ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ Μαρία Γιαννακούρου ΤΕΙ Αθηνών, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής, Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Νικόλαος Γ. Στοφόρος Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου ΠΕΡΙΛΗΨΗ Προκειμένου να προσδιοριστούν οι κινητικές παράμετροι θερμικής απενεργοποίησης (π.χ. χρόνος υποδεκαπλασιασμού, D T, και τιμή z), χρησιμοποιούνται δεδομένα από πειράματα σε ισοθερμοκρασιακές συνθήκες, και προσδιορίζονται οι κινητικές παράμετροι σε δύο φάσεις: στο πρώτο στάδιο, επιλέγεται ο δείκτηςστόχος της θερμικής επεξεργασίας (εδώ η L-καρνιτίνη), μετράται η μεταβολή του στο χρόνο και προσδιορίζεται ο ρυθμός καταστροφής του σε συγκεκριμένη, σταθερή θερμοκρασία, μέσω του κατάλληλου μαθηματικού μοντέλου (πρωτογενές μοντέλο). Στο επόμενο βήμα, η επίδραση της θερμοκρασίας στους ρυθμούς καταστροφής του επιλεγμένου δείκτη προσδιορίζεται μέσω κατάλληλων με τη χρήση δευτερογενούς μαθηματικού μοντέλου. Όπως αποδείχθηκε και στη συγκεκριμένη εφαρμογή, με τη μεθοδολογία αυτή τα εκτιμώμενα με στατιστική επεξεργασία διαστήματα εμπιστοσύνης των εκτιμήσεων των ρυθμών καταστροφής στην εκάστοτε μελετώμενη θερμοκρασία δεν παίρνονται υπόψη στον υπολογισμό των των δευτερογενών μοντέλων, με συνέπεια τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης να εμφανίζονται, ψευδώς, μικρότερα από ότι υποδηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν, να διερευνήθεί μια εναλλακτική προσέγγιση, που ακολουθεί τις βασικές αρχές της μεθοδολογίας των δύο βημάτων, λαμβάνοντας όμως υπόψιν την αβεβαιότητα (ή σφάλμα) των τιμών των κινητικών του πρωτογενούς μοντέλου (εδώ της παραμέτρου D T ). Αυτό πραγματοποιήθηκε με θεώρηση κανονικής κατανομής των τιμών D T για την εκάστοτε θερμοκρασία και με χρήση της τεχνικής Monte Carlo για πολλαπλές περιπτώσεις τυχαίων συνδυασμών τιμών D T, προκειμένου να υπολογιστούν οι τιμές των κινητικών του δευτερογενούς μοντέλου (z και D T ), αλλά και τα πραγματικά διαστήματα εμπιστοσύνης αυτών. Στη συγκεκριμένη μελέτη βρέθηκε ότι, ειδικά στην περίπτωση διερυμένων σφαλμάτων των του πρωτογενούς μοντέλου, η τελευταία αυτή προσέγγιση προσδιορίζει με ακρίβεια την πραγματική διακύμανση του εύρους τιμών των του δευτερογενούς μοντέλου, αποφεύγοντας τα, πλασματικά εκτιμώμενα, μικρά διαστήματα εμπιστοσύνης. ΕΙΣΑΓΩΓΗ H κλασική μεθοδολογία εκτίμησης κινητικών θερμικής απενεργοποίησης βασίζεται σε δεδομένα από πειράματα σε ισοθερμοκρασιακές συνθήκες και στον σταδιακό προσδιορισμό των. Σύμφωνα με την προσέγγιση αυτή, στο πρώτο στάδιο, επιλέγεται ο δείκτης-στόχος της θερμικής επεξεργασίας (συνήθως πρόκειται για έναν θερμοευαίσθητο παράγοντα), μετράται η μεταβολή του συναρτήσει του χρόνου κατεργασίας σε συγκεκριμένη, σταθερή θερμοκρασία και προσδιορίζεται ο ρυθμός καταστροφής του, μέσω κατάλληλου μαθηματικού μοντέλου (πρωτογενές μοντέλο). Σύμφωνα με την κλασική θερμοβακτηριολογική προσέγγιση [1,2] που ακολουθείται για την περιγραφή κινητικών δεδομένων θερμικής απενεργοποίησης, ο ρυθμός απενεργοποίησης αποδίδεται με τον χρόνο υποδεκαπλασιασμού, D Τ, ο οποίος ορίζεται από την Εξ. (1): t log C log Co (1) DT όπου D Τ ο χρόνος θέρμανσης, σε σταθερή θερμοκρασία T, που απαιτείται για την καταστροφή του 90% ενός θερμοευαίσθητου παράγοντα (π.