ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΑΘΗΤΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΑΝΑΜΙΚΤΗ ΓΙΑ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΠΕΨΗ ΔΕΣΟΞΥΡΙΒΟΖΟΝΟΥΚΛΕΪΚΟΥ ΟΞΕΟΣ (DNA)

ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΑΘΗΤΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΑΝΑΜΙΚΤΗ ΓΙΑ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΠΕΨΗ ΔΕΣΟΞΥΡΙΒΟΖΟΝΟΥΚΛΕΪΚΟΥ ΟΞΕΟΣ (DNA) Β. Παπαδόπουλος, Ι. Κεφαλά, Γ. Κόκκορης, Γ. Παπαδάκης, Α. Τσερέπη Τομέας Μικροηλεκτρονικής, ΙΠΥΦΔΝΜ, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος, Πατριάρχου Γρηγορίου & Νεαπόλεως, 153 10 Αγία Παρασκευή ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το αντικείμενο της εργασίας είναι ο σχεδιασμός μέσω υπολογιστικής μελέτης ενός παθητικού μικροαναμίκτη που θα χρησιμοποιηθεί στην ενζυμική πέψη δειγμάτων δεσοξυριβοζονουκλεϊκού οξέος (DNA). Ο μικροαναμίκτης αναμιγνύει το δείγμα DNA με κατάλληλο ένζυμο πριν την αντίδραση (πέψη). Το μαθηματικό πρότυπο που χρησιμοποιείται για το σχεδιασμό του μικροαναμίκτη αποτελείται από την εξίσωση συνέχειας, τις εξισώσεις Navier- Stokes, καθώς και την εξίσωση διατήρησης της μάζας του ενζύμου. Οι εξισώσεις λύνονται με εμπορικό κώδικα στις 3 διαστάσεις. Μελετάται η επίδραση της γεωμετρίας των καναλιών του μικροαναμίκτη και πιο συγκεκριμένα το σχήμα του καναλιού (π.χ. «ζιγκ-ζαγκ») και ο λόγος του πλάτους προς το ύψος του στην απόδοση της ανάμιξης. Επίσης, εξετάζεται η επίδραση του πλήθους και θέσης των εισόδων του καναλιού. Οι υπολογισμοί δείχνουν ότι σε ένα κανάλι με σχήμα «ζιγκ-ζαγκ» η ανάμιξη είναι αποτελεσματικότερη σε σχέση με το αντίστοιχο ευθύγραμμο κανάλι. Επίσης, η αύξηση του πλήθους των εισόδων καθώς και ο περιττός αριθμός εισόδων οδηγεί σε σημαντικά μικρότερα μήκη ανάμιξης. Οι υπολογισμοί προκρίνουν δύο σχέδια μικροαναμίκτη διαφορετικής τεχνολογικής πολυπλοκότητας. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η βασική ιδέα και το όραμα που οδηγεί τη ραγδαία ανάπτυξη των συστημάτων Lab-on-a- Chip (LoC) είναι η προσαρμογή και ολοκλήρωση όλων των λειτουργιών ενός εργαστηρίου (βιο)χημικών αναλύσεων μέσα σε μικροσυσκευές μικροσκοπικών διαστάσεων, πάνω σε υποστρώματα διαστάσεων μίας ψηφίδας (τσιπ). Απαραίτητα μέρη των συστημάτων LoC αποτελούν τα μικρορρευστονικά συστήματα (microfluidics) όπου λαμβάνουν χώρα μεταφορά, ανάμιξη, διαχωρισμός ή/και αντιδράσεις συστατικών, μέχρι και ανίχνευση μέσω κατάλληλων αισθητήρων/ανιχνευτών. Οι μικροαναμίκτες αποτελούν κρίσιμα συστατικά των μικρορρευστονικών συστημάτων, καθώς τα χαρακτηριστικά τους μπορούν να καθορίσουν τη συνολική απόδοση του συστήματος. Για παράδειγμα, ταχύτερη ανάμιξη οδηγεί σε μείωση του χρόνου ανάλυσης. Οι μικροαναμίκτες, λόγω της μικρής ταχύτητας ροής του υγρού στα μικρορρευστονικά κανάλια, λειτουργούν σε πολύ μικρούς αριθμούς Reynolds (Re < 1) και έτσι η ανάμιξη συμβαίνει λόγω διάχυσης ή/και χαοτικής μεταφοράς (chaotic advection) [1-5] η οποία επιτυγχάνεται με το χειρισμό της ροής στα μικροκανάλια (αλλαγή κατεύθυνσης της ροής). Από τη μία πλευρά, η ανάμιξη μέσω διάχυσης είναι αργή και επομένως το μήκος των μικροκαναλιών και κατά συνέπεια και ο χρόνος, που απαιτείται για την επίτευξη πλήρους ανάμιξης ροών, είναι πολύ μεγάλα. Από την άλλη, λόγω του πολύ μικρού αριθμού Re που χαρακτηρίζει τις ροές αυτές δεν είναι εύκολο να πραγματοποιηθεί ενίσχυση της διάχυσης μέσω χαοτικής μεταφοράς. Επομένως, ο σχεδιασμός μικροαναμίκτη εμφανίζει μεγάλο ενδιαφέρον. O σκοπός ενός μικροαναμίκτη είναι η γρήγορη ανάμιξη ροών με διαφορετική συγκέντρωση διαλυμένης ουσίας σε όσο το δυνατόν μικρότερο όγκο (ή μήκος) μικροκαναλιού. Οι κύριες

