ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΗΣ ΑΠΟΦΟΛΙ ΩΤΙΚΗΣ ΕΡΜΑΤΙΤΙ ΑΣ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum)

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΗΣ ΑΠΟΦΟΛΙ ΩΤΙΚΗΣ ΕΡΜΑΤΙΤΙ ΑΣ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum) ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ Ι. ΠΑΠΑ ΟΓΙΑΝΝΑΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2003

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΗΣ ΑΠΟΦΟΛΙ ΩΤΙΚΗΣ ΕΡΜΑΤΙΤΙ ΑΣ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum) ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ Ι. ΠΑΠΑ ΟΓΙΑΝΝΑΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΕΚΠΟΝΗΘΗΚΕ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΣΥΝΤΡΟΦΙΑΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Α. Κουτίνας Επιβλέπων Καθηγητής Σ. Λέκκας Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Ι. Βλέµµας Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Γ. Κοπτόπουλος Μέλος Καθηγητής Τ. Ράλλης Μέλος Καθηγητής Σ. Χαραλαµπίδης Μέλος Καθηγητής Α. Μηνάς Μέλος

Στην Ανθή, Λυδία και Ιωάννα Στους γονείς µου

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 1 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ: ΓΕΝΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ Α. ΓΕΝΙΚΑ 5 Β. ΕΡΜΑΤΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ 15 Γ. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΥΠΟΜΝΗΣΗ 21. Η ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΣΤΗ Leishmania sp. 29 Ε. Η ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΟΥ ΕΡΜΑΤΟΣ ΣΤΗ Leishmania sp. 37 ΜΕΡΟΣ ΕΥΤΕΡΟ: ΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 1. Ζώα-συγκρότηση οµάδων-ιστορικό 41 2. Γενική κλινική και δερµατολογική εξέταση 46 3. Εργαστηριακές εξετάσεις στο αίµα και το ούρο 49 4. Εργαστηριακές µέθοδοι για τη διάγνωση της λεισµανίωσης του σκύλου και τον αποκλεισµό συχνών στην πράξη λοιµωδών και παρασιτικών νοσηµάτων 53 5. Λήψη βιοψιών από το δέρµα 56 6. Ανοσοϊστοχηµικές τεχνικές για την ανίχνευση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήµατος και των αµαστιγωτών µορφών της L. infantum. 57 7. Μέθοδος καταµέτρησης των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήµατος και των αµαστιγωτών µορφών της L. infantum. 62 8. Στατιστική Ανάλυση 64 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 9. Ευρήµατα από την κλινική εξέταση του δέρµατος 65 10. Ευρήµατα από την ιστοπαθολογική εξέταση του δέρµατος 70 11. Συγκρίσεις µεταξύ των οµάδων Α, Β και Γ ως προς τα ιστοπαθολογικά ευρήµατα 73 12. Ευρήµατα από την ανοσοϊστοχηµική εξέταση του δέρµατος 74 13. Συσχετισµοί µεταξύ των διαφόρων κυτταρικών πληθυσµών 89 14. Παρουσία αµαστιγωτών µορφών της Leishmania infantum στο 90 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 91 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 109 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 111 SUMMARY 117 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ 123 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 141

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην Ελλάδα, η λεϊσµανίωση από τη Leishmania infantum είναι ένα από τα συχνότερα λοιµώδη νοσήµατα του σκύλου η κλινική εικόνα του οποίου παρουσιάζει συχνά δερµατικές αλλοιώσεις µε συνηθέστερη εκείνη της αποφολιδωτικής δερµατίτιδας. Βασικό κίνητρο της έρευνας αυτής, αποτέλεσε η ουσιαστική απουσία µελετών µε θέµα την ανοσοπαθογένεια της αποφολιδωτικής δερµατίτιδας. Η έρευνα, που είχε ως κύριο αντικείµενο τη µελέτη των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων και των διαφόρων κυτταρικών πληθυσµών του ανοσοποιητικού συστήµατος που συµµετέχουν στην πυοκοκκιωµατώδη-κοκκιωµατώδη φλεγµονή που παρατηρείται στην αποφολιδωτική δερµατίτιδα, έγινε στην Κλινική της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. τη χρονική περίοδο 1998-2001. Η εργασία αποτελείται από δύο µέρη. Στο πρώτο γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση της αιτιολογίας, της κλινικής εικόνας, των εργαστηριακών ευρηµάτων και των διαγνωστικών µεθόδων που εφαρµόζονται στη λεϊσµανίωση του σκύλου, ενώ εκτενέστερα αναφέρεται η µακροσκοπική και µικροσκοπική εικόνα των δερµατικών της αλλοιώσεων. Στη συνέχεια, και ύστερα από µία σύντοµη υπόµνηση πάνω στο σύστηµα των οµάδων διαφοροποίησης των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήµατος, το σύµπλεγµα TCR-CD3, και τα µόρια CD4, CD8, CD45RA, MHC-I, MHC-II και CD21, γίνεται λεπτοµερής αναφορά πάνω στους µηχανισµούς που διέπουν τη γενική και τη δερµατική ανοσολογική αντίδραση του οργανισµού στη µόλυνση από Leishmania sp. Στο δεύτερο µέρος αναφέρονται τα υλικά και οι µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν στη µελέτη και τα αποτελέσµατα που εµπλουτίζονται από συγκεντρωτικούς πίνακες. Τη συζήτηση των αποτελεσµάτων, που στηρίχθηκε στα δεδοµένα της πρόσφατης διεθνούς βιβλιογραφίας και τα συµπεράσµατα 1

ακολουθούν αµέσως το παράρτηµα πινάκων και ο κατάλογος των βιβλιογραφικών πηγών. Από τη θέση αυτή αισθάνοµαι την ανάγκη να εκφράσω τις βαθύτερες ευχαριστίες µου στον Καθηγητή της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ κ. Αλέξανδρο Φ. Κουτίνα, στον οποίο άλλωστε ανήκει και η πατρότητα του θέµατος, για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε µε την ανάθεση της µελέτης αυτής και για την αµέριστη συµπαράστασή του κατά τη διάρκεια της εκπόνησής της. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους Καθηγητές του Εργαστηρίου της Παθολογικής Ανατοµικής του ίδιου Τµήµατος κ.κ Σ.Λέκκα και Ι.Βλέµµα και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Ν. Παπαϊωάννου για την βοήθεια που µου προσέφεραν στην ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχηµική µελέτη των βιοψιών από το δέρµα και τις πολύτιµες συµβουλές τους πάνω στην ερµηνεία των ευρηµάτων. Τον Λέκτορα της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς κ. Ε. Σαριδοµιχελάκη ευχαριστώ για την βοήθεια που µου προσέφερε στην λήψη σηµαντικού αριθµού βιοψιών και τις χρήσιµες συµβουλές του στη συγγραφή του πονήµατος αυτού. Θα ήθελα ακόµη να ευχαριστήσω θερµά τον αρχίατρο ιστοπαθολόγο κ. Α. Καραµέρη που όχι µόνο µε δέχτηκε στο Εργαστήριο Παθολογικής Ανατοµικής και Ανοσοϊστοχηµείας του 401 ΓΣΝΑ αλλά µου πρόσφερε άπλετα την επιστηµονική του εµπειρία καθόλη τη διάρκεια της έρευνας. Στον ιευθυντή του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατοµικής και Ανοσοϊστοχηµείας του Γενικού Κρατικού Νοσοκοµείου Αθηνών κ. Γ. Κοντογεώργο θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις ευχαριστίες µου για την αµέριστη βοήθεια που µου πρόσφερε πάνω σε τεχνικά και επιστηµονικά θέµατα. Θα ήταν επίσης µεγάλη παράλειψη αν δεν ευχαριστούσα τον µοριακό βιολόγο κ. Ανδρέα Σκορίλα για την επιστηµονική του βοήθεια πάνω σε τεχνικά θέµατα που αφορούσαν το ανοσοϊστοχηµικό µέρος της µελέτης και τη 2

στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων καθώς και την παρασκευάστρια του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατοµικής και Ανοσοϊστοχηµείας του Γενικού Κρατικού Νοσοκοµείου Αθηνών κ. Μ. Πατεράκη για την τεχνική της βοήθεια. Τις εταιρείες Π.Ν.Γερολυµάτος Α.Β.Ε.Ε και Elsevier ευχαριστώ θερµά για την οικονοµική βοήθεια και τη δωρεάν άδεια για τη δηµοσίευση 4 σχηµατογραφηµάτων, αντίστοιχα. Τέλος, ευχαριστώ θερµά τη γυναίκα µου Ανθή και τα παιδιά µου Λυδία και Ιωάννα για την πολυετή υποµονή που έδειξαν και την ψυχολογική στήριξη που αγόγγυστα µου πρόσφεραν. 3

