Lupusni antikoagulanti Martina Fink Specializirani hematološki laboratorij, Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana Google.images
Klinični kriteriji Antifosfolipidni sindrom - APS * Sistemska pridobljena avtoimuna bolezen, ki jo spremljajo venske in / ali arterijske tromboze ter komplikacije v nosečnosti. * Za potrditev diagnoze morata biti prisotna vsaj en klinični in en laboratorijski kriterij. * Prisotnost trombotičnega dogodka: venski ali arterijski. Laboratorijski kriteriji * Lupusni antikoagulanti v plazmi : podaljšan PTČ, drvvt, SCT... * Ponavljajoče prekinitve nosečnosti, prezgodnja smrt fetusa, prezgodnje rojstvo. * Anti-kardiolipinska protitelesa (IgG in / ali IgM v serumu ali plazmi v srednje ali visokem titru) ali Anti-beta2-glikoprotein-I protitelesa (IgG in / ali IgM v serumu ali plazmi). * Pozitiven rezultat ob dveh ali več preiskovanjih, ki so vsaj 12 tednov narazen in ne v času akutne bolezni (Pogosto se prehodno pojavijo tudi pri zdravih)!
Lupusni antikoagulanti - LA * Lupusni antikoagulanti so heterogena skupina antifosfolipidnih avtoprotiteles, ki so usmerjena proti negativno nabitim proteinsko fosfolipidnim kompleksom (beta-2- glikoprotein-1,kardiolipin, koagulacijski faktorji...). * LA se najpogosteje pojavljajo pri antifosfolipidnem sindromu (APS) in sistemskem lupusu eritematozusu (SLE). * Ime lupusni antikoagulanti izhaja iz metuljastega izpuščaja na obrazu bolnikov, ki spominja na obarvanost volkove dlake. Google.images
Lupusni antikoagulanti * Ime lupusni antikoagulanti je zavajujoče saj lupusni antikoagulanti v pogojih in vivo povzročajo tromboze in ne krvavitev. * V pogojih in vitro, v laboratoriju, pa opazimo podaljšanje časov koagulacije, ki so odvisni od fosfolipidov, ker ti motijo aktivacijo faktorjev IX, X in protrombina. * LA delujejo nespecifično. * LA običajno odkrijemo z uporabo koagulacijskih testov, ki so odvisni od fosfolipidov (parcialni tromboplastinski čas - PTČ, protrombinski čas (PČ), silica clotting time (SCT), kaolinski čas (KČ) in test z razredčenim Russell s Viper strupom (drvvt). * Podaljšani koagulacijski čas, ki ga ne moremo normalizrati z dodatkom normalne plazme bolnikovi, običajno opozarja na prisotnost LA.
Google.images Laboratorijske preiskave lupusnih antikoagulantov * Anti kardiolipinska protitelesa in anti β2 glikoproteinska I protitelesa večinoma določamo s testi ELISA. * Zaradi velike heterogenosti lupusnih antikoaguantov referenčna metoda (zlati standard) za določitev lupusnih antikoagulantov ne obstaja. * ISTH je pripravil priporočila za ugotavljanje lupusnih antikoagulantov (Sapporo criteria 1999, Sydney 2009 veljavna). * Laboratoriji so na osnovi ISTH priporočil pripravili algoritme za določitev prisotnosti lupusnih antikoagulantov.
ARUP laboratory QUEST laboratory Algoritmi za določitev prisotnosti lupusnih antikoagulantov. Vpogled v spletne strani laboratorijev 16. 10. 2013
Priporočila ISTH Priporočajo postopke v predanalitski, analitski in postanalitski fazi Predanalitika : čas in vrsta odvzema, ravnanje z vzorci. Analitika : izbira preiskav, izbira dodatnih preiskav. Postanalitika : podajanje rezultatov, interpretacija rezultatov.
Priporočila 1 1. Odvzem krvi pred začetkom antikoagulantne terapije ali pa ustrezen čas po njenem prenehanju. 2. Venska kri naj se odvzame v citratne svetlo modre epruvete. 3. Plazma naj se dvakrat centrifugira (št. trombocitov < 10 x 10 9 / l). 4. Če se vzorci ne analizirajo takoj, naj se hitro zamrznejo in pred uporabo hitro odtajajo. 5. Uporabi naj se vsaj dva testa, ki imata različen princip delovanja. 6. Eden od testov naj bo drvvt, drugi pa od fosfolipidov odvisen PTČ ali njemu sorodni test.
Priporočila 2 1. Rezultat določitve prisotnosti LA je pozitiven, če je vsaj eden od testov pozitiven. 2. Za mešalne teste naj se uporabi v laboratoriju pripravljen pool normalne plazme - PNP. 3. Mešalni testi naj se izvedejo v razmerju 1 : 1 (bolnikova / PNP). Mešanice pa naj se analizirajo takoj in po 1 2 h. 4. Potrditveni testi naj se izvedejo z višjimi koncentracijami fosfolipidov, kot so v presejalnih testih. 5. Rezultati naj se podajajo kot razmerje preiskovanec / PNP.