κατηγορίες μικροαναμικτών είναι δύο: Οι παθητικοί και οι ενεργητικοί. Παθητικοί χαρακτηρίζονται οι αναμίκτες οι οποίοι βασίζονται στην ενέργεια άντλησης των υπό ανάμιξη ρευστών, ενώ οι ενεργητικοί έχουν ως χαρακτηριστικό την επιπλέον διοχέτευση εξωτερικής ενέργειας με σκοπό την υποβοήθηση της ανάμιξης. Γενικά οι ενεργητικοί αναμίκτες είναι πιο αποδοτικοί από τους παθητικούς [6]. Παρόλα αυτά, οι ενεργητικοί αναμίκτες έχουν πιο πολύπλοκες διαδικασίες κατασκευής, ενώ η εξωτερική ενέργεια που απαιτούν για τη λειτουργία τους δυσκολεύει την ολοκλήρωσή τους με τις υπόλοιπες διατάξεις. Τα προηγούμενα καθώς και η υψηλή κατανάλωση ενέργειας καθιστά τη χρήση των παθητικών αναμικτών πιο επιθυμητή από αυτή των ενεργητικών. Υπάρχουν εργασίες στη βιβλιογραφία που αφορούν στην κατασκευή και προσομοίωση παθητικών μικροαναμικτών διαφορετικών τύπων. Έχουν προταθεί διατάξεις στις οποίες επιχειρείται η ενίσχυση της ανάμιξης με κατάλληλες γεωμετρίες στην είσοδο του καναλιού, όπως διατάξεις με γεωμετρία σχήματος Y ή T [7] καθώς και διατάξεις πολλαπλών εισόδων [8,9]. Άλλες διατάξεις στοχεύουν στη δημιουργία χαοτικής μεταφοράς δημιουργώντας μικροσκοπικές τρισδιάστατες γεωμετρίες στο εσωτερικό του καναλιού ανάμιξης όπως εμπόδια (posts) [4,10,11] και εσοχές κατάλληλης γεωμετρίας [12,13]. Για την υπολογιστική μελέτη της ανάμιξης χρησιμοποιείται η επίλυση της εξίσωσης συνέχειας, της Navier-Stokes και της εξίσωσης μεταφοράς και διάχυσης της διαλυμένης ουσίας (ισοζύγιο μάζας του συστατικού). Εναλλακτικά, αντί της επίλυσης της εξίσωσης μεταφοράς και διάχυσης, χρησιμοποιούνται μέθοδοι ιχνηλασίας σωματιδίων (Particle Tracing) [12] όπου με βάση το πεδίο ροής υπολογίζονται οι τροχιές των σωματιδίων. Στην παρούσα εργασία για την υπολογιστική μελέτη της ανάμιξης χρησιμοποιείται η πρώτη προσσέγγιση με την επίλυση της εξίσωσης μεταφοράς και διάχυσης. Μελετάται συστηματικά η επίδραση στην ανάμιξη του πλήθους και των θέσεων των εισόδων στο κανάλι του μικροαναμίκτη. Επίσης, εξετάζεται η επίδραση παραπάνω από μία μεταβλητών, όπως ο λόγος πλάτους προς ύψος της ορθογωνικής διατομής του καναλιού, το σχήμα του καναλιού και η ύπαρξη εμπόδιων στη ροή. Τα αποτελέσματα της υπολογιστικής μελέτης χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό και υλοποίηση παθητικού μικροαναμίκτη που θα χρησιμοποιηθεί στην ενζυμική πέψη δειγμάτων δεσοξυριβοζονουκλεϊκού οξέος (DNA). Ο μικροαναμίκτης αναμιγνύει το DNA με κατάλληλο ένζυμο πριν την αντίδραση (πέψη). Τα συμπεράσματα της μελέτης μπορούν να εφαρμοστούν σε οποιοδήποτε σύστημα ανάμιξης υγρών όπου η διαλυμένη ουσία έχει πολύ χαμηλό συντελεστή διάχυσης, όπως τα βιομόρια στην εν λόγω μελέτη. Στο υπόλοιπο της παρούσας εργασίας περιγράφεται το μαθηματικό πρότυπο, οι προδιαγραφές του παθητικού μικροαναμίκτη και η διαδικασία επίλυσης του προτύπου. Ακολουθεί η παρουσίαση των αποτελεσμάτων και η περιγραφή του προτεινόμενου μικροαναμίκτη. Η εργασία ολοκληρώνεται με τα συμπεράσματα. ΤΟ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΤΥΠΟ Tο πρόβλημα της ανάμιξης αντιμετωπίζεται με δύο μαθηματικά πρότυπα διαφορετικής λεπτομέρειας. Και τα δύο πρότυπα αφορούν στην ανάμιξη υγρών διαλυμάτων με ένα διαλυμένο συστατικό. Το πρώτο πρότυπο είναι μονοδιάστατο (1δ) και χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να εξαχθούν χρήσιμα συμπεράσματα για το φαινόμενο της καθαρής διάχυσης. Το πρότυπο περιγράφεται από το 2 ο νόμο διάχυσης του Fick 2 C C = D (1) 2 t x

