1 5. LIMFOCITELE Limfocitele sunt celule cu rol esenţial în cadrul sistemului imun, fiind implicate în imunitatea adaptativă (specifică), cu roluri importante atât în răspunsul imun celular cât şi în cel umoral. Limfocitele sunt singurele celule care prezintă toate trăsăturile caracteristice sistemului imun adaptativ: diversitate specificitate memorie imunologică recunoaştere self / nonself. Majoritatea limfocitelor secretă diverse molecule proteice numite citokine, care sunt hormoni cu rol imunomodulator. Au fost descrise şi limfocite care aparţin sistemului imun înnăscut - celulele natural killer. Toate celelalte celule ale sistemului imunitar au roluri accesorii în imunitatea adaptativă (captează şi prelucrează antigenul, activează limfocitele, secretă diverse molecule cu rol imunoefector etc.). Din punct de vedere histologic, limfocitele fac parte din ţesutul limfoid. Sistemul imun este format din organe şi ţesuturi distribuite în diverse regiuni ale corpului. Există: organe limfoide primare - în care se formează şi se maturează limfocitele. organe limfoide secundare - organele care captează antigenul şi unde există un mediu favorabil interacţiunii între limfocite şi antigene. Organele limfoide primare sunt măduva hematogenă şi timusul. Măduva hematogenă este sursa tuturor limfocitelor care populează ţesuturile limfoide. Organele limfoide secundare sunt: Splina Ganglionii limfatici Ţesutul limfoid asociat mucoaselor MALT (mucous associated lymphoid tissue) Ţesutul limfoid de la nivel cutanat SALT (skin associated lymphoid tissue). Limfocitele reprezintă 20-40% din totalul leucocitelor din sânge, sau în cifre absolute între 1500-3000/mmc, în medie 2500/mmc. La nivelul limfei, aproximativ 99% dintre celule sunt limfocite. Limfocitele au capacitatea de a migra în ţesuturi şi organele limfoide. LIMFOCITE IMPLCATE ÎN IMUNITATEA ADAPTATIVĂ Limfocitele apar la microscopul optic, pe frotiul colorat policromatic (Giemsa sau Wright), cu două morfologii: limfocite mici şi mari. Limfocitele mari, numite şi large granular lymphocytes sau LGL, reprezintă aproximativ 5-10 % din totalul limfocitelor. Din această clasă cele mai importante sunt celulele NK (natural killer), cu rol în imunitatea înnăscută (nespecifică), îndreptată contra celulelor infectate viral şi tumorale. Limfocitele implicate în imunitatea specifică (adaptativă) sunt cele mici. Această categorie cuprinde limfocitele T (LT) şi limfocitele B (LB). Există unele tipuri de LB şi LT care aparţin sistemului imun înnăscut (limfocitele B-1 şi limfocitele T γδ).
2 Limfocitele T sau B care nu au venit în contact cu antigenul se numesc naive. Limfocitele naive sunt celule aflate în faza G0 a ciclului celular şi prezintă următoarele caracteristici: Au diametrul de 6-7 microni. Au un nucleu ovoid sau reniform, care ocupă 90% din suprafaţa celulei şi prezintă cromatină nucleară densă. Perinuclear apare un inel de citoplasmă colorat albastru deschis. Citoplasma conţine puţine organite celulare şi 5-15 granulaţii azurofile. Reticulul endoplasmic este slab dezvoltat. Interacţiunea cu antigenul determină activarea limfocitelor naive, cu intrarea în ciclul celular prin progresia către faza G1 şi apoi S, G2 şi M. Pe măsură ce avansează în ciclul celular, diametrul se dublează (14-15 microni) şi se transformă în limfoblaşti. Limfoblaştii sunt celule metabolic active, cu organite dezvoltate. Raportul între citoplasmă şi nucleu este modificat în favoarea citoplasmei. Limfoblaştii proliferează şi în final se diferenţiază în celule efectoare sau în celule de memorie. Celulele efectoare contribuie la eliminarea antigenului: Plasmocitele sunt celulele rezultate prin diferenţierea şi maturarea limfocitelor B. Plasmocitele sintetizează anticorpi. Au un reticulul endoplasmic abundent, care facilitează rata înaltă de sinteze proteice, şi un aparat Golgi bine reprezentat. Celulele efectoare de pe linia T includ limfocitele T helper (LTH) care secretă citokine şi limfocitele T citotoxice (LTC). Celulele efectoare au o durată de viaţă relativ redusă (zile săptămâni). Unii dintre limfoblaştii B şi T se transformă în celule de memorie. Acestea sunt responsabile de imunitatea pe