χ., μικροοργανισμών, ενζύμων, βιταμινών ή άλλων ποιοτικών ), C ο η αρχική συγκέντρωση και C η συγκέντρωση μετά από χρόνο θέρμανσης t, του υπό εξέταση παράγοντα (π.χ., αριθμός μικροοργανισμών ανά περιέκτη, αριθμός σπορίων ανά ml, mg/ml, κλπ). Με βάση την Εξ. (1) και απλή γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης προσδιορίζονται οι χρόνοι υποδεκαπλασιασμού σε κάθε θερμοκρασία που μελετάται. Σε επόμενο βήμα, η επίδραση της θερμοκρασίας στους ρυθμούς καταστροφής του επιλεγμένου δείκτη προσδιορίζεται με τη χρήση δευτερογενών μαθηματικών μοντέλων. Κατά την παραπάνω προσέγγιση, η επίδραση της θερμοκρασίας στο χρόνο υποδεκαπλασιασμού, περιγράφεται με την τιμή z από την Εξ. (2):
T T log DT log DT (2) z όπου z είναι η σταθερά θερμικής αντίστασης, αποτελεί μέτρο της εξάρτησης του ρυθμού θερμικής απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία, ορίζεται ως η διαφορά θερμοκρασίας που απαιτείται για να δεκαπλασιαστεί ή να υποδεκαπλασιαστεί η τιμή D T. Ως Τ ορίζεται η θερμοκρασία αναφοράς. Εναλλακτικά, είναι εφικτός ο ταυτόχρονος των κινητικών των πρωτογενών και δευτερογενών μαθηματικών μοντέλων σε ένα βήμα, από τα ίδια με παραπάνω πειράματα σε ισοθερμοκρασιακές συνθήκες, δια μέσου της Εξ. (3) και ανάλυσης μη γραμμικής παλινδρόμησης. t log C log Co (3) ( T T ) / z DT Η μεθοδολογία αυτή οδηγεί στον προσδιορισμό κινητικών με μικρότερα διαστήματα εμπιστοσύνης σε σχέση με την κλασική μέθοδο των δυο βημάτων. Ο ταυτόχρονος των κινητικών των πρωτογενών και δευτερογενών μαθηματικών μοντέλων είναι επίσης εφικτός από πειράματα σε δυναμικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Με τη μέθοδο αυτή μειώνεται σημαντικά ο αριθμός των απαιτούμενων πειραματικών δεδομένων και της συνεπακόλουθης προσπάθειας. Εντούτοις, η επιλογή κατάλληλων δυναμικών θερμοκρασιακών συνθηκών είναι κρίσιμη για την ακριβή πρόβλεψη των κινητικών με ικανοποιητικά χαμηλά διαστήματα εμπιστοσύνης (υψηλή ακρίβεια-χαμηλή αβεβαιότητα εκτιμήσεων). Οι παραπάνω μεθοδολογίες εφαρμόστηκαν [3] για τον προσδιορισμό των κινητικών θερμικής απενεργοποίησης της L-καρνιτίνης (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Εκτιμούμνες τιμές κινητικών θερμικής απενεργοποίησης L-καρνιτίνης. Ισοθερμοκρασιακές συνθήκες (2 σημεία) Δυναμικές θερμοκρασιακές συνθήκες (14 σημεία) * CI: Διάστημα εμπιστοσύνης Σταδιακός Ταυτόχρονος Ταυτόχρονος z ( C) D 120 C (min) Μέση τιμή 95% CI * Μέση τιμή 95% CI 30.2 2.3 50.6 7.3 30.8 0.4 50.4 1.0 31.8 6.0 52.0 9.8 Τα μεγαλύτερα διαστήματα εμπιστοσύνης που παρατηρήθηκαν κατά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των κινητικών από πειράματα σε δυναμικές