4

ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΓΕΝΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum) Α. ΓΕΝΙΚΑ Η λεϊσµανίωση του σκύλου (ΛΣ) είναι πολυσυστηµατικό λοιµώδες νόσηµα µε παγκόσµια εξάπλωση, οφείλεται σε διάφορα είδη του πρωτόζωου Leishmania sp., που ανήκει στην τάξη των Kinetoplastida και την οικογένεια των Trypanosomatidae (Molyneux και Ashford 1983, Euzeby 1986, Sellon 1992, WHO 1996, Slappendel και Ferrer 1998). Στην Ελλάδα, όπως εξάλλου και στις άλλες παραµεσόγειες χώρες, η νόσος έχει ενδηµικό χαρακτήρα, µε κύριο υπεύθυνο είδος τη Leishmania infantum (Tzamouranis και συν 1984, Kontos και Spais 1989, Dereure και συν 1999, Gradoni 1999, ιάκου 2000). Η τελευταία είναι διφασικό πρωτόζωο που ολοκληρώνει τον βιολογικό της κύκλο σε σπονδυλωτούς (σκύλος, τρωκτικά, άνθρωπος) και ασπόνδυλους (είδη σκνιπών) ξενιστές (Ferrer 1992, Noli 1999). Το παράσιτο µεταδίδεται στο σκύλο µε τα νύγµατα των θηλυκών Phlebotomus sp., για να πολλαπλασιαστεί στη συνέχεια µέσα στα µακροφάγα κύτταρα του δέρµατος, των βλεννογόνων και των σπλάχνων (Chang και συν 1985, Slappendel 1988, Alexander και Russel 1992, Fraile και Gonzalez 1995, Trees και Shaw 1999). Η προµαστιγωτή του µορφή αναπτύσσεται στο έντερο της σκνίπας για να µετατραπεί στη συνέχεια στη µολύνουσα µετακυκλική προµαστιγωτή µορφή που µεταναστεύει στο φάρυγγα και τα στοµατικά µόρια του εντόµου (Sacks και Perkins 1985, Killick-Kendrick 1990, Alexander και συν 1999). Η µεταµόρφωση στην αµαστιγωτή µορφή πραγµατοποιείται µέσα στα µακροφάγα κύτταρα των ιστών του σκύλου (Ferrer 1992, Slappendel και Ferrer 1998, Trees και Shaw 1999, ιάκου 2000, Killick-Kendrick 2002). Πρόσφατη έρευνα στις Η.Π.Α έδειξε ότι 5

η Leishmania sp. µπορεί να µεταδοθεί και µε µετάγγιση αίµατος από µολυσµένο δότη (Owens και συν 2001). Η κλινική εικόνα της ΛΣ παρουσιάζει τέτοια ποικιλοµορφία ώστε να κάνει αρκετά δύσκολη τη διαφορική διάγνωση από άλλα συστηµατικά νοσήµατα ή δερµατοπάθειες (Kontos και Koutinas 1993, Ferrer 1997). Στις φυλές Doberman, German shepherd, foxhound και boxer έχει αναφερθεί ότι υπάρχει προδιάθεση, ενώ οι σκύλοι-νάνοι και οι collie και Ibizian hound πρέπει να θεωρούνται φυλές µειωµένου κινδύνου (Solano-Gallego και συν 2000, Gaskin και συν 2002). Ενώ έχει αναφερθεί σαφής προδιάθεση στα νεαρά ενήλικα και τα ενήλικα-µεσήλικα ζώα (Amela και συν 1995), υπάρχει διχογνωµία για το αν οι αρσενικοί σκύλοι προσβάλλονται συχνότερα από τους θηλυκούς (Slappendel 1988, Ciaramella και συν 1997, Zaffaroni 1999), ή όχι (Mur και Verde 1995, Koutinas και συν 1999). Στο σκύλο ο χρόνος επώασης της νόσου ποικίλει από λίγους µήνες µέχρι 7 χρόνια (Rioux και συν 1979, Slappendel 1988, Ferrer 1992, Slappendel και Ferrer 1998, Trees και Shaw 1999). Η γενική κατάσταση των προσβεβληµένων σκύλων συνήθως είναι τέτοια ώστε αρκετά από αυτά να προσκοµίζονται σε κατάσταση απίσχνασης µε θαµπό, ξηρό και ανορθωµένο τρίχωµα και γενικευµένη µυϊκή αδυναµία (Longstaffe και Guy 1985, Ferrer 1992, Slappendel και Ferrer 1998, Chatterjee και συν 1999, Koutinas και συν 1999). Στα ζώα αυτά η προοδευτική απώλεια του σωµατικού βάρους, είναι ο κανόνας παρά το ό,τι η όρεξή τους παραµένει φυσιολογική ή και αυξάνει ακόµη (Longstaffe και Guy 1985, Kontos και Koutinas 1993, Mur και Verde 1995, Slappendel και Ferrer 1998). Αν και σε ορισµένα ζώα έχει παρατηρηθεί διαλείποντας πυρετός (Chapman και Hanson 1984, Slappendel 1988, Ciaramella και συν 1997, Blavier και συν 2001), στη συντριπτική τους πλειοψηφία αυτά είναι απύρετα (Koutinas και συν 1993, Slappendel και Ferrer 1998). Ο πυρετός τις περισσότερες φορές οφείλεται στη συνύπαρξη διαφόρων νοσηµάτων όπως 6

για παράδειγµα η ερλιχίωση, η πιροπλάσµωση, ο συστηµατικός ερυθηµατώδης λύκος και οι βακτηριδιακές λοιµώξεις (Kontos και Κοutinas 1993, Mur και Verde 1995). Οι ορατοί βλεννογόνοι συχνά είναι ωχροί, εξαιτίας της αναιµίας (Longstaffe και Guy 1985, Kontos και Koutinas 1993, Ciaramella και συν 1997). Στη γενικευµένη περιφερική λεµφαδενοπάθεια, που αποτελεί ένα από τα συνηθέστερα κλινικά ευρήµατα (Ciaramella και συν 1997, Slappendel 1998, Slappendel και Ferrer 1998), τα λεµφογάγγλια ψηλαφούνται φυσιολογικά ή είναι υποπλαστικά, ιδιαίτερα στα περιστατικά εκείνα που βρίσκονται στο τελικό στάδιο της νεφρικής ανεπάρκειας (Kontos και Koutinas 1993, Koutinas και συν 1999). Στη ΛΣ η ηπατοµεγαλία είναι µάλλον σπάνια (Kontos και Koutinas 1993), σε αντίθεση µε τη σπληνοµεγαλία (Slappendel 1988, Ciaramella και συν 1997) αν και τις περισσότερες φορές αυτή είναι υποκλινική, σε αντίθεση µε άλλα λοιµώδη νοσήµατα (π.χ ερλιχίωση, πιροπλάσµωση), στα οποία διαπιστώνεται εύκολα κατά την κλινική εξέταση (Koutinas και συν 1999). Η µυϊκή ατροφία, που εγκαθίσταται προοδευτικά, αν και θα µπορούσε να είναι γενικευµένη είναι σαφώς ορατή στους κροταφίτες µύες (Rioux και Golvan 1969, Ferrer 1999, Koutinas και συν 1999). Τελευταία διαπιστώθηκε ότι η ατροφία αυτή είναι το τελικό αποτέλεσµα υποκλινικής πολυµυίτιδας που οδηγεί στην εκφύλιση, νέκρωση και ατροφία των µυϊκών ινών και την αντικατάστασή τους στη συνέχεια από ινώδη συνδετικό ιστό (Vamvakidis και συν 2000). Η νεφροπάθεια της ΛΣ, οφείλεται κατά κύριο λόγο στην από ανοσοσύµπλοκα σπειραµατονεφρίτιδα (Bindseil και συν 1985, Mancianti και συν 1989, Nieto και συν 1992, Lopez και συν 1996) και διαµεσοσωληναριακή νεφρίτιδα και πολύ σπανιότερα στην αµυλοϊδωση (George και συν 1976, Poli και συν 1991, Κoutinas και συν 1995). Η παθολογική αυτή κατάσταση, που κατά κανόνα έχει χρόνια εξέλιξη, µπορεί να εκδηλωθεί µε ασυµπτωµατική πρωτεϊνουρία, χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, ή/και σπανιότερα µε την 7

εγκατάσταση νεφρωσικού συνδρόµου (Benderitter και συν 1988, Κoutinas και συν 1995, Koutinas και συν 1999, Blavier και συν 2001). εν υπάρχει αµφιβολία ότι η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια αποτελεί το συχνότερο αίτιο θανάτου στην ΛΣ (Ciaramella και συν 1997, Koutinas και συν 1999, Ferrer 1999). Η επίσταξη, που είναι αµφοτερόπλευρη ή ετερόπλευρη, ήπιου ή έντονου βαθµού και συνεχής ή διαλείπουσα (Ferrer 1999, Blavier και συν 2001), µπορεί να αποτελέσει το µοναδικό πρωτοεµφανιζόµενο σύµπτωµα σε ορισµένα περιστατικά της νόσου (Longstaffe και Guy 1985, Kontos και Koutinas 1993, Koutinas και συν 1999). Αν και η παθογένεια της επίσταξης δεν έχει διευκρινισθεί σε όλες της τις πτυχές, πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι πιθανότατα οφείλεται στο συνδυασµό θροµβοκυτταροπάθειας, υπερσφαιριναιµίας και ελκώδους ρινίτιδας (Slappendel και Ferrer 1998, Jüttner και συν 2001). Τα συχνότερα οφθαλµολογικά προβλήµατα στην ΛΣ είναι η λεµφοπλασµοκυτταρική ή κοκκιωµατώδης επιπεφυκίτιδα και η πρόσθια ιριδοκυκλίτιδα ή ραγοειδίτιδα, η ελκώδης βλεφαρίτιδα, η επιπολής και εν τω βάθει κερατίτιδα και η σκληρίτιδα (Roze 1986, Ferrer 1992, Martin και Stiles 1998, Roze 2002). Συγκεκριµένα, η ραγοειδίτιδα που συνήθως οφείλεται στην από ανοσοσύµπλοκα αγγειίτιδα (Garcia-Alonso και συν 1996), µπορεί να προκαλέσει οίδηµα του κερατοειδούς ή/και γλαύκωµα κλειστής γωνίας ή να εξελιχθεί σε πανοφθαλµίτιδα, µε µοιραίο αποτέλεσµα την τυφλότητα του ζώου (Ciaramella και συν 1997, Roze 2002). Τα κινητικά προβλήµατα στη ΛΣ, εκτός από τον πιθανό ρόλο της πολυµυΐτιδας, οφείλονται στην µη ελκώδη πολυαρθρίτιδα εξαιτίας της εναπόθεσης ανοσοσυµπλόκων στον αρθρικό υµένα (Cucinotta και συν 1991, Spreng 1993, Cucinotta και συν 1995, Wolschrijn και συν 1996) και πολύ σπανιότερα στην οστεοµυελίτιδα ή/και την υπερπλαστική περιοστίτιδα (Turrel 8

