentracija Ag in intenzivnost barve sta obratno sorazmerna. 5-20 -
7.2 KROMATOGRAFSKE METODE Kromatografske metode opisujejo skupino laboratorijskih tehnik, kjer gre za separacijo zmesi. V postopku kromatografije je možno spremljati, kako preiskovana zmes potuje skozi mobilno in stacionarno fazo, pri tem pa se deli zmesi ločujejo in izolirajo, kar omogoča, da jih lahko analiziramo in kvantitativno določamo. Kromatografija se lahko uporablja v analitične metode za določanje prisotnosti in koncentracije analita v vzorcu, lahko pa se uporablja tudi za ločevanje substanc iz zmesi. Te metode omogočajo ločevanje in kvantitativno določanje substanc, ki imajo zelo podobne lastnosti. Ločevanje poteka tako, da se substance razdelijo v dve fazi, v stacionarno in mobilno. 7.2.1 RAZDELITEV KROMATOGRAFSKIH METOD Kromatografske metode se lahko razdelijo glede na različne kriterije: glede na fizično stanje, obliko sistema in mehanizem ločevanja. Kromatografske metode glede na fizično stanje: - tekočinska kromatografija: tekoča-tekoča LLC (porazdelitev) tekoča-trdna LSC, PC, (adsorpcija) tekoča-trdna IEC (ionska izmenjava) tekoča-trda EC (izločitev) - plinska kromatografija: plin-tekoča GLC (porazdelitev) plin- trdna GSC (adsorpcija) Kromatografske metode glede na mehanizem ločevanja: - ionsko izmenjevalna - ločevanje glede na velikost substanc - 21 -
7.2.2 HPLC HPLC metoda je oblika tekočinske kolonske kromatografije, ki se uporablja za ločevanje substance iz zmesi na osnovi kemijskih interakcij med substancami, ki jih analiziramo in stacionarno fazo v koloni. Pri tej metodi pod visokim pritiskom substance potujejo skozi kolono. V mobilno fazo se vnese majhna količina vzorca in na osnovi specifičnih kemijskih in fizičnih interakcij prihaja do različnega zadrževanja substance v koloni. Čas zadrževanja je odvisen od lastnosti substance, ki se analizairajo, od stacionarne faze in sestave mobilne faze. Čas v katerem se eluira substance se imenuje retencijski čas, ta pa je karakterističen za vsako substance. 7.2.3 KOMPONENTE HPLC SISTEMA: rezervoar z mobilno fazo, črpalka, injektor, kolona detektor rekorder Značilna topila mobilne faze: ADSORPCIJA/PORAZDELITEV: heksan, metilenklorid, kloroform, metanol, acetonitril REVERZNA FAZA: metanol/voda, acetonitril/voda, reagenti z ionskimi pari IONSKA IZMENJAVA: vodne puferske raztopine IZLOČITVENA KROMATOGRAFIJA: tetrahidrofuran, kloroform - 22 -
Zahteve HPLC črpalk: 1. Črpanje konstantnega volumna (tekočine) mora biti neodvisno od "povratnega pritiska" (upora) kolone. 2. Pretok mobilne faze (tekočine) mora biti brez "pulziranja" (nihanja), kar zmanjšuje šum detektorja 3. Na izhodu naj bi bil dosežene visok tlak(do 600 barov). 4. Dobro je, če lahko črpamo neomejeno množino topila (mobilne faze) z možnostjo recikliranja, izokratskega in gradientnega izpiranja. 5. Zaželeno je široko območje pretokov mobilne faze (do 10 ml/min) za različne HPLC tehnike. HPLC kolone Kolona je napolnjena z delci polnila (običajno velikost <10 µm), ki so prekriti s stacionarno fazo. Z izbiro ustreznih faz in ostalih pogojev je dosežena separacija večkomponentne mešanice v nekaj minutah. 7.2.4 VRSTE DETEKORJEV: Detektorji imajo pomembno vlogo pri določanju analitov. Detektor zazna spremembo, ki jo pretvori v električni signal, ki je propocionalen intenziteti neke lastnosti mobilne faze ali substance, ki jo določamo. Detektorji morajo imeti visoko občutljivost, visoko dinamično območje in linearnost v širokem območju. - 23 -