termen lung faţă patogenul respectiv. Limfocitele de memorie sunt similare morfologic cu limfocitele inactive, de care se deosebesc prin prezenţa sau absenţa anumitor receptori membranari. Limfocitele mici se împart funcţional în LB şi LT. Aceste două tipuri de limfocite nu se pot diferenţia morfologic, prin microscopie optică, ci funcţional, prin testele de rozetare: Dacă se pun în contact limfocitele cu hematii de oaie sau berbec, numai LT se leagă de aceste hematii, adică rozetează. La microscop se vizualizează mici conglomerate celulare formate dintr-un LT central înconjurat de o coroană de hematii de oaie, care se numesc rozete E. Dacă se pun în contact limfocitele cu hematii de şoarece, numai LB se leagă de aceste hematii, producându-se rozete M. Diferitele linii limfocitare pot fi diferenţiate pe baza existenţei pe suprafaţa membranei a unor receptori specifici. Aceşti receptori pot recunoscuţi de anticorpi monoclonali specifici. Toţi anticorpii care reacţionează cu o anumită moleculă de membrană formează un grup numit cluster of differentiation (CD). Până acum au fost descoperiţi aproximativ 200 de receptori, care sunt folosiţi pentru caracterizarea fenotipică a diferitelor limfocite. LIMFOCITELE T Limfocitele T (LT) reprezintă funcţional o populaţie celulară heterogenă. Au fost numite limfocite T pentru că se maturează în timus. Clasele de LT seamănă morfologic şi toate rozetează cu hematiile de oaie. Ele se diferenţiază numai prin receptorii sau markerii de suprafaţă, care se evidenţiază cu anticorpi monoclonali.
3 LT sunt produse în măduva hematogenă şi se maturează în timus. Timusul stimulează dezvoltarea doar a limfocitelor care au pe membrană receptori care recunosc structuri non-self, iar restul sunt eliminate. Selecţia realizată de timus este foarte riguroasă - aproximativ 95% din totalul limfocitelor care au migrat din maduvă sunt distruse prin apoptoză. Timusul eliberează limfocite T mature, dar care nu au venit încă în contact cu antigenul (limfocite naive). LT naive sunt transportate de către circulaţia sangvină la organele limfoide periferice. La acest nivel există venule al căror perete prezintă o structură specială (HEV - high endothelial venules), care permite trecerea LT. Astfel, LT naive migrează în circulaţia limfatică, prin intermediul căreia ajung din nou în cea sangvină. Astfel se realizează un circuit prin care LT sunt intens recirculate, pentru a creşte probabilitatea întâlnirii cu antigenul specific. Limfocitele T naive au o durată de viaţă de câţiva ani. Sunt celule inactive, cu cromatină condensată, citoplasmă redusă şi activitate metabolică scăzută. O caracteristică definitorie pentru cele mai multe LT este faptul că nu pot recunoaşte antigene libere, în stare nativă. LT recunosc doar antigene prezentate de diverse celule ale sistemului imun. Aceste celule prezintă antigene cu ajutorul unor structuri specializate aflate pe membrană, numite molecule ale complexului major de histocompatibilitate (major histocompatibility complex - MHC). Din punct de vedere funcţional, limfocitele T se împart în: Limfocite T citotoxice (LTC) - au pe suprafaţă receptorul specific CD8. Recunosc peptidele antigenice rezultate din degradarea agenţilor patogeni intracelulari, peptide care sunt prezentate către LT citotoxice împreună cu moleculele complexului major de histocompatibilitate de tip I (MHC I). Rolul acestor limfocite este de a distruge celulele ţintă infectate. Limfocitele T helper (LTH) - prezintă pe suprafaţă receptori CD4. Pot să recunoască peptide antigenice care rezultă în urma prelucrării agenţilor patogeni extracelulari, peptide prezentate împreună cu molecule MHC II. Limfocitele T supresoare (LTS) - reprezintă o subpopulaţie de limfocite T a cărei existenţă este controversată. Aceste limfocite au efecte inhibitorii în cadrul răspunsului imun. Receptorii de suprafaţă ai LT mature Receptorii de suprafaţă ai limfocitelor T sunt: Receptorii de recunoaştere a epitopului - reprezintă principala cale de activare a LT. Receptorul pentru antigen al limfocitelor T este denumit TCR (T -cell receptor). TCR este cuplat pe membrană cu receptorul CD3, cu care formează un complex