και Pool 1982, Buracco και συν 1997, Slappendel και Ferrer 1998, Franch και συν 2002). Η µάλλον σπάνια στην πράξη χρόνια ηπατίτιδα στη ΛΣ, που πιθανότατα έχει ανοσολογικό χαρακτήρα, µπορεί να εξελιχθεί σε χρόνια ηπατική ανεπάρκεια (Ferrer 1992). Επισηµαίνεται ότι ακόµη και οξεία αιµορραγική παγκρεατίτιδα έχει διαπιστωθεί σε ένα περιστατικό της νόσου (Carrasco και συν 1997). Η χρόνια κοκκιωµατώδης κολίτιδα και εντερίτιδα στη ΛΣ, σπάνια ευθύνονται για την εµφάνιση συµπτωµάτων από τον γαστρεντερικό σωλήνα, ενώ το αντίθετο θα µπορούσε να λεχθεί για το νεφρικής προέλευσης ουραιµικό σύνδροµο (Denerolle 1996, Ferrer 1999, Blavier και συν 2001). Στην ελκώδη στοµατίτιδα οι αλλοιώσεις εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στην υπερώα όπως εξάλλου και σε ορισµένες αυτοάνοσες δερµατοπάθειες (π.χ κοινή πέµφιγα, ποµφολυγώδες πεµφιγοειδές, συστηµατικός ερυθηµατώδης λύκος) (Koutinas και συν 1999). Η νόσος σπάνια µπορεί να εκδηλωθεί µε τη µορφή οζιδίων στους βλεννογόνους της στοµατικής κοιλότητος, των ρινικών κοιλοτήτων και του πέους (Font και συν 1996, Ochoa και συν 2002), γενικευµένης αγγειϊτιδας (Pumarola και συν 1991, Font και συν 2002), διάµεσης πνευµονίας (Duarte και συν 1986, Blavier και συν 2001) ή περικαρδίτιδας (Font και συν 1993), ενώ έχει επιβεβαιωθεί η προσβολή του εγκεφάλου και των µηνίγγων (Nieto και συν 1996, Cortese και συν 1999, Vinuelas και συν 2001). Τέλος, δεν είναι λίγα τα περιστατικά ΛΣ στα οποία διαπιστώνεται ταυτόχρονη προσβολή από άλλα αιµοπρωτόζωα (Babesia canis, Hepatozoon canis, Neospora caninum), βακτηρίδια (Ehrlichia canis, Rickettsia rickettsii), αιµοπαράσιτα (Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens) ή εξωπαράσιτα (Demodex canis, Sarcoptes scabiei) και αυτοάνοσα νοσήµατα (φυλλώδης πέµφιγα) (Κοντός 1986, Huss και Ettinger 1992, Ginel και συν 1993, Arnold και συν 1998, Mozos και συν 1999, Tarantino και συν 2001, Tarello 2002). 9

Υποστηρίζεται ότι τα ζώα αυτά ήταν χρόνιοι ασυµπτωµατικοί φορείς της L.infantum και όταν η ανοσολογική τους αντίδραση άλλαξε (µόλυνση, εξωπαράσιτα κ.λ.π) τότε παρουσίασαν συµπτώµατα του νοσήµατος (Ferrer 2002). Από τα εργαστηριακά ευρήµατα το συχνότερο είναι η αναιµία, που βασικά χαρακτηρίζεται ως ορθόχρωµη, ορθοκυτταρική και µη αναγεννητική (Slappendel 1988, Ferrer 1992, Koutinas και συν 1999, Lobetti 2002). Αυτή οφείλεται στο χρόνιο φλεγµονώδη χαρακτήρα της νόσου, στη χρόνια ή οξεία αιµορραγία (π.χ δερµατικά έλκη), σε ανοσολογικούς µηχανισµούς και ενδεχοµένως στην καταστολή του µυελού των οστών (Kontos και Koutinas 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Lobetti 2002 ). Στα περιστατικά που παρατηρείται θροµβοκυτταροπενία, τα αίτιά της θα µπορούσαν να είναι τα κυκλοφορούντα στο αίµα ανοσοσύµπλοκα και αυτοαντισώµατα, η υπερπλαστική σπληνοµεγαλία και πιθανότατα η χρόνια µορφή του συνδρόµου της διάσπαρτης ενδοαγγειακής πήξης (Ciaramella και συν 1997, Kontos και Koutinas 1993, Noli 1999). Έρευνα πάνω στην πρωτογενή αιµόσταση, έδειξε ότι ο χρόνος ροής ήταν αυξηµένος, ενώ ο αριθµός των αιµοπεταλίων δεν παρουσίαζε µεταβολές σε σχέση µε τα υγιή ζώα (Moreno και συν 1998). Στη µελέτη της δευτερογενούς αιµόστασης διαπιστώθηκε ότι µόνο οι χρόνοι θροµβοπλαστίνης και θροµβίνης ήταν αυξηµένοι (Moreno 1999). Αν και ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων συνήθως παραµένει φυσιολογικός (Κοντός 1986), σποραδικά είναι δυνατόν να παρατηρηθεί λευκοπενία (Slappendel 1988) ή λευκοκυττάρωση (Ciaramella και συν 1997, Mur και Verde 1995). Στο δεύτερο και τρίτο στάδιο της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας, που συχνά η νόσος προκαλεί, παρατηρείται αύξηση της συγκέντρωσης του αζώτου ουρίας (BUN), της κρεατινίνης και του φωσφόρου στον ορό του αίµατος (Slappendel 1988, Noli 1999, Koutinas και συν 1999). Το συχνότερο όµως εργαστηριακό 10

εύρηµα είναι η β και γ υπερσφαιριναιµία που συχνά συνοδεύεται από υπολευκωµατιναιµία (Groulade και Person 1987, Slappendel 1988, Ciaramella και συν 1997). H υπερσφαιριναιµία είναι το αποτέλεσµα της υπερενεργοποίησης της χυµικής ανοσίας (Mur και Verde 1995), ενώ η υπολευκωµατιναιµία βασικά οφείλεται στην σπειραµατονεφρίτιδα και τη µείωση της όρεξης του ζώου (Ferrer 1992, Kontos και Koutinas 1993). Στo αρχικό στάδιο της νόσου αυξάνουν οι β1 και β2 σφαιρίνες και ακολουθούν οι β3 και οι γ σφαιρίνες (Noli 1999) ενώ έχει παρατηρηθεί και µονοκλωνική γ σφαιριναιµία (Blavier και συν 2001). Στην ανοσοηλεκτροφόρηση κυριαρχούν οι ανοσοσφαιρίνες IgG, το µεγαλύτερο µέρος των οποίων εµπεριέχεται στα ανοσοσύµπλοκα που κυκλοφορούν στο αίµα (Slappendel 1988, Lopez και συν 1996). Αν και αντιπυρηνικά αντισώµατα και αυτοαντισώµατα έχουν ανιχνευθεί στη ΛΣ, τα πρώτα φαίνεται να συµµετέχουν ελάχιστα στη παθογένειά της (Brandonisio και συν 1990, Lucena και συν 1996, Lucena και Ginel 1998, Ginel και συν 2002). Η σπειραµατική πρωτεϊνουρία είναι το πλέον σταθερό εύρηµα στην εξέταση του ούρου, που συνήθως έχει χαµηλό ειδικό βάρος, και κατά κανόνα συνοδεύεται από την παρουσία υαλοκοκκιωδών κυλίνδρων στο ίζηµα (Κοντός 1986, Koutinas και συν 1999). Στις σύγχρονες µεθόδους που χρησιµοποιούνται για την διάγνωση της ΛΣ, περιλαµβάνονται οι παρασιτολογικές (αναζήτηση του παρασίτου), οι καλλιέργειες, οι ορολογικές (ανίχνευση των ειδικών αντισωµάτων), οι ανοσοϊστοχηµικές (ανίχνευση αντιγόνων συγκεκριµένου µοριακού βάρους) και οι µοριακές (ανίχνευση γενετικού υλικού του παρασίτου) (Ferrer 1997, Slappendel 1998, Aisa και συν 1998, Ferrer 1999). Η απλούστερη µέθοδος είναι η απευθείας παρατήρηση του παρασίτου σε χρωµατισµένα µε Giemsa ή Diff Quick επιχρίσµατα παρακέντησης από το µυελό των οστών, τα λεµφογάγγλια, το σπλήνα και τα οζίδια-φλύκταινες του δέρµατος καθώς και σε επιχρίσµατα 11