Vrste detektorjev: spektrofotometrični fluorescenčni elektrokemijski refraktometrični masni spektrometer - 24 -
III. NAMEN DELA Namen dela te diplomske naloge je bil primerjati encimskoimunsko metodo za določanje vitamina D z radioimunsko metodo, ki se trenutno uporablja za določanje vitamina D v Hormonskem laboratoriju v sklopu KC Ljubljana. Pri primerjavi smo uporabili iste vzorce, nekatere smo tudi redčili, želeli pa smo preveriti ali bo encimskoimunska metoda boljša in ali bomo z njo lahko nadomestili radioimunsko metodo. Razlog za vpeljevanje nove metode je predvsem narava radioimunskih metod, saj se pri njih uporabljajo radioaktivne snovi, ki pa so škodljive zdravju. Za lažje ovrednotenje smo rezultate statistično obdelali in dobljene rezultate med seboj primerjali. - 25 -
METODE IN MATERIALI 1. VZORCI Za analizo smo izbrali 14 vzorcev preiskovanih oseb različnega spola in starosti, v katerih smo določali vitamin D z dvema metodama in sicer; z ELISA in z RIA metodo. Vsi vzorci so bili pravilno prineseni v laboratorij, ker smo jih takoj vnesli v računalnik in zabeležili potrebne preiskave. Preverili smo tudi, če so vzorci pravilno odvzeti, če je zadostna količina vzorca in ali so hemolizirani ali lipemični, ter vse zabeležili. Vzorce smo do analize zmrznili na 4 C. Vse vzorce in reagente smo pred analizo za nekaj časa pustili na sobni temperaturi, da so se odtalili, nato pa smo jih rahlo premešali z vortexom, da so bili homogeni. Reagenti, standardi, kontrole in ves ostali material iz kompleta pa je že bil pripravljen za uporabo, tako, da ga ni bilo potrebno posebej pripravljati. Spiralni pufer smo razredčili z destilirano vodo v razmerju 1:10 ( 100 ml koncentrata in 900 ml destilirane vode ). Vzorce smo na kolono nanesli tako da smo najprej dodali toliko vzorca kolikor ga je bilo nato pa še TRIS HCl pufer, da smo dosegli količino 500 µl. Za analizo smo prvotno izbrali 40 vzorcev, vendar ker ni bilo vseh vzorcev dovolj za obe metodi, smo jih za primerjavo metod izbrali le 14. Standarde in vzorce smo analizirali v dvojnikih. Pri RIA metodi smo standarde od 1 do 5, ki so bili liofilizirani rekonstituirali tako, da smo dodali vsakemu standardu 3 ml osnovne standardne raztopine. Ostali reagenti so že bili pripravljeni za uporabo. Pred pričetkom analize smo tudi pripravili organska topila za ekstrakcijo. Razmerje topila Vrsta topila Volumen ( 1 l ) 70 : 30 metanol deionizirana voda 700 ml 300 ml 90 : 10 heksan metilen klorid 900 ml 100 ml 99 : 1 heksan izopropanol 990 ml 10 ml 92 : 2 heksan izopropanol 920 ml 80 ml - 26 -
2. METODI ZA DOLOČANJE VITAMINA D Vitamin D smo določali z ELISA metodo in RIA metodo, kateri smo tudi primerjali med seboj. 2.1 ELISA METODA NAMEN UPORABE To imunodiagnostično metodo uporabljamo za kvantitativno in vitro določanje 1,25(OH) 2 D v plazmi ali serumu. PRINCIP TESTA Pri tej metodi se mora biološko aktiven metabolit vitamina D 1,25 (OH)2 D ločiti z dvema ločenima kolonama ( ekstrakcija ). Ekstrakcijo oziroma ločitev se mora narediti predvsem zato, da se loči 1,25 (OH)2 D od ostalih metabolitov vitamina D, predvsem od 25 dihidroksivitamina D in 24,25 dihidroksivitamina D. Ta metoda je kompetitivna encimsko imunokemijska metoda, zato