funcţional. Complexul TCR-CD3 recunoaşte epitopul şi este prezent pe toate subtipurile de LT. CD4 şi CD8 sunt coreceptori care recunosc moleculele MHC aşezate pe celele prezentatoare de antigen (APC) sau pe celulele somatice. Receptori cu rol accesor în activarea LT. Receptorii cu rol în adeziunea intercelulară permit LT să adere intim de alte celule. Receptorii cu rol în recunoaşterea epitopului Un limfocit prezintă pe membrană un număr de aproximativ 10 5 TCR. Receptorul pentru antigen al LT face parte din superfamilia imunoglobulinelor. TCR este asociat pe membrană cu receptorul CD3, care are rolul de a transmite semnale de activare în interiorul celulei. Fiecare receptor TCR este format din 2 lanțuri proteice α și β. Fiecare dintre lanţuri are un segment intracitoplasmatic foarte scurt (5-12 aminoacizi situaţi la capătul C - terminal al
4 lanţului), un segment transmembranar (21-22 aminoacizi), şi câte două domenii extracelulare (60-75 aminoacizi). Lanţurile sunt aşezate faţă în faţă: Domeniile dinspre exterior sunt variabile şi se notează cu V. Domeniile situate proximal de membrană sunt constante şi se notează cu C. Fiecare domeniu variabil are, la rândul său, trei regiuni hipervariabile (similare regiunilor determinante ale complementarităţii ale imunoglobulinelor - CDR). Lanţul β prezintă în plus încă o regiune hipervariabilă, care însă nu este implicată în recunoaşterea antigenului. Cele două domenii variabile se asociază şi formează o cavitate numită situsul de recunoaştere pentru antigen, sau paratop, asemănător cu paratopul imunoglobulinelor. Genele care codifică domeniile variabile ale TCR seamănă structural cu genele domeniilor variabile ale imunoglobulinelor, iar variabililitatea este de asemenea obţinută prin procese de recombinare genică. Situsurile de recunoaştere nu se leagă de molecula de antigen pe toată lungimea. Contactele sunt punctiforme, prin 6 secvenţe scurte de aminoacizi la nivelul regiunilor hipervariabile (CDR): CDR1 şi CDR2 se leagă cu domeniile polimorfe ale MHC (1 + 2 ale MHC I şi 1 + 1 în cazul MHC II). CDR3 se leaga de epitop, având structuri complementare. Regiunea dintre buclele constante C şi inserţia pe membrana limfocitară a lanţurilor TCR se numeşte zona balama a TCR. Ea dă mobilitatea TCR, foarte importantă pentru contactul lor cu moleculele MHC. Recunoaşterea epitopului de către LT are câteva caracteristici generale: TCR recunosc un epitop ca non-self după structura liniară sau primară. TCR nu pot recunoaşte antigenele native, ci numai fragmentele peptidice prelucrate de celulele APC. TCR recunosc epitopii numai dacă aceştia sunt prezentaţi în complex cu moleculele prezentatoare MHC, de pe membranele APC sau a celulelor somatice. Funcţiile receptorilor TCR sunt: TCR recunosc antigenul. TCR declanşează stimulii activatori pentru LT. TCR nu poate să transmită singur semnalul activator pentru că TCR are un segment intracitoplasmatic foarte scurt, iar enzimele care activează LT sunt aşezate profund în citoplasma LT. De aceea transducţia semnalului se face prin intermediul receptorului CD3. CD3 este un receptor membranar cu structură complexă, aşezat lângă receptorul TCR. CD3 este o moleculă accesorie, cu rol de transmitere intracelulară a semnalelor activatoare determinate de interacţiunea TCR - antigen. Coreceptorii CD4 şi CD8 În funcţie de prezenţa pe suprafaţa membranei a coreceptorilor CD4 sau CD8, limfocitele T se împart în: LT CD4 - majoritatea limfocitelor care prezintă pe suprafaţă CD 4 are funcţia de LT helper. LT CD 4 pot recunoaşte doar antigenul care este prezentat împreună cu molecule MHC II. LT CD8 - cele mai multe limfocite care au pe suprafaţă acest coreceptor funcţionează ca LT citotoxice. LT CD8 recunosc peptide antigenice prezentate împreună cu MHC I. CD4 este un monomer glicoproteic cu o greutate moleculară de aproximativ 55 kda. Segmentul extracelular prezintă 4 domenii, iar segmentul intracelular este lung şi bogat în resturi de serină. Prin bucla exterioară N-terminală, CD4 se leagă de domeniul monomorf al MHC II, care este domeniul alfa2. Segmentul intracitoplasmatic participă la activarea metabolică a LTH, prin activarea unor enzime intracelulare.