θερμοκρασιακές συνθήκες (σε σχέση με τα πειράματα σε ισοθερμοκρασιακές συνθήκες) αποδίδονται στον περιορισμένο αριθμό πειραματικών δεδομένων (7 σημεία επί 2 επαναλήψεις). Τα μικρότερα διαστήματα εμπιστοσύνης που υπολογίστηκαν κατά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των κινητικών από πειράματα σε ισοθερμοκρασιακές συνθήκες (σε σχέση με τον σταδιακό προσδιορισμό των ) εν πρώτοις, δικαιολογούνται από το γεγονός ότι, κατά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό, δεν μεσολαβούν υπολογισμοί ενδιάμεσων. Κατά το σταδιακό προσδιορισμό των, τα σφάλματα, ή ισοδύναμα τα διαστήματα εμπιστοσύνης, των εκτιμήσεων των χρόνων υποδεκαπλασιασμού στην εκάστοτε μελετώμενη θερμοκρασία δεν παίρνονται υπόψη στον υπολογισμό της τιμής z και D T Έτσι τα διαστήματα εμπιστοσύνης των εκτιμήσεων των των δευτερογενών μοντέλων εμφανίζονται, ψευδώς, μικρότερα από ότι υποδηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της μεθοδολογίας του σταδιακού προσδιορισμού των κινητικών, έτσι ώστε τα σφάλματα των χρόνων υποδεκαπλασιασμού στην εκάστοτε μελετώμενη θερμοκρασία να ληφθούν υπόψη στον υπολογισμό των των δευτερογενών μοντέλων (τιμές D T και z). ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η προτεινόμενη προσέγγιση βασίζεται στην παραδοχή ότι η βασική παράμετρος D T της Εξ. (1), η εκτιμήτρια τιμή της οποίας προσδιορίζεται με γραμμική προσαρμογή των δεδομένων logc vs. t για κάθε μια από τις
μελετώμενες θερμοκρασίες, δεν περιγράφεται από μια μοναδική τιμή, αλλά από μια κατανομή τιμών (εδώ επιλέγεται η κανονική κατανομή) που ενσωματώνει και το προσδιοριζόμενο (από τη γραμμική προσαρμογή) σφάλμα, αλλά και τη μεταβλητότητα της παραμέτρου [4,5]. Για την ανάπτυξη της μεθοδολογίας που παρουσιάζεται στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκαν τα δεδομένα θερμικής απενεργοποίησης L-καρνιτίνης από την βιβλιογραφία [3] που αναφέρονται σε πειράματα σε 8 διαφορετικές σταθερές θερμοκρασίες (Σχήμα 1). log(dt) (DT σε min). 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 y = -0.033145x + 5.681755 R 2 = 0.99 Πειραματικές τιμές ±95% Confidence band ±95% Prediction band Γραμμή προσαρμογής 1.0 70 80 90 0 1 120 130 140 Θερμοκρασία ( C) Σχήμα 1. Χρόνοι υποδεκαπλασιασμού D Τ με 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (confidemce band) και πρόβλεψης (prediction band) βάσει πειραματικών δεδομένων θερμικής απενεργοποίησης L-καρνιτίνης σε ισοθερμοκρασιακές συνθήκες και ανάλυσης δύο βημάτων (σταδιακός ). Με τη βοήθεια της τεχνικής Monte Carlo [6] γίνεται τυχαία επιλογή τιμών από τις κανονικές κατανομές της παραμέτρου D T για κάθε μια από τις 8 θερμοκρασίες, με συχνότητα που καθορίζεται από την εκάστοτε κατανομή. Στόχος είναι ο των τιμών των D T και z (Εξ. 2), καθώς και των σφαλμάτων τους, με βάση τα πολλαπλά σετ τιμών D T (500 οκτάδες) που έχουν παραχθεί με το προηγούμενο βήμα της τεχνικής Monte Carlo. Για κάθε μια συγκεκριμένη, τυχαία, "οκτάδα" τιμών D T, προκύπτει