temelji na tekmovanju med 1,25 (OH)2 D v vzorcu z 1,25 (OH)2 D označenim z encimom peroksidaza za prosto vezavno mesto na specifičnem protitelesu za vitamin D. Po ekstrakciji je treba narediti predinkubacijo in vzorce inkubirati. Po tej stopnji se vzorci nanesejo na mikrotitrsko ploščo, kjer 1,25 (OH)2 D prisoten v vzorcu tekmuje z označenim 1,25 (OH)2 D za prosto vezavno mesto na specifičnem protitelesu. Z naraščanjem koncentracije 1,25 (OH)2 D v vzorcu upada količina označenega 1,25 (OH)2 D. Po spiranju se odstranijo nevezane komponente, dodati pa je treba encimski substrat. Reakcija se ustavili tako, da se doda reagent za to pripravljen reagent (žveplova kislina). Meri se ekstinkcija vzorcev pri valovni dolžini 450 nm. Intenziteta barve je obratno sorazmerna z koncentracijo 1,25 (OH)2 D v vzorcu. Krivulja absorbanc v odvisnosti od koncentracij se dobi z rezultati kalibratorjev. Koncentracija 1,25 (OH) 2 D se določili direktno iz krivulje. - 27 -
ANALITČNA OBČUTLJIVOST Občutljivost te metode je 10,4 pmol/l NATANČNOST Natančnost metode so pri firmi Immundiagnostik 1,25 (OH) 2 D izračunali tako, da so en vzorec določili v 21 replikah in dobili CV = 6,6 % ANALITIČNA SPECIFIČNOST Analitična specifičnost nam kaže sposobnost metode, da v kemijski zmesi podobnih analitov izmeri samo tisti analit, ki ga določamo. SUBSTANACA Navzkrižna reakcija v % 1,25 ( OH )2 Vit D3 100 % Vit D2 in D3 < 0,01 % 24,25 ( OH )2 Vit D3 < 0,1 % 25 OH Vit D2 < 0,1 % 25 OH VIT D3 < 0,01 % Alfakalcidol < 0,003 % OPOZORILA IN ROKOVANJE Standardni in kontrolni vzorci vsebujejo humane materiale, ki so bili testirani in negativni na HBsAG, anti HIV in anti HCV. Vendar, ker nobena metode ne nudi 100 % sigurnost, da vzorci ne vsebujejo infektivne snovi smo s temi vzorci ravnati kot z potencialnimi infekcijskimi vzorci. Reagent stop vsebuje žveplovo kislino, ki je močna kislina, zato smo z njim ravnali previdno. Reagente moramo porabiti do navedenega roka uporabnosti. - 28 -
Analizator Personal Lab ADALTIS Personal Lab je funkcionalen in intenziven analizator z dvema ploščama, kjer je možna polna avtomatizacija laboratorijskih testov v imunoencimskih tehnikah. Dokazana in utrjena izvedenska mnenja tega analizatorja omogočajo prilagodljive instrumente za uporabo širokega območja od diagnostičnih potreb iz avtoimunosti do rodnosti oz. nosečnosti, od bolezni ščitnic do nalezljivih bolezni ( HIV ), retrovirusov in tudi hepatitisa tipov A, B, C, D in E. Analizator se pa tudi prilagaja proizvajalčevim metodam in nudi učinkovito alternativo tradicionalnim ročnim metodam, kot to omogočajo dosedanji EIA analizatorji z zaprtim sistemom. Analizator Personal Lab omogoča dva osnovna modula: - instrument, ki vsebuje vse sestavne dele za obdelavo vzorcev in reagentov - vodstven sistem, ki vsebuje instrumente za kontroliranje s programsko opremo in podatkovno upravljanje dela Analizator je zgrajen tako, da ima pokrov, ki ga je možno odpreti in tako omogoča preprost dostop in enostavno upravljanje in obratovanje z kompatibilno strojno opremo Microsoft Windows 98. Slika 7: Analizator Personal Lab - 29 -