Integrirani test * Priporočila ISTH dovoljujejo tudi uporabo integriranega testa, ko se sočasno izvede presejalno in potrditveno testiranje, pri tem pa se lahko izognemo mešalnemu testu. * Rezultate se podaja kot razmerje med presejalnim in potrditvenim testom ali kot % korekcije. Google.images
Priporočila 3 določitev mejnih vrednosti 1. Mejne vrednosti presejalnih testov naj bodo določene na zdravi populaciji. 2. Mejno vrednost naj predstavlja 99 percentil vrednosti zdrave populacije. 3. Rezultati lupusnih antikoagulantov so pozitivni, ko so časi nastanka strdka daljši od mejne vrednost. 4. Tudi mejne vrednosti potrditvenih testov naj se določijo na zdravi populaciji. Izvedejo nas se s višjimi koncentracijami fosfolipidov, kot so le te v presejalnih testih. 5. Rezultati naj se podajajo kot normalizirano razmerje (preiskovanec / normalna poolirana plazma.
drvvt test test razredčenega strupa kače Russell viper 1 * Osnova testa je uporaba razredčenega strupa kače Russell s Viper, ki neposredno aktivira faktorja V in X, in tako zaobide faktor VII v ekstrinznični poti in antihemofilični faktor v intrinznični poti. * V normalni plazmi (odsotnost LA) se faktorja V in X aktivirata, kar vodi do nastanka strdka. * Pri bolnikih z LA pa antifosfolipidna avtoprotitelesa vežejo epitope fosfolipidov v reagentu in tako preprečijo nastanek strdka čas nastanka strdka je podaljšan. * Na drvvt test ne vpliva pomanjkanje faktorjev VII, VIII, IX, XI in XII ali prisotnost njihovih inhibitorjev. Google.images
drvvt test test razredčenega strupa kače Russell viper 2 * Test sestavljata dve reakcijski mešanici presejalna (screen) in potrditvena (confirm), ki se medsebojno razlikujeta v koncentraciji fosfolipidov. * V presejalni mešanici je koncentracija fosfolipidov nižja, zato v vzorcu prisotna antifosfolipidna protitelesa motijo nastanek strdka. * V reagentu potrditvenega ( confirm) testa pa je koncentracija fosfolipidov višja, kar delno nevtralizira delovanje antifosfolipidnih protiteles, zato je čas nastanka strdka pri potrditvenem testu krajši. * Na ta način se potrdi prisotnost antifosfolipidnih protiteles. * Rezultati se podajajo kot normalizirano razmerje presejalnega in potrditvenega testa LA = drvvt screen / drvvt confirm.
Silica clotting time - SCT * Silica clotting time je v osnovi parcialni trombolpastinski čas, kjer silika (silicijev dioksid SiO 2 ) nadomesti kaolin. * Koloidni raztopini SiO 2 dodamo calcij in s trombociti osiromačeno plazmo. Reagent v osnovi vsebuje tudi nizko koncentracijo fosfolipidov in je zato zelo občutljiv na prisotnost lupusnih antikoagulantov presejalni test. * V reagentu potrditvenega (confirm) testa pa je koncentracija fosfolipidov višja, kar delno nevtralizira delovanje antifosfolipidnih protiteles, zato je čas nastanka strdka pri potdritvenem testu krajši. * Na ta način se potrdi prisotnost antifosfolipidnih protiteles. * Rezultati se podajajo kot normalizirano razmerje presejalnega in potrditvenega testa LA = SCT screen / SCT confirm. Google.images
Pristop za določitev LA v SHL * Integriran pristop istočasna uporaba presejalnega in potrditvenega testa * Uporabljena testa silica clotting time (SCT) in drvvt. * Primerjava vseh rezultatov na normalno poolirano plazmo - PNP. * Podajanje rezultatov kot normalizirano razmerje R presejalni / R potrditveni R presejalni = Čas nastanka strdka bolnik Čas nastanka strdka PNP Bolnikova plazma preverjena z osnovnimi testi hemostaze PČ, TČ, PTČ, D-dimer, fibrinogen, da se izključi pomanjkanje faktorjev koagulacije in fibrinogena, ter obstoj tromboze (naše priporočilo), ker to omogoča lažjo in bolj pravilno interpretacijo rezultatov. Trenutne omejitve priprava normalne poolirane plazme - PNP.
Pristop za določitev LA v SHL Osnovni testi hemostaze? TČ PČ PTČ Fibrinogen D-dimer SCT presejalni in potrditveni test drvvt presejalni in potrditveni test
Primer rezultatov in izgled izvida Preiskava Rezultat Ref. vred. Enota P - Lupusni antikoagulanti Pozitiven Negativen Negativen Po E Mejni rezultat P - Lupusni antikoagulanti drvvt 0,8-1,2 po E (R) P - Lupusni antikoagulanti SCT 0,76-1,26 po E (R) NR (po E(R)) = R presejalnega/ R potrdilnega NR večje od 2,0 močno prisotni LA od 1,5 do 2,0 zmerno prisotni LA od 1,2 do 1,5 šibko prisoti LA manj od 1,2 LA niso prisotni Vir : Naš laboratorij, literatura in podatki reagenčnih kompletov.
Take home message * Za potrditev diagnoze antifosfolipidnega sindroma morata obstajati vsaj en klinični in en laboratorijski kriterij. * Vzorce se odvzame v neaktivni fazi bolezni, v citratno epruveto v času, ko bolnik ne uživa antikoagulantne terapije. * Pozitivne rezultate prisotnosti lupusnih antikoagulantov je potrebno potrditi po najmanj 12 tednih. * V laboratoriju je potrebno uporabiti vsaj dva različna testa za potrditev prisotnosti lupusnih antikoagulantov. * Preiskava se izvaja v s trombociti osiromašeni plazmi.