όπου C και D είναι η συγκέντρωση και ο συντελεστής διάχυσης του συστατικού και x [0, L]. Οι συνοριακές συνθήκες είναι C = 0 (2) x x = 0, L και η αρχική συνθήκη είναι συνάρτηση πολλαπλών βημάτων [Σχήμα 1(α)] ή συνάρτηση πολλαπλών παλμών [Σχήμα 1(β)] που εκφράζουν το προφίλ της συγκέντρωσης για t=0. Ο λόγος για τον οποίο επιλέγονται αυτές οι συναρτήσεις ως εναλλακτικές αρχικές συνθήκες είναι η ανάγκη για τη μελέτη της επίδρασης πολλαπλών εισόδων σε ένα κανάλι στην ανάμιξη. Οι συναρτήσεις παραπέμπουν στο προφίλ συγκέντρωσης σε κανάλι πολλαπλών, αντίστοιχης μορφής, εισόδων. Η συγκέντρωση στις εισόδους είναι α ή β. Σχήμα 1: Αρχική συνθήκη συγκέντρωσης στο 1δ πρότυπο: α) Βηματικό και β) παλμικό προφίλ. Με τη μέθοδο των χωριζομένων μεταβλητών η τελική μορφή της συγκέντρωσης συναρτήσει του χρόνου και της θέσης είναι 2 2 n π nπ x D t 2 L C( xt, ) = Cn cos e. (3) n= 0 L Αν k είναι το διπλάσιο του πλήθους των βημάτων (z), οι συντελεστές C n για την περίπτωση του «βηματικού προφίλ» είναι k 1 k 2 m+ 1 mnπ l lnπ Cn = α ( 1) sin β ( 1) sin nπ m= 0 k + l= 0 k (4) Αν k είναι το τετραπλάσιο του πλήθους των βημάτων (z), οι συντελεστές C n για την περίπτωση «παλμικού προφίλ» είναι k 4 k 2 2 2 2 m nπ l+ 1 nπ Cn = α ( 1) sin ( 2m 1 ) β ( 1) sin ( 2l 1 ) nπ + + + m= 0 k l= 0 k (5) Από τις εξισώσεις (3) και (4) ή (5) υπολογίζεται η συγκέντρωση C(x,t). Ως χρόνος ανάμιξης ορίζεται το χρονικό διάστημα που χρειάζεται ώστε ο λόγος της τυπικής απόκλισης της συγκέντρωσης προς τη συγκέντρωση στη μόνιμη κατάσταση [(α+β)/2 στην περίπτωση αυτή] γίνει μικρότερος από 0.01 (1%). Τότε θεωρείται ότι προσεγγίζεται η πλήρης ανάμιξη. Το δεύτερο πρότυπο είναι λεπτομερέστερο του πρώτου: Περιλαμβάνει την περιγραφή της ροής μέσα σε κανάλι και είναι τρισδιάστατο (3δ). Αφορά σε ασυμπίεστη και στρωτή (o Re σε μικρορρευστονικές διατάξεις είναι μικρότερος του 1) ροή νευτωνικού ρευστού με σταθερό ιξώδες και λύνεται σε μόνιμη κατάσταση. Η πρώτη εξίσωση του προτύπου είναι η εξίσωση συνέχειας

u =0 (6) όπου u είναι το διάνυσμα της ταχύτητας του υγρού στο κανάλι. Η δεύτερη εξίσωση του προτύπου είναι η εξίσωση Navier-Stokes 2 ρ u u= p + µ u (7) όπου ρ και μ είναι η πυκνότητα και το δυναμικό ιξώδες του υγρού, και p είναι η πίεσή του. Η τρίτη εξίσωση του προτύπου είναι η εξίσωση διατήρησης της μάζας του διαλυμένου συστατικού D C + u C = (8) ( ) 0 Όσον αφορά τις συνοριακές συνθήκες, σε κάθε είσοδο καναλιού εφαρμόζεται προφίλ ταχυτήτας που αντιστοιχεί σε πλήρως ανεπτυγμένη ροή και σταθερή τιμή συγκέντρωσης (0 αν η εισερχόμενη ροή περιέχει μόνο διαλύτη και C 0 αν η εισερχόμενη ροή περιέχει το διαλυμένο συστατικό). Στην εκροή του καναλιού του μικροαναμίκτη οι κλίσεις των μεταβλητών (ταχύτητας και συγκέντρωσης) σε διεύθυνση κάθετη στην εκροή θεωρούνται μηδενικές. Το τελευταίο ισχύει και στα τοιχώματα καναλιού για τη συγκέντρωση. Τέλος, στα τοιχώματα καναλιού εφαρμόζεται η συνθήκη μη ολίσθησης. Για το 3δ πρόβλημα ανάμιξης σε ένα κανάλι, μήκος ανάμιξης ορίζεται ως το μήκος κατά τον άξονα