αποτύπωσης από αλλοιώσεις του δέρµατος και των βλεννογόνων (Kontos και Koutinas 1993, Ferrer 1997, Slappendel 1998). Η µέθοδος αυτή είναι πολύ ειδική αλλά λιγότερο ευαίσθητη σε σύγκριση µε τις άλλες (Ferrer 1999, Saridomichelakis και συν 2000) (Εικόνα 1). Η βιοψία του δέρµατος είναι επίσης χρήσιµη, αν και οι ιστολογικές αλλοιώσεις στη ΛΣ δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερο παθογνωµονικό χαρακτήρα (Koutinas και συν 1993, Yager και Wilcock 1994, Ferrer 1999). Με την εξέταση αυτή, εφόσον ο αριθµός των παρασίτων είναι µεγάλος δεν υπάρχει διαγνωστικό πρόβληµα, ενώ στην αντίθετη περίπτωση µόνο η ανοσοϊστοχηµεία, µε τη χρησιµοποίηση ειδικών αντισωµάτων, µπορεί να ανιχνεύσει τα παράσιτα (Ferrer και συν 1988a, Bourdoiseau και συν 1997). Αν και οι λεϊσµάνιες µπορούν να καλλιεργηθούν στα θρεπτικά υποστρώµατα NNN, RPMI-1640 και HO-MEM (Kontos και Koutinas 1993, Ferrer 1997, Ferrer 1999), το σχετικά µεγάλο χρονικό διάστηµα που απαιτείται για το σκοπό αυτό και η µικρή ευαισθησία της µεθόδου, ιδιαίτερα όταν ο αριθµός των παρασίτων είναι µικρός, την περιορίζει στην ταυτοποίηση των διαφόρων ειδών της Leishmania sp. (Noli 1999, Ferrer 1999). Από τις ορολογικές µεθόδους οι συνηθέστερα χρησιµοποιούµενες είναι ο έµµεσος ανοσοφθορισµός (IFA) και η ανοσοενζυµική (ELISA) (Slappendel 1988, Kontos και Koutinas 1993, WHO 1996, Ferrer 1999). Το αποτέλεσµα των ορολογικών αυτών εξετάσεων θα πρέπει να ερµηνεύεται µε βάση την κλινική εικόνα του ζώου και την εξέταση των επιχρισµάτων από τον µυελό των οστών ή τα λεµφογάγγλια (Slappendel 1988, Kontos και Koutinas 1993). Σε καµία περίπτωση το αρνητικό αποτέλεσµα δεν µπορεί να αποκλείσει τη νόσο, ιδιαίτερα στο αρχικό και το τελικό της στάδιο (Slappendel 1988, Ferrer και συν 1995). Στην περίπτωση αυτή η ορολογική εξέταση θα πρέπει να επαναλαµβάνεται κάθε µήνα και για εύλογο χρονικό διάστηµα (Noli 1999). Από την άλλη πλευρά, η ορολογική εξέταση είναι κατά κανόνα θετική στους 12

µολυσµένους ασυµπτωµατικούς σκύλους που ενδέχεται να µην εκδηλώσουν ποτέ τη νόσο (Ferrer 1999, Pinelli και συν 1999). Από τις µοριακές µεθόδους, η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) εκτός από την διάγνωση της νόσου, είναι χρήσιµη για τον έλεγχο της πλήρους εξουδετέρωσης του παρασίτου σε ζώα που υποβάλλονται σε θεραπεία καθώς και για την ταυτοποίηση των διαφόρων ειδών και στελεχών του παρασίτου (Ferrer 1997, Slappendel 1998, ιάκου 2000). Με την PCR επιτυγχάνεται η ενζυµική σύνθεση και ενίσχυση συγκεκριµένων τµηµάτων του γονιδιώµατος της Leishmania sp. µε τη βοήθεια της DNA πολυµεράσης (Καραµέρης 1997, Ferrer 1999, Solano-Gallego και συν 2001). Συγκεκριµένα, απειροελάχιστη ποσότητα του DNA, που συνήθως προέρχεται από τον κινητοπλάστη της αµαστιγωτής µορφής του παρασίτου, µπορεί να αναγνωριστεί και να πολλαπλασιαστεί ανάλογα σε νωπά ή µονιµοποιηµένα παρασκευάσµατα (Ferrer 1999, Solano-Gallego και συν 2001). Βασικό πλεονέκτηµα της µεθόδου είναι η υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία και µειονέκτηµα η ανάγκη ενός καλά εξοπλισµένου και εξειδικευµένου εργαστηρίου. (Noli 1999, Ferrer 1999). Πρόσφατα, η τεχνική της τυχαίας ενίσχυσης τµηµάτων του πολυµορφικού DNA (RAPD-PCR), χρησιµοποιήθηκε µε µικρές τροποποιήσεις για την ταυτοποίηση των ειδών και των στελεχών της Leishmania sp. στη χώρα µας ( ιάκου 2000). Υψηλή, τέλος, είναι και η ειδικότητα και ευαισθησία του ανοσοαποτυπώµατος Western στο οποίο τα αντιγονικά κλάσµατα µε µοριακό βάρος 12 και 14 kd χαρακτηρίζουν την πρώϊµη φάση της λοίµωξης (Aisa και συν 1998). Η µέθοδος αυτή θα µπορούσε να αντικαταστήσει τις επανειληµµένες ορολογικές εξετάσεις στα περιστατικά εκείνα στα οποία το αρχικό αποτέλεσµα είναι αρνητικό. 13

Εικόνα 1: Επίχρισµα αποτύπωσης από έλκος του δέρµατος σε σκύλο µε λεϊσµανίωση (L.infantum). ιακρίνονται τέσσερεις αµαστιγωτές µορφές του παρασίτου στο κυτταρόπλασµα ενός µολυσµένου µακροφάγου κυττάρου. (Χρώση Haemacolor, x1000) 14

Β. ΕΡΜΑΤΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ Οι δερµατικές αλλοιώσεις, που αποτελούν τη συχνότερη και εντυπωσιακότερη κλινική εκδήλωση της ΛΣ, βασικά περιλαµβάνουν την αποφολιδωτική δερµατίτιδα (Α ), τα άτονα έλκη (χείλη πτερυγίων αυτιών, οστέϊνες προεξοχές), τα οζίδια και τις πλάκες, τη φλυκταινώδη δερµατίτιδα και την ονυχοπάθεια (Koutinas και συν 1993, Opitz 1996, Koutinas και συν 1999, Ferrer 1999, Scott και συν 2001). Οι αλλοιώσεις αυτές συνήθως έχουν χρόνια εξέλιξη, κατά κανόνα δεν είναι κνησµώδεις και µερικές φορές παρουσιάζουν συµµετρική διάταξη (Slappendel 1988, Ferrer 1992, Kontos και Koutinas 1993). Στις λιγότερο συχνές αλλοιώσεις περιλαµβάνονται η υπερκεράτωση του ακρορρινίου και των πελµατικών φυµάτων, τα βλεννογονοδερµατικά έλκη, το διάχυτο ερύθηµα (Koutinas και συν 1993, Opitz 1996), η εστιακή υποτρίχωση µε πολυάριθµα κόµεδα (Morgan και συν 1997) και οι λειχηνόµορφες πλάκες. Στην Α παρατηρείται εστιακή, πολυεστιακή ή διάχυτη αλωπεκίαυποτρίχωση, που είναι ιδιαίτερα εµφανής στην κεφαλή, τα πτερύγια των αυτιών και τα άκρα (Ferrer 1988, Koutinas και συν 1993). Το τρίχωµα τις περισσότερες φορές είναι θαµπό, ξηρό, εύθραυστο και ανορθωµένο και συνοδεύεται από ξηρή, λιπαρή ή µικτή σµηγµατόρροια (Koutinas και συν 1993, Slappendel και Ferrer 1998). Η Α χαρακτηρίζεται από ελαφρού ως έντονου βαθµού αποφολίδωση που µπορεί να συνοδεύεται από ερύθηµα ή υπερχρωµία (Ferrer 1992, Koutinas και συν 1999) (Εικόνα 2). Οι πιτυρόµορφες και αµιαντόµορφες φολίδες, εκτός από την κεφαλή, εντοπίζονται στην εξωτερική επιφάνεια του κορµού και των άκρων και µόνο σπάνια στην εσωτερική τους και την κάτω επιφάνεια του κορµού (Ferrer και συν 1988, Koutinas και συν 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν 1999). Η δερµατική αυτή µορφή της ΛΣ µοιάζει αρκετά µε ορισµένες ανοσολογικές δερµατοπάθειες ή µε εκείνες που χαρακτηρίζονται από διαταραχές της κερατινοποίησης (Scott και συν 2001). 15