5 CD4 este şi receptorul de care se ataşează virusul HIV. CD 8 este un coreceptor dimeric formată din două lanţuri: α/β sau α/α. Fiecare lanţ prezintă un segment extracelular, transmembranar şi intracitoplasmatic. Cele două segmente extracelulare au câte un domeniu. Cele două domenii se asociază şi au un aspect immunoglobulin-like. Ele participă la cooperarea dintre LTC şi APC. În timpul cooperării, segmentul extracelular al CD8 se leagă de domeniul monomorf al MHC I, care este alfa3. Segmentul intracitoplasmatic al CD8 este foarte lung. El participă la activarea metabolică a LTC prin activarea unor enzime intracelulare. Receptorii cu rol accesor Pe suprafaţa limfocitului T există molecule care contribuie suplimentar la activarea acestuia, prin intreacţiunea cu liganzi corespunzători de pe suprafaţa APC sau celulelor ţintă: CD28 și CD45. O parte dintre aceşti receptori au rol şi în transmiterea intracelulară a semnalului activator. Receptorii de adeziune intercelulară Aceşti receptori permit stabilirea de contacte între LT şi APC sau celulele somatice şi permit cooperarea dintre ele. Principalii receptori implicaţi în aderarea LT sunt: LFA1, CD2, VLA. LFA1 sau antigenul asociat funcţiei limfocitare face parte din familia integrinelor. Integrinele sunt receptori celulari care permit aderarea de endoteliu, de proteinele matricei extracelulare şi de alte celule (APC, celulele ţintă). Receptorii VLA fac parte din familia integrinelor. Moleculele VLA1 şi 2 sunt caracteristice pentru LT. VLA sunt molecule de adeziune la endoteliu (VLA4) şi la proteinele din matricea extracelulară. Ele dau LT posibilitatea să se deplaseze prin ţesuturi şi să se concentreze intratisular în zona unde se găsesc antigenele. Receptorul CD2 se mai numeşte LFA2. CD2 face parte din superfamilia imunoglobulinelor şi se găseşte pe membrana tuturor LT şi pe NK. Moleculele de adeziune au o serie de funcţii esenţiale pentru răspunsul imun: Prin aceste molecule LT stabilesc permanent contacte cu APC sau cu celulele somatice pe care le controlează dacă prezintă sau nu antigene. Contactele sunt antigen-independente, adică se fac indiferent dacă APC sau celula somatică prezintă sau nu antigene pe suprafaţă. Cuplurile de adeziune LFA1-ICAM1 şi CD2-LFA3 au rol în această etapă iniţială a recunoaşterii antigenice. Receptorii de adeziune nu participă direct la recunoaşterea epitopilor, dar au un rol esenţial în recunoaştere pentru că realizează un contact intim între LT şi APC. Contactul se face pe suprafeţe mari de membrană şi durează mult, favorizând contactul moleculelor MHC şi TCR, care sunt aşezate în locuri diferite pe membrane şi pentru a se întâlni fac mişcări de difuzie laterală. Cuplurile de adeziune se desfac după recunoaşterea antigenelor, sau dacă celula APC sau somatică nu prezintă antigene. În acest fel LT îşi continuă circuitul prin organism, adică se face recircularea LT. Receptorul CD2 are rol şi în activarea metabolică a LT. Rolul activator al CD2 este indispensabil mai ales când concentraţia de epitopi prezentaţi spre TCR este scăzută, astfel că numai recunoaşterea epitopilor de către TCR-CD3 nu este suficientă pentru activarea LT. LIMFOCITELE B Denumirea de limfocite B provine de la bursa lui Fabricius, un organ al păsărilor, unde au fost descoperite prima dată şi care reprezintă locul unde se maturează.