του καναλιού που χρειάζεται ώστε ο λόγος της τυπικής απόκλισης της συγκέντρωσης σε μία κάθετη στον άξονα διατομή προς την τιμή της συγκέντρωσης στην πλήρη ανάμιξη να είναι μικρότερη από 0.01 (1%). ΠΡΟΔΙΑΓΡΑΦΕΣ Το αποτέλεσμα του σχεδιασμού του μικροαναμίκτη, δηλ. ο προτεινόμενος μικροαναμίκτης, θα κατασκευαστεί στο εργαστήριο του Τομέα Μικροηλεκτρονικής του ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος. Θα χρησιμοποιηθούν πολυμερικά υποστρώματα. Οι προδιαγραφές του μικροαναμίκτη υπαγορεύονται από την τεχνολογία κατασκευής. Στην πράξη, ο μικροαναμίκτης θα είναι ένα κανάλι με πολλές εισόδους και μία έξοδο. Λόγω της τεχνολογίας που θα χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή του, το κανάλι του μικροαναμίκτη θα είναι σε ένα επίπεδο και η διατομή του καναλιού θα είναι ορθογωνική. Το υγρό που ρέει στο κανάλι, το οποίο είναι ο διαλύτης, είναι νερό. Η διαλυμένη ουσία είναι ένζυμο με συντελεστή διάχυσης στο εύρος 10-9 έως 10-11 m 2 /s. Η συγκέντρωση του ενζύμου είναι 10-6 mol/ml. Η μέση ταχύτητα του υγρού στο κανάλι είναι 5-6 mm/s (ώστε να είναι συμβατή με τυπική διάταξη ενίσχυσης DNA με βάση την PCR [14]). Όλες οι μελέτες που περιγράφονται στις επόμενες παραγράφους έχουν σαν στόχο την εξέταση διαφορετικών παραμέτρων στο μήκος ή στο χρόνο ανάμιξης, στην αποτελεσματικότητα της ανάμιξης. Πιο συγκεκριμένα, γίνεται συστηματική μελέτη για την επίδραση που έχουν στο μήκος ανάμιξης το πλήθος και οι θέσεις των εισόδων, ο λόγος ασυμμετρίας (ύψος προς πλάτος) του καναλιού, το σχήμα του καναλιού καθώς και ο συνδυασμός των παραπάνω παραμέτρων ώστε να σχεδιαστεί ο μικροαναμίκτης. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΕΠΙΛΥΣΗΣ Για το πρώτο (1δ) μαθηματικό πρότυπο, αναπτύχθηκε κώδικας σε Java ο οποίος παράγει τα προφίλ συγκέντρωσης συναρτήσει του χρόνου [εξισώσεις (3) (5)] και υπολογίζει το χρόνο ανάμιξης. Για την επίλυση του λεπτομερούς (3δ) μαθηματικού προτύπου χρησιμοποιήθηκε εμπορικός κώδικας (Comsol 4.3a [15]). Το πρώτο στάδιο στη διαδικασία επίλυσης είναι η δημιουργία γεωμετρίας και πλέγματος. Η γεωμετρία των μικροκαναλιών, λόγω τεχνολογικών περιορισμών θα είναι ορθογωνικής διατομής. Στους υπολογισμούς που ακολουθούν το ύψος του καναλιού είναι μερικές δεκάδες μm και το πλάτος τους μέχρι 200 μm. Το μήκος του

καναλιού σχεδιάζεται έτσι ώστε να είναι αρκούντως μεγάλο για την επίτευξη πλήρους ανάμιξης. Για την διακριτοποίηση των εξισώσεων χρησιμοποιήθηκε δομημένο πλέγμα με εξάπλευρα στοιχεία. Επιπλέον πύκνωση του πλέγματος έγινε σε σημεία όπου οι βαθμίδες των μεταβλητών (συγκέντρωση και ταχύτητα) ήταν υψηλές. Σε όλους τους υπολογισμούς η επίλυση έγινε για πλέγματα διαφορετικής και αυξανόμενης πυκνότητας. Μετά την εύρεση κατάλληλης πύκνωσης στο πλέγμα, πέραν της οποίας η περαιτέρω πύκνωση δεν επιφέρει αλλαγή στη λύση, θεωρήθηκε ότι η λύση είναι ανεξάρτητη του πλέγματος. Η απαιτούμενη πυκνότητα πλέγματος, ειδικά σε πολύ μικρούς συντελεστές διάχυσης, ήταν πολύ υψηλή, με αποτέλεσμα η επίλυση σε όλο το μήκος του καναλιού να μην είναι δυνατή (σε υπολογιστή με 8 GB RAM) λόγω υψηλών απαιτήσεων σε μνήμη. Το πρόβλημα αυτό αντιμετωπίστηκε με την υποδιαίρεση της ολικής γεωμετρίας του καναλιού σε μικρότερα τμήματα: Τα αποτελέσματα στην έξοδο του προηγούμενου τμήματος (ταχύτητα και συγκέντρωση) τροφοδοτούνταν στην είσοδο του επόμενου. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Επίδραση του πλήθους και της θέσης των εισόδων του καναλιού στο μήκος ανάμιξης Η πρώτη υπό μελέτη περίπτωση περιλαμβάνει την επίδραση που έχει η παρουσία πολλαπλών εισόδων των δύο υγρών διαφορετικής συγκέντρωσης στο κανάλι ανάμιξης. Ο άξονας του καναλιού σε κάθε περίπτωση είναι ευθύγραμμος. Το πλήθος και η θέση των εισόδων καθώς επίσης και τα προφίλ συγκέντρωσης στην αρχή του καναλιού που δοκιμάστηκαν φαίνονται στο Σχήμα 2. Τα διαφορετικά προφίλ συγκέντρωσης στην είσοδο μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε δύο περιπτώσεις: Παλμούς και βήματα. Σχήμα 2: Είδη εισόδων στον μικροαναμίκτη Στα Σχήματα 3(α) - 3(στ) φαίνεται η συγκέντρωση σε διατομές του καναλιού από την είσοδο μέχρι και το 75% του μήκους ανάμιξης για την περίπτωση των δύο παλμών. Παρατηρείται ότι η διάχυση σε μικρά ποσοστά του μήκους ανάμιξης είναι πιο έντονη. Επίσης είναι εμφανές ότι οι δύο κορυφές των παλμών πλησιάζουν η μία την άλλη κατά την πορεία της ροής. Τα μήκη ανάμιξης για κάθε περίπτωση παρουσιάζονται στο Σχήμα 3(ζ). Τα αποτελέσματα δείχνουν σημαντική μείωση του μήκους στις περιπτώσεις των παλμών. Επίσης, για το ίδιο προφίλ συγκέντρωσης στην είσοδο (παλμοί ή βήματα) το μήκος ανάμιξης μειώνεται όσο αυξάνουν οι είσοδοι. Το τελευταίο οφείλεται στην αύξηση της διεπιφάνειας μεταξύ των υγρών διαφορετικής συγκέντρωσης.

(α) είσοδος καναλιού (β) 10% του μήκους ανάμιξης (γ) 20% του μήκους ανάμιξης (δ) 30% του μήκους ανάμιξης (ε) 50% του μήκους ανάμιξης (στ) 75% του μήκους ανάμιξης (ζ) Σχήμα 3. α) στ) Προφίλ συγκέντρωσης σε διατομές κάθετες στον άξονα του καναλιού σε διαφορετικές αποστάσεις από την είσοδο για την περίπτωση εισόδου μορφής 2 παλμών. ζ) Μήκος ανάμιξης συναρτήσει του πλήθους εισόδων στο κανάλι όπως προκύπτουν από το 3δ πρότυπο. Διατηρούνται σταθερά η γεωμετρία του καναλιού (με ευθύγραμμο άξονα και ορθογωνική διατομή 25 μm 12.5 μm), η συγκέντρωση των δύο υπό ανάμιξη υγρών (0 και 10-6 mol/ml), η μέση ταχύτητα εισόδου των υγρών (5.6 mm/s) καθώς και ο συντελεστής διάχυσης (2.3 10-9 m 2 /s). Η σημαντική βελτίωση της ανάμιξης στις περιπτώσεις της παλμικής εισόδου οδήγησε στη μελέτη του φαινομένου στη μία διάσταση προκειμένου να κατανοηθεί θεμελιωδώς το φαινόμενο της διάχυσης χωρίς την επίδραση της ροής. Έτσι, χρησιμοποιώντας το πρώτο (1δ) πρότυπο, υπολογίστηκε ο χρόνος ανάμιξης για τις περιπτώσεις όπου η αρχική συνθήκη είναι σε μορφή βημάτων [Σχήμα 1(α)] και παλμών [Σχήμα 1(β)] με βάση τις εξισώσεις (3)-(5). Στο Σχήμα 4(α) φαίνεται η επίδραση του πλήθους των βημάτων και παλμών στο χρόνο ανάμιξης. Η αύξηση του πλήθους τόσο των βημάτων όσο και των παλμών οδηγεί στη μείωση του χρόνου ανάμιξης. Επίσης, με την παλμική είσοδο μειώνεται σημαντικά ο χρόνος ανάμιξης σε σχέση με την αντίστοιχη βηματική. Στο Σχήμα 4(β) παρουσιάζεται η επίδραση της θέσης του παλμού στο χρόνο ανάμιξης. Ο μικρότερος δυνατός χρόνος ανάμιξης επιτυγχάνεται με το συμμετρικό προφίλ δηλαδή με την αρχική συνθήκη μορφής παλμού. Όσο αυξάνεται η ασυμμετρία και η αρχική συνθήκη πλησιάζει τη μορφή βήματος αυξάνεται ο απαιτούμενος χρόνος ανάμιξης. Το συμπέρασμα από το 3δ πρότυπο είναι συμβατό με αυτό που προκύπτει από το 1δ πρότυπο. Η θέση των εισόδων είναι πολύ σημαντική για το χρόνο ή το μήκος ανάμιξης. Τα προφίλ συγκέντρωσης με μορφή παλμού μειώνουν το μήκος ανάμιξης και άρα το μήκος του καναλιού του αναμίκτη.