VAKUUMSKA POSODA VAC ELUT SPS 24 VARIAN INC Varian Vac Elut SPS 24 je vakuumska posoda, ki se uporablja za fazno ekstrakcijo in vzorčno filtriranje. Istočasno sprejme 24 kolon. Steklene stene omogočajo, da spremljamo vzorec tekom cele analize. Iz vseh kolon se zbirajo odpadne snovi, ki se izločijo skozi lijak v kontejnerje odpadnih snovi, kar preprečuje navzkrižno kontaminacijo vzorca in pa tudi zmanjša izpostavljenost nevarnim odpadkom. Tako se odpadne snovi odstranjujejo ne da bi bilo potrebno odstranili pokrov. Zbiralna stojala se lahko postavijo v notranjost pred pričetkom ekstrakcije. Slika 8: Vac Elut SPS 24-30 -
Tabela 2: Material prisoten v kompletu SESTAVINE KOLIČINA testna ploščica z vrsticami 96 ELISA spiralna tekočina 10x koncentrirana 1 x 100 ml TRIS HCL pufer 1 x 30 ml etanol ( pripravljen za uporabo ) 1 x 1,5 ml raztopina protiteles ( mišja anti 1,25 (OH)2 1 x 2,5 ml Vitamin D ) pripravljena za uporabo standardi in NSB, pripravljeni za uporabo 7 x 2,5 ml (0; 11; 27; 69.1; 172,8; 432 pmol/l) kontrola, pripravljena za uporabo 2 x 2,5 ml konjugat, pripravljen za uporabo 1 x 22 ml TMB substrat, pripravljen za uporabo 2 x 15 ml ELISA stop substrat, pripravljen za uporabo 1 x 7 ml Vsi reagenti morajo biti primerno shranjeni in sicer na temperaturi 2 8 C. Tudi po odprtju so reagenti stabilni na temperaturi 2 8 C do roka uporabe, ki je natisnjen na škatli kompleta. Uporabili smo še naslednji material: - kromabond kolone - silikatne kolone - destilirana oz. deionizirana voda - diizopropileter p.a. - izopropanol p.a. - heksan p.a. - metanol p.a. - deionizirana voda - 12 mm steklene epruvete - 31 -
- nastavljive pipete ( 20 1000 µl ) - avtomatsko pipeto - Vortex - Vac Elut SPS 24 - analizator Adaltis Personal Lab POSTOPEK: Ekstrakcija Na vakuumsko posodo VAC ELUT SPS 24 smo nastavili kromabond kolone, pod njimi pa prazne označene epruvete kamor so se na koncu zbirali eluati. - na kromabond kolone smo pipetirali 500 µl NSB, standarde in vzorce, kjer je bilo vzorca manj kot 500 µl smo dodali Tris-HCL pufer ( najprej smo nanesli pufer in nato še vzorec), pustili smo da se vse adsorbira ( približno 10 minut) - nastavili smo silikatne kolone in nanj kromabond kolone, tako da se je eluat iz naslednje stopnje lahko zbiral direktno na silikatne kolone - nato smo kolone spirali z diisopropiletrom in sicer 4 x po 1ml ( 3 minute za vsako spiranje ), s tem smo ekstrahirali vitamin D iz kolon, eluat pa se je zbiral direktno v silikatne kolone - zatem smo kolone spirali z pripravljeno raztopino izopropanol/heksan v razmerju 4/96 in sicer 5 x po 2 ml - nato smo spirali še z pripravljeno raztopino izopropanol/heksan v razmerju 6/94 3 x po 2 ml - nazadnje smo še 1,25 dihidroksivitamin D eluirali iz kolon z 2 x po 2 ml raztopine izopropanol/heksan v razmerju 25/75 - Po spiranju smo eluate uparili pod tokom dušika - 32 -
Pred inkubacija Po izhlapevanju smo vsem vzorcem dodali 20 µl etanola ter rahlo premešali, in 450 µl reagenta, ki vsebuje protitelesa ter prav tako rahlo premešali. Vse skupaj smo prekrili z parafilmom ter pustili, da se je inkubiralo 1 uro. ELISA ( avtomatizirani del analize ) - po inkubaciji smo pipetirali 200 µl preinkubiranih vzorcev na mikrotitrsko ploščo ( delali smo v dvojniku) - mikrotitrsko ploščo smo prekrili z parafilmom in inkubirali 18 ur na temperaturi 4ºC - po inkubaciji smo ploščo vstavili v analizator Personal Lab Adaltis, ki smo ga prej vključili, naredili samokontrolo, spirali in napolnili celico ter namestili spiralni pufer, konjugat, substrat ter stop reagent - ploščo se je nato spirala z spiralnim pufrom 5 x po 300 µl - dodali smo 200 µl konjugata v vsak vzorec ter inkubirali eno uro - nato se je spiralo s spiralnim pufrom 5 x 300 µl - dodali smo 200 µl substrat ter inkubirali na sobni temperaturi v temnem 20 minut - na koncu smo dodali še 50 µl stop reagenta in rahlo premešamo ter zmerimo absorbanco pri 450 nm Rezultate smo odčitali direktno iz krivulje. IZRAČUN REZULTATOV Rezultate odčitamo direktno iz standardne krivulje. - 33 -
ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI Orientacijske referenčne vrednosti 1,25 (OH) 2 D v serumu so naslednje: odrasli (20 50 let) otroci do 12 let nosečnice (8. 42. teden) starejši od 70 let 36,7 114,5 pmol/l približno 40 % večje približno 60 % večje približno 40 % večje Orientacijske referenčne vrednosti pa so tudi odvisne od letnega časa, in sicer pozimi so nekoliko manjše, poleti, ko smo pa več izpostavljeni sončnim žarkom pa so te vrednosti nekoliko višje. OMEJITVE POSTOPKA Vzorce v katerih je koncentracija 1,25 (OH) 2 D višja kot najvišji standard, je potrebno ponovno analizirati. KONTROLA KAKOVOSTI Za kontrolo kakovosti smo uporabili kontrolna vzorca, ki bi morala padati v interval podanih vrednosti za kontrolna vzorca. V primerih, če eden ali več kontrolnih vzorcev ne pada v podani interval, rezultati vzorcev mogoče niso veljavni. - 34 -
2.2 RIA METODA NAMEN UPORABE Ta kompetitivna radioimunska metoda se uporablja za kvantitativno in vitro določanje 1,25-(OH) 2 D v serumu ali plazmi. PRINCIP TESTA DiaSorin 1,25-(OH) 2 vitamin D test je sestavljen iz dvostopenjskega postopka. Test vključuje predhodno ekstrakcijo in pozneje še prečiščevanje metabolitov vitamina D iz seruma ali EDTA krvne plazme z uporabo C18OH kolon. Po ekstrakciji se za določanje uporablja RIA kompetitivno metodo. Pri RIA postopku se uporabljajo poliklonska protitelesa, ki so specifična za oba 1,25-dihidroksivitamin D 2 in 1,25-dihidroksivitamin D3. Vzorci, protitelesa in tracer se morajo inkubirati. Faza ločitve je dosežena po 20- minutah inkubacije z dodatkom precipitacijskega kompleksa sekundarnih protiteles. Po centrifugiranju in odlitju supernatanta ostanejo vezne frakcije v kroglicah, ter se preračunajo v gama števcu. Vrednosti so izračunane direktno iz standardno krivulje. Končne koncentracije 1,25-dihidroksivitamina D v serumu in EDTA krvni plazmi so podani v pg/ml, zato smo jih preračunali v pmol/l. ANALITIČNA OBČUTLJIVOST Analitična občutljivost te metode je 4,32 pmol/l. NATANČNOST Pri firmi DiaSorin so izvedli teste in določili, da je med meritvami CV = 7,7 %, med dnevi CV = 11,1 % in totalni CV = 12,3%. - 35 -
ANALITIČNA SPECIFIČNOST SUBSTANCA NAVZKRIŽNA REAKCIJA 1,25 Vit D3 100 % 1,25 Vit D2 109% 24,25- ( OH )2 Vit D3 < 0,08 % 25,26 ( OH )2 Vit D3 < 0,08 % 25 Vit D3 < 0,01 % 1470 WALAC WIZARD GAMA ŠTEVEC GMI INC Gama števci imajo to prednost, da se snovi ne dotikajo. Štetje epruvet poteka tako, da se gama žarki sipljejo na material, prestreza pa jih detektor. Povečan signal na detektorju pomeni navzočnost snovi, ki je radioaktivno označena. Gama števec 1470 Wallac Wizard prenese signal iz vzorcev na konvektor, tudi potencionalno mesto onesnaženja je odstranjeno. Visoka resolucija MCA tehnologije je narejena za geometrijsko štetje. Ta gama števec ima 1, 2, 5 ali deset cevi za nosilnost in lahko sprejme vse RIA stekleničke. Slika 9: Walac Wizard gama števec - 36 -