Τα έλκη, που εκτός από τα σηµεία τριβής του δέρµατος και τα βλεννογονοδερµατικά όρια, µπορεί να εντοπίζονται στα πελµατικά φύµατα και τα χείλη των πτερυγίων των αυτιών (Koutinas και συν 1993, Mur και Verde1995, Noli 1999), συνήθως έχουν στρογγυλό ή ωοειδές σχήµα, είναι επιφανειακά ή βαθειά και έχουν διάµετρο από ένα ως 5cm (Koutinas και συν 1993, Ciaramella και συν 1997). Οι αλλοιώσεις αυτές µπορεί να είναι το αποτέλεσµα της αγγειϊτιδας από ανοσοσύµπλοκα (Slappendel 1988, Pumarola και συν 1991) ή ακόµη και της άµεσης δράσης του παρασίτου (Ridley και Ridley 1983). Τα δερµατικά οζίδια και οι πλάκες, που εµφανίζονται σπανιότερα από τις προηγούµενες αλλοιώσεις, είναι µονήρη ή πολλαπλά (Mur και Verde 1995, Slappendel και Ferrer 1998) και ενδέχεται να έχουν εξελκωµένη επιφάνεια (Koutinas και συν 1993). Για το είδος αυτό των δερµατικών αλλοιώσεων η προδιάθεση συγκεκριµένων φυλών (Ferrer και συν 1988) αµφισβητείται (Koutinas και συν 1999). Επειδή στα επιχρίσµατα παρακέντησης µε λεπτή βελόνη ή την ιστοπαθολογική εξέταση των βιοψιών από τα δερµατικά οζίδιαπλάκες ο αριθµός των αµαστιγωτών µορφών που αποκαλύπτεται είναι µεγάλος, δεν υπάρχει δυσκολία ως προς τη διαφοροποίησή τους από τα νεοπλάσµατα του δέρµατος, τα βακτηριδιακά, µυκητιακά ή άσηπτα κοκκιώµατα-πυοκοκκιώµατα ή από άλλους µη νεοπλασµατικούς όγκους (Ferrer 1992, Koutinas και συν 1999). Στη φλυκταινώδη δερµατίτιδα οι φλύκταινες ή ό,τι µένει µετά τη ρήξη τους, εντοπίζονται κυρίως στην κάτω επιφάνεια του κορµού και την εσωτερική επιφάνεια των άκρων (Koutinas και συν 1999, Ferrer 1999). Όµως στα επιχρίσµατα αποτύπωσης από το περιεχόµενο των φλυκταινών αντί των ουδετερόφιλων κυριαρχούν τα λεµφοκύτταρα και τα µακροφάγα, που συνήθως περιέχουν το παράσιτο (Ferrer και συν 1988, Koutinas και συν 1999). 16

Εικόνα 2: Αποφολιδωτική δερµατίτιδα στο πρόσωπο σκύλου φυλής Rottweiler µε λεϊσµανίωση από Leishmania infantum στην οποία διακρίνονται αλωπεκία-υποτρίχωση, και άφθονες πιτυρόµορφες-αµιαντόµορφες φολίδες. Η διαφορική διάγνωση, της σπάνιας στην πράξη δερµατικής αυτής µορφής, πρέπει απαραίτητα να περιλαµβάνει την βακτηριδιακή θυλακίτιδα, τη φυλλώδη και ερυθηµατώδη πέµφιγα, την υποκεράτια φλυκταινώδη και την εωσινοφιλική φλυκταινώδη δερµατίτιδα (Mur και Verde 1995, Scott και συν 2001). Η σταφυλοκοκκική λοίµωξη, που συχνά επιπλέκει τις δερµατικές αλλοιώσεις της ΛΣ, θα µπορούσε να οφείλεται στην ξηροδερµία, τη σµηγµατόρροια και τη µειωµένη αντίδραση της κυτταρικής ανοσίας (Carlotti 1990, Koutinas και συν 1999). Τέλος, τα νύχια ενδέχεται να παρουσιάζουν υπερβολική ανάπτυξη και κύρτωση (ονυχογρύπωση), η οποία τις περισσότερες 17

φορές δεν συνοδεύεται από ονυχόσχιση ή ονυχοµαλάκυνση (Koutinas και συν 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν 1999, Carlotti 2002). Παρονυχία παρουσιάζεται σε µικρό αριθµό περιστατικών, ενώ η έντονη υπερκεράτωση και εξέλκωση των πελµατικών φυµάτων µπορεί να προκαλέσει ακόµη και κινητικά προβλήµατα (Koutinas και συν 1993, Noli 1999). Τα πελµατικά φύµατα εµφανίζονται πεπαχυµένα, σκληρά και όχι σπάνια διακρίνονται ραγάδες, διαβρώσεις και έλκη (Koutinas και συν 1993, Koutinas και συν 1999). Η ιστοπαθολογική εικόνα της ΛΣ έχει ορισµένα µόνο κοινά σηµεία µε τη δερµατική λεϊσµανίωση του ανθρώπου (Lever και Schaumburg-Lever 1990, Mehregan και συν 1999). Στην βλεννογονοδερµατική λεϊσµανίωση του σκύλου που προκλήθηκε πειραµατικά µε τη L.braziliensis braziliensis, τα ιστοπαθολογικά ευρήµατα ήταν παρόµοια µε εκείνα της ανάλογης νόσου του ανθρώπου (Pirmez και συν 1989). Στην πειραµατική όµως λεϊσµανίωση µε τη L.amazonensis σε πιθήκους του είδους Macaca mulatta, οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις ήταν κάπως διαφορετικές από αυτές της ΛΣ (Amaral και συν 2000). Η ποικιλοµορφία των ιστολογικών αλλοιώσεων στο δέρµα δεν εξαρτάται τόσο από το είδος ή το στέλεχος του παρασίτου και το µέγεθος του ενοφθαλµίσµατος, όσο από την ανοσολογική ανταπόκριση του ξενιστή (Mehregan και συν 1999). Στη ΛΣ η επιδερµίδα εµφανίζει διαφόρου βαθµού ορθοκερατωτική υπερκεράτωση και υπερπλασία (ακάνθωση) (Ferrer και συν 1988, Gross και συν 1992, Koutinas και συν 1993), ενώ έλκη και διαβρώσεις µπορεί να παρατηρηθούν σε ποσοστό µέχρι και 25% στο σύνολο των περιστατικών µε δερµατικές αλλοιώσεις (Ferrer και συν 1988). Η ορθοκερατωτική υπερκεράτωση του θυλάκου των τριχών και της επιδερµίδας των πελµατικών φυµάτων, αποτελεί επίσης συχνό ιστοπαθολογικό εύρηµα (Ferrer και συν 1988, Longstaffe και συν 1983). Στο χόριο συνήθως παρατηρείται κοκκιωµατώδης ή/και λεµφοπλασµοκυτταρική διάµεση δερµατίτιδα (Ferrer και συν 1988, 18

Koutinas και συν 1993), περιθυλακίτιδα, περιαδενίτιδα, σµηγµαταδενίτιδα και επιπολής ή εν τω βάθει περιαγγειακή δερµατίτιδα, σε πολλούς και διάφορους συνδυασµούς (Altimira 1998, Scott και συν 2001). Η περιθυλακίτιδα και σµηγµαταδενίτιδα αναφέρεται ότι είναι οι συχνότερες ιστολογικές αλλοιώσεις (Koutinas και συν 1993), αν και έχουν υπάρξει διαφορετικές απόψεις (Longstaffe και συν 1983, Ferrer και συν 1988). Όµως δεν είναι λίγα τα περιστατικά στα οποία παρατηρείται πλήρης καταστροφή και αντικατάσταση των σµηγµατογόνων αδένων από κοκκιώδη ή ινώδη συνδετικό ιστό (Gross και συν 1992, Koutinas και συν 1993). Λιγότερο συχνά παρατηρούνται η οζώδης δερµατίτιδα (Ferrer και συν 1988, Ferrer και συν 1990), η λειχηνοειδής ή χοριοεπιδερµική δερµατίτιδα, η λοβιώδης υποδερµατίτιδα (Ferrer και συν 1988, Scott και συν 2001), και η ενδοεπιδερµική φλυκταινώδης δερµατίτιδα (Ferrer και συν 1988, Scott και συν 2001). Για την ύπαρξη αγγειϊτιδας υπάρχουν τόσο θετικές (Poli 1989, Tarantino και συν 2001), όσο και αρνητικές αναφορές (Ferrer και συν 1988, Koutinas και συν 1993). Το φλεγµονικό διήθηµα στους παραπάνω τύπους της δερµατίτιδας της ΛΣ συνίσταται από µακροφάγα κύτταρα, λεµφοκύτταρα και πλασµοκύτταρα (Ferrer και συν 1988, Koutinas και συν 1993, Yager και Wilcock 1994), ενώ τα εωσινόφιλα είναι σπάνια, και τα ουδετερόφιλα συνήθως παρατηρούνται κάτω από τα έλκη ή όταν υπάρχει βακτηριδιακή επιπλοκή (Ferrer και συν 1988, Koutinas και συν 1993). Στην πειραµατική ΛΣ µε τη L.infantum, ουδετερόφιλα και µακροφάγα παρατηρήθηκαν µόλις 3,5 ώρες µετά τον ενοφθαλµισµό του παρασίτου (Santos-Gomes και συν 2000). Ανάλογες παρατηρήσεις έχουν γίνει και στην πειραµατική λεϊσµανίωση του ποντικού (Belkaid και συν 1998), την φυσική νόσο του ανθρώπου από τη L. infantum (Rab και συν 1992) και την πειραµατική δερµατική λεϊσµανίωση µε τη L.amazonensis σε πιθήκους Macaca mulatta (Amaral και συν 2000). 19

Σε τοµές του δέρµατος που βάφονται µε αιµατοξυλίνη-εωσίνη, οι αµαστιγωτές µορφές του παρασίτου παρατηρούνται σε ποσοστό µέχρι 50%, όχι µόνο µέσα στα µακροφάγα κύτταρα και τους ινοβλάστες αλλά και εξωκυτταρικά, ενώ ο αριθµός τους είναι αντίστροφα ανάλογος µε την χρονιότητα των αλλοιώσεων. Επιπλέον ο αριθµός επηρρεάζεται από το είδος των δερµατικών αλλοιώσεων αφού είναι πολύ µεγαλύτερος στην οζώδη µορφή σε σύγκριση µε την Α και τις άλλες δερµατικές µορφές της νόσου (Koutinas και συν 1993, Yager και Wilcock 1994, Νoli 1999). 20