ένα ζεύγος τιμών (εκτιμητές) για τα D T και z (και οι αντίστοιχες κατανομές των ιδίων, D T και z, ). Για 0 τυχαία από τα τελευταία ζεύγη D T και z, με τη βοήθεια των προσδιοριζομένων κατανομών τους και της τεχνικής Monte Carlo γίνεται τυχαία επιλογή 0 σημείων από κάθε κατανομή και, τελικά καταλήγουμε στη δημιουργία 00 τιμών για κάθε μια από τις παραμέτρους του δευτερογενούς μοντέλου D T και z, απ όπου υπολογίζουμε τις εκτιμήτριες (μέσες τιμές) και τα αντίστοιχα 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (CI) των D T και z. Να σημειωθεί ότι κατά τους υπολογισμούς ως θερμοκρασία αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν οι 120 ο C. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας τους κανόνες της διάδοσης σφαλμάτων, δηλαδή, f ( x) (4) x f ( x) x προκειμένου να προσδιοριστούν τα 95% CI των πραμέτρων D T, D T και z, συμβολιζόμενα με (D T ), (D T ) και (z), αντίστοιχα, από τα τα 95% CI των 1/D T, 1/z, και log(d T ) συμβολιζόμενα με (1/D T ), (1/z), και (log(d T )), που προκύπτουν από τη χρήση των Εξ. (1) και (2), χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εξισώσεις: 1 1 (5) DT 2 D DT T
1 1 z 2 z z (6) DT ln() DT log( DT ) (7) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η εφαρμογή της προτεινόμενης μεθοδολογίας στα πειραματικά δεδομένα, δηλαδή στις τιμές D Τ και τα αντίστοιχα 95% CI της βιβλιογραφίας [3], (πρώτες στήλες δεδομένων στον Πίνακα 2) δεν οδήγησε σε διαφοροποίηση των διαστημάτων εμπιστοσύνης των τιμών D T και z σε σχέση με τα αρχικά προσδιορισθέντα διαστήματα, των 7.3 minκαι 2.3 C, αντίστοιχα (πρώτη σειρά αποτελεσμάτων του Πίνακα 1) που υπολογίζονται χωρίς να ληφθεί υπόψη η αβεβαιότητα στον προσδιορισμό των επιμέρους τιμών D T. Αυτό αποδόθηκε στο σχετικά μικρό σφάλμα (95% CI) των επιμέρους τιμών D T σε σχέση με το προσδιοριζόμενο από τη γραμμική προσαρμογή) σφάλμα (Σχήμα 1). Για το λόγο αυτό, η προτεινόμενη μεθοδολογία εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα μεγαλύτερο, αυθαίρετα, 95% CI στις ίδιες (πειραματικές) μέσες τιμές D T (Πίνακας 2). Η τυχαία επιλογή των 500 και 0 τυχαίων δειγμάτων (οκτάδων D T ) επιβεβαιώθηκε με τον υπολογισμό των μέσων τιμών και των 95% CI των δειγμάτων (Πίνακας 2) και την μη ουσιαστική τους απόκλιση από τις αρχικές τους τιμές (Πίνακας 2). T ( C) Πίνακας 2. Χρόνοι υποδεκαπλασιασμού D Τ (min) θερμικής απενεργοποίησης L-καρνιτίνης. Τεχνητά Από 500 τυχαία Από 0 τυχαία Από πειραματικά αυξημένο δείγματα (με το δείγματα (με το τεχνητά δεδομένα CI τεχνητά αυξημένο CI) αυξημένο CI) Μέση τιμή 95% CI 95% CI Μέση τιμή 95% CI Μέση τιμή 95% CI 80 896.3 45.0 267.7 890.8 262.0 873.1 278.5 85 728.8 57.2 230.2 735.8 223.6 749.3 245.4 90 573.8 65.0 196.2 569.1 192.5 559.2 186.9 95 384.1 41.0 123.4 387.4 121.5 388.4 132.5 0 238.2 7.6 59.0 236.4 57.8 233.4 56.2 1 5.8 2.4 24.3 6.3 24.4 6.6 23.0 120 47.3 2.2 13.5 47.1 13.4 45.7 13.5 130 23.6 0.6 4.9 23.5 5.0 23.7 4.7 Μια ποιοτική απεικόνιση, με βάση την