(α) (β) Σχήμα 4: α) Χρόνος ανάμιξης (κανονικοποιημένος) συναρτήσει του πλήθος των παλμών και των βημάτων όπως προκύπτει από το 1δ πρότυπο. β) Χρόνος ανάμιξης (κανονικοποιημένος) συναρτήσει του ποσοστού μετατόπισης 1 παλμού. Στο μηδέν ο παλμός είναι στο κέντρο της εισόδου του καναλιού και στο 50% μετατοπίζεται εξ ολοκλήρου στο δεξιό τμήμα του, μετατρέπεται σε βήμα. Σε όλους τους παραπάνω υπολογισμούς με το 3δ πρότυπο οι είσοδοι στο κανάλι είναι παράλληλες μεταξύ τους (Σχήμα 2). Έγιναν υπολογισμοί και για την περίπτωση όπου δύο είσοδοι καταλήγουν στο κανάλι σε σχήμα Υ. Πραγματοποιήθηκε μελέτη επίδρασης της γωνίας των εισόδων του Υ. Υπολογίστηκε το μήκος ανάμιξης για γωνίες 15 0 έως 90 0 (σχήμα Τ) με βήμα 15 0. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική βελτίωση του μήκους ανάμιξης λόγω του πολύ μικρού αριθμού Re που χαρακτηρίζει τις ροές αυτές. Επίδραση του λόγου ασυμμετρίας της διατομής του καναλιού στο μήκος ανάμιξης Σημαντικός παράγοντας στο μήκος ανάμιξης αποτελεί ο λόγος του πλάτους προς το ύψος της ορθογωνικής διατομής του καναλιού ή ο λόγος ασυμμετρίας της διατομής του καναλιού: Η μεταβολή του λόγου ασυμμετρίας μεταβάλλει τη διεπιφάνεια των υπό ανάμιξη υγρών. Πραγματοποιήθηκε σειρά προσομοιώσεων σε κανάλια με ευθύγραμμο άξονα για διαφορετικό λόγο ασυμμετρίας. Σε κάθε περίπτωση το εμβαδό της διατομής του καναλιού είναι το ίδιο. Τα αποτελέσματα των προσομοιώσεων παρουσιάζονται στο Σχήμα 5: Το μήκος ανάμιξης αυξάνεται με το λόγο ασυμμετρίας. Η μείωση του λόγου ασυμμετρίας αυξάνει τη διεπιφάνεια μεταξύ των υγρών και ενισχύει την ανάμιξη. Επιπρόσθετα, αυτή η εξάρτιση είναι περίπου γραμμική. Σχήμα 5. Μήκος ανάμιξης συναρτήσει του λόγου πλάτους προς ύψος (λόγος ασυμμετρίας) της ορθογωνικής διατομής του καναλιού. Η συγκέντρωση των δύο υπό ανάμιξη υγρών είναι 0 και 10-6 mol/ml, η μέση ταχύτητα εισόδου των υγρών είναι 5.6 mm/s και ο συντελεστής διάχυσης είναι 2.3 10-9 m 2 /s. Το προφίλ συγκέντρωσης στην είσοδο είναι αυτό που αντιστοιχεί σε ένα βήμα (Σχήμα 2). Το εμβαδό της διατομής του καναλιού είναι 312.5 μm 2.

Επίδραση του σχήματος του καναλιού και των εμποδίων της ροής στο μήκος ανάμιξης Έγιναν υπολογισμοί σε κανάλια με σχήμα ζιγκ-ζαγκ και σε κανάλια που περιείχαν εμπόδια διαφορετικού σχήματος (κύκλοι, τετράγωνα και ρόμβοι) που προκαλούν αυξομειώσεις στη διατομή του καναλιού. Οι κατόψεις των καναλιών καθώς και η συγκέντρωση σε μία διατομή στο μέσο ύψος του καναλιών φαίνονται στο Σχήμα 6(α). Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα πειραματικά δεδομένα των Jeon και Shin [4]. Στο Σχήμα 6(β) φαίνεται η τυπική απόκλιση της συγκέντρωσης σε κάθετες στον άξονα διατομές των καναλιών σε διαφορετικές αποστάσεις από την είσοδο. Δεν παρουσιάζεται το μήκος ανάμιξης διότι σε κανένα από τα κανάλια δεν προσεγγίζεται η πλήρης ανάμιξη. Τα αποτελέσματα του Σχήματος 7 δείχνουν πως η βέλτιστη γεωμετρία από αυτές που εξετάστηκαν είναι αυτή του ζιγκ-ζαγκ. (β) (α) Σχήμα 6: α) Προφίλ συγκέντρωσης (κανονικοποιημένο) στο μέσο ύψος καναλιών με διαφορετικά σχήματα και διαφορετικά εμπόδια. β) Τυπική απόκλιση της συγκέντρωσης για τις γεωμετρίες του Σχήματος 6(α) σε διατομές του καναλιού σε αυξανόμενη απόσταση από την είσοδο. Η μέση ταχύτητα εισόδου των υγρών είναι 3 mm/s και ο συντελεστής διάχυσης είναι 1.7 10-8 m 2 /s. Το ύψος των καναλιών είναι 125 μm και το πλάτος στο ευθύγραμμο κανάλι είναι 2.16 