Γ. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΥΠΟΜΝΗΣΗ Σύστηµα CD Τα Τ- λεµφοκύτταρα αναπτύσσονται στο θύµο αδένα, όπου οι πρόδροµες µορφές τους διαφοροποιούνται κατά τη µετάβαση από τη φλοιώδη στη µυελώδη ουσία (Tizard 2000, Affolter 2000a). Η διαφοροποίηση αυτή πραγµατοποιείται µε την έκφραση συγκεκριµένων γλυκοπρωτεϊνών ή και άλλων πρωτεϊνών στην επιφάνειά τους (Moore και συν 1998, Affolter και Cannon 2000). Τα λεµφοκύτταρα που βρίσκονται στη φάση της ηρεµίας (παρθένα λεµφοκύτταρα), αποτελούνται από πολλούς κυτταρικούς υποπληθυσµούς, η αναγνώριση και διάκριση των οποίων γίνεται µε βάση την έκφραση συγκεκριµένων πρωτεϊνικών µορίων στην επιφάνειά τους (Feldman 2000). Μελέτες που έγιναν σε πληθυσµούς λεµφοκυττάρων µε κυτταροµετρία ροής, έδειξαν ότι αυτά που εκφράζουν συγκεκριµένους συνδυασµούς πρωτεϊνικών µορίων (αντιγόνα διαφοροποίησης) αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς υποπληθυσµούς µε συγκεκριµένες λειτουργίες (Tizard 2000). Με τη βοήθεια µονοκλωνικών αντισωµάτων συγκροτήθηκαν διάφορες οµάδες διαφοροποίησης (clusters of differentiation ή CD) (Cobbold και Metcalfe 1994, Χαραλαµπίδης 1994, Moore και συν 1998, Day 1999, Affolter και Cannon 2000). Τα αντιγόνα αυτά βασικά χρησιµεύουν ως φαινοτυπικοί δείκτες των λεµφοκυτταρικών υποπληθυσµών (Williams 1997, Feldman 2000). Tα βοηθητικά Τ-λεµφοκύτταρα, για παράδειγµα, εκφράζουν το CD4 αντιγόνο, ενώ τα κυτταροτοξικά Τ- λεµφοκύτταρα εκφράζουν το CD8 (Moore και συν 1998, Affolter 2000b). Τα µόρια αυτά, εκτός από τα λεµφοκύτταρα, µπορούν να αναγνωρίσουν και άλλους κυτταρικούς πληθυσµούς που συµµετέχουν σε φλεγµονώδεις αντιδράσεις (Abbas και συν 1997, Moore και συν 2000). Με τα µονοκλωνικά αντισώµατα έχει διευκολυνθεί σε µεγάλο βαθµό η µελέτη του ανοσολογικού συστήµατος του σκύλου και ιδιαίτερα του ρόλου των διαφόρων λεµφοκυτταρικών 21

υποπληθυσµών σε συστηµατικά νοσήµατα όπως η λεϊσµανίωση (Williams 1997, Chabanne και συν 2000, Affolter και Cannon 2000). Σύµπλεγµα TCR-CD3 To σύµπλεγµα του υποδοχέα του Τ-λεµφοκυττάρου (T cell receptor, TCR) αποτελείται από τον αντιγονικό υποδοχέα και το µόριο CD3 και εκφράζεται µόνο στα ώριµα Τ-λεµφοκύτταρα (Day 1999, Tizard 2000, Brown και συν 2002). Ο TCR είναι ετεροδιµερής και αποτελείται από τις αβ ή γδ γλυκοπρωτεϊνικές αλυσίδες. (Moore και συν 1998, Affolter 2000a). Το αβ ή γδ τµήµα δίνει τη ικανότητα στα λεµφοκύτταρα να αναγνωρίζουν τα αντιγονικά πεπτίδια που συνδέονται µε τα µόρια που κωδικοποιεί το µείζον σύµπλεγµα ιστοσυµβατότητος (MHC) (Yager 1993, Τizard 2000, Affolter 2000a). H ενεργοποίηση των Τ-λεµφοκυττάρων, εξαρτάται από πέντε άλλες διαµεµβρανικές πρωτεΐνες που συνδέονται µη-οµοιοπολικά, όχι µόνο µεταξύ τους αλλά και µε τις γλυκοπρωτεΐνες αβ ή γδ του TCR, και επιτρέπουν τη µετάδοση µηνυµάτων στο εσωτερικό του κυττάρου (Janeway και Travers 1997, Moore και συν 1998, Affolter 2000a, Moore και συν 2000). Τρεις από τις πρωτεΐνες αυτές (CD3γ, CD3δ, CD3ε) συνιστούν το σύµπλεγµα CD3 και είναι απαραίτητες για τη συγκρότηση και τη µεταφορά του TCR στην κυτταρική µεµβράνη (Janeway και Travers 1997, Τizard 2000, Moore και συν 2000) (Σχήµα 1). Υπάρχουν και άλλες δύο (ζ, η) που εκφράζονται σε πολυάριθµες θέσεις φωσφορυλίωσης µέσα στο κύτταρο (Χαραλαµπίδης 1994, Abbas και συν 1997, Tizard 2000). 22

ΑΠΚ Τ-λεµφοκύτταρο Σχήµα 1: Σύµπλεγµα TCR-CD3. ΑΠΚ: αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο MHC: µόριο µείζονος συµπλέγµατος ιστοσυµβατότητας Ag: αντιγονικό πεπτίδιο CD4: µόριο CD4 CD8: µόριο CD8 α και β: ετεροδιµερές του Τ-λεµφοκυτταρικού υποδοχέα δ,γ,ε,ζ και η: γλυκοπρωτεϊνες του συµπλέγµατος CD3 Λόγω της υψηλής ειδικότητας του TCR, η ποικιλοµορφία του είναι µεγάλη αν ληφθεί υπόψη ο απεριόριστος αριθµός εξωγενών και ενδογενών αντιγόνων που καθηµερινά έρχονται σε επαφή µε το ανοσοποιητικό σύστηµα (Janeway and Travers 1997, Affolter 2000a). Η ποικιλοµορφία αυτή επιτυγχάνεται µε τους ανασυνδυασµούς των γονιδιακών τµηµάτων V, D και J στις µεταβλητές περιοχές των γλυκοπρωτεϊνικών αλυσίδων αβ ή γδ σε κάθε Τ-λεµφοκύτταρο, µε τη βοήθεια των γονιδίων ανασυνδυασµoύ RAG-1 και RAG-2 (Κοπτόπουλος 1993, Janeway and Travers 1997, Affolter 2000a). 23

Μόριο CD4 και Th1, Th2, Th0 υποπληθυσµοί Στο σκύλο το µόριο CD4 αποτελείται από τα D1 και D2 και τα D3 και D4 πεδία που συνδέονται στενά ανά δύο µεταξύ τους σχηµατίζοντας δύο άκαµπτες ράβδους που ενώνονται στη συνέχεια µε µίσχο (Janeway και Travers 1997, Moore και συν 1998). Η κυτταροπλασµατική περιοχή του CD4 αλληλεπιδρά µε την κινάση της τυροσίνης (Lck), δίνοντας έτσι τη δυνατότητα συµµετοχής του στην µετάδοση σηµάτων στο εσωτερικό του κυττάρου (Parnes 1989, Janeway και Travers 1997, Tizard 2000). Επιπλέον το CD4 παίζει σπουδαίο ρόλο στην αλληλεπίδραση των Τ-βοηθητικών (Τh) λεµφοκυττάρων µε τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (AΠΚ) σε συνδυασµό µε µόρια του MHC-II (Bierer και συν 1989, Tizard 2000, Brown και συν 2002). Με τον τρόπο αυτό το CD4 λειτουργεί ως υποδοχέας στη µη πολυµορφική περιοχή των µορίων MHC- II (Moore και συν 1992). Το µόριο CD4 στο σκύλο εκφράζεται στα βοηθητικά Τ-λεµφοκύτταρα, τα ουδετερόφιλα και τα δενδριτικά κύτταρα του χορίου (Cobbold και συν 1994, Moore και συν 1998). Στον ποντικό, τα CD4+ Τh-λεµφοκύτταρα διακρίνονται στους υποπληθυσµούς Th1 και Th2, ανάλογα µε τις κυτταροκίνες που παράγουν (Day 1999, Affolter 2000a). Τα Th1 λεµφοκύτταρα παράγουν, µεταξύ των άλλων, την ιντερλευκίνη 2 (IL-2), την ιντερφερόνη γ (IFN-γ) και τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων-α (TNF-α), ευνοόντας έτσι την αντίδραση υπερευαισθησίας καθυστερηµένου τύπου, την ενεργοποίηση των µακροφάγων κυττάρων και την καταστροφή των ενδοκυτταρικών µικροοργανισµών (Liew και O`Donnell 1993, Jones και συν 1998, Αffolter 2000a). Τα Th2 λεµφοκύτταρα, που παράγουν τις ιντερλευκίνες IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και IL-13, βασικά ρυθµίζουν την παραγωγή αντισωµάτων από τα Β λεµφοκύτταρα, την µεταβολή του τύπου των παραγόµενων ανοσοσφαιρινών και τη φλεγµονώδη αντίδραση των ιστών απέναντι στους εξωκυτταρικούς µικροοργανισµούς (Liew και O`Donnell 1993, 24