6 Această denumire a fost menţinută, deoarece măduva hematogenă este organul unde se maturează la oameni (bone marrow). LB reprezintă 15-30% din totalul limfocitelor mici circulante. Ele au o serie de caractere generale: LB au durata de viaţă scurtă, de câteva săptămâni. LB sunt celule puţin recirculante, sunt cantonate în ariile burso-dependente din organele limfoide secundare - ganglionii limfatici şi splină. Limfocitele B mature se disting faţă de alte limfocite prin sinteza şi prezenţa pe membrană de monomeri de imunoglobuline (anticorp). Acestea intră în structura receptorului pentru antigen al limfocitelor B (B-cell receptor - BCR). Fiecare limfocit B prezintă aproximativ 1,5 X 10 5 molecule de BCR pe membrană. Structura BCR BCR este format din: monomeri de imunoglobuline heterodimerul Igα/Igβ Imunoglobulinele care intră în structura BCR au fost denumite mig (membrane bound immunoglobulin). Moleculele de mig au aceeaşi specificitate pentru antigen ca şi imunoglobulinele care vor rezulta în urma activării limfocitului B pe membrana căruia se află şi transformării acestuia în plasmocit. Structura anticorpilor solubili şi cea a anticorpilor aflaţi pe membrana limfocitelor B este similară, cu excepţia unei mici porţiuni de la nivelul capătului C - terminal. Toate toate clasele de imunoglobuline pot avea rol de mig, dar cel cel mai important rol îl au migm şi migd. Recunoaşterea antigenelor de către LB are unele caractere: LB recunosc epitopii dupa structura lor conformaţională, spaţială sau tridimensională. LB recunosc antigene solubile native, adică neprelucrate de celulele prezentatoare de antigen. Nu este necesară prezentarea antigenelor pe moleculele MHC. PLASMOCITELE Plasmocitele apar prin activarea LB şi diferenţierea lor terminală în urma stimulării antigenice şi de către LTH. Procesul de diferenţiere implică modificări morfologice şi imunofenotipice. LB trec prin stadiile succesive de: imunoblast B, plasmoblast, pre-plasmocit şi plasmocit. Pe parcurs celulele pierd antigenele LB de repaus şi de activare. Apar noi markeri de suprafaţă, de exemplu CD38 şi CD71 cu rol în proliferare. Diferenţele morfologice şi structurale ale plasmocitelor faţă de LB exprimă funcţia lor de sinteză şi de secreţie a imunoglobulinelor, care asigură RIU. Caracterele morfologice sunt: Au formă ovală şi diametrul între 7 şi 25 de microni. Nucleul este sferoidal, cu zone dense de heterocromatină orientată în «spiţe de roată». Citoplasma este abundentă şi intens bazofilă, datorită conţinutului mare de ARN. Citoplasma conţine reticul endoplasmic rugos abundent, cu mulţi ribozomi.
7 CELULELE NATURAL KILLER (NK) Celulele NK pot recunoaşte antigenelede pe membrana celulelor țintă prin intermediul următorilor receptori: NK-R receptori de tip lectinic FcR (recunoaştere mediată de anticorpi) Celulele NK au următoarele caractere: Au diametrul de 10-15 microni. Au mai multă citoplasmă, care conţine granulaţii dense. NK au rol în imunitatea înnăscută sau nespecifică. Intervin în primele momente ale unei infecţii virale şi elimină o parte dintre celulele self infectate. În acest mod se oferă organismului răgazul pentru proliferarea clonelor de LB şi LT antigen-specifice, care vor eradica infecţia. De asemenea, celulele NK recunosc şi distrug celulele tumorale. Şi această recunoaştere este imunologic nespecifică. Celulele natural killer au capacitatea de a sintetiza citokine care modulează răspunsul imun, cele mai importante fiind: interferonul γ interleukina 4 (IL-4) interleukina 10 (IL-10).