mm [4]. Με βάση το παραπάνω ευνοϊκό συμπέρασμα για το σχήμα του ζιγκ-ζαγκ, εξετάστηκε αν υπάρχει επίδραση της γωνίας του ζιγκ-ζαγκ στο μήκος ανάμιξης. Υπολογίστηκαν οι τυπικές αποκλίσεις συγκέντρωσης σε μία κάθετη στον άξονα διατομή των καναλιών συναρτήσει της απόστασης από την είσοδο για γωνίες ζιγκ-ζαγκ ίσες με 90 ο και 60 ο. Οι γεωμετρίες που χρησιμοποιήθηκαν είναι αυτές του Σχήματος 7(α). Τα αποτελέσματα των προσομοιώσεων φαίνονται στο Σχήμα 7(β), όπου παρουσιάζεται η τυπική απόκλιση της συγκέντρωσης του ρευστού στους κανονικοποιημένους αντίστοιχους όγκους γεωμετρίας, για τα διάφορα είδη αναμικτών. Δεδομένων των ανωτέρω προσομοιώσεων και των αποτελεσμάτων τους

παρατηρήθηκε πως η γωνία του ζιγκ-ζαγκ δεν επηρεάζει σημαντικά την ανάμιξη. Με πολύ μικρή διαφορά, η βέλτιστη γεωμετρία είναι αυτή του ζιγκ-ζαγκ των 60 ο. (α) Σχήμα 7. α) Γεωμετρίες για τη μελέτη επίδρασης αποτυπώματος ζιγκ-ζαγκ διαφορετικών γωνιών. β) Τυπική απόκλιση της συγκέντρωσης για τις γεωμετρίες του Σχήματος 7(α) και σε κανάλι ευθύγραμμου άξονα σε διατομές του καναλιού σε αυξανόμενη απόσταση από την είσοδο. Η διατομή του καναλιού είναι 200 μm 60 μm, ο συντελεστής διάχυσης είναι 10-10 m 2 /s, η μέση ταχύτητα του εισερχόμενου ρευστού είναι ίση με 5 mm/s. Στην είσοδο επιβάλλεται βηματικό προφίλ συγκεντρώσεων (0 και 1 mol/m 3 ). Ο προτεινόμενος μικροαναμίκτης Αξιοποιώντας τις πληροφορίες από τους παραπάνω υπολογισμούς, ο προτεινόμενος μικροαναμίκτης για την ενζυμική πέψη του DNA θα πρέπει να έχει είσοδο με μορφή παλμών και γεωμετρία ζιγκ-ζαγκ με γωνία 60 ο. Κάποιες από τις πληροφορίες των υπολογισμών δεν αξιοποιήθηκαν λόγω τεχνολογικών περιορισμών, όπως για παράδειγμα η επιλογή υψηλού λόγου ασυμμετρίας της διατομής του καναλιού: Η ορθογωνική διατομή του καναλιού σχεδιάστηκε, λόγω τεχνολογικών περιορισμών, με πλάτος 200 μm και ύψος 60 μm. Οι μέχρι στιγμής υπολογισμοί προκρίνουν δύο προτάσεις για το μικροαναμίκτη. Η πρώτη συνιστά ένα απλούστερο τεχνολογικά σχέδιο με 3 εισόδους - 1 παλμική είσοδος (Σχήμα 2). Αν η μέση ταχύτητα εισόδου είναι 5 mm/s και ο συντελεστής διάχυσης του ενζύμου είναι 10-10 m 2 /s, το συνολικό μήκος του καναλιού του μικροαναμίκτη για να προσεγγιστεί πλήρης ανάμιξη υπολογίστηκε 15 cm. Το μήκος ανάμιξης είναι μικρότερο κατά 30% σε σχέση με το αντίστοιχο κανάλι με ευθύγραμμο άξονα και 35% σε σχέση με την περίπτωση καναλιού με σχήμα ζιγκ-ζαγκ και βηματικό προφίλ συγκέντρωσης στην είσοδο. Η δεύτερη πρόταση είναι τεχνολογικά πολυπλοκότερη όμως οδηγεί σε μικρότερο απαιτούμενο μήκος για το μικροαναμίκτη. Πρόκειται για ένα σχέδιο με 5 εισόδους - 2 παλμούς (Σχήμα 2) και κανάλι ευθύγραμμου άξονα. Σε αυτή την περίπτωση το απαιτούμενο μήκος θα είναι περίπου 8 cm. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στοχεύοντας στο σχεδιασμό ενός βελτιωμένου παθητικού μικροαναμίκτη για την ανάμιξη δείγματος DNA με ένζυμο που χρησιμοποιείται στην ενζυματική πέψη DNA, εξετάζεται η επίδραση διαφορετικών παραμέτρων διάταξης παθητικού μικροαναμίκτη στο μήκος ανάμιξης μέσω υπολογιστικής μελέτης με 3δ και 1δ μαθηματικά πρότυπα. Γίνεται συστηματική μελέτη του πλήθους και της θέσης των εισόδων στο κανάλι του μικροαναμίκτη: Η αύξηση του πλήθους των εισόδων μειώνει το μήκος και ως εκ τούτου το χρόνο ανάμιξης. Παρατηρείται εντυπωσιακή ελάττωση του μήκους ανάμιξης στην περίπτωση που οι είσοδοι εισέρχονται στο κανάλι του μικροναμίκτη υπό την μορφή παλμών (Σχήμα 2). Ο μειωμένος λόγος πλάτους προς ύψος της διατομής του καναλιού (Σχήμα 5) αποτελεί ενισχυτικό παράγοντα στην επίτευξη γρήγορης ανάμιξης, καθώς ένα κανάλι με ορθογωνική διατομή μεγαλύτερου ύψους σε σχέση με το πλάτος αυξάνει τη διεπιφάνεια των ρευστών (β)