Jones και συν 1998, Αffolter 2000a). Τα Th0 λεµφοκύτταρα, που παράγουν κυτταροκίνες µικτού τύπου (IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ, TNF-α), ρυθµίζουν τις αντιδράσεις τόσο της κυτταρικής όσο και χυµικής ανοσίας (Αffolter 2000a, Affolter 2000b, Tizard 2000). Η διαφοροποίηση των παρθένων Τh-λεµφοκυττάρων σε Th1, Th2 ή Th0, εξαρτάται όχι µόνο από τον τύπο των κυτταροκινών (Mosmann και συν 1986, Fiorentino και συν 1989), αλλά και από τον τύπο, τη συγκέντρωση, τον τρόπο παρουσίασης του αντιγόνου, την υπερσκέλιση των Β7-1 από τα Β7-2 συνδιεγερτικά µόρια και από τα υπεύθυνα γονίδια (Αffolter 2000a). Για το σκύλο, το θέµα των υποπληθυσµών των CD4+ Τh-λεµφοκυττάρων δεν είναι τόσο ξεκάθαρο όσο στον ποντικό, αν και υπάρχουν αρκετά κοινά στοιχεία (Affolter 2000α). Μόριο CD8 To µόριο CD8 είναι γλυκοπρωτείνη που εκφράζεται στα κυτταροτοξικάκατασταλτικά Τ-λεµφοκύτταρα και αποτελείται από δύο αλυσίδες (α, β) που µεταξύ τους συνδέονται µε δισουλφιδικό δεσµό στο ετεροδιµερές CD8αβ ή το οµοιοδιµερές CD8αα (Gorman και συν 1994, Janeway και Travers 1997, Abbas και συν 1997, Moore και συν 1998). Μία από τις κύριες ιδιότητες του CD8 είναι η σταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης των κυτταροτοξικών-κατασταλτικών Τ- λεµφοκυττάρων µε τα κύτταρα-στόχους που παρουσιάζουν το αντιγόνο µε το MHC-I (Roitt 1991, Janeway και Travers 1997). Επιπλέον, το CD8 παίζει σηµαντικό ρόλο στην µετάδοση µηνυµάτων στο εσωτερικό του κυττάρου µε τη βοήθεια της ενδοκυτταροπλασµικής κινάσης της τυροσίνης p56 lck (Parnes 1989, Moore και συν 1992, Tizard 2000). Κύρια λειτουργία των CD8+ Τ-λεµφοκυττάρων είναι η αναγνώριση των ενδογενών αντιγόνων που παρουσιάζονται µε το MHC-I (Parnes 1989, Affolter 2000a, Brown και συν 2002). Τα κυτταροτοξικά Τ-λεµφοκύτταρα προκαλούν τη 25

λύση του κυττάρου-στόχου µε την απελευθέρωση της περφορίνης και διαφόρων ενζύµων ή την απόπτωσή του µέσω της σύνδεσης των Fas-FasL (Affolter 2000α). Το Fas είναι διαµεµβρανική τύπου 1 πρωτεϊνη του TNF και του αυξητικού παράγοντα των νεύρων (Neuron growth factor, NGF) και εκφράζεται στα µακροφάγα κύτταρα ή σε άλλα κύτταρα-στόχους (Janeway και Travers 1997). Η πρωτεϊνη αυτή χρησιµεύει ως υποδοχέας του Fas-συνδέτη (FasL), που εκφράζεται από τα κυτταροτοξικά CD8+ Τ-λεµφοκύτταρα (Abbas και συν 1997, Janeway και Travers 1997). Μόριο CD45RA Το CD45 είναι δοµική γλυκοπρωτείνη της κυτταρικής µεµβράνης όλων των ειδών των λευκοκυττάρων, που παίζει σηµαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των Τ-λεµφοκυττάρων (Thomas 1989). Το µόριο αυτό συµµετέχει στην µετάδοση µηνυµάτων µέσω του TCR, χωρίς ακόµη να έχει διευκρινιστεί πλήρως ποιος είναι ο συνδέτης και ποιος ο µηχανισµός δράσης των διαφόρων ισοτύπων του (Barclay και συν 1992). Οι τελευταίοι, καθορίζονται ως CD45RΑ για τα παρθένα Τ-λεµφοκύτταρα και ως CD45RΟ για τα Τ-λεµφοκύτταρα µνήµης (Cobbold και Metcalfe 1994, Holmes και Lunn 1994, Janeway και Travers 1997, Affolter 2000b). Για το διαχωρισµό των διαφόρων υποπληθυσµών των Τ- λεµφοκυττάρων χρησιµοποιούνται µονοκλωνικά αντισώµατα κατά συγκεκριµένων επιτόπων του CD45 (Sanders και συν 1988, Cobbold και Metcalfe 1994). MHC-Ι και MHC-II Το MHC είναι ένα σύνολο πολύµορφων γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν την παραγωγή γλυκοπρωτεϊνών οι οποίες εκφράζονται στην επιφάνεια των εµπύρηνων κυττάρων και ονοµάζονται MHC-µόρια. Ο βασικός ρόλος των µορίων αυτών συνίσταται στο σχηµατισµό συµπλέγµατος µε πεπτίδια των επεξεργασµένων πρωτεϊνικών αντιγόνων από τα ΑΠΚ και τη παρουσίασή τους 26

στην επιφάνειά τους (Κοπτόπουλος 1993). Στο σκύλο, τo MHC συνιστά την οµάδα γονιδίων DLA στο χρωµόσωµα 12 (Day 1999) και παίζει σηµαντικό ρόλο στις ανοσολογικές αλληλεπιδράσεις τόσο µεταξύ των λεµφοκυττάρων όσο και µεταξύ των τελευταίων και των ΑΠΚ (Abbas και συν 1997, Day 1996). Εξαιτίας των πολυάριθµων γονιδιακών θέσεων, παράγεται µεγάλος αριθµός απλοτύπων του MHC (Day 1999). Κάθε µόριο MHC-I, αποτελείται από ένα κωδικοποιηµένο πολυπεπτίδιο και τη β 2 µικροσφαιρίνη, ενώ το MHC-II από δύο (α+β) πολυπεπτίδια (Roitt 1991, Κοπτόπουλος 1993, Χαραλαµπίδης 1994). Επειδή το MHC-I παρουσιάζει στην επιφάνεια δείγµα από το εσωτερικό του κυττάρου, όταν πρόκειται για ενδοκυτταρικά αλλοαντιγόνα (π.χ ιοί, πρωτόζωα) η αναγνώριση θα γίνει από τα κυτταροτοξικά Τ-λεµφοκύτταρα µε τελικό σκοπό την καταστροφή των µολυσµένων κυττάρων (Day 1999, Affolter 2000a). Το MHC-II εκφράζεται µόνο από τα ΑΠΚ, αποστολή των οποίων είναι η παρουσίαση των επεξεργασµένων αντιγόνων στα Τh-λεµφοκύτταρα, ώστε να εξασφαλιστεί η διέγερση της χυµικής και της κυτταρικής ανοσίας (Day 1999, Tizard 2000, Brown και συν 2002). Ειδικότερα, το MHC-II παραλαµβάνει και παρουσιάζει στην επιφάνεια του κυττάρου το αντιγονικό κλάσµα που θα προκύψει από την φαγοκυττάρωση και την επεξεργασία του αντιγόνου από τα ΑΠΚ (Abbas και συν 1997, Day 1999). Στο σκύλο, σε αντίθεση µε τα άλλα είδη ζώων, το MHC-II µπορεί να εκφραστεί από τα ενεργοποιηµένα ή τα ανενεργά Τ-λεµφοκύτταρα και τα Β-λεµφοκύτταρα (Holmes και Lunn 1994, Cobbold και συν 1994). Σε φυσιολογικές καταστάσεις το MHC-I εκφράζεται από όλα τα εµπύρηνα κύτταρα του σώµατος, ενώ η έκφραση του MHC-II περιορίζεται στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος και ιδιαίτερα στα κύτταρα του Langerhans (LC), τα δενδριτικά κύτταρα και τα Β-λεµφοκύτταρα (Day 1996, Abbas και συν 1997). Μόριο CD21 27

Το µόριο CD21, που αποτελεί δοµική γλυκοπρωτεΐνη της κυτταρικής µεµβράνης, εκφράζεται στα Β-λεµφοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα του βλαστικού κέντρου των λεµφογαγγλίων (Cobbold και συν 1994, Moore και συν 1998) και κωδικοποιείται από γονίδιο της οµάδας του συµπληρώµατος (Janeway και Travers 1997). Το µόριο αυτό, που αναγνωρίζει το µόριο C3dg του συµπληρώµατος, αποτελεί σηµαντικό µέρος του συνυποδοχέα των Β- λεµφοκυττάρων (Ahearn και Fearon 1989, Abbas και συν 1997, Moore και συν 1998). Η ένωση του C3dg µε το CD21 εξασφαλίζει τη σύνδεση του Β αντιγονικού υποδοχέα µε τον συνυποδοχέα, αυξάνοντας έτσι κατά 100 ως 10000 φορές την ευαισθησία του Β-λεµφοκυττάρου απέναντι στο αντιγόνο που αναγνωρίζει (Ahearn και Fearon 1989, Janeway και Travers 1997).. Η ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΣΤΗ Leishmania sp. Οι σχετικές µελέτες πάνω στην ανοσολογική ανταπόκριση του σκύλου στη Leishmania infantum, είναι λίγες, σε σύγκριση µε τον ποντικό και τον άνθρωπο καθώς και µε τα άλλα είδη του παρασίτου (Pinelli και συν 1999, Pinelli και συν 1999c). 28