προτεινόμενη μεθοδολογία, του 95% διαστήματος εμπιστοσύνης (confidemce band) των D Τ συναρτήσει της θερμοκρασίας γραμών, για 250 (από τις 500) οκτάδες D Τ απεικονίζεται στο Σχήμα 2. Εμφανίζεται το διευρημένο εύρος του 95% CI της προτεινόμενης μεθοδολογίας σε σχέση με το το ±95% CI της γραμμικής προσαρμογής. Στα Σχήματα 3 και 4 απεικονίζονται οι κατανομές των (00) τιμών D 120 C και z που υπολογίστηκαν με βάση τα προτεινόμενα. Με βάση τις κατανομές αυτές, οι μέσες τιμές και τα 95% CI των τιμών D 120 C και z υπολογίστηκαν ως 49.8 13.9 min και 30.2 4.8 C, αντίστοιχα. Παρατηρώντας, επομένως, το Σχήμα 2 και τις κατανομές των τιμών των D 120 C και z του Σχήματος 3, και ειδικότερα τα διευρυμένα, πραγματικά 95% CI μπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι με την προτεινόμενη μεθοδολογική προσέγγιση αίρεται το πρόβλημα "στρεβλού" υπολογισμού του σφάλματος των του δευτερογενούς μοντέλου με την κλασσική μέθοδο των δύο βημάτων. Αυτό επιβεβαιώνεται και από τη σύγκριση των τιμών της πρώτης γραμμής του Πίνακα 1 (πλασματικά μικρές τιμές σφαλμάτων) με τα πραγματικά διαστήματα εμπιστοσύνης των D 120 C και z ( 13.9 min και 4.8 C αντίστοιχα), όπως υπολογίστηκαν με το παρουσιαζόμενο στην εργασία αυτή μεθοδολογικό εργαλείο που λαμβάνει υπόψη την αβεβαιότητα τιμών των (D T ) του πρωτογενούς μοντέλου και την "ενσωματώνει" κατάλληλα στους υπολογισμούς για τις παραμέτρους του δευτερογενούς μοντέλου (D 120 C και z).
3.5 3.0 log(dt) (DT in min). 2.5 2.0 1.5 1.0 70 80 90 0 1 120 130 140 Temperature ( C) Σχήμα 2. Διαγραμματική απεικόνιση του log(d T ) ως προς τη θερμοκρασία. Οι ανοικτοί κύκλοι αναφέρονται στα πειραματικά σημεία με τις μπάρες σφαλμάτων να συμβολίζουν τα ±95% CI για τα τεχνητά αυξημένα σφάλματα. Η συνεχής μαύρη γραμμή αποτελεί την ευθεία γραμμικής προσαρμογής στα πειραματικά δεδομένα και η διακεκομμένη γραμμή το ±95% CI. Η ζώνη των γκρι ευθειών απεικονίζει το εύρος των D Τ συναρτήσει της θερμοκρασίας γραμì ών των 8 κατανομών D T (μια για κάθε θερμοκρασία) ενδεικτικά για 250 σημεία που έχουν προέλθει από προσομοίωση Monte Carlo. 25 25 % συχνότητα 20 15 5 % συχνότητα 20 15 5 0 0 20 30 40 50 60 70 80 90 D 120 C (min) 20 25 30 35 40 z ( C) Σχήμα 3. Κατανομές των (00) τιμών D 120 C και z που υπολογίστηκαν με βάση την προτεινόμενη μεθοδολογία. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Bigelow W.D., Bohart G.S., Richardson A.C. and Ball C.O., Natl. Canners Assoc. Res. Lab., Bull. 16-L, Washington, DC (1920). [2]. Ball C.O., Bulletin of the National Research Council No. 37, Vol. 7, Part 1, Natl. Res. Council, Washington, DC (1923). [3]. Προκοπίου, Π., Γούλα, Α.Μ. και Στοφόρος Ν.Γ. Πρακτικά 7 ου ΠΕΣΧΜ (2009). [4]. Lammerdig AM, Fazil A. Int.J Food Microbiol 58:147 (2000). [5]. Taoukis P.S. In: Tijkskens LMM, Hertog MLATM, Nicolai BM, ed. Food Process Modelling. CRC Press (2001), p.402. [6]. Smid J.H., Verloo D., Barker G.C. and Havelaar A.H. Int. J Food Microbiol. 139:S57 (20).