διαφορετικής συγκέντρωσης. Εξετάστηκε ακόμη η επίδραση εμποδίων στη ροή και του σχήματος του καναλιού στην απόδοση του μικροαναμίκτη. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παρουσία περιοδικής αλλαγής της σχήματος (σχήμα ζιγκ-ζαγκ) του καναλιού είναι πολύ αποτελεσματική. Δύο προτάσεις με διαφορετική τεχνολογική πολυπλοκότητα έχουν προκρίνει οι μέχρι στιγμής υπολογισμοί. Η πρώτη πρόταση αφορά σε μικρο-αναμίκτη με σχήμα ζιγκ-ζαγκ, γωνίας 60 o, και προφίλ συγκέντρωσης 1 παλμού (3 είσοδοι, Σχήμα 2) στην είσοδο. Το μήκος του καναλιού που απαιτείται για να προσεγγίσουμε την πλήρη ανάμιξη είναι 15 cm. Η δεύτερη πρόταση αφορά σε μικροαναμίκτη με ευθύγραμμο άξονα και προφίλ συγκέντρωσης δύο παλμών (5 είσοδοι, Σχήμα 2). Σε αυτή την περίπτωση το απαιτούμενο μήκος είναι περίπου 8 cm. Το επόμενο βήμα είναι η υλοποίηση και πειραματική σύγκριση των προτάσεων και η εφαρμογή τους στην ενζυμική πέψη δειγμάτων DNA. Επίσης, η υπολογιστική μελέτη θα συνεχιστεί: Θα μελετηθεί η συνέργεια του σχήματος ζιγκ-ζαγκ καναλιού με 2 παλμούς στην είσοδο (συνολικά 5 είσοδοι). Τέλος, σχεδιάζεται να χρησιμοποιηθεί και η εναλλακτική προσέγγιση των μεθόδων ιχνηλασίας σωματιδίων για τη μελέτη της ανάμιξης. Ο στόχος είναι η μείωση των απαιτήσεων σε μνήμη και υπολογιστικό χρόνο. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εργασία υποστηρίχθηκε μερικώς από το έργο DoW- DNA on Waves: An integrated diagnostic system" (LS7-276) στα πλαίσια της δράσης «Ενίσχυση Μεταδιδακτόρων Ερευνητών» του ΕΣΠΑ 2007-2013. Η πηγή χρηματοδότησης είναι το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ) Ευρωπαϊκή Ένωση και Εθνικοί Πόροι. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Ottino J. M. and Wiggins S., Philos. Trans. R. Soc. Lond A 362: 923-935 (2004). [2] Nguyen N. T. and Wu. Zhigang, Journal of Micromechanics and Microengineering 15: R1 R16 (2005) [3] Fu L.-M. and Lin C.-H., Biomedical Microdevices 9:277-286 (2006). [4] Jeon W. and Shin C. B., Chemical Engineering Journal 152:575-582 (2009). [5] Stroock A. D., Dertinger S.K.W., Ajdari A., Mezic I., Stone H.A., Whitesides G.M., Science 295:647-651 (2002). [6] Park S.-J., Kim J. K., Park J., Chung S., Chung C. and Chang J. K., Journal of Micromechanics and Microengineering. 14:6-14 (2004). [7] Gobby D., Angeli P., Gavriilidis A., Journal of Micromechanics and Microengineering 11:126-132 (2001). [8] Hessel V., Hardt S., Löwe H., and Schönfeld F.. AIChE Journal 49:566-577 (2003). [9] Hardt S. and Schonfeld F., AIChE Journal 49:578-584 (2003). [10] Bhagat A.A.S., Peterson E.T.K., Papautsky I., Journal of Micromechanics and Microengineering. 17:1017-1024 (2007). [11] Wang C. T. and Hu Y. C., Tamkang Journal of Science and Engineering 13:385-394 (2010). [12] Kee S. P., Gavriilidis A., Chemical Engineering Journal 142:109 121 (2008) [13] Wang L., Liu D., Wang X., Han X., Chemical Engineering Science 81:157-163 (2012). [14] Vourdas N., Moschou D., Kokkoris G., Papadakis G., Chatzandroulis S., Tserepi A., Proceedings of 3 rd European Conference on Microfluidics, paper no 128 (2012) [15] www.comsol.com