Μετά τον ενοφθαλµισµό στο δέρµα, οι µετακυκλικές προµαστιγωτές µορφές του παρασίτου φαγοκυτταρώνονται µέσα σε λίγες ώρες από τα µακροφάγα κύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα του χορίου, µέσα στα οποία µπορούν να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν (Ferrer 1992, Χαραλαµπίδης 1994, Fraile και Gonzalez 1995, Killick-Kendrick 2002). Σε πειραµατική µόλυνση του σκύλου µε L.infantum, µακροφάγα παρασιτούµενα παρατηρήθηκαν µόλις 3,5 ώρες µετά τον ενδοδερµικό ενοφθαλµισµό (Santos- Gomes και συν 2000). Στους µηχανισµούς που επιτρέπουν την επιβίωση του παρασίτου στον ξενιστή περιλαµβάνονται η παθητική προστασία του παρασίτου από αντιλεϊσµανιακούς παράγοντες µέσα στα ασφαλή κύτταρα-στόχους, η ενεργητική καταστολή της σύνθεσης του οξειδίου του αζώτου (NO) στα µακροφάγα, η τροποποίηση των προστατευτικών κυτταροκινών και η αναστολή της έκφρασης των συνδιεγερτικών µορίων από τα ΑΠΚ µε αποτέλεσµα τη µη ενεργοποίηση των ειδικών Τ-λεµφοκυττάρων. (Lucena και συν 1994, Reiner 1994, Χαραλαµπίδης 1994, Bogdan και Rollinghoff 1998, Brandonisio και συν 2000). Σχετικά πρόσφατα διαπιστώθηκε η παρουσία των αµαστιγωτών µορφών της L.infantum και στους ινοβλάστες, στο χόριο του δέρµατος σκύλων µε λεϊσµανίωση (Rodriguez και συν 1996). Σε in vitro µελέτες σε ποντικούς, βρέθηκε ότι οι ινοβλάστες µπορούν να φαγοκυτταρώσουν αλλά όχι να σκοτώσουν τη Leishmania major λόγω της έλλειψης του ενζύµου συνθετάση του οξειδίου του αζώτου (Moll 1996). Είναι άγνωστο αν στο σκύλο οι ινοβλάστες, που θα µπορούσαν να λειτουργήσουν και ως ΑΠΚ (Tizard 2000), στερούνται το ένζυµο αυτό. Τα µακροφάγα παίζουν πρωταρχικό ρόλο, όχι µόνο γιατί φαγοκυτταρώνουν τις λεϊσµάνιες, αλλά και γιατί οι αντιγονοπαρουσιαστικές τους ικανότητες επιτρέπουν την ενεργοποίηση των ειδικών Τ-λεµφοκυττάρων (Moll 1993, Tapia και συν 1994, Pinelli 1999α). Στον ποντικό και το σκύλο είναι γνωστό ότι παράλληλα µε την κινητοποίηση των µακροφάγων τα LC πιθανότατα 29

µεταναστεύουν από την επιδερµίδα ή φθάνουν µε την κυκλοφορία του αίµατος στο χόριο για να παραλάβουν τα παράσιτα µε τη βοήθεια των IL-1β και TNF-α ή των διαφόρων επιφανειακών µορίων του παρασίτου (Moll 1993). Συγκεκριµένα, ενώ τα µακροφάγα χρησιµεύουν παράλληλα ως τόπος αναπαραγωγής και καταστροφής του παρασίτου, τα LC φαίνεται ότι το µεταφέρουν στα επιχώρια λεµφογάγγλια, όπου αλληλεπιδρούν µε τα Τ- λεµφοκύτταρα (Moll 1993, Saint-Andre Marchal και συν 1997). Κατά τη διάρκεια της µετανάστευσης, τα LC αναπτύσσουν ισχυρές αντιγονοπαρουσιαστικές ιδιότητες προκειµένου να ενεργοποιήσουν όχι µόνο τα ειδικά αλλά και τα παρθένα Τ-λεµφοκύτταρα (Kripke και συν 1990, Μoll 1993). Τα τελευταία µεταναστεύουν µε το αίµα στο σηµείο του ενοφθαλµισµού, όπου έρχονται σε επαφή µε τα µολυσµένα µακροφάγα και τα παραµένοντα LC που τους παρουσιάζουν τα επεξεργασµένα αντιγόνα του παρασίτου (Moll 1993). Τα ειδικά Τ-λεµφοκύτταρα µέσω των κυτταροκινών που παράγουν, ρυθµίζουν ανάλογα την παραπέρα αντιλεϊσµανιακή δράση των µακροφάγων (Moll 1993, Saint-Andre Marchal και συν 1997, Fondevila και συν 1997) (Σχήµα 2). Η ανθεκτικότητα του σκύλου στη φυσική µόλυνση µε L. infantum, φαίνεται να οφείλεται στην αποτελεσµατική ενεργοποίηση της κυτταρικής ανοσίας µε την παραγωγή των προστατευτικών κυτταροκινών IL-2, IL-12, IFN-γ και TNF (Pinelli και συν 1994b, Ruitenberg και συν 2001, Ferrer 2002). Οι κυτταροκίνες αυτές ενεργοποιούν τα µακροφάγα για την παραγωγή ΝΟ που τελικά θα εξουδετερώσει το παράσιτο (Pinelli και συν 2000), όπως εξάλλου έχει αποδειχθεί στον ποντικό (Locksley και Scott 1991) και τον άνθρωπο (Kemp και συν 1996) (Σχήµα 3). Σε σκύλους µε ασυµπτωµατική λεϊσµανίωση έχουν αποµονωθεί ειδικά κατά της L. infantum, κυτταροτοξικά CD8+ Τ-λεµφοκύτταρα, τα οποία εφόσον επαναδραστηριοποιηθούν in vitro παράγουν IFN-γ προκαλώντας έτσι τη λύση των µολυσµένων µακροφάγων (Pinelli και συν 1994b). Τα στοιχεία αυτά 30

δείχνουν ότι οι προστατευτικές κυτταροκίνες των παραπάνω λεµφοκυττάρων παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη προστατευτικής ανοσίας (Ruitenberg και συν 2001). Σε σκύλους όµως που παρουσιάζουν συµπτώµατα της νόσου τα µολυσµένα µακροφάγα παρουσιάζουν µειωµένη έκφραση των Β7 συνδιεγερτικών µορίων που είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των ειδικών Τh1- λεµφοκυττάρων (Pinelli και συν 1999α) (Σχήµα 4). Ο παραπάνω µηχανισµός έχει επιβεβαιωθεί και στη λεϊσµανίωση του ποντικού (Saha και συν 1995) και του ανθρώπου (Kaye και συν 1994). Η µόλυνση µε L.infantum καλλιεργειών µονοκυττάρων από φυσιολογικούς σκύλους είχε σαν αποτέλεσµα την απώλεια της ικανότητας παραγωγής ΝΟ από τα κύτταρα αυτά (Panaro και συν 1998). Στον ποντικό, τα Th2 λεµφοκύτταρα ενεργοποιούνται περισσότερο από την µειωµένη έκφραση των Β7 µορίων στα µακροφάγα κύτταρα (Chakkalath και Titus 1994), ενώ στο σκύλο παραµένει άγνωστο αν συµβαίνει κάτι ανάλογο. Σε πρόσφατη µελέτη ανιχνεύθηκαν τύπου Th2 κυτταροκίνες µετά από την διέγερση των µονοκυττάρων του αίµατος από συµπτωµατικά ζώα (Pinelli και συν 1999c), ενώ βρέθηκαν µεταλλάξεις του γονιδίου RAMP1-το οποίο ελέγχει µία πρωτεϊνη µεταφοράς ιόντων στο φαγόσωµα µε αποτέλεσµα να επηρρεάζει την αναπαραγωγή του παρασίτου-στα ζώα αυτά (Altet και συν 2002). Επισηµαίνεται ότι στα τελευταία, όπου η ενδοδερµική δοκιµή µε λεϊσµανίνη ήταν αρνητική, οι παραγόµενες κυτταροκίνες στο δέρµα ήταν του τύπου Th2 (Ruitenberg και συν 2001). Επιπλέον, η in vitro ικανότητα πολλαπλασιασµού των Τ-λεµφοκυττάρων στα ζώα αυτά ήταν µειωµένη όταν διεγέρθηκαν µε αντιγόνα της L.infantum (Pinelli και συν 1994a, Bourdoiseau και συν 1997b). Σε ποντικούς που µολύνθηκαν µε L.infantum, η IL-12 βρέθηκε να ευνοεί τη διέγερση των Th1-λεµφοκυττάρων και η IL-4 των Th2 (Sypek και συν 1993, London και συν 1998). Για τον καθορισµό της αντίδρασης αυτής 31

ενοχοποιήθηκαν η κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήµατος (Gazzinelli και συν 1998), και η δόση του παρασιτικού ενοφθαλµίσµατος (Menon και Bretscher 1998). Πειραµατικές µελέτες µε την L. major σε ποντικούς έδειξαν ότι αν και η Th1 αντίδραση παρείχε αποτελεσµατική προστασία, η ταυτόχρονη ενεργοποίηση της Th2 αντίδρασης καταργούσε το ευεργετικό αποτέλεσµα της πρώτης (Sjolander και συν 1998). Στη ΛΣ από L.infantum παραµένει άγνωστο αν η IL-12 µπορεί να οδηγήσει σε τύπου Τh1 αντίδραση ή αν το µέγεθος του ενοφθαλµίσµατος θα οδηγήσει τελικά σε κυτταρική (Th1), χυµική (Th2) ή µικτή (Th0) αντίδραση. Υπάρχουν όµως ενδείξεις ότι ο σκύλος ενεργοποιεί παράλληλα τα Th1 και τα Th2 λεµφοκύτταρα, γεγονός που θα µπορούσε να εξηγήσει την ποικιλοµορφία της κλινικής εικόνας και της εξέλιξης της νόσου (Pinelli και συν 1999α). 32